GPCR Elibrary - 41337212 - 14699075

Содержание
Введение 9
Литература 12
Глава 1. GPCR и их сигнальные системы 13
1.1. Классификация и структурно-функциональная 13

характеристика GPCR
1.2. G-белки и β-аррестины, как основные 22
трансдукторные компоненты GPCR-
сигналинга
1.3. Избирательная активация внутриклеточных 32
сигнальных каскадов
1.4. Внутриклеточные сигнальные пути 36
гонадотропинов
1.4.1. Влияние гонадотропинов на 38
аденилатциклазную сигнальную систему
1.4.2. Влияние фолликулостимулирующего и 45
лютеинизирующего гормонов на β-
аррестиновые пути
1.4.3. Влияние фолликулостимулирующего и 47
лютеинизирующего гормонов на
фосфоинозитидные сигнальные пути
1.5. Внутриклеточные сигнальные пути 50
тиреотропного гормона
Глава 2. Аллостерические регуляторы GPCR 71
2.1. Механизмы действия и классификация 71
аллостерических регуляторов GPCR
2.2. Оценка фармакологического профиля 82
аллостерических регуляторов
2.3. Количественная оценка аллостерических 87
взаимодействий
2.4. Влияние олигомеризации рецепторов и их 92
4
комлексообразования с RAMP на
аллостерические эффекты
2.5. Подходы, направленные на оптимизацию 98
структуры аллостерических модуляторов
Глава 3 Эндогенные аллостерические регуляторы 115
GPCR
3.1. G-белки, как аллостерические регуляторы 115
GPCR
3.2. Аррестины и RAMP-белки, как 117
аллостерические регуляторы GPCR
3.3. Ионы, как аллостерические регуляторы GPCR 121
3.4. Липиды, как аллостерические регуляторы 130
GPCR
3.5. Аминокислоты и их производные, как 139
3.6. Пептиды и белки, как аллостерические 141
регуляторы GPCR
3.7. Аутоантитела к GPCR, как аллостерические 145
регуляторы
Глава 4 Синтетические аллостерические регуляторы 159
GPCR
4.1. Аллостерические регуляторы хемокиновых 159
рецепторов
4.2. Аллостерические регуляторы опиоидных 162
4.3. Аллостерические регуляторы 164
каннабиноидных рецепторов
4.4. Аллостерические регуляторы метаботропных 168
глутаматных рецепторов
Глава 5 Аллостерические регуляторы рецепторов 187
5.1. Рецепторы гонадотропинов – структурно- 187

функциональная организация и регуляторные
свойства
5
5.1.1. Рецептор лютеинизирующего гормона 189
5.1.2. Рецептор фолликулостимулирующего 192
гормона
5.2. Необходимость разработки 195
низкомолекулярных аллостерических
регуляторов рецепторов гонадотропинов
5.3. Низкомолекулярные аллостерические 199
агонисты рецептора лютеинизирующего
гормона
5.4. Современные достижения в разработке 208
тиенопиримидиновых аллостерических
агонистов рецептора лютеинизирующего
гормона
5.4.1. Селективность регуляторного действия 214
тиенопиримидиновых производных на
внутриклеточные каскады
5.4.2. Устойчивость стероидогенного эффекта 216
тиенопиримидинов в условиях in vivo
5.4.3. Аддитивность и синергизм стероидогенных 222
эффектов тиенопиримидинов и
5.4.4. Влияние тиенопиримидинов на 225
стероидогенную функцию в условиях
сахарного диабета и при старении
5.5. Шапероноподобная активность 231
низкомолекулярных аллостерических
лигандов рецептора лютеинизирующего
гормона
агонисты рецептора
фолликулостимулирующего гормона
антагонисты рецептора
фолликулостимулирующего гормона
Глава 6 Аллостерические регуляторы рецептора 265
6
6.1. Тиреотропный гормон и другие эндогенные 265
регуляторы рецепторов тиреотропного
гормона
6.2. Структурно-функциональная организация 271
рецептора тиреотропного гормона
6.2.1. Внеклеточный домен рецептора ТТГ 273

6.2.2. Трансмембранный домен рецептора ТТГ 279
6.3. Структурные и функциональные основы 287
сигнальной трансдукции через рецептор
6.4. Олигомеризация рецептора тиреотропного 303
гормона
6.5. Низкомолекулярные лиганды рецептора 307
6.6. Низкомолекулярные аллостерические полные 308
агонисты рецептора тиреотропного гормона
6.5.2. Низкомолекулярные позитивные 317
аллостерические модуляторы рецептора
6.5.3 Низкомолекулярные антагонисты и 319
инверсионные агонисты рецептора
Глава 7 Аутоантитела как регуляторы функций GPCR 345
7.1. Концепция аутоантигенности 345
7.2. Аутоантитела к адренергическим рецепторам 347
7.3 Аутоантитела к мускариновым рецепторам 353
7.4 Аутоантитела к ангиотензиновым рецепторам 355
7.5 Аутоантитела к рецептору тиреотропного 359
гормона
7.6 Аутоантитела к меланокортиновым 362
рецепторам
7.7 Аутоантитела к серотониновым рецепторам 367
7.8 Аутоантитела к дофаминовым рецепторам 370
7.9 Стратегии лечения аутоиммунных 370
заболеваний, вызванных антителами к GPCR
7
Глава 8 Пепдуцины – производные 384
цитоплазматических петель GPCR – и их
применение в медицине
8.1. Молекулярные механизмы действия GPCR- 387
пептидов
8.2. GPCR-пептиды, как селективные регуляторы 392
сигнальной трансдукции
8.3. PAR-производные пепдуцины 399
8.3.1. Влияние PAR-производных пепдуцинов на 399
агрегацию тромбоцитов
ангиогенез, опухолевый рост и
метастазирование
процессы воспаления
острый панкреатит
8.4. Пепдуцины, производные хемокиновых 414
8.5. GPCR-пептиды, как регуляторы функций 418
сердечно-сосудистой системы
8.6. GPCR-пептиды – регуляторы эндокринных 421
функций
8.6.1. Пептиды – производные третьей 422
цитоплазматической петли рецептора
лютеинизирующего гормона
8.6.2. Пептиды – производные третьей 427
цитоплазматической петли рецептора
8.7. Некоторые перспективы использования и 430
разработки GPCR-пептидов
Список основных сокращений 444
8
9
ВВЕДЕНИЕ
Для обмена информацией между различными типами

клеток, а также между конкретной клеткой и окружающей средой
служат хемосигнальные системы, которые в процессе эволюции
преобразовались в сложноорганизованные многокомпонентные
гормональные сигнальные системы. Следует отметить, что
прототипы этих систем возникли еще на уровне одноклеточных
эукариот (Shpakov, Pertseva, 2008), а некоторые их элементы
возникли еще раньше – у представителей различных типов
бактерий (Перцева, Шпаков, 2008; Шпаков, Перцева, 2008;
Шпаков, 2009а, 2009б; Martín-Mora et al., 2018; Liu et al., 2019). У
одноклеточных форм грибов, в первую очередь у наиболее
исследованных дрожжевых грибов и слизевого гриба
Dictyostelium discoideum, а также у трипаносом и
свободноживущих инфузорий, обнаружены все основные
компоненты, присущие гормональным сигнальным системам
позвоночных, включая гетеротримерные G-белки и
функционально сопряженные с ними рецепторы, называемые
GPCR (G protein-coupled receptors) (Шпаков, 2007; Shpakov,
Pertseva, 2008; Alvaro, Thorner, 2016). В структуре GPCR
одноклеточных эукариот, а в дальнейшем в структуре
соответствующих рецепторов у представителей многоклеточных
беспозвоночных животных, имеются функционально активные
домены и субдомены, ответственные за специфическую
детекцию гормонального сигнала, включая высокоаффинный
ортостерический сайт рецептора, а также за процесс активации
G-белка и трансдукцию сигнала внутрь клетки к ее эффекторным
системам и транскрипционным факторам (Shpakov, Pertseva,
2008; Liu et al., 2016; Brown et al., 2018). В GPCR одноклеточных
и многоклеточных беспозвоночных животных также имеются
детерминанты, которые могут быть вовлечены в
аллостерическую регуляцию их активности. Однако до
10
настоящего времени аллостерические сайты в GPCR
беспозвоночных остаются малоизученными, что существенно
сдерживает разработку новых подходов для регуляции и
модуляции их активности с помощью лигандов аллостерических
сайтов.
В то же время в случае GPCR позвоночных животных в
настоящее время достаточно подробно изучены не только
механизмы активации и структурно-функциональные
характеристики ортостерических сайтов, ответственных за
высокоаффинное связывание эндогенных и синтетических
лигандов, но и аллостерические сайты, которые могут
располагаться во внеклеточных, трансмембранных и
цитоплазматических доменах рецепторов. Достоинствами
аллостерических регуляторов, взаимодействующих с этими
сайтами, являются высокая селективность их действия и
способность тонко перенастраивать активность рецептора и его
чувствительность к ортостерическим лигандам с агонистической
активностью. Важно и то, что лиганды аллостерических сайтов
GPCR с активностью агонистов, инверсионных агонистов,
нейтральных антагонистов, а также положительных и
отрицательных модуляторов гормонального сигналинга
способны избирательно влиять на активность вполне
определенного внутриклеточного сигнального каскада. Это
обеспечивает таргетность их регуляторного влияния на тот или
иной физиологический или биохимический процесс в организме
и в значительной степени снижает вероятность развития
побочных эффектов при их использовании в клинике.
В монографии приводятся данные о структурно-
функциональной организации GPCR, об основных компонентах
GPCR-зависимых сигнальных путей, а также о локализации,
структуре и фунциональных свойствах аллостерических сайтов в
молекулах GPCR. Подробно описаны основные классы как
эндогенных, так и синтетических аллостерических регуляторов и
модуляторов GPCR, многие из которых уже применяются или
предлагаются для использования в медицине. Две отдельные
11
главы посвящены структуре и функциональной активности
низкомолекулярных лигандов аллостерических сайтов
рецепторов гипофизарных гликопротеиновых гормонов –
лютеинизирующего, фолликулостимулирующего и
тиреотропного. Эти лиганды специфично связываются с
аллостерическим сайтом, расположенным в трансмембранном
домене этих рецепторов, там, где в подавляющем большинстве
GPCR располагается ортостерический сайт. Основной акцент
сделан на тиенопиримидиновых производных с активностью
агонистов рецептора лютеинизирующего гормона, которые на
протяжении последних лет интенсивно разрабатываются и
изучаются авторами монографии. В монографии также
анализируются стратегия создания, структурные особенности и
активность пептидных регуляторов GPCR, которые
взаимодействуют с аллостерическими сайтами, расположенными
в цитоплазматических доменах GPCR. Наиболее активными
среди них являются модифицированные гидрофобными
радикалами GPCR-пептиды, называемые пепдуцинами, которые
проникают через плазматическую мембрану внутрь клетки и там
специфично взаимодействуют с аллостерическими сайтами
гомологичного им рецептора, контролируя, тем самым, процесс
сигнальной трансдукции. Подробно обсуждаются разработанные
авторами пепдуцины – производные третьей цитоплазматической
петли рецепторов лютеинизирующего и тиреотропного гормонов,
которые специфически активны как потенциальные регуляторы
функций эндокринной системы. Отдельная глава посвящена
аутоиммунным заболеваниям, которые вызываются антителами с
активностью аллостерических регуляторов GPCR, выработанных
на антигенные детерминанты этих рецепторов, которые либо
сами участвуют в формировании аллостерических сайтов
рецептора, либо опосредованно влияют на его структуру и
активность. В этой главе описаны собственные результаты
авторов монографии о продолжительном аутоиммунном
ингибировании меланокортиновых рецепторов 3-го и 4-го типов
у крыс с помощью специфичных к этим рецепторам аутоантител,
12
что вызывало развитие у экспериментальных животных
метаболических расстройств.
Литература
Перцева М.Н., Шпаков А.О. Прокариотическое происхождение и

эволюция хемосигнальных систем эукариот // Российский Физиологический
журнал им. И.М. Сеченова. 2008. T. 94. № 9. С. 1029–1047.
Шпаков А.О. Рецепторы серпантинного типа и гетеротримерные G-
белки дрожжевых грибов: структурно-функциональная организация и
молекулярные механизмы действия // Журн. эволюц. биохимии и физиологии.
2007. T. 43. № 1. С. 3–23.
Шпаков А.О. Сигнальные молекулы бактерий непептидной природы
QS-типа // Микробиология. 2009а. Т. 78. № 2. С. 163–175.
Шпаков А.О. Пептидные аутоиндукторы бактерий // Микробиология.
2009б. Т. 78. № 3. С. 291-303.
Шпаков А.О., Перцева М.Н. Системы сигнальной трансдукции
прокариот // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. 2008. T. 44. № 2. С. 113–
130.
Alvaro C.G., Thorner J. Heterotrimeric G Protein-coupled Receptor
Signaling in Yeast Mating Pheromone Response // J. Biol. Chem. 2016. V. 291 (15).
P. 7788–7795. doi: 10.1074/jbc.R116.714980.
Brown N.A., Schrevens S., van Dijck P., Goldman G.H. Fungal G-protein-
coupled receptors: mediators of pathogenesis and targets for disease control // Nat.
Microbiol. 2018. V. 3 (4). P. 402–414. doi: 10.1038/s41564-018-0127-5.
Liu C., Sun D., Zhu J., Liu W. Two-Component Signal Transduction
Systems: A Major Strategy for Connecting Input Stimuli to Biofilm Formation //
Front. Microbiol. 2019. V. 9. P. 3279. doi: 10.3389/fmicb.2018.03279.
Liu R., Wong W., IJzerman A.P. Human G protein-coupled receptor studies
in Saccharomyces cerevisiae // Biochem. Pharmacol. 2016. V. 114. P. 103–115. doi:
10.1016/j.bcp.2016.02.010.
Martín-Mora D., Fernández M., Velando F., Ortega Á., Gavira J.A., Matilla
M.A., Krell T. Functional Annotation of Bacterial Signal Transduction Systems:
Progress and Challenges // Int. J. Mol. Sci. 2018. V. 19 (12). pii: E3755. doi:
10.3390/ijms19123755.
Shpakov A.O., Pertseva M.N. Signaling systems of lower eukaryotes and
their evolution // Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2008. V. 269. P. 151–282. doi:
10.1016/S1937-6448(08)01004-6.
13
ГЛАВА 1
GPCR и их сигнальные системы
1.1. Классификация и структурно-функциональная

характеристика GPCR
Наиболее распространенным суперсемейством сенсорных

белков у всех представителей многоклеточных эукариот
являются мембранные рецепторы, функционально сопряженные с
гетеротримерными G-белками, имеющие аббревиатуру «GPCR»
(G protein-coupled receptors). Будучи локализованными в
плазматической мембране различных типов эукариотических
клеток, GPCR опознают и преобразуют в клеточный ответ
широкий спектр внеклеточных сигналов. Среди таких сигналов
кванты света, гормональные и гормоноподобные молекулы,
ростовые факторы, нейротрансмиттеры и нейромодуляторы,
нутриенты, метаболиты и одоранты, которые специфически
взаимодействуют с GPCR, активируют его и, тем самым,
генерируют передачу сигнала к внутриклеточным эффекторным
системам и транскрипционным факторам (Lagerstrom, Schioth,
2008; Muller et al., 2008; Latek et al., 2012; Katritch et al., 2013).
Регуляторы функциональной активности GPCR являются одним
из наиболее распространенных классов фармакологических
препаратов, составляя более 30 % всех лекарств, применяемых в
настоящее время для лечения заболеваний ЦНС, сердечно-
сосудистой, эндокринной, пищеварительной, выделительной и
других систем у человека и животных (Salon et al., 2011).
Основной структурной особенностью молекул GPCR
являются семь спиральных гидрофобных участков, имеющих
длину от 17 до 25 аминокислотных остатков. Эти спирали
14
разделены вариабельными по длине и первичной структуре
цитоплазматическими (ЦП) и внеклеточными (ВП)
гидрофильными петлями. Наряду с ВП, в молекуле GPCR
локализован внеклеточный N-концевой участок. Он сравнительно
короток в большинстве GPCR, но достигает значительных
размеров в некоторых типах GPCR, например, в рецепторах
гипофизарных гликопротеиновых гормонов и в рецепторах,
контролирующих процессы клеточной адгезии. Участки ЦП
рецепторов и их интерфейсы с гидрофобными
трансмембранными спиралями (ТМС) играют определяющую
роль в функциональном взаимодействии с гетеротримерными G-
белками, β-аррестинами и другими эффекторными и
регуляторными белками, активность которых регулируется через
посредство GPCR (Шпаков, 2002а, 2007). В цитоплазме
располагается С-концевой домен, который сильно варьирует по
протяженности и содержит большое число сайтов, мишеней
серин/треонинового фосфорилирования GPCR-специфичными
протеинкиназами (GRK-киназами). В некоторых GPCR
гидрофобный сегмент, расположенный сразу после седьмой ТМС
в проксимальном к мембране участке С-концевого домена,
способен образовывать дополнительную амфипатическую
спираль, обозначаемую как H8. Эта спираль модифицирована
остатком жирной кислоты, как правило, пальмитиновой, что
позволяет ей прочно заякориваться в плазматической мембране и
формировать дополнительную четвертую ЦП (Maeda et al., 2010).
Семь ТМС образуют трансмембранный домен (Lefkowitz,
2007a, 2007b). Эти спирали могут иметь изгибы, некоторые из
которых содержат остатки пролина, условно разделяющие
трансмембранный домен рецептора на внеклеточную и
цитоплазматическую части. Интерфейсы ВП и ТМС более
вариабельны по первичной структуре в сравнении с
интерфейсами, которые образованы ориентированными в
цитоплазму сегментами ТМС и проксимальными к мембране
участками ЦП рецептора, взаимодействующими с
гетеротримерными G-белками. Важно отметить, что изменения
15
конформации рецептора вследствие связывания лиганда в
большей степени затрагивают не внеклеточные, а
внутриклеточные интерфейсы трансмембранного домена
(Katritch et al., 2012; Шпаков, 2013).
У млекопитающих, в том числе у человека и приматов,
число GPCR превышает 800, причем большая их часть вовлечена
в детекцию различных по химической природе одорантов и, тем
самым, отвечает за процессы обоняния. В свою очередь около
350 GPCR специфично связываются с гормональными и
нейромедиаторными молекулами, регулируя и модулируя
широкий спектр физиологических и биохимических процессов в
организме (Erlandson et al., 2018). Длина GPCR варьирует от 289
(Mas-подобный GPCR, Q86SM5) до 3312 (ЭФР-подобный
рецепторный белок-1, Q9NYQ7) аминокислотных остатков, хотя
большинство рецепторов содержат 300–500 аминокислотных
остатков (Mirzadegan et al., 2003). Варьирование по длине в
значительной степени зависит от протяженности внеклеточных
участков – N-концевого домена, второй и третьей ВП, а также,
хотя и в меньшей степени, от длины цитоплазматических
участков – третьей ЦП и С-концевого домена.
На основе сравнительного анализа нуклеотидных и
аминокислотных последовательностей GPCR, а также изучения
структурно-функциональной организации GPCR у человека и
млекопитающих выделяют пять основных семейств GPCR:
рецепторы, имеющие структурное и функциональное сходство с
родопсином (семейство А), секретиновые рецепторы (часть
семейства В), рецепторы клеточной адгезии (часть семейства B),
метаботропные глутаматные рецепторы (семейство C) и
рецепторы Frizzled/Taste2 (семейство F) (Fredriksson et al., 2003;
Schioth, Fredriksson, 2005) (табл. 1-1). У грибов и одноклеточных
эукариот имеются еще два дополнительных семейства GPCR – D
(рецепторы феромонов спаривания) и E (цАМФ-специфичные
рецепторы), но их нет у позвоночных животных (Shpakov,
Pertseva, 2008). Родопсиновое семейство включает четыре
подсемейства – α, β, γ и δ (Fredriksson et al., 2003). Подсемейство
16
α включает пять основных групп – рецепторы простагландинов,
рецепторы биогенных аминов, опсины, рецепторы мелатонина и
аденозиновые рецепторы, причем для многих из них установлена
пространственная структура. Подсемейство β родопсинового
семейства включает рецепторы гипокретина (орексина),
нейропептида FF, тахикинина, холецистокинина, нейропептида
Y, эндотелин-подобных пептидов, гастрин-высвобождающего
пептида, нейромедина B, бомбезина, нейротензина, грелина,
нейромедина, тиролиберина, люлиберина (гонадолиберина),
аргинин-вазопрессина, окситоцина, а также орфановые
рецепторы. В подсемейство γ включены опиоидные рецепторы,
ноцицептивный рецептор, меланокортиновые и хемокиновые
рецепторы. Подсемейство δ включает Mas-подобные
(онкогенные) рецепторы, рецепторы гликопротеиновых гормонов
и нуклеотидов, а также обонятельные рецепторы.
Однако существуют и другие варианты классификации
рецепторов родопсинового семейства. Так согласно
классификации Julien Pelé и соавторов (Pele et al., 2011), GPCR
родопсинового семейства подразделяют на четыре подсемейства:
G0 – пептидные рецепторы, опсины, мелатониновые рецепторы,
G1 – соматостатиновые, опиоидные и хемокиновые рецепторы,
G2 – рецепторы биогенных аминов и аденозина, G3 –
меланокортиновые, Mas-подобные и каннабиноидные рецепторы,
рецепторы сфингозин-1-фосфата и простагландинов, рецепторы
релаксина и гипофизарных гликопротеиновых гормонов, которые
содержат обогащенные остатками лейцина повторы (leucine-rich
repeat, LRR).
Особенностью рецепторов секретинового семейства (B1)
является их способность специфично взаимодействовать с
полипептидными гормонами, содержащими протяженные α-
спиральные участки, такими как, например, глюкагон и
паратиреоидный гормон.
17
Таблица 1-1. Основные семейства GPCR у человека и
млекопитающих (по Erlandson et al., 2018).
Семейство Представители Биологическая роль
GPCR семейства
Родопсиновое Адренергические, Реализация эффектов
(А) ангиотензиновые, гормонов, ростовых
каннабиноидные, факторов, ауто- и
хемокиновые, паракринных регуляторов,
мускариновые нейротрансмиссия, обоняние,
ацетилхолиновые, зрение, контроль функций
гистаминовые, иммунной, нервной,
опиоидные и сердечно-сосудистой систем,
одорантные рецепторы, воспаление, контроль
опсины, и др. метаболических процессов,
регуляция широкого спектра
других жизненно важных
функций
Секретиновое Рецепторы глюкагона, Контроль функций
(B1) глюкагоноподобного эндокринной и
пептида-1, пищеварительной систем,
кальцитонин-ген- регуляция метаболических
родственного пептида, процессов и энергетического
соматолиберина и обмена
паратиреоидного
гормона
Адгезионное Лактофиллины, Контроль функций иммунной
(B2) рецепторы кадгеринов системы, формирование и
(CELSR) развитие ЦНС в онтогенезе
Глутаматное Метаботропные Реализация эффектов
(С) глутаматные нейротрансмиттеров,
рецепторы, GABAB- контроль функций нервной
рецепторы, вкусовые системы, вкусовые
рецепторы Taste1 восприятия (сладкий и
пикантный вкус)
Frizzled/taste2 Frizzled-рецепторы, Контроль процессов развития
(F) Smoothened-рецепторы, и дифференцировки тканей и
вкусовые рецепторы органов, опухолевый рост и
Taste2 метастазирование, вкусовые
восприятия (горький вкус)
18
Представители семейства адгезионных GPCR (B2)
располагают большими внеклеточными N-концевыми доменами,
а также GAIN(GPCR autoproteolysis-inducing)-доменами, которые
индуцируют аутопротеолиз молекул GPCR. Секретиновое и
адгезионное семейства GPCR характеризуются значительным
структурно-функциональным сходством.
Рецепторы глютаматного семейства (С) в функционально
активном состоянии представляют собой димеры и имеют
большие внеклеточные домены, в которых расположен лиганд-
связывающий сайт.
Семейство Frizzled/Taste2-рецепторов (F) включает
рецепторы Frizzled и Smoothened, которые играют важную роль в
развитии организма, в контроле клеточной дифференцировки и в
формировании органов и тканей на ранних стадиях онтогенеза
(табл. 1-1). Несмотря на сходство по топологии с другими GPCR,
механизмы активации рецепторов Frizzled/Taste2-семейства и
роль различных их участков во взаимодействии с белками-
партнерами остаются малоизученными (Erlandson et al., 2018).
После установления в конце 20-го века структуры GPCR,
как трансмембранных белков с семиспиральным
трансмембранным доменом, начались интенсивные исследования
пространственной структуры их лигандсвязывающих сайтов,
которые обычно расположены внутри трансмембранного домена,
а также молекулярных детеминант ВП и ЦП рецептора,
ответственных за осуществление процесса сигнальной
трансдукции. Однако до 2007 года такие исследования не имели
под собой достаточных оснований, поскольку в то время была
известна пространственная структура только одного, причем
наиболее примитивно устроенного GPCR – светочувствительного
родопсина (Palczewski et al., 2000). Все попытки построить
пространственные модели других рецепторов базировались в
основном на структуре родопсина, данных сайт-направленного
мутагенеза и данных по структуре и активности лигандов, а
также на результатах биофизических и биохимических
19
исследований различных типов GPCR (Schwartz et al., 2006;
Kobilka, 2007).
Однако, начиная с 2007 года, широкое использование
рентгеноструктурного анализа и молекулярного инжиниринга
кардинально изменило возможности, позволив создать
трехмерные модели лигандсвязывающих сайтов GPCR, а также
установить тонкие молекулярные механизмы, лежащие в основе
активации рецепторов лигандами и ответственных за
взаимодействие активированных рецепторов с G-белками и
другими участниками сигнальной трансдукции (Cherezov et al.,
2007; Rasmussen et al., 2007; Rosenbaum et al., 2007; Park et al.,
2008; Scheerer et al., 2008; Warne et al., 2008). Пионерами этих
работ стали американские ученые Роберт Лефковиц и Брайан
Кобилка, которые в 2012 году за расшифровку структурно-
функциональной организации GPCR были удостоены
Нобелевской премии по химии.
На начальном этапе пространственная структура была
установлена для β2-адренергического рецептора, имеющего
классическую структуру GPCR (Cherezov et al., 2007; Rasmussen
et al., 2007). В дальнейшем была установлена пространственная
структура для большого числа рецепторов, которые относятся к
разным семействам и подсемействам GPCR. Среди них β1-
адренергический рецептор (Warne et al., 2008), A2A-аденозиновый
рецептор (Jaakola et al., 2008), дофаминовый рецептор 3-го типа
(Chien et al., 2010), хемокиновые рецепторы CXCR1 (Park et al.,
2012), CXCR4 (Wu et al., 2010) и CCR5 (Tan et al., 2013),
гистаминовый рецептор 1-го типа (Shimamura et al., 2011),
рецептор сфингозин-1-фосфата (Hanson et al., 2012), m2- и m3-
мускариновые ацетилхолиновые рецепторы (Haga et al., 2012;
Kruse et al., 2012), μ-, δ- и κ-опиоидные рецепторы (Manglik et al.,
2012; Granier et al., 2012; Wu et al., 2012; Fenalti et al., 2014),
серотониновые рецепторы 1B- и 2С-подтипов (5-HT1BR и 5-
HT2CR) (Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013a), NTS1-
нейротензиновый рецептор (White et al., 2012), пуриновый
рецептор P2Y12 (Zhang et al., 2014), ноцицептивный
20
орфанизированный рецептор, высокоаффинный к FQ-пептиду
(Thompson et al., 2012), Smoothened-рецептор (Wang et al., 2013b),
протеаза-активируемый рецептор 1-го типа (PAR1) (Zhang et al.,
2012), родопсин быка (Park et al., 2008; Scheerer et al., 2008),
рецептор глюкагона (Siu et al., 2013), рецептор кортикотропин-
рилизинг фактора-1 (Hollenstein et al., 2013), метаботропный
глутаматный рецептор 5-го типа (Dore et al., 2014). При этом для
некоторых рецепторов были получены структурные данные как в
их активном, лиганд-связанном, так и в неактивном, свободном
от лиганда, состоянии (табл. 1-2).
Активация GPCR гормонами и другими сигнальными
молекулами приводит к изменению конформации
лигандсвязывающего сайта и цитоплазматической части
рецептора, что, в свою очередь, индуцирует взаимодействие
рецепторов с различными типами αβγ-гетеротримерных G-
белков, вызывая их диссоциацию на Gα-субъединицу и Gβγ-
димер, через посредство которых регулируется множество
эффекторных белков. В их число входят аденилатциклаза (АЦ),
фосфоинозитид-специфичная фосфолипаза Сβ (ФЛСβ), γ-
изоформа фосфатидилинозитол-3-киназы (ФИ-3-К), G-белок-
регулируемые ионные каналы и гуаниннуклеотид-обменные
факторы Rho-семейства. Наряду с этим через независимые от G-
белков механизмы, связывание агонистов с GPCR активирует β-
аррестины и ряд других сигнальных белков, через которые
осуществляется контроль процессов эндоцитоза и рециклизации
лиганд-рецепторных комплексов, а также стимулируется
активность ФИ-3-К, каскада митогенактивируемых протеинкиназ
(МАПК) и ряда других сигнальных путей.
21
Таблица 1-2. GPCR семейства А, кристаллические структуры
которых имеются для неактивного или активного состояний или
для обоих состояний
Структуры GPCR в Структуры GPCR в Структуры GPCR в
неактивном состоянии активном состоянии неактивном и
активном состоянии
β2-адренергический Рецептор 2-го типа Родопсин; β2-
рецептор; 5-HT1B- ангиотензина-II; адренергический
серотониновый вирусный GPCR рецептор; A2A-
рецептор; A1- US20. аденозиновый
аденозиновый рецептор; 5-HT2C-
рецептор; апелиновый серотониновый
рецептор; хемокиновые рецептор; CB1-
рецепторы CXCR1, каннабиноидный
CXCR4 и CCR5; рецептор; m2-
дофаминовый рецептор мускариновый
3-го типа; PAR1 и ацетилхолиновый
PAR2; δ- и κ- рецептор; μ-
опиоидные рецепторы; опиоидный рецептор;
ETB-эндотелиновый NTS1-
рецептор; рецептор нейротензиновый
свободных жирных рецептор.
кислот 1-го типа;
гистаминовый рецептор
1-го типа; рецептор
лизофосфатидной
кислоты 1-го типа; m1-,
m3- и m4-мускариновые
ацетилхолиновые
рецепторы;
ноцицептивный
рецептор; OX1- и OX2-
орексиновые
рецепторы; пуриновые
рецепторы P2Y1 и
P2Y12; рецептор
сфингозин-1-фосфата.
22
1.2. G-белки и β-аррестины, как основные трансдукторные
компоненты GPCR-сигналинга
Все гетеротримерные G-белки состоят из Gα-

субъединицы, которая связывает и гидролизует ГТФ, а также из
Gβ- и Gγ-субъединиц, которые тесно ассоциированы между
собой и образуют прочный Gβγ-димерный комплекс. У
млекопитающих Gα-субъединицы подразделяют на 4 основных
класса – Gαs, Gαi/o, Gαq/11 и Gα12/13, представители которых
кодируются 16 генами (табл. 1-3). Наряду с этим имеются 5
типов Gβ-субъединиц и 12 типов Gγ-субъединиц (табл. 1-4)
(Wettschureck, Offermanns, 2005; Birnbaumer, 2007; Lin, Smrcka,
2011). Gβ1-, Gβ2- Gβ3- и Gβ4-субъединицы образуют прочный
комплекс с Gγ-субъединицами, устойчивый при денатурирующих
условиях, в то время как Gβ5-субъединица взаимодействует с Gγ-
субъединицами слабее и способна функционировать, как
мономер или в комплексе с другими белками (Шпаков, 2002б;
Wettschureck, Offermanns, 2005). Необходимо отметить, что как
Gα-субъединицы, так и Gβ-субъединицы гетеротримерных G-
белков высоко консервативны в эволюции позвоночных
животных, а их ортологи обнаруживаются даже у представителей
низших эукариот (Shpakov, Pertseva, 2008). Так у слизевого гриба
Dictyostelium discoideum имеется более десяти различных форм
Gα-субъединиц, которые имеют значительное сходство с
различными классами Gα-субъединиц человека и
млекопитающих, а также представлены все пять типов Gβ-
субъединицы, включая ортолог Gβ5-субъединицы, способной
функционировать вне комплекса с Gγ-субъединицей
(Bakthavatsalam et al., 2009; Wu, Janetopoulos, 2013; Alamer et al.,
2018). При этом сходной является не только структурная
организация G-белков, но и механизмы их функционирования,
что указывает на раннее формирование в эволюции не только
GPCR, но и регулируемых ими сигнальных систем (Kamp et al.,
2016).
23
Таблица 1-3. Gα-субъединицы, их экспрессия и мишени
действия (по Wettschureck, Offermanns, 2005)
Тип Gα Ген Экспрессия Эффекторы
Gαs-класс
Gαs GNAS Повсеместно АЦ (все типы фермента) ↑
GαsXL (GNASXL) Нейроэндокринны АЦ ↑
е клетки
Gαolf GNAL Обонятельный АЦ ↑
эпителий, мозг
Gαi/o-класс
Gαi1 GNAI1 В большинстве АЦ (1, 3, 5, 6, 8 и 9 типы) ↓
тканей (прямая регуляция), различные
Gαi2 GNAI2 Повсеместно типы эффекторов, регулируемых
Gαi3 GNAI3 В большинстве Gβγ-димером
тканей
Gαo GNAO Нейроны, VDCC ↓, GIRK ↑ (через Gβγ-
нейроэндокринные димер)
клетки
Gαz GNAZ Нейроны, АЦ (в том числе 5 и 6 типы) ↓
тромбоциты (прямая регуляция), Rap1-GAP
Gαgust GNAT3 Вкусовые клетки, ФДЭ ↑
пневмоциты
Gαt-r GNAT1 Палочки сетчатки, ФДЭ, тип 6
вкусовые клетки (γ-субъединица палочек) ↑
Gαt-c GNAT2 Колбочки сетчатки ФДЭ, тип 6
(γ-субъединица колбочек) ↑
Gαq/11-класс
Gαq GNAQ Повсеместно ФЛС β ↑
Gα11 GNA11 Практически во ФЛС β ↑
всех тканях
Gα14 GNA14 Почки, легкие, ФЛС β ↑
селезенка
Gα15/16 GNA16 Кроветворные ФЛС β ↑
(GNA15) клетки
Gα12/13-класс
Gα12 GNA12 Повсеместно PDZ-RhoGEF/LARG, Btk, Cap1m,
кадгерин
Gα13 GNA13 Повсеместно p115-RhoGEF, PDZ-
RhoGEF/LARG, радиксин
Примечание. АЦ, аденилатциклаза; ФДЭ, фосфодиэстераза; ФЛСβ,
фосфолипаза Cβ; Btk, нерецепторная тирозинкиназа Брутона; Cap1m,
ГТФазу активирующий белок; GIRK, G белок-регулируемый входящий
калиевый канал; Rap1-GAP, Rap1-специфичный ГТФазу активирующий
белок; RhoGEF (PDZ-RhoGEF/LARG, p115-RhoGEF), обменный фактор
Rho-семейства; VDCC, потенциал-зависимый Ca2+-канал.
24
Таблица 1-4. Gβ- и Gγ-субъединицы, их экспрессия и мишени
действия (по Wettschureck, Offermanns, 2005)
Тип Ген Экспрессия Эффекторы
Gβ/Gγ
Gβ-субъединицы
Gβ1 GNB1 Широкое распространение,
палочки сетчатки АЦ 1-го типа ↓,
Gβ2 GNB2 В большинстве тканей АЦ 2-го, 4-го и 7-го
Gβ3 GNB3 Широкое распространение, типов ↑, ФЛС β (β3 > β2
колбочки сетчатки > β1) ↑, GIRK1–GIRK4
Gβ4 GNB4 В большинстве тканей (Kir3.1–Kir3.4) ↑,
Gβ5 GNB5 В основном в мозге киназы GRK2 и GRK3 ↑,
Gγ-субъединицы ФИ-3-Кβ и ФИ-3-Кγ ↑,
Gγ1, Gγrod GNGT1 Палочки сетчатки, мозг VDCC T-типа (Cav3.2) ↓,
Gγ14, GNGT2 Колбочки сетчатки, мозг VDCC N-, P/Q- и R-
Gγcone типов (Cav2.1–Cav2.3) ↓
Gγ2, Gγ6 GNG2 Широкое распространение
Gγ3 GNG3 Мозг, кровь
Gγ4 GNG4 Мозг и другие ткани
Gγ5 GNG5 Широкое распространение
Gγ8, Gγ9 GNG8 Обонятельный эпителий
Gγ13 GNG13 Мозг, вкусовые сосочки
Примечание. АЦ, аденилатциклаза; ФИ-3-К, фосфатидилинозитол-3-
киназа; ФЛСβ, фосфолипаза Cβ; GIRK, G белок-регулируемый
входящий калиевый канал; GRK, GPCR-специфичная киназа; VDCC,
потенциал-зависимый Ca2+-канал.
В неактивном состоянии Gα-субъединица, имеющая в

нуклеотидсвязывающем сайте ГДФ, образует прочный комплекс
с Gβγ-димером и специфично взаимодействует со свободным от
лиганда рецептором. Активация GPCR агонистом приводит к
снижению аффинности Gα-субъединицы к ГДФ и его замене на
ГТФ. Следствием ГДФ/ГТФ-обмена является снижение сродства
ГТФ-связанной Gα-субъединицы не только к активированному
агонистом рецептору, но и к Gβγ-димеру (Dohlman, Jones, 2012).
Генерируемые таким образом мономерная ГТФ-связанная Gα-
субъединица и Gβγ-димер осуществляют регуляцию большого
числа эффекторных белков и ионных каналов, что является
25
ключевым механизмом GPCR-опосредуемой сигнальной
трансдукции. В дальнейшем вследствие присущей Gα-
субъединице ГТФазной активности ГТФ гидролизуется до ГДФ,
и ГДФ-связанная Gα-субъединицы реассоциирует с Gβγ-димером
в неактивную форму гетеротримерного G-белка, в которой он
способен снова специфично связываться с GPCR и готов для
следующего цикла активации (рис. 1-1).
Рис. 1-1. Цикл активации-инактивации αβγ-гетеротримерных G-

белков, запускаемый связыванием GPCR с агонистом (Ag).
В рецепторах за взаимодействие с G-белками отвечают

различные сегменты второй и третьей ЦП, проксимальные к
мембране участки С-концевого домена, а также интерфейсы,
включающие цитоплазматические окончания ТМС (подробнее
см. Шпаков, 2002а, 2002б, 2016; Шпаков, Деркач, 2015). В
молекуле G-белка основными молекулярными детерминантами,
вовлеченными во взаимодействие с активированным рецептором,
являются N- и C-концевые участки Gα-субъединиц, а также
26
структурные элементы, определяющие конформацию
нуклеотидсвязывающего сайта, расположенного в полости между
Ras-подобным и α-спирализованным субдоменами Gα-
субъединицы (Mahoney, Sunahara, 2016).
Ранее считали, что основной причиной высокой скорости
замены ГДФ в нуклеотидсвязывающем сайте G-белка на ГТФ
является более высокая в сравнении с ГДФ концентрация ГТФ в
цитоплазме клетки. Так концентрация ГТФ в цитозоле
большинства эукариотических клеток достигает 200–300 мкМ,
что на один-два порядка выше таковой для ГДФ (McKee et al.,
1999). Однако исключительно высокая скорость ГДФ/ГТФ
обмена не может быть в полной мере объяснена повышенной
концентрацией ГТФ. В последние годы появились данные о том,
что нуклеотидный обмен зависит в основном от ГТФ-
связывающих белков цитоскелета, в первую очередь от тубулина,
которые тесно ассоциированы с гетеротримерными G-белками.
При активации G-белков в условиях снижения их аффинности к
ГДФ осуществляется активный транспорт ГТФ из
нуклеотидсвязывающего сайта тубулина к соответствующему
сайту Gα-субъединицы. Белки цитоскелета в этом случае
являются поставщиками молекул ГТФ, а сам процесс транспорта
гуаниновых нуклеотидов представляет собой эффективный
механизм регуляции активности GPCR и зависимых от G-белков
сигнальных систем клетки (Schappi et al., 2014).
Необходимо отметить, что, по крайней мере, в ряде
случаев, процесс активации G-белка не ведет к полной
диссоциации αβγ-гетеротримерного комплекса (Dohlman, Jones,
2012). Происходит лишь ослабление межмолекулярных
взаимодействий между ГТФ-связанной формой Gα-субъединицы
и Gβγ-димером, что вызывает высвобождение отдельных
участков субъединиц G-белка для взаимодействия с другими
компонентами GPCR-зависимых сигнальных систем. Важную
роль в этом также играют белки цитоскелета, которые не только
являются донорами ГТФ для G-белков, но определяют
27
структурную организацию и стабильность многокомпонентных
G-белковых комплексов (Schappi et al., 2014).
Физиологическая роль G-белков, определяемая
специфичностью их взаимодействия с эффекторными белками,
зависит в основном от типовой принадлежности Gα-субъединиц,
которые различным образом регулируют эффекторные звенья
внутриклеточных сигнальных каскадов. Однако природа Gβγ-
димера также исключительно важна для сигнальной трансдукции,
хотя Gβγ-димеры, имеющие в своем составе разные типы Gβ- и
Gγ-субъединиц, слабо различаются по специфичности
взаимодействия с эффекторными белками (Шпаков, 2002б; Lin,
Smrcka, 2011).
Большинство GPCR сопряжены сразу с несколькими
типами G-белков, вследствие чего их связывание с гормоном
приводит к запуску двух и более внутриклеточных сигнальных
каскадов. Однако в определенных физиологических условиях при
взаимодействии рецептора с несколькими типами G-белков
доминирует, как правило, какой-то один сигнальный каскад,
реализуемый через определенный тип G-белков. Это позволяет
классифицировать GPCR на основе их специфичности по
отношению к определенному классу G-белков (рис. 1-2).
Основным результатом активации Gs-белок-сопряженных
GPCR является диссоциации функционально связанных с ними
Gs-белков и вызываемая Gαs-субъединицей стимуляция
активности фермента АЦ, катализирующего образование
вторичного посредника цАМФ (Taussig, Gilman, 1995; Hurley,
1999). Повышение внутриклеточного уровня цАМФ приводит к
активации нижележащих цАМФ-зависимых эффекторных белков
– протеинкиназы А и обменных факторов семейства Epac
(exchange protein directly activated by cAMP) (Grandoch et al.,
2010).
28
29
Рис. 1-2. Типичные сигнальные каскады, реализуемые через Gs-белки
(1), Gi/o-белки (2), Gq/11- и G12/13-белки (3).
Сокращения: β1-, β2-, α1-, α2-АР, β1-, β2-, α1-, α2-адренергические
рецепторы; D1–5, дофаминовые рецепторы, относящиеся к типам 1–5;
GIRK, G белок-регулируемые входящие калиевые каналы Kir3.1–
Kir3.4; Cav 2.1-2.3, G-белок-регулируемые кальциевые каналы P/Q- и
N-типов; 5-HT1, 5-HT2, серотониновые рецепторы 1-го и 2-го типов;
M1–5, мускариновые ацетилхолиновые рецепторы, относящиеся к
типам 1–5; mGluR1–7, метаботропные глутаматные рецепторы,
относящиеся к типам от 1–7; PLC-β, фосфолипаза Cβ; PI-3-K,
фосфатидилинозитол-3-киназа; PIP2, фосфатидилинозитол-4,5-
дифосфат; IP3, инозитол 1,4,5-трифосфат; ДАГ, диацилглицерин; PKC,
протеинкиназа C; Rho-GEF, гуаниннуклеотид-обменный фактор для
белков Rho-семейства; Rho-А, малый ГТФ-связывающий белок Rho-
семейства; TP, A2-тромбоксановый рецептор; IP, простациклиновый
рецептор.
Активация GPCR, функционально сопряженных с Gi/o-

белками, приводит к высвобождению из гетеротримерного
комплекса мономерной Gαi/o-субъединицы и Gβγ-димера,
имеющих широкий спектр мишеней в клетке (рис. 1-2). Во-
первых, они способны влиять на функциональную активность
различных изоформ АЦ. При этом, если Gαi/o-субъединица
снижает стимулированную гормональными или
негормональными агентами активность АЦ, нормализуя, тем
самым, уровень цАМФ внутри клетки, то Gβγ-димер может
воздействовать на активность АЦ разнонаправлено, в
зависимости от изоформы фермента и его функционального
состояния (Hurley, 1999; Defer et al., 2000; Sunahara, Taussig,
2002). Во-вторых, Gβγ-димер стимулирует активность
фосфоинозитид-специфичной ФЛСβ и γ-изоформы
гетеродимерной ФИ-3-К, а также различных типов G-белок-
активируемых ионных каналов – калиевых каналов Kir3.1–Kir3.4
и кальциевых каналов P/Q- и N-типов.
При активации Gq/11-сопряженных GPCR высвобождается
Gαq/11-субъединица, которая активирует фермент ФЛСβ,
катализирующий синтез двух вторичных посредников –
диацилглицерина и инозитол-1,4,5-трифосфата, первый из
30
которых активирует чувствительные к нему изоформы
протеинкиназы С, в то время как второй вызывает повышение
уровня внутриклеточного кальция и, тем самым, активирует
кальциевые сигнальные пути в клетке (рис. 1-2). В свою очередь,
результатом стимуляции G12/13-сопряженных GPCR является
активация гуаниннуклеотид-обменного фактора для белков Rho-
семейства, являющегося мишенью для Gα12/13-субъединиц. После
активации светочувствительного белка родопсина, который
функционально сопряжен с G-белком трансдуцином (Gt),
генерируется ГТФ-связанная форма Gαt-субъединицы,
относящейся к семейству Gαi/o-субъединиц, которая
осуществляет активацию цГМФ-зависимой фосфодиэстеразы,
определяющей процесс восприятия светового сигнала (Hamm,
1998).
В дополнение к активации гетеротримерных G-белков,
связывание GPCR с лигандами приводит к функциональному
взаимодействию активированного рецептора с рядом сигнальных
и адапторных белков, относящихся к семейству «регуляторов G-
белкового сигналинга» (RGS-белки), наиболее важными среди
которых для сигнальной трансдукции являются различные
изоформы β-аррестинов.
В настоящее время у человека и млекопитающих
идентифицированы четыре различных β-аррестина причем
формы 1 и 4 выявлены только в светочувствительных клетках
сетчатки, в то время как формы 2 и 3, обозначаемые как β1- и β2-
аррестины, экспрессируются повсеместно. Первоначально
полагали, что основной функцией β-аррестинов является участие
в процессе гомологической десенситизации и запуск процессов
лиганд-индуцированного эндоцитоза рецепторных комплексов и
их дальнейшей деградации или рециклизации. Однако в
последние годы было установлено, что β-аррестины являются
важнейшими компонентами сигнальной трансдукции, опосредуя
активацию различных внутриклеточных сигнальных каскадов
(Shukla et al., 2011; Lefkowitz, 2013).
31
Показано, что началом гомологической десенситизации
рецепторов является GRK-опосредуемое фосфорилирование
активированного агонистом GPCR по серин/треонин-
содержащим сайтам, локализованным преимущественно в его C-
концевом домене. Это приводит к повышению аффинности
рецепторов к β-аррестинам и одновременно с этим способствует
нарушению функционального взаимодействия GPCR с α-
субъединицей G-белка, поскольку сайты связывания β-
аррестинов и Gα-субъединиц перекрываются. Образуя комплекс с
клатрином и адапторным белком-2, β-аррестины индуцируют
процесс клатрин-зависимого эндоцитоза лиганд-рецепторного
комплекса и его дальнейшую интернализацию, блокируя
сигнальную трансдукцию через G-белки (Ferguson, 2001).
Образующийся интернализованный комплекс рецептора и β-
аррестина способен формировать сигналосому, в составе которой
он активирует компоненты каскада МАПК – ERK1/2, p38-MAPK
и JNK3 (c-Jun N terminal kinase-3), регулируя, тем самым,
процессы роста и дифференцировки клеток, а также активность
антиапоптотических каскадов (Luttrell et al., 1998; McDonald et al.,
2000; Gong et al., 2008; Song et al., 2009).
Наряду с активацией МАПК-каскада комплекс β-
аррестина и GPCR может быть вовлечен в стимуляцию 3-
фосфоинозитидного пути и его основного эффекторного
компонента – фермента Akt-киназы, а также в регуляцию
активности цАМФ-специфичной фосфодиэстеразы 4-го типа
(DeWire et al., 2007). Показано также, что β-аррестины могут
опосредовать стимулирующее влияние активированных
лигандами GPCR на образование микро-РНК, как важнейших
компонентов ядерного сигналинга и регуляторов генной
экспрессии (Kim et al., 2014).
32
1.3. Избирательная активация внутриклеточных

сигнальных каскадов
Одной из ключевых проблем современной молекулярной

эндокринологии и биохимии является расшифровка тонких
механизмов, определяющих избирательность активации
гормонами и другими регуляторами GPCR внутриклеточных
сигнальных каскадов (Duc et al., 2015; Bologna et al., 2017; Zhou et
al., 2017; Edward Zhou et al., 2019; Seyedabadi et al., 2019). Как
отмечалось выше, GPCR обычно сопряжены сразу с несколькими
трансдукторами – гетеротримерными G-белками и адапторными
белками β-аррестинами. Следовательно, взаимодействие с
лигандом приводит к запуску сразу нескольких сигнальных
каскадов, реализуемых через эти трансдукторные белки. При
этом каждому сигнальному каскаду соответствует определенная
активная конформация GPCR, в которой он способен эффективно
взаимодействовать с определенным типом G-белка или β-
аррестина. Как полагают, в связанном с лигандом состоянии
рецептор может принимать несколько различных конформаций, в
каждой из которых он активирует только определенный
сигнальный каскад. Интенсивность передачи гормонального
сигнала через конкретный сигнальный каскад зависит от времени
пребывания GPCR в той конформации, в которой он способен
активировать целевой G-белок или β-аррестин, которые являются
трансдукторными компонентами именно этого сигнального
каскада.
Неселективная активация сразу нескольких сигнальных
каскадов при связывании с GPCR эндогенных лигандов или их
синтетических аналогов может привести к нежелательным
последствиям и снижению чувствительности рецептора к
агонисту. Потому в настоящее время большое внимание уделяют
созданию принципиально новых GPCR-регуляторов,
высокоселективных в отношении определенных сигнальных
каскадов. Такие лиганды, которые, как правило, представляют
33
собой синтетические аналоги эндогенных гормонов, способны
стабилизировать преимущественно одну активную конформацию
GPCR, в которой тот функционально взаимодействует с
определенным типом G-белка или β-аррестина, в результате чего
процесс сигнальной трансдукции становится векторным и
направлен на регуляцию вполне определенных внутриклеточных
эффекторных белков и транскрипционных факторов. Принцип
избирательной активации внутриклеточных сигнальных каскадов
положен в основу разработки новых поколений «таргетных»
лекарств, являющихся лигандами GPCR (Rankovic et al., 2016;
Bologna et al., 2017; Seyedabadi et al., 2019). Важной задачей
является «разделение» физиологических эффектов, достигаемых
при активации GPCR, на опосредуемые через гетеротримерные
G-белки или через β-аррестины, поскольку при запуске
аррестиновых путей неизбежно наступает десенситизация
рецепторов и снижается чувствительность тканей-мишеней к
GPCR-лигандам. В этом отношении большой интерес
представляют исследования молекулярных механизмов и
структурных детерминант в молекулах GPCR, позволяющих
селективно регулировать G-белок-зависимые и β-аррестин-
опосредуемые сигнальные пути.
При изучении аргинин-вазопрессинового рецептора 2-го
типа было показано, что за передачу сигнала с активированного
гормоном рецептора к гетеротримерным G-белкам отвечают
шестая ТМС и третья ЦП, в то время как за рекрутирование и
активацию β-аррестина – седьмая ТМС и расположенный в
проксимальном участке С-концевого домена спиральный H8-
сегмент (Rahmeh et al., 2012). Исследование молекулярных
механизмов взаимодействия с β2-адренергическим рецептором
селективных в отношении G-белков и β-аррестинов лигандов
позволило установить, что в случае активации G-белков в
наибольшей степени меняется ориентация и конформация шестой
ТМС, в то время как в случае β-аррестин-селективных лигандов
наиболее значительные конформационные изменения
обнаруживаются в седьмой ТМС (Liu et al., 2012). Показано, что
34
ведущую роль в переключении селективности активации
внутриклеточных сигнальных каскадов играет остаток Tyr308,
локализованный в седьмой ТМС β2-адренергического рецептора
(Woo et al., 2014). Важно отметить, что для активации β-
аррестиновых сигнальных путей фосфорилирование C-концевого
домена β2-адренергического рецептора не является обязательным,
и это указывает на определенную степень независимости
процессов активации β-аррестинов и десенситизации рецептора
(Woo et al., 2014).
Несмотря на то, что фосфорилирование GPCR не является
обязательным условием активации β-аррестинов, по крайней
мере, для некоторых рецепторов, паттерн фосфорилирования в
значительной степени определяет как особенности активации β-
аррестинов, так и векторность опосредуемого ими
внутриклеточного сигналинга. Паттерн фосфорилирования C-
концевого домена GPCR зависит от изоформ GRK-киназ, которые
рекрутируются активированным рецептором и осуществляют его
специфическое фосфорилирование по определенным сайтам-
мишеням. Такое фосфорилирование можно уподобить нанесению
специального «штрих-кода» на цитоплазматическую часть
молекулы рецептора, который предопределяет механизмы
взаимодействия β-аррестина с лиганд-рецепторным комплексом
и, соответственно, от которого зависит результат такого
взаимодействия – эндоцитоз и деградация рецептора или
формирование им сигналосомы (Butcher et al., 2011). Так,
например, β-аррестин-специфичный β-агонист карведиол при
связывании с β2-адренергическим рецептором рекрутирует
различные формы GRK-киназ, что приводит к паттерну
фосфорилирования С-концевого домена рецептора, отличному от
такового, вызываемого связыванием с рецептором
неселективного в отношении внутриклеточных каскадов β-
агониста изопротеренола, который также вызывает
рекрутирование и активацию β-аррестинов (Nobles et al., 2011).
Разнообразие эффектов β-аррестинов во многом
предопределяется множественностью их активных конформаций,
35
в которых они по-разному взаимодействуют с
фосфорилированными участками GPCR, а также различиями
функциональной активности β1- и β2-аррестинов. Так известно,
что процесс интернализации μ-опиоидного рецептора
опосредуется как через β1-, так и через β2-аррестины. При этом
μ-агонист морфин, способный активировать только β2-аррестин,
вызывает очень медленную интернализацию μ-опиоидного
рецептора, в то время как μ-агонист DAMGO, активирующий обе
формы β-аррестина, приводит к быстрой его интернализации.
Наряду с этим, в отличие от морфина, DAMGO через посредство
β1-аррестина с высокой интенсивностью стимулирует
убиквитинирование μ-опиоидного рецептора, что лежит в основе
его протеосомной деградации (Groer et al., 2011). Сходная
ситуация выявлена и в случае агонистов δ-опиоидного рецептора.
Показано, что δ-агонист SNC80, который рекрутирует β1-
аррестин в большей степени, чем β2-аррестин, вызывает быструю
и значительную интернализацию рецептора, в то время как
агонисты ARM390 и JNJ20788560, стимулирующие только β2-
аррестин, сравнительно слабо влияют на этот процесс (Pradhan et
al., 2016). В случае C-C-хемокинового рецептора 7-го типа
установлено, что агонист CCL19, с высокой эффективностью
стимулирующий интернализацию рецептора, вызывает
рекрутирование β2-аррестина и, в меньшей степени, β1-
аррестина, в то время как агонист CCL21, который очень слабо
стимулирует интернализацию рецептора, не способен
активировать β-аррестины (Byers et al., 2008). Обнаружено, что
различные по природе агонисты одного и того же рецептора
способны селективно активировать только какой-то один тип β-
аррестина. Так АТФ при связывании с P2Y2-пуринергическим
рецептором способствует образованию комплекса рецептора с
β1-аррестином, в то время как УТФ, другой P2Y2-агонист,
рекрутирует оба типа β-аррестинов (Hoffmann et al., 2008).
Далее будут более подробно рассмотрены множественные
сигнальные каскады, запускаемые гликопротеиновыми
гипофизарными гормонами: гонадотропинами –
36
лютеинизирующим гормоном (ЛГ), его структурным и
функциональным гомологом хорионическим гонадотропином
человека (ХГЧ) и фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ), а
также тиреотропным гормоном (ТТГ), основным регулятором
синтеза и секреции тиреоидных гормонов тироцитами
щитовидной железы.
1.4. Внутриклеточные сигнальные пути гонадотропинов
Показано, что активация рецепторов ЛГ и ФСГ

гонадотропинами приводит к активации: (1) аденилатциклазного
сигнального каскада, включающего активированный гормоном
рецептор, Gs-белок, фермент АЦ и цАМФ-зависимые эффекторы
– фермент протеинкиназу А и цАМФ-активируемые обменные
факторы семейства Epac, (2) фосфолипазного пути, который,
наряду с активированным рецептором, включает Gq/11-белок,
фермент фосфолипазу Сβ, катализирующую образование
вторичных посредников – инозитол-3,4,5-трифосфата и
диацилглицерина, и кальций-чувствительные эффекторные
белки, и (3) β-аррестиновых сигнальных путей через образование
функционально активных комплексов между
фосфорилированными формами рецепторов и β-аррестинами
(Ulloa-Aguirre et al., 2011, 2013; Riccetti et al., 2017a, 2017b).
Определенное значение также имеют сигнальные каскады,
включающие Gi/o-белок, через которые осуществляется
ингибирование активности АЦ, стимулированной
гормональными и негормональными агентами, в том числе
гонадотропинами, а также сигнальные пути, включающие
регуляторные белки APPL-семейства, через которые
осуществляется модуляция 3-фосфоинозитидных путей, а также
контролируется биогенез митохондрий и активность АМФ-
активируемой протеинкиназы.
Схемы основных сигнальных путей, контролируемых
гонадотропинами – ЛГ и ФСГ, представлены ниже (рис. 1-3, 1-4).
Паттерн сигнальных путей, которые активируются обоими
37
гонадотропинами в клетках мужской и женской репродуктивной
систем, а также в тканях с эктопической экспрессией рецепторов
ЛГ и ФСГ, может различаться. В процессе онтогенеза также
отмечаются значительные изменения архитектуры сигнальных
каскадов ЛГ и ФСГ, что необходимо учитывать при изучении
гонадотропиновой сигнализации.
Рис. 1-3. Сигнальные каскады, активируемые при связывании ЛГ с

рецептором ЛГ.
Условные обозначения: Gs, Gq/11 – гетеротримерные Gs- и Gq/11-белки,
АЦ – аденилатциклаза; ФЛС – фосфоинозитид-специфичная
фосфолипаза Сβ; цАМФ – циклический аденозинмонофосфат; И3Ф –
инозитол-3,4,5-трифосфат; [Ca2+]i – внутриклеточная концентрация
ионов кальция; ПКА – протеинкиназа А; ERK1/2 –
митогенактивируемые протеинкиназы ERK-семейства.
38
Рис. 1-4. Сигнальные каскады, активируемые при связывании ФСГ с

рецептором ФСГ.
Условные обозначения: Gi/o, Gs – гетеротримерные Gi/o- и Gs-белки;
βarr. – регуляторный белок β-аррестин; APPL – адаптерный APPL-
белок; АЦ – аденилатциклаза; EPAC – цАМФ-зависимый обменный
фактор Epac-семейства; ПКА – протеинкиназа А; p38 и ERK1/2 –
компоненты каскада митогенактивируемых протеинкиназ; AKT – Akt-
киназа; CREB – АМФ-зависимый транскрипционный фактор.
1.4.1. Влияние гонадотропинов на аденилатциклазную

сигнальную систему
Аденилатциклазная сигнальная система включает

рецептор ФСГ или ЛГ, Gs-белок и фермент АЦ, каталитический
компонент этой системы, ответственный за синтез вторичного
посредника цАМФ. Она является основным сигнальным
39
каскадом, который регулируется гонадотропинами в клетках-
мишенях. Наряду со стимулирующим влиянием на активность
АЦ, гонадотропины способны ингибировать АЦ через посредство
Gi/o-белка, что является наиболее короткой отрицательной
обратной связью, позволяющей достаточно быстро ослабить
избыточный стимулирующий эффект гонадотропинов на
аденилатциклазную систему (Landomiel et al., 2014). Стимуляция
АЦ гонадотропинами лежит в основе регуляции ими
стероидогенеза, как на уровне регуляции экспрессии генов
стероидогенных белков, так и на уровне стимуляции секреции
стероидных гормонов. Наряду с этим, стимулирующие эффекты
ФСГ, ЛГ и ХГЧ на аденилатциклазную сигнальную систему
вовлечены в реализацию других регуляторных эффектов этих
гормонов, таких как контроль клеточного роста,
дифференцировки и созревания репродуктивных клеток,
регуляция процессов сперматогенеза и фолликулогенеза.
Вследствие этого, именно АЦ и функционально сопряженные с
ней сигнальные белки играют определяющую роль в реализации
физиологических эффектов гонадотропинов.
Влияние ФСГ на аденилатциклазную сигнальную

систему
ФСГ-индуцированная активация АЦ и цАМФ-зависимой
протеинкиназы А вызывает фосфорилирование большого числа
эффекторных белков и транскрипционных факторов, ключевых
звеньев сигнальных каскадов, в том числе компонента каскада
МАПК – киназы ERK1/2 (Crépieux et al., 2001; Kara et al., 2006).
Описаны, по крайней мере, два основных механизма активации
киназы ERK1/2. В рамках первого механизма протеинкиназа А
фосфорилирует протеинфосфатазу, мишенью которой является
ERK1/2, что приводит к диссоциации комплекса фосфатазы и
ERK1/2. Высвобождение ERK1/2 делает ее мишенью для MEK-
киназы, вышележащего компонента каскада МАПК, которая
фосфорилирует ERK1/2 и переводит ее в активную форму
(Cottom et al., 2003). Второй механизм включает вызываемое
40
протеинкиназой А фосфорилирование протеинкиназы Raf1,
активирующей MEK-киназу. В дальнейшем MEK-киназа
активирует ERK1/2 (Yang, Roy, 2006; Ongeri et al., 2007).
Ингибирование активности протеинкиназы А снижает ФСГ-
индуцированную стимуляцию p38-MAPK, еще одного
компонента каскада МАПК, что ведет к нарушению процесса
сперматогенеза (Maizels et al., 1998; Yu et al., 2005). На основании
этих данных сделано заключение, что p38-MAPK, как и ERK1/2,
является мишенью для протеинкиназы А, активируемой ФСГ
через аденилатциклазную сигнальную систему.
ФСГ-индуцированная активация протеинкиназы А
приводит к фосфорилированию транскрипционного фактора
CREB, который усиливает экспрессию генов, включающих
регуляторные элементы CRE. Для идентификации таких генов
использовали конститутивно активированную форму
протеинкиназы А с повышенной базальной активностью,
независимой от цАМФ. При обработке клеток ФСГ и в
присутствии конститутивно активированной формы
протеинкиназы А повышалась экспрессия 108 генов, в то время
как экспрессия еще 48 генов стимулировалась только одним
ФСГ, по независимым от протеинкиназы А клеточным
механизмам. Так экспрессия гена, кодирующего белок StAR,
осуществляющий транспорт холестерина в митохондрии на
начальной стадии стероидогенеза, и экспрессия генов,
кодирующих ферменты стероидогенеза цитохром P450scc и 3β-
гидроксистероиддегидрогеназу, усиливались как при обработке
ФСГ, так и в присутствии конститутивно активированной формы
протеинкиназы А. В то же время экспрессия генов, кодирующих
фермент ароматазу (цитохром P450arom) и рецептор ЛГ,
повышалась только при действии ФСГ и не зависела от
активности протеинкиназы А (Escamilla-Hernandez et al., 2008).
Для выяснения роли цАМФ-зависимого фактора CREB в ФСГ-
опосредуемой регуляции экспрессии генов в клетках Сертоли
использовали аденовирусную конструкцию, кодирующую фактор
CREB с мутацией, предотвращающей его фосфорилирование
41
протеинкиназой А. Добавление аденовирусной конструкции к
культуре клеток Сертоли полностью подавляло стимулирующий
эффект ФСГ на экспрессию ряда генов, причем экспрессия
мутантного фактора CREB в семенных канальцах крысы
приводила к апоптозу сперматоцитов и нарушению
сперматогенеза, снижая на 75 % число морфологически
нормальных сперматид (Scobey et al., 2001).
Экспрессия в клетках гранулезы яичников конститутивно
активной Gαs-субъединицы с заменой Gln227Leu, делающей Gαs-
субъединицу неспособной гидролизовать ГТФ, так же как и
экспрессия в этих клетках конститутивно активной формы
протеинкиназы А, вызывала усиление экспрессии большого
числа генов. Их паттерн в значительной степени совпадал с
таковым, полученным при изучении мутантной формы
протеинкиназы А. В то же время экспрессия генов, кодирующих
ароматазу и рецептор ЛГ, при этом не менялась, что
свидетельствует об отсутствии влияния Gs-белок- и цАМФ-
зависимых механизмов на синтез ароматазы и рецептора ЛГ
(Zeleznik et al., 2003). Полученные данные указывают на то, что
хотя экспрессия большей части (примерно 2/3) генов
регулируется ФСГ через цАМФ-зависимые механизмы,
экспрессия остальной их части контролируется через
независимые от цАМФ сигнальные каскады (Ulloa-Aguirre et al.,
2011). Действительно, многие зависимые от ФСГ гены не
содержат в промоторном участке регуляторный элемент CRE,
основную мишень для транскрипционного фактора CREB. Здесь
возможны три механизма регуляции экспрессии таких генов: (1) в
результате активации протеинкиназы А, но без участия фактора
CREB, (2) в результате активации АЦ и повышения уровня
цАМФ, но без последующей активации протеинкиназы А (в
основном через активацию факторов Epac), (3) в результате
запуска цАМФ-независимых механизмов.
В пользу первого механизма свидетельствуют данные о
том, что ФСГ-индуцированная активация протеинкиназы А
может приводить к фосфорилированию гистона H3,
42
взаимодействующего с промоторными участками генов c-fos,
serum/glucocorticoid-inducible serine/threonine protein kinase (SGK)
и α-inhibin, и это положительно влияет на процесс
ремоделирования хроматина и лежит в основе зависимой от
протеинкиназы А, но независимой от фактора CREB регуляции
транскрипции генов (Salvador et al., 2001). Вызываемое ФСГ
изменение генной экспрессии может быть результатом
рекрутирования и активации β-аррестинов, которые способны
модифицировать гистоны и, тем самым, влиять на структурную
организацию хроматина, в том числе модулировать доступность
промоторных участков генов для фактора CREB.
Второй механизм включает вызываемую повышением
уровня цАМФ активацию обменных факторов семейства Epac
(Wayne et al., 2007). Установлено, что связывание цАМФ с этими
факторами приводит к стимуляции обмена гуаниновых
нуклеотидов в малых G-белках Rap-семейства, опосредуя
активацию Rap-зависимых сигнальных каскадов в клетках
гранулезы и в клетках поверхностного эпителия яичников (Wayne
et al., 2007; Choi et al., 2009). ФСГ-индуцированная активация
Rap-белков вызывает стимуляцию Akt-киназы и различных
компонентов каскада МАПК (p38, ERK1/2) (Wayne et al., 2007;
Choi et al., 2009). В пользу участия факторов Epac в
стимулирующих Akt-киназу эффектах ФСГ свидетельствуют
данные о том, что селективный ингибитор протеинкиназы А
(соединение H89) не влияет на ФСГ-стимулированную
активность Akt-киназы, в то время как селективные ингибиторы
фермента ФИ-3-К, которая регулируется факторами Epac-
семейства, подавляют стимулирующий эффект ФСГ (Gonzalez-
Robayna et al., 2000).
В пользу третьего механизма свидетельствуют данные об
участии в ФСГ-индуцированной регуляции генной экспрессии β-
аррестиновых путей, независимых от протеинкиназы А и фактора
CREB. При ингибировании цАМФ-зависимых сигнальных путей
способность ФСГ регулировать транскрипционную активность
генома полностью не утрачивается, что указывает на вовлечение
43
в эти процессы цАМФ-независимых механизмов (Wehbi et al.,
2010a, 2010b; Tranchant et al., 2011).
Влияние гонадотропинов с ЛГ-активностью на

аденилатциклазную сигнальную систему
Эффективность стимулирующего влияния ЛГ и ХГЧ на
активность АЦ существенно различается, поскольку ХГЧ
способен в большей степени активировать этот фермент в
сравнении с ЛГ. При этом ХГЧ в меньшей степени активирует
независимые от цАМФ сигнальные каскады, что предопределяет
различия фармакологического профиля ЛГ и ХГЧ. Так значение
ED50 для стимулирующего АЦ эффекта ХГЧ в культуре COS-7-
клеток в 5 раз ниже такового для ЛГ, что указывает на более
высокую эффективность ХГЧ в сравнении с ЛГ. В то же время
максимальный стимулирующий эффект ЛГ на активность АЦ
достигается быстрее, чем в случае ХГЧ, что свидетельствует о
различиях во временной динамике изменений чувствительности
аденилатциклазной сигнальной системы к действию этих
гонадотропинов, а также о различиях эффективности запуска
системы отрицательных обратных связей и модулирующих
активность АЦ сигнальных каскадов (Riccetti et al., 2017a).
Сходную картину отмечали при изучении АЦ эффектов ЛГ и
ХГЧ в клетках гранулезы яичников и в клетках Лейдига (Gupta et
al., 2012; Riccetti et al., 2017a). В то же время, стимулирующее
влияние ЛГ на активность киназы ERK1/2 и Akt-киназы в этих
клетках было выражено сильнее, чем таковое в случае ХГЧ
(Casarini et al., 2012; Gupta et al., 2012; Riccetti et al., 2017a).
Специфичность ХГЧ и ЛГ в отношении регуляции ими
внутриклеточных каскадов усиливается при их совместном
применении с ФСГ. При обработке клеток гранулезы смесью
ФСГ и ХГЧ отмечали пятикратное усиление стимулирующего
эффекта ХГЧ на внутриклеточный уровень цАМФ, а также
потенцирование эффекта ХГЧ на фосфорилирование фактора
CREB и зависимую от него продукцию прогестерона. На
стероидогенный эффект ЛГ добавление ФСГ практически не
44
влияло, но усиливало стимулирующие эффекты ЛГ на активность
киназы ERK1/2 и Akt-киназы, что приводило к подавлению
апоптоза в клетках гранулезы (Casarini et al., 2016b). Эти данные
объясняют наблюдаемые в условиях клиники сильно
выраженные пролиферативные эффекты ЛГ, выявляемые во
время фолликулярной фазы и после формирования трофобласта,
и мощный стероидогенный эффект ХГЧ, необходимый для
поддержания беременности после завершения лютеиновой фазы
(Casarini et al., 2016b).
В пользу существования различий в эффективности
действия ХГЧ и ЛГ на активность АЦ указывают результаты,
полученные при исследовании рецептора ЛГ с делецией 10-го
экзона, который сохранял способность связываться с обоими
гонадотропинами. Однако ХГЧ стимулировал активность АЦ и
повышал внутриклеточный уровень цАМФ, в то время как ЛГ
был в этом отношении не активен. Обработка коклюшным
токсином, вызывающая инактивацию Gi/o-белков, сопряженных с
рецептором ЛГ и ответственных за ингибирование АЦ, не
приводила к восстановлению стимулирующего эффекта ЛГ на
активность АЦ. Не было выявлено различий в десенситизации
мутантного рецептора при связывании с обоими
гонадотропинами, о чем свидетельствует сходство кинетики
изменений уровня цАМФ после удаления ЛГ и ХГЧ из
культуральной среды (Muller et al., 2003; Klett et al., 2016). Все
это позволяет заключить, что основной причиной различий
являются особенности конформационных перестроек,
вызываемые ХГЧ и ЛГ при связывании с рецептором, и более
выраженная способность ХГЧ стабилизировать активную
конформацию рецептора, в которой он способен эффективно
активировать Gs-белок (Muller et al., 2003). Важно также
отметить, что комплекс ХГЧ с рецептором ЛГ существует более
длительное время в сравнении с комплексом ЛГ–рецептор ЛГ,
что объясняет более длительную стимуляцию АЦ в случае ХГЧ
(Riccetti et al., 2017b).
45
1.4.2. Влияние фолликулостимулирующего и
лютеинизирующего гормонов на β-аррестиновые пути
После гормональной активации рецептор ФСГ

подвергается фосфорилированию различными
серин/треониновыми киназами, специфичными к GPCR – GRK2,
GRK3, GRK5 и GRK6 (Nakamura et al., 1998; Lazari et al., 1999;
Troispoux et al., 1999; Marion et al., 2002; Krishnamurthy et al.,
2003; Kara et al., 2006). Основным сайтом для взаимодействия с β-
аррестинами является цитоплазматический С-концевой домен
рецептора ФСГ, который содержит остатки серина и треонина,
мишени для киназ GRK-семейства. Эти остатки играют
ключевую роль в фосфорилировании рецептора ФСГ и в
процессе рекрутирования β-аррестинов (Kara et al., 2006). При
этом β-аррестины, фосфорилированные различными киназами
GRK-семейства, играют различную роль в регуляции сигнальных
путей ФСГ. Так GRK2/GRK3-опосредуемое фосфорилирование
приводит в основном к интернализации рецептора ФСГ, в то
время как GRK5/GRK6-опосредуемое фосфорилирование – как к
интернализации, так и к деградации рецептора ФСГ в лизосомах
(Kara et al., 2006). Вызываемое GRK5 и GRK6 фосфорилирование
рецептора ФСГ вовлечено в β-аррестин-опосредуемую
регуляцию ряда сигнальных каскадов, в том числе компонентов
каскада МАПК (Kara et al., 2006; Reiter, Lefkowitz, 2006). При
взаимодействии с фосфорилированным рецептором β-аррестины
стимулируют киназу ERK1/2, причем в отличие от быстрой G-
белок-опосредуемой активации ERK1/2, активация через
посредство β-аррестинов осуществляется медленнее. Если в
случае G-белок-опосредуемой активации ERK1/2 эффект ФСГ
является транзиторным, то при активации ERK1/2 через β-
аррестиновый путь он сохраняется длительное время (Kara et al.,
2006). Выявлены различия в регуляторных эффектах различных
форм β-аррестинов на сигнальные пути ФСГ, хотя и показано,
что как β1-, так и β2-аррестины вовлечены в процессы
интернализации и рециклизации рецепторов ФСГ (Nakamura et
46
al., 1998; Lazari et al., 1999; Kishi et al., 2002; Kara et al., 2006;
Piketty et al., 2006). От степени и паттерна фосфорилирования
рецептора ФСГ, паттерна рекрутированных изоформ β-аррестина,
микроокружения рецептора и β-аррестинов, зависит доля
рецепторов, которые после интернализации возвращаются в
плазматическую мембрану, доля рецепторов, деградирующих в
лизосомах, а также интенсивность и избирательность β-аррестин-
зависимых путей.
Имеются данные об участии β-аррестинов в
интернализации рецептора ЛГ и активации гонадотропинами с
ЛГ-активностью β-аррестин-зависимых сигнальных каскадов
(Nakamura et al., 1999; Ayoub et al., 2015, 2016; Casarini et al.,
2016a; Riccetti et al., 2017b). В отличие от ХГЧ, действие которого
ориентировано в основном на Gs-белок-опосредуемую
стимуляцию АЦ и не столь выражено в отношении β-
аррестиновых путей, в случае ЛГ рекрутирование и активация β-
аррестинов имеют в значительной степени большее значение для
реализации физиологических эффектов этого гонадотропина.
Этим обусловлено то, что ЛГ, как отмечалось выше,
эффективнее, чем ХГЧ, активирует ERK1/2 и Akt-киназу (Casarini
et al., 2012; Gupta et al., 2012; Riccetti et al., 2017a). Спектр
конформационных изменений в молекуле β2-аррестина,
связанного с рецептором ЛГ, при активации рецептора с
помощью ХГЧ в существенной степени отличается от такового
при активации рецептора с помощью ЛГ (Riccetti et al., 2017b).
Как известно, набор активных конформаций β2-аррестинов при
их взаимодействии с GPCR определяет селективность передачи
сигнала с GPCR к эффекторным системам клетки (Shukla et al.,
2006; Lee et al., 2016; Nuber et al., 2016).
Различные механизмы влияния ЛГ и ХГЧ на
пространственную структуру и активность β-аррестинов,
связанных с активированным рецептором ЛГ, определяют
дифференцированную регуляцию ими синтеза стероидных
гормонов – прогестерона и тестостерона (Ayoub et al., 2016).
Ингибирование экспрессии гена, кодирующего β2-аррестин,
47
приводило к сильно выраженному снижению ЛГ-
индуцированной продукции прогестерона, указывая на то, что ЛГ
является агонистом β-аррестиновых путей, которые, наряду с
цАМФ-зависимыми путями, вовлечены в синтез и секрецию
этого стероидного гормона. При этом снижение экспрессии гена
β2-аррестина не влияло на АЦ эффект ЛГ. В свою очередь,
стимулирующий эффект ХГЧ на продукцию прогестерона при
ингибировании экспрессии β2-аррестина менялся слабо, что
вызвано меньшим, в сравнении с ЛГ, влиянием ХГЧ на
рекрутирование и активацию β2-аррестина. В то же время
цАМФ-зависимый синтез тестостерона не зависел от способности
ХГЧ взаимодействовать с β2-аррестинами. Важно отметить, что
соотношение между цАМФ-зависимыми и β-аррестиновыми
сигнальными путями в различных типах клеток и при различных
физиологических состояниях сильно меняется, что имеет
большое значение для регуляции стероидогенеза,
фолликулогенеза, оогенеза и сперматогенеза на различных
стадиях репродуктивных циклов и в онтогенезе (Riccetti et al.,
2017b).
1.4.3. Влияние фолликулостимулирующего и

лютеинизирующего гормонов на фосфоинозитидные
сигнальные пути
Активация ФИ-3-К и комплекса mTOR играет важную

роль в реализации регуляторных эффектов ФСГ, включая
влияние гонадотропина на пролиферацию клеток
репродуктивной системы. ФСГ через посредство ФИ-3-К
регулирует транскрипцию большого числа генов (Park et al., 2005;
Musnier et al., 2009; Dupont et al., 2010). Интересно, что в
недифференцированных клетках репродуктивной системы ФСГ
стимулирует активность ФИ-3-К и накопление 3-
фосфоинозитидов, в то время как в дифференцированных
клетках, этот гонадотропин повышает активность фосфатазы
PTEN, негативного регулятора 3-фосфоинозитидных путей,
48
снижая уровень фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата (Dupont
et al., 2010). Таким образом, в зависимости от степени
дифференцировки и стадии развития клеток репродуктивной
системы ФСГ разнонаправлено действует на сигнальный путь,
включающий ФИ-3-К, Akt-киназу и Akt-зависимые эффекторные
белки и гены.
Молекулярные механизмы, лежащие в основе ФСГ-
индуцированной активации ФИ-3-К и Akt-киназы, достаточно
хорошо изучены (Gonzalez-Robayna et al., 2000; Alam et al., 2004,
2009; Meroni et al., 2004; Nechamen et al., 2004; Park et al., 2005;
McDonald et al., 2006; Chen et al., 2007; Fan et al., 2008, 2010).
Показано, что в репродуктивных клетках активация Akt-киназы с
помощью ФСГ приводит к фосфорилированию и инактивации
киназы-3 гликогенсинтетазы (Alam et al., 2009; Fan et al., 2010),
фосфорилированию и инактивации АМФ-активируемой
протеинкиназы, основного энергетического сенсора клетки
(Kayampilly, Menon, 2009), а также к инактивации
транскрипционных факторов FoxO3a и FoxO1, вовлеченных в
регуляцию экспрессии большого числа Akt-зависимых генов
(Cunningham et al., 2003; Nechamen et al., 2004; Park et al., 2005;
Chen et al., 2007; Fan et al., 2008; Musnier et al., 2009). Основной
мишенью Akt-киназы является комплекс mTOR, который
подвергается фосфорилированию и переходит в активированное
состояние (Chen et al., 2007; Fan et al., 2008; Musnier et al., 2009).
Наряду с этим, существует и Akt-независимый механизм ФСГ-
индуцированной активации mTOR, включающий активацию
киназы ERK1/2, которая фосфорилирует белок TSC2 и
выключает его из негативной регуляции белка Rheb,
активирующего mTOR (Alam et al., 2004; Lécureuil et al., 2005;
Kayampilly, Menon, 2007). Следствием активации комплекса
mTOR является усиление рибосомального синтеза белков, что
свидетельствует о способности ФСГ регулировать не только
процесс экспрессии генов, но и трансляционную активность
(Gloaguen et al., 2011).
49
Важную роль в ФСГ-опосредуемой активации 3-
фосфоинозитидного пути играет адаптерный белок APPL1,
который взаимодействует с различными цитоплазматическими
участками рецептора ФСГ (Nechamen et al., 2004). Активация
ФИ-3-К и Akt-киназы, вызываемая ФСГ через APPL1-зависимый
механизм, приводит к Akt-зависимому фосфорилированию
транскрипционного фактора FoxO1a, что препятствует его
нахождению в ядре и ингибирует влияние этого фактора на
экспрессию генов. Поскольку процесс фосфорилирования
фактора FoxO1a реализуется в сигналосомах, содержащих
активированные рецепторы ФСГ, можно предположить, что
перемещение внутрь клетки и направленный транспорт везикул,
включающих эти рецепторы, является одним из основных
механизмов регуляции FoxO1a-зависимой транскрипции (Dias et
al., 2010). Белок APPL1 может быть вовлечен и в другие ФСГ-
регулируемые сигнальные пути, включая фосфолипазный путь,
ответственный за регуляцию уровня внутриклеточного кальция
(Thomas et al., 2011).
1.5. Внутриклеточные сигнальные пути тиреотропного

гормона
Активация рецептора ТТГ, так же как и в случае

рецепторов гонадотропинов, вызывает активацию нескольких
внутриклеточных каскадов, что обусловлено способностью
рецептора ТТГ сопрягаться со всеми четырьмя классами
гетеротримерных G-белков – Gs-, Gq/11-, Gi/o- и G12/13-белками, а
также с β-аррестинами (Laugwitz et al., 1996; Buch et al., 2008;
Kleinau et al., 2017; Krieger et al., 2019). Наиболее важное
значение для контроля роста и дифференцировки тироцитов, а
также для продукции тиреоидных гормонов имеют ТТГ-
стимулируемые аденилатциклазный и фосфоинозитидный
сигнальные пути. Активация АЦ, повышение внутриклеточного
уровня цАМФ и стимуляция активности протеинкиназы А и
зависимых от нее эффекторных белков являются следствием
50
взаимодействия активированого гормоном рецептора ТТГ с Gs-
белками, в то время как ТТГ-индуцированная активация
фосфоинозитидного пути осуществляется через активацию Gq/11-
белков и ФЛСβ, что приводит к повышению внутриклеточного
уровня катионов кальция и активации чувствительных к
диацилглицерину изоформ протеинкиназы С (рис. 1-5).
Усиление кальциевой сигнализации в тироцитах является
одним из основных механизмов стимуляции синтеза и секреции
тиреоидных гормонов. Через посредство активации Gi/o-белков
осуществляется снижение ТТГ-индуцированной стимуляции АЦ
(короткая отрицательная обратная связь), а через посредство
активации G12/13-белков и через взаимодействие с β-аррестинами
регулируется активность каскада МАПК (Buch et al., 2008;
Kleinau et al., 2017). Показано, что βγ-димер, образующийся
вследствие активации и диссоциации G-белков, стимулирует
компоненты 3-фосфоинозитидного пути – ФИ-3-К и Akt-киназу,
усиливая экспрессию Akt-зависимых генов, причем источником
βγ-димера в тироцитах могут быть как Gi/o-, так и Gs-белки
(Zaballos et al., 2008).
В активном состоянии рецептор ТТГ образует
гомодимерный комплекс, стабилизированный
межмолекулярными дисульфидными связями между
эктодоменами (Kaczur et al., 2003). При этом рецептор ТТГ также
способен формировать гомоолигомерные комплексы,
включающие более двух молекул рецептора (Zoenen et al., 2012;
Latif et al., 2015; Kleinau et al., 2017). Нарушение формирования
комплексов ведет к снижению или полной потере способности
рецептора ТТГ отвечать на гормональное воздействие и
повышает его базальную активность. Показано, что в
стабилизацию димерного комплекса вовлечены внешние
поверхности пятой и шестой ТМС и, в меньшей степени, первой
и седьмой ТМС, в то время как вторая, третья и четвертая ТМС
важны в основном для образования олигомерных комплексов.
51
Рис. 1-5. Сигнальные каскады, активируемые при связывании ТТГ с

рецептором ТТГ.
Условные обозначения: Gs, Gq/11, G13 – гетеротримерные Gs-, Gq/11- и
G13-белки, АЦ – аденилатциклаза; ФЛСβ – фосфоинозитид-
специфичная фосфолипаза Сβ; β-arr. – регуляторный белок β-аррестин;
цАМФ – циклический аденозинмонофосфат; И3Ф – инозитол-3,4,5-
трифосфат; [Ca2+]i – внутриклеточная концентрация ионов кальция;
ПКА – протеинкиназа А; CREB – цАМФ-активируемый
транскрипционный фактор; RhoA – малый G-белок Ras-семейства с
ГТФазной активностью; ERK1/2 – митогенактивируемые
протеинкиназы ERK-семейства; p90 RSK – p90 рибосомальная S6-
киназа; PDK1 – фосфоинозитид-зависимая протеинкиназа-1; p70 S6K –
p70 рибосомальная S6-киназа; mTOR – протеинкиназа, являющаяся
мишенью для рапамицина (mammalian target of rapamycin); ПКС-ζ/λ –
протеинкиназа С-ζ/λ; STAT3 – транскрипционный фактор STAT-
семейства 3-го типа.
52
В средней части шестой ТМС локализован сегмент 629–
633, формирующий полтора оборота α-спирали, который играет
определяющую роль в стабилизации гомодимерного комплекса
рецептора ТТГ (Farid, Szkudlinski, 2004). Остатки Thr632 и Asp633
взаимодействуют с остатком Asn674, который включен в NPXXY-
мотив, локализованный на цитоплазматическом конце седьмой
ТМС. Замена остатка Asn674 на другие аминокислоты
препятствует такому взаимодействию, дестабилизируя
конформацию трансмембранного домена рецептора ТТГ
(Claeysen et al., 2002; Vassart et al., 2004). Для стабильности
трансмембранного домена рецептора ТТГ необходимыми
являются остатки 425–427 в первой ТМС и остатки 540, 543 и 547
в четвертой ТМС (Kaczur et al., 2003; Knudsen, Farud, 2004).
Важную роль в определении вектора сигнальной
трансдукции и селективности взаимодействия рецептора ТТГ с
различными типами G-белков и β-аррестинами играют участки
ЦП рецептора и их интерфейсы с ТМС (Шпаков, 2009; Kleinau et
al., 2017). Первая ЦП (441–450) вовлечена во взаимодействие с
Gq/11-белком, а также модулирует взаимодействие с ним других
цитоплазматических участков рецептора ТТГ (Kosugi, Mori,
1994). Замена сегмента 441–446 в этой петле рецептора ТТГ на
соответствующие сегменты α1- и β2-адренергических рецепторов
приводит к мутантным рецепторам ТТГ, не способным
активировать Gq/11-белок, притом, что мутантные рецепторы
сохраняют способность активировать Gs-белки и АЦ. На
взаимодействие с G-белками влияет и замена остатка Thr447 на
глутамин, причем мутантный рецептор не способен активировать
ни Gq/11-, ни Gs-белки. Таким образом, первая ЦП в рецепторе
ТТГ вносит заметный вклад во взаимодействие с G-белками,
формируя Gq/11-связывающую поверхность рецептора.
Вторая ЦП отвечает за переход рецептора ТТГ в
активированное состояние при связывании с гормоном и
вовлечена в формирование G-белок-связывающей поверхности
рецептора (Kosugi et al., 1994; Neumann et al., 2005). Замены
сегментов 525–527 и 528–532 в середине второй ЦП на
53
соответствующие сегменты β2-адренергического рецептора
нарушают взаимодействие мутантного рецептора с G-белками
(Kosugi et al., 1994). При замене сегмента 525–527 блокируется
взаимодействие мутантного рецептора ТТГ с Gs-белками и
снижается ТТГ-индуцированная активация Gq/11-белка, в то время
как при замене сегмента 528–532 нарушается активация Gq/11-
сопряженных сигнальных путей. Делеции сегментов 522–525,
526–530 и 531–534 и замены аминокислотных остатков в
сегментах 522–525 и 526–530 приводят к мутантным рецепторам
ТТГ со сниженной способностью активировать Gs-белки
(Neumann et al., 2005). Сделан вывод, что N-концевая часть
второй ЦП важна в основном для активации Gs-белков, в то время
как центральная часть второй ЦП в большей степени вовлечена в
активацию Gq/11-белков. При этом гидрофобные остатки Phe525,
Met527 и Leu529 второй ЦП взаимодействуют с гидрофобными
остатками Leu343 и Leu347, локализованными в C-концевом
сегменте αq/11-субъединицы Gq/11-белка, в то время как
заряженные остатки Arg528 и Asp530 второй ЦП взаимодействуют
с гидрофильными аминокислотными остатками,
локализованными в β2/β3-петле, α5-спирали, N- и С-концевых
сегментах αq/11-субъединицы Gq/11-белка (Claus et al., 2006).
Ключевую роль во взаимодействии рецептора ТТГ с
гетеротримерными G-белками, как и в большинстве других
GPCR, играет третья ЦП, в первую очередь, ее С-концевой
BBXXB-мотив (B – положительно заряженный аминокислотный,
остаток, Arg или Lys) (Chazenbalk et al., 1991; Kosugi et al., 1993;
Claus et al., 2006). Замена остатка Arg625 в BBXXB-мотиве третьей
ЦП рецептора ТТГ на аланин блокирует его взаимодействие с Gs-
белками и предотвращает активацию АЦ. Замена на аланин всех
трех положительно заряженных остатков Lys621, Lys624 и Arg625 не
только блокирует ТТГ-индуцированную стимуляцию АЦ, но и
нарушает посттрансляционный процессинг рецептора ТТГ
(Chazenbalk et al., 1991). BBXXB-мотив также участвует во
взаимодействии с Gq/11-белками, поскольку мутации Lys621Ala и
Ile622Ala, уменьшающие положительный заряд BBXXB-мотива, а
54
также введение в него отрицательно заряженной аминокислоты
(мутация Ile622Asp) или замена предшествующего BBXXB-мотиву
остатка Lys618 на аланин нарушают взаимодействие мутантного
рецептора ТТГ с Gq/11-белком (Claus et al., 2006). Установлено,
что определяющую роль во взаимодействии с Gq/11-белком
играют электростатические взаимодействия между положительно
заряженными остатками Lys618 и Lys621 С-концевого участка
третьей ЦП рецептора и отрицательно заряженными остатками
Asp313 и Asp315 β5/β6-петли αq/11-субъединицы. Наряду с С-
концевым участком во взаимодействие с Gq/11-белком вовлечен N-
концевой участок третьей ЦП (Biebermann et al., 1998; Claus et al.,
2006). Замены остатков Ile604, Tyr605 и Val608, расположенных на
границе пятой ТМС и третьей ЦП, на аланин приводят к
многократному снижению стимулирующего эффекта ТТГ на
фосфоинозитидный обмен.
Для эффективного взаимодействия с Gs- и Gq/11-белками и
с β-аррестинами важен цитоплазматический С-концевой домен
рецептора ТТГ, причем для образования функционально
активного комплекса с гетеротримерными G-белками наиболее
важен N-концевой участок этого домена, а для взаимодействия с
β-аррестинами – более отдаленные его участки, содержащие
сайты для фосфорилирования GRK-киназами. N-концевой
участок С-концевого домена включает дополнительную,
четвертую, ЦП, и следующий за ней сегмент (до Val721),
обогащенный положительно заряженными аминокислотными
остатками.
В рецепторе ТТГ важную роль во взаимодействии с
различными типами G-белков играют интерфейсы, образованные
проксимальными к мембране сегментами ЦП и ТМС (Biebermann
et al., 1998; Kaczur et al., 2003; Knudsen, Farud, 2004; Jaeschke et
al., 2008). Замена остатка Cys600 в сегменте 600–602,
расположенном на границе пятой ТМС и третьей ЦП, нарушает
связывание рецептора ТТГ с гормоном, а замена остатка Tyr601
подавляет функциональное сопряжение мутантного рецептора с
Gs- и Gq/11-белками (Jaeschke et al., 2008). К ингибированию
55
стимулирующего эффекта ТТГ на активность ФЛСβ ведут
замены остатков Leu512 (интерфейс между третьей ТМС и второй
ЦП) и Asn674 (интерфейс между седьмой ТМС и С-концевым
доменом), причем при одновременной замене сразу обоих
остатков отмечается многократное повышение базальной
активности рецептора ТТГ (в случае активации АЦ в 10–25 раз) и
значительное снижение чувствительности рецептора ТТГ к
гормону. Установлено, что стимулирующие эффекты ТТГ на
активность АЦ и фосфоинозитидный обмен в клетках с
экспрессированными в них рецепторами ТТГ, имеющими
мутации G431S/Y601N, M453T/Y601N, M453T/N674D, S505N/Y601N,
L512Q/Y601N или Y601N/A623V, снижаются в 1.6–2.7 и 6–12 раз,
соответственно. Сделан вывод о том, что для взаимодействия с
Gs-белками наиболее важны аминокислотные остатки,
локализованные во второй, шестой и седьмой ТМС, в то время
как для взаимодействия с Gq11-белками – остатки, расположенные
в первой, второй, третьей и шестой ТМС рецептора ТТГ (Jaeschke
et al., 2008).
Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты в рецепторах

серпантинного типа, ответственные за их функциональное сопряжение с
гетеротримерными G-белками // Цитология. 2002а. T. 44. № 3. C. 242–258.
Шпаков А.О. Роль -димеров ГТФ-связывающих белков в процессах
передачи гормонального сигнала // Журн. эвол. биохимии и физиологии. 2002б.
T. 38. № 6. C. 512–529.
Шпаков А.О. Молекулярные механизмы сопряжения гормональных
рецепторов с G-белками в аденилатциклазной сигнальной системе позвоночных
и беспозвоночных // Автореферат докторской диссертации. Санкт-Петербург,
2007. 40 с.
Шпаков А.О. Достижения в изучении структуры и функций
рецепторов, сопряженных с G-белками // Журн. эвол. биохимии и физиологии.
2013. T. 49. № 5. С. 323–332.
Шпаков А.О. Аденилатциклазная система в норме и при диабетической
патологии / Санкт-Петербург: Издательство Политехнического университета.
2016. 188 с. ISBN 978-5-7422-5337-2.
56
Шпаков А.О., Деркач К.В. Гормональные системы мозга и сахарный
диабет 2-го типа / Санкт-Петербург: Издательство Политехнического
университета. 2015. 252 с. ISBN 978-5-7422-4955-9.
Alam H., Maizels E. T., Park Y., Ghaey S., Feiger Z. J., Chandel N. S.,
Hunzicker-Dunn M. Follicle-stimulating hormone activation of hypoxia-inducible
factor-1 by the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT/Ras homolog enriched in brain
(Rheb)/mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway is necessary for induction
of select protein markers of follicular differentiation // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P.
19431–19440. doi: 10.1074/jbc.M401235200.
Alam H., Weck J., Maizels E., Park Y., Lee E. J., Ashcroft M., Hunzicker-
Dunn M. Role of the phosphatidylinositol-3-kinase and extracellular regulated kinase
pathways in the induction of hypoxia-inducible factor (HIF)-1 activity and the HIF-1
target vascular endothelial growth factor in ovarian granulosa cells in response to
follicle-stimulating hormone // Endocrinology. 2009. V. 150. P. 915–928. doi:
10.1210/en.2008-0850.
Alamer S., Kageyama Y., Gundersen R.E. Localization of palmitoylated and
activated G protein α-subunit in Dictyostelium discoideum // J. Cell. Biochem. 2018.
V. 119 (6). P. 4975–4989. doi: 10.1002/jcb.26689.
Ayoub M.A., Landomiel F., Gallay N., Jégot G., Poupon A., Crépieux P.,
Reiter E. Assessing Gonadotropin Receptor Function by Resonance Energy Transfer-
Based Assays // Front. Endocrinol. (Lausanne). 2015. V. 6. P. 130. doi:
10.3389/fendo.2015.00130.
Ayoub M.A., Yvinec R., Jégot G., Dias J.A., Poli S.M., Poupon A., Crépieux
P., Reiter E. Profiling of FSHR negative allosteric modulators on LH/CGR reveals
biased antagonism with implications in steroidogenesis // Mol. Cell. Endocrinol.
2016. V. 436. P. 10–22. doi: 10.1016/j.mce.2016.07.013.
Bakthavatsalam D., Choe J.M., Hanson N.E., Gomer R.H. A Dictyostelium
chalone uses G proteins to regulate proliferation // BMC Biol. 2009. V. 7. P. 44. doi:
10.1186/1741-7007-7-44.
Biebermann H., Schoneberg T., Schulz A., Krause G., Gruters A., Schultz
G., Gudermann T. A conserved tyrosine residue (Y601) in transmembrane domain 5
of the human thyrotropin receptor serves as a molecular switch to determine G-protein
coupling // FASEB J. 1998. V. 12 (14). P. 1461–1471. doi:
10.1096/fasebj.12.14.1461.
Birnbaumer L. Expansion of signal transduction by G proteins. The second
15 years or so: from 3 to 16 α subunits plus βγ dimmers // Biochim. Biophys. Acta.
2007. V. 1768 (4). P. 772–793. doi: 10.1016/j.bbamem.2006.12.002.
Bologna Z., Teoh J.P., Bayoumi A.S., Tang Y., Kim I.M. Biased G Protein-
Coupled Receptor Signaling: New Player in Modulating Physiology and Pathology //
Biomol. Ther. (Seoul). 2017. V. 25 (1). P. 12-25. doi: 10.4062/biomolther.2016.165.
Buch T.R., Biebermann H., Kalwa H., Pinkenburg O., Hager D., Barth H.,
Aktories K., Breit A., Gudermann T. G13-dependent activation of MAPK by
57
thyrotropin // J. Biol. Chem. 2008. V. 283 (29). P. 20330–20341. doi:
10.1074/jbc.M800211200.
Butcher A.J., Prihandoko R., Kong K.C., McWilliams P., Edwards J.M.,
Bottrill A., Mistry S., Tobin A.B. Differential G-protein-coupled receptor
phosphorylation provides evidence for a signaling bar code // J. Biol. Chem. 2011. V.
286. P. 11506–11518. doi: 10.1074/jbc.M110.154526.
Byers M.A., Calloway P.A., Shannon L., Cunningham H.D., Smith S., Li F.,
Fassold B.C., Vines C.M. Arrestin 3 mediates endocytosis of CCR7 following ligation
of CCL19 but not CCL21 // J. Immunol. 2008. V. 181. P. 4723–4732. doi:
10.4049/jimmunol.181.7.4723.
Casarini L., Lispi M., Longobardi S., Milosa F., La Marca A., Tagliasacchi
D., Pignatti E., Simoni M. LH and hCG action on the same receptor results in
quantitatively and qualitatively different intracellular signalling // PLoS One. 2012. V.
7. P. e46682. doi: 10.1371/journal.pone.0046682.
Casarini L., Reiter E., Simoni M. β-Arrestins regulate gonadotropin
receptor-mediated cell proliferation and apoptosis by controlling different FSHR or
LHCGR intracellular signaling in the hGL5 cell line // Mol. Cell. Endocrinol. 2016a.
V. 437. P. 11–21. doi: 10.1016/j.mce.2016.08.005.
Casarini L., Riccetti L., De Pascali F., Nicoli A., Tagliavini S., Trenti T., La
Sala G.B., Simoni M. Follicle-stimulating hormone potentiates the steroidogenic
activity of chorionic gonadotropin and the anti-apoptotic activity of luteinizing
hormone in human granulosa-lutein cells in vitro // Mol. Cell. Endocrinol. 2016b. V.
422. P. 103–114. doi: 10.1016/j.mce.2015.12.008.
Chazenbalk G.D., Nagayama Y., Wadsworth H., Russo D., Rapoport B.
Signal transduction by the human thyrotropin receptor: studies on the role of
individual amino acid residues in the carboxyl terminal region of the third
cytoplasmic loop // Mol. Endocrinol. 1991. V. 5. P. 1523–1526.
Chen Y.-J., Hsiao P.-W., Lee M.-T., Mason J. I., Ke F.-C., Hwang J.-J.
Interplay of PI3K and cAMP/PKA signaling, and rapamycin-hypersensitivity in
TGFbeta1 enhancement of FSH-stimulated steroidogenesis in rat ovarian granulosa
cells // J. Endocrinol. 2007. V. 192. P. 405–419. doi: 10.1677/JOE-06-0087.
Cherezov V., Rosenbaum D.M., Hanson M.A., Rasmussen S.G., Thian F.S.,
Kobilka T.S., Choi H.J., Kuhn P., Weis W.I., Kobilka B.K., Stevens R.C. High-
resolution crystal structure of an engineered human β2-adrenergic G protein-coupled
receptor // Science. 2007. V. 318 (5854). P. 1258–1265. doi:
10.1126/science.1150577.
Chien E.Y., Liu W., Zhao Q., Katritch V., Han G.W., Hanson M.A., Shi L.,
Newman A.H., Javitch J.A., Cherezov V., Stevens R.C. Structure of the human
dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist // Science. 2010.
V. 330 (6007). P. 1091–1095. doi: 10.1126/science.1197410.
Choi J.-H., Chen C.-L., Poon S.L., Wang H.-S., Leung P.C.K.
Gonadotropin-stimulated epidermal growth factor receptor expression in human
ovarian surface epithelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent exchange
58
protein activated by cAMP pathway // Endocr. Relat. Cancer. 2009. V. 16. P. 179–
188. doi: 10.1677/ERC-07-0238.
Claeysen S., Govaerts C., Lefort A., Van Sande J., Costagliola S., Pardo L.,
Vassart G. A conserved Asn in TM7 of the thyrotropin receptor is a common
requirement for activation by both mutations and its natural agonist // FEBS Lett.
2002. V. 517 (1-3). P. 195–200. doi: 10.1016/s0014-5793(02)02620-0.
Claus M., Neumann S., Kleinau G., Krause G., Paschke R. Structural
determinants for G-protein activation and specificity in the third intracellular loop of
the thyroid-stimulating hormone receptor // J. Mol. Med. 2006. V. 84 (11). P. 943–
954. doi: 10.1007/s00109-006-0087-8.
Cottom J., Salvador L.M., Maizels E.T., Reierstad S., Park Y., Carr D.W.,
Davare M.A., Hell J.W., Palmer S.S., Dent P., Kawakatsu H., Ogata M., Hunzicker-
Dunn M. Follicle stimulating hormone activates extracellular signal-regulated kinase
but not extracellular signal-regulated kinase kinase through a 100-kDa
phosphotyrosine phosphatase // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 7167–7179. doi:
10.1074/jbc.M203901200.
Crépieux P., Marion S., Martinat N., Fafeur V., Vern Y. L., Kerboeuf D.,
Guillou F., Reiter E. The ERK-dependent signalling is stage-specifically modulated
by FSH, during primary Sertoli cell maturation // Oncogene. 2001. V. 20. P. 4696–
4709. doi: 10.1038/sj.onc.1204632.
Cunningham M.A., Zhu Q., Unterman T.G., Hammond J.M. Follicle-
stimulating hormone promotes nuclear exclusion of the forkhead transcription factor
FoxO1a via phosphatidylinositol 3-kinase in porcine granulosa cells // Endocrinology.
2003. V. 144. P. 5585–5594. doi: 10.1210/en.2003-0678.
Defer N., Best-Belpomme M., Hanoune J. Tissue specificity and
physiological relevance of various isoforms of adenylyl cyclase // Am. J. Physiol.
Renal Physiol. 2000. V. 279. P. F400–F416.
DeWire S.M., Ahn S., Lefkowitz R.J., Shenoy S.K. β-arrestins and cell
signaling // Annu. Rev. Physiol. 2007. V. 69. P. 483–510. doi:
10.1146/annurev.physiol.69.022405.154749.
Dias J.A., Mahale S.D., Nechamen C.A., Davydenko O., Thomas R.M.,
Ulloa-Aguirre A. Emerging roles for the FSH receptor adapter protein APPL1 and
overlap of a putative 14-3-3τ interaction domain with a canonical G-protein
interaction site // Mol. Cell. Endocrinol. 2010. V. 329. P. 17–25. doi:
10.1016/j.mce.2010.05.009.
Dohlman H.G., Jones J.C. Signal activation and inactivation by the Gα
helical domain: a long-neglected partner in G protein signaling // Sci. Signal. 2012. V.
5. re2. doi: 10.1126/scisignal.2003013.
Dore A.S., Okrasa K., Patel J.C., Serrano-Vega M., Bennett K., Cooke
R.M., Errey J.C., Jazayeri A., Khan S., Tehan B., Weir M., Wiggin G.R., Marshall
F.H. Structure of class C GPCR metabotropic glutamate receptor 5 transmembrane
domain // Nature. 2014. V. 511 (7511). P. 557–562. doi: 10.1038/nature13396.
59
Duc N.M., Kim H.R., Chung K.Y. Structural mechanism of G protein
activation by G protein-coupled receptor // Eur. J. Pharmacol. 2015. V. 763 (Pt. B). P.
214–222. doi: 10.1016/j.ejphar.2015.05.016.
Dupont J., Musnier A., Decourtye J., Boulo T., Lécureuil C., Guillou H.,
Valet S., Fouchécourt S., Pitetti J.-L., Nef S., Reiter E., Crépieux P. FSH-stimulated
PTEN activity accounts for the lack of FSH mitogenic effect in prepubertal rat Sertoli
cells // Mol. Cell. Endocrinol. 2010. V. 315. P. 271–276. doi:
10.1016/j.mce.2009.09.016.
Edward Zhou X., Melcher K., Eric Xu H. Structural biology of G protein-
coupled receptor signaling complexes // Protein Sci. 2019. V. 28 (3). P. 487–501. doi:
10.1002/pro.3526.
Erlandson S.C., McMahon C., Kruse A.C. Structural Basis for G Protein-
Coupled Receptor Signaling // Annu. Rev. Biophys. 2018. doi: 10.1146/annurev-
biophys-070317-032931.
Escamilla-Hernandez R., Little-Ihrig L., Orwig K.E., Yue J., Chandran U.,
Zeleznik A.J. Constitutively active protein kinase A qualitatively mimics the effects of
follicle-stimulating hormone on granulosa cell differentiation // Mol. Endocrinol.
2008. V. 22 (8). P. 1842–1852. doi: 10.1210/me.2008-0103.
Fan H.-Y., Liu Z., Cahill N., Richards J.S. Targeted disruption of Pten in
ovarian granulosa cells enhances ovulation and extends the life span of luteal cells //
Mol. Endocrinol. 2008. V. 22. P. 2128–2140. doi: 10.1210/me.2008-0095.
Fan H.-Y., O’Connor A., Shitanaka M., Shimada M., Liu Z., Richards J.S.
Beta-catenin (CTNNB1) promotes preovulatory follicular development but represses
LH-mediated ovulation and luteinization // Mol. Endocrinol. 2010. V. 24. P. 1529–
1542. doi: 10.1210/me.2010-0141.
Farid N.R., Szkudlinski M.W. Minireview: structural and functional
evolution of the thyrotropin receptor // Endocrinology. 2004. V. 145 (9). P. 4048–
4057. doi: 10.1210/en.2004-0437.
Fenalti G., Giguere P.M., Katritch V., Huang X.P., Thompson A.A.,
Cherezov V., Roth B.L., Stevens R.C. Molecular control of δ-opioid receptor signaling
// Nature. 2014. V. 506 (7487). P. 191–196. doi: 10.1038/nature12944.
Ferguson S.S. Evolving concepts in G protein-coupled receptor endocytosis:
The role in receptor desensitization and signaling // Pharmacol. Rev. 2001. V. 53 (1).
P. 1–24.
Fredriksson R., Lagerstrom M.C., Lundin L.G., Schioth H.B. The G-protein-
coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic
analysis, paralogon groups, and fingerprints // Mol. Pharmacol. 2003. V. 63 (6). P.
1256–1272. doi: 10.1124/mol.63.6.1256.
Gloaguen P., Crépieux P., Heitzler D., Poupon A., Reiter E. Mapping the
follicle-stimulating hormone-induced signaling networks // Front. Endocrinol.
(Lausanne). 2011. V. 2. P. 45. doi: 10.3389/fendo.2011.00045.
Gong K.Z., Li Z.J., Xu M., Du J.H., Lv Z.Z., Zhang Y.Y. A novel protein
kinase A-independent, β-arrestin-1-dependent signaling pathway for p38 mitogen-
60
activated protein kinase activation by β2-adrenergic receptors // J. Biol. Chem. 2008.
V. 283. P. 29028–29036. doi: 10.1074/jbc.M801313200.
Gonzalez-Robayna I.J., Falender A.E., Ochsner S., Firestone G.L., Richards
J.S. FSH stimulates phosphorylation and activation of protein kinase B (PKB/Akt)
and serum and glucocorticoid-induced kinase (Sgk): evidence for A kinase--
independent signaling in granulosa cells // Mol. Endocrinol. 2000. V. 14. P. 1283–
1300. doi: 10.1210/mend.14.8.0500.
Grandoch M., Roscioni S.S., Schmidt M. The role of Epac proteins, novel
cAMP mediators, in the regulation of immune, lung and neuronal function // Br. J.
Pharmacol. 2010. V. 159. P. 265–284.
Granier S., Manglik A., Kruse A.C., Kobilka T.S., Thian F.S., Weis W.I.,
Kobilka B.K. Structure of the δ-opioid receptor bound to naltrindole // Nature. 2012.
V. 485 (7398). P. 400–404. doi: 10.1038/nature11111.
Groer C.E., Schmid C.L., Jaeger A.M., Bohn L.M. Agonist-directed
interactions with specific β-arrestins determine muopioid receptor trafficking,
ubiquitination and dephosphorylation // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. P. 31731–31741.
doi: 10.1074/jbc.M111.248310.
Gupta C., Chapekar T., Chhabra Y., Singh P., Sinha S., Luthra K.
Differential response to sustained stimulation by hCG & LH on goat ovarian
granulosa cells // Ind. J. Med. Res. 2012. V. 135. P. 331–340. doi: 10.4103/0971-
5916.93429.
Haga K., Kruse A.C., Asada H., Yurugi-Kobayashi T., Shiroishi M., Zhang
C., Weis W.I., Okada T., Kobilka B.K., Haga T., Kobayashi T. Structure of the human
M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist // Nature. 2012. V. 482
(7386). P. 547–551. doi: 10.1038/nature10753.
Hamm H.E. The many faces of G protein signaling // J. Biol. Chem. 1998.
V. 273. P. 669–672. doi: 10.1074/jbc.273.2.669.
Hanson M.A., Roth C.B., Jo E., Griffith M.T., Scott F.L., Reinhart G.,
Desale H., Clemons B., Cahalan S.M., Schuerer S.C., Sanna M.G., Han G.W., Kuhn
P., Rosen H., Stevens R.C. Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor //
Science. 2012. V. 335 (6070). P. 851–855. doi: 10.1126/science.1215904.
Hoffmann C., Ziegler N., Reiner S., Krasel C., Lohse M.J. Agonist-selective,
receptor-specific interaction of human P2Y receptors with β-arrestin-1 and -2 // J.
Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 30933–30941. doi: 10.1074/jbc.M801472200.
Hollenstein K., Kean J., Bortolato A., Cheng R. K., Dore A. S., Jazayeri A.,
Cooke R.M., Weir M., Marshall F.H. Structure of class B GPCR corticotropin-
releasing factor receptor 1 // Nature. 2013. V. 499 (7459). P. 438–443. doi:
10.1038/nature12357.
Hurley J.H. Structure, mechanism, and regulation of mammalian adenylyl
cyclase // J. Biol. Chem. 1999. V. 274 (12). P. 7599–7602. doi:
10.1074/jbc.274.12.7599.
Jaakola V.P., Griffith M.T., Hanson M.A., Cherezov V., Chien E.Y., Lane
J.R., Ijzerman A.P., Stevens R.C. The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A
61
adenosine receptor bound to an antagonist // Science. 2008. V. 322 (5905). P. 1211–
1217. doi: 10.1126/science.1164772.
Jaschke H., Kleinau G., Sontheimer J., Mueller S., Krause G., Paschke R.
Preferences of transmembrane helices for cooperative amplification of Gαs and Gαq
signaling of the thyrotropin receptor // Cell. Mol. Life Sci. 2008. V. 65 (24). P. 4028–
4038. doi: 10.1007/s00018-008-8530-3.
Kaczur V., Puskas L.G., Takacs M., Racz I.A., Szendroi A., Toth S., Nagy Z.,
Szalai C., Balazs C., Falus A., Knudsen B., Farid N.R. Evolution of the thyrotropin
receptor: a G protein coupled receptor with an intrinsic capacity to dimerize // Mol.
Genet. Metab. 2003. V. 78 (4). P. 275–290.
Kamp M.E., Liu Y., Kortholt A. Function and Regulation of Heterotrimeric
G Proteins during Chemotaxis // Int. J. Mol. Sci. 2016. V. 17 (1). P. pii: E90. doi:
10.3390/ijms17010090.
Kara E., Crépieux P., Gauthier C., Martinat N., Piketty V., Guillou F., et al.
A phosphorylation cluster of five serine and threonine residues in the C-terminus of
the follicle-stimulating hormone receptor is important for desensitization but not for
beta-arrestin-mediated ERK activation // Mol. Endocrinol. 2006. V. 20. P. 3014–3026.
doi: 10.1210/me.2006-0098.
Katritch V., Cherezov V., Stevens R.C. Diversity and modularity of G
protein-coupled receptor structures // Trends Pharmacol. Sci. 2012. V. 33 (1). P. 17–
27. doi: 10.1016/j.tips.2011.09.003.
Katritch V., Cherezov V., Stevens R.C. Structure-function of the G protein-
coupled receptor superfamily // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2013. V. 53. P. 531-
556. doi: 10.1146/annurev-pharmtox-032112-135923.
Kayampilly P.P., Menon K.M.J. Follicle-stimulating hormone increases
tuberin phosphorylation and mammalian target of rapamycin signaling through an
extracellular signal-regulated kinase-dependent pathway in rat granulosa cells //
Endocrinology. 2007. V. 148. P. 3950–3957. doi: 10.1210/en.2007-0202.
Kim I.M., Wang Y.C., Park K.M., Tang Y.P., Teoh J.P., Vinson J.,
Traynham C.J., Pironti G., Mao L., Su H.B., Johnson J.A., Koch W.J., Rockman H.A.
β-arrestin1-biased β1-adrenergic receptor signaling regulates microRNA processing //
Circ. Res. 2014. V. 114. P. 833–844. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.114.302766.
Kishi H., Krishnamurthy H., Galet C., Bhaskaran R.S., Ascoli M.
Identification of a short linear sequence present in the C-terminal tail of the rat
follitropin receptor that modulates arrestin-3 binding in a phosphorylation-
independent fashion // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 21939–21946. doi:
10.1074/jbc.M111365200.
Kleinau G., Worth C.L., Kreuchwig A., Biebermann H., Marcinkowski P.,
Scheerer P., Krause G. Structural-Functional Features of the Thyrotropin Receptor: A
Class A G-Protein-Coupled Receptor at Work // Front. Endocrinol. (Lausanne). 2017.
V. 8. P. 86. doi: 10.3389/fendo.2017.00086.
Klett D., Meslin P., Relav L., Nguyen T.M., Mariot J., Jégot G., Cahoreau
C., Combarnous Y. et al. Low reversibility of intracellular cAMP accumulation in
62
mouse Leydig tumor cells (MLTC-1) stimulated by human Luteinizing Hormone
(hLH) and Chorionic Gonadotropin (hCG) // Mol. Cell. Endocrinol. 2016. V. 434. P.
144–153. doi: 10.1016/j.mce.2016.06.028.
Knudsen B., Farid N.R. Evolutionary divergence of thyrotropin receptor
structure // Mol. Genet. Metab. 2004. V. 81 (4). P. 322–334. doi:
10.1016/j.ymgme.2004.01.010.
Kobilka B.K. G protein coupled receptor structure and activation // Biochim.
Biophys. Acta. 2007. V. 1768 (4). P. 794–807. doi: 10.1016/j.bbamem.2006.10.021.
Kosugi S., Kohn L.D., Akamizu T., Mori T. The middle portion in the second
cytoplasmic loop of the thyrotropin receptor plays a crucial role in adenylate cyclase
activation // Mol. Endocrinol. 1994. V. 8 (4). P. 498–509. doi:
10.1210/mend.8.4.7914349.
Kosugi S., Mori T. The first cytoplasmic loop of the thyrotropin receptor is
important for phosphoinositide signaling but not for agonist-induced adenylate
cyclase activation // FEBS Lett. 1994. V. 341 (2-3). P. 162–166. doi: 10.1016/0014-
5793(94)80449-4.
Kosugi S., Okajima F., Ban T., Hidaka A., Shenker A., Kohn L.D.
Substitutions of different regions of the third cytoplasmic loop of the thyrotropin
(TSH) receptor have selective effects on phosphoinositide and 3’,5’-cyclic adenosine
monophosphate signal generation // Mol. Endocrinol. 1993. V. 7 (8). P. 1009–1020.
doi: 10.1210/mend.7.8.7901757.
Krieger C.C., Boutin A., Jang D., Morgan S.J., Banga J.P., Kahaly G.J.,
Klubo-Gwiezdzinska J., Neumann S., Gershengorn M.C. Arrestin-β-1 Physically
Scaffolds TSH and IGF1 Receptors to Enable Crosstalk // Endocrinology. 2019. V.
160 (6). P. 1468–1479. doi: 10.1210/en.2019-00055.
Krishnamurthy H., Galet C., Ascoli M. The association of arrestin-3 with
the follitropin receptor depends on receptor activation and phosphorylation // Mol.
Cell. Endocrinol. 2003. V. 204. P. 127–140. doi: 10.1016/S0303-7207(03)00088-1.
Kruse A.C., Hu J., Pan A.C., Arlow D.H., Rosenbaum D.M., Rosemond E.,
Green H.F., Liu T., Chae P.S., Dror R.O., Shaw D.E., Weis W.I., Wess J., Kobilka
B.K. Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor // Nature.
2012. V. 482 (7386). P. 552–556. doi: 10.1038/nature10867.
Lagerstrom M.C., Schioth H.B. Structural diversity of G protein-coupled
receptors and significance for drug discovery // Nat. Rev. Drug Discov. 2008. V. 7
(4). P. 339–357. doi: 10.1038/nrd2518.
Landomiel F., Gallay N., Jégot G., Tranchant T., Durand G., Bourquard T.,
Crépieux P., Poupon A., Reiter E. Biased signalling in follicle stimulating hormone
action // Mol. Cell. Endocrinol. 2014. V. 382 (1). P. 452–459. doi:
10.1016/j.mce.2013.09.035.
Latek D., Modzelewska A., Trzaskowski B., Palczewski K., Filipek S. G
protein-coupled receptors--recent advances // Acta Biochim. Pol. 2012. V. 59 (4). P.
515–529.
63
Latif R., Ali M.R., Mezei M., Davies T.F. Transmembrane domains of
attraction on the TSH receptor // Endocrinology. 2015. V. 156 (2). P. 488–498. doi:
10.1210/en.2014-1509.
Laugwitz K.L., Allgeier A., Offermanns S., Spicher K., Van Sande J.,
Dumont J.E., Schultz G. The human thyrotropin receptor: a heptahelical receptor
capable of stimulating members of all four G protein families // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 1996. V. 93 (1). P. 116–120. doi: 10.1073/pnas.93.1.116.
Lazari M.F., Liu X., Nakamura K., Benovic J.L., Ascoli M. Role of G
protein-coupled receptor kinases on the agonist-induced phosphorylation and
internalization of the follitropin receptor // Mol. Endocrinol. 1999. V. 13. P. 866–878.
doi: 10.1210/mend.13.6.0289.
Lécureuil C., Tesseraud S., Kara E., Martinat N., Sow A., Fontaine I.,
Gauthier C., Reiter E., Guillou F., Crépieux P. Follicle-stimulating hormone activates
p70 ribosomal protein S6 kinase by protein kinase A-mediated dephosphorylation of
Thr 421/Ser 424 in primary Sertoli cells // Mol. Endocrinol. 2005. V. 19. P. 1812–
1820. doi: 10.1210/me.2004-0289.
Lee M.H., Appleton K.M., Strungs E.G., Kwon J.Y., Morinelli T.A., Peterson
Y.K., Laporte S.A., Luttrell L.M. The conformational signature of beta-arrestin2
predicts its trafficking and signalling functions // Nature. 2016. V. 531. P. 665–668.
doi: 10.1038/nature17154.
Lefkowitz R.J. Seven transmembrane receptors: a brief personal
retrospective // Biochim. Biophys. Acta. 2007a. V. 1768. P. 748–755.
Lefkowitz R.J. Seven transmembrane receptors: something old, something
new // Acta Physiol. (Oxf.). 2007b. V. 190. P. 9–19.
Lefkowitz R.J. Arrestins come of age: a personal historical perspective //
Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 2013. V. 118. P. 3–18. doi: 10.1016/B978-0-12-394440-
5.00001-2.
Lin Y., Smrcka A.V. Understanding molecular recognition by G protein βγ
subunits on the path to pharmacological targeting // Mol. Pharmacol. 2011. V. 80. P.
551–557.
Liu J.J., Horst R., Katritch V., Stevens R.C., Wuthrich K. Biased signaling
pathways in β2-adrenergic receptor characterized by 19F-NMR // Science. 2012. V.
335. P. 1106–1110. doi: 10.1126/science.1215802.
Luttrell L.M., Ferguson S.S., Daaka Y., Miller W.E., Maudsley S., Della
Rocca G.J., Lin F.T., Kawakatsu H., Owada K., Luttrell D.K., Caron M.G., Lefkowitz
R.J. β-arrestin-dependent formation of β(2) adrenergic receptor-Src protein kinase
complexes // Science. 1999. V. 283. P. 655–661. doi: 10.1126/science.283.5402.655.
Maeda A., Okano K., Park P.S., Lem J., Crouch R.K., Maeda T., Palczewski
K. Palmitoylation stabilizes unliganded rod opsin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010.
V. 107. P. 8428–8433.
Mahoney J.P., Sunahara R.K. Mechanistic insights into GPCR-G protein
interactions // Curr. Opin. Struct. Biol. 2016. V. 41. P. 247–254. doi:
10.1016/j.sbi.2016.11.005.
64
Maizels E.T., Cottom J., Jones J.C.R., Hunzicker-Dunn M. Follicle
stimulating hormone (FSH) activates the p38 mitogen-activated protein kinase
pathway, inducing small heat shock protein phosphorylation and cell rounding in
immature rat ovarian granulosa cells // Endocrinology. 1998. V. 139. P. 3353–3356.
doi: 10.1210/endo.139.7.6188.
Manglik A., Kruse A.C., Kobilka T.S., Thian F.S., Mathiesen J.M., Sunahara
R.K., Pardo L., Weis W.I., Kobilka B.K., Granier S. Crystal structure of the μ-opioid
receptor bound to a morphinan antagonist // Nature. 2012. V. 485. P. 321–326.
Marion S., Robert F., Crepieux P., Martinat N., Troispoux C., Guillou F.,
Reiter E. G protein-coupled receptor kinases and beta arrestins are relocalized and
attenuate cyclic 3′,5′-adenosine monophosphate response to follicle-stimulating
hormone in rat primary Sertoli cells // Biol. Reprod. 2002. V. 66. P. 70–76. doi:
10.1095/biolreprod66.1.70.
McDonald C.A., Millena A.C., Reddy S., Finlay S., Vizcarra J., Khan S.A.,
Davis J.S. Follicle-stimulating hormone-induced aromatase in immature rat Sertoli
cells requires an active phosphatidylinositol 3-kinase pathway and is inhibited via the
mitogen-activated protein kinase signaling pathway // Mol. Endocrinol. 2006. V. 20.
P. 608–618. doi: 10.1210/me.2005-0245.
McDonald P.H., Chow C.W., Miller W.E., Laporte S.A., Field M.E., Lin
F.T., Davis R.J., Lefkowitz R.J. β-arrestin 2: a receptor-regulated MAPK scaffold for
the activation of JNK3 // Science. 2000. V. 290. P. 1574–1577. doi:
10.1126/science.290.5496.1574.
McKee E.E., Bentley A.T., Smith R.M., Jr., Ciaccio C.E. Origin of guanine
nucleotides in isolated heart mitochondria // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999.
V. 257. P. 466–472.
Meroni S.B., Riera M.F., Pellizzari E.H., Galardo M.N., Cigorraga S.B.
FSH activates phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway in 20-
day-old Sertoli cells independently of IGF-I // J. Endocrinol. 2004. V. 180. P. 257–
265. doi: 10.1677/joe.0.1800257.
Mirzadegan T., Benko G., Filipek S., Palczewski K. Sequence analyses of
G-protein-coupled receptors: similarities to rhodopsin // Biochemistry. 2003. V. 42. P.
2759–2767.
Muller D.J., Wu N., Palczewski K. Vertebrate membrane proteins: structure,
function, and insights from biophysical approaches // Pharmacol. Rev. 2008. V. 60. P.
43–78.
Muller T., Gromoll J., Simoni M. Absence of exon 10 of the human
luteinizing hormone (LH) receptor impairs LH, but not human chorionic gonadotropin
action // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003. V. 88. P. 2242–2249. doi: 10.1210/jc.2002-
021946.
Musnier A., Heitzler D., Boulo T., Tesseraud S., Durand G., Lécureuil C.,
Guillou H., Poupon A., Reiter E., Crépieux P. Developmental regulation of p70 S6
kinase by a G protein-coupled receptor dynamically modelized in primary cells //
Cell. Mol. Life Sci. 2009. V. 66. P. 3487–3503. doi: 10.1007/s00018-009-0134-z.
65
Nakamura K., Krupnick J.G., Benovic J.L., Ascoli M. Signaling and
phosphorylation-impaired mutants of the rat follitropin receptor reveal an activation-
and phosphorylation-independent but arrestin-dependent pathway for internalization //
J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 24346–24354.
Nakamura K., Lazari M.F., Li S., Korgaonkar C., Ascoli M. Role of the rate
of internalization of the agonist-receptor complex on the agonist-induced down-
regulation of the lutropin/choriogonadotropin receptor // Mol. Endocrinol. 1999. V.
13. P. 1295–1304. doi: 10.1210/mend.13.8.0331.
Nechamen C.A., Thomas R.M., Cohen B.D., Acevedo G., Poulikakos P.I.,
Testa J.R., et al. Human follicle-stimulating hormone (FSH) receptor interacts with
the adaptor protein APPL1 in HEK 293 cells: potential involvement of the PI3K
pathway in FSH signaling // Biol. Reprod. 2004. V. 71. P. 629–636. doi:
10.1095/biolreprod.103.025833.
Neumann S., Krause G., Claus M., Paschke R. Structural determinants for G
protein activation and selectivity in the second intracellular loop of the thyrotropin
receptor // Endocrinology. 2005. V. 146. P. 477–485.
Nobles K.N., Xiao K.H., Ahn S., Shukla A.K., Lam C.M., Rajagopal S.,
Strachan R.T., Huang T.Y., Bressler E.A., Hara M.R., Shenoy S.K., Gygi S.P.,
Lefkowitz R.J. Distinct phosphorylation sites on the β2-adrenergic receptor establish a
barcode that encodes differential functions of β-arrestin // Sci. Signal. 2011. V. 4. P.
ra51. doi: 10.1126/scisignal.2001707.
Nuber S., Zabel U., Lorenz K., Nuber A., Milligan G., Tobin A.B., Lohse
M.J., Hoffmann C. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent
activation/deactivation cycle // Nature. 2016. V. 531. P. 661–664. doi:
10.1038/nature17198.
Ongeri E.M., Verderame M.F., Hammond J.M. The TATA binding protein
associated factor 4b (TAF4b) mediates FSH stimulation of the IGFBP-3 promoter in
cultured porcine ovarian granulosa cells // Mol. Cell. Endocrinol. 2007. V. 278. P. 29–
35. doi: 10.1016/j.mce.2007.08.004.
Palczewski K., Kumasaka T., Hori T., Behnke C.A., Motoshima H., et al.
Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor // Science. 2000. V. 289.
P. 739–745.
Park J.H., Scheerer P., Hofmann K.P., Choe H.W., Ernst O.P. Crystal
structure of the ligand-free G-protein-coupled receptor opsin // Nature. 2008. V. 454.
P. 183–187.
Park S.H., Das B.B., Casagrande F., Tian Y., Nothnagel H.J., Chu M.,
Kiefer H., Maier K., De Angelis A.A., Marassi F.M., Opella S.J. Structure of the
chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers // Nature. 2012. V. 491. P. 779–
783.
Park Y., Maizels E.T., Feiger Z. J., Alam H., Peters C.A., Woodruff T.K.,
Unterman T.G., Lee E.J., Jameson J.L., Hunzicker-Dunn M. Induction of cyclin D2 in
rat granulosa cells requires FSH-dependent relief from FOXO1 repression coupled
66
with positive signals from Smad // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 9135–9148. doi:
10.1074/jbc.M504011200.
Pele J., Abdi H., Moreau M., Thybert D., Chabbert M. Multidimensional
scaling reveals the main evolutionary pathways of class A G-protein-coupled
receptors // PLoS One. 2011. V. 6. P. e19094. doi: 10.1371/journal.pone.0019094.
Piketty V., Kara E., Guillou F., Reiter E., Crepieux P. Follicle-stimulating
hormone (FSH) activates extracellular signal-regulated kinase phosphorylation
independently of beta-arrestin- and dynamin-mediated FSH receptor internalization //
Reprod. Biol. Endocrinol. 2006. V. 4. P. 33–44. doi: 10.1186/1477-7827-4-33.
Pradhan A.A., Perroy J., Walwyn W.M., Smith M.L., Vicente-Sanchez A.,
Segura L., Bana A., Kieffer B.L., Evans C.J. Agonist-specific recruitment of arrestin
isoforms differentially modify delta opioid receptor function // J. Neurosci. 2016. V.
36. P. 3541–3551. doi: 10.1523/JNEUROSCI.4124-15.2016.
Rahmeh R., Damian M., Cottet M., Orcel H., Mendre C., Durroux T.,
Sharma K.S., Durand G., Pucci B., Trinquet E., Zwier J.M., Deupi X., Bron P.,
Baneres J.L., Mouillac B., Granier S. Structural insights into biased G protein-
coupled receptor signaling revealed by fluorescence spectroscopy // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 2012. V. 109. P. 6733–6738. doi: 10.1073/pnas.1201093109.
Rankovic Z., Brust T.F., Bohn L.M. Biased agonism: An emerging paradigm
in GPCR drug discovery // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2016. V. 26. P. 241–250. doi:
10.1016/j.bmcl.2015.12.024.
Rasmussen S.G., Choi H.J., Rosenbaum D.M., Kobilka T.S., Thian F.S.,
Edwards P.C., Burghammer M., Ratnala V.R., Sanishvili R., Fischetti R.F., Schertler
G.F., Weis W.I., Kobilka B.K. Crystal structure of the human beta2 adrenergic G-
protein-coupled receptor // Nature. 2007. V. 450. P. 383–387.
Reiter E., Lefkowitz R.J. GRKs and beta-arrestins: roles in receptor
silencing, trafficking and signaling // Trends Endocrinol. Metab. 2006. V. 17. P. 159–
165. doi: 10.1016/j.tem.2006.03.008.
Riccetti L., De Pascali F., Gilioli L., Potì F., Giva L.B., Marino M.,
Tagliavini S., Trenti T., Fanelli F., Mezzullo M., Pagotto U., Simoni M., Casarini L.
Human LH and hCG stimulate differently the early signalling pathways but result in
equal testosterone synthesis in mouse Leydig cells in vitro // Reprod. Biol.
Endocrinol. 2017a. V. 15 (1). P. 2. doi: 10.1186/s12958-016-0224-3.
Riccetti L., Yvinec R., Klett D., Gallay N., Combarnous Y., Reiter E., Simoni
M., Casarini L., Ayoub M.A. Human luteinizing hormone and chorionic gonadotropin
display biased agonism at the LH and LH/CG receptors // Sci. Rep. 2017b. V. 7 (1). P.
940.
Rosenbaum D.M., Cherezov V., Hanson M.A., Rasmussen S.G., Thian F.S.,
et al. GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-
adrenergic receptor function // Science. 2007. V. 318. P. 1266–1273.
Salon J.A., Lodowski D.T., Palczewski K. The significance of G protein-
coupled receptor crystallography for drug discovery // Pharmacol. Rev. 2011. V. 63.
P. 901–937.
67
Salvador L.M., Park Y., Cottom J., Maizels E.T., Jones J.C., Schillace R.V.,
Carr D.W., Cheung P., Allis C.D., Jameson J.L., Hunzicker-Dunn M. Follicle-
stimulating hormone stimulates protein kinase A-mediated histone H3
phosphorylation and acetylation leading to select gene activation in ovarian granulosa
cells // J. Biol. Chem. 2001. V. 276 (43). P. 40146–40155.
Schappi J.M., Krbanjevic A., Rasenick M.M. Tubulin, actin and
heterotrimeric G proteins: coordination of signaling and structure // Biochim.
Biophys. Acta. 2014. V. 1838. P. 674–681.
Scheerer P., Park J.H., Hildebrand P.W., Kim Y.J., Krauss N., Choe H.W.,
Hofmann K.P., Ernst O.P. Crystal structure of opsin in its G-protein-interacting
conformation // Nature. 2008. V. 455. P. 497–502.
Schioth H.B., Fredriksson R. The GRAFS classification system of G-protein
coupled receptors in comparative perspective // Gen. Comp. Endocrinol. 2005. V. 142
(1-2). P. 94–101. doi: 10.1016/j.ygcen.2004.12.018.
Schwartz T.W., Frimurer T.M., Holst B., Rosenkilde M.M., Elling C.E.
Molecular mechanism of 7TM receptor activation–a global toggle switch model //
Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2006. V. 46. P. 481–519. doi:
10.1146/annurev.pharmtox.46.120604.141218.
Scobey M., Bertera S., Somers J., Watkins S., Zeleznik A., Walker W.
Delivery of a cyclic adenosine 3′,5′-monophosphate response element-binding protein
(creb) mutant to seminiferous tubules results in impaired spermatogenesis //
Endocrinology. 2001. V. 142 (2). P. 948–954. doi: 10.1210/endo.142.2.7948.
Seyedabadi M., Ghahremani M.H., Albert P.R. Biased signaling of G
protein coupled receptors (GPCRs): Molecular determinants of GPCR/transducer
selectivity and therapeutic potential // Pharmacol. Ther. 2019. pii: S0163-
7258(19)30080-4. doi: 10.1016/j.pharmthera.2019.05.006.
Shimamura T., Shiroishi M., Weyand S., Tsujimoto H., Winter G., Katritch
V., Abagyan R., Cherezov V., Liu W., Han G.W., Kobayashi T., Stevens R.C., Iwata S.
Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin // Nature. 2011.
V. 475 (7354). P. 65–70. doi: 10.1038/nature10236.
10.1016/S1937-6448(08)01004-6.
Shukla A.K., Violin J.D., Whalen E.J., Gesty-Palmer D., Shenoy S.K.,
Lefkowitz R.J. Distinct conformational changes in beta-arrestin report biased agonism
at seven-transmembrane receptors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. P.
9988–9993. doi: 10.1073/pnas.0804246105.
Shukla A.K., Xiao K.H., Lefkowitz R.J. Emerging paradigms of β-arrestin-
dependent seven transmembrane receptor signaling // Trends Biochem. Sci. 2011. V
36. P. 457–469. doi: 10.1016/j.tibs.2011.06.003.
Siu F.Y., He M., De Graaf C., Han G.W., Yang D., Zhang Z., Zhou C., Xu
Q., Wacker D., Joseph J.S., Liu W., Lau J., Cherezov V., Katritch V., Wang M.W.,
68
Stevens R.C. Structure of the human glucagon class B G-protein-coupled receptor //
Nature. 2013. V. 499 (7459). P. 444–449. doi: 10.1038/nature12393.
Song X.F., Coffa S., Fu H.A., Gurevich V.V. How does arrestin assemble
MAPKs into a signaling complex? // J. Biol. Chem. 2009. V. 284. P. 685–695. doi:
10.1074/jbc.M806124200.
Sunahara R.K., Taussig R. Isoforms of mammalian adenylyl cyclase:
Multiplicities of signaling // Mol. Interv. 2002. V. 2 (3). P. 168–184. doi:
10.1124/mi.2.3.168.
Tan Q., Zhu Y., Li J., Chen Z., Han G. W., Kufareva I., Li T., Ma L., Fenalti
G., Li J., Zhang W., Xie X., Yang H., Jiang H., Cherezov V., Liu H., Stevens R.C.,
Zhao Q., Wu B. Structure of the CCR5 chemokine IV entry inhibitor maraviroc
complex // Science. 2013. V. 341 (6152). P. 1387–1390. doi:
10.1126/science.1241475.
Taussig R., Gilman A.G. Mammalian membrane-bound adenylyl cyclases //
J. Biol.Chem. 1995. V. 270 (1). P. 1–4. doi: 10.1074/jbc.270.1.1.
Thomas R.M., Nechamen C.A., Mazurkiewicz J.E., Ulloa-Aguirre A., Dias
J.A. The adapter protein APPL1 links FSH receptor to inositol 1,4,5-trisphosphate
production and is implicated in intracellular Ca2+ mobilization // Endocrinology. 2011.
V. 152. P. 1691–1701. doi: 10.1210/en.2010-1353.
Thompson A.A., Liu W., Chun E., Katritch V., Wu H., Vardy E., Huang X.P.,
Trapella C., Guerrini R., Calo G., Roth B.L., Cherezov V., Stevens R.C. Structure of
the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic // Nature.
2012. V. 485 (7398). P. 395–399. doi: 10.1038/nature11085.
Tranchant T., Durand G., Gauthier C., Crepieux P., Ulloa-Aguirre A.,
Royere D., Reiter E. Preferential beta-arrestin signalling at low receptor density
revealed by functional characterization of the human FSH receptor A189 V mutation
// Mol. Cell. Endocrinol. 2011. V. 331 (1). P. 109–118. doi:
10.1016/j.mce.2010.08.016.
Troispoux C., Guillou F., Elalouf J. M., Firsov D., Iacovelli L., Blasi A.D.,
Combarnous Y., Reiter E. Involvement of G protein-coupled receptor kinases and
arrestins in desensitization to follicle-stimulating hormone action // Mol. Endocrinol.
1999. V. 13. P. 1599–1614. doi: 10.1210/me.13.9.1599.
Ulloa-Aguirre A., Crepieux P., Poupon A., Maurel M.C., Reiter E. Novel
pathways in gonadotropin receptor signaling and biased agonism // Rev. Endocr.
Metab. Disorders. 2011. V. 12 (4). P. 259–274. doi: 10.1007/s11154-011-9176-2.
Ulloa-Aguirre A., Dias J.A., Bousfield G., Huhtaniemi I., Reiter E.
Trafficking of the follitropin receptor // Methods Enzymol. 2013. V. 521. P. 17–45.
doi: 10.1016/B978-0-12-391862-8.00002-8.
Vassart G., Pardo L., Costagliola S. A molecular dissection of the
glycoprotein hormone receptors // Trends Biochem. Sci. 2004. V. 29 (3). P. 119–126.
doi: 10.1016/j.tibs.2004.01.006.
Wacker D., Wang C., Katritch V., Han G. W., Huang X. P., Vardy E.,
McCorvy J.D., Jiang Y., Chu M., Siu F.Y., Liu W., Xu H.E., Cherezov V., Roth B.L.,
69
Stevens R.C. Structural features for functional selectivity at serotonin receptors //
Science. 2013. V. 340 (6132). P. 615–619. doi: 10.1126/science.1232808.
Wang C., Jiang Y., Ma J., Wu H., Wacker D., Katritch V., Han G.W., Liu
W., Huang X.P., Vardy E., McCorvy J.D., Gao X., Zhou X.E., Melcher K., Zhang C.,
Bai F., Yang H., Yang L., Jiang H., Roth B.L., Cherezov V., Stevens R.C., Xu H.E.
Structural basis for molecular recognition at serotonin receptors // Science. 2013a. V.
340 (6132). P. 610–614. doi: 10.1126/science.1232807.
Wang C., Wu H., Katritch V., Han G.W., Huang X.P., Liu W., Siu F.Y., Roth
B.L., Cherezov V., Stevens R.C. Structure of the human smoothened receptor bound to
an antitumour agent // Nature. 2013b. V. 497 (7449). P. 338–343. doi:
10.1038/nature12167.
Warne T., Serrano-Vega M.J., Baker J.G., Moukhametzianov R., Edwards
P.C., Henderson R., Leslie A.G,. Tate C.G., Schertler G.F. Structure of a β1-
adrenergic G-protein-coupled receptor // Nature. 2008. V. 454 (7203). P. 486–491.
doi: 10.1038/nature07101.
Wayne C.M., Fan H.Y., Cheng X., Richards J.S. Follicle-stimulating
hormone induces multiple signaling cascades: evidence that activation of Rous
sarcoma oncogene, RAS, and the epidermal growth factor receptor are critical for
granulosa cell differentiation // Mol. Endocrinol. 2007. V. 21 (8). P. 1940–1957. doi:
10.1210/me.2007-0020.
Wehbi V., Decourtye J., Piketty V., Durand G., Reiter E., Maurel M.C.
Selective modulation of follicle-stimulating hormone signaling pathways with
enhancing equine chorionic gonadotropin/antibody immune complexes //
Endocrinology. 2010a. V. 151 (6). P. 2788–2799. doi: 10.1210/en.2009-0892.
Wehbi V., Tranchant T., Durand G., Musnier A., Decourtye J., Piketty V.,
Butnev V.Y., Bousfield G.R., Crépieux P., Maurel M.C., Reiter E. Partially
deglycosylated equine LH preferentially activates beta-arrestin-dependent signaling at
the follicle-stimulating hormone receptor // Mol. Endocrinol. 2010b. V. 24 (3). P.
561–573. doi: 10.1210/me.2009-0347.
Wettschureck N., Offermanns S. Mammalian G proteins and their cell type
specific functions // Physiol. Rev. 2005. V. 85 (4). P. 1154–1209. doi:
10.1152/physrev.00003.2005.
White J.F., Noinaj N., Shibata Y., Love J., Kloss B., Xu F., Gvozdenovic-
Jeremic J., Shah P., Shiloach J., Tate C.G., Grisshammer R. Structure of the agonist-
bound neurotensin receptor // Nature. 2012. V. 490. P. 508–513.
Woo A.Y., Jozwiak K., Toll L., Tanga M.J., Kozocas J.A., Jimenez L., Huang
Y., Song Y., Plazinska A., Pajak K., Paul R.K., Bernier M., Wainer I.W., Xiao R.P.
Tyrosine 308 is necessary for ligand-directed Gs protein-biased signaling of β2-
adrenoceptor // J. Biol. Chem. 2014. V. 289. P. 19351–19363. doi:
10.1074/jbc.M114.558882.
Wu B., Chien E.Y., Mol C.D., Fenalti G., Liu W., Katritch V., Abagyan R.,
Brooun A., Wells P., Bi F.C., Hamel D.J., Kuhn P., Handel T.M., Cherezov V.,
Stevens R.C. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and
70
cyclic peptide antagonists // Science. 2010. V. 330 (6007). P. 1066–1071. doi:
10.1126/science.1194396.
Wu H., Wacker D., Mileni M., Katritch V., Han G.W., Vardy E., Liu W.,
Thompson A.A., Huang X.P., Carroll F.I., Mascarella S.W., Westkaemper R.B.,
Mosier P.D., Roth B.L., Cherezov V., Stevens R.C. Structure of the human κ-opioid
receptor in complex with JDTic // Nature. 2012. V. 485 (7398). P. 327–332. doi:
10.1038/nature10939.
Wu Y., Janetopoulos C. The G alpha subunit Gα8 inhibits proliferation,
promotes adhesion and regulates cell differentiation // Dev. Biol. 2013. V. 380 (1). P.
58-72. doi: 10.1016/j.ydbio.2013.05.001.
Yang P., Roy S.K. A novel mechanism of FSH regulation of DNA synthesis
in the granulosa cells of hamster preantral follicles: involvement of a protein kinase
C-mediated MAP kinase 3/1 self-activation loop // Biol. Reprod. 2006. V. 75. P. 149–
157. doi: 10.1095/biolreprod.106.051813.
Yu F.-Q., Han C.-S., Yang W., Jin X., Hu Z.-Y., Liu Y.-X. Activation of the
p38 MAPK pathway by follicle-stimulating hormone regulates steroidogenesis in
granulosa cells differentially // J. Endocrinol. 2005. V. 186. P. 85–96. doi:
10.1677/joe.1.05955.
Zaballos M.A., Garcia B., Santisteban P. Gβγ dimers released in response to
thyrotropin activate phosphoinositide 3-kinase and regulate gene expression in thyroid
cells // Mol. Endocrinol. 2008. V. 22 (5). P. 1183–1199. doi: 10.1210/me.2007-0093.
Zeleznik A.J., Saxena D., Little-Ihrig L. Protein kinase B is obligatory for
follicle-stimulating hormone-induced granulosa cell differentiation // Endocrinology.
2003. V. 144 (9). P. 3985–3994.
Zhang C., Srinivasan Y., Arlow D.H., Fung J.J., Palmer D., Zheng Y.,
Green H.F., Pandey A., Dror R.O., Shaw D.E., Weis W.I., Coughlin S.R., Kobilka
B.K. High-resolution crystal structure of human protease-activated receptor 1 //
Zhang J., Zhang K., Gao Z.G., Paoletta S., Zhang D., Han G.W., Li T., Ma
L., Zhang W., Müller C.E., Yang H., Jiang H., Cherezov V., Katritch V., Jacobson
K.A., Stevens R.C., Wu B., Zhao Q. Agonist-bound structure of the human P2Y12
receptor // Nature. 2014. V. 509 (7498). P. 119–122. doi: 10.1038/nature13288.
Zhou X.E., Melcher K., Xu H.E. Understanding the GPCR biased signaling
through G protein and arrestin complex structures // Curr. Opin. Struct. Biol. 2017. V.
45. P. 150–159. doi: 10.1016/j.sbi.2017.05.004.
Zoenen M., Urizar E., Swillens S., Vassart G., Costagliola S. Evidence for
activity-regulated hormone-binding cooperativity across glycoprotein hormone
receptor homomers // Nat. Commun. 2012. V. 3. P. 1007. doi: 10.1038/ncomms1991.
71
ГЛАВА 2
Аллостерические регуляторы GPCR
2.1. Механизмы действия и классификация

аллостерических регуляторов GPCR
Ортостерические сайты близкородственных по

структурно-функциональной организации сопряженных с G-
белками рецепторов (GPCR), которые с высоким сродством
связываются со сходными по природе эндогенными лигандами,
характеризуются высокой консервативностью первичной
структуры и пространственной организации (Brogi et al., 2014;
Lee et al., 2018). В свою очередь, локализованные в
близкородственных GPCR аллостерические сайты имеют менее
выраженную консервативность первичной структуры и более
высокую вариабельность пространственной организации по
сравнению с ортостерическими сайтами. При этом существенные
различия в структуре аллостерических сайтов выявляются даже в
случае GPCR, которые регулируются идентичными
ортостерическими лигандами, что позволяет создавать
регуляторы и модуляторы аллостерических сайтов с высокой
селективностью по отношению к определенному подтипу GPCR
(Christopoulos, 2002; Mohr et al., 2013; Gentry et al., 2015).
Взаимное расположение ортостерических и
аллостерических сайтов у представителей различных классов
GPCR существенно различается. В GPCR, относящихся к классу
А, у которых ортостерический сайт расположен во внутренней
полости трансмембранного домена, аллостерический сайт может
располагаться вблизи него, в области внешнего входа в
72
трансмембранный домен, при этом, однако, не пересекаясь с
ортостерическим сайтом, или включать сегменты внеклеточных
петель (ВП) рецептора и его внеклеточного N-концевого участка
(рис. 2-1). В GPCR, которые относятся к классам B и С, в
которых ортостерический сайт локализован во внеклеточных
участках рецептора, в том числе в значительном по размеру
эктодомене, аллостерический сайт может располагаться во
внутренней полости трансмембранного домена. В этом случае
речь идет об инверсии локализации ортостерического и
аллостерического сайтов у рецепторов классов А и B/C (рис. 2-1).
Наряду с аллостерическими сайтами, локализация которых
детерминирована для определенного класса рецепторов,
возможны ситуации, когда такие сайты могут возникать
«случайно», в результате формирования в молекуле рецептора
дополнительных карманов или вследствие особенностей
взаимодействия липидов плазматической мембраны с боковой
поверхностью трансмембранного домена рецептора. При этом в
ряде случаев аллостерические лиганды для таких «транзиторных»
аллостерических сайтов остаются неизвестными, вследствие чего
их часто называют «орфановыми». Аллостерические сайты могут
быть сформированы цитоплазматическими петлями GPCR и их
интерфейсами с трансмембранными спиралями. О природе и
структурной организации таких сайтов известно намного меньше,
чем об аллостерических сайтах, расположенных на внеклеточной
поверхности рецептора.
Среди эндогенных аллостерических регуляторов GPCR
значительную группу составляют катионы металлов, таких как
натрий, кальций, цинк, магний, а также анионы хлора и ряд
сравнительно простых по структуре метаболитов и пищевых
молекул. С аллостерическими сайтами GPCR способны
взаимодействовать и многие лекарственные препараты, которые
на начальном этапе исследования их биологической активности
не относили к аллостерическим регуляторам (Allegretti et al.,
2008, 2016; Gentry et al., 2015; van der Westhuizen et al., 2015).
73
Рис. 2-1. Модели связывания аллостерических и ортостерических

лигандов с различными классами GPCR (по van der Westhuizen et al.,
2015).
Представлены GPCR, относящиеся к классам A, B и C, которые
различаются локализацией ортостерического и аллостерического сайтов.
Наряду с этим, возможно «случайное» формирование аллостерического
сайта в GPCR, как результат особенностей его фолдинга,
внутриклеточного везикулярного транспорта и встраивания в
плазматическую мембрану. Такие аллостерические сайты часто
называют «орфановыми», поскольку в большинстве случаев для них не
известны специфичные аллостерические регуляторы, и они могут
располагаться в различных доменах и субдоменах рецептора.
Важную роль в аллостерической регуляции GPCR играют

гетеротримерные G-белки и белки-регуляторы GPCR-сигналинга
(RGS-белки), в первую очередь аррестины. Как следствие,
множество разнообразных по структуре и функциям эндогенных
и синтетических регуляторов гетеротримерных G-белков и RGS-
белков, а также молекул, способных модифицировать
функциональное взаимодействие рецепторов с этими белками
также могут рассматриваться как аллостерические регуляторы
GPCR. К таким соединениям относятся как значительные по
74
размеру полипептиды, липиды и олигосахариды, так и небольшие
по размеру молекулы и ионы (van der Westhuizen et al., 2015)
(подробнее см. Главу 3).
Лиганды аллостерического сайта могут модулировать
функциональную активность GPCR различным образом и по
этому показателю подразделяются как на аллостерические
регуляторы, наделенные функциональной активностью полных и
инверсионных агонистов и нейтральных антагонистов, так и на
аллостерические модуляторы. В свою очередь, аллостерические
модуляторы подразделяются на три основные группы –
положительные (positive allosteric modulator, PAM),
отрицательные (negative allosteric modulator, NAM) и
нейтральные (silent allosteric modulator, SAM), которые будут
подробно рассмотрены ниже.
Отрицательные аллостерические модуляторы (NAM),
связываясь с аллостерическим сайтом GPCR, ингибируют
стимулирующий эффект ортостерического агониста, снижая его
аффинность к рецептору. При этом сами они не наделены
агонистической или антагонистической активностью. В основе
ингибирующего эффекта NAM лежит их способность
стабилизировать неактивную конформацию рецептора и
повышать тем самым энергетический барьер, преодоление
которого необходимо для активации рецептора ортостерическим
агонистом (Burford et al., 2011). В присутствии NAM отмечается
сдвиг вправо и(или) вниз кривых «концентрация агониста–
функциональный ответ» (рис. 2-2), что обусловлено как
снижением аффинности ортостерического агониста к рецептору в
присутствии NAM вследствие стабилизации конформации
рецептора с более низким сродством к лиганду, так и с
индуцированными NAM изменениями энергетического барьера,
преодоление которого необходимо для активирования рецептора.
75
Рис. 2-2. Эффекты аллостерических модуляторов на аффинность

ортостерического агониста к рецептору и на эффективность его
действия (по Allegretti et al., 2016).
NAM и PAM оказывают регуляторное влияние на аффинность и
эффективность ортостерического агониста GPCR, в то время как SAM в
этом отношении не эффективен. OA – ортостерический агонист.
Важно отметить, что сдвиг кривых «концентрация

агониста–функциональный ответ» достигает предельных
значений после того, как все аллостерические сайты оказываются
связанными с NAM. В то же время сдвиг кривых остается
существенно меньшим, чем таковой при действии
ортостерических антагонистов или инверсионных агонистов,
которые при повышении концентрации, конкурируя с полными
агонистами за места связывания с ортостерическим сайтом,
способны полностью блокировать их стимулирующие эффекты.
Способность NAM сравнительно мягко ингибировать
стимулированную полными ортостерическими агонистами
76
активность GPCR, предотвращая тем самым гиперактивацию
рецептора и зависимых от него внутритклеточных каскадов при
длительном стимулирующем воздействии агониста, а также
отсутствие острого «дефицита» GPCR-сигналинга в условиях
обработки NAM являются безусловными достоинствами этих
аллостерических модуляторов. Все это делает NAM весьма
привлекательными фармакологическими препаратами для
медицины (Lindsley et al., 2016; Foster, Conn, 2017).
Положительные аллостерические регуляторы (PAM),
специфично связываясь с аллостерическим сайтом рецептора,
способствуют более эффективному взаимодействию полных
агонистов с ортостерическим сайтом, меняя конформацию
рецептора, и снижают энергетический барьер для перехода
рецептора в активное состояние. В присутствии PAM отмечается
сдвиг влево и(или) вверх кривых «концентрация агониста–
функциональный ответ» (рис. 2-2). В отсутствие эндогенных или
экзогенных ортостерических агонистов PAM не проявляют
какой-либо функциональной активности и не вызывают заметных
фармакологических эффектов. При совместном применении с
полными ортостерическими агонистами PAM потенцируют их
стимулирующие эффекты на активность рецептора, что делает
возможным значительное снижение эффективных доз
ортостерических агонистов. В условиях применения в клинике
это позволяет предотвратить некоторые побочные эффекты
ортостерических агонистов, обусловлены применением их
концентраций, намного превышающих физиологические.
Наряду с «чистыми» PAM, которые не способны
активировать рецептор в отсутствие ортостерического агониста,
имеется обширная группа PAM, которые в отсутствие агониста
способны самостоятельно стимулировать функциональную
активность рецептора, действуя как аллостерические агонисты
(ago-PAM). Наряду с собственной агонистической активностью,
при совместном применении с ортостерическим агонистом ago-
PAM потенцируют его стимулирующий эффект, демонстрируя
PAM-активность. В тех случаях, когда базальная активность
77
GPCR низка или когда ортостерический агонист по каким-то
причинам малодоступен, для регуляции рецептора
предпочтительно использование аллостерических регуляторов с
ago-PAM-активностью. В то же время при наличии у рецептора
высокой базальной активности применение ago-PAM приводит к
его гиперактивации, что может привести к нежелательным
последствиям. Однако ago-PAM необходимо отделять от
классических аллостерических агонистов, которые способны
активировать рецептор в отсутствие ортостерического агониста,
но при этом на эффекты последнего не влияют (Digby et al.,
2012a, 2012b; Sheffler et al., 2013). Функциональная
классификация PAM и механизмы их действия на GPCR
подробно описаны в ряде аналитических обзоров (Christopoulos,
2002; Christopoulos, Kenakin, 2002; Bridges, Lindsley, 2008; Fenton,
2008; Conn et al., 2009, 2014; Kenakin 2009; Kenakin et al., 2010;
Lane R.J. et al., 2013; Menniti et al., 2013; Lindsley, 2014; Wenthur
et al., 2014; Lindsley et al., 2016; Foster, Conn, 2017).
Нейтральные аллостерические регуляторы (SAM) не
влияют ни на аффинность рецептора к ортостерическому
агонисту, ни на эффективность стимулирующего действия
агониста. В пользу этого свидетельствует отсутствие сдвига
кривых «концентрация агониста–функциональный ответ» в
присутствии SAM (рис. 2-2). Установлено, что SAM могут
выступать в качестве конкурентных антагонистов
аллостерического сайта рецептора, блокируя связывание с ним
NAM и PAM. В настоящее время SAM широко применяют для
подтверждения взаимодействия NAM и PAM с определенным
типом рецептора, а также для изучения молекулярных
механизмов их действия. Следует обратить внимание на тот факт,
что, специфически связываясь с аллостерическим сайтом
рецептора, SAM могут влиять на его конформацию и, таким
образом, на сродство к эндогенным аллостерическим
регуляторам, что приводит к модификации активности GPCR.
Таким образом, SAM могут опосредованно влиять на активность
78
GPCR-зависимых сигнальных путей, что необходимо учитывать
при их применении в медицине.
Действие аллостерических модуляторов на активность
рецептора может осуществляться как вследствие модуляции ими
сродства GPCR к эндогенным лигандам путем изменения
конформации отростерического сайта, так и вследствие
модификации и модуляции ими функционального ответа
рецептора на воздействие ортостерического лиганда (Brogi et al.,
2014; Lee et al., 2018). Важным преимуществом аллостерических
регуляторов является то, что по химической структуре они, как
правило, сильно отличаются от ортостерических лигандов
рецептора с активностью агонистов или антагонистов, что
исключает конкуренцию между лигандами аллостерического и
ортостерического сайтов за места связывания на молекуле GPCR.
Это снимает целый ряд ограничений при разработке селективных
аллостерических молуляторов GPCR и позволяет использовать их
в сочетании с эндогенными ортостерическими регуляторами или
их синтетическими аналогами. Следует отметить, что при
одновременном связывании с лигандами ортостерического и
аллостерического сайтов функции рецептора сильно меняются, и
по многим показателям такой рецептор существенно отличается
от того же рецептора, но связанного либо с ортостерическим,
либо с аллостерическим лигандом (Lindsley et al., 2016). Это
является молекулярной основой для регуляции и модификации
физиологических ответов при активации одного и того же
рецептора различными комбинациями лигандов
ортостерического и аллостерического сайтов.
В пользу перспективности аллостерических лигандов
GPCR, как новых лекарственных препаратов, свидетельствуют
данные об использовании в клинике целого ряда сравнительно
недавно разработанных аллостерических регуляторов различных
типов GPCR, наделенных активностью PAM и NAM. Препарат
Sensipar (cinacalcet), являющийся PAM для кальций-
чувствительного рецептора CaSR, функционирует как кальций-
миметик, подавляя продукцию паратиреоидного гормона, и
79
может использоваться для лечения первичного и вторичного
гиперпаратиреоза (Harrington, Fotsch, 2007). Препарат Mozobil
(plerixafor) представляет собой NAM для хемокинового
рецептора CXCR4 и применяется при трансплантации
аутологичных стволовых клеток (Allegretti et al., 2016). Препарат
Selzentry (maraviroc), высокоаффинный модулятор активности
хемокинового рецептора CCR5, в сочетании с
антиретровирусными препаратами широко используется для
лечения пациентов с ВИЧ-инфекцией (Dorr et al., 2005). В
настоящее время различные стадии клинических испытаний
проходят еще ряд фармакологических препаратов с активностью
PAM и NAM (Conn et al., 2014). Среди них Reparixin, лиганд
аллостерического сайта CXCR1- и CXCR2-хемокиновых
рецепторов, который по активности относится к группе NAM
(Zarbock et al., 2008), соединение MK-7622 с активностью PAM
для m1-мускаринового рецептора (Beshore et al., 2018; Moran et
al., 2018; Rook et al., 2018; Uslaner et al., 2018; Voss et al., 2018),
серия аллостерических модуляторов метаботропных глутаматных
рецепторов – NAM для mGlu5-глутаматного рецептора
(mavoglurant, dipraglurant, STX107, basimglurant и fenobam), PAM
для mGlu2-глутаматного рецептора (ADX71149, JNJ-40411813 и
42491293) и PAM с двойной специфичностью для mGlu2- и
mGlu3-глутаматных рецепторов (AZD8529) (Rocher et al., 2011;
Emmitte, 2013; Hopkins, 2013; Lavreysen et al., 2013) (подробнее
см. Главу 4).
Интенсивно ведутся поиски аллостерических регуляторов
рецепторов биогенных аминов, что демонстрируют данные по
дофаминовому рецептору 3-го типа. Ортостерический сайт и
один из аллостерических сайтов в этом рецепторе располагаются
на небольшом расстоянии друг от друга. Так ортостерический
сайт локализован во внутренней полости трансмембранного
домена, в то время как аллостерический сайт располагается в
преддверии внешнего входа в этот домен и включает участки
второй ВП и ориентированные во внеклеточное пространство
сегменты первой, второй и седьмой трансмембранных спиралей
80
(ТМС) (Lane J.R. et al., 2013). C помощью компьютерного
докинга четырех миллионов соединений, включенных в базу
данных «Molsoft Screen Pub» (Molsoft, LLC, Сан-Диего, США),
были отобраны несколько структур, потенциально способных с
высокой эффективностью связываться с аллостерическим сайтом
дофаминового рецептора 3-го типа, находящегося в связанном с
дофамином состоянии. Соответствующие этим структурам
сединения эффективно взаимодействовали с сегментами первой и
второй ВП и с формирующими вход в трансмембранный домен
аминокислотными остатками, локализоваными в первой, второй,
третьей и седьмой ТМС. В дальнейшем экспериментально было
показано, что соответствующие отобранным структурам
соединения модулируют функциональную активность
дофаминового рецептора 3-го типа (Lane J.R. et al., 2013).
Наряду с классическими, моновалентными,
аллостерическими лигандами, в настоящее время большие
надежды связывают с битопическими (bitopic) или
двухстеричными (dualsteric) лигандами. Они способны одной
частью молекулы связываться с ортостерическим сайтом, другой
частью – с одним из аллостерических сайтов рецептора.
Битопические лиганды состоят из двух фармакофоров, которые
соединены различными линкерами. Основным назначением
линкеров является обеспечение способности фармакофоров
лиганда одновременно, без значимых стерических препятствий,
связываться с ортостерическим и аллостерическим сайтами.
Одной из важнейших задач при создании битопических лигандов
является оптимизация структуры линкера с учетом необходимой
длины, гибкости, гидрофильности или гидрофобности, а также
ориентации лиганда в рецепторе (Fronik et al., 2017). Примером
успешной разработки битопических лигандов являются агонисты
iper-6-phth и iper-6-naph, которые одновременно связываются с
ортостерическим и аллостерическим сайтами m2-мускаринового
рецептора и имеют значительные преимущества перед
ортостерическими агонистами (рис. 2-3). При этом
ортостерический сайт, одна из мишеней битопических лигандов
81
iper-6-phth и iper-6-naph, располагается во внутренней полости
трансмембранного домена, в то время как их вторая мишень,
аллостерический сайт, во внеклеточном преддверии входа в этот
домен. Связывание iper-6-phth и iper-6-naph с m2-мускариновым
рецептором приводит к селективной активации Gi-белок-
зависимых сигнальных путей, которые являются одной из
ключевых мишеней m2-агонистов (Bock et al., 2012).
Соединение SB269652, которое сначала рассматривали
как неселективный антагонист дофаминовых рецепторов 2-го и 3-
го типов, в дальнейшем было идентифицировано как
битопический лиганд дофаминового рецептора 2-го типа (Silvano
et al., 2010; Lane et al., 2014) (рис. 2-3). Показано, что
положительно заряженная аминогруппа соединения SB269652
взаимодействует с отрицательно заряженной карбоксильной
группой остатка Asp114, формирующего ортостерический сайт
рецептора. Наряду с этим, соединение SB269652 образовывало
водородную связь с остатком глутаминовой кислоты в
аллостерическом сайте рецептора. Другим представителем
битопических лигандов является препарат Brexpiprazole (Rexulti),
частичный агонист дофаминового рецептора 2-го типа,
наделенный антипсихотической активностью (Garnock-Jones,
2016) (рис. 2-3). Его особенностью является сочетание высокой
аффинности к дофаминовому рецептору 2-го типа,
обусловленное связыванием с ортостерическим сайтом, и
высокой селективности, достигаемой при связывании препарата
Brexpiprazole с аллостерическим сайтом рецептора.
82
Рис. 2-3. Битопические лиганды m2-мускаринового ацетилхолиноворго

рецептора и дофаминовых рецепторов 2-го и 3-го типов (по Lee et al.,
2018).
Анализируя фармакологические свойства битопических

лигандов, необходимо отметить, что они относятся к классу
аллостерических агонистов и лишены PAM-активности. В
большинстве своем битопические лиганды являются
инверсионными агонистами, а эффективность их действия в
немалой степени зависит от уровня экспрессии GPCR. При этом
такие лиганды могут демонстрировать «кажущуюся» активность
полных агонистов в системах с высоким уровнем экспрессии
рецепторов, что особенно характерно для клеточных культур, но
ведут себя как инверсионные агонисты или даже антагонисты в
системах с низким уровнем экспрессии GPCR (Digby et al.,
2012a).
2.2. Оценка фармакологического профиля

аллостерических регуляторов
Для идентификации фармакологического профиля

аллостерических регуляторов большое значение имеет
адекватная постановка экспериментов по их совместному
83
действию с лигандами ортостерического сайта. При этом
важными параметрами являются не только концентрации
препаратов, но и последовательность их добавления. Поскольку
аллостерические модуляторы и агонисты способны вызывать
переключение внутриклеточных сигнальных каскадов, а также
существенно менять свои эффекты во времени и в зависимости от
степени активации или ингибирования рецептора в условиях его
связывания с ортостерическими лигандами, то наиболее
приемлемой стратегией является множественное добавление
тестируемого препарата с предполагаемой активностью
аллостерического регулятора и полного ортостерического
агониста (Sharma et al., 2008, 2009; Wood et al., 2011).
В качестве примера приведем тестирование, в ходе
которого оценивалось воздействие препаратов на
внутриклеточную мобилизацию Ca с использованием кальций-
2+
чувствительных красителей. Процедура включала начальное

добавление тестируемого соединения в среду инкубации (первое
добавление) и через 2 мин добавление ортостерического агониста
в низкой концентрации (второе добавление). Низкой
концентрацией полного ортостерического агониста считали
такую его концентрацию, в которой он вызывал функциональный
ответ, составляющий 20% от величины максимального ответа
(EC20). Еще через 1 мин добавляли ортостерический агонист в
концентрации, близкой к максимальной (EC80) (третье
добавление) (Rodriguez et al., 2010). Такой подход позволяет
идентифицировать агонисты, ago-PAM, PAM и
антагонисты/NAM при проведении всего одного анализа
кинетических параметров, минимизируя необходимость
проведения нескольких процедур скрининга. При проведении
тестирования соединений необходимо предотвращать или, по
крайней мере, учитывать процессы их возможной деградации и
окисления, и процедура множественного добавления препаратов,
по крайней мере, частично решает эту проблему (Bridges et al.,
2013).
84
Первичный анализ аллостерических регуляторов, как
правило, проводится на клеточных культурах, в которых
экспрессированы GPCR, мишени этих регуляторов. Однако
механизмы постттрансляционного процессинга GPCR в
различных линиях клеток сильно различаются, вследствие чего
один и тот же рецептор может характеризоваться различными
структурными и функциональными свойствами. Это весьма
существенно для изучения функциональной активности
аллостерических регуляторов, поскольку, в отличие от
высококонсервативных ортостерических сайтов, обычно не
подверженных пост-трансляционным модификациям,
аллостерические сайты GPCR являются к ним более
чувствительными. Важными факторами здесь являются
имеющиеся в различных линиях и типах клеток существенные
различия в микроокружении рецептора и в паттерне
взаимодействующих с ним гетеротримерных G-белков, β-
аррестинов и других белков – регуляторов GPCR-сигналинга.
Необходимо отметить, что сами эти белки могут выступать в
качестве аллостерических регуляторов и в значительной степени
влиять на структуру и доступность аллостерических сайтов,
локализованных в GPCR. В литературе имеется много сведений о
существенном, а порой критическом влиянии выбранной
клеточной культуры на фармакологический профиль
аллостерических регуляторов, а также о различиях ответа
рецептора и его сигнальной системы на аллостерический
регулятор в зависимости от видовой принадлежности клеток-
мишеней (Christopoulos, 2002; Christopoulos, Kenakin, 2002;
Bertrand et al., 2007; Bridges, Lindsley, 2008; Fenton, 2008; Conn et
al., 2009, 2014; Kenakin 2009; Kenakin et al., 2010; Lane R.J. et al.,
2013; Menniti et al., 2013; Cho et al., 2014; Lindsley, 2014; Wenthur
et al., 2014; Lindsley et al., 2016; Foster, Conn, 2017). Тестирование
обычно стараются проводить с использованием широкой линейки
клеточных культур, в том числе с учетом того, что
аллостерический регулятор при действии на клеточные линии
грызунов, собак и даже обезьян-приматов, может вызывать
85
совершенно иные эффекты, чем при действии на клеточные
линии человека. На начальных стадиях тестирования
рекомендуется использовать линии клеток грызунов, в то время
как на заключительных его стадиях обычно выбирают линии
клеток человека и приматов.
При изучении аллостерических регуляторов необходимо
принимать во внимание то, что одни лиганды аллостерических
сайтов способны усиливать или, напротив, ослаблять
специфическое связывание и регуляторные эффекты большого
числа ортостерических лигандов. Это характерно, например, для
ионов натрия и двухвалентных металлов, в то время как другие
аллостерические регуляторы способны влиять на активацию
GPCR только определенными типами ортостерических лигандов
(Rajagopal et al., 2011; Kenakin et al., 2012). Важно отметить, что
некоторые аллостерические регуляторы демонстрируют
отрицательную кооперативность с другими лигандами GPCR.
Еще одной важной особенностью лигандов
аллостерических сайтов GPCR являются вызываемые ими
изменения паттерна регулируемых внутриклеточных сигнальных
каскадов. Лиганды ортостерического сайта стабилизирует сразу
несколько конформаций, каждая из которых приводит к запуску
какого-то одного канонического внутриклеточного сигнального
каскада, причем, как правило, одна или две из этих конформаций
превалируют, что определяет векторность передачи
гормонального сигнала к определенным эффекторным белкам. В
случае аллостерических лигандов могут стабилизироваться как
типичные для данного рецептора, так и «уникальные» (не
стабилизируемые ортостерическими лигандами) активные
конформации, через посредство которых может осуществляться
активация неканонических сигнальных каскадов, как зависимых,
так и независимых от гетеротримерных G-белков (Kenakin, 2012;
Kenakin, Christopoulos, 2013). «Смещение» внутриклеточных
сигнальных каскадов, называемое «смещением стимула»,
показано как в случае PAM, так и в случае NAM, для большого
числа GPCR, среди которых m1- и m4-мускариновые рецепторы,
86
чувствительные к кальцию рецепторы CaSR, различные типы
метаботропных глутаматных рецепторов, каннабиноидные
рецепторы (Zhang et al., 2005; Sheffler et al., 2008; Leach et al.,
2010, 2012; Anh et al., 2012; Davey et al., 2012; Conn et al., 2014;
Lindsley et al., 2016).
В пользу избирательности действия аллостерических
лигандов на внутриклеточные сигнальные каскады
свидетельствуют данные о регуляторном влиянии двух PAM,
соединений VU0090157 и VU0029767, на активность m1-
мускаринового рецептора (Mario et al., 2009). Оба соединения с
одинаковой эффективностью потенцировали индуцированную
ацетилхолином мобилизацию катионов кальция в клеточных
линиях с экспрессированным в них m1-мускариновым
рецептором. При этом соединение VU0090157 повышало долю
стабилизированной ацетилхолином конформации рецептора,
которая активирует сразу два типа G-белков – Gq/11-белок, через
который стимулируется фосфолипаза Сβ и повышается
внутриклеточная концентрация катионов кальция, и G12/13-белок,
через который осуществляется регуляция активности
фосфолипазы D. В свою очередь, соединение VU0029767
стабилизировало уникальную конформацию m1-мускаринового
рецептора, в которой он терял способность активировать
фосфолипазу D (Mario et al., 2009).
Определение значений EC50 для потенцирующего
эффекта аллостерических лигандов сопряжено с целым рядом
проблем и приводит к различным результатам для одного и того
же лиганда в зависимости от выбранного способа оценки этого
показателя. Обычно значение EC50 для потенцирующего эффекта
рассчитывается при использовании субмаксимальных
концентраций полного ортостерического агониста, которые
составляют 20% (EC20) от его концентрации, при которой
достигается максимальный функциональный ответ. При этом в
большинстве случаев эти концентрации ортостерического
агониста, рассчитанные на основе анализа соотношений
«структура–активность», являются величинами относительными
87
и варьируемыми. Соответственно, очень часто потенцирующие
эффекты PAM и ago-PAM либо переоцениваются, либо
недооцениваются, что приводит к проблемам с оптимизацией доз
и выбором наиболее эффективных стратегий их применения в
условиях in vivo и в дальнейшем в клинике (Lindsley et al., 2016).
2.3. Количественная оценка аллостерических

взаимодействий
Как отмечалось выше, набор активных конформаций

GPCR, которые возникают вследствие его связывания с
аллостерическими лигандами, принципиально отличается от
такового, стабилизируемого связыванием рецептора с
ортостерическими лигандами. При совместном действии
аллостерических и ортостерических лигандов на рецептор
формируется еще один набор активных конформаций, и это
существенным образом влияет на регуляторные эффекты
ортостерических агонистов, определяет избирательность
активации внутриклеточных сигнальных путей, влияет на
процессы олигомеризации, десенситизации и деградации
рецепторной молекулы, а в ряде случаев меняет лигандную
специфичность рецептора. Для разработки новых
аллостерических регуляторов и оптимизации уже имеющихся
необходима адекватная количественная оценка тех регуляторных
влияний, которые аллостерический лиганд оказывает на
рецептор-регулирующие функции ортостерических лигандов.
Для этого используется модель аллостерического тройного
комплекса, которая достаточно просто, хотя и с рядом серьезных
допущений и упрощений, описывает природу аллостерических
взаимодействий в молекуле GPCR.
В соответствии с этой моделью GPCR (R) может
специфично связываться либо с ортостерическим лигандом
(димерный комплекс AR), либо с аллостерическим лигандом
(димерный комплекс BR). Образование лиганд-рецепторных
комплексов определяется концентрацией каждого лиганда и
88
константой диссоциации (Kd) для каждого лиганда по отношению
к свободной от лиганда форме рецептора. Изменения величины
сродства лиганда к рецептору и направление ее сдвига в сторону
более высоких или более низких концентраций при
одновременном связывании с аллостерическим и
ортостерическим сайтами, приводящем к образованию тройного
комплекса ARB, определяются фактором кооперативности α.
Поскольку аллостерический и ортостерический сайты в GPCR
конформационно взаимосвязаны, то аллостерические влияния
при связывании лигандов с этими сайтами являются
реципрокными (Conn et al., 2009). Кооперативность является
насыщаемой, вследствие чего при непрерывном повышении
концентрации аллостерического лиганда его эффект достаточно
быстро достигает предела и это предотвращает передозировку и
связанные с этим побочные эффекты, которые характерны для
ортостерических лигандов.
Согласно модели аллостерического тройного комплекса, в
отсутствие ортостерического лиганда рецептор, связанный с
аллостерическим модулятором, пребывает в состоянии покоя, и
кооперативность взаимодействия начинает проявляться только
при воздействии на него ортостерического лиганда.
Следовательно, аллостерические модуляторы обладают
способностью модулировать рецепторную активность
пространственно-временным образом. Значение α меньше 1, но
превышающее нулевое значение, указывает на отрицательное
аллостерическое взаимодействие, при котором связывание
одного лиганда уменьшает сродство рецептора к другому
лиганду. Это характерно для NAM и приводит к сдвигу вправо
концентрационной кривой для ортостерического лиганда (рис. 2-
2, график для NAM справа). При значении α больше 1
наблюдается положительная кооперативность, когда связывание
одного лиганда усиливает сродство рецептора к другому лиганду.
Это соответствует PAM и ago-PAM, и характеризуется сдвигом
концентрационной кривой влево, в сторону более низких
концентраций ортостерического лиганда (рис. 2-2, график для
89
PAM справа). При этом нейтральные аллостерические
модуляторы (SAM), которые при связывании с аллостерическими
сайтами не влияют на аффинность ортостерических лигандов,
описываются значением α, равным или близким 1 (рис. 2-2,
графики для SAM).
Как уже отмечалось выше, наряду с аллостерическим
влиянием на связывающие характеристики ортостерических
лигандов, некоторые классы аллостерических регуляторов
обладают собственной активностью, причем как положительной,
функционируя в этом случае как полные агонисты, так и
отрицательной, проявляя свойства инверсионных агонистов и
нейтральных антагонистов. Собственная функциональная
активность аллостерических регуляторов может быть
дополнением к их модулирующему влиянию на связывание
ортостерических лигандов (например, ago-PAM), но может быть
самодостаточной и не связанной с модулирующим влиянием на
структурно-функциональные характеристики ортостерического
сайта. Аллостерические лиганды могут влиять не только на
аффинность ортостерического лиганда, но и на величину и
паттерн физиологического ответа (Christopoulos et al., 2014). Для
ряда аллостерических модуляторов показано, что их влияние на
величину физиологического ответа, вызываемого
ортостерическим агонистом, может осуществляться независимо
от их влияния на сродство этого агониста к рецептору, что,
например, продемонстрировано для низкомолекулярных
аллостерических регуляторов GPCR, относящихся к семейству С
(Lundstrom et al., 2011; Gregory et al., 2012; Rook et al., 2015; van
der Westhuizen et al., 2015; Lindsley et al., 2016). Наряду с этим,
изменение эффективности действия ортостерического агониста в
присутствии аллостерического модулятора не обязательно
меняется в том же направлении, что и фактор кооперативности α,
который отражает влияние аллостерического лиганда на
аффинность связывания ортостерического агониста с
ортостерическим сайтом (Price et al., 2005; Dias et al., 2011; Jalan-
Sakrikar et al., 2014). Для описания сложных взаимоотношений
90
между изменением эффективности действия и аффинности
связывания ортостерического агониста в присутствии
аллостерических модуляторов была разработана операционная
модель аллостеризма, основу которой составляют операционная
модель агонизма и модель аллостерического тройного комплекса
(Leach et al., 2007). В рамках операционной модели аллостеризма
был введен дополнительный фактор кооперативности β, который
отражает влияние аллостерического лиганда на эффективность
действия ортостерического агониста (величина максимального
ответа).
Так при действии NAM, например, со значением α=0.1,
значение фактора кооперативности β может быть как выше, так и
ниже единицы. В этом сучае, при сдвиге концентрационной
кривой вправо (снижение аффинности), эффективность действия
ортостерического агониста (максимальный ответ) в присутствии
NAM может повышаться (β=3) или, напротив, снижаться (β=0.3).
При действии PAM со значением α=10, значение β также может
быть выше или ниже единицы. В случае α=10 и β=3 PAM
повышает как сродство к рецептору, так и эффективность
действия ортостерического агониста. В то же время в случае α=10
и β=0.3 PAM повышает аффинность связывания
ортостерического агониста с рецептором, но при этом снижает
эффективность его действия. Для оценки результирующего
эффекта аллостерического модулятора используют произведение
αβ (Davey et al., 2012; Wootten et al., 2013). При этом вклад
факторов α и β в эффекты аллостерических модуляторов
определить сложно, что делает значения α и β, а, следовательно, и
их произведение, сильно варьируемыми величинами. Имеются
различные подходы, позволяющие оптимизировать вклад α и β в
аллостерическое взаимодействие, как на уровне влияния NAM и
PAM на максимальный функциональный ответ агониста (Urwyler
et al., 2001; Jalan-Sakrikar et al., 2014), так и на уровне их влияния
на аффинность связывания с ортостерическим сайтом (Valant et
al., 2012; Bernat et al., 2015; Cook et al., 2015).
91
Кооперативность взаимодействий определяется
химической природой обоих лигандов – как аллостерического,
так и ортостерического, которые одновременно специфично
связаны с молекулой GPCR, и такие зависимости называют
зондовыми. Зондовая зависимость может проявляться в виде
различий в степени положительной или отрицательной
кооперативности при использовании различных ортостерических
лигандов. В некоторых случаях, например, для мускариновых
ацетилхолиновых рецепторов, показано, что сама природа
кооперативности может меняться в зависимости от природы
ортостерического лиганда (Chan et al., 2008; Farrell, Roth, 2010;
Valant et al., 2012; Abdul-Ridha et al., 2014a, 2014b). В связи с этим
для оптимизации тестирования аллостерических модуляторов и
регуляторов, как в клеточных культурах, так и в экспериментах in
vivo на животных, необходимо использовать не только
эндогенный агонист, но и его синтетический аналог с
агонистической активностью.
Некоторые GPCR имеют сразу несколько эндогенных
ортостерических лигандов. В этом случае для изучения зондовой
зависимости при проведении фармакологического анализа
аллостерических регуляторов может быть использован весь набор
ортостерических лигандов, как это продемонстрировано в случае
рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1). Этот
рецептор имеет, по меньшей мере, шесть эндогенных
ортостерических лигандов, включая полноразмерный GLP-1(1–
36), его укороченный метаболит GLP-1(9–36) и оксинтомодулин.
Первые из синтезированных низкомолекулярных
аллостерических лигандов рецептора GLP-1 характеризовались
зондозависимыми эффектами, являясь слабыми положительными
модуляторами (αβ < 2) полноразмерного GLP-1(1–36) и
высокоэффективными положительными модуляторами GLP-1(9–
36) (α>100) и оксинтомодулина (αβ=10–30). Они усиливали
стимулирующие эффекты GLP-1(9–36) и оксинтомодулина на
активность фермента аденилатциклазы и цАМФ-зависимых
сигнальных путей в клетках-мишенях (Willard et al., 2012;
92
Wootten et al., 2012, 2013). В свою очередь было показано, что
различные PAM способны потенцировать стимулирующие
эффекты полноразмерного GLP-1(1–36) и его сплайсинговых
изоформ, а также синтетических пептидов лираглутида или
эксендина-4 с активностью селективных агонистов рецептора
GLP-1, устойчивых к протеолитической деградации аналогов
GLP-1. При этом имеются PAM, которые в одинаковой степени
потенцируют эффекты как GLP-1(1–36), так и лираглутида и
эксендина-4, являясь, тем самым, наиболее востребованными
фармакологическими препаратами для активации GLP-1-
зависимых физиологических процессов (Morris et al., 2014a,
2014b).
2.4. Влияние олигомеризации рецепторов и их

комлексообразования с RAMP на аллостерические
эффекты
Установлено, что GPCR в функционально активном

состоянии способны образовывать комплексы, причем как
гомодимерные и гомоолигомерные, так и гетеродимерные и
гетероолигомерные. Это характерно для различных семейств
GPCR, причем для некоторых типов рецепторов является
обязательным условием проявления ими специфической
биологической активности. Гетеродимерные GPCR-комплексы по
аллостерической регуляции и кооперативности взаимодействий
между аллостерическими и ортостерическими сайтами
существенно отличаются от гомодимерных комплексов. Более
того, они в значительной степени отличаются по избирательной
активации внутриклеточных сигнальных каскадов, зависимых от
гетеротримерных G-белков и β-аррестинов. Так, например, при
совместной экспрессии в клеточных культурах µ- и δ-опиоидных
рецепторов их регуляция гормональными агентами сильно
меняется по сравнению с клетками, в которых экспрессирован
только какой-то один тип опиоидного рецептора (George et al.,
2000). Та же ситуация наблюдается и при совместной экспрессии
93
дофаминовых рецепторов 1-го и 2-го типов, что приводит к
образованию D1/D2-гетеродимерных форм рецептора и, как
следствие, меняет специфичность рецептора по отношению к G-
белкам и паттерн активируемых через них внутриклеточных
сигнальных каскадов (Rashid et al., 2007). Соответственно,
аллостерические регуляторы по-разному влияют на гомо- и
гетеродимерные комплексы GPCR (Milligan, Smith, 2007), что
необходимо учитывать при поиске и разработке таких
регуляторов, а также в процессе тестирования их биологической
активности в условиях in vitro и in vivo (AbdAlla et al., 2001;
Ayoub et al., 2004; Kostenis et al., 2005; Levoye et al., 2006;
Milligan, 2010).
Некоторых из GPCR, относящихся к семействам А и В,
способны образовывать гомо- и гетероолигомерные комплексы,
что в еще большей степени расширяет границы и усложняет
механизмы аллостерической регуляции (Milligan, Smith, 2007;
Archbold et al., 2011). При этом компонентами в этих комлексах
могут быть как молекулы GPCR, так и другие сигнальные и
акцессорные белки – гетеротримерные G-белки, различные типы
β-аррестинов и специализированных белков, модифицирующих
рецепторную активность (receptor-activity-modifying proteins,
RAMP). В случае рецепторов, относящихся к семейству B и
активируемых различными полипептидными ортостерическими
лигандами, такими как кальцитонин-ген-родственный пептид
(CGRP), адреномедуллин, интермедин, амилин и секретин,
образование комплекса рецептора с RAMP абсолютно
необходимо для его полноценной активации. Взаимодействие
рецептора с различными типами RAMP определяет как
избирательность сигнальной трансдукции, так и
фармакологические характеристики рецепторного комплекса
(Bomberger et al., 2005, 2012; Hay et al., 2006; Sexton et al., 2006;
Russell et al., 2014). Так RAMP определяют сродство рецептора,
родственного рецептору кальцитонина (CLR), к ортостерическим
лигандам – CGRP и адреномедуллину. В том случае, когда
рецептор CLR образует комплекс с RAMP1, он приобретает
94
высокую аффинность по отношению к CGRP и активируется
преимущественно этим лигандом, в то время как при
образовании комплекса с RAMP2 тот же рецептор приобретает
высокую аффинность к адреномедуллину, хотя и сохраняет
способность активироваться CGRP (Russell et al., 2014).
Образованием различных по структуре GPCR-содержащих
комплексов во многом обусловлено то, что в различных типах
клеток и тканей, имеющих различный паттерн таких комплексов
и их компонентов, сигнальная трансдукция через GPCR и
фармакологический профиль активации и модуляции рецепторов
сильно варьируют.
GPCR класса C, которые включают метаботропные
рецепторы γ-аминомасляной кислоты (GABAB), чувствительные
к кальцию рецепторы CaSR, рецепторы вкуса и метаботропные
глутаматные рецепторы (Erlandson et al., 2018), являются
функционально активными только в форме конститутивных
димерных комплексов (Romano et al., 1996b; Bai et al., 1998; Jones
et al., 1998; Kaupmann et al., 1998; White et al., 1998; Zhao et al.,
2003; Javitch, 2004; Kniazeff et al., 2011). Так GABAB-рецепторы
функционируют как гетеродимеры, состоящие из двух типов
рецепторных субъединиц – GABAB1 и GABAB2. Несмотря на то,
что агонист связывается только с ортостерическим сайтом
GABAB1-субъединицы, в отсутствие GABAB2-субъединицы
гормональный сигнал не передается. Установлено, что GABAB2-
субъединица выполняет сразу две функции – повышает сродство
GABAB1-субъединицы к агонисту и отвечает за передачу
гормонального сигнала с активированного рецептора на
гетеротримерные G-белки, поскольку в ее цитоплазматических
участках локализованы основные молекулярные детермнанты,
определяющие функциональное взаимодействие с G-белками (Pin
et al., 2004, 2007). Показано, что соединение CGP7930 с
активностью PAM для GABAB-рецептора связывается с
трансмембранными участками GABAB2-субъединицы, в
результате чего повышается сродство GABAB1-субъединицы к
ортостерическому агонисту и усиливается его стимулирующий
95
эффект на внутриклеточные сигнальные каскады (Binet et al.,
2004). Аллостерический эффект соединения CGP7930 на
активность GABAB-рецептора представляет собой пример
гетеродимер-специфичного аллостеризма, который, как
полагают, широко распространен в GPCR-системах (Binet et al.,
2004). Другой пример относится к различным подтипам
вкусового рецептора 1-го типа – T1R1, T1R2 и T1R3. Все эти
подтипы функционально не активны как в мономерной, так и в
гомодимерной формах (Xu et al., 2004). В составе T1R2/T1R3-
гетеродимерного комплекса с ортостерическим агонистом
аспартамом специфично связывается только T1R2-субъединица, в
то время как оба аллостерических регулятора с противоположной
активностью – цикламат (PAM) и лактизол (NAM) регулируют
активность рецептора T1R2/T1R3, специфично связываясь с его
T1R3-субъединицей (Jiang et al., 2005a, 2005b, 2005c; Winnig et
al., 2005; Cui et al., 2006). Эти результаты свидетельствуют о том,
что аллостерические модуляторы влияют на функциональную
активность T1R2/T1R3-гетеродимерного рецепторного комплекса
путем трансактивации или трансингибирования через
взаимодействие с протомерами рецептора.
Метаботропные глутаматные рецепторы (mGlu), которых
сейчас насчитывают восемь типов, подразделяемых на три
группы (группа I: mGlu1 и mGlu5; группа II: mGlu2 и mGlu3;
группа III: mGlu4, mGlu6, mGlu7 и mGlu8), могут
функционировать как гомо- и гетеродимеры, стабилизированные
межмолекулярными дисульфидными связями (Romano et al.,
1996a, 1996b; Kunishima et al., 2000; Tsuji et al., 2000; Niswender et
al., 2010). Важно отметить, что в случае mGlu-рецепторов группы
I гетеродимеризация может осуществляться только с
представителями той же группы, а не двух других групп
глутаматных рецепторов, в то время как mGlu-рецепторы групп II
и III не имеют таких ограничений и могут гетеродимеризоваться
как с представителями своей, так и других групп mGlu-
рецепторов (Doumazane et al., 2011). Регуляторные эффекты
аллостерических модуляторов на функциональную активность
96
гетеродимеров mGlu-рецепторов зависят от их состава, причем
механизмы действия NAM и PAM также могут сильно
различаться. Это было продемонстирировано в целом ряде работ
в условиях in vitro и in vivo.
В 2012 году изучено влияние соединения Ro 64-5229,
NAM для mGlu2-глутаматного рецептора, и структурно
различных PAM, специфичных в отношении mGlu2- или mGlu4-
глутаматных рецепторов, на активность рецепторов mGlu2 и
mGlu4, экспрессированных в клетках верхнего шейного ганлия
крысы. Для активации гетеродимерного комплекса, образуемого
mGlu2- и mGlu4-субъединицами, необходимо наличие сразу двух
ортостерических агонистов, каждый из которых специфично
связывается с одной из субъединиц рецептора (Kammermeier,
2012). Показано, что в присутствии соединения Ro 64-5229 ответ
гетеродимерного mGlu2/mGlu4-рецептора на агонисты
сохраняется. Это свидетельствует о необходимости блокирования
сразу обеих субъединиц рецептора, что невозможно в случае
mGlu2-специфичного Ro 64-5229. Сходная картина отмечалась и
при воздействии PAM на эти рецепторы. Так ни mGlu2-
специфичный PAM бифенилинданон A, ни mGlu4-специфичные
PAM, например (–)-N-фенил-7-(гидроксиимино)циклопропа-[b]
хромен-1a-карбоксамид (PHCCC) и N-(4-хлор-3-метоксифенил)-
2-пиридинкарбоксамид (VU0361737), не потенцировали
стимулирующие эффекты mGlu2- и mGlu4-агонистов. При этом
Ro 64-5229 и бифенилинданон A были эффективны в отношении
гомодимерного mGlu2/mGlu2-рецептора, в то время как PHCCC и
VU0361737 – в отношении гомодимерного mGlu4/mGlu4-
рецептора. Парадоксально, но одновременное использование
PAM для обеих субъединиц не вызывало потенцирования
эффекта ортостерических mGlu2- и mGlu4-агонистов, что
указывает на сложный характер влияний аллостерических
модуляторов на соотношение активных конформаций
гетеродимерных форм глутаматных рецепторов (Kammermeier,
2012).
97
В дальнейшем, уже in vivo и при использовании более
широкого набора аллостерических модуляторов, которые
связывались с различными по локализации сайтами глутаматных
рецепторов, были получены несколько иные результаты.
Исследования проводили на кортикостриальных нейронах мозга
крыс, проекции которых идут из коры головного мозга к
стриатальным синапсам, где экспрессируются обе субъединицы
метаботропных глутаматных рецепторов, mGlu2 и mGlu4.
Показано, что соединение PHCCC, специфичное по отношению к
mGlu4-субъединице PAM, как и в случае клеточных культур, не
влияло на стимуляцию глутаматного рецептора агонистами, в то
время как два других mGlu4-специфичных PAM – VU0361737 и
Lu AF21934, напротив, отчетливо повышали стимулирующий
эффект mGlu4-агониста L-2-амино-4-фосфомасляной кислоты
(Yin et al., 2014). Необходимо отметить, что если сайты
связывания соединений PHCCC и VU0361737 перекрываются, то
соединение Lu AF21934 связывается с аллостерическим сайтом
на mGlu4-субъединице, который отличается от такового для
соединения PHCCC. Возможно, этим и объясняются различия в
действии mGlu4-специфичных аллостерических модуляторов
PHCCC и Lu AF21934. С другой стороны, это не может
объяснить различий PAM-активности для соединения
VU0361737, которое было активным, как PAM, в
кортикостриальных нейронах мозга крыс in vivo, но не проявляло
активности при действии на культуру нейрональных клеток in
vitro. Нельзя исключить, что в отличие от клеточной культуры,
где все mGlu2- и mGlu4-субъединицы объединяются в
гетеродимеры, в нативных тканях сосуществуют популяции
гомо- и гетеродимеров и(или) имеются дополнительные
регуляторные белки, влияющие на механизмы аллостерической
регуляции.
98
2.5. Подходы, направленные на оптимизацию структуры
аллостерических модуляторов
Поиск и оптимизации химических структур

аллостерических модуляторов GPCR представляет собой крайне
сложную задачу. Это, с одной стороны, является серьезным
препятствием для успешной разработки и внедрения препаратов с
активностью PAM, NAM и SAM в медицину, и с другой,
побуждает интенсифицировать изучение структурно-
функциональной организации рецепторов и механизмов их
аллостерической регуляции. При разработке аллостерических
модуляторов необходимо принимать во внимание такие
показатели, как избирательность лиганда по отношению к
рецепторам, их комплексам и внутриклеточным сигнальным
каскадам, соотношение активности PAM и ago-PAM, клеточная
специфичность, различия во влиянии на сродство
ортостерических лигандов и их эффективность, кооперативность
взаимодействий, фармакокинетический профиль и
биодоступность, токсичность и возможные побочные эффекты.
Для разработки аллостерических модуляторов
используются как скрининг большого числа различных классов
химических соединений, так и направленные изменения
структуры функциональных групп. Для поиска групп, которые
устойчивы к функционализации, широко применяют стратегию
замещения с фтором, называемую “fluorine walk”. В этом случае
атомы фтора включают в различные положения ядра молекулы
аллостерического модулятора и оценивают, как такая
модификация влияет на фармакологическую активность
соединения (Lindsley et al., 2016).
Функциональные группы и заместители в молекулах
аллостерических регуляторов, модификации или замены которых
приводят к изменению специфической фармакологической
активности, определяют как «молекулярные переключатели»
(“molecular switches”). Выявление «молекулярных
переключателей» позволяет создать различные формы
99
аллостерических регуляторов – PAM, ago-PAM, NAM,
инверсионные агонисты, SAM (Sharma et al., 2008, 2009; Wood et
al., 2011). Необходима определенная осторожность при
модификации «молекулярных переключателей», поскольку даже
небольшие изменения их структуры способны критически
изменить фармакологический профиль. Одним из наиболее ярких
примеров этого являются модификация 3,3'-дифторбензалдазина
(DFB), являющегося первым синтезированным PAM для mGlu5-
глутаматного рецептора (EC50=2.6 мкМ). Замена в DFB обоих
атомов фтора на метоксируппы приводила к соединению с NAM-
активностью (EC50=3.0 мкМ), в то время как при замене тех же
атомов на хлор было получено соединение с SAM-активностью,
которое со значение EC50=7.6 мкМ блокировало PAM-эффект
DFB (O’Brien et al., 2003).
Тот факт, что даже небольшие изменения структуры
способны столь кардинально изменить свойства аллостерических
регуляторов, указывает на возможность того, что in vivo в
процессе деградации, как гидролитической, так и окислительной,
могут появляться производные с новыми фармакологическими
свойствами. Здесь уместно упомянуть препарат VU0403602 с
активностью PAM для mGlu5-глутаматного рецептора, который в
организме моногидроксилируется цитохромом P450, вследствие
чего в циклобутановом кольце появляется гидроксильная группа.
В результате у гидроксилированной формы препарата
VU0403602 ослабляется PAM-активность, усиливается
собственная агонистическая активность по отношению к mGlu5-
глутаматному рецептору, слабо выраженная у соединения
VU0403602, и повышается проницаемость гидроксилированной
формы через гематоэнцефалический барьер. Следствием этого
является появление судорог и других побочных эффектов у крыс
при системном введении препарата VU0403602 (Bridges et al.,
2013).
При разработке аллостерических регуляторов необходимо
принимать во внимание наличие мутаций и полиморфизмов в
молекулах GPCR, которые очень часто прямо или косвенно
100
затрагивают структуру аллостерических сайтов, а также влияют
на конформационные характеристики участков GPCR,
ответственных за кооперативность взаимодействий между
аллостерическими и ортостерическими лигандами. Показано, что
мутация высококонсервативного остатка фенилаланина в шестой
ТМС глутаматных рецепторов может быть триггером,
переключающим кооперативность аллостерического модулятора.
Так при замене этого остатка в mGlu1-глутаматном рецепторе
(Phe801Ala) препарат YM298198, который при воздействии на
рецептор дикого типа проявляет активность NAM, превращается
в селективный PAM для того же рецептора (Fukuda et al., 2009). В
случае той же замены в mGlu5-глутаматном рецепторе (Phe787Ala)
активность DFB, как PAM в отношении мобилизации
внутриклеточного кальция под действием mGlu5-агонистов,
трансформировалась в NAM-активность (Muhlemann et al., 2006).
В дальнейшем в трансмембранном домене mGlu5-глутаматного
рецептора крысы были идентифицированы еще три
аминокислотных остатка Tyr658, Trp784 и Ser808, замены которых
также приводили к изменению фармакологического профиля
аллостерических регуляторов. При этом замена остатка Trp784 на
аланин оказывала различное влияние на кооперативность NAM,
включая уменьшение величины отрицательной кооперативности
и даже ее «переключение» на положительную кооперативность
по отношению глутамату (Gregory et al., 2013, 2014). Важно
отметить, что замены остатка Trp784 отрицательно сказывались на
аффинности рецептора как к NAM, так и к PAM, в то время как
кооперативность PAM либо не менялась, либо повышалась
(Gregory et al., 2013; Turlington et al., 2013). Эти данные
свидетельствуют о том, что Trp784 является критичным
аминокислотным остатком, определяющим стабилизацию
различных конформаций рецептора при его связывании с NAM.
Замены остатка Tyr658 в третьей ТМС и остатка Ser808 в седьмой
ТМС mGlu5-глутаматного рецептора превращали некоторые
аллостерические модуляторы с активностью PAM для эффектов
101
глутамата в регуляторы с активностью NAM и SAM (Gregory et
al., 2013; Turlington et al., 2013).
Кристаллографические исследования mGlu5-
глутаматного рецептора в комплексе с NAM показали, что
остатки Tyr658, Trp784 и Ser808 образуют водородные связи с
молекулами воды, локализованными внутри трансмембранного
домена рецептора, что может указывать на важную роль
структурированного H2O-матрикса в реализации эффектов
кооперативности между аллостерическим и ортостерическим
сайтами (Dore et al., 2014; Christopher et al., 2015). В этом
отношении GPCR имеют некоторые общие черты с ионными
каналами и Ca2+-АТФазами, в которых структурированная вода
также вовлечена в функционирование воротного механизма и в
регуляцию активности ионных каналов аллостерическими
лигандами (Musgaard et al., 2012; Dudev, Lim, 2014). Необходимо
отметить, что эндогенные аллостерические модуляторы, такие
как ионы натрия, также вовлечены в структурирование молекул
воды внутри трансмембранного домена GPCR и его частей,
ориентированных как во внеклеточное пространство, так и в
цитоплазму.
Точечные мутации как в ортостерическом, так и в
аллостерическом сайтах мускариновых ацетилхолиновых
рецепторов способны менять фармакологический профиль
аллостерических регуляторов. Так мутации в ортостерическом
сайте m2-мускаринового рецептора переключают эффекты
соединения LY2033298, как NAM для m2-агониста QNB, на
положительную регуляцию активности мутантного рецептора
(Valant et al., 2012). Мутация в аллостерическом сайте m1-
мускаринового рецептора переключает кооперативность
соединения BQCA, функционирующего при связывании с
рецептором дикого типа как PAM. При связывании с мутантным
рецептором соединение BQCA по фармакологическому профилю
становится NAM или SAM как по влиянию на аффинность
связывания ацетилхолина, так и по влиянию на функциональную
активность рецептора (Abdul-Ridha et al., 2014a). В соответствии
102
с этим, как искусственно вызванные, так и природные мутации
могут заметно влиять на конечные эффекты аллостерических
лигандов, в значительной степени определяя их
фармакологические характеристики. Это необходимо учитывать
при разработке препаратов на основе аллостерических
регуляторов для лечения врожденных заболеваний,
обусловленных мутациями и полиморфизмами в генах,
кодирующих GPCR.
AbdAlla S., Lother H., Abdel-tawab A.M., Quitterer U. The Angiotensin II
AT2 Receptor is an AT1 Receptor Antagonist // J. Biol. Chem. 2001. V. 276 (43). P.
39721–39726. doi: 10.1074/jbc.M105253200.
Abdul-Ridha A., Lane J.R., Mistry S.N., Lopez L., Sexton P.M., Scammells
P.J., Christopoulos A., Canals M. Mechanistic Insights into Allosteric Structure-
Function Relationships at the M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor // J. Biol. Chem.
2014a. V. 289 (48). P. 33701–33711. doi: 10.1074/jbc.M114.604967.
Abdul-Ridha A., Lopez L., Keov P., Thal D.M., Mistry S.N., Sexton P.M.,
Lane J.R., Canals M., Christopoulos A. Molecular Determinants of Allosteric
Modulation at the M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor // J. Biol. Chem. 2014b. V.
289 (9). P. 6067–6079. doi: 10.1074/jbc.M113.539080.
Ahn K.H., Mahmoud M.M., Kendall D. The Allosteric Modulator
ORG27569 Induces CB1 Cannabinoid Receptor High Affinity Agonist Binding State,
Receptor Internalization, and Gi Protein-Independent ERK1/2 Kinase Activation // J.
Biol. Chem. 2012. V. 287 (15). P. 12070–12082. doi: 10.1074/jbc.M111.316463.
Allegretti M., Bertini R., Bizzarri C., Beccari A., Mantovani A., Locati M.
Allosteric inhibitors of chemoattractant receptors: opportunities and pitfalls // Trends
Pharmacol. Sci. 2008. V. 29. P. 280–286. doi: 10.1016/j.tips.2008.03.005.
Allegretti M., Cesta M.C., Locati M. Allosteric modulation of
chemoattractant receptors // Front. Immunol. 2016. V. 7. P. 170. doi:
10.3389/fimmu.2016.00170.
Archbold J.K., Flanagan J.U., Watkins H.A., Gingell J.J., Hay D.L.
Structural Insights into RAMP Modification of Secretin Family G Protein-Coupled
Receptors: Implications for Drug Development // Trends Pharmacol. Sci. 2011. V, 32
(10). P. 591–600. doi: 10.1016/j.tips.2011.05.007.
Ayoub M.A., Levoye A., Delagrange P., Jockers R. Preferential Formation
of MT1/MT2 Melatonin Receptor Heterodimers with Distinct Ligand Interaction
Properties Compared with MT2 Homodimers // Mol. Pharmacol. 2004. V. 66 (2). P.
312–321. doi: 10.1124/mol.104.000398.
103
Bai M., Trivedi S., Brown E.M. Dimerization of the Extracellular Calcium-
Sensing Receptor (CaR) on the Cell Surface of CaR-Transfected HEK293 Cells // J.
Biol. Chem. 1998. V. 273 (36). P. 23605–23610. doi: 10.1074/jbc.273.36.23605.
Bernat V., Brox R., Heinrich M.R., Auberson Y.P., Tschammer N. Ligand-
Biased and Probe-Dependent Modulation of Chemokine Receptor CXCR3 Signaling
by Negative Allosteric Modulators // ChemMedChem. 2015. V. 10 (3). P. 566–574.
doi: 10.1002/cmdc.201402507.
Bertrand D., Gopalakrishnan M. Allosteric Modulation of Nicotinic
Acetylcholine Receptors // Biochem. Pharmacol. 2007. V. 74 (8). P. 1155–1163. doi:
10.1016/j.bcp.2007.07.011.
Beshore D.C., Di Marco C., Chang R.K., Greshock T.J., Ma L., Wittmann
M., Seager M.A., Koeplinger K.A., Thompson C.D., Fuerst J., Hartman G.D.,
Bilodeau M.T., Ray W.J., Kuduk S.D. MK-7622: A First-in-Class M1 Positive
Allosteric Modulator Development Candidate // ACS Med. Chem. Lett. 2018. V. 9
(7). P. 652-656. doi: 10.1021/acsmedchemlett.8b00095.
Binet V., Brajon C., Le Corre L., Acher F., Pin J.-P., Prezeau L. The
Heptahelical Domain of GABAB2 Is Activated Directly by CGP7930, a Positive
Allosteric Modulator of the GABAB Receptor // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P.
29085–29091.
Bock A., Merten N., Schrage R., Dallanoce C., Batz J., Klockner J., Schmitz
J., Matera C., Simon K., Kebig A., Peters L., Muller A., Schrobang-Ley J., Trankle C.,
Hoffmann C., De Amici M., Holzgrabe U., Kostenis E., Mohr K. The allosteric
vestibule of a seven transmembrane helical receptor controls G-protein coupling //
Nat. Commun. 2012. V. 3. P. 1044. doi: 10.1038/ncomms2028.
Bomberger J.M., Parameswaran N., Hall C.S., Aiyar N., Spielman W.S.
Novel Function for Receptor Activity-Modifying Proteins (RAMPs) in Post-
Endocytic Receptor Trafficking // J. Biol. Chem. 2005. V. 280 (10). P. 9297–9307.
doi: 10.1074/jbc.M413786200.
Bomberger J.M., Parameswaran N., Spielman W.S. Regulation of GPCR
Trafficking by RAMPs // Adv. Exp. Med. Biol. 2012. V. 744. P. 25–37. doi:
10.1007/978-1-4614-2364-5_3.
Bridges T.M., Lindsley C.W. G-Protein Coupled Receptors: From Classical
Modes of Modulation to Allosteric Mechanisms // ACS Chem. Biol. 2008. V. 3 (9). P.
530–542. doi: 10.1021/cb800116f.
Bridges T.M., Rook J.M., Noetzel M.J., Morrison R.D., Zhou Y., Gogliotti
R.D., Vinson P.N., Jones C.K., Niswender C.M., Lindsley C.W., et al.
Biotransformation of a Novel Positive Allosteric Modulator of Metabotropic
Glutamate Receptor Subtype 5 Contributes to Seizures in Rats Involving a Receptor
Agonism-Dependent Mechanism // Drug Metab. Dispos. 2013. V. 41 (9). P. 1703–
1714. doi: 10.1124/dmd.113.052084.
Brogi S., Tafi A., Desaubry L., Nebigil C.G. Discovery of GPCR ligands for
probing signal transduction pathways // Front. Pharmacol. 2014. V. 5. P. 255. doi:
10.3389/fphar.2014.00255.
104
Burford N.T., Watson J., Bertekap R., Alt A. Strategies for the identification
of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors // Biochem. Pharmacol. 2011.
V. 81. P. 691–702. doi: 10.1016/j.bcp.2010.12.012.
Chan W.Y., McKinzie D.L., Bose S., Mtchell S.N., Witkin J.M., Thompson
R.G., Christopoulos A., Lazareno S., Birdsall N.J., Bymaster F.P., Felder C.C.
Allosteric Modulation of the Muscarinic M4 Receptor as an Approach to Treating
Schizophrenia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105 (31). P. 10978–10983. doi:
10.1073/pnas.0800567105.
Cho H.P., Engers D.W., Venable D.F., Niswender C.M., Lindsley C.W.,
Conn P.J., Emmitte K.A., Rodriguez A.L. A Novel Class of Succinimide-Derived
Negative Allosteric Modulators of Metabotropic Glutamate Receptor Subtype 1
Provides Insight into a Disconnect in Activity Between Rat and Human Receptors //
ACS Chem. Neurosci. 2014. V. 5. P. 597–610.
Christopher J.A., Aves S.J., Bennett K.A., Doré A.S., Errey J.G., Jazayeri
A., Marshall F.H., Okrasa K., Serrano-Vega M.J., et al. Fragment and Structure-
Based Drug Discovery for a Class C GPCR: Discovery of the mGlu 5 Negative
Allosteric Modulator HTL14242 (3-Chloro-5-[6-(5-fluoropyridin-2-yl)pyrimidin-4-
yl]-benzonitrile) // J. Med. Chem. 2015. V. 58. P. 6653–6664.
Christopoulos A. Allosteric binding sites on cell-surface receptors: novel
targets for drug discovery // Nat. Rev. Drug Discov. 2002. V. 1. P. 198–210. doi:
10.1038/nrd746.
Christopoulos A., Changeux J.P., Catterall W.A., Fabbro D., Burris T.P.,
Cidlowski J.A., Olsen R.W., Peters J.A., Neubig R.R., Pin J.P., et al. International
Union of Basic and Clinical Pharmacology. XC. Multisite Pharmacology:
Recommendations for the Nomenclature of Receptor Allosterism and Allosteric
Ligands // Pharmacol. Rev. 2014. V. 66. P. 918–947.
Christopoulos A., Kenakin T. G Protein-Coupled Receptors Allosterism and
Complexing // Pharmacol. Rev. 2002. V. 54. P. 323–374.
Conn P.J., Christopoulos A., Lindsley C.W. Allosteric Modulators of
GPCRs as a Novel Approach to Treatment of CNS Disorders // Nat. Rev. Drug
Discovery. 2009. V. 8. P. 41–54.
Conn P.J., Lindsley C.W., Meiler J., Niswender C.M. Opportunities and
Challenges in the Discovery of Allosteric Modulators of GPCRs for the Treatment of
CNS Disorders // Nat. Rev. Drug Discovery. 2014. V. 13. P. 692–708.
Cook A.E., Mistry S.N., Gregory K.J., Furness S.G., Sexton P.M.,
Scammells P.J., Conigrave A.D., Christopoulos A., Leach K. Biased Allosteric
Modulation at the CaS Receptor Engendered by Structurally Diverse Calcimimetics //
Br. J. Pharmacol. 2015. V. 172. P. 185–200.
Cui M., Jiang P., Maillet E., Max M., Margolskee R.F., Osman R. The
Heterodimeric Sweet Taste Receptor has Multiple Potential Ligand Binding Sites //
Curr. Pharm. Des. 2006. V. 12. P. 4591–4600.
Davey A.E., Leach K., Valant C., Conigrave A.D., Sexton P.M.,
Christopoulos A. Positive and Negative Allosteric Modulators Promote Biased
105
Signaling at the Calcium-Sensing Receptor // Endocrinology. 2012. V. 153. P. 1232–
1241.
Dias J.A., Bonnet B., Weaver B.A., Watts J., Kluetzman K., Thomas R.M.,
Poli S., Mutel V., Campo B. A Negative Allosteric Modulator Demonstrates Biased
Antagonism of the Follicle Stimulating Hormone Receptor // Mol. Cell. Endocrinol.
2011. V. 333. P. 143–150.
Digby G.J., Noetzel M.J., Bubser M., Utley T.J., Walker A.G., Byun N.B.,
LeBois E.P., Xiang Z., Sheffler D.J., Niswender C.M., et al. Novel Allosteric Agonists
of the M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor Induce Brain Region-Specific
Responses and Correspond with Behavioral Effects in Animal Models // J. Neurosci.
2012a. V. 32. P. 8532–8544.
Digby G.J., Utley T.J., Lamsal A., Sevel C., Sheffler D.J., Lebois E.P.,
Bridges T.M., Wood M.R., Niswender C.M., Lindsley C.W., Conn P.J. Chemical
Modification of the M1 Agonist VU0364572 Reveals Molecular Switches in
Pharmacology as Well as a Bitopic Binding Mode // ACS Chem. Neurosci. 2012b. V.
3. P. 1025–1036.
Dore A.S., Okrasa K., Patel J.G., Serrano-Vega M., Bennett K., Cooke
R.M., Errey J.G., Jazayeri A., Khan S., Tehan B., et al. Structure of Class C GPCR
Metabotropic Glutamate Receptor 5 Transmembrane Domain // Nature. 2014. V. 511.
P. 557–562.
Dorr P., Westby M., Dobbs S., Griffin P., Irvine B., Macartney M., Mori J.,
Rckett G., Smith-Burchnell C., Napier C., Webster R., Armour D., Price D., Stammen
B., Wood A., Perros M. Maraviroc (UK-427,857), a Potent, Orally Bioavailable, and
Selective Small-Molecule Inhibitor of Chemokine Receptor CCR5 with Broad-
Spectrum Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity // Antimicrob.
Agents Chemother. 2005. V. 49. P. 4721–4732.
Doumazane E., Scholler P., Zwier J.M., Trinquet E., Rondard P., Pin J.-P.
A New Approach to Analyze Cell Surface Protein Complexes Reveals Specific
Heterodimeric Metabotropic Glutamate Receptors // FASEB J. 2011. V. 25. P. 66–77.
Dudev T., Lim C. Ion selectivity strategies of sodium channel selectivity
filters // Acc. Chem. Res. 2014. V. 47 (12). P. 3580–3587. doi: 10.1021/ar5002878.
Emmitte K. A mGlu5 Negative Allosteric Modulators: A Patent Review
(2010–2012) // Expert Opin. Ther. Pat. 2013. V. 23. P. 393–408.
Erlandson S.C., McMahon C., Kruse A.C. Structural Basis for G Protein-
Coupled Receptor Signaling // Annu. Rev. Biophys. 2018. doi: 10.1146/annurev-
biophys-070317-032931.
Farrell M., Roth B.L. Allosteric Antipsychotics: M4Muscarinic Potentiators
as Novel Treatments for Schizophrenia // Neuropsychopharmacology. 2010. V. 35. P.
851–852.
Fenton A.W. Allostery: An Illustrated Definition for the ‘Second Secret of
Life // Trends Biochem. Sci. 2008. V. 33. P. 420–425.
106
Foster D.J., Conn P.J. Allosteric Modulation of GPCRs: New Insights and
Potential Utility for Treatment of Schizophrenia and Other CNS Disorders // Neuron.
2017. V. 94 (3). P. 431-446. doi: 10.1016/j.neuron.2017.03.016.
Fronik P., Gaiser B.I., Sejer Pedersen D. Bitopic ligands and metastable
binding sites: opportunities for G protein-coupled receptor (GPCR) medicinal
chemistry // J. Med. Chem. 2017. V. 60. P. 4126. doi:
10.1021/acs.jmedchem.6b01601.
Fukuda J., Suzuki G., Kimura T., Nagatomi Y., Ito S., Kawamoto H., Ozaki
S., Ohta H. Identification of a Novel Transmembrane Domain Involved in the
Negative Modulation of mGluR1 Using a Newly Discovered Allosteric mGluR1
Antagonist, 3-Cyclohexyl-5-fluoro-6-methyl-7-(2-morpholin-4-ylethoxy)-4H–
chromen-4-one // Neuropharmacology. 2009. V. 57 (4). P. 438–445. doi:
10.1016/j.neuropharm.2009.06.017.
Garnock-Jones K.P. Brexpiprazole: a review in schizophrenia // CNS
Drugs. 2016. V. 30. P. 335– 342. doi: 10.1007/s40263-016-0325-8.
Gentry P.R., Sexton P.M., Christopoulos A. Novel allosteric modulators of
G protein-coupled receptors // J. Biol. Chem. 2015. V. 290 (32). P. 19478–19488. doi:
10.1074/jbc.R115.662759.
George S.R., Fan T., Xie Z., Tse R., Tarn V., Varghese G., O’Dowd B.F.
Oligomerization of µ- and δ-Opioid Receptors. Generation of Novel Functional
Properties // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 26128–26135.
Gregory K.J., Nguyen E.D., Malosh C., Mendenhall J.L., Zic J.Z., Bates
B.S., Noetzel M.J., Squire E.F., Turner E.M., Rook J.M., et al. Identification of
Specific Ligand-Receptor Interactions that Govern Binding and Cooperativity of
Diverse Modulators to a Common Metabotropic Glutamate Receptor 5 Allosteric Site
// ACS Chem. Neurosci. 2014. V. 5. P. 282–295.
Gregory K.J., Nguyen E.D., Reiff S.D., Squire E.F., Stauffer S.R., Lindsley
C.W., Meiler J., Conn P.J. Probing the Metabotropic Glutamate Receptor 5 (mGlu 5)
Positive Allosteric Modulator (PAM) Binding Pocket: Discovery of Point Mutations
that Engender a “Molecular Switch” in PAM Pharmacology // Mol. Pharmacol. 2013.
V. 83. P. 991–1006.
Gregory K.J., Noetzel M.J., Rook J.M., Vinson P.N., Stauffer S.R.,
Rodriguez A.L., Emmitte K.A., Zhou Y., Chun A.G., Felts A.S., et al. Investigating
mGlu5 Allosteric Modulator Cooperativity, Affintiy and Agonism: Enriching
Structure-Function Studies and Structure-Activity Relationships // Mol. Pharmacol.
2012. V. 82. P. 860–875.
Harrington P.E., Fotsch C. Calcium Sensing Receptor Activators:
Calcimimetics // Curr. Med. Chem. 2007. V. 14 (28). P. 3027–3034.
Hay D.L., Poyner D.R., Sexton P.M. GPCR Modulation by RAMPs //
Pharmacol. Ther. 2006. V. 109 (1-2). P. 173–197. doi:
10.1016/j.pharmthera.2005.06.015.
107
Hopkins C.R. Is There a Path Forward for mGlu2 Positive Allosteric
Modulators for the Treatment of Schizophrenia? // ACS Chem. Neurosci. 2013. V. 4
(2). P. 211–213. doi: 10.1021/cn400023y.
Jalan-Sakrikar N., Field J.R., Klar R., Mattmann M.E., Gregory K.J.,
Zamorano R., Engers D.W., Bollinger S.R., Weaver C.D., Days E.L., Lewis L.M.,
Utley T.J., Hurtado M., Rigault D., Acher F., Walker A.G., Melancon B.J., Wood
M.R., Lindsley C.W., Conn P.J., Xiang Z., Hopkins C.R., Niswender C.M.
Identification of Positive Allosteric Modulators VU0155904 (ML397) and
VU0422288 (ML396) Reveals New Insights Into the Biology of Metabotropic
Glutamate Receptor 7 // ACS Chem. Neurosci. 2014. V. 5 (12). P. 1221–1237. doi:
10.1021/cn500153z.
Javitch J. A The Ants go Marching Two by Two: Oligomeric Structure of
G-Protein-Coupled Receptors // Mol. Pharmacol. 2004. V. 66 (5). P. 1077–1082. doi:
10.1124/mol.104.006320.
Jiang P., Cui M., Ji Q., Snyder L., Liu Z., Benard L., Margolskee R.F.,
Osman R., Max M. Molecular Mechanisms of Sweet Receptor Function // Chem.
Senses. 2005a. V. 30 (Suppl 1). P. i17–i18.
Jiang P., Cui M., Zhao B., Liu Z., Snyder L.A., Benard L.M.J., Osman R.,
Margolskee R.F., Max M. Lactisole Interacts with the Transmembrane Domains of
Human T1R3 to Inhibit Sweet Taste // J. Biol. Chem. 2005b. V. 280 (15). P. 15238–
15246. doi: 10.1074/jbc.M414287200.
Jiang P., Cui M., Zhao B., Snyder L.A., Benard L.M.J., Osman R., Max M..,
Margolskee R.F. Identification of the Cyclamate Interaction Site Within the
Transmembrane Domain of the Human Sweet Taste Receptor Subunit T1R3 // J. Biol.
Chem. 2005c. V. 280 (40). P. 34296–34305. doi: 10.1074/jbc.M505255200.
Jones K.A., Borowsky B., Tamm J.A., Craig D.A., Durkin M.M., Dai M.,
Yao W.-J., Johnson M., Gunwaldsen C., Huang L.-Y., Tang C., Shen Q., Salon J.A.,
Morse K., Laz T., Smith K.E., Nagarathnam D., Noble S.A., Branchek T.A., Gerald C.
GABAB Receptors Function as a Heteromeric Assembly of the Subunits GABABR1
and GABABR2 // Nature. 1998. V. 396 (6712). P. 674–679. doi: 10.1038/25348.
Kammermeier P.J. Functional and Pharmacological Characteristics of
Metabotropic Glutamate Receptors 2/4 Heterodimers // Mol. Pharmacol. 2012. V. 82
(3). P. 438–447. doi: 10.1124/mol.112.078501.
Kaupmann K., Malitschek B., Schuler V., Heid J., Froestl W., Beck P.,
Mosbacher J., Bischoff S., Kulik A., Shigemoto R., Karschin A., Bettler B. GABAB-
Receptor Subtypes Assemble into Functional Heteromeric Complexes // Nature. 1998.
V. 396 (6712). P. 683–687. doi: 10.1038/25360.
Kenakin T.P. 7TM Receptor Allostery: Putting Numbers to Shapeshifting
Proteins // Trends Pharmacol. Sci. 2009. V. 30 (9). P. 460–469. doi:
10.1016/j.tips.2009.06.007.
Kenakin T. Biased Signalling and Allosteric Machines: New Vistas and
Challenges for Drug Discovery // Br. J. Pharmacol. 2012. V. 165 (6). P. 1659–1669.
doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01749.x.
108
Kenakin T., Christopoulos A. Signalling Bias in New Drug Discovery:
Detection, Quantification and Therapeutic Impact // Nat. Rev. Drug Discovery. 2013.
V. 12 (3). P. 205–216. doi: 10.1038/nrd3954.
Kenakin T., Miller L.J. Seven Transmembrane Receptors as Shapeshifting
Proteins: The Impact of Allosteric Modulation and Functional Selectivity on New
Drug Discovery // Pharmacol. Rev. 2010. V. 62. P. 265–304.
Kenakin T., Watson C., Muniz-Medina V., Christopoulos A., Novick S. A
Simple Method for Quantifying Functional Selectivity and Agonist Bias // ACS
Chem. Neurosci. 2012. V. 3 (3). P. 193–203. doi: 10.1021/cn200111m.
Kniazeff J., Prezeau L., Rondard P., Pin J.-P., Goudet C. Dimers and
Beyond: The Functional Puzzles of Class C GPCRs //. Pharmacol. Ther. 2011. V. 130
(1). P. 9–25. doi: 10.1016/j.pharmthera.2011.01.006.
Kostenis E., Milligan G., Christopoulos A., Sanchez-Ferrer C.F., Heringer-
Walther S., Sexton P.M., Gembardt F., Kellett E., Martini L., Vanderheyden P.,
Schultheiss H.-P., Walther T. G-Protein-Coupled Receptor Mas Is a Physiological
Antagonist of the Angiotensin II Type 1 Receptor // Circulation. 2005. V. 111 (14). P.
1806–1813. doi: 10.1161/01.CIR.0000160867.23556.7D.
Kunishima N., Shimada Y., Tsuji Y., Sato T., Yamamoto M., Kumasaka T.,
Nakanishi S., Jingami H., Morikawa K. Structural Basis of Glutamate Recognition by
a Dimeric Metabotropic Glutamate Receptor // Nature. 2000. V. 407 (6807). P. 971–
977. doi: 10.1038/35039564.
Lane J.R., Chubukov P., Liu W., Canals M., Cherezov V., Abagyan R.,
Stevens R.C., Katritch V. Structure-based ligand discovery targeting orthosteric and
allosteric pockets of dopamine receptors // Mol. Pharmacol. 2013. V. 84. P. 794– 807.
doi: 10.1124/mol.113.088054.
Lane J.R., Donthamsetti P., Shonberg J., Draper-Joyce C.J., Dentry S.,
Michino M., Shi L., Lopez L., Scammells P.J., Capuano B., Sexton P.M., Javitch J.A.,
Christopoulos A. A new mechanism of allostery in a G protein-coupled receptor dimer
// Nat. Chem. Biol. 2014. V. 10. P. 745–752. doi: 10.1038/nchembio.1593.
Lane R.J., Abdul-Ridha A., Canals M. Regulation of G Protein-Coupled
Receptors by Allosteric Ligands // ACS Chem. Neurosci. 2013. V. 4. P. S27–S34.
Lavreysen H., Langlois X., Ahnaou A., Drinkenburg W., te Riele P.,
Biesmans I., Van der Linden I., Peeters L., Megens A., Wintmolders C., et al.
Pharmacological Characterization of JNJ-40068782, a New Potent, Selective, and
Systemically Active Positive Allosteric Modulator of the mGlu2 Receptor and its
Radioligand[3H]-JNJ-40068782 // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2013. V. 346. P. 514–527.
Leach K., Loiacono E.I., Felder C.C., McKinzie D.L., Mogg A., Shaw D.B.,
Sexton P.M., Christopoulos A. Molecular Mechanisms of Action and in Vivo
Validation of an M4Muscarinic Acetylcholine Receptor Allosteric Modulator with
Potential Antipsychotic Properties // Neuropsychopharmacology. 2010. V. 35. P. 855–
869.
109
Leach K., Sexton P.M., Christopoulos A. Allosteric GPCR Modulators:
Taking Advantage of Permissive Receptor Pharmacology // Trends Pharmacol. Sci.
2007. V. 28 (8). P. 382–389. doi: 10.1016/j.tips.2007.06.004.
Leach K., Wen A., Davey A.E., Sexton P.M., Conigrave A.D., Christopoulos
A. Identification of Molecular Phenotypes and Biased Signaling Induced by Naturally
Occurring Mutations of the Human Calcium-Sensing Receptor // Endocrinology.
2012. V. 153 (9). P. 4304–4316. doi: 10.1210/en.2012-1449.
Lee Y., Basith S., Choi S. Recent Advances in Structure-Based Drug Design
Targeting Class A G Protein-Coupled Receptors Utilizing Crystal Structures and
Computational Simulations // J. Med. Chem. 2018. V. 61 (1). P. 1-46. doi:
Levoye A., Dam L., Ayoub M.A., Guillaume J.L., Couturier C., Delagrange
P., Jockers R. The Orphan GPR50 Receptor Specifically Inhibits MT1Melatonin
Receptor Function Through Heterodimerization // EMBO J. 2006. V. 25 (13). P.
3012–3023. doi: 10.1038/sj.emboj.7601193.
Lindsley C.W. Philip S. Portoghese Medicinal Chemistry Lectureship: Drug
Discovery Targeting Allosteric Sites // J. Med. Chem. 2014. V. 57 (18). P. 7485–
7498. doi: 10.1021/jm5011786.
Lindsley C.W., Emmitte K.A., Hopkins C.R., Bridges T.M., Gregory K.J.,
Niswender C.M., Conn P.J. Practical Strategies and Concepts in GPCR Allosteric
Modulator Discovery: Recent Advances with Metabotropic Glutamate Receptors //
Chem. Rev. 2016. V. 116 (11). P. 6707-6741. doi: 10.1021/acs.chemrev.5b00656.
Lundstrom L., Bissantz C., Beck J., Wettstein J.G., Woltering T.J.,
Wichmann J., Gatti S. Structural Determinants of Allosteric Antagonism at
Metabotropic Glutamate Receptor 2: Mechanistic Studies with New Potent Negative
Allosteric Modulators // Br. J. Pharmacol. 2011. V. 164 (2b). P. 521–527. doi:
10.1111/j.1476-5381.2011.01409.x.
Mario J.E., Niswender C.M., Luo Q., Brady A.E., Shirey J.K., Rodriguez
A.L., Bridges T.M., Williams R., Days E., Nalywajko N.T., et al. Identification and
Characterization of Novel Allosteric Potentiators of M1 Muscarinic Receptors Reveals
Multiple Modes of Activity // Mol. Pharm. 2009. V. 75 (3). P. 577–588.
Menniti F.S., Lindsley C.W., Conn P.J., Pandit J., Zagouras P., Volkmann
R.A. Allosteric Modulation for the Treatment of Schizophrenia: Targeting
Glutamatergic Networks // Curr. Top. Med. Chem. 2013. V. 13. P. 26–54.
Milligan G. The Role of Dimerisation in the Cellular Trafficking of G-
Protein-Coupled Receptors // Curr. Opin. Pharmacol. 2010. V. 10 (1). P. 23–29. doi:
10.1016/j.coph.2009.09.010.
Milligan G., Smith N.J. Allosteric Modulation of Heterodimeric G-Protein-
Coupled Receptors // Trends Pharmacol. Sci. 2007. V. 28 (12). P. 615–620. doi:
10.1016/j.tips.2007.11.001.
Mohr K., Schmitz J., Schrage R., Trankle C., Holzgrabe U. Molecular
alliance-from orthosteric and allosteric ligands to dualsteric/bitopic agonists at G
110
protein coupled receptors // Angew. Chem. Int. Ed. 2013. V. 52. P. 508–516. doi:
10.1002/anie.201205315.
Moran S.P., Dickerson J.W., Cho H.P., Xiang Z., Maksymetz J., Remke
D.H., Lv X., Doyle C.A., Rajan D.H., Niswender C.M., Engers D.W., Lindsley C.W.,
Rook J.M., Conn P.J. M1-positive allosteric modulators lacking agonist activity
provide the optimal profile for enhancing cognition // Neuropsychopharmacology.
2018. V. 43 (8). P. 1763-1771. doi: 10.1038/s41386-018-0033-9.
Morris L.C., Days E.L., Turney M., Mi D., Lindsley C.W., Weaver C.D.,
Niswender K.D. A Duplexed High-Throughput Screen to Identify Allosteric
Modulators of the Glucagon-Like Peptide 1 and Glucagon Receptor // J. Biomol.
Screening. 2014a. V. 19. P. 847–858.
Morris L.C., Nance K.D., Gentry P.R., Days E.L., Weaver C.D., Niswender
C.M., Thompson A.D., Jones C.K., Locuson C.W., Morrison R.D., et al. Discovery of
(S)-2-Cyclopentyl-N-((1-isopropylpyrrolidin2-yl)-9-methyl-1-oxo-2,9-dihydro-1H–
pyrrido[3,4-b]indole-4-carboxamide (VU0453379): A Novel, CNS Penetrant GLP-1
Positive Allosteric Modulator (PAM) // J. Med. Chem. 2014b. V. 57. P. 10192–
10197.
Muhlemann A., Ward N.A., Kratochwil N., Diener C., Fischer C., Stucki A.,
Jaeschke G., Malherbe P., Porter R.H. Determination of Key Amino Acids
Implicated in the Actions of Allosteric Modulation by 3,3-Difluorobenzaldazine on
Rat mGlu5 Receptors // Eur. J. Pharmacol. 2006. V. 529 (1-3). P. 95–104. doi:
10.1016/j.ejphar.2005.11.008.
Musgaard M., Thøgersen L., Schiøtt B., Tajkhorshid E. Tracing cytoplasmic
Ca2+ ion and water access points in the Ca(2+)-ATPase // Biophys. J. 2012. V. 102
(2). P. 268–277. doi: 10.1016/j.bpj.2011.12.009.
Niswender C.M., Johnson K.A., Miller N.R., Ayala J.E., Luo Q., Williams
R., Saleh S., Orton D., Weaver C.D., Conn P.J. Context-Dependent Pharmacology
Exhibited by Negative Allosteric Modulators of Metabotropic Glutamate Receptor 7 //
Mol. Pharmacol. 2010. V. 77 (3). P. 459–468. doi: 10.1124/mol.109.058768.
O’Brien J.A., Lemaire W., Chen T.-B., Chang R.S.L., Jacobson M.A., Ha
S.N., Lindsley C.W., Schaffhauser H.J., Sur C., Pettibone D.J., Conn P.J., Williams
D.L., Jr. A Family of Highly Selective Allosteric Modulators of the Metabotropic
Glutamate Receptor Subtype 5 (mGluR5) // Mol. Pharmacol. 2003. V. 64. P. 731–
741.
Pin J.P., Kniazeff J., Binet V., Liu J., Maurel D., Galvez T., Duthey B.,
Havlickova M., Blahos J., Prezeau L., Rondard P. Activation Mechanism of the
Heterodimeric GABAB Receptor // Biochem. Pharmacol. 2004. V. 68 (8). P. 1565–
1572. doi: 10.1016/j.bcp.2004.06.035.
Pin J.P., Prezeau L. Allosteric Modulators of GABAB Receptors:
Mechanism of Action and Therapeutic Perspective // Curr. Neuropharmacol. 2007. V.
5 (3). P. 195–201. doi: 10.2174/157015907781695919.
Price M.R., Baillie G.L., Thomas A., Stevenson L.A., Easson M., Goodwin
R., McLean A., Mcintosh L., Goodwin G., Walker G., Westwood P., Marrs J.,
111
Thomson F., Cowley P., Christopoulos A., Pertwee R.G., Ross R.A. Allosteric
Modulation of the Cannabinoid CB1 Receptor // Mol. Pharmacol. 2005. V. 68 (5). P.
1484–1495. doi: 10.1124/mol.105.016162.
Rajagopal S., Ahn S., Rominger D.H., Gowen-MacDonald W., Lam C.M.,
DeWire S.M., Violin J.D., Lefkowitz R.J. Quantifying Ligand Bias at Seven-
Transmembrane receptors // Mol. Pharmacol. 2011. V. 80 (3). P. 367–377. doi:
10.1124/mol.111.072801.
Rashid A.J., So C.H., Kong M.M.C., Furtak T., El-Ghundi M., Cheng R.,
O’Dowd B.F., George S. D1-D2 Dopamine Receptor Heterooligomers with Unique
Pharmacology are Coupled to Rapid Activation of Gq/11 in the Striatum // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 654–659.
Rocher J.-P., Bonnet B., Boléa C., Liitjens R., Le Poul E., Poli S., Epping-
Jordan M., Bessis A.-S., Ludwig B., Mutel V. mGluR5 Negative Allosteric Modulators
Overview: A Medicinal Chemistry Approach Towards a Series of Novel Therapeutic
Agents // Curr. Top. Med. Chem. 2011. V. 11 (6). P. 680–695.
Rodriguez A.L., Grier M.D., Jones C.K., Herman E.J., Kane A.S., Smith
R.L., Williams R., Zhou Y., Mario J.E., Days E.L., et al. Discovery of Novel Allosteric
Modulators of Metabotropic Glutamate Receptor Subtype 5 Reveals Chemical and
Functional Diversity and in Vivo Activity in Rat Behavioral Models of Anxiolytic and
Antipsychotic Activity // Mol. Pharm. 2010. V. 78 (6). P. 1105–1123. doi:
10.1124/mol.110.067207.
Romano C., Yang W.L., O’Malley K.L. Metabotropic Glutamate Receptor 5
is a Disulfide-Linked Dimer // J. Biol. Chem. 1996a. V. 271 (45). P. 28612–2866. doi:
10.1074/jbc.271.45.28612.
Romano C., Yang W.L., O’Malley K.L. Metabotropic Glutamate Receptor 5
is a Disulfide-Linked Dimer // J. Biol. Chem. 1996b. V. 271 (45). P. 28612–28616.
doi: 10.1074/jbc.271.45.28612.
Rook J.M., Bertron J.L., Cho H.P., Garcia-Barrantes P.M., Moran S.P.,
Maksymetz J.T., Nance K.D., Dickerson J.W., Remke D.H., Chang S., Harp J.M.,
Blobaum A.L., Niswender C.M., Jones C.K., Stauffer S.R., Conn P.J., Lindsley C.W. A
Novel M1 PAM VU0486846 Exerts Efficacy in Cognition Models without Displaying
Agonist Activity or Cholinergic Toxicity // ACS Chem. Neurosci. 2018. V. 9 (9). P.
2274-2285. doi: 10.1021/acschemneuro.8b00131.
Rook J.M., Xiang Z., Lv X., Ghoshal A., Dickerson J., Bridges T.M.,
Johnson K.A., Foster D.J., Gregory K.J., Vinson P.N., et al. Biased mGlu5 Positive
Allosteric Modulators Provide in Vivo Efficacy Without Potentiating mGlu5
Modulation of NMDAR Currents // Neuron. 2015. V. 86 (4). P. 1029–1040. doi:
10.1016/j.neuron.2015.03.063.
Russell F.A., King R., Smillie S.-J., Kodji X., Brain S.D. Calcitonin Gene-
Related Peptide: Physiology and Pathophysiology // Physiol. Rev. 2014. V. 94 (4). P.
1099–1142. doi: 10.1152/physrev.00034.2013.
Sexton P.M., Morfis M., Tilakarante N., Hay D.L., Udawela M.,
Christopoulos G., Christopoulos A. Complexing Receptor Pharmacology: Modulation
112
of Family B G Protein-Coupled Receptor Function by RAMPs // Ann. N. Y. Acad.
Sci. 2006. V. 1070. P. 90–104. doi: 10.1196/annals.1317.076.
Sharma S., Rodriguez A., Conn P.J., Lindsley C.W. Synthesis and SAR of a
mGluR5 Allosteric Partial Antagonist Lead: Unexpected Modulation of
Pharmacology with Slight Structural Modifications to a 5-(Phenylethynyl)pyrimidine
Scaffold // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008. V. 18. P. 4098–4101.
Sharma S., Kedrowski J., Rook J.M., Smith J.M., Jones C.K., Rodriguez
A.L., Conn P.J., Lindsley C.W. Discovery of Molecular Switches that Modulate
Modes of mGluR5 Pharmacology in Vitro and in Vivo Within a Series of
Functionalized 5-(Phenylethynyl)-pyrimidines // J. Med. Chem. 2009. V. 52. P. 4103–
4106.
Sheffler D.J., Conn P.J. Allosteric Potentiators of Metabotropic Glutamate
Receptor Subtype 1a Differentially Modulate Independent Signaling Pathways in
Baby Hamster Kidney Cells // Neuropharmacology. 2008. V. 55 (4). P. 419–427. doi:
10.1016/j.neuropharm.2008.06.047.
Sheffler D.J., Sevel C., Le U., Lovell K.M., Tarr J.C., Cho H.P., Digby G.J.,
Niswender C.M., Conn P.J., Hopkins C.R., et al. Further Exploration of M1 Allosteric
Agonists. Subtle Structural Changes Abolish M 1 Allosteric Agonism and Result in
Pan-mAChR Orthosteric Antagonism // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2013. V. 23. P.
223–227.
Silvano E., Millan M.J., Mannoury la Cour C., Han Y., Duan L., Griffin
S.A., Luedtke R., Aloisi G., Rossi M., Zazzeroni F., Javitch J.A., Maggio R. The
tetrahydroisoquinoline derivative SB269,652 is an allosteric antagonist at dopamine
D3 and D2 receptors // Mol. Pharmacol. 2010. V. 78. P. 925–934. doi:
10.1124/mol.110.065755.
Tsuji Y., Shimada Y., Takeshita T., Kajimura N., Nomura S., Sekiyama N.,
Otomo J., Usukura J., Nakanishi S., Jingami H. Cryptic Dimer Interface and Domain
Organization of the Extracellular Region of Metabotropic Glutamate Receptor
Subtype 1 // J. Biol. Chem. 2000. V. 275 (36). P. 28144–28151. doi:
10.1074/jbc.M003226200.
Turlington M., Noetzel M.J., Chun A., Zhou Y., Gogliotti R.D., Nguyen E.D.,
Gregory K.J., Vinson P.N., Rook J.M., Gogi K.K., Xiang Z., Bridges T.M., Daniels
J.S., Jones C., Niswender C.M., Meiler J., Conn P.J., Lindsley C.W., Stauffer S.R.
Exploration of Allosteric Agonism Structure-Activity Relationships Within an
Acetylene Series of Metabotropic Glutamate Receptor 5 (mGlu5) Positive Allosteric
Modulators (PAMs): Discovery of 5-((3-Fluorophenyl)ethynyl)-N-(3-methyloxetan-3-
yl)-picolinamide (ML254) // J. Med. Chem. 2013. V. 56 (20). P. 7976–7996. doi:
10.1021/jm401028t.
Urwyler S., Mosbacher J., Lingenhoehl K., Heid J., Hofstetter K., Froestl
W., Bettler B., Kaupmann K. Positive Allosteric Modulation of Native and
Recombinant Gamma-Aminobutyric AcidB Receptors by 2,6-Di-tert-Butyl-4-(3-
hydroxy-2,2-dimethyl-prop-yl)-phenol (CGP7930) and Its Aldehyde Analog CGP13501 //
Mol. Pharmacol. 2001. V. 60. P. 963–971.
113
Uslaner J.M., Kuduk S.D., Wittmann M., Lange H.S., Fox S.V., Min C.,
Pajkovic N., Harris D., Cilissen C., Mahon C., Mostoller K., Warrington S., Beshore
D.C. Preclinical to Human Translational Pharmacology of the Novel M 1 Positive
Allosteric Modulator MK-7622 // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2018. V. 365 (3). P. 556–
566. doi: 10.1124/jpet.117.245894.
Valant C., Felder C.C., Sexton P.M., Christopoulos A. Probe Dependence in
the Allosteric Modulation of a G Protein-Coupled Receptor: Implications for
Detection and Validation of Allosteric Ligand Effects // Mol. Pharmacol. 2012. V. 81
(1). P. 41–52. doi: 10.1124/mol.111.074872.
van der Westhuizen E.T., Valant C., Sexton P.M., Christopoulos A.
Endogenous allosteric modulators of G protein-coupled receptors // J. Pharmacol.
Exp. Ther. 2015. V. 353. P. 246–60. doi: 10.1124/jpet.114.221606.
Voss T., Li J., Cummings J., Farlow M., Assaid C., Froman S.,
Leibensperger H., Snow-Adami L., McMahon K.B., Egan M., Michelson D.
Randomized, controlled, proof-of-concept trial of MK-7622 in Alzheimer's disease //
Alzheimers Dement. (N.Y.). 2018. V. 4. P. 173-181. doi: 10.1016/j.trci.2018.03.004.
Wenthur C.J., Gentry P.R., Mathews T.P., Lindsley C.W. Drugs for
Allosteric Sites on Receptors // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2014. V. 54. P. 165–
184.
White J.H., Wise A., Main M.J., Green A., Fraser N.J., Disney G.H., Barnes
A.A., Emson P., Foord S.M., Marshall F.H. Heterodimerization Is Required for the
Formation of a Functional GABAB Receptor // Nature. 1998. V. 396. P. 679–682.
Willard F.S., Wootten D., Showalter A.D., Savage E.E., Ficorilli J., Farb
T.B., Bokvist K., Alsina-Fernandez J., Furness S.G., Christopoulos A., Sexton P.M,
Sloop K.W. Small Molecule Allosteric Modulation of the Glucagon-Like Peptide-1
Receptor Enhances the Insulinotropic Effect of Oxyntomodulin // Mol. Pharmacol.
2012. V. 82 (6). P. 1066–1073. doi: 10.1124/mol.112.080432.
Winnig M., Bufe B., Meyerhof W. Valine 738 and Lysine 735 in the Fifth
Transmembrane Domain of rTas1r3Mediate Insensitivity Towards Lactisole of the
Rat Sweet Taste Receptor // BMC Neurosci. 2005. V. 6. P. 22–30.
Wood M.R., Hopkins C.R., Brogan J.T., Conn P.J., Lindsley C.W.
’Molecular Switches’ on Allosteric Ligands that Modulate Modes of Pharmacology //
Biochemistry. 2011. V. 50. P. 2403–2410.
Wootten D., Savage E.E., Valant C., May L.T., Sloop K.W., Ficorilli J.,
Showalter A.D., Willard F.S., Christopoulos A., Sexton P.M. Allosteric Modulation of
Endogenous Metabolites as an Avenue for Drug Discovery // Mol. Pharmacol. 2012.
V. 82 (2). P. 281–290. doi: 10.1124/mol.112.079319.
Wootten D., Savage E.E., Willard F.S., Bueno A.B., Sloop K.W.,
Christopoulos A., Sexton P.M. Differential Activation and Modulation of the
Glucagon-Like Peptide-1 Receptor by Small Molecule Ligands // Mol. Pharmacol.
2013. V. 83 (4). P. 822–834. doi: 10.1124/mol.112.084525.
114
Xu H., Staszewski L., Tang H., Adler E., Zoller M., Li X. Different
Functional Roles of T1R Subunits in the Heteromeric Taste Receptors // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2004. V. 101 (39). P. 14258–14263. doi: 10.1073/pnas.0404384101.
Yin S., Noetzel M.J., Johnson K.A., Zamorano R., Jalan-Sakrikar N.,
Gregory K.J., Conn P.J., Niswender C.M. Selective Actions of Novel Allosteric
Modulators Reveal Functional Heteromers of Metabotropic Glutamate Receptors in
the CNS // J. Neurosci. 2014. V. 34 (1). P. 79–94. doi: 10.1523/JNEUROSCI.1129-
13.2014.
Zhang Y., Rodriguez A.L., Conn P.J. Allosteric potentiators of metabotropic
glutamate receptor subtype 5 have differential effects on different signaling pathways
in cortical astrocytes // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005. V. 315 (3). P. 1212–1219. doi:
10.1124/jpet.105.090308.
Zhao G.Q., Zhang Y., Hoon M.A., Chandrashekar J., Erlenbach I., Ryba
N.J.P., Zuker C.S. The Receptors for Mammalian Sweet and Umami Taste // Cell.
2003. V. 115 (3). P. 255–266.
115
ГЛАВА 3
Эндогенные аллостерические регуляторы

GPCR
3.1. G-белки, как аллостерические регуляторы GPCR
Сами рецепторы, сопряженные с гетеротримерными G-

белками (GPCR), по своей природе являются аллостерическими
белками, что обусловлено, как минимум, двумя причинами. Во-
первых, связывание GPCR с гормональным агентом или каким-то
другим эндогенным регулятором осуществляется в
ортостерическом сайте, расположенном либо вне клетки
(например, в эктодомене), либо в полости трансмембранного
домена рецептора, в то время как трансдукция сигнала с
активированного рецептора на гетеротримерный G-белок
происходит при непосредственном участии цитоплазматических
участков рецептора и их интерфейсов с трансмембранными
спиралями (ТМС). Другими словами, сайты активации и
трансдукции в молекуле GPCR находятся в разных частях
рецептора. Во-вторых, функциональные взаимодействия в
системе агонист–GPCR–G-белок также носят аллостерический
характер, поскольку агонист при связывании с рецептором влияет
на структуру и активность гетеротримерного G-белка, в то время
как активированный G-белок, который диссоциирует на ГТФ-
связанную α-субъединицу и βγ-димерный комплекс,
непосредственно влияет на конформацию ортостерического сайта
116
и его аффинность к ортостерическим лигандам (Christopoulos,
Kenakin, 2002).
В пользу функционирования гетеротримерных G-белков
как аллостерических регуляторов свидетельствуют данные о
влиянии гуаниновых нуклеотидов, которые специфически
взаимодействуют с нуклеотидсвязывающим сайтом α-
субъединицы G-белка, на связывающие характеристики
рецептора и его регуляцию агонистом. Связывание G-белка с
ГТФ оказывает отрицательный кооперативный эффект на
аффинность рецептора к агонисту, как это еще в 1985 году было
продемонстрировано при изучении связывания карбахола с m2-
мускариновым рецептором (Ehlert, 1985). В свою очередь,
связывание агониста с рецептором повышает аффинность его
связывания с гетеротримерным G-белком, в
нуклеотидсвязывающем сайте которого отсутствует гуаниновый
нуклеотид. Результатом этого является образование
функционально активного тройного комплекса агонист–GPCR–
G-белок, активация и диссоциация гетеротримерного G-белка,
нарушение взаимодействия между рецептором и субъединицами
активированного G-белка, переход рецептора в низкоаффинное
состояние и, в конечном итоге, диссоциация тройного комплекса
и завершение цикла сигнальной трансдукции (De Lean et al., 1980;
Ehlert, 1985).
В пользу аллостерической природы взаимодействий
между G-белком и GPCR свидетельствуют результаты
исследования с клетками, в которых была в значительной степени
повышена экспрессия различных типов G-белков. Так
избыточная экспрессия Gs- и Gq/11-белков вызывала повышение
базальной активности Gs-сопряженного β2-адренергического
рецептора и Gq/11-сопряженных m1-, m3- и m5-мускариновых
рецепторов, соответственно (Burstein et al., 1997; Azzi et al., 2001).
Инверсионные агонисты снижали повышенную конститутивную
активность GPCR в условиях гиперэкспрессии G-белков, в то
время как аффинность и эффективность действия полных
агонистов в этих условиях, как правило, повышалась (Burstein et
117
al., 1997; Yan et al., 2008). В настоящее время достигнут
значительный прогресс в изучении конформационных изменений
и молекулярных детерминант, которые обеспечивают
взаимосвязь между связыванием лигандов в ортостерическом
сайте рецепторов и изменениями в интерфейсе, опосредующем
взаимодействие цитоплазматических участков рецептора c
GPCR-связывающими сегментами G-белков, локализованными,
как правило, в С-концевом сегменте их α-субъединиц (Rasmussen
et al., 2011; Ring et al., 2013). Имеются данные в пользу того, что
ортостерический сайт и интерфейс GPCR–G-белок
коэволюцинируют у животных различного филогенетического
уровня, что является еще одним доказательством в пользу тесной
взаимосвязи между ними и аллостерическим характером их
взаимного влияния (Suel et al., 2003).
3.2. Аррестины и RAMP-белки, как аллостерические

Как отмечалось в Главе 1, важную роль в

функционировании GPCR, наряду с G-белками, играют
регуляторные белки – β-аррестины. Не удивительно, что они
могут выступать, как аллостерические регуляторы и модуляторы
активности GPCR. Одним из первых доказательств этого стало
обнаружение того факта, что β-аррестины при взаимодействии с
β2-адренергическим рецептором повышают его аффинность к
агонисту изопротеренолу, что является результатом образования
тройного комплекса лиганд–GPCR–β-аррестин (Gurevich et al.,
1997).
Другую группу аллостерических регуляторов составляют
белки, модифицирующие активность GPCR (receptor-activity-
modifying proteins, RAMP), которые представляют собой
обширную группу вспомогательных белков, модулирующих и
регулирующих активность GPCR и их взаимодействие с другими
компонентами системы сигнальной трандсукции. При изучении
рецептора, подобного рецептору кальцитонина (calcitonin
118
receptor–like receptor, CLR), относящегося к GPCR класса B, было
выявлено три трансмембранных акцессорных белка (RAMP),
способных образовывать гетероолигомерные комплексы с CLR.
В зависимости от того, с каким типом RAMP рецептор
образовывал комплекс, он характеризовался различной
аффинностью к двум его эндогенным ортостерическим лигандам
– кальцитонин-ген-родственному пептиду (CGRP) и
адреномедуллину (McLatchie et al., 1998; Bühlmann et al., 1999;
Poyner et al., 2002; Hay et al., 2006). В дальнейшем было показано,
что кальцитониновый рецептор, находясь в комплексе с
определенным типом RAMP, приобретает способность связывать
несвойственный ему лиганд – полипептидный гормон амилин
(Poyner et al., 2002; Hay et al., 2006; Udawela et al., 2006).
Дальнейшие исследования функциональной активности
RAMP показали, что эти белки способны определять не только
специфичность GPCR к лиганду, но и влияют на специфичность
активации гормонами внутриклеточных сигнальных каскадов.
При этом RAMP могут усиливать функциональное сопряжение с
G-белками, как показано для кортиколиберинового рецептора 1-
го типа (Wootten et al., 2013), а также определять селективность
активации агонистами G-белок-зависимых и β-аррестиновых
сигнальных путей. Это продемонстрировано для рецептора 2-го
типа вазоактивного кишечного пептида и кальцитонинового
рецептора (Christopoulos et al., 2003; Morfis et al., 2008). RAMP
могут функционировать в качестве GPCR-шаперонов,
контролируя процессы эндоцитоза рецепторов, их
внутриклеточный везикулярный транспорт и транслокацию к
плазматической мембране, что показано на примере рецептора
CRL и чувствительного к внеклеточному кальцию рецептора
CaSR, относящегося к классу C (Bouschet et al., 2005).
Необходимость изучения RAMP как аллостерических
регуляторов GPCR-сигналинга и мишеней для регуляции
фармакологическими препаратами обусловлена их
исключительно важной ролью в функционировании сердечно-
сосудистой, выделительной и дыхательной систем, а также в
119
регуляции воспалительных процессов, о чем свидетельствуют
многочисленные данные, полученные при изучении генетически
модифицированных животных (Kadmiel et al., 2012; Lenhart et al.,
2013; Li et al., 2014).
Интерфейс, который определяет функциональное
взаимодействие между GPCR и RAMP, является одной из
мишеней для создания новых поколений регуляторов GPCR-
сигналинга (Sexton et al., 2009, 2012; Wootten et al., 2010). Среди
таких регуляторов есть препарат Olcegepant, используемый в
клинике для лечения мигрени. Этот препарат специфично
встраивается в карман, образуемый RAMP1 и N-концевым
участком рецептора CLR, что обеспечивает негативную
модуляцию сигнальных путей, активируемых CGRP (Sixt et al.,
2009; ter Haar et al., 2010) (рис. 3-1).
Отдельную группу RAMP составляют акцессорные белки,
однократно пронизывающие плазматическую мембрану, которые
специфично взаимодействуют с меланокортиновыми
рецепторами и модулируют их экспрессию, функциональную
активность, внутриклеточный транспорт и транслокацию к
мембране, а также определяют устойчивость к деградации в
протеосомах. Поскольку функции этих белков сходны с
«классическими» RAMP, их называют MRAP (melanocortin
receptor accessory proteins) (Novoselova et al., 2013).
Первый MRAP был идентифицирован с помощью
генетического скрининга у пациентов с наследственной формой
дефицита глюкокортикоидных гормонов. Этот белок с высокой
интенсивностью экспрессируется в надпочечниках, где MRAP1
усиливает экспрессию меланокортинового рецептора 2-го типа на
поверхности клеток-мишеней и повышает чувствительность
этого рецептора к его эндогенному агонисту –
адренокортикотропному гормону (Metherell et al., 2005).
120
Рис. 3-1. Кристаллическая структура N-концевого участка рецептора,

родственного рецептору кальцитонина (CLR), в комплексе с
акцессорным белком RAMP1 и антимигренозным препаратом Olcegepant
(PDB ID 3N7S) (по van der Westhuizen et al., 2015).
Второй представитель MRAP-белков, MRAP2,

характеризуется высокой консервативностью у различных
представителей позвоночных животных и экспрессируется в
мозге, надпочечниках и в ряде других тканей (Chan et al., 2009).
Необходимо отметить, что MRAP1 и MRAP2 могут
взаимодействовать не только с меланокортиновым рецептором 2-
го типа, но и с остальными четырьмя типами меланокортиновых
рецепторов, в том числе с меланокортиновым рецептором 4-го
типа, который контролирует энергетический обмен, пищевое
поведение, периферическую инсулиновую чувствительность, а
также функции эндокринной системы (Shpakov et al., 2015;
Деркач и др., 2016; Шпаков, Деркач, 2016). Все это
свидетельствует о перспективности применения селективных
регуляторов MRAP и системы MRAP–меланокортиновый
рецептор для лечения и профилактики заболеваний эндокринной,
нервной и других систем организма.
121
3.3. Ионы, как аллостерические регуляторы GPCR
В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что

универсальными аллостерическими модуляторами активности
GPCR являются ионы ряда биогенных металлов, в том числе
ионы натрия, цинка, магния, кальция и марганца. При этом
выявлена следующая закономерность. Однозарядные ионы
натрия, как правило, усиливают связывание рецепторов с
антагонистами и, напротив, ингибируют их связывание с
агонистами, стабилизируя тем самым неактивные состояния
GPCR. В свою очередь, двухзарядные ионы, такие как кальций и
магний, в большинстве случаев сдвигают равновесие в сторону
активных конформаций рецептора, тем самым, способствуя их
активации ортостерическими агонистами (van der Westhuizen et
al., 2015; White et al., 2018; Ye et al., 2018).
Ионы натрия. Первое исследование, посвященное роли
Na в регуляции функциональной активности GPCR, относится
+
еще к 1973 году, когда было показано, что ионы натрия являются
отрицательными аллостерическими модуляторами связывания
агонистов с опиоидными рецепторами (Pert, Snyder, 1973). В
дальнейшем было показано, что ионы натрия осуществляют
модуляцию конформационных состояний опиоидных рецепторов
(Simon, Groth, 1975), а также усиливают связывание антагонистов
с δ-опиоидным рецептором (Appelmans et al., 1986). В
дальнейшем роль Na+ как аллостерического регулятора была
продемонстрирована и для ряда других GPCR, включая
рецепторы биогенных аминов, нуклеотидов, пептидных гормонов
и липидов (Ericksen et al., 2009; Liu et al., 2012; Katritch et al.,
2013). При изучении действия ионов Na+ на регуляторные
эффекты лигандов ортостерического сайта, различным образом
влияющих на активность рецепторов, в ряде случаев были
получены противоположные результаты, что хорошо
иллюстрируют данные по дофаминовому рецептору 2-го типа.
Показано, что в присутствии ионов натрия аффинность рецептора
122
к селективному D2-агонисту квинпиролу снижается, в то время
как сродство к неселективному D2/D3-антагонисту эпидеприду,
напротив, повышается (Neve, 1991). В то же время сродство
дофаминового рецептора 2-го типа к ряду других антагонистов и
инверсионных агонистов в присутствии катионов Na+ оставалось
неизменным, что указывает на зависимость аллостерического
эффекта ионов Na+ от химической структуры лиганда и набора
конформационных состояний рецептора, стабилизированных
этим лигандом (Vivo et al., 2006; Christopoulos, 2014).
Исключительно важно, что обнаруженные эффекты ионов натрия
на связывающие характеристики GPCR реализуются при их
физиологических или близких к ним концентрациях, что
свидетельствует об участии Na+ в регуляции GPCR-сигналинга в
реальных биологических системах. Установлено, что ионы
натрия вносят существенный вклад в селективность активации
агонистами внутриклеточных сигнальных каскадов, реализуемых
через δ-опиоидный рецептор (Fenalti et al., 2014), а также в
сигнальные механизмы действия синтетических
низкомолекулярных аллостерических лигандов μ-опиоидного
рецептора (Livingston, Traynor, 2014).
Поиск молекулярных детерминант в молекулах GPCR
класса А позволил выявить в них основную мишень для ионов
натрия – высококонсервативный остаток аспарагиновой кислоты,
D2.50, локализованный во второй ТМС (Fraser et al., 1989;
Horstman et al., 1990; Neve, 1991; Strader et al., 1994; White et al.,
2018) (рис. 3-2). В дальнейшем было показано, что, наряду с
остатком D2.50, в связывании ионов Na+ участвует ряд других
аминокислотных остатков. Так в A2A-аденозиновом рецепторе
ими являются Ser91 (3.39), Trp246 (6.48), Asn280 (7.45) и Asn284
(7.49) (White et al., 2018) (рис. 3-3). Необходимо отметить, что не
только D2.50, но и другие остатки, формирующие Na+-
связывающий сайт, являются высококонсервативными в
большинстве GPCR, относящихся к классу А (Katritch et al.,
2014).
123
Рис. 3-2. Роль катионов натрия, как негативных аллостерических

модуляторов, в активации A2A-аденозинового рецептора
ортостерическими агонистами (по White et al., 2018).
Показано связывание катионов натрия с A2A-аденозиновым
рецептором дикого типа (слева) и отсутствие такого связывания с
мутантным рецептром, в котором Asp (2.50), ответственный за
связывание с катионами Na+, заменен на остаток аланина (справа).
С помощью сайт-направленного мутагенеза установлено,

что замены остатков Asp52 (2.50) и Asn284 (7.49) на аланин
полностью блокируют негативный аллостерический эффект
катионов натрия на активацию мутантного рецептора
агонистами. В то же время замены остатков Ser91 (3.39), Trp246
(6.48) и Asn280 (7.45) на аланин, хотя в значительной степени его
снижают, но не подавляют полностью. Показано также, что
замены остатков Ser91 (3.39) и Asn280 (7.45) ведут к повышению
базальной активности рецептора, что также может быть
обусловлено подавлением негативного аллостерического влияния
на нее ионов натрия (Massink et al., 2015). Остаток Asp52 (2.50) не
участвует в формировании ортостерического сайта рецептора и
124
существенно не влияет на аффинность связывания с ним
ортостерических лигандов. В то же время, являясь основным
аминокислотным остатком, взаимодействующим с ионами
натрия, он контролирует их транслокацию и удерживание в Na+-
связывающем сайте, расположенном внутри трансмембранного
домена рецептора (Massink et al., 2015).
Рис. 3-3. Модель трансмембранного домена A2A-аденозинового

рецептора и локализованного в нем сайта, связывающего ионы натрия
(по White et al., 2018).
Представлены аминокислотные остатки Asp52 (2.50), Ser91 (3.39), Trp246
(6.48) и Asn284 (7.49), которые образуют Na+-связывающий сайт и
локализованы во второй, третьей, шестой и седьмой ТМС,
соответственно.
Установление пространственной структуры GPCR на

основе кристаллографических исследований позволило уточнить
локализацию ионов натрия в трансмембранном домене
рецепторов, находящихся в неактивном состоянии. Среди таких
рецепторов – A2A-аденозиновый рецептор (Liu et al., 2012),
протеаза-активируемый рецептор 1-го типа (Zhang et al., 2012),
β1-адренергический рецептор (Miller-Gallacher et al., 2014) и δ-
125
опиоидный рецептор (Fenalti et al., 2014). При переходе GPCR в
активное состояние вследствие связывания с ортостерическим
агонистом пространственная конфигурация сайта связывания с
Na+ существенно меняется, что, как можно полагать, приводит к
потере спрособности этого сайта эффективно взаимодействовать
с онами натрия. В связи с этим предполагается, что связывание с
ионами Na+ является одним из молекулярных механизмов
сохранения GPCR в неактивной конформации (Wootten et al.,
2013b; Katritch et al., 2014). Недавно это получило подтверждение
в исследовании Libin Ye и соавторов, которое посвящено
изучению молекулярных механизмов взаимодействия ионов Na+ с
A2A-аденозиновым рецептором (Ye et al., 2018).
При изучении влияния ионов Na+ на различные
конформеры A2A-аденозинового рецептора было установлено, что
в диапазоне невысоких концентраций ионы натрия
стабилизируют две его неактивные конформации S-1 и S-2, но
при этом они также повышают долю переходной активной
конформации S-3. Повышение доли указанных конформаций
происходит вследствие снижения стабильности полностью
активной корнформации S-3*. Интересно отметить, что при
повышении концентрации Na+ доля конформации S-3
повышается, что может указывать на наличие в молекуле второго
сайта для связывания Na+, который имеет более низкое сродство
к этому иону (Ye et al., 2018). Показано, что среднее время
пребывания ионов натрия в апо-форме A2A-аденозинового
рецептора составляет всего 480 миллисекунд. Выход ионов
натрия из сайта связывания с рецептром является весьма
непростым процессом, который индуцирует возмущение
расположенных по соседству с ним молекул воды, образующих
высокоупорядоченную систему, как компонент аллостерической
пространственной сети, охватывающей трансмембранный домен
рецептора и преддверие его внеклеточного входа. После
высвобождения ионов натрия их стабилизирующее влияние на
неактивные конформации и на промежуточную, активную,
конформацию исчезает, что способствует повышению доли
126
активной конформации и эффективному связыванию агониста.
Таким образом, агонист должен успеть «проскочить» в
ортостерический сайт после диссоциации иона Na+, после чего он
закрывает доступ следующему иону натрия к связывающему его
сайту. Добавление инверсионного агониста приводит к
стабилизации Na+-связанного состояния A2A-аденозинового
рецептора до 630 миллисекунд, что сокращает время нахождения
рецептора в свободном от ионов натрия состоянии и снижает
вероятность активации рецептора агонистом. Продемонстрирован
значительный уровень совпадения соотношений различных
конформеров рецептора в присутствии ионов натрия или
инверсионного агониста (Ye et al., 2018).
Ионы цинка. Ионы Zn2+ являются регуляторами
активности многих белков, в том числе целого ряда ферментов и
транскрипционных факторов. Имеется много исследований, в
которых продемонстрирована присущая ионам цинка активность
аллостерических модуляторов дофаминовых, адренергических,
меланокортиновых и опиоидных рецепторов. Ионы Zn2+
избирательно ингибируют связывание ортостерических лигандов
с дофаминовыми рецепторами 1-го, 2-го и 4-го типов,
меланокортиновыми рецепторами 1-го и 4-го типов, α1A- и β2-
адренергическими рецепторами, μ-, κ- и δ-опиоидными
рецепторами (Stengaard-Pedersen et al., 1981; Tejwani, Hanissian,
1990; Rodriguez et al., 1992; Schetz, Sibley, 1997, 2001; Holst et al.,
2002; Swaminath et al., 2002, 2003; Lagerstrom et al., 2003). Ионы
Zn2+ увеличивают скорость диссоциации антагонистов от
дофаминовых рецепторов 1-го и 2-го типов (Schetz, Sibley, 1997,
2001), но при этом снижают скорость диссоциации антагонистов
от α1A- и β2-адренергических рецепторов (Swaminath et al., 2002;
Ciolek et al., 2011). Показано также, что Zn2+ усиливает
стимулирующее воздействие агонистов меланокортиновых
рецепторов 1-го и 4-го типов и β2-адренергического рецептора на
активность фермента аденилатциклазы и на накопление цАМФ
внутри клетки. В то же время ионы цинка снижают
стимулирующие эффекты агонистов α1A-адренергических
127
рецепторов на активность фосфоинозитид-специфичной
фосфолипазы Сβ и на зависимые от нее кальциевые сигнальные
пути (Holst et al., 2002; Swaminath et al., 2002; Ciolek et al., 2011).
Все вышесказанное свидетельствует о том, что катионы цинка
могут функционировать как аллостерические модуляторы
различных типов GPCR, как повышая, так и понижая аффинность
связывания и функциональную активность ортостерических
агонистов.
Ионы магния. В настоящее время доказана роль ионов
Mg 2+
как аллостерических модуляторов для опиоидных,
дофаминовых, адренергических и мускариновых рецепторов.
Показано, что катионы Mg2+ концентрационно-зависимым
способом повышают специфическое связывание агонистов и
антагонистов с опиоидными рецепторами (Pasternak et al., 1975;
Rodriguez et al., 1992). При этом эффекты ионов магния на
различные типы опиоидных рецепторов различаются. Так в
случае μ- и κ-опиоидных рецепторов ионы магния увеличивает
сродство связывания агониста без изменения количества сайтов
связывания, в то время как в случае δ-опиоидных рецепторов в
присутствии Mg2+ сродство рецептора к агонисту DPDPE ([d-
Pen2, d-Pen5]-энкефалину) снижается по мере увеличения
значения Bmax (Rodriguez et al., 1992). Для антагонистов
опиоидных рецепторов количество сайтов связывания
удваивалось в присутствии ионов магния без изменения их
сродства к лигандам (Rodriguez et al., 1992). Ионы магния
повышали аффинность агонистов к β-адренергическим
рецепторам и дофаминовым рецепторам 2-го типа, не влияя на
связывающие характеристики этих рецепторов в отношении
антагонистов (Williams et al., 1978; Sibley, Creese, 1983). В случае
m2-мускаринового рецептора идентифицирован аллостерический
сайт, с которым специфично взаимодействуют ионы Mg2+
(Burgmer et al., 1998).
Необходимо отметить, что ионы магния участвуют в
функционировании гетеротримерных G-белков, поскольку
отвечают за эффективное взаимодействие гуаниновых
128
нуклеотидов с нуклеотидсвязывающим сайтом их α-субъединиц,
а также вовлечены в регуляцию ГДФ/ГТФ обмена и ГТФазной
активности G-белков (Birnbaumer, Zurita, 2010). В отсутствие или
при низких концентрациях ионов магния G-белок теряет
функциональную активность и способность эффективно
взаимодействовать с GPCR. Поскольку G-белок является
аллостерическим регулятором GPCR, то ионы магния, как
регуляторы его активности, могут опосредованно выполнять
функции аллостерического модулятора процесса взаимодействия
GPCR и G-белка. В то же время обнаружение специфичных
сайтов связывания ионов магния в молекуле GPCR, как это
продемонстрировано на примере m2-мускаринового рецептора
(Burgmer et al., 1998), может свидетельствовать о «собственной»
аллостерической активности ионов Mg2+.
Другие катионы. Информация о вкладе других катионов
в аллостерическую регуляцию GPCR не столь многочисленна.
Показано, что ионы кальция и марганца вызывают повышение
эффективности связывания агониста μ-опиоидного рецептора, [d-
Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ол]-энкефалина, с гомогенатами мозга
морской свинки и агониста β-адренергического рецептора,
гидроксибензилизопротеренола, с эритроцитарными мембранами
лягушки (Williams et al., 1978; Rodriguez et al., 1992). Повышение
концентрации кальция также влияет на сродство и эффективность
ортостерических и аллостерических лигандов при их связывании
с метаботропным глутаматным рецептором 1а-подтипа
(mGluR1a) (Jiang et al., 2014). Ионы меди ингибируют связывание
антагониста празозина с α1A-адренергическими рецепторами,
экспрессируемыми в культуре COS7-клеток, не влияя при этом на
диссоциацию празозина от рецептора. Наряду с этим, ионы Cu2+
модулируют связывание эндогенного агониста адреналина с α1A-
адренергическими рецепторами и процесс трансдукции
адреналинового сигнала к эффекторным системам клетки (Ciolek
et al., 2011). Ионы кобальта снижают аффинность связывания
агонистов с µ-опиоидными рецепторами в гомогенатах мозга
морской свинки (Rodriguez et al., 1992).
129
При анализе воздействий различных катионов на GPCR
необходимо учитывать тот факт, что в ряде случаев их мишенями
могут быть и другие сигнальные белки, образующие
функционально активные комплексы с рецепторами. Наряду с
этим, ионы металлов могут образовывать комплексы с
лигандами, модифицируя их способность связываться с
ортостерическим или аллостерическим сайтами, что особенно
характерно для ионов меди, цинка и кобальта. В высоких
концентрациях ионы металлов способны влиять на структурную
организацию GPCR и устойчивость их комплексов, изменяя
осмолярность среды и влияя на физико-химические свойства
мембран. Вследствие этого для окончательного суждения об
аллостерическом характере воздействия ионов металлов на
структуру и функциональную активность рецепторов во многих
случаях требуются дополнительные исследования. С другой
стороны, обнаружение в GPCR сайтов, опосредующих
связывание с ионами металлов, и все возрастающее число
примеров аллостерической регуляции ионами металлов, а также
хлорид-анионами других сигнальных белков (ионные каналы,
рецепторы натрийуретических пептидов, и др.) указывает на то,
что, по крайней мере, в отдельных случаях, целый ряд ионов
способны функционировать как NAM и PAM. Такую
возможность необходимо учитывать при изучении
функциональной активности системы лиганд–GPCR–G-белок.
Изучение механизмов действия двухзарядных ионов
металлов на рецептор, на примере ионов магния и кальция и A2A-
аденозинового рецептора, показало, что они сходным образом
увеличивают долю конформеров активного состояния рецептора
в присутствии насыщающих концентраций смешанного A1/A2-
агониста аденозиновых рецепторов 5'-N-этилкарбоксамид-
аденозина (NECA) и С-концевого пептида Gαs-субъединицы.
Предполагают, что двухзарядные катионы проникают в
трансмембранный домен и связываются там с сегментом вблизи
Na+-связывающего сайта, вследствие чего препятствуют эффекту
Na+, как NAM. Кроме того, ионы Mg2+ и Ca2+ способны
130
образовывать комплексы с боковой карбоксильной группой
остатка Glu228 (6.30), который является ключевым звеном в
«ионном замке», что предотвращает возвращение рецептора в
неактивную конформацию (Ye et al., 2018).
С помощью сайт-направленного мутагенеза установлено,
что кандидатами для первичного взаимодействия с
двухзарядными катионами на входе в трансмембранный домен
могут быть остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот
(Glu151, Glu161, Glu169 и Asp170), локализованные во второй
внеклеточной петле (ВП) A2A-аденозинового рецептора (Kim et
al., 1996). Их боковые карбоксильные группы способны
образовывать связи с ионами Mg2+ и Ca2+, что может приводить к
физическому стягиванию внешнего входа в трансмембранный
домен. При таком взаимодействии, как показано в ходе
молекулярного моделирования, G-белок-связывающая
поверхность рецептора, образованная его цитоплазматическими
участками, становится более доступной для взаимодействия с G-
белком. С другой стороны, стягивание внеклеточных петель до
связывания агониста может затруднять его транслокацию к
ортостерическому сайту рецептора. Важно и то, что ион Fe2+
сходен по своим комплексообразующим свойствам с ионами
Mg2+ и Ca2+, но при этом не оказывает PAM-эффекта на
активацию A2A-аденозинового рецептора агонистами (Ye et al.,
2018). Эти результаты свидетельствуют о том, что до конца не
ясно, оказывают ли двухзарядные катионы свой эффект
первично, или их действие реализуются уже после того, как
рецептор перешел в активную форму.
3.4. Липиды, как аллостерические регуляторы GPCR
Согласно современным представлениям, липиды

являются одними из ключевых аллостерических регуляторов
GPCR. Это обусловлено тем, что GPCR, являясь интегральными
белками, находятся в контакте с липидной фазой плазматической
мембраны. Взаимодействие между рецептором и липидами
131
осуществляется как через контакты липидного бислоя мембраны
с гидрофобными спиралями GPCR, образующими его
трансмембранный домен, так и через контакты мембранных
липидов с проксимальными по отношению к мембране участками
ВП и цитоплазматических петель (ЦП) рецептора. Эти участки
ответственны за узнавание и связывание лиганда (ВП), а также за
процесс передачи гормонального сигнала от активированного
рецептора к гетеротримерным G-белкам (ЦП). Необходимо
отметить, что проксимальные к мембране участки петель GPCR
являются основными структурными элементами внеклеточных и
внутриклеточных аллостерических сайтов.
Липиды способны влиять на конформационные
характеристики и функциональную активность GPCR через как
минимум три молекулярных механизма. Первый из них – это
влияние липидов на физико-химические свойства
плазматической мембраны, поскольку известно, что такие ее
свойства, как текучесть, упругость и механическая прочность
определяются химической природой и соотношением
мембранных липидов. Изменение физико-химических свойств
мембраны оказывает значительное влияние на конформацию
молекулы GPCR. Это отчетливо продемонстрировано при
изучении различных форм светочувствительного рецепторного
белка родопсина, где на переход между метародопсинами I и II
существенным образом влияют физические свойства мембраны
(Mitchell et al., 1990; Botelho et al., 2002; Soubias et al. 2010).
Второй механизм, посредством которого липиды влияют
на GPCR, состоит в регуляции ими субклеточной
компартментализации рецепторных и связанных с ними
акцессорных и эффекторных белков, а также в регуляции
образования этими белками высокоупорядоченных структур,
таких как кавеолы и липидные рафты (Chini, Parenti, 2004;
Ostrom, Insel, 2004; Patel et al., 2008). Третий механизм
заключается в непосредственном взаимодействии различных
типов липидов со специфичными связывающими доменами,
локализованными на молекуле GPCR.
132
Наиболее изученным аллостерическим регулятором
GPCR липидной природы является холестерин, один из основных
компонентов клеточных мембран, липидных рафтов,
предшественник большого числа биологически активных
липидов (Paila, Chattopadhyay, 2010).
Холестерин. Высокое содержание холестерина в
липидных рафтах приводит к значительному повышению у
присутствующих в них рецепторах сродства к ортостерическим
агонистам, как это показано для рецептора окситоцина,
глутаматного метаботропного рецептора mGluR1a,
серотонинового рецептора 1А-подтипа и холецистокининового
рецептора 1-го типа. В то же время в рафтах с низким
содержанием холестерина связывающие характеристики
рецепторов резко ухудшаются (Gimpl et al., 1997; Eroglu et al.,
2003; Prasad et al., 2009; Potter et al., 2012). Восстановление
содержания холестерина в липидных рафтах приводит к
повышению в них числа рецепторов и восстанавливает
аффинность связывания лигандов с GPCR, как это
продемонстрировано для рецептора окситоцина и mGluR1a-
глутаматного рецептора (Gimpl et al., 1997; Eroglu et al. , 2003). В
обедненных холестерином мембранах снижается не только
функциональная активность рецепторов, но и нарушается
процесс передачи гормонального сигнала, осуществляемого через
посредство GPCR. В таких мембранах нарушается активация
фосфолипазы Сβ и кальциевых сигнальных путей в ответ на
стимуляцию агонистом холецистокининового рецептора 1-го
типа, а также блокируется стимуляция митогенактивируемых
протеинкиназ (ERK1/2) и активация транскрипционного фактора
c-Fos в ответ на стимуляцию гонадолиберином рецептора этого
рилизинг-фактора. При нормализации содержания холестерина в
мембранах, регуляторные эффекты агонистов GPCR на
внутриклеточные эффекторные звенья сигнальных систем
полностью восстанавливаются (Navratil et al., 2003; Potter et al.,
2012). Необходимо отметить, что влияние содержания
холестерина в мембранах на сигнальную трансдукцию может
133
зависеть от типа рецептора и меняться даже в случае
близкородственных рецепторов. Истощение содержания
холестерина в мембране ослабляет передачу сигнала с μ-
опиоидного рецептора, но при этом практически не влияет на
этот процесс, запускаемый при активации агонистом δ-
опиоидного рецептора (Levitt et al., 2009). Показано также, что
при нормализации содержания холестерина в липидных рафтах
сродство к агонистам холецистокининового рецептора 1-го типа
повышается, в то время как аффинность родственного ему
холецистокининового рецептора 2-го типа к агонистам
существенно не меняется (Potter et al., 2012).
Обнаружение аллостерического эффекта холестерина
поставило задачу выявить молекулярные детерминанты в
молекулах GPCR, ответственные за специфичное взаимодействие
с этим липидом. Это стало возможным при изучении с помощью
рентгеноструктурного анализа кристаллических структур
комплекса β2-адренергического рецептора с двумя молекулами
тимола и двумя молекулами холестерина (Hanson et al., 2008).
Было показано, что в трансмембранных спиралях рецептора
имеются аминокислотные остатки, образующие связи с
молекулами холестерина – три остатка локализованы в четвертой
ТМС и еще один во второй ТМС. Наиболее значимым было
взаимодействие остатка триптофана в положении 4.50, в то время
как взаимодействие холестерина с другими аминокислотными
остатками играло скорее вспомогательную роль. На основе этих
данных был идентифицирован консенсусный мотив для
связывания холестерина (cholesterol consensus motif, CCM),
включающий 4 аминокислотных остатка, который имеется, по
крайней мере, в 96 GPCR (Hanson et al., 2008). Этот мотив можно
представить следующим образом – 4.39-4.43 (Lys или Arg), 4.46
(Ile, Val или Ile), 4.50 (Trp или Tyr) и 2.41 (Phe, Tyr или Trp).
Однако верификация CCM и оценка роли этого мотива во
взаимодействии с холестерином требует дополнительных
исследований, поскольку, например, оба типа
холецистокининовых рецепторов, CCK1 и CCK2, имеют такие
134
мотивы в структуре трансмембранного домена, но только
активность холецистокининового рецептора 1-го типа снижается
при истощении холестерина в липидных рафтах (Potter et al.,
2012). Показано также, что некоторые GPCR, имеющие в своей
структуре CCM, способны нормально экспрессироваться в
мембранах и наделены функциональной активностью в
мембранах, лишенных холестерина, например в мембранах
бактерии Escherichia coli (Oates, Watts, 2011). Поскольку уровень
холестерина и соотношение его форм существенно меняются при
различных патологических состояниях, то имеются веские
основания полагать, что индуцированные этим изменения
аллостерических эффектов холестерина на GPCR-сигналинг
вносят заметный вклад в этиологию и патогенез этих состояний
(Vance, 2012; Ridker, 2014).
Эндоканнабиноиды. Основными эндогенными
лигандами каннабиноидных рецепторов в мозге и на периферии
являются анандамид и 2-арахидоноилглицерин, но вопрос об
избирательности их функционального взаимодействия с CB1- и
CB2-каннабиноидными рецепторами остается открытым,
поскольку имеются данные о возможности влияния этих
эндогенных каннабиноидов на функциональную активность
других типов рецепторов (Castillo et al., 2012). Так в ЦНС
анандамид подавляет связывание агонистов с серотониновыми и
мускариновыми рецепторами (Kimura et al., 1998; Lagalwar et al.,
1999). Ингибирующее влияние анандамида на m1- и m4-
мускариновые рецепторы было выявлено при его действии на
культуры клеток, в которых экспрессировались эти рецепторы
(Christopoulos, Wilson, 2001; Lanzafame et al., 2004). Показано, что
анандамид при действии на m1-мускариновые рецепторы по
неконкурентному механизму ингибирует их связывание с
антагонистами путем снижения числа сайтов связывания, но без
заметного влияния на сродство антагониста к рецептору
(Lanzafame et al., 2004). Анандамид не менял профиль
конкурентного связывания классических ортостерических
агонистов или аллостерических модуляторов, при этом оказывая
135
модулирующее влияние на эффективность стимулирующего
эффекта агониста. Все эти данные свидетельствуют о
возможности связывания анандамида с каким-то
дополнительным аллостерическим сайтом m1-мускаринового
рецептора и(или) на способность этого гидрофобного
каннабиноида влиять на структуру плазматической мембраны и,
тем самым, менять устойчивость и соотношение конформаций
рецептора (Lanzafame et al., 2004).
2-Арахидоноилглицерин, также как и анандамид,
модулирует связывание агонистов и антагонистов с
неканнабиноидными GPCR, например, с аденозиновым
рецептором 3-го типа (Lane et al., 2010). Анализ влияния
возрастающих концентраций 2-арахидоноилглицерина на
связывание агониста аденозинового рецептора 3-го типа, N6-(4-
аминобензил)-9-[5-(метилкарбонил)-β-d-рибофуранозил)]-
аденина, показал, что большая часть «зоны» ингибирования
связывания агониста приходится на весьма узкий диапазон
концентраций каннабиноида. Это свидетельствует в пользу
отсутствия конкуренции между агонистом и 2-
арахидоноилглицерином за места связывания на молекуле
рецептора. Необходимо отметить, что ингибирующее влияние 2-
арахидоноилглицерина не выявлялось в отношении регуляторных
эффектов агонистов аденозиновых рецепторов 1-го и 2А типов,
что указывает на высокую рецепторную специфичность действия
этого каннабиноида. Не исключено, что мишенями 2-
арахидоноилглицерина являются и другие рецепторы, которые
локализованы в тех же областях мозга, что и аденозиновые
рецепторы 3-го типа, например, мускариновые рецепторы.
Поскольку аденозиновые и мускариновые рецепторы способны
образовывать гетероолигомерные комплексы, как между собой,
так и с другими рецепторами, то аллостерические эффекты
каннабиноидов могут осуществляться через посредство
активации ими таких комплексов. Все это открывает новые
перспективы для расшифровки молекулярных механизмов
действия каннабиноидов и для идентификации их новых
136
мишеней в ЦНС и в периферических органах и тканях (van der
Westhuizen et al., 2015).
Липоксин А4. Родственное каннабиноидам производное
арахидоновой кислоты, липоксин А4, при действии на мышей
вызывает у них каннабиноидоподобные реакции, которые
подавляются антагонистами CB1-каннабиноидного рецептора
(рис. 3.4). Это позволяет предположить, что регуляторные
эффекты липоксина А4 могут реализовываться через CB1-
каннабиноидный рецептор (Pamplona et al., 2012), хотя
классической мишенью липоксина А4 является N-
формилпептидный рецептор FPR1 (Chiang et al., 2006).
Кажущееся несоответствие может быть объяснено тем, что
действие липоксина А4 на CB1-каннабиноидный рецептор имеет
аллостерическую природу. Действительно, липоксин А4
повышает сродство к рецептору таких его агонистов, как
анандамид, СР55,940 и WIN55212-2, и при этом частично
подавляет связывание с ним антагонистов (Pamplona et al., 2012).
В пользу аллостерического эффекта липоксина А4
свидетельствуют данные о том, что при совместном введении в
мозг мышей липоксина А4 и анандамида или 2-
арахидоноилглицерина в относительно низких дозах отмечается
значительное потенцирование каталептических эффектов
эндоканнабиноидов (Pamplona et al., 2012).
Прегненолон. Имеются данные о том, что в ЦНС
прегненолон, основной предшественник нейростероидов,
функционирует как NAM в отношении CB1-каннабиноидного
рецептора (рис. 3.4). Хотя прегненолон не влияет на связывание
агониста Δ9-тетрагидроканнабинола с рецептором, он
ингибирует вызываемую им стимуляцию активности
митогенактивируемых протеинкиназ, снижая степень
фосфорилирования ERK1/2, и предотвращает индуцированные
Δ9-тетрагидроканнабинолом изменения клеточного дыхания и
митохондриальной динамики (Vallée et al., 2014). В условиях in
vivo прегненолон подавляет эффекты Δ9-тетрагидроканнабинола
на локомоцию, термогенез, каталепсию и анальгезию. При
137
длительном введении крысам Δ9-тетрагидроканнабинола в мозге
животных существенно повышается синтез прегненолона, что
можно рассматривать как компенсаторную реакцию синтеза
NAM, направленную на снижение стимулирующего влияния
каннабиноида на специфичный к нему рецептор (Vallée et al.,
2014).
Прогестерон. Установлено, что стероидный гормон
прогестерон ингибирует связывание агонистов и антагонистов с
окситоциновыми рецепторами крысы, экспрессируемыми в
клеточной культуре, вызывая снижение максимального
связывания лиганда без изменения кажущейся аффинности к
лиганду (Grazzini et al., 1998). Результатом ингибирующего
влияния прогестерона на стимулирующие эффекты окситоцина
было снижение активации фосфоинозитидного пути и, как
следствие ослабление индуцированного окситоцином
кальциевого сигналинга в клетках-мишенях. Эффект
прогестерона характеризовался видовой специфичностью,
поскольку он не влиял на связывание окситоцина с
окситоциновым рецептором человека. Однако метаболит
прогестерона, 5β-дигидроксипрогестерон, оказался эффективным
NAM для окситоцинового рецептора человека, подавляя
вызываемое окситоцином накопление инозитол-1,4,5-трифосфата
(Grazzini et al., 1998).
Олеамид. Среди молекулярных механизмов действия
олеамида, представляющего собой амид эндогенной жирной
кислоты, который в больших количествах имеется в
цереброспинальной жидкости и вовлечен в регуляцию
нейрональной активности, можно выделить его способность
активировать каннабиноидные рецепторы и ингибировать
активность фермента – гидролазы амидов жирных кислот
(Leggett et al., 2004). Однако основная биологическая активность
олеамида обусловлена его способностью аллостерически
модулировать функциональную активность различных типов
серотониновых рецепторов.
138
Рис. 3-4. Структуры эндогенных аллостерических регуляторов –

липоксина А4, прегненолона и пептидного фактора пепкана-12 (по
Morales et al., 2016).
При действии на серотониновый рецептор 2А-подтипа

олеамид усиливал стимулирующие эффекты агониста этого
рецептора на инозитолтрифосфат-опосредуемую мобилизацию
кальция из внутриклеточных депо. В то же время в отсутствие 5-
HT2A-агониста олеамид не проявлял биологической активности
по отношению к серотониновому рецептору 2А-подтипа (Thomas
et al., 1997, 1998). В клетках с экспрессированным в них
серотониновым рецептором 7-го типа как серотонин, так и
олеамид по отдельности стимулировали накопление
внутриклеточного цАМФ, но при совместном воздействии
олеамид снижал стимулирующие эффекты серотонина на цАМФ-
139
зависимые сигнальные пути, действуя в этом случае, как NAM
(Thomas et al., 1997). Прямая отрицательная кооперативность
между эффектами олеамида и серотонина продемонстрирована
при изучении радиолигандного связывания агонистов с
серотониновым рецептором 7-го типа (Hedlund et al., 1999).
3.5. Аминокислоты и их производные, как

Среди двадцати канонических аминокислот, наибольшое

значение как аллостерические регуляторы GPCR имеют
ароматические аминокислоты – фенилаланин, тирозин и
триптофан. Показано, что эти ароматические аминокислоты
аллостерически модулируют регуляторные эффекты
внеклеточного кальция на активность чувствительного к кальцию
рецептора CaSR (Conigrave et al., 2000). Они специфично
связываются с доменом, который структурно напоминает
венерину мухоловку и располагается вблизи ортостерического
сайта, тем самым, усиливая действие ионов кальция на CaSR-
зависимые сигнальные пути (Conigrave et al., 2000; Zhang et al.,
2002; Mun et al., 2005). Еще одним результатом такого
связывания является усиление зависимой от внеклеточного
кальция супрессии секреторной активности клеток
паращитовидной железы, продуцирующих паратиреоидный
гормон (Lee et al., 2007). Хотя потенцирующие эффекты
ароматических аминокислот на сигнальную трансдукцию,
реализуемую через CaSR, относительно невелики, они являются
физиологически значимыми (Davey et al., 2012) и могут быть
применены в клинике (Saidak et al., 2009). Фенилаланин и
алифатические аминокислоты, лейцин и изолейцин, способны
аллостерически модулировать регуляторные эффекты агониста
баклофена на активность метаботропного рецептора γ-
аминомасляной кислоты (GABAB) (Kerr, Ong, 2003). Однако
физиологическое значение такого влияния аминокислот до конца
не ясно, поскольку они не влияют на эффекты γ-аминомасляной
140
кислоты, эндогенного агониста GABAB-рецептора ни в нативных,
ни в рекомбинантных клеточных системах (Urwyler et al., 2004).
Как известно, аминокислоты являются
биосинтетическими предшественниками большого числа
гормональных агентов и нейротрансмиттеров, таких как
серотонин, дофамин, норадреналин, адреналин и γ-
аминомасляная кислота. Возможно, именно с этим связан тот
факт, что некоторые метаболиты аминокислот могут
функционировать, как аллостерические модуляторы GPCR.
Показано, что гомоцистеин, метаболит метионина, специфично
взаимодействует с третьей ВП дофаминового рецептора 2-го типа
и отрицательно модулирует связывание дофамина, функционируя
как NAM. В то же время гомоцистеин проявляет нейтральные
аллостерические свойства по отношению к связыванию
рецептора с антагонистом раклопридом (Agnati et al., 2006). Как
известно, значимое повышение уровни гомоцистеина в крови
свидетельствует о развитии у пациентов неврологических
расстройств и является важнейшим патогенетическим фактором
болезней Альцгеймера, Хантингтона и Паркинсона, а также ряда
других нейродегенеративных заболеваний (Seshadri et al., 2002;
Morris, 2003; Andrich et al. al., 2004; Müller, 2008).
Агматин, декарбоксилированный метаболит
аминокислоты аргинина, положительно модулирует
индуцированное норадреналином высвобождение этого
нейромедиатора из его комплекса с α2-адренергическим
рецептором. Показано, что в основе эффекта агматина может
лежать его специфическое связывание как с ортостерическим, так
и с аллостерическим сайтами рецептора (Molderings et al. al.,
2000). Агматин и опосредуемая им активация α2-
адренергического рецептора являются важным звеном защиты
сердечно-сосудистой системы от повреждений, а также могут
быть вовлечены в реализацию противосудорожных,
антинейротоксических и антидепрессивных эффектов (Piletz et
al., 2013).
141
3.6. Пептиды и белки, как аллостерические регуляторы
GPCR
Одним из интенсивно изучаемых аллостерических

регуляторов пептидной природы является наделенный
антиоксидантной активностью глутатион (γ-глутаминил-
цистеинилглицин), который синтезируется преимущественно
печенью и представляет собой наиболее распространенный
биогенный тиол в клетках млекопитающих. К настоящему
времени показано, что глутатион относится к группе эндогенных
аллостерических модуляторов рецептора CaSR, а механизмы его
действия на активность этого рецептора сходны с таковыми у
ароматических аминокислот (Wang et al., 2006; Broadhead et al.,
2011). Присущая глутатиону способность аллостерически влиять
на активность рецептора CaSR делает его важнейшим
физиологическим регулятором функций паращитовидной
железы, обеспечивая снижение повышенного уровня
паратиреоидного гормона при различных формах
гиперпаратиреоза.
Свойства аллостерического модулятора выявлены у
продуцируемого в мозге трипептида Leu-Pro-Gly, который
называют фактором, ингибирующим высвобождение
меланоцитстимулирующего гормона (Horvath, Kastin, 1990).
Установлено, что этот трипептид является положительным
аллостерическим модулятором дофаминового рецептора 2-го
типа, усиливая связывание с ним ортостерических лигандов и
потенцируя запуск агонистами внутриклеточных сигнальных
каскадов (Bhargava, 1983; Johnson et al., 1986; Ott et al., 1996;
Mishra et al., 1999). Поскольку повышение чувствительности
дофаминовых рецепторов 2-го типа к эндогенно
высвобождаемому дофамину может эффективно компенсировать
дегенерацию окончаний дофаминергических нейронов при
болезни Паркинсона, то разработка PAM для этих рецепторов
представляет значительный интерес как для лечения болезни
Паркинсона, так и других нейродегенеративных заболеваний.
142
К аллостерическим регуляторам также относится
эндогенный пептид 5-гидрокситриптамин-модулин (Leu-Ser-Ala-
Leu), который влияет на функциональную активность
серотониновых систем мозга через посредство взаимодействия с
серотониновыми рецепторами 1B/1D-подтипа. Этот
короткоживущий пептид высвобождается в различных областях
мозга, причем его продукция в значительной степени усиливается
в условиях стресса (Fillion et al., 1996; Fillion, 2000). 5-
Гидрокситриптамин-модулин является NAM в отношении
связывания серотонина с рецепторами (Rousselle et al., 1996), а
также подавляет индуцированную агонистами серотониновых
рецепторов 1B/1D-подтипа синаптосомальную активность
(Massot et al., 1996). Это позволяет использовать 5-
гидрокситриптамин-модулин в качестве потенциального
препарата для предотвращения депрессивных состояний (Fillion,
2000).
Экспрессируемый в мозге пепкан-12 (pepcan-12),
называемый также RVD-гемопрессином, представляет собой
олигопептид RVDPVNFKLLSH, который генерируется из
прекурсорного пепкана-23 (SALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSH).
Показано, что он способен оказывать аллостерическое влияние на
различные типы каннабиноидных рецепторов – как 1-го (Gomes
et al., 2009; Bauer et al., 2012; Straiker et al., 2015), так и 2-го типов
(Petrucci et al., 2017), причем по своему фармакологическому
профилю регуляторные эффекты пепкана-12 на различные типы
каннабиноидных рецепторов сильно различаются.
Показано, что пепкан-12 влияет на связывание
ортостерического агониста WIN55212-2 с CB1-каннабиноидным
рецептором (рис. 3.4) (Gomes et al., 2009). В отличие от полного
ингибирования связывания WIN55212-2, вызываемого
ортостерическим агонистом СР55,940, пепкан-12 ингибирует
специфическое связывание WIN55212-2 лишь частично, даже при
насыщающих концентрациях этого пептида, что указывает на
сравнительно слабо выраженную отрицательную
кооперативность между связыванием пепкана-12 и WIN55212-2
143
(Bauer et al., 2012). Отрицательный аллостерический эффект
пепкана-12 также проявляется при ингибировании им
регуляторных эффектов агонистов CB1-каннабиноидного
рецептора на внутриклеточные сигнальные каскады, зависимые
от каннабиноидов (Bauer et al., 2012). Пепкан-12 и другие NAM
CB1-каннабиноидного рецептора могут использоваться при
коррекции таких метаболических расстройств, как ожирение и
сахарный диабет 2-го типа, поскольку, в отличие от классических
ортостерических CB1-антагонистов, они не вызывают депрессию
и другие побочные эффекты (de Kloet, Woods, 2009).
При действии на CB2-каннабиноидные рецепторы
пепкан-12 проявляет свойства PAM, повышая стимулирующие
этот рецептор эффекты полных ортостерических агонистов,
причем свое действие он реализует уже в наномолярных
концентрациях (Petrucci et al., 2017). Пепкан-12 в 5–10 раз
усиливает стимулирующий эффект агонистов CB2-
каннабиноидных рецепторов, в том числе эндоканнабиноида 2-
арахидоноилглицерина, на ГТФ-связывание G-белков
ингибирующего типа, а также потенцирует их ингибирующий
эффект на продукцию цАМФ. Показано, что уровень пепкана-12
существено повышается в условиях эндотоксемии и при
усилении воспалительных и апоптотических процессов,
ассоциированных с ишемией и реперфузией. Как известно, CB2-
каннабиноидные рецепторы при этих состояниях выполняют
защитные функции, вследствие чего повышение уровня пепкана-
12 можно рассматривать как пусковой механизм активации этих
функций (Petrucci et al., 2017).
Изучение структуры m2-мускаринового рецептора
показало, что положительно заряженные модуляторы пептидной
природы способны с высокой эффективностью
взаимодействовать с отрицательно заряженным аллостерическим
сайтом, расположенным во внеклеточном преддверии
трансмембранного домена рецептора, и аллостерически влиять на
его активацию агонистами (Dror et al., 2013). В полном
соответствии с этими результатами, еще 37 лет назад было
144
установлено, что белок протамин, обогащенный положительно
заряженными аминокислотными остатками, негативно
модулирует связывание радиоактивно меченых ортостерических
антагонистов с m2-мускариновым рецептором (Hu et al., 1992). В
дальнейшем было показано, что положительно заряженный
пептид динорфин-А(1–13) и основный белок миелина проявляют
сходный с протамином ингибирующий эффект на активацию m2-
мускаринового рецептора агонистами (Hu, el-Fakahany, 1993).
Поскольку как динорфин-А(1–13), повсеместно экспрессируемый
в ЦНС эндогенный опиоидный пептид, так и основной белок
миелина, важнейший компонент нервного миелина, в больших
количествах обнаруживаются во внеклеточном пространстве, то
их можно рассматривать как физиологические регуляторы
активности m2-мускариновых рецепторов (van der Westhuizen et
al., 2015). Негативное влияние динорфина-А(1–13) и основного
белка миелина на функциональную активность m2-мускариновых
рецепторов в нервной системе приводит к ослаблению
отрицательной обратной связи, которую они опосредуют,
контролируя высвобождение ацетилхолина нейронами мозга.
Наряду с ЦНС, m2-мускариновые рецепторы с высокой
эффективностью экспрессируются в постганглионарных нервах
дыхательных путей, и нарушение функций этих рецепторов,
являющихся, как правило, ауторецепторами, является одной из
первопричин различных заболеваниях дыхательных путей,
включая бронхиальную астму (Barnes et al., 1988).
Отличительной чертой бронхиальной астмы является
инфильтрация эозинофилов в область воспаления и их
дегрануляция, что сопровождается высвобождением
обогащенного аргинином доминантного основного белка (major
basic protein), активирующего тучные клетки и нейтрофилы
(Rosenberg et al., 2013). Предполагается, что у астматиков
нарушения функциональной активности m2-мускариновых
рецепторов в нейронах обусловлены присутствием доминантного
основного белка в нервно-мышечных соединениях (Jacoby et al.,
1998). Этот провоспалительный белок способен эффективно
145
связываться с m2-мускариновым рецептором и по
аллостерическому механизму менять его функциональные
характеристики (Jacoby et al., 1993).
3.7. Аутоантитела к GPCR, как аллостерические

регуляторы
В результате деградации и нарушений процессинга

GPCR, как в норме, так и в условиях патологии (онкологические
заболевания, травмы, воспалительные процессы), генерируется
большое число антигенов, представляющих различные по
размеру и локализации фрагменты GPCR, на которые в
дальнейшем вырабатываются антитела. В последние годы
проводятся интенсивные исследования по идентификации и
изучению механизмов образования таких антител, а также
выяснению молекулярных механизмов их действия и роли в
развитии аутоиммунных заболеваний (Жарова, Шпаков, 2016;
Шпаков и др., 2017). Наибольший интерес представляют
антитела, вырабатываемые на внеклеточный N-концевой домен и
ВП GPCR, поскольку они в физиологических условиях способны
с высокой специфичностью взаимодействовать с внеклеточными
частями рецепторов и влиять на их функциональную активность
и сродство к агонистам, функционируя как аллостерические
регуляторы. Одни аутоантитела характеризуются агонист-
подобной активностью, вызывая повышение базальной
активности GPCR, или потенцирует активирующие рецептор
эффекты агонистов, функционируя как PAM. Другая группа
аутоантител вызывает ингибирование регуляторных эффектов
агонистов, снижая их сродство к GPCR и предотвращая
активацию внутриклеточных каскадов, функционируя как NAM.
Подробное описание аутоантител к GPCR, как их
аллостерических регуляторов, представлено в Главе 7.
Несмотря на то, что аллостерические механизмы
являются основой регуляторного действия аутоантител на GPCR
и зависимые от них внутриклеточные сигнальные каскады, они
146
до сих пор остаются малоизученными. Во многом подобная
ситуация обусловлена сложностью поиска молекулярных
детерминант в молекулах GPCR, вовлеченных во взаимодействие
с антителами, а также прикладным характером подобных
исследований, направленных в основном на расшифровку
этиопатогенетических механизмов аутоиммунных заболеваний,
вызванных анти-GPCR-антителами, а также на выяснение роли
определенных типов GPCR в регуляции физиологических и
биохимических процессов.
В заключение приведем таблицу, в которой представлены
основные эндогенные аллостерические регуляторы GPCR, а
также рецепторы, являющиеся мишенями их действия (табл. 3-1).
Необходимо отметить, что это лишь небольшая часть
функционирующих в нашем организме аллостерических
регуляторов, поскольку большинство из них еще только ожидают
своего открытия. На это указывает большое число
аллостерических сайтов, расположенных в GPCR, для которых не
найдены эндогенные регуляторы. Паттерн эндогенных
аллостерических регуляторов GPCR во многом определяется
физиологическим состоянием организма, а также
патологическими процессами, которые генерируют большое
число молекул, потенциально способных взаимодействовать с
аллостерическими сайтами рецепторов.
Таблица 3-1. Эндогенные аллостерические регуляторы GPCR

Классы веществ Представители веществ GPCR-мишени
Ионы металлов Na+ Различные рецепторы
Zn2+ Различные рецепторы
Mg2+ μ- и κ-опиоидные, β1-
адренергический
Mn2+ μ-, δ- и κ-опиоидные, β-
адренергические
Аминокислоты Фенилаланин, тирозин, CaSR
и их триптофан
производные
Лейцин, изолейцин, Метаботропные GABAB-
фенилаланин рецепторы
147
Продолжение таблицы 3-1
Гомоцистеин Дофаминовый 2-го типа
Агматин α2D-адренергический
Пептиды Фактор, Дофаминовый 2-го типа
ингибируюший
высвобождение
меланотропина
5-HT-модулин Серотониновый 1B/1D-
подтипа
Глутатион CaSR
Полипептиды и Пепкан-12 CB1-каннабиноидный
белки
Динорфин А m2-мускариновый
ацетилхолиновый
Полипептиды и Протамин m2-мускариновый
белки ацетилхолиновый
Миелиновый основный m2-мускариновый
белок ацетилхолиновый
Доминантный m2-мускариновый
основной белок ацетилхолиновый
Липиды Олеамид Серотониновые 2A/2C-го,
1А-го и 7-го типов
Анандамид m1- и m4-мускариновые
ацетилхолиновые,
аденозиновый 3-го типа
2- Аденозиновый 3-го типа
Арахидоноилглицерин
Арахидоновая кислота Мускариновые
ацетилхолиновые
Липоксин А4 CB1-каннабиноидный
Прогестерон Окситоциновый (крыса)
5β- Окситоциновый (человек)
Дигидропрогестерон
Холестерин Родопсин, β2-
адренергический,
окситоциновый,
аденозиновый 2А-подтипа,
серотониновый 1А-
подтипа
Прегненолон CB1-каннабиноидный
148
Деркач К.В., Романова И.В., Шпаков А.О. Функциональное
взаимодействие между дофаминовой и меланокортиновой системами мозга //
Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2016. Т. 102. № 12. C.
1393–1405.
Жарова О.А., Шпаков А.О. Роль аутоантител к внеклеточным
участкам ионотропных рецепторов в этиологии и патогенезе аутоиммунных
заболеваний // Рос. Физиол. Журн. им. И.М. Сеченова. 2016. Т. 102. № 7. C. 773–
791.
Шпаков А.О., Деркач К.В. Меланокортиновая сигнальная система
гипоталамуса и ее функциональное состояние в условиях сахарного диабета 2-
го типа и метаболического синдрома // Российский Физиологический журнал
им. И.М. Сеченова. 2016. Т. 102. № 1. C. 18–40.
Шпаков А.О., Жарова О.А., Деркач К.В. Аутоантитела к внеклеточным
участкам сопряженных с G-белками рецепторов и рецепторов-тирозинкиназ, как
одна из причин аутоиммунных заболеваний // Журн. эвол. биохим. физиологии.
2017. Т. 53. № 2. C. 84–98.
Agnati L.F., Ferré S., Genedani S., Leo G., Guidolin D., Filaferro M.,
Carriba P., Casadó V., Lluis C., Franco R., et al. Allosteric modulation of dopamine
D2 receptors by homocysteine // J. Proteome Res. 2006. V. 5. P. 3077–3083.
Andrich J., Saft C., Arz A., Schneider B., Agelink M.W., Kraus P.H., Kuhn
W., Müller T. Hyperhomocysteinaemia in treated patients with Huntington’s disease
homocysteine in HD // Mov. Disord. 2004. V. 19. P. 226–228.
Appelmans N., Carroll J.A., Rance M.J., Simon E.J., Traynor J.R. Sodium
ions increase the binding of the antagonist peptide ICI 174864 to the delta-opiate
receptor // Neuropeptides. 1986. V. 7. P. 139–143.
Azzi M., Piñeyro G., Pontier S., Parent S., Ansanay H., Bouvier M.
Allosteric effects of G protein overexpression on the binding of beta-adrenergic
ligands with distinct inverse efficacies // Mol. Pharmacol. 2001. V. 60. P. 999–1007.
Barnes P.J., Minette P., Maclagan J. Muscarinic receptor subtypes in
airways // Trends Pharmacol. Sci. 1988. V. 9. P. 412–416.
Bauer M., Chicca A., Tamborrini M., Eisen D., Lerner R., Lutz B., Poetz O.,
Pluschke G., Gertsch J. Identification and quantification of a new family of peptide
endocannabinoids (Pepcans) showing negative allosteric modulation at CB1 receptors
// J. Biol. Chem. 2012. V. 287. P. 36944–36967.
Bhargava H.N. The effect of melanotropin release inhibiting factor, its
metabolites and analogs on [3H]spiroperidol and [3H]apomorphine binding sites //
Gen. Pharmacol. 1983. V. 14. P. 609–614.
Birnbaumer L., Zurita A.R. On the roles of Mg in the activation of G
proteins // J. Recept. Signal Transduct. Res. 2010. V. 30. P. 372–375.
149
Botelho A.V., Gibson N.J., Thurmond R.L., Wang Y., Brown M.F.
Conformational energetics of rhodopsin modulated by nonlamellar-forming lipids //
Biochemistry. 2002. V. 41. P. 6354–6368.
Bouschet T., Martin S., Henley J.M. Receptor-activity-modifying proteins
are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma
membrane // J. Cell. Sci. 2005. V. 118. P. 4709–4720.
Broadhead G.K., Mun H.-C., Avlani V.A., Jourdon O., Church W.B.,
Christopoulos A., Delbridge L., Conigrave A.D. Allosteric modulation of the calcium-
sensing receptor by gamma-glutamyl peptides: inhibition of PTH secretion,
suppression of intracellular cAMP levels, and a common mechanism of action with L-
amino acids // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. P. 8786–8797.
Bühlmann N., Leuthäuser K., Muff R., Fischer J.A., Born W. A receptor
activity modifying protein (RAMP)2-dependent adrenomedullin receptor is a
calcitonin gene-related peptide receptor when coexpressed with human RAMP1 //
Endocrinology. 1999. V. 140. P. 2883–2890.
Burgmer U., Schulz U., Tränkle C., Mohr K. Interaction of Mg2+ with the
allosteric site of muscarinic M2 receptors // Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol.
1998. V. 357. P. 363–370.
Burstein E.S., Spalding T.A., Brann M.R. Pharmacology of muscarinic
receptor subtypes constitutively activated by G proteins // Mol. Pharmacol. 1997. V.
51. P. 312–319.
Castillo P.E., Younts T.J., Chávez A.E., Hashimotodani Y. Endocannabinoid
signaling and synaptic function // Neuron. 2012. V. 76. P. 70–81.
Chan L.F., Webb T.R., Chung T.T., Meimaridou E., Cooray S.N., Guasti L.,
Chapple J.P., Egertová M., Elphick M.R., Cheetham M.E., et al. MRAP and MRAP2
are bidirectional regulators of the melanocortin receptor family // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 2009. V. 106. P. 6146–6151.
Chiang N., Serhan C.N., Dahlén S.-E., Drazen J.M., Hay D.W.P., Rovati
G.E., Shimizu T., Yokomizo T., Brink C. The lipoxin receptor ALX: potent ligand-
specific and stereoselective actions in vivo // Pharmacol. Rev. 2006. V. 58. P. 463–
487.
Chini B., Parenti M. G-protein coupled receptors in lipid rafts and caveolae:
how, when and why do they go there? // J. Mol. Endocrinol. 2004. V. 32. P. 325–338.
Christopoulos A. Advances in G protein-coupled receptor allostery: from
function to structure // Mol. Pharmacol. 2014. V. 86. P. 463–478.
Christopoulos A., Christopoulos G., Morfis M., Udawela M., Laburthe M.,
Couvineau A., Kuwasako K., Tilakaratne N., Sexton P.M. Novel receptor partners and
function of receptor activity-modifying proteins // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P.
3293–3297.
Christopoulos A., Kenakin T. G protein-coupled receptor allosterism and
complexing // Pharmacol. Rev. 2002. V. 54. P. 323–374.
Christopoulos A., Wilson K. Interaction of anandamide with the M1 and M4
muscarinic acetylcholine receptors // Brain Res. 2001. V. 915. P. 70–78.
150
Ciolek J., Maïga A., Marcon E., Servent D., Gilles N. Pharmacological
characterization of zinc and copper interaction with the human alpha1A-adrenoceptor //
Eur. J. Pharmacol. 2011. V. 655. P. 1–8.
Conigrave A.D., Quinn S.J., Brown E.M. L-amino acid sensing by the
extracellular Ca2+-sensing receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P.
4814–4819.
Christopoulos A. Positive and negative allosteric modulators promote biased signaling
at the calcium-sensing receptor // Endocrinology. 2012. V. 153. P. 1232–1241.
de Kloet A.D., Woods S.C. Minireview: Endocannabinoids and their
receptors as targets for obesity therapy // Endocrinology. 2009. V. 150. P. 2531–2536.
De Lean A., Stadel J.M., Lefkowitz R.J. A ternary complex model explains
the agonist-specific binding properties of the adenylate cyclase-coupled beta-
adrenergic receptor // J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 7108–7117.
Dror R.O., Green H.F., Valant C., Borhani D.W., Valcourt J.R., Pan A.C.,
Arlow D.H., Canals M., Lane J.R., Rahmani R., et al. Structural basis for modulation
of a G-protein-coupled receptor by allosteric drugs // Nature. 2013. V. 503. P. 295–
299.
Ehlert F.J. The relationship between muscarinic receptor occupancy and
adenylate cyclase inhibition in the rabbit myocardium // Mol. Pharmacol. 1985. V. 28.
P. 410–421.
Ericksen S.S., Cummings D.F., Weinstein H., Schetz J.A. Ligand selectivity
of D2 dopamine receptors is modulated by changes in local dynamics produced by
sodium binding // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2009. V. 328. P. 40–54.
Eroglu C., Brugger B., Wieland F., Sinning I. Glutamate-binding affinity of
Drosophila metabotropic glutamate receptor is modulated by association with lipid
rafts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 10219–10224.
Fenalti G., Giguere P.M., Katritch V., Huang X.P., Thompson A.A.,
// Nature. 2014. V. 506. P. 191–196.
Fillion G. Potential of 5-HT-moduline as a drug target for affective
disorders // Curr. Opin. Investig. Drugs. 2000. V. 1. P. 104–109.
Fillion G., Rousselle J.C., Massot O., Zifa E., Fillion M.P., Prudhomme N.
A new peptide, 5-HT-moduline, isolated and purified from mammalian brain
specifically interacts with 5-HT1B/1D receptors // Behav. Brain Res. 1996. V. 73. P.
313–317.
Fraser C.M., Wang C.-D., Robinson D.A., Gocayne J.D., Venter J.C. Site-
directed mutagenesis of m1 muscarinic acetylcholine receptors: conserved aspartic
acids play important roles in receptor function // Mol. Pharmacol. 1989. V. 36. P.
840–847.
Gimpl G., Burger K., Fahrenholz F. Cholesterol as modulator of receptor
function // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 10959–10974.
151
Gomes I., Grushko J.S., Golebiewska U., Hoogendoorn S., Gupta A.,
Heimann A.S., Ferro E.S., Scarlata S., Fricker L.D., Devi L.A. Novel endogenous
peptide agonists of cannabinoid receptors // FASEB J. 2009. V. 23. P. 3020–3029.
Grazzini E., Guillon G., Mouillac B., Zingg H.H. Inhibition of oxytocin
receptor function by direct binding of progesterone // Nature. 1998. V. 392. P. 509–
512.
Gurevich V.V., Pals-Rylaarsdam R., Benovic J.L., Hosey M.M., Onorato
J.J. Agonist-receptor-arrestin, an alternative ternary complex with high agonist
affinity // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 28849–28852.
Hanson M.A., Cherezov V., Griffith M.T., Roth C.B., Jaakola V.-P., Chien
E.Y.T., Velasquez J., Kuhn P., Stevens R.C. A specific cholesterol binding site is
established by the 2.8 A structure of the human beta2-adrenergic receptor // Structure.
2008. V. 16. P. 897–905.
Hay D.L., Poyner D.R., Sexton P.M. GPCR modulation by RAMPs //
Pharmacol. Ther. 2006. V. 109. P. 137–197.
Hedlund P.B., Carson M.J., Sutcliffe J.G., Thomas E.A. Allosteric
regulation by oleamide of the binding properties of 5-hydroxytryptamine7 receptors //
Biochem. Pharmacol. 1999. V. 58. P. 1807–1813.
Holst B., Elling C.E., Schwartz T.W. Metal ion-mediated agonism and
agonist enhancement in melanocortin MC1 and MC4 receptors // J. Biol. Chem. 2002.
V. 277. P. 47662–47670.
Horstman D.A., Brandon S., Wilson A.L., Guyer C.A., Cragoe E.J. Jr.,
Limbird L.E. An aspartate conserved among G-protein receptors confers allosteric
regulation of alpha2-adrenergic receptors by sodium // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P.
21590–21595.
Horvath A., Kastin A.J. Evidence for presence of Tyr-MIF-1 (Tyr-Pro-Leu-
Gly-NH2) in human brain cortex // Int. J. Pept. Protein Res. 1990. V. 36. P. 281–284.
Hu J., el-Fakahany E.E. Allosteric interaction of dynorphin and myelin
basic protein with muscarinic receptors // Pharmacology. 1993. V. 47. P. 351–359.
Hu J., Wang S.Z., Forray C., el-Fakahany E.E. Complex allosteric
modulation of cardiac muscarinic receptors by protamine: potential model for putative
endogenous ligands // Mol. Pharmacol. 1992. V. 42. P. 311–321.
Jacoby D.B., Gleich G.J., Fryer A.D. Human eosinophil major basic protein
is an endogenous allosteric antagonist at the inhibitory muscarinic M2 receptor // J.
Clin. Invest. 1993. V. 91. P. 1314–1318.
Jacoby D.B., Xiao H.Q., Lee N.H., Chan-Li Y., Fryer A.D. Virus- and
interferon-induced loss of inhibitory M2 muscarinic receptor function and gene
expression in cultured airway parasympathetic neurons // J. Clin. Invest. 1998. V. 102.
P. 242–248.
Jiang J.Y., Nagaraju M., Meyer R.C., Zhang L.., Hamelberg D., Hall R.A.,
Brown E.M., Conn P.J., Yang J.J. Extracellular calcium modulates actions of
orthosteric and allosteric ligands on metabotropic glutamate receptor 1α // J. Biol.
Chem. 2014. V. 289. P. 1649–1661.
152
Johnson R.L., Rajakumar G., Mishra R.K. Dopamine receptor modulation
by Pro-Leu-Gly-NH2 analogues possessing cyclic amino acid residues at the C-
terminal position // J. Med. Chem. 1986. V. 29. P. 2100–2104.
Kadmiel M., Fritz-Six K.L., Caron K.M. Understanding RAMPs through
genetically engineered mouse models // Adv. Exp. Med. Biol. 2012. V. 744. P. 49–60.
Katritch V., Cherezov V., Stevens R.C. Structure-function of the G protein-
coupled receptor superfamily // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2013. V. 53. P. 531–
556.
Katritch V., Fenalti G., Abola E.E., Roth B.L., Cherezov V., Stevens R.C.
Allosteric sodium in class A GPCR signaling // Trends Biochem. Sci. 2014. V. 39. P.
233–244.
Kerr D.I.B., Ong J. Potentiation of metabotropic GABAB receptors by L-
amino acids and dipeptides in rat neocortex // Eur. J. Pharmacol. 2003. V. 468. P.
103–108.
Kim J., et al. Glutamate residues in the second extracellular loop of the
human A2a adenosine receptor are required for ligand recognition // Mol. Pharmacol.
1996. V. 49. P. 683–691.
Kimura T., Ohta T., Watanabe K., Yoshimura H., Yamamoto I.
Anandamide, an endogenous cannabinoid receptor ligand, also interacts with 5-
hydroxytryptamine (5-HT) receptor // Biol. Pharm. Bull. 1998. V. 21. P. 224–226.
Lagalwar S., Bordayo E.Z., Hoffmann K.L., Fawcett J.R., Frey W.H. 2nd.
Anandamides inhibit binding to the muscarinic acetylcholine receptor // J. Mol.
Neurosci. 1999. V. 13. P. 55–61.
Lagerström M.C., Klovins J., Fredriksson R., Fridmanis D., Haitina T.,
Ling M.K., Berglund M.M., Schiöth H.B. High affinity agonistic metal ion binding
sites within the melanocortin 4 receptor illustrate conformational change of
transmembrane region 3 // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 51521–51526.
Lane J.R., Beukers M.W., Mulder-Krieger T., Ijzerman A.P. The
endocannabinoid 2-arachidonylglycerol is a negative allosteric modulator of the
human A3 adenosine receptor // Biochem. Pharmacol. 2010. V. 79 (1). P. 48-56. doi:
10.1016/j.bcp.2009.07.024.
Lanzafame A.A., Guida E., Christopoulos A. Effects of anandamide on the
binding and signaling properties of M1 muscarinic acetylcholine receptors //
Biochem. Pharmacol. 2004. V. 68. P. 2207–2219.
Lee H.J., Mun H.-C., Lewis N.C., Crouch M.F., Culverston E.L., Mason
R.S., Conigrave A.D. Allosteric activation of the extracellular Ca2+-sensing receptor
by L-amino acids enhances ERK1/2 phosphorylation // Biochem. J. 2007. V. 404. P.
141–149.
Leggett J.D., Aspley S., Beckett S.R.G., D’Antona A.M., Kendall D.A.,
Kendall D.A. Oleamide is a selective endogenous agonist of rat and human CB1
cannabinoid receptors // Br. J. Pharmacol. 2004. V. 141. P. 253–262.
Lenhart P.M., Broselid S., Barrick C.J., Leeb-Lundberg L.M.F., Caron K.M.
G-protein-coupled receptor 30 interacts with receptor activity-modifying protein 3 and
153
confers sex-dependent cardioprotection // J. Mol. Endocrinol. 2013. V. 51. P. 191–
202.
Levitt E.S., Clark M.J., Jenkins P.M., Martens J.R., Traynor J.R.
Differential effect of membrane cholesterol removal on mu- and delta-opioid
receptors: a parallel comparison of acute and chronic signaling to adenylyl cyclase //
J. Biol. Chem. 2009. V. 284. P. 22108–22122.
Li M., Wetzel-Strong S.E., Hua X., Tilley S.L., Oswald E., Krummel M.F.,
Caron K.M. Deficiency of RAMP1 attenuates antigen-induced airway
hyperresponsiveness in mice // PLoS ONE. 2014. V. 9. P. e102356.
Liu W., Chun E., Thompson A.A., Chubukov P., Xu F., Katritch V., Han
G.W., Roth C.B., Heitman L.H., Ijzerman A.P., et al. Structural basis for allosteric
regulation of GPCRs by sodium ions // Science 2012. V. 337. P. 232–236.
Livingston K.E., Traynor J.R. Disruption of the Na+ ion binding site as a
mechanism for positive allosteric modulation of the mu-opioid receptor // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2014. V. 111. P. 18369–18374.
Massink A., Gutierrez-de-Teran H., Lenselink E.B., Ortiz Zacarias N.V., Xia
L., Heitman L.H., Katritch V., Stevens R.C., Ijzerman A.P. Sodium ion binding pocket
mutations and adenosine A2A receptor function // Mol. Pharmacol. 2015. V. 87. P.
305–313.
Massot O., Rousselle J.C., Fillion M.P., Grimaldi B., Cloëz-Tayarani I.,
Fugelli A., Prudhomme N., Seguin L., Rousseau B., Plantefol M., et al. 5-
hydroxytryptamine-moduline, a new endogenous cerebral peptide, controls the
serotonergic activity via its specific interaction with 5-hydroxytryptamine1B/1D
receptors // Mol. Pharmacol. 1996. V. 50. P. 752–762.
McLatchie L.M., Fraser N.J., Main M.J., Wise A., Brown J., Thompson N.,
Solari R., Lee M.G., Foord S.M. RAMPs regulate the transport and ligand specificity
of the calcitonin-receptor-like receptor // Nature. 1998. V. 393. P. 333–339.
Metherell L.A., Chapple J.P., Cooray S., David A., Becker C., Rüschendorf
F., Naville D., Begeot M., Khoo B., Nürnberg P., et al. Mutations in MRAP, encoding
a new interacting partner of the ACTH receptor, cause familial glucocorticoid
deficiency type 2 // Nat. Genet. 2005. V. 37. P. 166–170.
Miller-Gallacher J.L., Nehmé R., Warne T., Edwards P.C., Schertler
G.F.X., Leslie A.G.W., Tate C.G. The 2.1 Å resolution structure of cyanopindolol-
bound β1-adrenoceptor identifies an intramembrane Na+ ion that stabilises the ligand-
free receptor // PLoS ONE. 2014. V. 9. P. e92727.
Mishra R.K., Makman M.H., Costain W.J., Nair V.D., Johnson R.L.
Modulation of agonist stimulated adenylyl cyclase and GTPase activity by L-pro-L-
leu-glycinamide and its peptidomimetic analogue in rat striatal membranes //
Neurosci. Lett. 1999. V. 269. P. 21–24.
Mitchell D.C., Straume M., Miller J.L., Litman B.J. Modulation of
metarhodopsin formation by cholesterol-induced ordering of bilayer lipids //
Biochemistry. 1990. V. 29. P. 9143–9149.
154
Molderings G.J., Menzel S., Kathmann M., Schlicker E., Göthert M. Dual
interaction of agmatine with the rat alpha(2D)-adrenoceptor: competitive antagonism
and allosteric activation // Br. J. Pharmacol. 2000. V. 130. P. 1706–1712.
Morales P., Goya P., Jagerovic N., Hernandez-Folgado L. Allosteric
Modulators of the CB1 Cannabinoid Receptor: A Structural Update Review //
Cannabis Cannabinoid Res. 2016. V. 1 (1). P. 22–30. doi: 10.1089/can.2015.0005.
Morfis M., Tilakaratne N., Furness S.G.B., Christopoulos G., Werry T.D.,
Christopoulos A., Sexton P.M. Receptor activity-modifying proteins differentially
modulate the G protein-coupling efficiency of amylin receptors // Endocrinology.
2008. V. 149. P. 5423–5431.
Morris M.S. Homocysteine and Alzheimer's disease // Lancet Neurol. 2003.
V. 2 (7). P. 425-428.
Müller T. Role of homocysteine in the treatment of Parkinson’s disease //
Expert Rev. Neurother. 2008. V. 8. P. 957–967.
Mun H.-C., Culverston E.L., Franks A.H., Collyer C.A., Clifton-Bligh R.J.,
Conigrave A.D. A double mutation in the extracellular Ca2+-sensing receptor’s venus
flytrap domain that selectively disables L-amino acid sensing // J. Biol. Chem. 2005.
V. 280. P. 29067–29072.
Navratil A.M., Bliss S.P., Berghorn K.A., Haughian J.M., Farmerie T.A.,
Graham J.K., Clay C.M., Roberson M.S. Constitutive localization of the
gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor to low density membrane
microdomains is necessary for GnRH signaling to ERK // J. Biol. Chem. 2003. V.
278. P. 31593–31602.
Neve K.A. Regulation of dopamine D2 receptors by sodium and pH // Mol.
Pharmacol. 1991. V. 39. P. 570–578.
Novoselova T.V., Jackson D., Campbell D.C., Clark A.J., Chan L.F.
Melanocortin receptor accessory proteins in adrenal gland physiology and beyond // J.
Endocrinol. 2013. V. 217. P. R1–R11.
Oates J., Watts A. Uncovering the intimate relationship between lipids,
cholesterol and GPCR activation // Curr. Opin. Struct. Biol. 2011. V. 21. P. 802–807.
Ostrom R.S., Insel P.A. The evolving role of lipid rafts and caveolae in G
protein-coupled receptor signaling: implications for molecular pharmacology // Br. J.
Pharmacol. 2004. V. 143. P. 235–245.
Ott M.C., Mishra R.K., Johnson R.L. Modulation of dopaminergic
neurotransmission in the 6-hydroxydopamine lesioned rotational model by
peptidomimetic analogues of L-prolyl-L-leucyl-glycinamide // Brain Res. 1996. V.
737. P. 287–291.
Paila Y.D., Chattopadhyay A. Membrane cholesterol in the function and
organization of G-protein coupled receptors // Subcell. Biochem. 2010. V. 51. P. 439–
466.
Pamplona F.A., Ferreira J., Menezes de Lima O. Jr., Duarte F.S., Bento
A.F., Forner S., Villarinho J.G., Bellocchio L., Wotjak C.T., Lerner R., et al. Anti-
155
inflammatory lipoxin A4 is an endogenous allosteric enhancer of CB1 cannabinoid
receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109. P. 21134–21139.
Pasternak G.W., Snowman A.M., Snyder S.H. Selective enhancement of
[3H]opiate agonist binding by divalent cations // Mol. Pharmacol. 1975. V. 11. P.
735–744.
Patel H.H., Murray F., Insel P.A. G-protein-coupled receptor-signaling
components in membrane raft and caveolae microdomains // Handbook Exp.
Pharmacol. 2008. V. 186. P. 167–184.
Pert C.B., Snyder S.H. Properties of opiate-receptor binding in rat brain //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. V. 70. P. 2243–2247.
Petrucci V., Chicca A., Glasmacher S., Paloczi J., Cao Z., Pacher P.,
Gertsch J. Pepcan-12 (RVD-hemopressin) is a CB2 receptor positive allosteric
modulator constitutively secreted by adrenals and in liver upon tissue damage // Sci.
Rep. 2017. V. 7 (1). P. 9560. doi: 10.1038/s41598-017-09808-8.
Piletz J.E., Aricioglu F., Cheng J.-T., Fairbanks C.A., Gilad V.H., Haenisch
B., Halaris A., Hong S., Lee J.E., Li J., et al. Agmatine: clinical applications after 100
years in translation // Drug Discov. Today. 2013. V. 18. P. 880–893.
Potter R.M., Harikumar K.G., Wu S.V., Miller L.J. Differential sensitivity of
types 1 and 2 cholecystokinin receptors to membrane cholesterol // J. Lipid Res. 2012.
V. 53. P. 137–148.
Poyner D.R., Sexton P.M., Marshall I., Smith D.M., Quirion R., Born W.,
Muff R., Fischer J.A., Foord S.M. International Union of Pharmacology. XXXII. The
mammalian calcitonin gene-related peptides, adrenomedullin, amylin, and calcitonin
receptors // Pharmacol. Rev. 2002. V. 54. P. 233–246.
Prasad R., Paila Y.D., Chattopadhyay A. Membrane cholesterol depletion
enhances igand binding function of human serotonin1A receptors in neuronal cells //
Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 390. P. 93–96.
Rasmussen S.G.F., DeVree B.T., Zou Y., Kruse A.C., Chung K.Y., Kobilka
T.S., Thian F.S., Chae P.S., Pardon E., Calinski D., et al. Crystal structure of the β2
adrenergic receptor-Gs protein complex // Nature. 2011. V. 477. P. 549–555.
Ridker P.M. LDL cholesterol: controversies and future therapeutic
directions // Lancet. 2014. V. 384. P. 607–617.
Ring A.M., Manglik A., Kruse A.C., Enos M.D., Weis W.I., Garcia K.C.,
Kobilka B.K. Adrenaline-activated structure of β2-adrenoceptor stabilized by an
engineered nanobody // Nature. 2013. V. 502. P. 575–579.
Rodriguez F.D., Bardaji E., Traynor J.R. Differential effects of Mg2+ and
other divalent cations on the binding of tritiated opioid ligands // J. Neurochem. 1992.
V. 59. P. 467–472.
Rosenberg H.F., Dyer K.D., Foster P.S. Eosinophils: changing perspectives
in health and disease // Nat. Rev. Immunol. 2013. V. 13. P. 9–22.
Rousselle J.C., Massot O., Delepierre M., Zifa E., Rousseau B., Fillion G.
Isolation and characterization of an endogenous peptide from rat brain interacting
156
specifically with the serotonergic 1B receptor subtypes // J. Biol. Chem. 1996. V. 271.
P. 726–735.
Saidak Z., Brazier M., Kamel S., Mentaverri R. Agonists and allosteric
modulators of the calcium-sensing receptor and their therapeutic applications // Mol.
Pharmacol. 2009. V. 76. P. 1131–1144.
Schetz J.A., Sibley D.R. Zinc allosterically modulates antagonist binding to
cloned D1 and D2 dopamine receptors // J. Neurochem. 1997. V. 68. P. 1990–1997.
Schetz J.A., Sibley D.R. The binding-site crevice of the D4 dopamine
receptor is coupled to three distinct sites of allosteric modulation // J. Pharmacol. Exp.
Ther. 2001. V. 296. P. 359–363.
Seshadri S., Beiser A., Selhub J., Jacques P.F., Rosenberg I.H., D’Agostino
R.B., Wilson P.W.F., Wolf P.A. Plasma homocysteine as a risk factor for dementia and
Alzheimer’s disease // N. Engl. J. Med. 2002. V. 346. P. 476–483.
Sexton P.M., Poyner D.R., Simms J., Christopoulos A., Hay D.L.
Modulating receptor function through RAMPs: can they represent drug targets in
themselves? // Drug Discov. Today. 2009. V. 14. P. 413–419.
Sexton P.M., Poyner D.R., Simms J., Christopoulos A., Hay D.L. RAMPs as
drug targets // Adv. Exp. Med. Biol. 2012. V. 744. P. 61–74.
Shpakov A.O., Derkach K.V., Berstein L.M. Brain signaling systems in the
type 2 diabetes and metabolic syndrome: promising target to treat and prevent these
diseases // Future Science OA (FSO). 2015. V. 1 (3). FSO25. doi: 10.4155/fso.15.23.
Sibley D.R., Creese I. Regulation of ligand binding to pituitary D-2
dopaminergic receptors. Effects of divalent cations and functional group modification
// J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 4957–4965.
Simon E.J., Groth J. Kinetics of opiate receptor inactivation by sulfhydryl
reagents: evidence for conformational change in presence of sodium ions // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 2404–2407.
Sixt M.L., Messlinger K., Fischer M.J.M. Calcitonin gene-related peptide
receptor antagonist olcegepant acts in the spinal trigeminal nucleus // Brain. 2009. V.
132. P. 3134–3141.
Soubias O., Teague W.E. Jr., Hines K.G., Mitchell D.C., Gawrisch K.
Contribution of membrane elastic energy to rhodopsin function // Biophys. J. 2010. V.
99. P. 817–824.
Stengaard-Pedersen K., Fredens K., Larsson L.I. Inhibition of opiate
receptor binding by zinc ions: possible physiological importance in the hippocampus
// Peptides 1981. V. 2 (Suppl. 1). P. 27–35.
Strader C.D., Fong T.M., Tota M.R., Underwood D., Dixon R.A. Structure
and function of G protein-coupled receptors // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P.
101–132.
Straiker A., Mitjavila J., Yin D., Gibson A., Mackie K. Aiming for
allosterism: Evaluation of allosteric modulators of CB1 in a neuronal model //
Pharmacol. Res. 2015. V. 99. P. 370–376. doi: 10.1016/j.phrs.2015.07.017.
157
Süel G.M., Lockless S.W., Wall M.A., Ranganathan R. Evolutionarily
conserved networks of residues mediate allosteric communication in proteins // Nat.
Struct. Biol. 2003. V. 10 (1). P. 59–69. doi: 10.1038/nsb881.
Swaminath G., Lee T.W., Kobilka B. Identification of an allosteric binding
site for Zn2+ on the beta2 adrenergic receptor // J. Biol. Chem. 2003. V. 278 (1). P.
352–356. doi: 10.1074/jbc.M206424200.
Swaminath G., Steenhuis J., Kobilka B., Lee T.W. Allosteric modulation of
beta2-adrenergic receptor by Zn2+ // Mol. Pharmacol. 2002. V. 61 (1). P. 65–72. doi:
10.1124/mol.61.1.65.
Tejwani G.A., Hanissian S.H. Modulation of mu, delta and kappa opioid
receptors in rat brain by metal ions and histidine // Neuropharmacology. 1990. V. 29.
P. 445–452.
ter Haar E., Koth C.M., Abdul-Manan N., Swenson L., Coll J.T., Lippke
J.A., Lepre C.A., Garcia-Guzman M., Moore J.M. Crystal structure of the ectodomain
complex of the CGRP receptor, a class-B GPCR, reveals the site of drug antagonism
// Structure. 2010. V. 18 (9). P. 1083–1093. doi: 10.1016/j.str.2010.05.014.
Thomas E.A., Carson M.J., Neal M.J., Sutcliffe J.G. Unique allosteric
regulation of 5-hydroxytryptamine receptor-mediated signal transduction by oleamide
// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 14115–14119.
Thomas E.A., Carson M.J., Sutcliffe J.G. Oleamide-induced modulation of
5-hydroxytryptamine receptor-mediated signaling // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1998. V.
861. P. 183–189.
Udawela M., Christopoulos G., Tilakaratne N., Christopoulos A., Albiston
A., Sexton P.M. Distinct receptor activity-modifying protein domains differentially
modulate interaction with calcitonin receptors // Mol. Pharmacol. 2006. V. 69 (6). P.
1984–1989. doi: 10.1124/mol.105.021915.
Urwyler S., Gjoni T., Kaupmann K., Pozza M.F., Mosbacher J. Selected
amino acids, dipeptides and arylalkylamine derivatives do not act as allosteric
modulators at GABAB receptors // Eur. J. Pharmacol. 2004. V. 483 (2-3). P. 147–153.
doi: 10.1016/j.ejphar.2003.10.024.
Vallée M., Vitiello S., Bellocchio L., Hébert-Chatelain E., Monlezun S.,
Martin-Garcia E., Kasanetz F., Baillie G.L., Panin F., Cathala A., Roullot-Lacarrière
V., Fabre S., Hurst D.P., Lynch D.L., Shore D.M., Deroche-Gamonet V., Spampinato
U., Revest J.M., Maldonado R., Reggio P.H., Ross R.A., Marsicano G., Piazza P.V.
Pregnenolone can protect the brain from cannabis intoxication // Science. 2014. V.
343 (6166). P. 94–98. doi: 10.1126/science.1243985.
Vance J.E. Dysregulation of cholesterol balance in the brain: contribution to
neurodegenerative diseases // Dis. Model Mech. 2012. V. 5 (6). P. 746–755. doi:
10.1242/dmm.010124.
158
Vivo M., Lin H., Strange P.G. Investigation of cooperativity in the binding
of ligands to the D(2) dopamine receptor // Mol. Pharmacol. 2006. V. 69. P. 226–235.
Wang M., Yao Y., Kuang D., Hampson D.R. Activation of family C G-
protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione // J. Biol. Chem. 2006. V. 281
(13). P. 8864–8870. doi: 10.1074/jbc.M512865200.
White K.L., Eddy M.T., Gao Z.G., Han G.W., Lian T., Deary A., Patel N.,
Jacobson K.A., Katritch V., Stevens R.C. Structural Connection between Activation
Microswitch and Allosteric Sodium Site in GPCR Signaling // Structure. 2018. V. 26
(2). P. 259–269 (e5). doi: 10.1016/j.str.2017.12.013.
Williams L.T., Mullikin D., Lefkowitz R.J. Magnesium dependence of
agonist binding to adenylate cyclase-coupled hormone receptors // J. Biol. Chem.
1978. V. 253. P. 2984–2989.
Wootten D., Lindmark H., Kadmiel M., Willcockson H., Caron K.M.,
Barwell J., Drmota T., Poyner D.R. Receptor activity modifying proteins (RAMPs)
interact with the VPAC2 receptor and CRF1 receptors and modulate their function //
Br. J. Pharmacol. 2013. V. 168 (4). P. 822–834. doi: 10.1111/j.1476-
5381.2012.02202.x.
Wootten D.L., Simms J., Hay D.L., Christopoulos A., Sexton P.M. Receptor
activity modifying proteins and their potential as drug targets // Prog. Mol. Biol.
Transl. Sci. 2010. V. 91. P. 53–79. doi: 10.1016/S1877-1173(10)91003-X.
Yan F., Mosier P.D., Westkaemper R.B., Roth B.L. Galpha-subunits
differentially alter the conformation and agonist affinity of κ-opioid receptors //
Biochemistry. 2008. V. 47 (6). P. 1567–1578. doi: 10.1021/bi701476b.
Ye L., Neale C., Sljoka A., Lyda B., Pichugin D., Tsuchimura N., Larda S.T.,
Pomès R., García A.E., Ernst O.P., Sunahara R.K., Prosser R.S. Mechanistic insights
into allosteric regulation of the A2A adenosine G protein-coupled receptor by
physiological cations // Nat. Commun. 2018. V. 9 (1). P. 1372. doi: 10.1038/s41467-
018-03314-9.
Zhang C., Srinivasan Y., Arlow D.H., Fung J.J., Palmer D., Zheng Y.,
Green H.F., Pandey A., Dror R.O., Shaw D.E., Weis W.I., Coughlin S.R., Kobilka
B.K. High-resolution crystal structure of human protease-activated receptor 1 //
Zhang Z., Qiu W., Quinn S.J., Conigrave A.D., Brown E.M., Bai M. Three
adjacent serines in the extracellular domains of the CaR are required for L-amino
acid-mediated potentiation of receptor function // J. Biol. Chem. 2002. V. 277 (37). P.
33727–33735. doi: 10.1074/jbc.M200976200.
159
ГЛАВА 4
Синтетические аллостерические
4.1. Аллостерические регуляторы хемокиновых

Особенностью хемокиновых рецепторов является

большое число имеющихся для них специфичных эндогенных
лигандов, а также множество сигнальных путей, которые
стимулируются после их связывания с хемокиновыми
рецепторами. Так, например, хемокиновый рецептор CCR1
является мишенью, по крайней мере, для 11 хемокинов, причем
одни из них активируют преимущественно G-белок-зависимые
сигнальные каскады, в то время как другие – β-аррестиновые
сигнальные пути (Rajagopal et al., 2013). Важнейшим фактором,
позволяющим контролировать специфичность связывания
хемокиновых рецепторов с их эндогенными полипептидными
лигандами, а также регулировать векторность передачи
генерируемого хемокинами сигнала к эффекторным системам
клетки, является запуск аллостерических механизмов. В основе
этого лежит изменение конформации аллостерических сайтов,
что приводит к изменениям кооперативности взаимодействия
между ними и ортостерическим сайтом хемокиновых рецепторов.
Установлено, что лиганды аллостерических сайтов
хемокинового рецептора CCR1 различным образом влияют на его
сродство к эндогенным лигандам и активацию CCR1-зависимых
эффекторных систем клетки. Показано, что хелатирующие
соединения, образующие комплексы с ионами металлов, которые
первоначально рассматривали как полные агонисты рецептора
160
CCR1, усиливают специфическое связывание с рецептором
хемокина CCL3, действуя как PAM, но при этом препятствуют
нормальному связыванию с рецептором другого хемокина CCL5,
действуя в этом случае как NAM (Jensen et al., 2008). Соединение
AMD3100 является аллостерическим ингибитором
стимулирующего эффекта хемокина CXCL12 на активность
хемокинового рецептора CXCR4, но не влияет на активацию
этого рецептора фрагментом хемокина CXCL12, также
наделенного активностью полного агониста, но отличающегося
от полноразмерного хемокина сайтом связывания с рецептором
(Sachpatzidis et al., 2003). Аллостерические регуляторы влияют и
на эффекторную специфичность хемокинов, как это показано в
случае аллостерического лиганда ATI-2341. Это соединение
подавляло стимуляцию хемокинового рецептора CXCR4 его
эндогенным лигандом – фактором-1α, продуцируемым
стромальными клетками (stromal cell-derived factor-1α, SCDF-1α),
действуя как NAM. Однако ингибирующий эффект ATI-2341
отчетливо выявлялся только в отношении внутриклеточных
каскадов, реализуемых через β-аррестины и G13-белки, но не
затрагивал сигнальные пути SCDF-1α, включающие Gi/o-белки
(Quoyer et al., 2013).
В настоящее время ведутся разработки аллостерических
модуляторов хемокиновых рецепторов CXCR1 и CXCR2,
которые играют важную роль в развитии иммунных реакций,
острых и хронических воспалительных заболеваний, вовлечены в
этиопатогенез онкологических и аутоиммунных заболеваний.
Наибольший интерес здесь представляют два препарата –
Reparixin (repertaxin) и Ladarixin (DF 2156A) (Allegretti et al.,
2016). Reparixin сначала был идентифицирован, как
неконкурентный аллостерический ингибитор рецепторов CXCR1
и CXCR2, мишеней интерлейкина-8. В дальнейшем было
показано, что он специфично связывается с аллостерическими
сайтами рецепторов CXCR1 и CXCR2, которые сходны по
структуре и включают аминокислотные остатки четырех ТМС
(первой, третьей, шестой и седьмой). При этом ингибирующий
161
эффект препарата Reparixin в отношении стимулированного
агонистом рецептора CXCR1 был выражен в существенно
большей степени, чем таковой в отношении рецептора CXCR2.
Reparixin подавлял регуляторные эффекты интерлейкина-8, но
при этом существенно не влиял на аффинность рецептора к этому
цитокину (Bertini et al., 2004). В настоящее время в
экспериментах in vitro продемонстрирована способность
препарата Reparixin предотвращать повреждения, вызванные
ишемией/реперфузией, ослаблять воспалительные процессы,
подавлять развитие и метастазирование опухолей, а также
предупреждать иммунные реакции, индуцированные при
трансплантации органов (Souza et al., 2004; Cugini et al., 2005;
Garau et al., 2005; Huang et al., 2008). Другой препарат, Ladarixin,
является мощным ингибитором рецепторов CXCR1 и CXCR2 со
значением IC50 около 0.1 нМ и способен с высокой
эффективностью предотвращать повреждения панкреатических
островков, вызываемые факторами воспаления и аутоиммунными
реакциями, что указывает на его антидиабетическую активность.
Иллюстрацией этого является тот факт, что при обработке мышей
с помощью Ladarixin ослабляется диабетогенный эффект
стрептозотоцина, действие которого основано на избирательном
разрушении β-клеток поджелудочной железы (Citro et al., 2015).
На основе сравнительного анализа структур
хемоаттрактантного рецептора C5aR и хемокиновых рецепторов
CXCR1 и CXCR2, а также с учетом данных сайт-специфичного
мутагенеза, в области внеклеточного входа в трансмембранный
домен рецептора C5aR был идентифицирован аллостерический
сайт, который не совпадал с ортостерическим сайтом этого
рецептора. Это позволило разработать соединение DF2593A,
которое снижало стимулированную агонистом активность
рецептора C5aR, и в условиях in vivo подавляло болевые
синдромы, вызываемые острым и хроническим воспалением
(Moriconi et al., 2014). Все вышеприведенные данные стали
основанием для проведения клинических испытаний препаратов
Reparixin, Ladarixin и DF2593A.
162
4.2. Аллостерические регуляторы опиоидных

Среди аллостерических регуляторов опиоидных

рецепторов наибольший интерес представляют недавно
разработанные селективные PAM для µ- и δ-опиоидных
рецепторов, которые по структуре являются многоядерными
гетероциклическими соединениями (рис. 4-1) (Burford et al., 2013,
2015; Livingston, Traynor, 2014; Bisignano et al., 2015; Livingston et
al., 2018). Все они специфично связываются с аллостерическим
сайтом опиоидных рецепторов, который не перекрывается с их
ортостерическим сайтом, мишенью эндогенных опиоидных
пептидов и опиатных анальгетиков.
Рис. 4-1. Положительные аллостерические модуляторы опиоидных

рецепторов, имеющие многоядерную гетероциклическую структуру
(по Livingston et al., 2018).
А – соединение BMS-986187; B – соединение BMS-986122; C –
соединение BMS-986124.
Соединение BMS-986122 является высокоселективным

PAM для µ-опиоидных рецепторов, в то время как при действии
на близкородственные ему δ- и κ-опиоидных рецепторов оно
проявляет свойства SAM или аллостерического антагониста
(Burford et al., 2013; Livingston et al., 2018). Соединение BMS-
163
986124 характеризуется активностью SAM для µ-опиоидных
рецепторов, но также проявляет активность аллостерического
антагониста для δ- и κ-опиоидных рецепторов (рис. 4-1). По
спектру селективности BMS-986124 близко к BMS-986122, что
вытекает из сходства их химической структуры (Livingston et al.,
2018). В свою очередь, соединение BMS-986187 функционирует
как PAM для µ-, δ- и κ-опиоидных рецепторов, но его сродство по
отношению к δ-опиоидному рецептору существенно выше, чем
по отношению к µ- и κ-опиоидным рецепторам (Burford et al.,
2015; Livingston et al., 2018). Результатом такого связывания
является повышение сродства ортостерических агонистов и
усиление эффективности их действия.
Избирательная селективность соединений BMS-986187,
BMS-986122 и BMS-986124 в отношении различных типов
опиоидных рецепторов обусловлена тем, что их аллостерические
сайты существенно различаются, и потому даже небольшие
изменения в химической структуре лигандов придают им
различия в селективности взаимодействия с этими сайтами
(Livingston et al., 2018). И это несмотря на то, что, например, µ- и
δ-опиоидные рецепторы характеризуются значительным
структурно-функциональным сходством (64% идентичности
первичной структуры) и высокой гомологией ортостерических
сайтов и трансмембранных доменов как в активном, так и в
неактивном состояниях (Lin et al., 2009; Stevens, 2009; Manglik et
al., 2012; Fenalti et al., 2014; Huang et al., 2015). Более того,
эндогенными лигандами опиоидных рецепторов являются одни и
те же опиоидные пептиды – метэнкефалин и лейэнкефалин,
которые запускают в клетках-мишенях сходные сигнальные
каскады.
Полагают, что одним из механизмов действия BMS-
986122 с активностью PAM в отношении µ-опиоидных
рецепторов и BMS-986187 с активностью PAM по отношению ко
всем трем типам опиоидных рецепторов является их влияние на
связывание рецепторов с катионами натрия, которые, как описано
164
в Главе 3, являются NAM для большого числа GPCR,
относящихся к классу А (Livingston, Traynor, 2014).
4.3. Аллостерические регуляторы каннабиноидных

Как отмечалось ранее (см. Главу 3), имеются два типа

каннабиноидных рецепторов – CB1 и CB2, которые вовлечены в
регуляцию аппетита, болевой чувствительности, настроения и
памяти (Aizpurua-Olaizola et al., 2017). Они активируются тремя
группами лигандов. К первой относятся эндоканнабиноиды,
такие как анандамид и 2-арахидоноилглицерин, образующиеся
преимущественно в сосцевидных телах лимбической системы
головного мозга, ко второй – фитоканнабиноиды
(тетрагидроканнабинол и его производные), к третьей –
синтетические препараты с активностью агонистов
каннабиноидных рецепторов, к которым, в том числе, относятся
аллостерические регуляторы. Установлено, что CB1-
каннабиноидные рецепторы локализованы в основном в нервной
системе, но также в заметных количествах обнаруживаются в
легких, почках, печени, надпочечниках, сердце и гипофизе. В
свою очередь, CB2-каннабиноидные рецепторы экспрессируются
в поджелудочной железе, яичниках, а также в больших
количествах присутствуют в иммунокомпетентных и
гемопоэтических клетках. Через посредство каннабиноидных
рецепторов регулируется функциональная активность
аденилатциклазной сигнальной системы путем подавления
активности аденилатциклазы и снижения уровня
внутриклеточного цАМФ, стимулируется активность каскада
митогенактивируемых протеинкиназ, а также различных типов
калиевых и кальциевых каналов, в том числе калиевых каналов
Kir-семейства (inwardly rectifying potassium channel) (Demuth,
Molleman, 2006).
Несмотря на большое число разработанных в настоящее
время лигандов CB1- и CB2-каннабиноидных рецепторов
165
(Marinol™, Nabilone™, Sativex™), их применение в клинике
сопряжено с большим числом нежелательных эффектов.
Вследствие этого основные перспективы в создании селективных
и эффективных регуляторов каннабиноидных рецепторов
связывают с их аллостерическими регуляторами (Busquets Garcia
et al., 2016). Среди CB1-аллостерических лигандов наибольший
интерес представляют производные индола и мочевины, а также
эндогенные регуляторы (Morales et al., 2016). К последним
относятся липоксин А4, прегненолон, пептидный фактор пепкан-
12, которые подробно рассмотрены в Главе 3, а также
фитоканнабиноид каннабидиол (CBD). Показано, что
каннабидиол может взаимодействовать не только с CB1-
каннабиноидными рецепторами, но и с опиоидными
рецепторами, лиганд-активируемыми ионными каналами,
ядерными рецепторами, в том числе с рецептором-γ,
активируемым пероксисомными пролифераторами (peroxisome
proliferator-activated receptor-γ, PPAR-γ) (Morales et al., 2016). При
действии на CB1-каннабиноидный рецептор он подавляет
стимуляцию его агонистами (тетрагидроканнабинолом или 2-
арахидоноилглицерином), функционируя, таким образом, как
NAM для этого рецептора (Thomas et al., 2007; Laprairie et al.,
2016). Каннабидиол также ингибирует стимуляцию агонистами
CB2-каннабиноидного рецептора, что свидетельствует в пользу
сходства аллостерических сайтов CB1- и CB2-каннабиноидных
рецепторов (Thomas et al., 2007).
Наибольший прогресс достигнут при разработке
аллостерических регуляторов CB1-каннабиноидного рецептора,
имеющих структуру индола. Первый из индол-содержащих
препаратов разработан фирмой Organon Research и получил
обозначение Org27569 (рис. 4-2) (Price et al., 2005). Этот препарат
усиливает связывание агониста с рецептором, и по этому
показателю отнесен к классу PAM. Однако с точки зрения
влияния на функциональную активность рецептора соединение
Org27569 ближе к NAM, что подтверждено на нейрональной
166
модели эндоканнабиноидной синаптической передачи (Straiker et
al., 2015).
Рис. 4-2. Структуры аллостерических регуляторов CB1-

каннабиноидного рецептора, являющихся производными индола (по
Morales et al., 2016).
В условиях in vivo соединение Org27569 мало эффективно

как модулятор регуляторных эффектов эндогенных
каннабиноидов, что указывает на зависимость его
аллостерического эффекта от большого числа факторов и
сложность механизмов его взаимодействия с рецептором
(Gamage et al., 2014; Khajehali et al., 2015). Пример с соединением
Org27569 демонстрирует проблемы тестирования
аллостерических модуляторов, что может приводить к серьезным
расхождениям между результатами, полученными in vitro и in
vivo. Конструирование Org27569-связывающего сайта в молекуле
CB1-каннабиноидного рецептора показало, что он сформирован
боковыми цепями аминокислотных остатков, локализованных в
третьей, шестой и седьмой ТМС. Связывание с этим сайтом
соединения Org27569 индуцирует значительные
конформационные изменения в молекуле рецептора,
включающие изменение пространственной локализации участка
шестой ТМС, ответственной как за активацию рецептора, так и за
167
его взаимодействие с G-белками (Shore et al., 2014; Fay, Farrens,
2015).
Основываясь на данных по изучению фармакологических
свойств соединения Org27569, синтезированы многочисленные
его аналоги, в том числе соединения Org29647 и Org27759 и ряд
других индольных производных (рис. 4-2) (Piscitelli et al., 2012;
Ahn et al., 2013; Mahmoud et al., 2013; Khurana et al., 2014).
Синтезированное в 2012 году соединение Org27759
характеризовалось способностью в значительной степени
повышать стимулирующие эффекты агонистов CB1-
каннабиноидного рецептора, в том числе ортостерического
агониста CP-55,940 (Piscitelli et al., 2012). Производные 3-пентил-
1H-индол-2-карбоксамида, являющиеся гомологами Org27569, в
еще большей степени усиливали агонистическую активность CP-
55,940, причем их потенцирующий эффект был избирателен в
отношении β-аррестинового сигнального каскада (Mahmoud et al.,
2013; Khurana et al., 2014).
6-Метил-3-[2-нитро-1-(тиофен-2-ил)этил]-2-фенил-1H-
индол (ZCZ011), повышая связывание ортостерических агонистов
с CB1-каннабиноидным рецептором, потенцирует
стимулирующий эффект CP-55,940 на связывание GTPγS,
негидролизуемого аналога ГТФ, что указывает на стимуляцию им
ГТФ-связывания G-белков, а также усиливает стимулирующие
эффекты анандамида на рекрутирование β-аррестинов и
активность ERK1/2-киназ (Ignatowska-Jankowska et al., 2015).
Важно отметить, что PAM-эффекты ZCZ011 выявлены и в
условиях in vivo, поскольку соединение ZCZ011 проявляет
антиноцицептивные эффекты на моделях невропатической и
воспалительной боли без сопутствующих каннабимиметических
эффектов (Ignatowska-Jankowska et al., 2015).
В 2007 году компания Prosidion разработала
аллостерический регулятор CB1-каннабиноидного рецептора на
основе производных мочевины – PSNCBAM-1. Этот регулятор
повышал связывание селективных CB1-агонистов с рецептором и
проявлял свойства антагониста в отношении стимуляции ими
168
GTPγS-связывания и активности аденилатциклазы. В
экспериментах in vivo установлено, что соединение PSNCBAM-1
подавляет потребление животными пищи с той же
эффективностью, что и соединение SR141716, являющееся
ортостерическим антагонистом CB1-каннабиноидного рецептора
(Horswill et al., 2007). Только спустя восемь лет были проведены
исследования механизмов действия PSNCBAM-1 и показано, что
его фармакологический профиль позволяет отнести это
соединение к классу NAM (German et al., 2014). В дальнейшем
была разработана серия соединений, являющихся производными
PSNCBAM-1 и имеющих различные функциональные группы.
Некоторые из этих производных имеют сопоставимую с
соединением PSNCBAM-1 специфическую активность,
функционируя в условиях in vivo как аллостерические
инверсионные CB1-агонисты. Наиболее активным среди них
является соединение GAT358, производное 3,4-
диаминоциклобут-3-ен-1,2-диона (Thakur et al., 2015).
4.4. Аллостерические регуляторы метаботропных

глутаматных рецепторов
В настоящее время наибольшие успехи в разработке

аллостерических модуляторов достигнуты в отношении
метаботропных глутаматных рецепторов. Их семейство
включает восемь типов рецепторов, общей характеристикой
которых является способность со средней аффинностью
связывать глутамат, основной возбуждающий нейротрансмиттер
в ЦНС и, тем самым, контролировать и модулировать передачу
нервного импульса (Niswender et al., 2010). Особенностью
глутаматных рецепторов является наличие у них значительного
по размеру внеклеточного N-концевого домена, напоминающего
мухоловку венеры (Venus flytrap domain). Глутаматные
рецепторы, как уже отмечалось в Главе 2, подразделяют на три
группы в зависимости от их структурно-функциональной
организации и особенностей сигнальной трансдукции.
169
Представители группы I (mGlu1 и mGlu5) в нейронах имеют
преимущественно постсинаптическую локализацию и
функционально сопряжены с Gq/11-белками, через которые они
активируют фосфоинозитид-специфичную фосфолипазу Сβ и
нижележащие кальциевые сигнальные пути. Представители
групп II (mGlu2 и mGlu3) и III (mGlu4, mGlu6, mGlu7 и mGlu8)
локализованы в основном пресинаптически и функционально
сопряжены с Gi/o-белками, через которые они подавляют
активность аденилатциклазы, а также, высвобождая Gβγ-димер,
регулируют активность некоторых типов ионных каналов и Ca2+-
зависимые сигнальные пути. Необходимость разработки
аллостерических регуляторов mGlu-рецепторов обусловлена в
первую очередь тем, что ортостерические лиганды,
представляющие в большинстве своем производные
глутаминовой кислоты, характеризуются плохой растворимостью
в водных растворителях, недостаточной селективностью по
отношению к определенным типам глутаматных рецепторов,
низкой биодоступностью при пероральном введении, а также
сравнительно низкой эффективностью проникновения через
гематоэнцефалический барьер. В настоящее время создано
большое число селективных аллостерических модуляторов для
всех типов mGlu-рецепторов (кроме mGlu6), некоторые из
которых рассмотрены ниже.
Значительное число разработанных в последние годы
аллостерических модуляторов mGlu1-глутаматных рецепторов
составляют NAM, в то время как в отношении PAM успехи не
столь очевидны (Owen, 2011; Urwyler, 2011; Lindsley et al., 2016).
Интерес к разработке PAM для mGlu1-рецептора во многом
обусловлен тем, что целый ряд неврологических расстройств,
включая некоторые формы шизофрении, обусловлен мутациями в
гене, кодирующем этот рецептор. Эти мутации снижают
функциональную активность mGlu1-рецептора и его
чувствительность к ортостерическим агонистам. Показано, что
соединение Ro 07-11401 с активностью PAM для mGlu1-
рецептора не только усиливает связывание мутантных форм
170
рецептора с глутаматом, но также почти полностью
восстанавливает функциональную активность mGlu1-зависимой
сигнальной системы (Cho et al., 2014b). В дальнейшем были
разработаны более эффективные PAM для mGlu1-рецептора –
соединения VU0486321 и его фторированный аналог, которые
усиливали стимуляцию агонистами рецепторов человека и
крысы, причем как рецепторов дикого типа, так и их мутантных
форм. Значения EC50 для потенцирующего эффекта этих
соединений составили 31.8 и 12.9 нМ, соответственно, причем их
селективность по отношению к mGlu1-рецептору была на
порядки выше, чем таковая для mGlu4-рецептора (Garcia-
Barrantes et al., 2015a, 2015b).
При разработке PAM для mGlu2-рецептора наибольший
интерес представляет соединение 58 (Trabanco et al., 2012),
производное имидазопиридина, которое было создано на основе
соединения 57, также наделенного PAM-активностью, но при
этом обладающего сильно выраженной липофильностью
(Tresadern et al., 2010) (рис. 4-3). Соединение 58
характеризовалось хорошей пероральной биодоступностью, не
подвергалось быстрой деградации и модификации в микросомах
крысы и человека, а его введение крысам подавляло фазу
быстрого сна, практически не влияя на другие стадии сна и на
бодрствование. Эти эффекты соединения 58 хорошо согласуются
с теми, которые ожидаются для активаторов mGlu2-рецепторов.
Два других соединения 59 и 60, также сконструированные на
основе каркаса имидазопиридина, характеризовались
сопоставимой с соединением 58 специфической биологической
активностью, но уступали ему по биодоступности и устойчивости
к деградации (рис. 4-3). Дальнейшая модификация соединения 58
привела к созданию еще одного высокоэффективного PAM для
mGlu2-рецептора – JNJ-42153605 (соединение 61) (рис. 4-3). В
этом случае триазолопиридиновое ядро использовали в качестве
альтернативы имидазопиридину, стараясь снизить
липофильность соединения JNJ-42153605 (Cid et al., 2012).
171
57 58
59 60
61 62
Рис. 4-3. Структуры позитивных аллостерических модуляторов mGlu2-
глутаматного рецептора (по Lindsley et al., 2016).
Критическим для повышения эффективности этого

соединения было введение в положение 8 трифторметильной
группы (рис. 4-3). Наряду с отчетливо выраженным влиянием на
сон и бодрствование, соединение JNJ-42153605 также оказывало
антипсихотический эффект, предотвращая индуцированную
172
фенциклидином гиперподвижность, и нормализовало поведение
животных в тесте условного избегания (Megens et al., 2014). На
основе соединения JNJ-42153605 разработан его аналог –
соединение 62, которое обладает более высокой аффинностью к
mGlu2-рецептору, но не превосходит свой прототип по
специфической активности (Andrés et al., 2012).
При разработке NAM для mGlu3-рецептора на первом
этапе было идентифицировано соединение 67, которое обладало
двойной специфичностью – оно подавляло активацию mGlu3-
рецептора агонистами, но при этом характеризовалось
активностью PAM для mGlu5-рецептора (Engers et al., 2015) (рис.
4-4). Оптимизация структуры этого соединения позволила
идентифицировать соединение 68, обозначаемое как VU0650786,
важной особенностью которого является атом хлора в пятом
положении левого пиридинового кольца. Варьирование правого
кольца в серии аналогов соединения 67 показало, что
оптимальным здесь является 2-фторпиридин-3-ильное кольцо,
которое присутствует и в соединении VU0650786. Это кольцо
обеспечивало улучшенный фармакологический профиль
препарата и высокую селективность по отношению к mGlu3-
рецептору в сравнении с таковой для mGlu5-рецептора (рис. 4-4).
Соединение VU0650786 показало высокую эффективность в
тесте принудительного плавания крыс и в модели закапывания
мраморной мыши, а также при воздействии на грызунов с
моделями анксиолитических и антидепрессантных расстройств.
Эффективность соединения VU0650786 сопоставима с таковой у
селективных ортостерических антагонистов mGlu2- и mGlu3-
рецепторов (Engers et al., 2015).
Несмотря на успехи в разработке PAM для mGlu2-
рецептора и NAM для mGlu3-рецептора, данные об эффективных
аллостерических модуляторах в отношении NAM для mGlu2-
рецептора и PAM для mGlu3-рецептора фрагментарны.
173
Рис. 4-4. Структура соединения VU0650786 и его ортолога с

активностью NAM для mGlu3-глутаматного рецептора (по Lindsley et
al., 2016).
Интерес к разработке аллостерических модуляторов

mGlu4-рецептора обусловлен недавно установленной ролью этих
рецепторов в развитии болезни Паркинсона, а также в развитии
медулобластомы, аутизма и рассеянного склероза (Bennouar et al.,
2013; Rovira et al., 2015). В настоящее время создано несколько
препаратов с PAM-активностью для mGlu4-рецептора, наиболее
перспективные из которых представлены на рис. 4-5. Первым из
разработанных препаратов стал (–)-PHCCC, но он имел
недостаточно высокую селективность и сравнительно низкую
специфическую активность. Однако его способность оказывать
нейропротекторный эффект в отношении различных
нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона,
привлекла внимание к этому классу веществ. Существенным
недостатком (–)-PHCCC была необходимость его
интрацеребровентрикулярного введения, поскольку, будучи
растворимым в 50%-ном диметилсульфоксиде, он с низкой
174
эффективностью преодолевал гематоэнцефалический барьер
(ГЭБ) и плохо поступал к структурам мозга (Maj et al., 2003).
Высокой PAM-активностью для mGlu4-рецептора
характеризовалось соединение VU0155041, структурно похожее
на (–)-PHCCC, которое эффективно предотвращало развитие
нейродегенеративных изменений в мозге крыс с индуцированной
галоперидолом каталептической моделью болезни Паркинсона, а
также с моделью того же заболевания, но вызванного 6-
гидроксидофамином (Marino et al., 2003; Betts et al., 2012).
Однако недостатком этого соединения, как и в случае (–)-PHCCC,
была необходимость его интрацеребровентрикулярного введения
из-за плохой проницаемости через ГЭБ (Niswender et al., 2008).
В дальнейшем было разработано соединение VU0364770
с активностью PAM для mGlu4-рецептора (Engers et al., 2011),
которое было эффективным при лечении крыс с различными
моделями болезни Паркинсона (Jones et al., 2012). При
совместном введении соединения VU0364770 с низкими,
неактивными, дозами L-DOPA оно потенцировало
антипаркинсонический эффект этого препарата, что указывает на
перспективы его включения в схемы лечения болезни
Паркинсона в сочетании с L-DOPA (Jones et al., 2012). Если при
лечении крыс с моделью болезни Паркинсона, индуцированной
6-гидроксидофамином, соединение VU0364770 было
эффективным, как при монотерапии, так и в комбинации с L-
DOPA, то два других PAM для mGlu4-рецептора, ADX88178 и Lu
AF21934, оказывали антипаркинсонический эффект только в
комбинации с L-DOPA, потенцируя его действие (Le Poul et al.,
2012; Bennouar et al., 2013). Наряду с этим оба соединения
характеризовались антипсихотической активностью и подавляли
депрессивные состояния, снижая тревожность (Sławińska et al.,
2013a, 2013b; Kalinichev et al., 2014).
175
Рис. 4-4. Химические структуры наиболее эффективных

положительных аллостерических модуляторов для mGlu4-
глутаматного рецептора (по Lindsley et al., 2016).
Среди всех глутаматных рецепторов наибольший спектр

аллостерических модуляторов разработан для mGlu5, причем
часть этих модуляторов с активностью NAM в настоящее время
используется в клинике (Christopoulos, 2002; Christopoulos,
Kenakin, 2002; Bridges, Lindsley, 2008; Fenton, 2008; Conn et al.,
2009, 2014; Kenakin 2009; Kenakin, Miller, 2010; Rocher et al.,
2011; Emmitte, 2013; Lane et al., 2013; Menniti et al., 2013;
Lindsley, Philip, 2014; Wenthur et al., 2014; Lindsley et al., 2016;
Foster, Conn, 2017). Первые препараты с активностью NAM,
такие как MPEP и MTEP, представляющие собой ацетилены,
несущие на концах фенильные кольца или гетероциклы,
демонстрировали высокую степень ингибирования активности
176
mGlu5-рецепторов, действуя, как аллостерические антагонисты
или инверсионные агонисты, что приводило к ряду
неблагоприятных эффектов, включая психомиметические
эффекты у экспериментальных животных и различные типы
психозов у людей. Поиск более мягких NAM для mGlu5-
рецепторов позволил разработать целую серию препаратов, M-
5MPEP, Br-5MPEPy и VU0477573, также являющихся
замещенными ацетиленами, которые сохраняли терапевтическую
эффективность, присущую MPEP и MTEP, но в отличие от них не
вызывали побочных эффектов. Эти препараты, которые по
фармакологическому профилю были отнесены к «частичным»
NAM, демонстрировали антидепрессантный и анксиолитический
эффекты (Gould et al., 2015; Nickols et al., 2016).
Многие из разработанных для mGlu5-рецепторов PAM
демонстрируют активность ago-PAM и характеризуются рядом
побочных эффектов, среди которых индукция эпилептиформной
и судорожной активности, различные проявления
нейротоксичности, причем эти побочные эффекты обусловлены
присущей им собственной агонистической активностью (Rook et
al., 2013, 2015; Parmentier-Batteur et al., 2014). Вследствие этого
основные усилия направлены на получение «чистых» PAM.
Одним из них является соединение VU0403602, лишенное
активности аллостерического агониста, которое демонстрирует
высокую эффективность в условиях in vivo и не вызывает
характерных для ago-PAM побочных эффектов в дозах,
обеспечивающих высокую концентрацию VU0403602 в мозге
(Lindsley et al., 2016). В 2015 году разработан PAM для mGlu5-
рецептора – соединение VU0409551 с высокой рецепторной
селективностью и биодоступностью при пероральном способе
введения. Это соединение оказывало выраженный
антипсихотический эффект и улучшало когнитивные функции,
причем оно проявляло свои эффекты в условиях отсутствия
стимуляции активности ионотропного глутаматного NMDA-
рецептора (Conde-Ceide et al., 2015; Rook et al., 2015).
177
Успехи в разработке PAM и NAM для mGlu7-рецептора
менее значимы в сравнении с таковыми для mGlu4- и mGlu5-
рецепторов, хотя mGlu7-рецептор является терапевтической
мишенью при лечении многих заболеваний ЦНС, таких как
шизофрения, аутизм, депрессивные состояния, биполярные
расстройства, синдромы дефицита внимания и гиперактивности
(Shibata et al., 2009; Kandaswamy et al., 2014). Синтезированы два
соединения VU0422288 и VU0155094 с PAM-активностью для
mGlu7-рецептора, которые оказались активными в условиях in
vivo. Они способны регулировать функциональную активность
mGlu7-экспрессирующих синапсов в гиппокампе и других
областях мозга, но не обладают высокой селективностью и
сохраняют способность связываться с другими метаботропными
глутаматными рецепторами группы III (Jalan-Sakrikar et al., 2014).
Среди NAM mGlu7-рецептора необходимо выделить соединения
XAP044, MMPIP и ADX71743 (Suzuki et al., 2007; Nakamura et al.,
2010; Niswender et al., 2010; Yamasaki et al., 2013; Gee et al., 2014).
Все они, хотя и в различной степени, проявляют выраженную
адаптогенную, антидепрессантную и анксиолитическую
активность при введении грызунам.
Ahn K.H., Mahmoud M.M., Samala S., Lu D., Kendall D.A. Profiling two
indole-2-carboxamides for allosteric modulation of the CB1 receptor // J. Neurochem.
2013. V. 29 (5). P. 997–1003. doi: 10.1111/jnc.12115.
Aizpurua-Olaizola O., Elezgarai I., Rico-Barrio I., Zarandona I.,
Etxebarria N., Usobiaga A. Targeting the endocannabinoid system: future therapeutic
strategies // Drug Discovery Today. 2017. V. 22 (1). P. 105–110. doi:
10.1016/j.drudis.2016.08.005.
Allegretti M., Cesta M.C., Locati M. Allosteric modulation of
chemoattractant receptors // Front. Immunol. 2016. V. 7. P. 170. doi:
10.3389/fimmu.2016.00170.
Andrés J.I., Alcázar J., Cid J.M., De Angelis M., Iturrino L., Langlois X.,
Lavreysen H., Trabanco A.A., Celen S., Bormans G. Synthesis, Evaluation, and
Radiolabeling of New Potent Positive Allosteric Modulators of the Metabotropic
Glutamate Receptor 2 as Potential Tracers for Positron Emission Tomography
Imaging // J. Med. Chem. 2012. V. 55 (20). P. 8685–8699. doi: 10.1021/jm300912k.
178
Bennouar K.E., Uberti M.A., Melon C., Bacolod M.D., Jimenez H.N.,
Cajina M., Kerkerian-Le Goff L., Doller D., Gubellini P. Synergy between l-DOPA
and a Novel Positive Allosteric Modulator of Metabotropic Glutamate Receptor 4:
Implications for Parkinson’s Disease Treatment and Dyskinesia //
Neuropharmacology. 2013. V. 66. P. 158–169. doi:
10.1016/j.neuropharm.2012.03.022.
Bertini R., Allegretti M., Bizzarri C., Moriconi A., Locati M., Zampella G.,
et al. Noncompetitive allosteric inhibitors of the inflammatory chemokine receptors
CXCR1 and CXCR2: prevention of reperfusion injury // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2004. V. 101. P. 11791–11796. doi: 10.1073/pnas.0402090101.
Betts M.J., O’Neill M.J., Duty S. Allosteric Modulation of the Group III
mGlu4 Receptor Provides Functional Neuroprotection in the 6-Hydroxydopamine Rat
Model of Parkinson’s Disease // Br. J. Pharmacol. 2012. V. 166 (8). P. 2317–2330.
doi: 10.1111/j.1476-5381.2012.01943.x.
Bisignano P., Burford N.T., Shang Y., Marlow B., Livingston K.E., Fenton
A.M., Rockwell K., Budenholzer L., Traynor J.R., Gerritz S.W., Alt A., Filizola M.
Ligand-based discovery of a new scaffold for allosteric modulation of the μ-opioid
receptor // J. Chem. Inf. Model. 2015. V. 55 (9). P. 1836–1843. doi:
10.1021/acs.jcim.5b00388.
Bridges T.M., Lindsley C.W. G-Protein Coupled Receptors: From Classical
Modes of Modulation to Allosteric Mechanisms // ACS Chem. Biol. 2008. V. 3 (9). P.
530–542. doi: 10.1021/cb800116f.
Burford N.T., Clark M.J., Wehrman T.S., Gerritz S.W., Banks M., O’Connell
J., Traynor J.R., Alt A. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric
modulators of the μ-opioid receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V. 110. P.
10830–10835.
Burford N.T., Livingston K.E., Canals M., Ryan M.R., Budenholzer L.M.,
Han Y., Shang Y., Herbst J.J., O’Connell J., Banks M., Zhang L., Filizola M., Bassoni
D.L., Wehrman T.S., Christopoulos A., Traynor J.R., Gerritz S.W., Alt A. Discovery,
synthesis, and molecular pharmacology of selective positive allosteric modulators of
the δ-opioid receptor // J. Med. Chem. 2015. V. 58 (10). P. 4220–4229. doi:
Busquets Garcia A., Soria-Gomez E., Bellocchio L., Marsicano G.
Cannabinoid receptor type-1: breaking the dogmas // F1000Res. 2016. V. 5. P. pii:
F1000 Faculty Rev-990. doi: 10.12688/f1000research.8245.1.
Cho H.P., Garcia-Barrantes P.M., Brogan J.T., Hopkins C.R., Niswender
C.M., Rodriguez A.L., Venable D., Morrison R.D., Bubser M., Daniels J.S., et al.
Chemical Modulation of Mutant mGlu1 Receptors Derived from Deleterious GRM1
Mutations Found in Schizophrenics // ACS Chem. Biol. 2014b. V. 9. P. 2334–2346.
Christopoulos A. Allosteric binding sites on cell-surface receptors: novel
targets for drug discovery // Nat. Rev. Drug Discov. 2002. V. 1. P. 198–210. doi:
10.1038/nrd746.
179
Christopoulos A., Kenakin T. G Protein-Coupled Receptors Allosterism and
Complexing // Pharmacol. Rev. 2002. V. 54. P. 323–374.
Cid J.M., Tresadern G., Vega J.A., de Lucas A.I., Matesanz E., Iturrino L.,
Linares M.L., Garcia A., Andrés J.I., Macdonald G.J., et al. Discovery of 3-
Cyclopropylmethyl-7-(4-phenylpiperidin-1-yl)-8-trifluoromethyl[1,2,4]triazolo[4,3-
a]pyridine (JNJ-42153605): A Positive Allosteric Modulator of the Metabotropic
Glutamate 2 Receptor // J. Med. Chem. 2012. V. 55. P. 8770–8789.
Citro A., Valle A., Cantarelli E., Mercalli A., Pellegrini S., Liberati D., et
al. CXCR1/2 inhibition blocks and reverses type 1 diabetes in mice // Diabetes. 2015.
V. 64. P. 1329–1340. doi: 10.2337/db14-0443.
Conde-Ceide S., Martinez-Viturro C.M., Alcazar J., Garcia-Barrantes P.M.,
Lavreysen H., Mackie C., Vinson P.N., Rook J.M., Bridges T.M., Daniels S.J., et al.
Discovery of VU0409551/JNJ-46778212: An mGlu5 Positive Allosteric Modulator
Clinical Candidate Targeting Schizophrenia // ACS Med. Chem. Lett. 2015. V. 6. P.
716–720.
Conn P.J., Christopoulos A., Lindsley C.W. Allosteric Modulators of
GPCRs as a Novel Approach to Treatment of CNS Disorders // Nat. Rev. Drug
Discovery. 2009. V. 8. P. 41–54.
Conn P.J., Lindsley C.W., Meiler J., Niswender C.M. Opportunities and
Challenges in the Discovery of Allosteric Modulators of GPCRs for the Treatment of
CNS Disorders // Nat. Rev. Drug Discovery. 2014. V. 13. P. 692–708.
Cugini D., Azzollini N., Gagliardini E., Cassis P., Bertini R., Colotta F., et
al. Inhibition of the chemokine receptor CXCR2 prevents kidney graft function
deterioration due to ischemia/reperfusion // Kidney Int. 2005. V. 67. P. 1753–1761.
doi: 10.1111/j.1523-1755.2005.00272.x.
Christopoulos A. Positive and Negative Allosteric Modulators Promote Biased
Signaling at the Calcium-Sensing Receptor // Endocrinology. 2012. V. 153. P. 1232–
1241.
Demuth D.G., Molleman A. Cannabinoid signaling // Life Sci. 2006. V. 78
(6). P. 549–563. doi:10.1016/j.lfs.2005.05.055.
Emmitte K. A mGlu5 Negative Allosteric Modulators: A Patent Review
(2010–2012) // Expert Opin. Ther. Pat. 2013. V. 23. P. 393–408.
Engers D.W., Field J.R., Le U., Zhou Y., Bolinger J.D., Zamorano R.,
Blobaum A.L., Jones C.K., Jadhav S., Weaver C.D., et al. Discovery, Synthesis and
Structure Activity Relationship Development of a Series of N-(4-
Acetamido)phenylpicolinamides as Postive Allosteric Modulators of Metabotropic
Glutamate Receptor 4 (mGlu4) with CNS Exposure in Rats // J. Med. Chem. 2011. V.
54. P. 1106–1110.
Engers J.L., Rodriguez A.L., Konkol L.G., Morrison R.D., Thompson A.D.,
Byers F.W., Blobaum A.L., Chang S., Venable D.F., Loch M.T., et al. Discovery of
VU0650786: A Selective and CNS Penetrant Negative Allosteric Modulator of
180
Metabotropic Glutamate Receptor Subtype 3 with Antidepressant and Anxiolytic
Activity in Rodents // J. Med. Chem. 2015. V. 58. P. 7485–7500.
Fay J.F., Farrens D.L. Structural dynamics and energetics underlying
allosteric inactivation of the cannabinoid receptor CB 1 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2015. V. 112. P. 8469–8474.
Fenalti G., Giguere P.M., Katritch V., Huang X.-P., Thompson A.A.,
// Nature. 2014. V. 506. P. 191–196.
Fenton A.W. Allostery: An Illustrated Definition for the ‘Second Secret of
Life // Trends Biochem. Sci. 2008. V. 33. P. 420–425.
Foster D.J., Conn P.J. Allosteric Modulation of GPCRs: New Insights and
Potential Utility for Treatment of Schizophrenia and Other CNS Disorders // Neuron.
2017. V. 94 (3). P. 431-446. doi: 10.1016/j.neuron.2017.03.016.
Gamage T., Ignatowska-Jankowska B., Wiley J.L., et al. In-vivo
pharmacological evaluation of the CB1-receptor allosteric modulator Org-27569 //
Behav. Pharmacol. 2014. V. 25. P. 182–185.
Garau A., Bertini R., Colotta F., Casilli F., Bigini P., Cagnotto A., et al.
Neuroprotection with the CXCL8 inhibitor repertaxin in transient brain ischemia //
Cytokine. 2005. V. 30. P. 125–131. doi: 10.1016/j.cyto.2004.12.014.
Garcia-Barrantes P.M., Cho H.P., Blobaum A.L., Niswender C.M., Conn
P.J., Lindsley C.W. Lead Optimization of the VU0486321 Series of mGlu1 PAMs.
Part 1: SAR of Modifications to the Central Aryl Core // Bioorg. Med. Chem. Lett.
2015a. V. 25. P. 5107–5110.
Garcia-Barrantes P.M., Cho H.P., Niswender C.M., Byers F.W., Locuson
C.W., Blobaum A.L., Xiang Z., Rook J.M., Conn P.J., Lindsley C.W. Development of
Novel, CNS Penetrant Positive Allosteric Modulators for the Metabotropic Glutamate
Receptor Subtype 1 (mGlu1), Based on an N-(3-Chloro-4-(oxoisindolin-2-yl)phenyl)-
3-methylfuran-2-carboxamide Scaffold That Potentiate Wild Type and Mutant mGlu 1
Receptors Found in Schizophrenics // J. Med. Chem. 2015b. V. 58. P. 7959–7971.
Gee C.E., Peterlik D., Neuhäuser C., Bouhelal R., Kaupmann K., Laue G.,
Uschold-Schmidt N., Feuerbach D., Zimmermann K., Ofner S., et al. Blocking
Metabotropic Glutamate Receptor Subtype 7 (mGlu7) via the Venus Flytrap Domain
(VFTD) Inhibits Amygdala Plasticity, Stress, and Anxiety-Related Behavior // J. Biol.
Chem. 2014. V. 289. P. 10975–10987.
German N., Decker A.M., Gilmour B.P., et al. Diarylureas as allosteric
modulators of the cannabinoid CB1 receptor: structure–activity relationship studies on
1-(4- Chlorophenyl)-3-{3-[6-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-2-yl]phenyl}urea (PSNCBAM-
1) // J. Med. Chem. 2014. V. 57. P. 7758–7769.
Gould R.W., Amato R.J., Bubser M., Joffe M.E., Nedelcovych M.T.,
Thompson A.D., Nickols H.H., Yuh J.P., Zhan X., Felts A.S., Rodriguez A.L., Venable
D.F., et al. Partial mGlu5 Negative Allosteric Modulators Attenuate Cocaine Self-
Administration, Demonstrate Antidepressant- and Anxiolytic-Like Activity and Lack
Psychotomimetic Effects // Neuropsychopharmacology. 2015. V. 102. P. 244–253.
181
Horswill J.G., Bali U., Shaaban S., et al. PSNCBAM-1, a novel allosteric
antagonist at cannabinoid CB1 receptors with hypophagic effects in rats // Br. J.
Pharmacol. 2007. V. 152. P. 805–814.
Huang J., Chen K., Gong W., Dunlop N.M., Wang J.M. G-protein coupled
chemoattractant receptors and cancer // Front. Biosci. 2008. V. 13. P. 3352–3363. doi:
10.2741/2930.
Huang W., Manglik A., Venkatakrishnan A.J., Laeremans T., Feinberg E.N.,
Sanborn A.L., Kato H.E., Livingston K.E., Thorsen T.S., Kling R.C., Granier S.,
Gmeiner P., Husbands S.M., Traynor J.R., Weis W.I., Steyaert J., Dror R.O., Kobilka
B.K. Structural insights into µ-opioid receptor activation // Nature. 2015. V. 524
(7565). P. 315–321. doi: 10.1038/nature14886.
Ignatowska-Jankowska B.M., Baillie G.L., Kinsey S., et al. A cannabinoid
CB1 receptor-positive allosteric modulator reduces neuropathic pain in the mouse
with no psychoactive effects // Neuropsychopharmacology. 2015. V. 40. P. 2948–
2959.
Jalan-Sakrikar N., Field J.R., Klar R., Mattmann M.E., Gregory K.J.,
Zamorano R., Engers D.W., Bollinger S.R., Weaver C.D., Days E.L., et al.
Identification of Positive Allosteric Modulators VU0155904 (ML397) and
VU0422288 (ML396) Reveals New Insights Into the Biology of Metabotropic
Glutamate Receptor 7 // ACS Chem. Neurosci. 2014. V. 5. P. 1221–1237.
Jensen P.C., Thiele S., Ulven T., Schwartz T.W., Rosenkilde M.M. Positive
versus negative modulation of different endogenous chemokines for CC-chemokine
receptor 1 by small molecule agonists through allosteric versus orthosteric binding //
J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 23121–23128. doi: 10.1074/jbc.M803458200.
Jones C.K., Bubser M., Thompson A.D., Dickerson J.W., Turle-Lorenzo N.,
Amalric M., Blobaum A.L., Bridges T.M., Morrison R.D., Jadhav S., et al. The
Metabotropic Glutamate Receptor 4-Positive Allosteric Modulator VU0364770
Produces Efficacy Alone and in Combination with l-DOPA or an Adenosine 2A
Antagonist in Preclinical Rodent Models of Parkinson’s Disease // J. Pharmacol. Exp.
Ther. 2012. V. 340. P. 404–421.
Kalinichev M., Le Poul E., Bolea C., Girard F., Campo B., Fonsi M., Royer-
Urios I., Browne S.E., Uslaner J.M., Davis M.J., et al. Characterization of the Novel
Positive Allosteric Modulator of the Metabotropic Glutamate Receptor 4 ADX88178
in Rodent Models of Neuropsychiatric Disorders // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2014. V.
350 (3). P. 495–505. doi: 10.1124/jpet.114.214437.
Kandaswamy R., McQuillin A., Curtis D., Gurling H. Allelic Association,
DNA Resequencing and Copy Number Variation at the Metabotropic Glutamate
Receptor GRM7 Gene Locus in Bipolar Disorder // Am. J. Med. Genet. Part B. 2014.
V. 165B (4). P. 365–372. doi: 10.1002/ajmg.b.32239.
Kenakin T.P. 7TM Receptor Allostery: Putting Numbers to Shapeshifting
Proteins // Trends Pharmacol. Sci. 2009. V. 30 (9). P. 460–469. doi:
10.1016/j.tips.2009.06.007.
182
Kenakin T., Miller L.J. Seven Transmembrane Receptors as Shapeshifting
Proteins: The Impact of Allosteric Modulation and Functional Selectivity on New
Drug Discovery // Pharmacol. Rev. 2010. V. 62 (2). P. 265–304. doi:
10.1124/pr.108.000992.
Khajehali E., Malone D.T., Glass M., Sexton P.M., Christopoulos A., Leach
K. Biased agonism and biased allosteric modulation at the CB 1 cannabinoid receptors
// Mol. Pharmacol. 2015. V. 88 (2). P. 368–379. doi: 10.1124/mol.115.099192.
Khurana L., Ali H.I., Olszewska T., Ahn K.H., Damaraju A., Kendall D.A.,
Lu D. Optimization of chemical functionalities of indole-2-carboxamides to improve
allosteric parameters for the cannabinoid receptor 1 (CB1) // J. Med. Chem. 2014. V.
57 (7). P. 3040–3052. doi: 10.1021/jm5000112.
Lane R.J., Abdul-Ridha A., Canals M. Regulation of G Protein-Coupled
Receptors by Allosteric Ligands // ACS Chem. Neurosci. 2013. V. 4 (4). P. S27–S34.
doi: 10.1021/cn400005t.
Laprairie R.B., Bagher A.M., Kelly M.E.M., et al. Cannabidiol is a negative
allosteric modulator of the type 1 cannabinoid receptor // Br. J. Pharmacol. 2015. V.
172 (20). P 4790-4805. doi: 10.1111/bph.13250.
Le Poul E., Boléa C., Girard F., Poli S., Charvin D., Campo B., Bortoli J.,
Bessif A., Luo B., Koser A.J., Hodge L.M., Smith K.M., DiLella A.G., Liverton N.,
Hess F., Browne S.E., Reynolds I.J. A Potent and Selective Metabotropic Glutamate
Receptor 4 Positive Allosteric Modulator Improves Movement in Rodent Models of
Parkinson’s Disease // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2012. V. 343 (1). P. 167–177. doi:
10.1124/jpet.112.196063.
Lin H., Higgins P., Loh H.H., Law P.-Y., Liao D. Bidirectional effects of
fentanyl on dendritic spines and AMPA receptors depend upon the internalization of
mu opioid receptors // Neuropsychopharmacology. 2009. V. 34 (9). P. 2097–2111.
doi: 10.1038/npp.2009.34.
Lindsley C.W., Philip S. Portoghese Medicinal Chemistry Lectureship: Drug
Discovery Targeting Allosteric Sites // J. Med. Chem. 2014. V. 57 (18). P. 7485–
7498. doi: 10.1021/jm5011786.
Lindsley C.W., Emmitte K.A., Hopkins C.R., Bridges T.M., Gregory K.J.,
Niswender C.M., Conn P.J. Practical Strategies and Concepts in GPCR Allosteric
Modulator Discovery: Recent Advances with Metabotropic Glutamate Receptors //
Chem. Rev. 2016. V. 116 (11). P. 6707-6741. doi: 10.1021/acs.chemrev.5b00656.
Livingston K.E., Stanczyk M.A., Burford N.T., Alt A., Canals M., Traynor
J.R. Pharmacologic Evidence for a Putative Conserved Allosteric Site on Opioid
Receptors // Mol. Pharmacol. 2018. V. 93 (2). P. 157-167. doi:
10.1124/mol.117.109561.
Livingston K.E., Traynor J.R. Disruption of the Na+ ion binding site as a
mechanism for positive allosteric modulation of the mu-opioid receptor // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2014. V. 111 (51). P. 18369–18374. doi: 10.1073/pnas.1415013111.
Mahmoud M.M., Ali H.I., Ahn K.H., Damaraju A., Samala S., Pulipati V.K.,
Kolluru S., Kendall D.A., Lu D. Structure-activity relationship study of indole-2-
183
carboxamides identifies a potent allosteric modulator for the cannabinoid receptor 1
(CB1) // J. Med. Chem. 2013. V. 56 (20). P. 7965–7975. doi: 10.1021/jm4009828.
Maj M., Bruno V., Dragic Z., Yamamoto R., Battaglia G., Inderbitzin W.,
Stoehr N., Stein T., Gasparini F., Kuhn R., Nicoletti F., Flor P.J. (−)-PHCCC, a
Positive Allosteric Modulator of mGluR4: Characterization, Mechanism of Action,
and Neuro-protection // Neuropharmacology. 2003. V. 45. P. 895–906.
Manglik A., Kruse A.C., Kobilka T.S., Thian F.S., Mathiesen J.M., Sunahara
R.K., Pardo L., Weis W.I., Kobilka B.K., Granier S. Crystal structure of the µ-opioid
receptor bound to a morphinan antagonist // Nature. 2012. V. 485 (7398). P. 321–326.
doi: 10.1038/nature10954.
Marino M.J., Williams D.L., Jr., O’Brien J.A., Valenti O., McDonald T.P.,
Clements M.K., Wang R., DiLella A.G., Hess J.F., Kinney G.G., et al. Allosteric
Modulation of Group III Metabotropic Glutamate Receptor 4: A Potential Approach
to Parkinson’s Disease Treatment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P.
13668–13673.
Megens A.A.H.P., Hendrickx H.M.R., Hens K.A., Talloen W.J.-P.E.,
Lavreysen H. mGlu2 Receptor-Mediated Modulation of Conditioned Avoidance
Behavior in Rats // Eur. J. Pharmacol. 2014. V. 727. P. 130–139. doi:
10.1016/j.ejphar.2014.01.044.
Menniti F.S., Lindsley C.W., Conn P.J., Pandit J., Zagouras P., Volkmann
R.A. Allosteric Modulation for the Treatment of Schizophrenia: Targeting
Glutamatergic Networks // Curr. Top. Med. Chem. 2013. V. 13. P. 26–54.
Morales P., Goya P., Jagerovic N., Hernandez-Folgado L. Allosteric
Modulators of the CB1 Cannabinoid Receptor: A Structural Update Review //
Cannabis Cannabinoid Res. 2016. V. 1 (1). P. 22–30. doi: 10.1089/can.2015.0005.
Moriconi A., Cunha T.M., Souza G.R., Lopes A.H., Cunha F.Q., Carneiro
V.L., et al. Targeting the minor pocket of C5aR for the rational design of an oral
allosteric inhibitor for inflammatory and neuropathic pain relief // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 2014. V. 111. P. 18799–18799. doi: 10.1073/pnas.1417365111.
Nakamura M., Kurihara H., Suzuki G., Mitsuya M., Ohkubo M., Ohta H.
Isoxazolopyridone Derivatives as Allosteric Metabotropic Glutamate Receptor 7
Antagonists // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010. V. 20 (2). P. 726–729. doi:
10.1016/j.bmcl.2009.11.070.
Nickols H.H., Yuh J.P., Gregory K., Morrison R., Bates B.S., Stauffer S.,
Emmitte K., Bubser M., Peng W., Nedelcovych M.T., Thompson A., Lv X., Xiang Z.,
Daniels J.S., Niswender C.M., Lindsley C.W., Jones C.K., Conn P.J. VU0477573:
Partial Negative Allosteric Modulator of the Subtype 5 Metabotropic Glutamate
Receptor with High in Vivo Efficacy // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2016. V. 356 (1). P.
123–136. doi: 10.1124/jpet.115.226597.
Niswender C.M., Johnson K.A., Miller N.R., Ayala J.E., Luo Q., Williams
R., Saleh S., Orton D., Weaver C.D., Conn P.J. Context-Dependent Pharmacology
Exhibited by Negative Allosteric Modulators of Metabotropic Glutamate Receptor 7 //
Mol. Pharmacol. 2010. V. 77 (3). P. 459–468. doi: 10.1124/mol.109.058768.
184
Niswender C.M., Johnson K.A., Weaver C.D., Jones C.K., Xiang Z., Luo Q.,
Rodriguez A.L., Mario J.E., de Paulis T., Days E.L., Nalywajko T., Austin C.A.,
Williams M.B., Ayala J.E., Williams R., Lindsley C.W., Conn P.J. Discovery,
Characterization, and Antiparkinsonian Effect of Novel Positive Allosteric
Modulators of Metabotropic Glutamate Receptor 4 // Mol. Pharmacol. 2008. V. 74
(5). P. 1345–1358. doi: 10.1124/mol.108.049551.
Owen D.R. Recent Advances in the Medicinal Chemistry of the
Metabotropic Glutamate Receptor 1 (mGlu1) // ACS Chem. Neurosci. 2011. V. 2 (8).
P. 394–401. doi: 10.1021/cn2000124.
Parmentier-Batteur S., Hutson P.H., Menzel K., Uslaner J.M., Mattson
B.A., O’Brien J.A., Magliaro B.C., Forest T., Stump C.A., Tynebor R.M., Anthony
N.J., Tucker T.J., Zhang X.F., Gomez R., Huszar S.L., Lambeng N., Fauré H., Le Poul
E., Poli S., Rosahl T.W., Rocher J.P., Hargreaves R., Williams T.M. Mechanism
Based Neurotoxicity of mGlu5 Positive Allosteric Modulators-Development
Challenges for a Promising Novel Antipsychotic Target // Neuropharmacology. 2014.
V. 82. P. 161–173. doi: 10.1016/j.neuropharm.2012.12.003.
Piscitelli F., Ligresti A., La Regina G., Coluccia A., Morera L., Allarà M.,
Novellino E., Di Marzo V., Silvestri R. Indole-2-carboxamides as allosteric modulators
of the cannabinoid CB(1) receptor // J. Med. Chem. 2012. V. 55 (11). P. 5627–5631.
doi: 10.1021/jm201485c.
Price M.R., Baillie G.L., Thomas A., Stevenson L.A., Easson M., Goodwin
R., McLean A., Mcintosh L., Goodwin G., Walker G., Westwood P., Marrs J.,
Thomson F., Cowley P., Christopoulos A., Pertwee R.G., Ross R.A. Allosteric
Modulation of the Cannabinoid CB1 Receptor // Mol. Pharmacol. 2005. V. 68 (5). P.
1484–1495. doi: 10.1124/mol.105.016162.
Rajagopal S., Bassoni D.L., Campbell J.J., Gerard N.P., Gerard C.,
Wehrman T.S. Biased agonism as a mechanism for differential signaling by
chemokine receptors // J. Biol. Chem. 2013. V. 288. P. 35039–35048. doi:
10.1074/jbc.M113.479113.
Rocher J.-P., Bonnet B., Boléa C., Liitjens R., Le Poul E., Poli S., Epping-
Jordan M., Bessis A.-S., Ludwig B., Mutel V. mGluR5 Negative Allosteric Modulators
Overview: A Medicinal Chemistry Approach Towards a Series of Novel Therapeutic
Agents // Curr. Top. Med. Chem. 2011. V. 11. P. 680–695.
Rook J.M., Bertron J.L., Cho H.P., Garcia-Barrantes P.M., Moran S.P.,
Maksymetz J.T., Nance K.D., Dickerson J.W., Remke D.H., Chang S., Harp J.M.,
Blobaum A.L., Niswender C.M., Jones C.K., Stauffer S.R., Conn P.J., Lindsley C.W. A
Novel M1 PAM VU0486846 Exerts Efficacy in Cognition Models without Displaying
Agonist Activity or Cholinergic Toxicity // ACS Chem. Neurosci. 2018. V. 9 (9). P.
2274–2285. doi: 10.1021/acschemneuro.8b00131.
Rook J.M., Noetzel M.J., Pouliot W.A., Bridges T.M., Vinson P.N., Cho
H.P., Zhou Y., Gogliotti R.D., Manka J.T., Gregory K.J., Stauffer S.R., Dudek F.E.,
Xiang Z., Niswender C.M., Daniels J.S., Jones C.K., Lindsley C.W., Conn P.J. Unique
Signaling Profiles of Positive Allosteric Modulators of mGlu 5 Determine Differences
185
in in Vivo Activity // Biol. Psychiatry. 2013. V. 73 (6). P. 501–509. doi:
10.1016/j.biopsych.2012.09.012.
Rook J.M., Xiang Z., Lv X., Ghoshal A., Dickerson J., Bridges T.M.,
Johnson K.A., Foster D.J., Gregory K.J., Vinson P.N., et al. Biased mGlu5 Positive
Allosteric Modulators Provide in Vivo Efficacy Without Potentiating mGlu 5
Modulation of NMDAR Currents // Neuron. 2015. V. 86 (4). P. 1029–1040. doi:
10.1016/j.neuron.2015.03.063.
Rovira X., Malhaire F., Scholler P., Rodrigo J., Gonzalez-Bulnes P.,
Llebaria A., Pin J.P., Giraldo J., Goudet C. Overlapping Binding Sites Drive
Allosteric Agonism and Positive Cooperativity in Type 4 Metabotropic Glutamate
Receptors // FASEB J. 2015. V. 29 (1). P. 116–130. doi: 10.1096/fj.14-257287.
Quoyer J., Janz J.M., Luo J., Ren Y., Armando S., Lukashova V., et al.
Pepducin targeting the C-X-C chemokine receptor type 4 acts as a biased agonist
favoring activation of the inhibitory G protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V.
110. P. E5088–E5097. doi: 10.1073/pnas.1312515110.
Sachpatzidis A., Benton B.K., Manfredi J.P., Wang H., Hamilton A.,
Dohlman H.G., et al. Identification of allosteric peptide agonists of CXCR4 // J. Biol.
Chem. 2003. V. 278. P. 896–907. doi: 10.1074/jbc.M204667200.
Shibata H., Tani A., Chikuhara T., Kikuta R., Sakai M., Ninomiya H.,
Tashiro N., Iwata N., Ozaki N., Fukumaki Y. Association Study of Polymorphisms in
the Group III Metabotropic Glutamate Receptor Genes, GRM4 and GRM7, with
Schizophrenia // Psychiatry Res. 2009. V. 167 (1-2). P. 88–96. doi:
10.1016/j.psychres.2007.12.002.
Shore D.M., Baillie G.L., Hurst D.H., Navas F. 3rd, Seltzman H.H., Marcu
J.P., Abood M.E., Ross R.A., Reggio P.H. Allosteric modulation of a cannabinoid G
protein-coupled receptor binding site elucidation and relationship to G protein
signaling // J. Biol. Chem. 2014. V. 289 (9). P. 5828–5845. doi:
10.1074/jbc.M113.478495.
Sławińska A., Wierońska J.M., Stachowicz K., Marciniak M., Łasoń-
Tyburkiewicz M., Gruca P., Papp M., Kusek M., Tokarski K., Doller D., Pilc A. The
Antipsychotic-Like Effects of Positive Allosteric Modulators of Metabotropic
Glutamate mGlu4 Receptors in Rodents // Br. J. Pharmacol. 2013a. V. 169 (8). P.
1824. doi: 10.1111/bph.12254.
Slawińska A., Wierońska J.M., Stachowicz K., Palucha-Poniewiera A.,
Uberti M.A., Bacolod M.A., Doller D., Pilc A. Anxiolytic- but not Antidepressant-
Like Activity of Lu AF21934, a Novel, Selective Positive Allosteric Modulator of the
mGlu4 Receptor // Neuropharmacology. 2013b. V. 66. P. 225–235. doi:
10.1016/j.neuropharm.2012.05.001.
Souza D.G., Bertini R., Vieira A.T., Cunha F.Q., Poole S., Allegretti M., et
al. Repertaxin, a novel inhibitor of rat CXCR2 function, inhibits inflammatory
responses that follow intestinal ischaemia and reperfusion injury // Br. J. Pharmacol.
2004. V. 143. P. 132–142. doi: 10.1038/sj.bjp.0705862.
186
Straiker A., Mitjavila J., Yin D., Gibson A., Mackie K. Aiming for
allosterism: evaluation of allosteric modulators of CB1 in a neuronal model //
Pharmacol. Res. 2015. V. 99. P. 370–376. doi: 10.1016/j.phrs.2015.07.017.
Stevens C.W. The evolution of vertebrate opioid receptors // Front. Biosci.
(Landmark Ed.). 2009. V. 14. P. 1247–1269.
Suzuki G., Tsukamoto N., Fushiki H., Kawagishi A., Nakamura M.,
Kurihara H., Mitsuya M., Ohkubo M., Ohta H. In Vitro Pharmacological
Characterization of Novel Isoxazolopyridone Derivatives as Allosteric Metabotropic
Glutamate Receptor 7 Antagonists // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2007. V. 323 (1). P.
147–156. doi: 10.1124/jpet.107.124701.
Thakur G.A., Tichkule R.B., Kulkarni P.M., et al. Allosteric modulators of
the cannabinoid 1 receptor // Patent. 2015. WO2015027160.
Thomas A., Baillie G.L., Phillips A.M., Razdan R.K., Ross R.A., Pertwee
R.G. Cannabidiol displays unexpectedly high potency as an antagonist of CB1 and
CB2 receptor agonists in vitro // Br. J. Pharmacol. 2007. V. 150 (5). P. 613–623. doi:
10.1038/sj.bjp.0707133.
Trabanco A.A., Tresadern G., Macdonald G.J., Vega J.A., de Lucas A.I.,
Matesanz E., Garcia A., Linares M.L., Alonso de Diego S.A., Alonso J.M., Oehlrich
D., Ahnaou A., Drinkenburg W., Mackie C., Andrés J.I., Lavreysen H., Cid J.M.
Imidazo[1,2-a]pyridines: Orally Active Positive Allosteric Modulators of the
Metabotropic Glutamate 2 Receptor // J. Med. Chem. 2012. V. 55 (6). P. 2688–2701.
doi: 10.1021/jm201561r.
Tresadern G., Cid J.M., Macdonald G.J., Vega J.A., de Lucas A.I., García
A., Matesanz E., Linares M.L., Oehlrich D., Lavreysen H., et al. Scaffold Hopping
from Pyridones to Imidazo[1,2-a]pyridines. New Positive Allosteric Modulators of
Metabotropic glutamate 2 receptor // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010. V. 20. P. 175–
179.
Urwyler S. Allosteric Modulation of Family C G-Protein-Coupled
Receptors: From Molecular Insights to Therapeutic Perspectives // Pharmacol. Rev.
2011. V. 63 (1). P. 59–126. doi: 10.1124/pr.109.002501.
Wenthur C.J., Gentry P.R., Mathews T.P., Lindsley C.W. Drugs for
Allosteric Sites on Receptors // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2014. V. 54. P. 165–
184. doi: 10.1146/annurev-pharmtox-010611-134525.
Yamasaki T., Kumata K., Yui J., Fujinaga M., Furutsuka K., Hatori A., Xie
L., Ogawa M., Nengaki N., Kawamura K., Zhang M.R. Synthesis and Evaluation of
[11C]MMPIP as a Potential Radioligand for Imaging of Metabotropic Glutamate 7
Receptor in the Brain // EJNMMI Res. 2013. V. 3 (1). P. 54. doi: 10.1186/2191-219X-
3-54.
187
ГЛАВА 5
Аллостерические регуляторы рецепторов

5.1. Рецепторы гонадотропинов – структурно-

функциональная организация и регуляторные свойства
У человека и млекопитающих имеются два типа

рецепторов гонадотропинов, которые относятся к суперсемейству
GPCR и различаются по специфичности связывания с гормонами.
Первый из них связывается с лютеинизирующим гормоном (ЛГ)
и его структурным и функциональным гомологом хорионическим
гонадотропином человека (ХГЧ) и, соответственно, называется
рецептором ЛГ/ХГЧ или упрощенно рецептором ЛГ. Второй
рецептор специфично связывается с фолликулостимулирующим
гормоном (ФСГ), и потому его называют рецептором ФСГ. Оба
рецептора входят в группу δ GPCR, представителями которой
также являются рецепторы тиреотропного гормона (ТТГ),
релаксина и инсулиноподобного пептида-3 (Banerjee, Mahale,
2015). Рецепторы гонадотропинов, как и все другие GPCR,
включают семь трансмембранных спиралей (ТМС), которые
образуют трансмембранный домен. В отличие от большинства
GPCR, имеющих сравнительно небольшой внеклеточный N-
концевой участок, рецепторы ЛГ и ФСГ характеризуются
значительным по размеру внеклеточным доменом, который
содержит повторы, обогащенные остатками лейцина (leucine-rich
repeats, LRR) (Шпаков, 2009, 2017б). Наряду с этими повторами в
эктодомене рецепторов гонадотропинов имеется обогащенный
остатками цистеина N-концевой участок, который
характеризуется сильно выраженной вариабельностью первичной
188
структуры, и спейсерный участок, соединяющий LRR-субдомен с
первой ТМС трансмембранного домена (Puett et al., 2010). В
эктодомене рецепторов ЛГ и ФСГ локализован высокоаффинный
ортостерический сайт, с которым специфично связываются αβ-
гетеродимерные молекулы гонадотропинов – ЛГ, ХГЧ и ФСГ.
Как отмечалось в Главе 2, в большинстве GPCR этот сайт
расположен либо в полости трансмембранного домена, либо в
преддверии внешнего входа в него. При связывании
гонадотропинов с ортостерическим сайтом меняется
конформация как внеклеточных петель (ВП) рецепторов ЛГ и
ФСГ, так и их трансмембранного домена, что индуцирует
изменение функционального взаимодействия
цитоплазматических участков рецептора с гетеротримерными G-
белками и β-аррестинами. Результатом этого является активация
зависимых от G-белков и β-аррестинов внутриклеточных
сигнальных каскадов и транскрипционных факторов.
Связывание гонадотропинов с рецептором приводит к
активации сразу нескольких внутриклеточных сигнальных
каскадов, что обусловлено их взаимодействием с различными
типами гетеротримерных G-белков, в первую очередь с Gs- и
Gq/11-белками, а также с регуляторами G-белкового сигналинга (β-
аррестинами) и адапторными белками APPL-семейства (Шпаков,
2009, 2017а, 2017б; Ulloa-Aguirre et al., 2013; Banerjee, Mahale,
2015). Через посредство Gs-белков осуществляется активация
фермента аденилатциклазы (АЦ), что ведет к повышению
внутриклеточного уровня цАМФ, стимуляции протеинкиназы А,
цАМФ-активируемых обменных факторов семейства Epac и, как
следствие, к активации цАМФ-зависимых транскрипционных
факторов. Через посредство Gq/11-белков осуществляется
стимуляция активности фосфоинозитид-специфичной
фосфолипазы Сβ, катализирующей образование таких вторичных
посредников, таких как инозитол-1,4,5-трифосфат и
диацилглицерин, что приводит к повышению уровня
внутриклеточного кальция и активации кальций-зависимых
сигнальных путей. Взаимодействие активированных рецепторов
189
ЛГ и ФСГ с регуляторными белками – β-аррестинами (этот путь
независим от гетеротримерных G-белков) вызывает стимуляцию
каскада митогенактивируемых протеинкиназ (Ulloa-Aguirre et al.,
2013; Riccetti et al., 2017a, 2017b). Показано, что цАМФ-
зависимые, кальциевые и β-аррестиновые сигнальные пути
вовлечены в регуляцию синтеза и секреции стероидных
гормонов, в контроль роста и дифференцировки клеток
репродуктивной системы. Наряду с этим, β-аррестиновые пути
играют исключительно важную роль в механизмах
интернализации, эндоцитоза и рециклизации комплексов
гонадотропинов с их рецепторами и определяют, таким образом,
чувствительность тканей к гонадотропинам (подробнее см. Главу
1).
5.1.1. Рецептор лютеинизирующего гормона
Эктодомен рецептора ЛГ включает 330 аминокислотных

остатков и специфично взаимодействует с αβ-гетеродимерными
комплексами ЛГ и ХГЧ. В настоящее время сконструирована
трехмерная модель эктодомена рецептора ЛГ (Puett et al., 2005,
2007, 2010), которая сходна с таковой рецептора ФСГ (Fan,
Hendrickson, 2005). Различия между эктодоменами рецепторов
ЛГ и ФСГ имеются лишь в пространственной локализации
обогащенных лейцинами повторов LRR5 и LRR9 (Puett et al.,
2007). Определяющую роль в переходах рецептора ЛГ из
неактивной конформации в активную, лиганд-связанную,
конформацию играют: (1) ERW-мотив, расположенный в
интерфейсе между третьей ТМС и второй цитоплазматической
петлей (ЦП), (2) остатки Arg464 и Asp564, расположенные на
цитоплазматических концах третьей и шестой ТМС, и (3) остатки
Asp578 и Asn615, локализованные в шестой и седьмой ТМС внутри
трансмембранного домена. Идентифицировано множество
мутантных форм рецептора ЛГ, как с активирующими
мутациями, локализованными преимущественно в первой,
второй, третьей, пятой и шестой ТМС, так и с инактивирующими
190
мутациями, которые представляют собой замены
аминокислотных остатков в экзонах 1, 4–8, 10 эктодомена, в
первой и третьей ЦП и в первой, четвертой, пятой, шестой и
седьмой ТМС (Segaloff, 2009).
Показано, что петля β-субъединицы ХГЧ, которая
определяет связывание с рецептором, содержит два
положительно заряженных остатка Arg94 и Arg95 и отрицательно
заряженный остаток Asp99. Остаток Arg94 взаимодействует с
остатком Glu206 рецептора ЛГ, остаток Arg95 – с Glu154, остаток
Asp99 – с Asn107. Сходным образом с рецептором ЛГ
взаимодействуют и соответствующие аминокислотные остатки β-
субъединицы ЛГ. Наряду с этим, в β-субъединице ХГЧ имеются
еще два функционально важных для связывания с рецептором
аминокислотных остатка – Lys104 и Asp105, которые
взаимодействуют с Glu79 и Tyr58 рецептора ЛГ. Значимую роль в
связывании гормона и в передаче сигнала с эктодомена на
трансмембранный домен рецептора ЛГ играет спейсерный
участок эктодомена, поскольку в его отсутствие процесс
трансдукции генерируемого ХГЧ или ЛГ сигнала нарушается
(Fralish et al., 2003; Bruysters et al., 2008).
С помощью сайт-направленного мутагенеза показано, что
для взаимодействия рецептора ЛГ с Gs-белками и для активации
аденилатциклазного сигнального пути исключительно важен
интерфейс 459–482, образованный третьей ТМС и
проксимальным к мембране участком второй ЦП (Angelova et al.,
2008). При замене аминокислотных остатков в этом интерфейсе
(Ile460Ala, Thr461Ala, Arg464Ala, His466Ala, Thr467Ala, Ile468Ala,
Tyr470Ala, Ile472Ala, Leu478Ala) нарушается ХГЧ-индуцированная
стимуляция АЦ, причем наиболее критичными являются замены
Arg464 и Ile468. Замена в ERW-мотиве предшествующего аргинину
остатка Glu463 нарушает посттрансляционный процессинг
рецептора, а замена остатка Trp465, напротив, повышает
способность рецептора опосредовать стимуляцию АЦ
гонадотропином. Во взаимодействие с G-белками также
вовлечены интерфейсы пятой и шестой ТМС с проксимальными
191
участками третьей ЦП рецептора ЛГ. Критичными в этом случае
являются замены Ile549Ala, Tyr550Ala и Asp564Ala (Angelova et al.,
2008), а также целостность мотива положительно заряженных
аминокислотных остатков BBXXB, который локализован на
границе с шестой ТМС (Schultz et al., 1999). Замена
локализованного в этом мотиве остатка Lys570 на аланин
нарушает сопряжение мутантного рецептора ЛГ с Gs-белком и
блокирует ХГЧ-индуцированную активацию АЦ.
В С-концевом домене рецептора ЛГ расположены сайты
для фосфорилирования протеинкиназами, причем в активном
состоянии часть этих сайтов фосфорилирована, что отличает
рецептор ЛГ от рецептора ФСГ, в котором в активном состоянии
С-концевой домен не фосфорилирован (Nakamura et al., 1998a,
1998b). Локализованный в интерфейсе седьмой ТМС и С-
концевого домена остаток Cys644 является сайтом для
пальмитоилирования. Вблизи него локализован высоко
консервативный остаток Lys645, который необходим для
эффективного ацилирования SH-группы остатка Cys644 (Belanger
et al., 2001). Замена этого остатка на другие аминокислоты
нарушает процессинг рецептора ЛГ и приводит к потере им
специфической биологической активности (Galet et al., 2004).
Активность рецептора ЛГ в значительной степени
определяется его способностью образовывать олигомерные
комплексы. Рецептор ЛГ может существовать, как: (1) 67 кДа-
форма, соответствующая незрелому негликозилированному
предшественнику этого рецептора, (2) 84 кДа-форма,
соответствующая зрелому гликозилированному мономерному
рецептору, (3) 166 и 240 кДа-формы, представляющие собой ди-
и олигомерные комплексы (Tao et al., 2004). При связывании с
гонадотропинами относительное количество ди- и олигомерных
форм рецептора ЛГ на поверхности клеток возрастает, что
указывает на стимулирующее влияние гонадотропинов на
комплексообразование рецепторов ЛГ (Roess et al., 2000; Urizar et
al., 2005; Guan et al., 2009; Zhang et al., 2009). О важности таких
комплексов свидетельствует открытие эффекта трансактивации
192
рецепторов ЛГ, когда, связываясь с одной молекулой рецептора,
гонадотропин активирует другую молекулу, входящую в состав
олигомерного комплекса (Ji et al., 2002; Lee et al., 2002; Jeoung et
al., 2007). В пользу механизма трансактивации свидетельствует
то, что совместная экспрессия изоформ рецептора ЛГ, одна из
которых не способна связывать гормон, а другая лишена
сигнальных функций, приводит к функционально активному
олигомерному рецепторному комплексу (Rivero-Muller et al.,
2010). Сходные механизмы обнаружены и для других GPCR.
Основную роль в осуществлении димеризации и олигомеризации
рецептора ЛГ играют его четвертая, пятая и шестая ТМС (Fanelli,
2007; Fanelli et al., 2009).
5.1.2. Рецептор фолликулостимулирующего гормона
Рецептор ФСГ человека состоит из 695 аминокислотных

остатков, 17 из которых соответствуют сигнальной
последовательности, которая впоследствии отщепляется.
«Зрелая» молекула рецептора ФСГ включает 678
аминокислотных остатков и имеет молекулярный вес около 75
кДа (Dias et al., 2002). Следует отметить, что N-гликозилирование
рецептора ФСГ по трем или четырем аспарагин-содержащим
сайтам способно повысить молекулярный вес ФСГ до 80–87 кДа
(Ulloa-Aguirre et al., 2013). Рецептор ФСГ с высокой
аффинностью связывается с αβ-гетеродимерным комплексом
ФСГ в клетках гранулезы яичников у женщин, результатом чего
является стимуляция роста и созревания фолликулов. Связывание
ФСГ с его рецептором, локализованным на клетках Сертоли в
семенниках мужчин, стимулирует в них процесс сперматогенеза
(Foulkes et al., 1993; Robker, Richards, 1998; Themmen, Huhtaniemi,
2000). После синтеза в шероховатом эндоплазматическом
ретикулуме рецептор ФСГ подвергается N-гликозилированию и
пальмитоилированию, после чего его молекулы образуют
олигомерные комплексы, которые в составе везикул аппарата
Гольджи транслоцируются к плазматической мембране клетки.
193
Молекула ФСГ сначала взаимодействует с поверхностью
субдомена рецептора ФСГ, включающего 12 обогащенных
остатками лейцина участков, что обеспечивает высокоаффинное
связывание ФСГ с ортостерическим сайтом, который
локализован в эктодомене. Ключевую роль в процессе
связывания с ФСГ играет сульфатированный остаток Tyr335,
отрицательно заряженная сульфогруппа которого через систему
водородных связей взаимодействует с концевыми амидными
группами остатков Gln27 и Asn15 α-субъединицы и с атомами
азота в амидных связях остатков Val38 и Tyr39 β-субъединицы
ФСГ (Jiang et al., 2012). Таким образом, сульфатированный
остаток Tyr335, локализованный в нижней части ФСГ-
связывающего кармана, стабилизирует конформацию молекулы
ФСГ, которая необходима для высокоаффинного связывания
гормона с рецептором. С боковыми стенками ФСГ-связывающего
кармана взаимодействуют гидрофобные остатки Pro16, Leu17,
Phe18 и Phe74, расположенные в петлях L1 и L3 α-субъединицы,
гидрофобные остатки Leu37, Tyr39 и Pro45, расположенные в петле
L2 β-субъединицы, и локализованный в β-субъединице
положительно заряженный остаток Arg35. Гидрофобные остатки
обеспечивают низкую диэлектрическую проницаемость в
лигандсвязывающем ортостерическом сайте рецептора ФСГ, что
приводит к усилению электростатического взаимодействия
между Arg35 молекулы ФСГ и сульфатированным Tyr335
рецептора ФСГ (Jiang et al., 2012). Результатом изменения заряда
и конформации сульфатированного Tyr335 при связывании
рецептора ФСГ с гормоном является изменение
пространственной структуры спейсерного участка,
ответственного за взаимодействие эктодомена и ВП рецептора
ФСГ, что меняет конформацию трансмембранного домена и ЦП
рецептора, ответственных за взаимодействие с G-белками и β-
аррестинами (Jiang et al., 2012, 2014).
В рецепторе ФСГ, как и в рецепторах ЛГ и ТТГ,
сенсорная и сигнал-передающая функции разделены: за
сенсорную отвечает эктодомен, в то время как за сигнал-
194
передающую – трансмембранный домен и ЦП (эндодомен) (De
Pascali et al., 2018). В пользу этого свидетельствует тот факт, что
олигомерный комплекс, образованный рецептором ФСГ, который
сохраняет способность эффективно связывать гормон, но при
этом лишен сигнал-передающих функций, и рецептором ФСГ,
который лишен способности связываться с молекулой ФСГ, но
наделен сигнал-передающими функциями, является активным и
опосредует ФСГ-индуцированную стимуляцию G-белков. В
основе этого лежит способность мутантных мономеров рецептора
ФСГ трансактивировать друг друга в составе олигомерного
комплекса. Следует отметить, что при такой трансактивации, в
зависимости от типа мутантных рецепторов, осуществляется
активация только какого-то одного эффекторного звена – либо
фермента АЦ, либо фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы
Сβ (Ji et al., 2004).
Как и в случае рецептора ЛГ, связывание рецептора ФСГ
с гормоном приводит к активации сразу нескольких сигнальных
каскадов: (1) стимуляции активности АЦ через посредство Gs-
белков (основная мишень ФСГ), (2) ингибированию активности
АЦ через Gi/o-белки (короткая обратная отрицательная связь), (3)
стимуляции фосфоинозитидного пути через активацию Gq/11-
белков и фосфолипазы Сβ, (4) стимуляции β-аррестинового пути
через посредство взаимодействия GRK-фосфорилированных
участков С-концевого домена рецептора ФСГ с регуляторными
белками β-аррестинами (Quintana et al., 1994; Ulloa-Aguirre et al.,
2013; De Pascali et al., 2018; Landomiel et al., 2019). Наряду с этим,
ФСГ стимулирует различные классы митогенактивируемых
протеинкиназ и 3-фосфоинозитидные пути (De Pascali et al., 2018;
Landomiel et al., 2019). После активации комплекс, образуемый
ФСГ и его рецептором, подвергается интернализации, эндоцитозу
и рециклизации, причем в норме большинство рецепторов ФСГ в
«обновленном» состоянии возвращаются в плазматическую
мембрану и лишь сравнительно небольшая их часть деградирует
в протеосомах (Krishnamurthy et al., 2003).
195
5.2. Необходимость разработки низкомолекулярных
аллостерических регуляторов рецепторов
Применяемые в настоящее время в медицине

гонадотропины либо выделяют из природных источников
(мочевые формы ХГЧ и ФСГ), либо производят в
специализированных клетках-реакторах с помощью генно-
инженерных технологий (рекомбинантные формы ФСГ, ЛГ,
ХГЧ). У обеих форм гонадотропинов, природных и
рекомбинантных, имеются как преимущества, так и
существенные недостатки (Шпаков, 2018).
Бесспорным преимуществом мочевых форм ХГЧ и ФСГ
является их соответствие по степени N-гликозилирования и
другим посттрансляционным модификациям природным формам
гонадотропинов. В то же время в мочевых формах ХГЧ и ФСГ
имеются биологически активные примеси, а сами препараты от
партии к партии сильно варьируют по специфической
биологической активности, и это затрудняет их стандартизацию и
применение в репродуктологии и клинической эндокринологии.
Имеются проблемы, связанные с особенностями функциональной
активности гонадотропинов, получаемых различными способами.
Так ХГЧ, который выделяют из мочи беременных
женщин или жеребых кобыл, представляет собой плацентарную
форму гонадотропина. Эта форма продуцируется сначала
эмбрионом и затем плацентой уже после оплодотворения
яйцеклетки, в период беременности. Основными функциями
плацентарного ХГЧ являются регуляция процессов роста и
развития эмбриона, контроль дифференцировки тканей и органов
в эмбриогенезе, в то время как основным предназначением ЛГ и
гипофизарной формы ХГЧ в клинике является регуляция
полового созревания, фертильности, процессов стероидогенеза,
фолликулогенеза и сперматогенеза. Важно отметить, что у
мужчин в течение всего онтогенеза и у женщин во все периоды,
исключая первую половину беременности, плацентарная форма
196
ХГЧ отсутствует. Несмотря на это в условиях клиники мочевой
ХГЧ широко используют как функциональный аналог ЛГ для
усиления стероидогенеза и полового созревания у мальчиков с
задержкой полового развития, а также у женщин во
вспомогательных репродуктивных технологиях на этапе
контролируемой индукции овуляции. Необходимо также
отметить, что плацентарная форма ХГЧ существенно отличается
от ЛГ и гипофизарной формы ХГЧ по своей структуре – степени
N-гликозилирования, разветвленности и заряду N-гликанов, а
также по фармакокинетике.
В случае мочевой формы ФСГ основная проблема состоит
в том, что препарат выделяют из мочи постменопаузальных
женщин, у которых основной пул эндогенного ФСГ составляют
сильно гликозилированные формы гонадотропина со сниженной
функциональной активностью. С одной стороны, снижение
активности мочевого ФСГ не приводит к гиперактивации
рецепторов ФСГ, что важно для нормального созревания
фолликулов и отбора качественных ооцитов в условиях
контролируемой индукции овуляции. С другой стороны,
препараты мочевого ФСГ со сниженной активностью мало
эффективны при стимуляции фолликулогенеза у женщин с
ослабленным ответом яичников на гонадотропины, что
достаточно часто наблюдается при сниженной фертильности и в
условиях репродуктивных дисфункций (Шпаков, 2018).
Рекомбинантные формы гонадотропинов также не
лишены примесей, в том числе биологически активных белков,
но содержат их в существенно меньших количествах. В
сравнении с природными формами ХГЧ и ФСГ, препараты
рекомбинантных гонадотропинов характеризуются более
высокой степенью стандартизации, что обусловлено
оптимизацией процедур их синтеза и очистки. Однако по
структуре они значительно отличаются от природных аналогов,
что сказывается как на их фармакокинетических
характеристиках, так и на способности влиять на
функциональную активность рецепторов гонадотропинов и на
197
регулируемые через них физиологические функции. Поскольку в
«реакторных» клетках, где экспрессируются рекомбинантные
формы гонадотропинов, процессы N-гликозилирования и другие
посттрансляционные модификации, существенно отличаются от
таковых в гонадотрофах аденогипофиза, то и структура
рекомбинантных ФСГ, ЛГ, ХГЧ в значительной степени
отличается от таковой для их природных форм. Результатом
этого является изменение паттерна и интенсивности воздействий
рекомбинантных гонадотропинов на специфичные к ним
рецепторы и на нижележащие звенья «подконтрольных» им
сигнальных каскадов. Это приводит к смещению клеточного
ответа, что может вызывать побочные эффекты, в том числе и
отдаленные (эпигенетические изменения у плода), при
использовании рекомбинантных форм гонадотропинов во
вспомогательных репродуктивных технологиях и при коррекции
гипогонадотропных состояний.
В связи с вышесказанным ведется поиск альтернативных
путей регуляции рецепторов ЛГ и ФСГ и зависимых от них
сигнальных каскадов. Результаты исследований рецепторов ЛГ и
ФСГ, имеющих природные мутации или мутации, вызываемые
сайт-направленным мутагенезом, а также изучение химерных
рецепторов указывают на то, что в процессе активации
гонадотропинами конформационные перестройки неизбежно
затрагивает аллостерические сайты, расположенные в
трансмембранных доменах рецепторов. Изменения в этих сайтах
являются одним из пусковых механизмов сигнальной
трансдукции.
Необходимо отметить, что в процессе стимуляции
рецептора гонадотропином аллостерический сайт остается
свободным, точнее, заполненным молекулами воды, которые
образуют водородные связи с боковыми функциональными
группами полярных аминокислотных остатков, формирующих
внутреннюю полость этого сайта. В последние годы ведется
разработка аллостерических регуляторов рецепторов ЛГ и ФСГ,
способных специфично взаимодействовать с этим сайтом (рис. 5-
198
1). Поскольку эндогенных аллостерических регуляторов
рецепторов ЛГ и ФСГ в организме человека и животных не
обнаружено, то все усилия направлены на разработку
синтетических низкомолекулярных соединений с активностью
таких регуляторов.
Дополнительные сложности при создании таких
низкомолекулярных аллостерических регуляторов создает то, что
в трансмембранных доменах рецепторов ЛГ и ФСГ, наряду с
основным аллостерическим сайтом, имеется вспомогательный
(минорный) аллостерический сайт, связывание с которым
модулирует активность основного сайта (Arey, 2008; Heitman et
al., 2012). Основной аллостерический сайт сформирован третьей,
четвертой, пятой и шестой ТМС (Heitman et al., 2012; Gentry et al.,
2015; Manglik et al., 2017), в то время как вспомогательный сайт –
первой, второй, третьей и седьмой ТМС (Arey, 2008). Оба
аллостерических сайта, основной и минорный, локализованы
внутри полости трансмембранного домена рецепторов ЛГ и ФСГ,
хотя и с разной степенью углублены в него, и в определенной
степени перекрываются между собой. Следствием такого
перекрывания является большой фармакологический диапазон
аллостерической регуляции этих рецепторов. Действительно, при
разработке низкомолекулярных лигандов аллостерического сайта
рецепторов гонадотропинов выявлены как «чистые»
аллостерические агонисты и антагонисты, так и аллостерические
регуляторы с активностью аллостерических модуляторов, PAM и
NAM, а также аго-PAM (Nataraja et al., 2015; Anderson et al.,
2019).
199
Рис. 5-1. Локализация аллостерического сайта в рецепторах ЛГ и ФСГ.

Стрелкой показана локализация низкомолекулярного аллостерического
лиганда, который связывается с расположенным в полости
трансмембранного домена аллостерическим сайтом рецептора.
ВП2, ВП3 – вторая и третья внеклеточные петли рецептора, ТМ1–ТМ7 –
трансмембранные спирали 1–7, образующие трансмембранный домен.
5.3. Низкомолекулярные аллостерические агонисты

рецептора лютеинизирующего гормона
Первые низкомолекулярные лиганды рецептора ЛГ были

разработаны голландскими учеными в 2002 году, когда они,
будучи сотрудниками научного департамента фирмы «Organon»
(в настоящее время «Merck & Co/Merck Sharpe & Dohme (MSD)»,
200
Кенилворт, США), синтезировали первые производные
тиенопиримидинов с активностью аллостерических агонистов
рецептора ЛГ (van Straten et al., 2002). Наиболее эффективными
среди них были соединение Org 41841, N-трет-бутил-5-амино-4-
(3-метоксифенил)-2-(метилтио)тиено[2,3-D]пиримидин-6-
карбоксамид, и его более активный аналог – соединение Org
43553, которые селективно активировали рецептор ЛГ в
наномолярных концентрациях (рис. 5-2).
Org 41841
Org 43553
соединение 1
Рис. 5-2. Низкомолекулярные аллостерические агонисты
рецептора ЛГ на основе тиенопиримидиновой структуры.
201
В дальнейшем эти соединения стали прототипами

большого числа тиенопиримидиновых производных с
активностью аллостерических регуляторов как рецептора ЛГ, так
и родственного ему рецептора ТТГ, а также легли в основу
разработки других классов низкомолекулярных аллостерических
регуляторов этих рецепторов (Heitman, Ijzerman, 2008; Шпаков,
Шпакова, 2010; van de Lagemaat et al., 2009, 2011b; Lane,
IJzerman, 2013; Шпаков и др., 2014а, 2014б; Шпаков, 2015;
Деркач и др., 2016а, 2016б, 2017).
С использованием радиолигандного метода было
показано, что меченое тритием соединение Org 43553
специфично связывается с рецептором ЛГ со значением Kd,
равным 2.4 нМ. При этом, поскольку Org 43553 взаимодействует
с аллостерическим сайтом рецептора ЛГ, который не совпадает
по локализации с его ортостерическим сайтом, в его присутствии
связывание [125I]-ХГЧ с ортостерическим сайтом рецептора
полностью сохранялось (Heitman et al., 2008). В пользу
несовпадения сайтов связывания эндогенного гормона и
низкомолекулярного агониста свидетельствует и то, что
стимулирующее влияние ЛГ на активность АЦ в клетках с
экспрессированным в них рецептором ЛГ в присутствии
соединения Org 43553 не снижается. Результатом связывания
соединения Org 43553 с рецептором ЛГ является стимуляция АЦ
и цАМФ-зависимых транскрипционных факторов со значениями
EC50 28 и 4.7 нМ. Показано, что эффективность действия
низкомолекулярного агониста, как стимулятора АЦ и цАМФ-
зависимого фактора CREB, заметно ниже, чем у гонадотропинов,
и составляет 62 и 80 % от таковой ЛГ (van Koppen et al., 2008).
Однако более мягкая стимуляция активности аденилатциклазной
сигнальной системы может рассматриваться скорее как
положительный фактор, поскольку препятствует гиперактивации
цАМФ-зависимых сигнальных каскадов, что является одной из
причин развития резистентности тканей-мишеней к
гонадотропинам. При этом соединение Org 43553 очень слабо
202
влияет на функциональную активность рецепторов ТТГ и ФСГ,
что свидетельствует о его рецепторной специфичности (van
Koppen et al., 2008).
Как отмечалось выше, ЛГ через посредство Gq/11-белков
стимулирует активность фосфоинозитид-специфичной
фосфолипазы Сβ, причем для активации этого фермента
требуются более высокие концентрации гонадотропина, чем для
активации АЦ (Gilchrist et al., 1996). Соединение Org 43553 в
сравнительно высоких концентрациях (10-6–10-5 М)
стимулировало активность фосфолипазы Сβ лишь на 33–37 %,
что составляет менее 5 % от соответствующего эффекта ЛГ.
Таким образом, Org 43553 через посредство Gs-белков активирует
аденилатциклазный сигнальный путь, но практически не
приводит к стимуляции Gq/11-белков и активации
фосфоинозитидного обмена (van Koppen et al., 2008). Одной из
основных мишеней ЛГ и ХГЧ являются β-аррестины, через
посредство которых не только стимулируется активность
митогенактивируемых протеинкиназ и кальциевых путей, но и
регулируются процессы лиганд-опосредуемого эндоцитоза и
рециклизации рецептора ЛГ. Имеются основания полагать, что
Org 43553 сравнительно слабо влияет на функциональную
активность β-аррестинов, о чем свидетельствует отсутствие
выраженного стимулирующего эффекта этого соединения на
каскад митогенактивируемых протеинкиназ и сравнительно
низкая интенсивность эндоцитоза рецепторов ЛГ. Вызываемая
соединением Org 43553 стимуляция его целевых мишеней –
фермента АЦ и зависимых от цАМФ транскрипционных
факторов, приводит к активации синтеза и секреции половых
стероидных гормонов в клетках-мишенях. При действии
соединения Org 43553 на первичную культуру клеток Лейдига
мыши наблюдается не только повышение в них уровня цАМФ, но
и значительное усиление продукции этими клетками
тестостерона (van de Lagemaat et al., 2009).
Соединение Org41841 и его аналоги, в том числе наиболее
активное соединение Org 43553, были использованы для
203
реконструкции аллостерического сайта, расположенного внутри
трансмембранного домена рецептора ЛГ, а также для изучения
конформации этого домена. Для этого использовали технологию
сайт-направленного мутагенеза и молекулярного докинга. При
использовании сайт-направленного мутагенеза аминокислотные
остатки, формирующие аллостерический сайт трансмембранного
домена рецептора ТТГ, заменяли соответствующими по
локализации аминокислотными остатками, локализованными в
тех же позициях рецептора ЛГ. Вследствие таких замен
аллостерический сайт рецептора ТТГ по структуре постепенно
приближался к таковому рецептора ЛГ. Следует отметить, что в
качестве мишеней сайт-направленного мутагенеза были избраны
только те аминокислотные остатки, которые различались в
рецепторах ТТГ и ЛГ и были локализованы в их второй ВП и в
пятой и шестой ТМС. Замена Leu570Phe во второй ВП рецептора
ТТГ приводила к связыванию соединения Org41841 с мутантным
рецептором со значением EC50, равным 800 нМ, в то время как
двойные замены Leu570Phe/Phe585Thr и Leu570Phe/Tyr643Phe – к
связыванию этого соединения со значением EC50, равным 1000
нМ. Одновременная замена девяти аминокислотных остатков
(Ile560Val и Leu570Phe во второй ВП, Prp577Thr, Ala579Ser, Leu580Gln,
Ala581Val и Phe585Thr в пятой ТМС, Tyr643Phe и Ile648Ala в шестой
ТМС), которые формируют аллостерический сайт,
локализованный в трансмембранном домене рецептора ТТГ, на
соответствующие аминокислотные остатки рецептора ЛГ,
приводила к мутантному рецептору, для которого соединение
Org41841, как и в случае рецептора ЛГ, характеризовалось
активностью аллостерического агониста. Максимальный
стимулирующий АЦ эффект соединения Org41841 при активации
им мутантного рецептора по величине был сопоставим с таковым
для ТТГ. Полученные данные указывают на важную роль
остатков Lуг570Phe, Phe585Thr и Tyr643Phe для формирования
гидрофобной поверхности расположенного в трансмембранном
домене аллостерического сайта рецептора ЛГ (Jaschke et al.,
2006).
204
Ключевым для взаимодействия с соединением Org41841
является отрицательно заряженный остаток Glu506,
локализованный в третьей ТМС и высококонсервативный в
большинстве GPCR, в том числе в рецепторах ЛГ и ТТГ. Его
замена на остаток аланина полностью блокировала связывание
соединения Org41841 с мутантным рецептором ЛГ и
предотвращала активацию им аденилатциклазной сигнальной
системы. Предполагается, что боковая отрицательно заряженная
карбоксильная группа глутаминовой кислоты образует солевой
мостик с положительно заряженной аминогруппой
низкомолекулярного аллостерического лиганда, обеспечивая его
эффективное связывание с рецептором (Jaschke et al., 2006; Moore
et al., 2006).
Дальнейшие исследования показали, что соединение Org
43553 активно не только in vitro, но и in vivo, причем оно было
эффективным как при парентеральных способах введения –
подкожном и внутрибрюшинном, так и при пероральном способе
доставки (van de Lagemaat et al., 2009, 2011a, 2011b; Gerrits et al.,
2013). Однократное пероральное введение соединения Org 43553
в дозе 50 мг/кг вызывало овуляцию у неполовозрелых мышей и
половозрелых крыс, причем подвергшиеся овуляции яйцеклетки
были хорошего качества, характеризовались высокой
фертильностью, при имплантации с высоким выходом давали
жизнеспособные эмбрионы. Пероральное введение соединения
Org 43553 в той же дозе самцам крыс вызывало у них усиление
стероидогенеза и повышение уровня тестостерона в крови (van de
Lagemaat et al., 2009). Высокая эффективность соединения Org
43553 при его пероральном введении свидетельствует о его
хорошем всасывании в желудочно-кишечном тракте и высокой
биодоступности при таком способе доставки. Биодоступность
Org 43553 при пероральном введении составила 79 % у крыс и 44
% у собак от таковой при парентеральных способах введения.
Поскольку пероральное введение является предпочтительным и
особенно ценно при использовании агонистов рецептора ЛГ во
вспомогательных репродуктивных технологиях, то
205
сопоставимость биодоступности при пероральных и
парентеральных способах доставки соединения Org 43553
является безусловным преимуществом тиенопиримидиновых
производных перед гонадотропинами, которые могут вводиться
только парентеральным способом.
Фармакокинетические исследования показали, что
соединение Org 43553 деградирует быстрее, чем гонадотропины
(van de Lagemaat et al., 2009). У крыс период полувыведения Org
43553 составил около 3 ч, в то время как у ХГЧ он достигал 6–7
ч. Снижение времени полувыведения имеет большое
практическое значение, поскольку позволяет уменьшить время
активации агонистами рецептора ЛГ тканей-мишеней. Это
предотвращает развитие резистентности к эндогенным
гонадотропинам, снижает риск развития синдрома
гиперстимуляции яичников, одного из наиболее опасных
осложнений при контролируемой индукции овуляции с помощью
ХГЧ и ЛГ, а также снижает онкогенные риски, связанные с
применением гонадотропинов.
Так установлено, что при однократной обработке
половозрелых крыс гонадотропинами наблюдается значительное
увеличение размеров яичников, повышается проницаемость
сосудов, наблюдается гиперсекреция клетками гранулезы
фактора роста эндотелия сосудов, что является характерными
чертами развития синдрома гиперстимуляции яичников. В то же
время, при однократном пероральном введении соединения Org
43553 самкам крыс размеры яичников и проницаемость сосудов в
них практически не менялись, причем даже многократная
обработка животных низкомолекулярным агонистом не
приводила к развитию синдрома гиперстимуляции яичников.
Причиной этого является то, что соединение Org 43553 не
вызывает повышения уровня фактора роста эндотелия сосудов,
индуктора повышения проницаемости сосудов (van de Lagemaat
et al., 2011b). Повышенные уровни фактора роста эндотелия
сосудов в тканях репродуктивной системы являются триггером
206
для развития злокачественных новообразований и способствуют
метастазированию уже имеющихся опухолей.
Успешные эксперименты с животными позволили
перейти к клиническим испытаниям соединения Org 43553, как
индуктора овуляции у женщин (Gerrits et al., 2013). После
перорального приема женщинами соединения Org 43553 в дозах
от 25 до 900 мг пик его концентрации достигался через 0.5–1 ч, а
период полувыведения составил 30–47 ч. В дозе 300 мг
соединение Org 43553 вызывало овуляцию у 83 % женщин
репродуктивного возраста, не оказывая при этом каких-либо
побочных эффектов. Как и в случае экспериментальных
животных, никаких признаков развития синдрома
гиперстимуляции яичников при приеме соединения Org 43553
выявлено не было, что свидетельствует о перспективности
низкомолекулярных аллостерических агонистов рецептора ЛГ –
тиенопиримидиновых производных, как индукторов овуляции в
условиях клиники.
Соединения Org41841 и Org43553 в настоящее время
запатентованы фирмой «Organon»/«Merck & Co/Merck Sharpe &
Dohme (MSD)» (Кенилворт, США), основным их разработчиком
(Heitman, Ijzerman, 2008). Способность тиенопиримидиновых
производных в клинических испытаниях повышать уровень
тестостерона и компенсировать дефицит андрогенов у мужчин
может быть использована для компенсации андрогенной
недостаточности, для коррекции гипогонадотропных состояний, а
также для увеличения объема и силы мышц у атлетов при
использовании этих препаратов в качестве анаболиков.
Интересно отметить, что в связи с таким спектром биологической
активности соединение Org 43553 и его аналоги еще на раннем
этапе их разработки были рекомендованы для внесения в список
контролируемых препаратов при анализе на допинг (Goebel,
2011).
Наряду с тиенопиримидиновыми производными,
биологической активностью аллостерических регуляторов
рецептора ЛГ обладают производные 1,3,5-пиразола и терфенила,
207
являющиеся как полными, так и инверсионными
аллостерическими агонистами рецептора ЛГ (Jorand-Lebrun et al.,
2007; Heitman et al., 2009, 2012). Среди производных терфенила
соединение LUF5771 эффективно подавляло стимуляцию
рецептора ЛГ как гонадотропинами, так и низкомолекулярными
агонистами. Это соединение в концентрации 10 мкМ в 3.3 раза
ускоряло скорость диссоциации соединения [3H]Org 43553 от
рецептора ЛГ, а также в 2–3 раза снижало стимулирующие
эффекты ХГЧ и Org 43553 на зависимые от ЛГ внутриклеточные
сигнальные каскады (Heitman et al., 2009, 2012). Полученные
данные указывают на то, что соединение LUF5771 и его аналоги
являются селективными аллостерическими инверсионными
агонистами рецептора ЛГ и могут быть использованы для
создания препаратов, которые снижают чувствительность клеток
репродуктивной системы к гонадотропинам, что важно для
контрацептивных технологий и для лечения гормонозависимых
опухолей репродуктивных тканей.
Производные пиразола, в том числе наиболее активное
среди них соединение 1 (рис. 5-2), характеризуются активностью
полных аллостерических агонистов рецептора ЛГ (Jorand-Lebrun
et al., 2007). Установлено, что соединение 1 стимулирует
активность АЦ (EC50, 20 нМ) и синтез тестостерона клетками
Лейдига в условиях in vitro (ED50, 1.31 мкМ), причем его
эффективность была сопоставимой с таковой ХГЧ. В условиях in
vivo при внутрибрюшинном введении самцам крыс соединение 1
в дозе 32 мг/кг повышало уровень тестостерона в крови. Как и
соединение Org43553, производное пиразола не конкурировало с
меченым гормоном [125I]-ХГЧ за места связывания с рецептором
ЛГ. Это свидетельствует в пользу взаимодействия производных
пиразола с аллостерическим сайтом рецептора ЛГ,
локализованным в его трансмембранном домене (Jorand-Lebrun et
al., 2007).
208
5.4. Современные достижения в разработке
тиенопиримидиновых аллостерических агонистов
рецептора лютеинизирующего гормона
Основываясь на фармакологических характеристиках

соединения Org 43553, нами разработана серия
тиенопиримидиновых производных, аналогов впервые
синтезированного нами в 2014 году соединения 5-амино-N-
(трет-бутил)-4-(3-(изоникотинамидо)фенил)-2-(метилтио)тиено
[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамида (TP01) (рис. 5-3).
Рис. 5-3. Структура тиенопиримидиновых производных и схема их

получения из 5-амино-4-(3-аминофенил)-N-(трет-бутил)-2-
(метилтио)тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамида.
R = 4-пиридил (соединение 1, TP01) или 3-тиенил (соединение 2, TP02).
209
Соединение TP01 было активным не только in vitro, но и

in vivo как стимулятор стероидогенеза при пероральном и
парентеральном способах введения самцам крыс (Деркач и др.,
2014а; Шпаков и др., 2014а, 2014б). Наряду с TP01, был
синтезирован его аналог – соединение 5-амино-N-(трет-бутил)-
2-(метилтио)-4-(3-(тиофен-3-карбоксамидо)фенил)тиено [2,3-
d]пиримидин-6-карбоксамид (TP02) (рис. 5-3). Соединение TP02
было активным in vitro и при интратестикулярном введении
самцам крыс (Деркач и др., 2014; Шпаков и др., 2014а, 2014б).
Однако оно было лишено активности при внутрибрюшинном и
пероральном введении, что может быть обусловлено
неспособностью соединения TP02 эффективно преодолевать
гематотестикулярный барьер для взаимодействия с рецепторами
ЛГ, локализованными в клетках Лейдига, и(или) его быстрой
деградацией в кровяном русле (Деркач и др., 2014).
В экспериментах in vitro показано, что соединения TP01 и
TP02 в микромолярных концентрациях стимулировали
базальную активность АЦ во фракциях плазматических мембран,
выделенных из семенников и яичников крыс линии Wistar,
причем соединение TP02 было более активным в сравнении с
TP01. Значения EC50 для стимулирующих АЦ эффектов TP01 и
TP02 составили 1.05–1.12 мкМ и 280–365 нМ, соответственно.
Соединения TP01 и TP02 повышали базальный уровень ГТФ-
связывания гетеротримерных G-белков в мембранах, выделенных
из семенников и яичников крыс (Шпаков и др., 2014а). Важно
отметить, что стимулирующий эффект гонадотропина (ХГЧ) на
активность АЦ в присутствии соединений TP01 и TP02
сохранялся, а при низких, ненасыщающих, концентрациях
гонадотропина отмечали отчетливо выраженную аддитивность
эффектов ХГЧ и тиенопиримидиновых производных. Это
является еще одним свидетельством несовпадения
аллостерического и ортостерического сайтов в рецепторе ЛГ и
обусловлено отсутствием конкуренции между гонадотропинами
210
и тиенопиримидиновыми производными за места связывания на
молекуле рецептора ЛГ (Шпаков и др., 2014б).
В экспериментах in vivo через 3 и 5 ч после
внутрибрюшинного введения TP01 в дозе 15 мг/кг уровень
тестостерона в крови самцов крыс повышался на 83 и 339 %, при
использовании TP01 в дозе 27 мг/кг на 134 и 325 %,
соответственно. При сравнении стимулирующих эффектов TP01
и ХГЧ на уровень тестостерона у самцов крыс было обнаружено,
что через 3 ч после введения TP01 в дозах 15 и 27 мг/кг прирост
концентрации тестостерона составил 13 и 21 % от такового в
случае ХГЧ (250 МЕ/крысу). При этом стимулирующий эффект
TP01 на продукцию тестостерона был более пролонгирован, чем
в случае ХГЧ. Через 5 ч после инъекции TP01 прирост
концентрации тестостерона составил 44–46 % от такового в
случае ХГЧ, что свидетельствует о сопоставимости
стероидогенной активности тиенопиримидинового производного
и ХГЧ в более отставленные сроки после их введения (Деркач и
др., 2014). Исключительно важным представляется тот факт, что
соединение TP01 было активным при пероральном способе
введения – в дозе 50 мг/кг оно вызывало повышение уровня
тестостерона на 230 (через 3 ч) и 417 % (через 5 ч).
В дальнейшем были разработаны и синтезированы более
20 новых тиенопиримидиновых производных, наделенных
активностью низкомолекулярных агонистов рецептора ЛГ
(Деркач и др., 2016а, 2016б). Высоко активными среди них были
соединения TP21, TP22 и TP23, являющиеся аналогами
соединения TP01 и имеющие замены остатка изоникотиновой
кислоты в его варьируемой части на остатки 2-
метоксиникотиновой (TP21), N-оксид-изоникотиновой (TP22) и
2-хлорникотиновой (TP23) кислот (рис. 5-4). Соединение TP23 не
уступало по активности соединению TP01, что указывает на
эффективность введения остатка 2-хлорникотиновой кислоты в
качестве бокового заместителя в структуру
тиенопиримидинового производного (Деркач и др., 2016б).
211
TP21 TP22
TP23 TP03
TP04
Рис. 5-4. Структура тиенопиримидиновых производных с активностью
аллостерических агонистов рецептора ЛГ.
TP21 – 5-амино-N-(трет-бутил)-4-(3-(2-метоксиникотинамидо)фенил)-
2-(метилтио)тиено[2,3-d]пиримидин-6-карбоксамид, TP22 – 4-((3-(5-
амино-6-(трет-бутилкарбамоил)-2-(метилтио)тиено[2,3-d]пиримидин-
4-ил)фенил)карбамоил)пиридин 1-оксид, TP23 – 5-амино-N-(трет-
бутил)-4-(3-(2-хлорникотинамидо)фенил)-2-(метилтио)тиено[2,3-
d]пиримидин-6-карбоксамид, TP03 – 5-амино-N-трет-бутил-2-
(метилсульфанил)-4-(3-(никотинамидо)фенил)тиено[2,3-d]пиримидин-6-
карбоксамид, TP04 – 5-амино-N-трет-бутил-4-(3-(1-метил-1H-пиразол-
4-карбоксамидо)фенил)-2-(метилсульфанил)тиено[2,3-d]пиримидин-6-
карбоксамид.
212
Соединения TP21, TP22 и TP23 в микромолярных

концентрациях повышали базальную активность АЦ во фракциях
тестикулярных мембран крыс со значениями EC50 1556, 358 и 372
нМ, причем в концентрации 10-4 М они повышали активность АЦ
на 84, 70 и 149 %, соответственно (Деркач и др., 2016б). При
совместном применении ХГЧ (10-8 М) с соединениями TP21,
TP22 и TP23 (10-4 М) стимулирующий АЦ эффект гонадотропина
сохранялся. В то же время при низкой концентрации ХГЧ (10-10
М), как и в случае TP01 и TP02, была выявлена аддитивность
стимулирующих эффектов гонадотропина и соединений TP21,
TP22 и TP23.
Соединение TP23 с большей эффективностью в сравнении
с соединениями TP21 и TP22 повышало уровень тестостерона
при интратестикулярном и внутрибрюшинном введении самцам
крыс. Однако при интратестикулярном введении TP23 отмечали
усиление его стимулирующего эффекта на продукцию
тестостерона в течение 5 ч, в то время как при внутрибрюшинном
введении этот эффект достигал максимума через 1 ч и затем,
через 3 и 5 ч, начинал снижаться. Приведенная динамика
изменения стероидогенного эффекта TP23 на продукцию
тестостерона существенно отличается от той, которая была
получена для соединения TP01. В то же время динамика
изменения стимулирующего эффекта TP21 и TP22 на продукцию
тестостерона была близка к таковой для TP01. Одной из причин
выявленных различий в динамике стероидогенного эффекта TP23
в сравнении с TP01, TP21 и TP22 является высокая активность
атома хлора в остатке 2-хлорникотиновой кислоты. Это может
вызывать гидролиз и модификацию соединения TP23 в кровотоке
при его внутрибрюшинном введении. В структуре соединений
TP01, TP21 и TP22 высоко реакционноспособные группы
отсутствуют, что обеспечивает им большую стабильность в
биологических жидкостях (Деркач и др., 2016б).
213
Наибольший интерес среди синтезированных
тиенопиримидиновых производных представляют соединения
TP03 и TP04 (рис. 5-4), которые детально изучены в условиях in
vitro и in vivo (Деркач и др., 2016а). Они с высокой
эффективностью стимулировали активность АЦ в тестикулярных
и овариальных мембранах крыс, причем их стимулирующие
эффекты характеризовались частичной аддитивностью с
таковыми ХГЧ, но при этом не влияли на активность АЦ в
клетках, где отсутствуют рецепторы ЛГ. На примере TP03 были:
(1) изучена специфичность тиенопиримидиновых производных в
отношении определенного типа G-белков и конкретного
внутриклеточного сигнального каскада, (2) сопоставлена
эффективность стероидогенного действия гонадотропинов и
тиенопиримидиновых производных при их однократном и
длительном (до семи дней) введении самцам крыс, (3)
исследовано влияние тиенопиримидиновых производных на
экспрессию основных ферментов стероидогенеза и
транспортного белка StAR, осуществляющего перенос
холестерина в митохондрии, а также на экспрессию рецептора
ЛГ, влияющую на чувствительность тканей-мишеней к
эндогенным гонадотропинам, (4) оценена аддитивность
стероидогенных эффектов ХГЧ и тиенопиримидиновых
производных при их совместном введении самцам крыс, а также
(5) изучены терапевтические эффекты тиенопиримидиновых
производных при лечении ими самцов крыс с возрастным
ослаблением стероидогенной функции, а также со среднетяжелой
формой сахарного диабета 1-го типа с характерным для нее
андрогенным дефицитом. Необходимо отметить, что TP03, как и
большинство других тиенопиримидиновых производных, активен
при пероральном способе введения, что выгодно отличает его от
гонадотропинов и является одним из факторов, хотя и не
единственным, для внедрения низкомолекулярных
аллостерических лигандов рецептора ЛГ в клиническую
практику.
214
5.4.1. Селективность регуляторного действия
тиенопиримидиновых производных на внутриклеточные
каскады
Как отмечалось выше, в 2008 году при изучении

соединения Org 43553 голландскими учеными было установлено,
что оно селективно стимулирует активность АЦ и повышает
уровень цАМФ внутри клеток-мишеней, слабо влияя на
активность фосфолипазы Сβ и митогенактивируемых
протеинкиназ (van Koppen et al., 2008). Нами с использованием
TP03 получены дополнительные доказательства специфичности
действия низкомолекулярных агонистов рецептора ЛГ на
внутриклеточные сигнальные каскады (Деркач и др., 2017). Для
оценки специфичности активирующего действия TP03 на
различные типы G-белков были использованы бактериальные
токсины – холерный и коклюшный, и С-концевой пептид 349–359
αq/11-субъединицы Gq/11-белка. Инкубация мембран с холерным
токсином выключает из сигнальной трансдукции Gs-белки, что
обусловлено АДФ-рибозилированием их αs-субъединицы по
остатку Arg189. Результатом является потеря способности этой
субъединицы вызывать гидролиз ГТФ и, как следствие, переход
Gs-белка в перманентно активированное состояние, в котором он
не чувствителен к гормональной стимуляции. Инкубация с
коклюшным токсином ингибирует Gi/o-белки, вследствие АДФ-
рибозилирования остатка цистеина, расположенного в С-
концевом сегменте αi/o-субъединицы, ответственном за
взаимодействие с рецептором (Gudermann et al., 1996). Пептид
349–359 конкурирует с С-концевым участком αq/11-субъединицы
Gq/11-белка за связывание с лиганд-активированным рецептором,
подавляя активность Gq/11-зависимых сигнальных каскадов
(Chillar et al., 2010).
Селективное выключение Gs-белков при обработке
мембран холерным токсином и конкурентное ингибирование
Gq/11-белков с помощью пептида 349–359 αq/11-субъединицы
позволили нам подтвердить тот факт, что TP03 в семенниках и
215
яичниках активирует преимущественно Gs-белки. Показано, что
при обработке мембран холерным токсином стимулирующие
эффекты TP03 на активность АЦ и ГТФ-связывание
гетеротримерных G-белков подавлялись. Необходимо отметить,
что в случае ингибирования холерным токсином
стимулирующего эффекта TP03 на ГТФ-связывание отмечали
полное блокирование этого эффекта при низкой концентрации
TP03 (10-6 М) и частичное ингибирование при более высокой его
концентрации (10-4 М). Эти данные свидетельствуют о том, что
основной пул G-белков, активируемых TP03 в концентрации 10-6
М, составляют Gs-белки, активирующие АЦ, в то время как в
концентрации 10-4 М специфичность TP03 в отношении G-белков
снижается и начинает выявляться его стимулирующий эффект в
отношении других их типов, нечувствительных к холерному
токсину. При действии ХГЧ на обработанные холерным
токсином мембраны семенников и яичников отмечали
исчезновение его стимулирующего эффекта на активность АЦ, и
лишь частичное ингибирование (в среднем на 45–46 %)
соответствующего эффекта на ГТФ-связывание G-белков (Деркач
и др., 2017).
Обработка коклюшным токсином мембран, выделенных
из семенников и яичников крыс, слабо влияла на стимулирующие
эффекты TP03 и ХГЧ на активность АЦ и ГТФ-связывание, что
свидетельствует о незначительном вкладе сопряжения рецептора
ЛГ с Gi/o-белками в трансдукцию сигналов, генерируемых
гонадотропинами и тиенопиримидиновыми производными в
репродуктивных тканях. С помощью пептида 349–359 было
показано, что неполное ингибирование стимулирующего эффекта
высоких концентраций TP03 в мембранах, обработанных
холерным токсином, связано с активацией Gq/11-белков. Пептид
не влиял на стимулирующий АЦ эффект TP03, но в небольшой
степени снижал соответствующий эффект этого
низкомолекулярного агониста на ГТФ-связывание.
Стимулирующий эффект ХГЧ на ГТФ-связывание ослаблялся в
гораздо большей степени – на 34 и 45% в тестикулярных и
216
овариальных мембранах, соответственно, что согласуется с тем
фактом, что мишенями действия ХГЧ в одинаковой степени
являются Gs- и Gq/11-белки. Таким образом, только в относительно
высокой концентрации, которая на два порядка превосходит
значение EC50 для стимулирующего АЦ эффекта TP03,
выявляется, хотя и слабо выраженная, способность
тиенопиримидинового производного активировать Gq/11-белки
(Деркач и др., 2017).
Следует обратить внимание на тот факт, что часть
синтезированных и изученных нами тиенопиримидиновых
производных либо не активировали аденилатциклазную систему
и ферменты стероидогенеза, либо характеризовались низкой
активностью и, в конечном итоге, были выведены из
дальнейшего анализа. При этом имеются основания полагать, что
эти «неактивные» аллостерические лиганды способны
стимулировать независимые от Gs-белков сигнальные каскады,
включающие Gq/11-белки и β-аррестины. Учитывая, что эти
каскады вовлечены в регуляцию процессов роста и
дифференцировки клеток репродуктивной системы, а также
отвечают за рециклизацию рецепторов ЛГ, они также могут
найти применение в медицине, и требуют дальнейшего изучения
(Деркач и др., 2017).
5.4.2. Устойчивость стероидогенного эффекта

тиенопиримидинов in vivo
В рамках исследования стероидогенного эффекта TP03 и

ХГЧ при их длительном, семидневном, введении самцам крыс
изучали динамику изменения уровня тестостерона и активность
системы стероидогенеза (Бахтюков и др., 2019б) (рис. 5-5).
217
Тестостерон, нМ
*
180
160
*
140
*
120
*
100
* * 3
80
2
60
*
*
40 *
* * *
20 1
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Дни обработки
Рис. 5-5. Влияние семидневной обработки самцов крыс с помощью

ХГЧ или TP03 на уровень тестостерона в крови животных.
1 – контроль, 2 – ХГЧ (100 МЕ/крысу/сут, п/к), 3 – TP03 (15
мг/кг/сут, в/б). Уровни тестостерона оценивали через 3 ч после
введения препаратов (в 14.00). Препараты вводили в 11.00. * -
различия с контролем статистически значимы при p<0.05. Значения
представлены, как M  SEM, n=5 (Бахтюков и др., 2019б).
Показано, что ХГЧ и TP03, начиная с первого дня

обработки, достоверно повышали уровень тестостерона, но
динамика изменения их стимулирующего эффекта на
стероидогенез заметно различалась. При обработке крыс ХГЧ в
первый день прирост концентрации тестостерона был
максимальным, составив 158±15 нМ, затем снижался, вновь
повышался на пятый день, хотя и в существенно меньшей
степени, и впоследствии опять ослабевал (рис. 5-5). В свою
218
очередь, стимулирующий эффект TP03 менялся не столь
значительно, постепенно повышаясь и достигая максимума в
последний, седьмой день эксперимента. Если в первый день
обработки прирост концентрации тестостерона, вызываемый
TP03, был в 4 раза ниже такового для ХГЧ, то к концу
эксперимента стероидогенные эффекты ХГЧ и TP03 становились
сопоставимыми. Полученные результаты указывают на то, что
при однократном введении стимулирующий продукцию
тестостерона эффект TP03 ниже, чем в случае ХГЧ, в то время
как при длительном введении вследствие его усиления различия в
стероидогенной активности между TP03 и ХГЧ нивелируются
(рис. 5-5) (Бахтюков и др., 2019б).
Одной из причин различий стероидогенной активности
TP03 и ХГЧ при длительном введении препаратов могут быть
специфичные изменения чувствительности к ним рецептора ЛГ,
на что указывают наши данные о влиянии ХГЧ и TP03 на
экспрессию гена Lhr, кодирующего рецептор ЛГ в семенниках
крыс. После однократного введения ХГЧ отмечается двукратное
снижение экспрессии гена Lhr, причем сниженный уровень
сохраняется на протяжении всего курса введения гонадотропина
(рис. 5-6) (Бахтюков и др., 2019б). В случае TP03 после
однократного введения отмечали слабо выраженную тенденцию
к снижению экспрессии гена Lhr, в то время как через 7 дней она
парадоксально повышалась в 3 раза (рис. 5-6).
Полученные результаты указывают на значительное
ослабление экспрессии гена Lhr в семенниках крыс при их
обработке ХГЧ, что ведет к развитию резистентности клеток
Лейдига к гонадотропинам с ЛГ-активностью. В то же время
обработка TP03 не только сохраняет, но при длительном
введении усиливает экспрессию гена Lhr, сохраняя
чувствительность семенников к агонистам рецептора ЛГ, что
хорошо согласуется с изменениями стероидогенного эффекта
TP03 при его введении крысам. Необходимо отметить, что
развитие резистентности гонад к действию гонадотропинов
является одной из ключевых проблем при их применении для
219
лечения репродуктивных дисфункций и во вспомогательных
репродуктивных технологиях (Banker, Garcia-Velasco, 2015;
Riccetti et al., 2017b).
Результатом TP03-опосредованной стимуляции
активности аденилатциклазной сигнальной системы в клетках
семенников и яичников является повышение в них активности
StAR-белка (steroidogenic acute regulatory protein), который
отвечает за первую, скорость-лимитирующую стадию синтеза
тестостерона и других стероидных гормонов – транспорт
холестерина из внутриклеточных депо в митохондрии. Уже в
митохондриях под влиянием цитохрома P450scc (C27 cholesterol
side-chain cleavage cytochrome P450) холестерин превращается в
прегненолон (Aghazadeh et al., 2015; Бахтюков, Шпаков, 2016).
Далее прегненолон переносится в эндоплазматический
ретикулум, где стероидогенные ферменты – 3β-
гидроксистероиддегидрогеназа (3β-HSD), цитохром Р450-17α с
активностью 17α-гидроксилазы и С17,20-лиазы и 17β-
гидроксистероиддегидрогеназа (17β-HSD) сначала превращают
его в прогестерон, затем в 17-гидроксипрогестерон,
андростендион и тестостерон. Следует отметить, что активность
белка StAR и стероидогенных ферментов контролируется в
основном через посредство аденилатциклазной системы, в то
время как экспрессия генов, кодирующих стероидогенные белки,
может регулироваться как через цАМФ-зависимые механизмы,
так и через посредство стимуляции митогенактивируемых
протеинкиназ ERK1/2 и p38, которые, так же как и АЦ, являются
мишенями гонадотропинов (Payne, Hales, 2004; Sokanovic et al.,
2014, 2018).
В условиях семидневной обработки оба препарата, ХГЧ
(п/к, 100 МЕ/крысу) и TP03 (в/б, 15 мг/кг), стимулировали
экспрессию гена Star в семенниках крыс, причем этот эффект
наблюдался во все дни обработки, но в случае ХГЧ был выражен
в среднем в 3–5 раз сильнее, чем в случае TP03 (рис. 5-6)
(Бахтюков и др., 2019б).
220
RQ, отн.ед.
8 *
а
7
1
2
6 3 *
*
4
5
4 *
*
2 *
1 ***
*
0
Lhr Star Cyp11a1 Hsd3b
RQ, отн.ед.
8
б
7
1
2
6 3
4
5
4 *
*
3
*
2
0
Lhr Star Cyp11a1 Hsd3b
221
Рис. 5-6. Влияние однократной, трехдневной и семидневной обработки
самцов крыс с помощью ХГЧ (а) и TP03 (б) на экспрессию генов Lhr,
Star, Cyp11a1 и Hsd3b, кодирующих рецептор ЛГ и стероидогенные
белки, в семенниках животных.
1 – без обработки, 2 – однократное введение, 3 – введение в течение 3
дней, 4 – введение в течение 7 дней. Уровень экспрессии мРНК генов
нормировали по уровню экспрессии мРНК генов Gapdh и Actb,
кодирующих глицеральдегидфосфатдегидрогеназу и β-актин. Значения
RQ рассчитаны по отношению к контрольной группе. * - различия с
контролем статистически значимы при p<0.05. Значения
представлены, как M  SEM. n=5. (Бахтюков и др., 2019б).
Была выявлена следующая закономерность: чем в

большей степени снижалась экспрессия гена Lhr и
стимулирующий эффект препарата на продукцию тестостерона,
тем в большей степени повышалась экспрессия гена Star. Это
может указывать на компенсаторный характер повышения
экспрессии гена Star в клетках Лейдига при ослаблении передачи
в них гонадотропинового сигнала и снижении стимулирующего
влияния протеинкиназы А на активность белка StAR. Повышение
экспрессии гена Star при воздействии высоких доз ХГЧ на клетки
Лейдига в условиях in vitro отмечали и другие авторы (Lejeune et
al., 1998).
В условиях длительного воздействия ХГЧ существенно
повышалась экспрессия гена Cyp11a1, кодирующего цитохром
Р450scc, а на седьмой день отмечали статистически значимое
повышение экспрессии гена Hsd3b (рис. 5-6) (Бахтюков и др.,
2019б). Все эти изменения также являются составляющими
компенсаторной реакции, развивающейся в условиях развития
гонадотропин-индуцированной резистентности клеток Лейдига к
гонадотропинам и ослабления стимулируемых ими сигнальных
каскадов, мишенями которых являются цитохром Р450scc и
дегидрогеназа 3β-HSD (Payne, Hales, 2004; Aghazadeh et al., 2015).
Наряду с этим в первый день обработки гонадотропином было
выявлено снижение на 67% экспрессии гена Hsd3b. Снижение
экспрессии дегидрогеназы 3β-HSD под действием высоких доз
222
ХГЧ ранее было показано другими авторами в культуре клеток
Лейдига (Tang et al., 1998). Примечательно, что при
использовании TP03 не было отмечено изменений экспрессии
генов, кодирующих цитохром Р450scc и дегидрогеназу 3β-HSD
(рис. 5-6) (Бахтюков и др., 2019б). Это свидетельствует о более
мягком воздействии низкомолекулярных агонистов рецептора ЛГ
на паттерн экспрессии генов стероидогенных ферментов.
5.4.3. Аддитивность и синергизм стероидогенных эффектов

тиенопиримидинов и гонадотропинов
Поскольку стероидогенные эффекты ХГЧ и TP03 дозо-

зависимы, то снижение их доз приводит к ослаблению
стимулированной ими продукции тестостерона при введении
самцам крыс. Так, например, через 3 ч после обработки
животных с помощью ХГЧ в дозе 50 МЕ/крысу прирост
концентрации тестостерона составил 52±5 нМ, что на 53% ниже,
чем при использовании дозы 100 МЕ/крысу. В свою очередь, при
использовании доз TP03 15 и 7.5 мг/кг прирост концентрации
тестостерона через 3 ч после введения препаратов снижался, в
сравнении с дозой 25 мг/кг, на 20 и 63% (Шпаков и др., 2019).
Поскольку применение высоких доз ХГЧ неизбежно снижает
экспрессию рецептора ЛГ и провоцирует развитие
резистентности клеток-мишеней к эндогенным гонадотропинам,
ослабляя в них стероидогенез, то одной из актуальных задач
клинической эндокринологии и репродуктологии является поиск
условий для усиления или, по крайней мере, сохранения
стероидогенного эффекта гонадотропинов при использовании их
сниженных доз. Одним из возможных путей здесь является
совместное применение гонадотропинов и тиенопиримидинов,
что и было продемонстрировано нами на примере TP03.
Для оценки потенцирования стероидогенного эффекта
ХГЧ в дозе 50 МЕ/крысу изучали влияние на эффект
гонадотропина предварительной обработки самцов крыс с
помощью TP03 в дозах 7.5, 15 и 25 мг/кг. Соединение TP03
223
вводили за 1 ч до введения гонадотропина, чтобы обеспечить
достижение этим гидрофобным соединением клеток Лейдига и
позволить ему эффективно связаться с локализованными на их
поверхности рецепторами ЛГ. Установлено, что у крыс,
предварительно обработанных всеми исследованными дозами
TP03, стимулирующий эффект ХГЧ на продукцию тестостерона
усиливался, причем через 1 ч после введения ХГЧ
потенцирующий эффект тиенопиримидина на стероидогенную
активность гонадотропина был выражен в большей степени, чем
через 3 ч (рис. 5-7) (Шпаков и др., 2019). Это указывает на то, что
TP03 меняет динамику развития стимулирующего эффекта ХГЧ,
в меньшей степени влияя на его максимальный стероидогенный
эффект. Несмотря на значительные различия в эффективности
влияния доз 7.5 и 15 мг/кг TP03 на уровень тестостерона, обе
дозы демонстрировали сходную эффективность в отношении
усиления стероидогенного эффекта ХГЧ (рис. 5-7). Это может
быть обусловлено тем, что в основе усиливающего действия TP03
лежит не только и не столько независимая активация рецепторов
ЛГ гонадотропином и тиенопиримидином, а в большей степени
TP03-опосредованное потенцирование стероидогенного эффекта
ХГЧ, которое наиболее отчетливо прослеживается при
использовании низкой дозы TP03 (Шпаков и др., 2019).
224
90 1
2
80
3
70 4
5
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4
Время, ч
Рис. 5-7. Стимулирующий эффект ХГЧ на уровень тестостерона в

крови крыс и влияние на него предварительной обработки животных
TP03.
1 – контроль; 2 – ХГЧ, 50 МЕ/крысу; 3 – ХГЧ+TP03, 7.5 мг/кг; 4 –
ХГЧ+TP03, 15 мг/кг; 5 – ХГЧ+TP03, 25 мг/кг. Время указано с
момента введения TP03 или его растворителя (контроль), ХГЧ вводили
через 1 ч после введения TP03. M±SD, n=5 (Шпаков и др., 2019).
В семенниках крыс, обработанных последовательно TP03

и ХГЧ, экспрессия гена Hsd3b, кодирующего 3β-дегидрогеназу,
которая катализирует синтез прогестерона, снижалась в два раза
по сравнению с таковой у крыс без обработки TP03. Экспрессия
генов Star и Cyp17a1, кодирующих транспортный белок StAR и
цитохром Р450-17α, который катализирует превращение
прогестерона в андростендион, повышалась под влиянием ХГЧ,
хотя и в различной степени, причем как у крыс, предварительно
обработанных TP03, так и без такой обработки. Эти данные
свидетельствуют о том, что после предварительной обработки
крыс различными дозами TP03 паттерн ХГЧ-индуцированной
регуляции экспрессии генов стероидогенеза в семенниках крыс
225
менялся избирательно и в основном затрагивал экспрессию гена
3β-дегидрогеназы. Известно, что при длительном введении
высоких доз ХГЧ экспрессия гена рецептора ЛГ снижается, что
связано со снижением чувствительности к гонадотропину тканей-
мишеней (van de Lagemaat et al., 2011b; Riccetti et al., 2017b). В
нашем случае, через 3 ч после обработки крыс, которым
предварительно вводили TP03, с помощью ХГЧ в дозе 50
МЕ/крысу экспрессия гена Lhr существенно не менялась, что
указывает на сохранение чувствительности тканей семенников у
TP03-обработаных самцов крыс к ЛГ и ХГЧ (Шпаков и др., 2019).
Одним из предполагаемых механизмов потенцирующего
действия TP03 может являться его функционирование как
низкомолекулярного шаперона рецептора ЛГ. Известно, что
гидрофобные низкомолекулярные агонисты рецептора ЛГ
способны преодолевать плазматическую мембрану и связываться
с еще «незрелыми» формами рецептора ЛГ, расположенными
внутри клетки (Newton et al., 2011). Это не только приводит к
стабилизации структуры рецептора, но и способствует его
транслокации в мембрану, повышая чувствительность клеток
Лейдига к гонадотропинам (подробнее см. раздел 5.5).
5.4.4. Влияние тиенопиримидинов на стероидогенную

функцию в условиях сахарного диабета и при старении
Среднюю по тяжести форму сахарного диабета 1-го типа

у самцов крыс Wistar вызывали однократным введением им
стрептозотоцина (в/б) в дозе 40 мг/кг, после чего через пять
недель у них развивались гипергликемия и гипоинсулинемия, а
также отмечались выраженные признаки андрогенного дефицита.
Значение AUC9.00-15.00 для интегрированной площади под
кривыми «концентрация тестостерона(нМ)–время(ч)» у
диабетических крыс составило всего 34% от такового в контроле.
Однократная обработка контрольных и диабетических крыс с
помощью ХГЧ и TP03 повышала у них уровни тестостерона в
крови, причем стероидогенный эффект обоих препаратов в
226
диабетической группе был существенно ниже, чем в
контрольной, на что указывает снижение значений AUC9.00-15.00
для кривых «концентрация тестостерона(нМ)–время(ч)» у
диабетических животных, обработанных ХГЧ и TP03 (рис. 5-8).
Значения AUC9.00-15.00 в группах контрольных крыс, обработанных
ХГЧ и TP03, составили 546±105 и 224±55 усл. ед., в то время как
в группах диабетических животных, подвергнутых той же
обработке – 183±39 и 117±34 усл. ед., что на 66 и 48% ниже, чем
в соответствующих контрольных группах. Уровни тестостерона
во всех временных точках при обработке диабетических крыс
ХГЧ и TP03 статистически значимо отличались от таковых в
группах контрольных крыс с обработкой ХГЧ и TP03 (рис. 5-8)
(Бахтюков и др., 2019а).
У контрольных животных в пятый день обработки
гонадотропином, через 3 ч после его введения, стимулирующий
эффект ХГЧ на продукцию тестостерона снижался в сравнении с
таковым в первый день обработки, в то время как
соответствующий эффект TP03 не менялся (рис. 5-9) (Бахтюков и
др., 2019а). В группе диабетических крыс, которых пять дней
обрабатывали ХГЧ, стероидогенный эффект гонадотропина
менялся в незначительной степени, оставаясь существенно ниже
такового у получавших ХГЧ контрольных животных. В группе
диабетических животных с обработкой TP03 стероидогенный
эффект низкомолекулярного агониста, оцениваемый по приросту
уровня тестостерона в сравнении с диабетической группой без
обработки, повышался в среднем в два раза и был сопоставим с
таковым у контрольных крыс с обработкой тиенопиримидином
(рис. 5-9). Таким образом, в отличие от ХГЧ, стимулирующий
эффект TP03 на продукцию тестостерона при его длительном
введении крысам с сахарным диабетом 1-го типа возрастал, чего
не наблюдалось у контрольных животных, и это указывает на
кумулятивность стероидогенного эффекта этого
низкомолекулярного агониста в условиях диабетической
патологии (Бахтюков и др., 2019а).
227
В семенниках крыс, после 5 дней обработки ХГЧ и ТП03,
оценивали экспрессию генов, кодирующих рецептор ЛГ (Lhr),
транспортный белок StAR (Star), цитохром Р450scc (Cyp11a1), 3β-
гидроксистероиддегидрогеназу 3β-HSD (Hsd3b), цитохром Р450-
17α (Cyp17a1) и 17β-гидроксистероиддегидрогеназу 17β-HSD
(Hsd17b). В семенниках крыс с сахарным диабетом 1-го типа
экспрессия генов Lhr и Star в сравнении с контрольными
животными статистически значимо снижалась, в то время как
экспрессия генов, кодирующих ферменты стероидогенеза,
существенно не менялась (рис. 5-10) (Бахтюков и др., 2019а).
180
К
160 КГ
КТ
140 Д
ДГ
120
ДТ
100
80
60
* *
40
* *
20 *
0
* * *
9.00 11.00 13.00 15.00
Время суток
Рис. 5-8. Стимулирующий эффект ХГЧ и TP03 на уровень

тестостерона в крови контрольных и диабетических крыс при
однократном введении препаратов.
К – контроль; КГ – контроль + ХГЧ; КТ – контроль + TP03, Д – диабет;
ДГ – диабет + ХГЧ; ДТ – диабет + TP03. M ± SD, * - P < 0.05 в
сравнении с контролем (Бахтюков и др., 2019а).
228
*
140
120
100
* #
80 @
#
60
40
20
0
К КГ КТ Д ДГ ДТ
Рис. 5-9. Уровни тестостерона через 3 ч после обработки контрольных

и диабетических крыс с помощью ХГЧ и TP03 в пятый день
эксперимента.
К – контроль; КГ – контроль, обработанный ХГЧ; КТ – контроль,
обработанный TP03; Д – диабетические крысы; ДГ – диабетические
крысы, обработанные ХГЧ; ДТ – диабетические крысы, обработанные
TP03.
Различия между контролем и группами КГ и КТ (*), между группой Д
и группами ДГ и ДТ (#), а также между группами КГ и ДГ (@)
статистически значимы при P<0.05. Данные представлены как M ± SD,
n=5. (Бахтюков и др., 2019а).
229
*
8
К
7 КГ *
КТ
Д
6
ДГ @
ДТ @ #
RQ, отн.ед.
5
# *
4 @
*
*
* #
* #@ @
3 #
* *
* #
* * *
2 @
@
@
@
1 *# * *
*
*
0
Lhr Star Cyp11a Hsd3b Cyp17a Hsd17b
Рис. 5-10. Экспрессия генов Lhr, Star, Cyp11a, Hsd3b, Cyp17a и Hsd7b в
семенниках контрольных и диабетических крыс и влияние на нее
пятидневной обработки с помощью ХГЧ и TP03.
К – контроль; КГ – контроль + ХГЧ; КТ – контроль + TP03, Д – диабет;
ДГ – диабет + ХГЧ; ДТ – диабет + TP03. Различия между контролем и
другими группами (*), между группой Д и группами ДГ и ДТ (#), а
также между группами КГ и ДГ или КТ и ДТ (@) статистически
значимы при P<0.05. Данные представлены как M ± SD (Бахтюков и
др., 2019а).
Обработка ХГЧ контрольных крыс снижала экспрессию

генов Lhr и Hsd7b и при этом в значительной степени повышала
экспрессию других изучаемых генов. В условиях диабета
стимулирующий эффект ХГЧ на экспрессию генов Star, Cyp11a и
Cyp17a сохранялся, но был выражен в меньшей степени в
сравнении с контролем, в то время как соответствующий эффект
ХГЧ на экспрессию гена Hsd3b усиливался с 62 до 240%. При
этом у диабетических крыс с обработкой ХГЧ не было выявлено
ингибирующего эффекта ХГЧ на экспрессию гена дегидрогеназы
230
17β-HSD. У диабетических крыс, получавших ХГЧ, в
значительной степени подавлялась экспрессия гена Lhr, которая
составила 11 и 16% от ее уровня в контрольной и диабетической
группах (рис. 5-10) (Бахтюков и др., 2019а).
Обработка TP03 контрольных крыс повышала экспрессию
генов, кодирующих белок StAR и цитохром Р450-17α, слабо
влияя на экспрессию других ферментов стероидогенеза. При этом
TP03 в 2.5 раза повышал экспрессию гена Lhr, вызывая эффект,
противоположный таковому ХГЧ. У диабетических крыс,
получавших тиенопиримидин, также не было выявлено снижения
экспрессии гена Lhr, которая имела тенденцию к повышению и
не отличалась от этого показателя в контроле. При диабете
стимулирующие эффекты TP03 на экспрессию генов Star и
Cyp17a снижались, в то время как экспрессия гена Hsd3b
повышалась (рис. 5-10). Полученные данные свидетельствуют о
том, что изменения экспрессии генов стероидогенных белков при
обработке контрольных и диабетических крыс с помощью ХГЧ и
TP03 в значительной степени зависят от природы агониста
рецептора ЛГ (Бахтюков и др., 2019а).
Таким образом, по результатам сравнительного изучения
стероидогенной активности гонадотропинов с ЛГ-активностью и
низкомолекулярных агонистов рецептора ЛГ могут быть сделаны
следующие выводы. В условиях сахарного диабета 1-го типа в
значительной степени ослабляются стероидогенные эффекты
однократно вводимых ХГЧ и TP03, причем эффект ХГЧ в этом
случае существенно превышает таковой низкомолекулярного
агониста. При пятидневной же обработке диабетических крыс с
помощью ХГЧ и TP03 снижается только стероидогенный эффект
гонадотропина, в то время как соответствующий эффект TP03
практически не меняется и становится сопоставимым с таковым
ХГЧ. При пятидневном введении в семенниках контрольных и
диабетических крыс регуляторные эффекты TP03 на экспрессию
стероидогенных белков были сходными. Более того, соединение
TP03, в отличие от ХГЧ, ни в контрольной, ни в диабетической
группе не снижало экспрессию гена Lhr, кодирующего рецептор
231
ЛГ, предотвращая, тем самым, ослабление чувствительности
семенников к гонадотропинам в условиях диабетической
патологии. Все это указывает на то, что TP03 и другие
тиенопиримидиновые производные с активностью
аллостерических агонистов рецептора ЛГ являются
эффективными стимуляторами продукции тестостерона при
тяжелых формах диабетической патологии, для которой
характерны сильно выраженная андрогенная недостаточность,
нарушения репродуктивных функций, усиление окислительного
стресса и воспалительных реакций.
5.5. Шапероноподобная активность низкомолекулярных

аллостерических лигандов рецептора
лютеинизирующего гормона
Причиной многих заболеваний являются мутации в генах,

кодирующих GPCR, которые, в частности, приводят к
неправильному сворачиванию рецептора, к нарушению его
посттрансляционного процессинга и транслокации в
плазматическую мембрану (Conn, Janovick, 2009). Отсутствие или
недостаточное количество функционально активных рецепторов
в плазматической мембране приводит к ослаблению ответа
клетки на гормональное воздействие. Это в полной мере
относится к рецептору ЛГ. Так рецепторы ЛГ с мутациями
Ala593Pro и Ser616Tyr в их трансмембранных доменах не способны
к транслокации в плазматическую мембрану. Они остаются
внутри клетки, в эндоплазматическом ретикулуме, где пребывают
в неактивном состоянии, несмотря на то что сохраняют
способность связываться с гонадотропинами. Мутантные
рецепторы выявлены у пациентов с дисфункциями
репродуктивной системы, вызванными гипоплазией клеток
Лейдига, продуцирующих тестостерон (Kremer et al., 1995;
Latronico et al., 1996; Mizrachi, Segaloff, 2004). Степень тяжести
нарушений при таких дисфункциях положительно коррелирует
со степенью нарушений функциональной активности рецепторов
232
ЛГ и с потерей ими способности встраиваться в плазматическую
мембрану.
Имеются данные о том, что некоторые
низкомолекулярные липофильные вещества способны проникать
в клетку и там специфично связываться с мутантными формами
GPCR, встроенными в мембрану эндоплазматического
ретикулума. Это способствует правильному сворачиванию
молекулы рецептора и дальнейшей транслокации комплекса,
образованного этим веществом и рецептором, к плазматической
мембране. Такие вещества, восстанавливающие функциональную
активность GPCR, называют фармакологическими шаперонами.
Способность низкомолекулярных агонистов и антагонистов
восстанавливать активность мутантных рецепторов
продемонстрирована для вазопрессинового рецептора 2-го типа
(Morello et al., 2000), δ-опиоидного рецептора (Petäjä-Repo et al.,
2002), рецептора гонадолиберина (Janovick et al., 2002, 2003).
Показано, что соединение Org42599, низкомолекулярный
аллостерический агонист рецептора ЛГ, представляющий собой
трифторацетат тиенопиримидинового производного Org43553,
восстанавливает функциональную активность мутантных
рецепторов ЛГ с заменами аминокислотных остатков Ala593Pro и
Ser616Tyr (Newton et al., 2011). Инкубация клеток, в которых были
экспрессированы мутантные рецепторы, с соединением Org42599
повышала экспрессию белка мутантного рецептора, долю
мутантных рецепторов с правильной укладкой полипептидной
цепи и правильной топологией в мембране, а также увеличивала
плотность рецепторных молекул на поверхности клетки. Было
установлено, что этот эффект связан со способностью соединения
Org42599 проникать через плазматическую мембрану клеток
Лейдига и специфично связываться с аллостерическим сайтом
рецептора ЛГ, расположенного в ретикулярной мембране, что
способствует правильной укладке рецептора и необходимо для
транслокации его к плазматической мембране (Newton et al.,
2011).
233
Очень важно, что переход рецептора ЛГ в функционально
активное состояние препятствует его деградации в протеосомах.
Это связано с изменением взаимодействия мутантного рецептора
ЛГ в Org42599-связанном состоянии с ферментами и белками-
шаперонами, ответственными за созревание, транслокацию и
деградацию молекулы рецептора. Мутантный рецептор ЛГ в
комплексе с соединением Org42599, подобно нормальному
рецептору, приобретает способность модифицироваться
протеиндисульфидизомеразой. Этот фермент катализирует
образование дисульфидных связей в белках и, тем самым,
обеспечивает правильную их укладку, что справедливо и для
молекулы рецептора ЛГ. Наряду с этим, мутантный рецептор в
комплексе с соединением Org42599 теряет способность
образовывать комплексы с 94 кДа глюкоза-регулируемым белком
(Grp94) и Ig-связывающим белком (BiP), которые
транспортируют неправильно свернутые белки к месту их
деградации в протеосомах.
Поскольку низкомолекулярные агонисты при связывании
с мутантными рецепторами ЛГ нормализуют их функциональную
активность, то их можно использовать для стимуляции
стероидогенеза и других ЛГ-зависимых процессов в клетках
Лейдига с дефектными формами рецептора ЛГ, которые не
чувствительны к гонадотропинам. Это один из перспективных
путей для лечения репродуктивных дисфункций, вызванных
мутациями в гене, кодирующем рецептор ЛГ, а также для
контролируемой индукции овуляции у женщин с
полиморфизмами в гене, кодирующем этот рецептор. Показано,
что обработка HEK293-клеток с экспрессированными в них
мутантными рецепторами ЛГ с помощью соединения Org42599
приводит к стимуляции активности АЦ и цАМФ-зависимых
транскрипционных факторов, что является следствием
транслокации мутантных рецепторов из эндоплазматического
ретикулума в плазматическую мембрану при связывании с
Org42599. Через 2–4 ч после начала инкубации HEK293-клеток, в
которых был экспрессирован мутантный рецептор ЛГ с заменой
234
Ser616Tyr, для которого характерна низкая чувствительность к ЛГ,
с соединением Org42599, взятым в сравнительно низкой
концентрации (0.1 мкМ), стимулирующий эффект ЛГ на
активность АЦ повышался в два раза. Достаточно неожиданным
было то, что в клетках, где экспрессируются нормальные
рецепторы ЛГ, АЦ эффект соединения Org42599 составил 25 %
от такового ЛГ, в то время как в клетках, где экспрессируются
мутантные рецепторы, он был в полтора раза выше АЦ эффекта
ЛГ. Более того, стимулирующий эффект соединения Org42599 на
активность АЦ в клетках с мутантным рецептором ЛГ вдвое
превосходил таковой в клетках с экспрессированным рецептором
дикого типа (Newton et al., 2011).
Нами при изучении стероидогенных эффектов ХГЧ и
TP03 у самцов крыс при совместном применении этих
препаратов было установлено, что, наряду с аддитивностью этих
эффектов, при более низких концентрациях отмечается
потенцирующий эффект TP03 (7.5 мг/кг, в/б) на стероидогенный
эффект ХГЧ (100 МЕ/крысу) (Шпаков и др., 2019). Это может
быть обусловлено тем, что предварительная обработка животных
низкомолекулярным агонистом рецептора ЛГ повышает число
функционально активных рецепторов на поверхности клеток
Лейдига, что и усиливает эффективность ХГЧ-индуцированной
стимуляции стероидогенеза. Таким образом, появляется
возможность повышать чувствительность тканей-мишеней к
действию гонадотропинов с помощью низкомолекулярных
аллостерических регуляторов, которые в этом случае
функционируют как PAM, и, тем самым, избегать применения
высоких доз гонадотропинов, которые являются причиной целого
ряда побочных эффектов.
Шаперноподобный эффект тиенопиримидиновых
производных может объяснять и парадоксально высокую
эффективность TP03 в сравнении с гонадотропинами при
стимуляции стероидогенеза у крыс с экспериментальной
стрептозотоциновой моделью сахарного диабета 1-го типа.
Среднетяжелые и тяжелые формы сахарного диабета 1-го типа у
235
людей, а также у животных с экспериментальными моделями
этого заболевания характеризуются сильно выраженным
андрогенным дефицитом и нарушением чувствительности к
гонадотропинам, что продемонстрировано нами и другими
авторами (Schoeller et al., 2012; Carruthers, 2013; Jangir, Jain, 2014;
Бахтюков и др., 2019в). Причинами этого являются повышение
содержания активных форм кислорода, как следствие ослабления
системы антиоксидантной защиты в клетках семенников,
интенсификация в них воспалительных и апоптотических
процессов, ультраструктурные изменения ткани семенников, что
отчетливо показано на примере стрептозотоцинового диабета у
крыс (Kianifard et al., 2012; Kanter et al., 2013; Li et al., 2013; Liu et
al., 2017). Как мы полагаем, при обработке диабетических крыс с
помощью TP03, этот низкомолекулярный агонист проникает
через плазматическую мембрану и стабилизирует расположенные
внутри клетки рецепторы ЛГ в конформации, устойчивой к
деградации, обеспечивая тем самым транслокацию рецептора к
мембране. Следовательно, тиенопиримидиновые производные
могут составить серьезную конкуренцию гонадотропинам при
компенсации андрогенного дефицита в условиях метаболических
расстройств, которые характеризуются нарушением процессинга
сигнальных белков.
5.6. Низкомолекулярные аллостерические агонисты

рецептора фолликулостимулирующего гормона
Первый полный агонист рецептора ФСГ был разработан

фирмой “Serono” еще в 2001 году и представлял собой
пиперидинкарбоксамид, который стимулировал активность АЦ в
CHO-клетках с экспрессированным в них рецептором ФСГ со
значением EC50 равным 3.9 нМ. Однако пиперидинкарбоксамид
сравнительно слабо стимулировал синтез эстрадиола клетками
гранулезы крысы, а также не демонстрировал активности in vivo
и потому был исключен из дальнейших исследований (El Tayer et
al., 2001). Позднее несколько групп занялись поиском новых
236
низкомолекулярных лигандов для рецептора ФСГ, активных in
vivo. В результате обнаружено большое число органических
соединений различных классов, которые имеют широкий спектр
фармакологической активности, включая полные агонисты,
инверсионные агонисты и нейтральные антагонисты рецептора
ФСГ (van Straten, Timmers, 2009; Nataraja et al., 2015; Anderson et
al., 2019). Наибольший интерес среди них представляют
производные тиазолидинов (Maclean et al., 2004; Wrobel et al.,
2006; Yanofsky et al., 2006; Arey et al., 2008), замещенные γ-
лактамы (Pelletier et al., 2005), дикетопиперазины (Guo et al.,
2004a, 2004b), N-алкилированные сульфанилпиперазины (Magar
et al., 2004), тетрагидрохинолины (Van Straten et al., 2005),
гексагидрохинолины (Grima Poveda et al., 2006),
тиенопиримидины (Hanssen, Timmers, 2003) и бензамиды (van
Koppen et al., 2013). Также описан ряд эффективных
низкомолекулярных агонистов рецептора ФСГ без детализации
структуры, вследствие чего их нельзя отнести к какому-то классу
соединений (van de Lagemaat et al., 2011a).
Наибольший интерес в качестве аллостерических
агонистов рецептора ФСГ представляют тиазолидиновые
производные, которые являются важными каркасными
соединениями для большого числа регуляторов GPCR (Verma,
Saraf, 2008). Использование библиотеки производных
тиазолидинов, насчитывающей 42000 соединений, позволило
фирме «Affymax» (Купертино, США) найти несколько
тиазолидиновых производных, которые обладали свойствами
полных и инверсионных агонистов рецептора ФСГ. Так на
начальном этапе было идентифицировано производное
тиазолидина с активностью инверсионного агониста рецептора
ФСГ, которое со значением EC50, равным 32 нМ, снижало
максимальный стимулирующий эффект рекомбинантного ФСГ
(Emax, 24 %) (Maclean et al., 2004). С целью повышения
биологической активности это соединение было модифицировано
введением γ-лактамного кольца и 5-алкильных заместителей, что
позволило решить проблему преобладания неактивного транс-
237
изомера над активным цис-изомером (Pelletier et al., 2005; Wrobel
уе al., 2006). В результате на начальном этапе были разработаны
аллостерические агонисты, которые стимулировали активность
АЦ в клеточных культурах с экспрессированными в них
рецепторами ФСГ со значениями EC50 около 20 мкМ. В
дальнейшем вследствие оптимизации структуры эффективность
таких агонистов в отношении цАМФ-зависимых сигнальных
путей в клетках-мишенях была повышена на несколько порядков
(EC50, 1–6 нМ) (Wrobel et al., 2006; Yanofsky et al., 2006; Arey et
al., 2008).
Структурные исследования и эксперименты с химерными
рецепторами позволили установить, что тиазолидиновые
производные связываются с аллостерическим сайтом,
расположенным в трансмембранном домене рецептора ФСГ
между первой ТМС и второй ВП (Yanofsky et al., 2006). Одно из
соединений, разработанных в ходе оптимизации структуры
тиазолидиновых производных (соединение 5), стимулировало
синтез стероидных гормонов в первичной культуре клеток
гранулезы крысы и в культуре клеток Y1 надпочечников мыши с
экспрессированным в них рецептором ФСГ (Yanofsky et al.,
2006). В условиях in vivo соединение 5 дозозависимо
стимулировало развитие преовуляторных фолликулов и
повышало количество ооцитов при индукции овуляции у
неполовозрелых самок крыс. Однако при пероральном способе
доставки препарата его биодоступность была низкой и, наряду с
этим, отмечались некоторые генотоксические эффекты, которые
тормозили дальнейшее развитие ооцитов (Sriraman et al., 2014).
Даже небольшие изменения структуры тиазолидиновых
производных, затрагивающие арильную группу в положении 3
или ацетамидную группу в положении 5, существенно меняли
фармакологический профиль полученных соединений (Arey et al.,
2008). При этом полные аллостерические агонисты по своей
активности трансформировались в инверсионные агонисты и
антагонисты, к числу которых относится соединение 3, близкий
структурный аналог соединения 5 (рис. 5-11).
238
Соединение 3
Рис. 5-11. Низкомолекулярный инверсионный агонист рецептора ФСГ

на основе тиазолидинового производного.
Показано, что если полные аллостерические агонисты

после связывания с рецептором ФСГ через посредство Gs-белков
стимулировали активность АЦ и усиливали синтез эстрогенов в
первичной культуре клеток гранулезы, то инверсионные
аллостерические агонисты ингибировали стимулирующие
эффекты ФСГ на аденилатциклазную систему и предотвращали
вызываемую ФСГ активацию системы стероидогенеза в клетках-
мишенях. Инверсионные агонисты могли действовать по двум
механизмам – либо препятствовали взаимодействию
активированного гонадотропином рецептора ФСГ с Gs-белком,
либо стимулировали активность Gi/o-белка, который
функционально сопряжен с рецептором ФСГ и опосредует
ингибирование АЦ. Обнаружена зависимость
фармакологического профиля соединения 3 и других
инверсионных агонистов тиазолидинового ряда от их
концентрации. В низких концентрациях они вызывали активацию
Gs-белков и стимулировали цАМФ-зависимые сигнальные
каскады, в то время как в высоких концентрациях препятствовали
ФСГ-индуцированной активации Gs-белков и активировали
239
сопряженные с Gi/o-белками сигнальные пути, снижая активность
АЦ и цАМФ-зависимых транскрипционных факторов. Это было
отчетливо продемонстрировано при действии изучаемых
тиазолидиновых производных на клетки с экспрессированными в
них конститутивно активными формами рецептора ФСГ,
имеющими повышенную базальную активность (Arey et al., 2008;
Zoenen et al., 2012). По всем критериям, принятым для
аллостерических регуляторов, в низких концентрациях
соединение 3 и его аналоги вели себя как аллостерические
агонисты, а в высоких – как NAM.
Показано, что тиазолидиновые производные, в
зависимости от их химической структуры, способны
активировать не только АЦ, но и другие сигнальные каскады, как
это отмечено и для гонадотропинов (Sriraman et al., 2014). При
этом низкомолекулярные агонисты способны как усиливать
регуляторные эффекты низких концентраций ФСГ, выступая в
качестве PAM, так и дифференцированно влиять на зависимые от
ФСГ внутриклеточные сигнальные каскады. При
физиологических условиях тиазолидиновые производные
вызывали стимуляцию роста фолликулов в условиях in vitro, а
также индуцировали образование комплексов кумулюсных
клеток с ооцитами. В условиях in vivo при постоянной подаче
препарата с помощью насоса тиазолидиновые производные были
эффективны как стимуляторы фолликулогенеза у самок крыс.
Однако, из-за низкой биодоступности разработанных
тиазолидиновых производных при пероральном способе
введения, они могут быть использованы только при
парентеральных способах доставки, что в значительной степени
снижает их фармакологическую ценность, в том числе при
использовании для контролируемой индукции овуляции
(Sriraman et al., 2014).
Скрининг библиотеки производных дикетопиперазинов,
проведенный фирмами «Pharmacopeia Inc.» (в настоящее время
«Ligand Pharmaceuticals», Сан-Диего, США) и «Organon» (в
настоящее время «Merck & Co/Merck Sharpe & Dohme (MSD»),
240
Кенилворт, США), позволил выявить ряд биарильных агонистов,
среди которых наиболее активные соединения содержали
гетероциклические дикетопиперазиновые заместители (Guo et al.,
2004a). Дальнейшая оптимизация структуры
дикетопиперазиновых производных посредством модификации
боковых цепей ядра дикетопиперазина привела к увеличению их
активности, которая определялась по стимулирующему эффекту
на уровень цАМФ внутри клетки и на активность цАМФ-
зависимого транскрипционного фактора CREB и зависимой от
него экспрессии генов. Эти эффекты обнаружены при действии
наномолярных концентраций дикетопиперазиновых производных
(Guo et al., 2004b). Однако в дальнейшем эти соединения не
исследовались, что, как можно полагать, обусловлено их низкой
активностью in vivo (Anderson et al., 2019). Ряд других
пиперазиновых производных с активностью аллостерических
регуляторов рецептора ФСГ, выявленной при низких
наномолярных концентрациях этих соединений, был еще в 2002
году запатентован фирмой «Serono» (Magar et al., 2002).
В 2006 году появились данные о том, что
гексагидрохинолиновые производные (4-фенил-5-оксо-l,4,5,6,7,8-
гексагидрохинолины), в частности соединение Org214444-0 (рис.
5-12), со значениями EC50 менее 1 нМ способны влиять на
активность АЦ в СНО-клетках с экспрессированным в них
рецептором ФСГ. Действие этих соединений было специфичным
и не выявлялось в отношении рецепторов ЛГ и ТТГ (Grima
Poveda et al., 2006; van Koppen et al., 2013). Соединение
Org214444-0 эффективно стимулировало стероидогенные
сигнальные каскады в гранулезных клетках человека и крысы.
Оно в 6.5 раза повышало аффинность рецепторов к ФСГ, что
выявлено с помощью [125I]-ФСГ, а также в среднем в 3–5 раз
повышало эффективность стимуляции гонадотропином
аденилатциклазной сигнальной системы. Эти данные
свидетельствуют о присущей Org214444-0 активности ago-PAM
для рецептора ФСГ. Важным преимуществом соединения
Org214444-0 является его биодоступность при пероральном
241
способе введения, как это показано в экспериментах in vivo по
индукции овуляции и стимуляции фолликулогенеза у зрелых
самок крыс (van Koppen et al., 2013). Недостатком соединения
Org214444-0 является его липофильность, что создает серьезные
проблемы с растворимостью. Для снижения липофильности в
структуру этого соединения были введены пиридиновые и
сульфонамидные группы. Но результатом этого стало снижение
активности in vitro и полная потеря активности при пероральном
способе введения, вследствие чего от идеи снижения
липофильности в случае гексагидрохинолиновых производных
пришлось отказаться (Timmers et al., 2006).
Org214444-0
Рис. 5-12. Низкомолекулярный агонист рецептора ФСГ на основе

гексагидрохинолинового производного.
Тиенопиримидиновые производные, которые оказались

столь активными в отношении рецепторов ЛГ и ТТГ, в случае
рецептора ФСГ имели низкую активность или были вовсе ее
лишены. При этом, однако, соединение Org 43553, наиболее
активный аллостерический агонист рецептора ЛГ, в
наномолярных концентрациях обладало небольшой активностью
аллостерического регулятора рецептора ФСГ. Однако, эта
активность была в 10 раз ниже таковой для рецептора ЛГ
(Heitman et al., 2008; van Koppen et al., 2008).
242
5.7. Низкомолекулярные аллостерические антагонисты

рецептора фолликулостимулирующего гормона
Большой прогресс достигнут при разработке

низкомолекулярных нейтральных антагонистов рецептора ФСГ,
которые могут быть использованы в качестве контрацептивов для
предупреждения нежелательной беременности, а также при
лечении опухолей, зависимых от ФСГ и эстрогенов. В этой связи
следует отметить, что применяемые в настоящее время
контрацептивы, основу которых составляют аналоги стероидных
гормонов и соединения, мимикрирующие их в сигнальной
трансдукции, имеют много побочных эффектов, что требует
внедрения инновационных подходов для создания новых
поколений контрацептивов (Bahamondes, Bahamondes, 2014;
Warren et al., 2014). Поскольку ФСГ играет решающую роль в
нормальном протекании фолликулогенеза у женщин и в
созревании спермы у мужчин (Vegetti, Alagna, 2006; Palermo,
2007), то разработка негативных регуляторов ФСГ-сигналинга
является одним из перспективных направлений для контроля
репродуктивных функций и предупреждения нежелательной
беременности.
Одним из первых негативных регуляторов функций
рецептора ФСГ является сурамин – соединение, которое
содержит сульфоновую кислоту (рис. 5-13) и широко
используется для лечения трипаносомоза (африканской сонной
болезни). Однако в 1990-е годы было доказано, что сурамин
ингибирует передачу гормональных сигналов через целый ряд
GPCR. У крыс, получавших сурамин, наблюдали снижение
уровня тестостерона и ФСГ в плазме, а в экспериментах in vitro
было продемонстрировано вызываемое сурамином
ингибирование активности ХГЧ и ФСГ (Daugherty et al., 1992).
243
Сурамин
Рис. 5-13. Сурамин и другие низкомолекулярные антагонисты

рецептора ФСГ на основе производных нафтален-2-сульфоновой
кислоты (соединение 1) и тетрагидрохинолина (соединение 10).
244
Дальнейшие эксперименты по изучению влияния
сурамина на связывание радиоактивно меченых гонадотропинов
с рецепторами показали, что сурамин способен влиять на
структуру ортостерического сайта рецептора ФСГ и
предотвращать его эффективное связывание с ФСГ (Stevis et al.,
1999). Было также установлено, что сурамин способен
ингибировать образование тройного комплекса между лигандом,
рецептором и G-белком, предотвращая высвобождение ГДФ из
нуклеотидсвязывающего сайта G-белка, тем самым, препятствуя
сигнальной трансдукции (Beindl et al., 1996; Freissmuth et al.,
1996). Показано, что при обработке сурамином пациентов с
неоперабельным раком предстательной железы отмечается
снижение уровня тестостерона и ФСГ в крови (Danesi et al., 1996;
Small et al., 2000). Эти результаты позволили предположить, что
сурамин и другие содержащие сульфоновую кислоту соединения
могут рассматриваться как кандидаты на роль негативных
аллостерических регуляторов рецептора ФСГ.
Первые аллостерические антагонисты рецептора ФСГ
были идентифицированы еще в 2002 году (Arey et al., 2002;
Wrobel et al., 2002). На основе производных (бис)сульфоновой
кислоты и (бис)бензамида были сконструированы три
антагониста, которые имели умеренную эффективность в
отношении рецептора ФСГ, причем в отличие от сурамина,
который подавлял активность различных типов GPCR,
производные (бис)сульфоновой кислоты и (бис)бензамида
ингибировали активность только рецептора ФСГ, и вплоть до
концентрации 100 мкМ практически не влияли на рецепторы ЛГ
и ТТГ (Wrobel et al., 2002).
Одновременно с этим был разработан аллостеричекский
антагонист рецептора ФСГ – 7-{4-[бис-(2-карбамоил-этил)-
амино]-6-хлор-(1,3,5)-триазин-2-иламино)-4-гидрокси-3-(4-
метокси-фенилазо)-нафтален}-2-сульфоновая кислота
(соединение 1), который дозозависимо снижал специфическое
связывание [125I]-ФСГ с рецептором (Arey et al., 2002) (рис. 5-13).
Ингибирующее влияние соединения 1 не было обусловлено
245
конкуренцией за связывание с ортостерическим сайтом, что
свидетельствует об аллостерическом механизме регуляции
ортостерического сайта рецептора ФСГ при связывании этого
антагониста с рецептором ФСГ. Соединение 1 характеризовалось
высокой селективностью по отношению к рецептору ФСГ и
заметно не влияло на функциональную активность других
рецепторов гипофизарных гликопротеиновых гормонов, в том
числе рецептора ЛГ. Это соединение дозозависимо ингибировало
повышение уровня цАМФ, вызываемое ФСГ, и блокировало
эффекты гормона, реализуемые через цАМФ-зависимые
сигнальные каскады. Оно подавляло вызываемую ФСГ
стимуляцию стероидогенеза как в линии клеток Y1
надпочечников мыши, так и в первичной культуре клеток
гранулезы крысы. Наряду с этим, в клетках яичников было
обнаружено блокирование этим соединением стимулирующего
эффекта ФСГ на активность ароматазы, которая превращает
тестостерон в эстрогены, и регуляция которой осуществляется
через цАМФ-зависимые сигнальные пути. Внутрибрюшинное
введение соединения 1 самкам крыс в дозе 100 мг/кг полностью
блокировало у них овуляцию, что может указывать на
перспективность его применения в качестве эффективного
средства для контрацепции (Arey et al., 2002).
Вслед за 7-{4-[бис-(2-карбамоил-этил)-амино]-6-хлор-
(1,3,5)-триазин-2-иламино)-4-гидрокси-3-(4-метокси-фенилазо)-
нафтален}-2-сульфоновой кислотой, были разработаны
антагонисты рецептора ФСГ на основе аминоалкиламидов.
Однако in vivo они были не активны (Coats et al., 2003). В
дальнейшем фирма “Organon” разработала антагонисты
рецептора ФСГ на основе 6-амино-4-фенил-тетрагидрохинолина,
которые структурно близки производным тетрагидрохинолина с
активностью агонистов (Van Straten et al., 2005). Наиболее
активно среди них соединение 10, у которого в положении 6
находится бифенильный радикал (рис. 5-13). Значения IC50 для
ингибирования им стимулированной ФСГ активности АЦ в
246
экспериментах in vitro (клетки линии GFSHR-17 яичников крысы)
и in vivo составили 10 и 540 нМ, соответственно.
В условиях ex vivo соединение 10 ингибирует рост
незрелых фолликулов мыши, который индуцирован их
обработкой ФСГ, и подавляет процесс овуляции на 78 % (Van
Straten et al., 2005). Это соединение почти не влияло на
специфическое связывание [125I]-ФСГ с рецептором, что
свидетельствует о его взаимодействии с трансмембранным
доменом рецептора ФСГ. Поскольку как соединение 10, так и
соединение 1 сами по себе, в отсутствие гонадотропина, не
способны влиять на активность АЦ, то имеются основания
считать, что они блокируют ФСГ-индуцированную активацию
трансмембранного домена рецептора ФСГ, и потому их можно
рассматривать, как NAM для рецептора ФСГ (Van Straten et al.,
2005).
Результатом скрининга соединений с целью обнаружения
NAM для рецептора ФСГ, проведенного фирмой «Addex
Pharmaceuticals» (Женева, Швейцария), стала идентификация
производного бензамида – соединения ADX61623, которое
ингибировало стимулирующий эффект ФСГ на 55% со значением
IC50, равным 0.7 мкМ (рис. 5-14). Крайне интересен тот факт, что
соединение ADX61623 in vitro дозозависимо подавляло ФСГ-
индуцированную продукцию цАМФ и прогестерона, но при этом
в высоких концентрациях стимулировало выработку эстрадиола,
что свидетельствует о сложном фармакологическом профиле
этого аллостерического регулятора рецептора ФСГ (Dias et al.,
2011). В условиях in vivo подкожное введение соединения
ADX61623 в дозе 50 мг/кг было неэффективным в отношении
ингибирования фолликулогенеза и овуляции у крыс после
последовательной их обработки ФСГ и ХГЧ, на что указывает
отсутствие влияния этого соединения на количество извлеченных
ооцитов и массу яичников (Dias et al., 2011). Предполагается, что
это обусловлено неспособностью соединения ADX61623
подавлять стимулированную гонадотропинами выработку
эстрадиола, несмотря на ингибирование им продукции цАМФ.
247
В дальнейшем были разработаны еще два производных
бензамида, ADX68692 и ADX68693, которые, также как и
соединение ADX61623, проявляли активность аллостерических
антагонистов рецептора ФСГ (Dias et al., 2014). Соединение
ADX68692 в условиях in vitro ингибировало стимулированную
ФСГ продукцию прогестерона и эстрадиола в первичной
культуре клеток гранулезы крысы, а в условиях in vivo при
подкожном и пероральном введении нарушало цикличность у
зрелых самок крыс и уменьшало количество извлеченных у них
ооцитов. Соединение ADX68693 в условиях in vitro снижало
стимулированную ФСГ продукцию прогестерона, но не влияло
на синтез и секрецию эстрадиола, а также было неактивным в
условиях in vivo (Dias et al., 2014).
ADX61623
Рис. 5-14. Соединение ADX61623 с активностью негативного

аллостерического модулятора рецептора ФСГ.
Следует отметить, что соединения ADX68692 и

ADX68693 влияли не только на функциональную активность
рецептора ФСГ, но и на активность рецептора ЛГ. При этом
соединение ADX68693 ингибировало выработку прогестерона и
тестостерона в первичных культурах клеток Лейдига крысы, в то
время как соединение ADX68692 частично ингибировало
выработку тестостерона и, напротив, усиливало продукцию
прогестерона (Ayoub et al., 2016). Поскольку в большинстве
стратегий скрининга низкомолекулярных аллостерических
248
лигандов рецепторов гонадотропинов анализируется только один
или два биохимических показателя, то, с учетом данных по
соединениям ADX68692 и ADX68693, это может привести к
неадекватным выводам о фармакологической активности этих
препаратов и несет серьезные риски при их использовании в
клинике.
Достаточно перспективным подходом является создание
антагонистов рецептора ФСГ при сшивании через спейсер двух
низкомолекулярных соединений с активностью аллостерических
антагонистов. Такие димерные молекулы обладают повышенной
антагонистической активностью по отношению к рецептору ФСГ
in vitro (Bonger et al., 2009). Однако сведения об их активности in
vivo и о специфичности их действия на различные типы
рецепторов до сих пор не получены.
В настоящее время запатентованы четыре антагониста
рецептора ФСГ, которые относятся к классам аминоалкиламидов,
пиперазинов, пиррол[2,1-c]-бензодиазепинов и индола (Heitman,
Ijzerman, 2008; van Straten, Timmers, 2009; Nataraja et al., 2015;
Anderson et al., 2019). Все эти антагонисты, за исключением
производных пиперазина, содержат бифенильные радикалы,
которые являются, как полагают важнейшей структурной
детерминантой, необходимой для эффективного взаимодействия
низкомолекулярных лигандов с трансмембранным доменом
рецептора ФСГ.
В заключение необходимо еще раз подчеркнуть тот факт,
что низкомолекулярные аллостерические лиганды рецепторов
ФСГ и ЛГ характеризуются высокой избирательностью
активации внутриклеточных сигнальных каскадов и могут
рассматриваться, как bias-лиганды. Они активируют или,
напротив, подавляют вполне определенные сигнальные пути, что
позволяет точно предсказать клеточный ответ (Landomiel et al.,
2019) (рис. 5-15–5-18).
249
Рис. 5-15. Действие синтетических полных аллостерических

агонистов и позитивных аллостерических модуляторов на
аллостерический сайт рецептора ФСГ, который расположен в
трансмембранном домене рецептора.
Агонисты (тиазолидинон) и PAM (бензамиды, дигидропиридины),
связываясь с аллостерическим сайтом рецептора ФСГ, индуцируют
активацию как G-белок-зависимых, так и β-аррестиновых
сигнальных каскадов. Это приводит к повышению функциональной
активности большого числа эффекторных белков и
транскрипционных факторов в клетках-мишениях (по Landomiel et
al., 2019).
250
Рис. 5-16. Связывание слабо гликозилированных форм ФСГ,

имеющих молекулярный вес 21 или 18 кДа, с ортостерическим
сайтом эктодомена рецептора ФСГ приводит к избирательной
активации только аденилатциклазного сигнального каскада.
Избирательная активации рецептора с помощью изоформ ФСГ,
имеющих низкую степень N-гликозилирования, приводит к
специфичному взаимодействию трансмембранного домена
активированного рецептора ФСГ с Gs-белками, активации
аденилатциклазы и повышению внутриклеточного уровня цАМФ.
Результатом этих событий является стимуляция активности цАМФ-
зависимых эффекторных белков (протеинкиназы А, обменных
факторов Epac-семейства), а также каскада митогенактивируемых
протеинкиназ. При этом β-аррестиновые сигнальные пути остаются
неактивными, что предотвращает быструю десенситизацию
рецепторов ФСГ (по Landomiel et al., 2019).
251
Рис. 5-17. Связывание с рецептором ФСГ различающихся по

паттерну гликозилирования гонадотропинов, их комплексов с
антителами и комбинаций низкомолекулярных аллостерических
регуляторов приводит к избирательной активации β-аррестиновых
сигнальных путей.
Избирательная активации рецептора ФСГ с помощью
высокогликозилированных форм ФСГ (24 кДа),
негликозилированных форм ЛГ, комплексов ХГЧ с антителами и
низкомолекулярных аллостерических агонистов в присутствии β-
аррестин-специфичных NAM обеспечивает взаимодействие
трансмембранного домена рецептора ФСГ с β-аррестинами, что
приводит к запуску β-аррестин-зависимых путей, включая
стимуляцию митогенактивируемых протеинкиназ, и процессов
эндоцитоза лиганд-рецепторных комплексов. При этом G-белок-
сопряженные сигнальные пути остаются неактивными, что
предотвращает активацию сигнальных путей, регулируемых через
различные типы G-белков (по Landomiel et al., 2019).
252
Рис. 5-18. Связывание рецептора ФСГ с различными по природе

антагонистами, блокирующими передачу сигнала как с
ортостерического, так и с аллостерического сайтов, приводит к
подавлению как G-белок-зависимых, так и β-аррестиновых
сигнальных каскадов.
Связывание ФСГ с рецептором может быть предотвращено с
использованием конкурентных лигандов, в том числе
низкомолекулярных, а также с помощью антител, выработанных на
ФСГ-связывающий домен рецептора или на сами молекулы
гонадотропина (по Landomiel et al., 2019).
Эндогенными bias-регуляторами рецепторов ФСГ

являются различные по степени N-гликозилирования и другим
посттрансляционным модификациям молекулы ФСГ или
специфичные к рецептору ФСГ антитела, которые
вырабатываются на различные антигенные детерминанты,
локализованные в эктодомене рецепторной молекулы.
Избирательность сигнальной трансдукции может быть
обусловлена определенными мутациями и полиморфизмами в
молекуле рецептора ФСГ. Однако «эндогенные» механизмы,
253
позволяющие обеспечить bias-регуляцию ФСГ-зависимых
сигнальных каскадов, с трудом поддаются контролю, в то время
как применение низкомолекулярных аллостерических лигандов
рецептора ФСГ является многообещающим подходом для
обеспечения избирательной регуляции сигнальной трансдукции
через эти рецепторы.
Бахтюков А.А., Деркач К.В., Дарьин Д.В., Степочкина А.М., Шпаков
А.О. Низкомолекулярный агонист рецептора лютеинизирующего гормона
эффективно стимулирует аденилатциклазу в тестикулярных мембранах и
стероидогенез в семенниках крыс с диабетом 1-го типа // Биологические
мембраны. 2019а. Т. 36. № 5. doi: 10.1134/S0233475519050037.
Бахтюков А.А., Деркач К.В., Дарьин Д.В., Шпаков А.О.
Стероидогенный эффект низкомолекулярного агониста рецептора
лютеинизирующего гормона при его введении самцам крыс // Доклады
Академии наук. 2019б. Т. 484. № 6. C. 103–106.
Бахтюков А.А., Деркач К.В., Шпаков А.О. Взаимосвязь между
андрогенным дефицитом и ослаблением чувствительности аденилатциклазы к
гонадотропинам в семенниках крыс со стрептозотоциновым диабетом
различной степени тяжести // Рос. Физиол. журнал им. И.М. Сеченова. 2019в. Т.
105. № 1. C. 100–110. DOI: 10.1134/S0869813919010011.
Бахтюков А.А., Шпаков А.О. Молекулярные механизмы регуляции
стероидогенеза в клетках Лейдига // Цитология. 2016.Т. 58. № 9. С 666–678.
Деркач К.В., Бахтюков А.А., Шпаков А.А., Дарьин Д.В., Шпаков А.О.
Особенности регуляции гетеротримерных G-белков хорионическим
гонадотропином и низкомолекулярным агонистом рецептора
лютеинизирующего гормона // Цитология. 2017. Т. 59. № 7. С. 474–481.
Деркач К.В., Дарьин Д.В., Бахтюков А.А., Лобанов П.С., Шпаков А.О.
Изучение функциональной активности новых низкомолекулярных агонистов
рецептора лютеинизирующего гормона in vitro и in vivo // Биологические
мембраны. 2016а. Т. 33. № 4. С. 263–271.
Деркач К.В., Дарьин Д.В., Лобанов П.С., Шпаков А.О.
Тиенопиримидиновые производные повышают уровень тестостерона при их
интратестикулярном, внутрибрюшинном и пероральном введении самцам крыс
// Доклады Академии наук. 2014. Т. 459. № 3. С. 382–385.
Деркач К.В., Легкодух А.С., Дарьин Д.В., Шпаков А.О. Стимулирующее
влияние тиенопиримидинов, структурных аналогов Org43553, на активность
аденилатциклазы в семенниках и на продукцию тестостерона у самцов крыс //
Цитология. 2016б. Т. 58. № 8. C. 602–609.
254
Шпаков А.О. Структурно-функциональная организация рецепторов
полипептидных гормонов, содержащих LRR-повторы, и их взаимодействие с
гетеротримерными G-белками // Цитология. 2009. Т. 51. № 8. С. 638–649.
Шпаков А.О. Новые достижения в разработке и изучении механизмов
действия низкомолекулярных агонистов рецепторов тиреотропного и
лютеинизирующего гормонов // Цитология. 2015. Т. 57. № 3. С. 167–176.
Шпаков А.О. Гликозилирование гонадотропинов, как важнейший
механизм регуляции их активности // Рос. Физиол. журн. им. И.М. Сеченова.
2017а. Т. 103. № 9. C. 1004–1021.
Шпаков А.О. Регуляция и молекулярные механизмы
функционирования гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси / Санкт-Петербург:
Издательство Политехнического университета. 2017б. 284 с. ISBN 978-5-7422-
5876-6.
Шпаков А.О. Гонадотропины – от теории к клинической практике /
Санкт-Петербург: ПОЛИТЕХ-ПРЕСС. 2018. 347 c. ISBN 978-5-7422-6330-2.
Шпаков А.О., Бахтюков А.А., Дарьин Д.В., Деркач К.В. Предобработка
крыс аллостерическим агонистом рецептора лютеинизирующего гормона
усиливает стимуляцию продукции тестостерона хорионическим
гонадотропином // Журн. эвол. биохим. физиол. 2019. В печати.
Шпаков А.О., Дарьин Д.В., Деркач К.В., Лобанов П.С. Стимулирующее
влияние тиенопиримидиновых производных на аденилатциклазную сигнальную
систему в семенниках крыс // Доклады Академии наук. 2014а. Т. 456. № 4. С.
494–498.
Шпаков А.О., Деркач К.В., Дарьин Д.В., Лобанов П.С. Активация
аденилатциклазы тиенопиримидиновыми производными в семенниках и
яичниках крыс // Цитология. 2014б. Т. 56. № 5. С. 346–352.
Шпаков А.О., Шпакова Е.А. Низкомолекулярные регуляторы
рецепторов полипептидных гормонов, содержащих LGR-повторы //
Биомедицинская химия. 2010. Т. 56. вып. 3. С. 303–318.
Aghazadeh Y., Zirkin B.R., Papadopoulos V. Pharmacological regulation of
the cholesterol transport machinery in steroidogenic cells of the testis // Vitam. Horm.
2015. V. 98. P. 189–227. doi: 10.1016/bs.vh.2014.12.006.
Anderson R.C., Newton C.L., Millar R.P. Small Molecule Follicle-
Stimulating Hormone Receptor Agonists and Antagonists // Front. Endocrinol.
Angelova K., Fanelli F., Puett D. Contributions of intracellular loops 2 and
3 of the lutropin receptor in Gs coupling // Mol. Endocrinol. 2008. V. 22 (1). P. 126–
138. doi: 10.1210/me.2007-0352.
Arey B.J. Allosteric modulators of glycoprotein hormone receptors:
discovery and therapeutic potential // Endocrine. 2008. V. 34. P. 1–10. doi:
10.1007/s12020-008-9098-2.
Arey B.J., Deecher D.C., Shen E.S., Stevis P.E., Meade E.H., Wrobel J.,
Frail D.E., Lopez F.J. Identification and characterization of a selective, nonpeptide
255
follicle-stimulating hormone receptor antagonist // Endocrinology. 2002. V. 143 (10).
P. 3822–3829. doi: 10.1210/en.2002-220372.
Ayoub M.A., Yvinec R., Jégot G., Dias J.A., Poli S.M., Poupon A., et al.
Profiling of FSHR negative allosteric modulators on LH/CGR reveals biased
antagonism with implications in steroidogenesis // Mol. Cell. Endocrinol. 2016. V.
436. P. 10–22. doi: 10.1016/j.mce.2016.07.013.
Bahamondes L., Bahamondes M.V. New and emerging contraceptives: a
state-of-the-art review // Int. J. Womens Health. 2014. V. 6. P. 221–234. doi:
10.2147/IJWH.S46811.
Banerjee A.A., Mahale S.D. Role of the Extracellular and Intracellular
Loops of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Its Function // Front. Endocrinol.
Banker M., Garcia-Velasco J.A. Revisiting ovarian hyper stimulation
syndrome: Towards OHSS free clinic // J. Hum. Reprod. Sci. 2015. V. 8. P. 13–17.
doi: 10.4103/0974-1208.153120.
Beindl W., Mitterauer T., Hohenegger M., Ijzerman A.P., Nanoff C.,
Freissmuth M. Inhibition of receptor/G protein coupling by suramin analogues // Mol.
Pharmacol. 1996. V. 50 (2). P. 415–423.
Belanger C., Ansanay H., Qanbar R., Bouvier M. Primary sequence
requirements for S-acylation of β2-adrenergic receptor peptides // FEBS Lett. 2001. V.
499. P. 59–64.
Bonger K.M., Hoogendoorn S., van Koppen C.J., Timmers C.M., Overkleeft
H.S., van der Marel G.A. Synthesis and pharmacological evaluation of dimeric
follicle-stimulating hormone receptor antagonists // ChemMedChem. 2009. V. 4 (12).
P. 2098–2102. doi: 10.1002/cmdc.200900344.
Bruysters M.W.P., Verhoef-Post M., Themmen A.P.N. Asp330 and Tyr331 in
the C-terminal cysteine-rich region of the luteinizing hormone receptor are key
residues in hormone-induced receptor activation // J. Biol. Chem. 2008. V. 283 (38).
P. 25821–25828. doi: 10.1074/jbc.M804395200.
Carruthers M. Testosterone deficiency syndrome: cellular and molecular
mechanism of action // Curr. Aging Sci. 2013. V. 6 (1). P. 115–124. doi:
10.2174/18746098112059990008.
Chillar A., Wu J., Cervantes V., Ruan K.H. Structural and functional
analysis of the C-terminus of Gαq in complex with the human thromboxane A2
receptor provides evidence of constitutive activity // Biochemistry. 2010. V. 49 (30).
P. 6365–6374. doi: 10.1021/bi100047n.
Coats S.J., Fitzpatrick L.J., Hlasta D.J., Lanter C.L., Macielag M.J., Pan
K., et al. Inventors; Ortho-McNeill Pharmaceutical, Inc., assignee Substituted
Aminoalkylamide Derivatives as Antagonists of Follicle Stimulating Hormone //
United States patent US 6,583,179 B2. 2003.
Conn P.M., Janovick J.A. Trafficking and quality control of the
gonadotropin releasing hormone receptor in health and disease // Mol. Cell.
Endocrinol. 2009. V. 299 (2). P. 137–145. doi: 10.1016/j.mce.2008.10.051.
256
Danesi R., La Rocca R.V., Cooper M.R., Ricciardi M.P., Pellegrini A.,
Soldani P., Kragel P.J., Paparelli A., Del Tacca M., Myers C.E. Clinical and
experimental evidence of inhibition of testosterone production by suramin // J. Clin.
Endocrinol. Metab. 1996. V. 81. P. 2238–2246. doi: 10.1210/jcem.81.6.8964858.
Daugherty R.L., Cockett A.T., Schoen S.R., Sluss P.M. Suramin inhibits
gonadotropin action in rat testis: Implications for treatment of advanced prostate
cancer // J. Urol. 1992. V. 147. P. 727–732. doi: 10.1016/S0022-5347(17)37367-6.
De Pascali F., Tréfier A., Landomiel F., Bozon V., Bruneau G., Yvinec R.,
Poupon A., Crépieux P., Reiter E. Follicle-Stimulating Hormone Receptor: Advances
and Remaining Challenges // Int. Rev. Cell. Mol. Biol. 2018. V. 338. P. 1-58. doi:
10.1016/bs.ircmb.2018.02.001.
Dias J.A., Bonnet B., Weaver B.A., Watts J., Kluetzman K., Thomas R.M., et
al. A negative allosteric modulator demonstrates biased antagonism of the follicle
stimulating hormone receptor // Mol. Cell. Endocrinol. 2011. V. 333. P. 143–150. doi:
10.1016/j.mce.2010.12.023.
Dias J.A., Campo B., Weaver B.A., Watts J., Kluetzman K., Thomas R.M.,
Bonnet B., Mutel V., Poli S.M. Inhibition of follicle-stimulating hormone-induced
preovulatory follicles in rats treated with a nonsteroidal negative allosteric modulator
of follicle-stimulating hormone receptor // Biol. Reprod. 2014. V. 90 (1). P. 19. doi:
10.1095/biolreprod.113.109397.
Dias J.A., Cohen B.D., Lindau-Shepard B., Nechamen C.A., Peterson A.J.,
Schmidt A. Molecular, structural, and cellular biology of follitropin and follitropin
receptor // Vitam. Horm. 2002. V. 64. P. 249–322.
El Tayer N., Reddy A., Buckler D. Applied Research Systems ARS Holding
N.A., assignee FSH Mimetics for the Treatment of Infertility // Unites States patent
US 6,235,755. 2001.
Fan Q.R., Hendrickson W.A. Structure of human follicle-stimulating
hormone in complex with its receptor // Nature. 2005. V. 433 (7023). P. 269–277. doi:
10.1038/nature03206.
Fanelli F. Dimerization of the lutropin receptor: Insights from
computational modeling // Mol. Cell. Endocrinol. 2007. V. 260–262. P. 59–64. doi:
10.1016/j.mce.2005.12.054.
Fanelli F., De Benedetti P.G., Raimondi R., Seeber M. Computational
modeling of intramolecular and intermolecular communication in GPCRs // Curr.
Prot. Pept. Sci. 2009. V. 10 (2). P. 173–185.
Foulkes N.S., Schlotter F., Pevet P., Sassone-Corsi P. Pituitary hormone
FSH directs the CREM functional switch during spermatogenesis // Nature. 1993. V.
362. P. 264–267. doi: 10.1038/362264a0.
Fralish G.B., Dattilo B., Puett D. Structural analysis of yoked chorionic
gonadotropin-luteinizing hormone receptor ectodomain complexes by circular
dichroic spectroscopy // Mol. Endocrinol. 2003. V. 17 (7). P. 1192–1202. doi:
10.1210/me.2002-0349.
257
Freissmuth M., Boehm S., Beindl W., Nickel P., Ijzerman A.P., Hohenegger
M., Nanoff C. Suramin analogues as subtype-selective G protein inhibitors // Mol.
Pharmacol. 1996. V. 49 (4). P. 602–611.
Galet C., Hirakawa T., Ascoli M. The postendocytotic trafficking of the
human lutropin receptor is mediated by a transferable motif consisting of the C-
terminal cysteine and an upstream leucine // Mol. Endocrinol. 2004. V. 18 (2). P.
4343–4346. doi: 10.1210/me.2003-0293.
Gentry P.R., Sexton P.M., Christopoulos A. Novel allosteric modulators of
G protein-coupled receptors // J. Biol. Chem. 2015. V. 290. P. 19478–19488. doi:
10.1074/jbc.R115.662759.
Gerrits M., Mannaerts B., Kramer H., Addo S., Hanssen R. First evidence of
ovulation induced by oral LH agonists in healthy female volunteers of reproductive
age // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2013. V. 98 (4). P. 1558–1566. doi:
10.1210/jc.2012-3404.
Gilchrist R.L., Ryu K.S., Ji I., Ji T.H. The luteinizing hormone/chorionic
gonadotropin receptor has distinct transmembrane conductors for cAMP and inositol
phosphate signals // J. Biol. Chem. 1996. V. 271 (32). P. 19283–19287. doi:
10.1074/jbc.271.32.19283.
Goebel C. Stimulating luteinizing hormone // Drug Test. Anal. 2011. V. 3
(11-12). P. 868–872. doi: 10.1002/dta.393.
Grima Poveda P.M., Karstens Willem F.J., Timmers C.M. Inventors, N.V.
Organon, assignee 4-Phenyl-5-Oxo-1,4,5,6,7,8-Hexahydroquinoline Derivatives for
the Treatment of Infertility // United States patent US 8,022,218. 2006.
Guan R., Feng X., Wu X., Zhang M., Zhang X., Hebert T.E., Segaloff D.L.
Bioluminescence resonance energy transfer studies reveal constitutive dimerization of
the human lutropin receptor and a lack of correlation between receptor activation and
the propensity for dimerization // J. Biol. Chem. 2009. V. 284 (12). P. 7483–7494.
doi: 10.1074/jbc.M809150200.
Gudermann T., Kalkbrenner F., Schultz G. Diversity and selectivity of
receptor–G protein interaction // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1996. V. 36. P.
429–460. doi: 10.1146/annurev.pa.36.040196.002241.
Guo T., Adang A.E., Dolle R.E., Dong G., Fitzpatrick D., Geng P., et al.
Small molecule biaryl FSH receptor agonists. Part 1: lead discovery via encoded
combinatorial synthesis // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004a. V. 14 (7). P. 1713–1716.
doi: 10.1016/j.bmcl.2004.01.042.
Guo T., Adang A.E., Dong G., Fitzpatrick D., Geng P., Ho K.K., et al. Small
molecule biaryl FSH receptor agonists. Part 2: lead optimization via parallel synthesis
// Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004b. V. 14 (7). P. 1717–1720. doi:
10.1016/j.bmcl.2004.01.043.
Hanssen R.G.J.M., Timmers C.M. Inventors Preparation of
Thienopyrimidines with Combined FSH and LH Activity. 2003.
258
Heitman L.H., Ijzerman A.P. G protein-coupled receptors of the
hypothalamic-pituitary-gonadal axis: a case for Gnrh, LH, FSH, and GPR54 receptor
ligands // Med. Res. Rev. 2008. V. 28 (6). P. 975–1011. doi: 10.1002/med.20129.
Heitman L.H., Kleinau G., Brussee J., Krause G., Ijzerman A.P.
Determination of different putative allosteric binding pockets at the lutropin receptor
by using diverse drug-like low molecular weight ligands // Mol. Cell. Endocrinol.
2012. V. 351. P. 326–336. doi: 10.1016/j.mce.2012.01.010.
Heitman L.H., Narlawar R., de Vries H., Willemsen M.N., Wolfram D.,
Brussee J., Ijzerman A.P. Substituted terphenyl compounds as the first class of low
molecular weight allosteric inhibitors of the luteinizing hormone receptor // J. Med.
Chem. 2009. V. 52 (7). P. 2036–2042. doi: 10.1021/jm801561h.
Heitman L.H., Oosterom J., Bonger K.M., Timmers C.M., Wiegerinck
P.H.G., Ijzerman A.P. [3H]Org 43553, the first low-molecular-weight agonistic and
allosteric radioligand for the human luteinizing hormone receptor // Mol. Pharmacol.
2008. V. 73 (2). P. 518–524. doi: 10.1124/mol.107.039875.
Jangir R.N., Jain G.C. Diabetes mellitus induced impairment of male
reproductive functions: a review // Curr. Diabetes Rev. 2014. V. 10 (3). P. 147–157.
Janovick J.A., Goulet M., Bush E., Greer J., Wettlaufer D.G., Conn P.M.
Structureactivity relations of successful pharmacologic chaperones for rescue of
naturally occurring and manufactured mutants of the gonadotropin-releasing hormone
receptor // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003. V. 305. P. 608–614.
doi:10.1124/jpet.102.048454.
Janovick J.A., Maya-Nunez G., Conn P.M. Rescue of hypogonadotropic
hypogonadism-causing and manufactured GnRH receptor mutants by a specific
protein-folding template: Misrouted proteins as a novel disease etiology and
therapeutic target // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. V. 87 (7). P. 3255–3262. doi:
10.1210/jcem.87.7.8582.
Jäschke H., Neumann S., Moore S., Thomas C.J., Colson A.O., Costanzi S.,
Kleinau G., Jiang J.K., Paschke R., Raaka B.M., Krause G., Gershengorn M.C. A low
molecular weight agonist signals by binding to the transmembrane domain of thyroid-
stimulating hormone receptor (TSHR) and luteinizing hormone/chorionic
gonadotropin receptor (LHCGR) // J. Biol. Chem. 2006. V. 281 (15). P. 9841–9844.
doi: 10.1074/jbc.C600014200.
Jeoung M.K., Lee C.W., Ji I., Ji T.H. Trans-activation, cis-activation and
signal selection of gonadotropin receptors // Mol. Cell. Endocrinol. 2007. V. 260–262.
P. 137–143. doi: 10.1016/j.mce.2005.09.015.
Ji I., Lee C., Jeoung M., Koo Y., Sievert G.A., Ji T.H. Trans-activation of
mutant follicle-stimulating hormone receptors selectively generates only one of two
hormone signals // Mol. Endocrinol. 2004. V. 18. P. 968–978. doi: 10.1210/me.2003-
0443.
Ji I., Lee C., Song Y., Conn P.M., Ji T.H. Cis- and trans-activation of
hormone receptors: The LH receptor // Mol. Endocrinol. 2002. V. 16 (6). P. 1299–
1308. doi: 10.1210/mend.16.6.0852.
259
Jiang X., Dias J.A., He X. Structural biology of glycoprotein hormones and
their receptors: insights to signaling // Mol. Cell. Endocrinol. 2014. V. 382 (1). P.
424–451. doi: 10.1016/j.mce.2013.08.021.
Jiang X., Liu H., Chen X., Chen P.H., Fischer D., Sriraman V., Yu H.N.,
Arkinstall S., He X. Structure of follicle-stimulating hormone in complex with the
entire ectodomain of its receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109 (31). P.
12491–12496. doi: 10.1073/pnas.1206643109.
Jorand-Lebrun C., Brondyk B., Lin J., Magar S., Murray R., Reddy A.,
Schroff H., Wands G., Weiser W., Xu Q., McKenna S., Brugger N. Identification,
synthesis, and biological evaluation of novel pyrazoles as low molecular weight
luteinizing hormone receptor agonists // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007. V. 17 (7). P.
2080–2085. doi: 10.1016/j.bmcl.2006.12.062.
Kanter M., Aktas C., Erboga M. Curcumin attenuates testicular damage,
apoptotic germ cell death, and oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rats
// Mol. Nutr. Food Res. 2013. V. 57 (9). P. 1578–1585. doi: 10.1002/mnfr.201200170.
Kianifard D., Sadrkhanlou R.A., Hasanzadeh S. The ultrastructural changes
of the sertoli and leydig cells following streptozotocin induced diabetes // Iran J. Basic
Med. Sci. 2012. V. 15 (1). P. 623–635.
Kremer H., Kraaij R., Toledo S.P., Post M., Fridman J.B., Hayashida C.Y.,
van Reen M., Milgrom E., Ropers H.H., Mariman E. et al. Male
pseudohermaphroditism due to a homozygous missense mutation of the luteinizing
hormone receptor gene // Nat. Genet. 1995. V. 9 (2). P. 160–164. doi:
10.1038/ng0295-160.
Krishnamurthy H., Kishi H., Shi M., Galet C., Bhaskaran R.S., Hirakawa T.,
Ascoli M. Postendocytotic trafficking of the follicle-stimulating hormone (FSH)-FSH
receptor complex // Mol. Endocrinol. 2003. V. 17. P. 2162–2176. doi:
10.1210/me.2003-0118.
Landomiel F., De Pascali F., Raynaud P., Jean-Alphonse F., Yvinec R.,
Pellissier L.P., Bozon V., Bruneau G., Crépieux P., Poupon A., Reiter E. Biased
Signaling and Allosteric Modulation at the FSHR // Front. Endocrinol. (Lausanne).
2019. V. 10. P. 148. doi: 10.3389/fendo.2019.00148.
Lane J.R., Ijzerman A.P. Allosteric approaches to GPCR drug discovery //
Drug Discov. Today Technol. 2013. V. 10 (2). P. e219–e221. doi:
10.1016/j.ddtec.2013.01.006.
Latronico A.C., Anasti J., Arnhold I.J., Rapaport R., Mendonca B.B., Bloise
W., Castro M., Tsigos C., Chrousos G.P. Brief report: Testicular and ovarian
resistance to luteinizing hormone caused by inactivating mutations of the luteinizing
hormone-receptor gene // N. Engl. J. Med. 1996. V. 334. P. 507–512.
Lee C., Ji I., Ryu K., Song Y., Conn P.M., Ji T.H. Two defective
heterozygous luteinizing hormone receptors can rescue hormone action // J. Biol.
Chem. 2002. V. 277 (18). P. 15795–15800. doi : 10.1074/jbc.M111818200.
260
Lejeune H., Sanchez P., Chuzel F., Langlois D., Saez J.M. Time-course
effects of human recombinant luteinizing hormone on porcine Leydig cell specific
differentiated functions // Mol. Cell. Endocrinol. 1998. V. 144 (1-2). P. 59–69.
Li M., Liu Z., Zhuan L., Wang T., Guo S., Wang S., Liu J., Ye Z. Effects of
apocynin on oxidative stress and expression of apoptosis-related genes in testes of
diabetic rats // Mol. Med. Rep. 2013. V. 7 (1). P. 47–52. doi:
10.3892/mmr.2012.1132.
Liu H., Lin S., Lv Q., Yang Q., Wu G., Hu J., Yang J. Taurine recovers
testicular steroidogenesis and spermatogenesis in streptozotocin-induced diabetic rats
// Adv. Exp. Med. Biol. 2017. V. 975 (Pt. 2). P. 801–811. doi: 10.1007/978-94-024-
1079-2_62.
Maclean D., Holden F., Davis A.M., Scheuerman R.A., Yanofsky S., Holmes
C.P., Fitch W.L., Tsutsui K., Barrett R.W., Gallop M.A. Agonists of the follicle
stimulating hormone receptor from an encoded thiazolidinone library // J. Comb.
Chem. 2004. V. 6. P. 196–206. doi: 10.1021/cc0300154.
Magar S., Goutopoulos A., Liao Y., Schwarz M., Russell T.J. Piperazine
Derivatives and Methods of Use // Patent WO2004031182A1. 2002.
Manglik A., Kobilka B.K., Steyaert J. Nanobodies to study G protein-
coupled receptor structure and function // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2017. V.
57. P. 19–37. doi: 10.1146/annurev-pharmtox-010716-104710.
Mizrachi D., Segaloff D.L. Intracellularly located misfolded glycoprotein
hormone receptors associate with different chaperone proteins than their cognate
wild-type receptors // Mol. Endocrinol. 2004. V. 18 (7). P. 1768–1777. doi:
10.1210/me.2003-0406.
Moore S., Jaeschke H., Kleinau G., Neumann S., Costanzi S., Jiang J.K.,
Childress J., Raaka B.M., Colson A., Paschke R., Krause G., Thomas C.J.,
Gershengorn M.C. Evaluation of small-molecule modulators of the luteinizing
hormone/choriogonadotropin and thyroid stimulating hormone receptors: structure-
activity relationships and selective binding patterns // J. Med. Chem. 2006. V. 49 (13).
P. 3888–3896. doi: 10.1021/jm060247s.
Morello J.P., Salahpour A., Laperrière A., Bernier V., Arthus M.F.,
Lonergan M., Petäjä-Repo U., Angers S., Morin D., Bichet D.G., Bouvier M.
Pharmacological chaperones rescue cell-surface expression and function of misfolded
V2 vasopressin receptor mutants // J. Clin. Invest. 2000. V. 105. P. 887–895.
Nakamura K., Hipkin R.W., Ascoli M. The agonist-induced phosphorylation
of the rat follitropin receptor maps to the first and third intracellular loops // Mol.
Endocrinol. 1998a. V. 12. P. 580–591. doi: 10.1210/mend.12.4.0087.
Nakamura K., Krupnick J.G., Benovic J.L., Ascoli M. Signaling and
phosphorylation-impaired mutants of the rat follitropin receptor reveal an activation-
and phosphorylation-independent but arrestin-dependent pathway for internalization //
J. Biol. Chem. 1998b. V. 273 (38). P. 24346–24354. doi: 10.1074/jbc.273.38.24346.
261
Nataraja S.G., Yu H.N., Palmer S.S. Discovery and development of small
molecule allosteric modulators of glycoprotein hormone receptors // Front.
Endocrinol. (Lausanne). 2015. V. 6. P. 142. doi: 10.3389/fendo.2015.00142.
Newton C.L., Whay A.M., McArdle C.A., Zhang M., van Koppen C.J., van
de Lagemaat R., Segaloff D.L., Millar R.P. Rescue of expression and signaling of
human luteinizing hormone G protein-coupled receptor mutants with an allosterically
binding small-molecule agonist // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. V. 108. № 17. P.
7172–77176. doi: 10.1073/pnas.1015723108.
Palermo R. Differential actions of FSH and LH during folliculogenesis //
Reprod. Biomed. Online. 2007. V. 15 (3). P. 326–337. doi: 10.1016/S1472-
6483(10)60347-1.
Payne A.H., Hales D.B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway
from cholesterol to active steroid hormones // Endocr. Rev. 2004. V. 25 (6). P. 947–
970. doi: 10.1210/er.2003-0030.
Pelletier J.C., Rogers J., Wrobel J., Perez M.C., Shen E.S. Preparation of
highly substituted gamma-lactam follicle stimulating hormone receptor agonists //
Bioorg. Med. Chem. 2005. V. 13. P. 5986–5995. doi: 10.1016/j.bmc.2005.07.025.
Petäjä-Repo U.E., Hogue M., Bhalla S., Laperrière A., Morello J.P.,
Bouvier M. Ligands act as pharmacological chaperones and increase the efficiency of
delta opioid receptor maturation // EMBO J. 2002. V. 21 (7). P. 1628–1637. doi:
10.1093/emboj/21.7.1628.
Puett D., Angelova K., da Costa M.R., Warrenfeltz S.W., Fanelli F. The
luteinizing hormone receptor: insights into structure-function relationships and
hormone-receptor-mediated changes in gene expression in ovarian cancer cells // Mol.
Cell. Endocrinol. 2010. V. 329 (1–2). P. 47–55. doi: 10.1016/j.mce.2010.04.025.
Puett D., Li Y., Angelova K., DeMars G., Meehan T.P., Fanelli F., Narayan
P. Structure-function relationships of the luteinizing hormone receptor // Ann. N.Y.
Acad. Sci. 2005. V. 1061. P. 41–54. doi: 10.1196/annals.1336.006.
Puett D., Li Y., DeMars G., Angelova K., Fanelli F. A functional
transmembrane complex: The luteinizing hormone receptor with bound ligand and G
protein // Mol. Cell. Endocrinol. 2007. V. 260–262. P. 126–136. doi:
10.1016/j.mce.2006.05.009.
Quintana J., Hipkin R.W., Sanchez-Yague J., Ascoli M. Follitropin (FSH)
and a phorbol ester stimulate the phosphorylation of the FSH receptor in intact cells //
J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 8772–8779. doi: 10.1210/jbc.Fedrrv.2.5.0409.
Riccetti L., De Pascali F., Gilioli L., Potì F., Giva L.B., Marino M.,
Tagliavini S., Trenti T., Fanelli F., Mezzullo M., Pagotto U., Simoni M., Casarini L.
Human LH and hCG stimulate differently the early signalling pathways but result in
equal testosterone synthesis in mouse Leydig cells in vitro // Reprod. Biol.
Endocrinol. 2017a. V. 15 (1). P. 2. doi: 10.1186/s12958-016-0224-3.
Riccetti L., Yvinec R., Klett D., Gallay N., Combarnous Y., Reiter E., Simoni
M., Casarini L., Ayoub M.A. Human luteinizing hormone and chorionic gonadotropin
262
display biased agonism at the LH and LH/CG receptors // Sci. Rep. 2017b. V. 7 (1). P.
940. doi: 10.1038/s41598-017-01078-8.
Rivero-Muller A., Chou Y.Y., Ji I., Lajic S., Hanyaloglu A.C., Jonas K.,
Rahman N., Ji T.H., Huhtaniemi I. Rescue of defective G protein-coupled receptor
function in vivo by intermolecular cooperation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010.
V. 107 (5). P. 2319–2324. doi: 10.1073/pnas.0906695106.
Robker R.L., Richards J.S. Hormonal control of the cell cycle in ovarian
cells: proliferation versus differentiation // Biol. Reprod. 1998. V. 59. P. 476–482.
doi: 10.1095/biolreprod59.3.476.
Roess D.A., Horvat R.D., Munnelly H., Barisas B.G. Luteinizing hormone
receptors are self-associated in the plasma membrane // Endocrinology. 2000. V. 141
(12). P. 4518–4523. doi: 10.1210/endo.141.12.7802.
Segaloff D.L. Diseases associated with mutations of the human lutropin
receptor / In: Tao Y.-X., editor. Progress in Molecular Biology and Translational
Science: G Protein-Coupled Receptors in Health and Disease, Part B. Elsevier;
London. 2009. P. 97–114.
Schoeller E.L., Schon S., Moley K.H. The effects of type 1 diabetes on the
hypothalamic, pituitary and testes axis // Cell Tissue Res. 2012. V. 349 (3). P. 839–
847. doi: 10.1007/s00441-012-1387-7.
Schulz A., Schoneberg T., Paschke R., Shultz G., Gudermann T. Role of the
third intracellular loop for the activation of gonadotropin receptors // Mol. Endocrinol.
1999. V. 13 (2). P. 181–190. doi: 10.1210/mend.13.2.0233.
Small E.J., Meyer M., Marshall M.E., Reyno L.M., Meyers F.J., Natale R.B.,
et al. Suramin therapy for patients with symptomatic hormone-refractory prostate
cancer: results of a randomized phase III trial comparing suramin plus hydrocortisone
to placebo plus hydrocortisone // J. Clin. Oncol. 2000. V. 18. P. 1440–1450. doi:
10.1200/JCO.2000.18.7.1440.
Sokanovic S.J., Capo I., Medar M.M., Andric S.A., Kostic T.S. Long-term
inhibition of PDE5 ameliorates aging-induced changes in rat testis // Exp. Gerontol.
2018. V. 108. P. 139–148. doi: 10.1016/j.exger.2018.04.007.
Sokanovic S.J., Janjic M.M., Stojkov N.J. et al. Age related changes of
cAMP and MAPK signaling in Leydig cells of Wistar rats // Exp. Gerontol. 2014. V.
58. P. 19–29. doi: 10.1016/j.exger.2014.07.004.
Sriraman V., Denis D., de Matos D., Yu H., Palmer S., Nataraja S.
Investigation of a thiazolidinone derivative as an allosteric modulator of follicle
stimulating hormone receptor: evidence for its ability to support follicular
development and ovulation // Biochem. Pharmacol. 2014. V. 89 (2). P. 266–275. doi:
10.1016/j.bcp.2014.02.023.
Stevis P.E., Deecher D.C., Lopez F.J., Frail D.E. Pharmacological
characterization of soluble human FSH receptor extracellular domain: Facilitated
secretion by co-expression with FSH // Endocrine. 1999. V. 10. P. 153–160. doi:
10.1385/ENDO:10:2:153.
263
Tang P.Z., Tsai-Morris C.H., Dufau M.L. Regulation of 3beta-
hydroxysteroid dehydrogenase in gonadotropin-induced steroidogenic desensitization
of Leydig cells // Endocrinology. 1998. V. 139 (11). P. 4496–4505. doi:
10.1210/endo.139.11.6316.
Tao Y.X., Johnson N.B., Segaloff D.L. Constitutive and agonist-dependent
self-association of the cell surface human lutropin receptor // J. Biol. Chem. 2004. V.
279 (7). P. 5904–5914. doi: 10.1074/jbc.M311162200.
Themmen A.P.N., Huhtaniemi I.T. Mutations of gonadotropins and
gonadotropin receptors: elucidating the physiology and pathophysiology of pituitary-
gonadal function // Endocr. Rev. 2000. V. 21. P. 551–583. doi:
10.1210/edrv.21.5.0409.
Timmers C.M., Karstens W.F., Grima Poveda P.M. Inventors; N.V.
Organon, assignee 4-Phenyl-5-Oxo-1,4,5,6,7,8-Hexahydroquinoline Derivatives as
Medicaments for the Treatment of Infertility. United States patent US
WO2006/117370. 2006.
Ulloa-Aguirre A., Dias J.A., Bousfield G., Huhtaniemi I., Reiter E.
Trafficking of the follitropin receptor // Methods Enzymol. 2013. V. 521. P. 17–45.
doi: 10.1016/B978-0-12-391862-8.00002-8.
Urizar E., Montanelli L., Loy T., Bonomi M., Swillens S., Gales C., Bouvier
M., Smits G., Vassart G., Costagliola S. Glycoprotein hormone receptors: Link
between receptor homodimerization and negative cooperativity // EMBO J. 2005. V.
24 (11). P. 1954–1964. doi: 10.1038/sj.emboj.7600686.
van de Lagemaat R., van Koppen C.J., Krajnc-Franken M.A., Folmer B.J.,
van Diepen H.A., Mulders S.M., et al. Contraception by induction of luteinized
unruptured follicles with short-acting low molecular weight FSH receptor agonists in
female animal models // Reproduction. 2011a. V. 142. P. 893–905. doi: 10.1530/REP-
11-0234.
van de Lagemaat R., Raafs B.C., van Koppen C., Timmers C.M., Mulders
S.M., Hanssen R.G. Prevention of the onset of ovarian hyperstimulation syndrome
(OHSS) in the rat after ovulation induction with a low molecular weight agonist of the
LH receptor compared with hCG and rec-LH // Endocrinology. 2011b. V. 152 (11). P.
4350–4357. doi: 10.1210/en.2011-1077.
van de Lagemaat R., Timmers C.M., Kelder J., van Koppen C., Mosselman
S., Hanssen R.G. Induction of ovulation by a potent, orally active, low molecular
weight agonist (Org 43553) of the luteinizing hormone receptor // Hum. Reprod.
2009. V. 24 (3). P. 640–648. doi: 10.1093/humrep/den412.
van Koppen C.J., Verbost P.M., van de Lagemaat R., Karstens W.J., Loozen
H.J., van Achterberg T.A., et al. Signaling of an allosteric, nanomolar potent, low
molecular weight agonist for the follicle-stimulating hormone receptor // Biochem.
Pharmacol. 2013. V. 85 (8). P. 1162–1170. doi: 10.1016/j.bcp.2013.02.001.
van Koppen C.J., Zaman G.J., Timmers C.M., Kelder J., Mosselman S., van
de Lagemaat R., Smit M.J., Hanssen R.G. A signaling-selective, nanomolar potent
allosteric low molecular weight agonist for the human luteinizing hormone receptor //
264
Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 2008. V. 378 (5). P. 503–514. doi:
10.1007/s00210-008-0318-3.
van Straten N.C., Schoonus-Gerritsma G.G., van Someren R.G., Draaijer J.,
Adang A.E., Timmers C.M., Hanssen R.G., van Boeckel C.A. The first orally active
low molecular weight agonists for the LH receptor: Thienopyr(im)idines with
therapeutic potential for ovulation induction // ChemBioChem. 2002. V. 3 (10). P.
1023–1026. doi: 10.1002/1439-7633(20021004)3:10<1023::AID-
CBIC1023>3.0.CO;2-9.
van Straten N.C., Timmers C.M. Non-Peptide ligands for the gonadotropin
receptors // Annu. Rep. Med. Chem. 2009. V. 44. P. 171–188. doi: 10.1016/S0065-
7743(09)04408-X.
Van Straten N.C., van Berkel T.H., Demont D.R., Karstens W.J., Merkx R.,
Oosterom J., Schulz J., van Someren R.G., Timmers C.M., van Zandvoort P.M.
Identification of substituted 6-amino-4-phenyltetrahydroquinoline derivatives: potent
antagonists for the follicle-stimulating hormone receptor // J. Med. Chem. 2005. V.
48. P. 1697–1700. doi: 10.1021/jm049676l.
Vegetti W., Alagna F. FSH and folliculogenesis: from physiology to ovarian
stimulation // Reprod. Biomed. Online. 2006. V. 12 (6). P. 684–694. doi:
10.1016/S1472-6483(10)61080-2.
Verma A., Saraf S.K. 4-thiazolidinone–a biologically active scaffold // Eur.
J. Med. Chem. 2008. V. 43. P. 897–905. doi: 10.1016/j.ejmech.2007.07.017.
Warren A.M., Gurvich C., Worsley R., Kulkarni J. A systematic review of
the impact of oral contraceptives on cognition // Contraception. 2014. V. 90 (2). P.
111–116. doi: 10.1016/j.contraception.2014.03.015.
Wrobel J., Green D., Jetter J., Kao W., Rogers J., Pérez M.C., et al.
Synthesis of (bis)sulfonic acid, (bis)benzamides as follicle-stimulating hormone
(FSH) antagonists // Bioorg. Med. Chem. 2002. V. 10. P. 639–656. doi:
10.1016/S0968-0896(01)00324-8.
Wrobel J., Jetter J., Kao W., Rogers J., Di L., Chi J., et al. 5-alkylated
thiazolidinones as follicle-stimulating hormone (FSH) receptor agonists // Bioorg.
Med. Chem. 2006. V. 14. P. 5729–5741. doi: 10.1016/j.bmc.2006.04.012.
Yanofsky S.D., Shen E.S., Holden F., Whitehorn E., Aguilar B., Tate E., et
al. Allosteric activation of the follicle-stimulating hormone (FSH) receptor by
selective, nonpeptide agonists // J. Biol. Chem. 2006. V. 281 (19). P. 13226–13233.
doi: 10.1074/jbc.M600601200.
Zhang M., Feng X., Guan R., Hebert T.E., Segaloff D.L. A cell surface
inactive mutant of the human lutropin receptor (hLHR) attenuates signaling of wild-
type or constitutively active receptors via heterodimerzation // Cell. Signal. 2009. V.
21 (11). P. 1663–1671. doi: 10.1016/j.cellsig.2009.07.003.
receptor homomers // Nat. Commun. 2012. V. 3. P. 1007. doi: 10.1038/ncomms1991.
265
ГЛАВА 6
Аллостерические регуляторы рецептора

6.1. Тиреотропный гормон и другие эндогенные

регуляторы рецепторов тиреотропного гормона
Тиреотропный гормон (ТТГ), эндогенный агонист

рецептора ТТГ, вместе с гонадотропинами относится к семейству
гликопротеиновых гипофизарных гормонов. Они состоят из
одинаковой по первичной структуре α-субъединицы, кодируемой
одним геном, и структурно различных β-субъединиц, которые и
определяют типовую принадлежность гормона. В мономерном
состоянии β-субъединица ТТГ лишена какой-либо
специфической активности и способна взаимодействовать с
рецептором ТТГ только находясь в комплексе с α-субъединицей.
αβ-Гетеродимерный комплекс ТТГ, как и в случае
гонадотропинов, представляет собой структуру типа
«цистиновых узлов», в которой α- и β-субъединицы переплетены
между собой. Чтобы комплекс был стабильным, «цистиновые
узлы» фиксируются, точно застежками, дисульфидными связями.
Таким образом, комплекс приобретает высокую устойчивость не
только к детергентам, которые способны разрушать белковые
комплексы, но и к восстанавливающим агентам, которые
разрушают дисульфидные связи и, тем самым, приводят к
диссоциации белковых комплексов. Рассчитанная масса αβ-
гетеродимерного комплекса ТТГ составляет около 28 кДа, в то
время как его реальная масса существенно выше. Это
266
обусловлено посттрасляционным N-гликозилированием α- и β-
субъединиц ТТГ (в среднем рассчитанная масса при этом
повышается на 15 %). α-Субъединица включает 92
аминокислотных остатка, включая 10 остатков цистеина,
способных к образованию дисульфидных связей. β-Субъединица
имеет 118 аминокислотных остатков (ТТГβ человека) и в ходе
посттрансляционного процессинга подвергается ограниченному
протеолизу по С-концевому сегменту, укорачиваясь до 112
аминокислотных остатков.
После ограниченного протеолиза в тиреотрофах
осуществляется N-гликозилирование β-субъединицы ТТГ.
Сначала к остатку аспарагина Asn23, который является
единственным в молекуле ТТГβ сайтом для N-гликозилирования,
с помощью олигосахарилтрансферазы присоединяется
олигосахаридный предшественник, после чего образовавшийся
гликопротеин транслоцируется из шероховатого
эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи, где под
действием большого числа гликозидаз и гликозилтрансфераз,
происходит «созревание» гликозильной компоненты ТТГβ. В
ходе структурной модификации гликозильной компоненты часть
маннозильных остатков в олигосахаридном предшественнике
удаляется. К образовавшемуся в результате этого
олигосахаридному остову присоединяются остатки
сульфатированного N-ацетилгалактозамина, N-
ацетилглюкозамина, фукозы, галактозы или сиаловой кислоты.
Важно отметить, что остатки сульфатированного N-
ацетилгалактозамина и сиаловой кислоты несут отрицательный
заряд, наиболее высокий у сульфатированного N-
ацетилгалактозамина, что придает молекуле ТТГβ суммарный
отрицательный заряд, и это крайне важно для образования
функционально активного αβ-гетеродимерного комплекса ТТГ
(Fares, 2006). Параллельно с N-гликозилированием β-
субъединицы в тиреотрофах осуществляется N-гликозилирование
α-субъединицы, в структуре которой имеются два сайта для N-
гликозилирования – остатки Asn52 и Asn78 (рис. 6-1).
267
Рис. 6-1. Трехмерная структура αβ-гетеродимерного комплекса ТТГ

человека (по Estrada et al., 2014).
Условные обозначения: α-субъединица представлена серой линией,
ТТГβ – черной линией. Шпилькообразные петли, имеющиеся в обеих
субъединицах, обозначены как L1 и L3, в то время как протяженные
петли, исходящие из центральной части гетеродимера, обозначены
как L2. Функционально важные участки α-субъединицы и ТТГβ
выделены штриховыми линиями. Представлены сайты для N-
гликозилирования (остатки Asn23, Asn52 и Asn78) и структура
олигосахаридных радикалов, которые модифицируют эти сайты.
Наряду со стабилизацией αβ-гетеродимерного комплекса

и обеспечения адекватной специфической активности ТТГ, N-
гликозилирование влияет на утилизацию ТТГ в кровотоке,
определяя время полужизни гормона в крови и регулируя, тем
самым, выработку тиреоидных гормонов тироцитами
268
щитовидной железы (Persani, 1998). Показано, что
дегликозилированные формы ТТГ не только не способны сами
активировать рецептор ТТГ, но и по конкурентному механизму
препятствуют их активации нормально гликозилированными
молекулами ТТГ (Fares, 2001).
Стабилизирующий структуру αβ-гетеродимерного
комплекса ТТГ «цистиновый центр», образован тремя
внутренними дисульфидными связями и окружен
шпилькообразными петлями L1 и L3, с одной стороны, и
протяженными петлями L2 от каждой субъединицы, с другой
(рис. 6-1). α-Субъединица, подобно тому, как это происходит в
молекулах гонадотропинов, отвечает в основном за
эффективность связывания и играет важную роль в изменении
конформации эктодомена и передачи этих конформационных
изменений к трансмембранному домену рецептора ТТГ, в то
время как ТТГβ содержит основные молекулярные
детерминанты, ответственные за специфическое высокоаффинное
связывание с рецептором ТТГ. Ключевую роль в связывании с
рецептором играют участок ТТГβ, расположенный между
десятым и двенадцатым остатками цистеина (Cys86 и Cys105), и
дисульфидная связь между остатками Cys39 и Cys125, которые
формируют так называемый «ремень безопасности»,
опоясывающий αβ-гетеродимерный комплекс и фиксирующий в
надлежащей конформации α-субъединицу ТТГ. Мутации в гене
TSHB, кодирующем ТТГβ, такие как замены Gly29Arg, Cys85Arg,
Cys88Tyr и Cys105Val, а также нонсенс-мутации (Glu12X и Gln49X),
ведущие к укороченным формам ТТГβ, приводят к нарушению
образования αβ-гетеродимерного комплекса и, как следствие, к
снижению эффективности или полному отсутствию связывания
мутантных форм гормона с рецептором ТТГ. Такие мутации
являются причинами врожденного гипотиреоза и других
патологий тиреоидной системы (Deladoëy et al., 2003;
Schoenmakers et al., 2015).
Основными регуляторами синтеза и секреции ТТГ
тиреотрофами являются тиролиберин – рилизинг-фактор ТТГ,
269
продуцируемый тиролиберин-экспрессирующими нейронами, и
тиреоидные гормоны. При этом тироксин и значительная часть
трийодтиронина продуцируются тироцитами щитовидной
железы, в то время как оставшаяся часть трийодтиронина
синтезируется с помощью фермента D2-дейодиназы в мозге и
ряде периферических органов и тканей. Тиролиберин,
воздействуя на специфичные к нему рецепторы в тиреотрофах,
является мощным стимулятором синтеза и секреции ТТГ (Fekete,
Lechan, 2014), в то время как действующие по механизму
отрицательной обратной связи тиреоидные гормоны, напротив,
подавляют продукцию ТТГ.
В гипофизе человека также имеется структурный и
функциональный гомолог ТТГ – гликопротеиновый гормон
тиростимулин, который активирует рецептор ТТГ и, тем самым,
усиливает продукцию тиреоидных гормонов (Nakabayashi et al.,
2002). Тиростимулин состоит из двух субъединиц – α2-
субъединицы (GPA2) и β5-субъединицы (GPB5), которые при
сравнении с соответствующими α- и β-субъединицами ТТГ
имеют 29 и 43 % гомологии первичной структуры. Тиростимулин
частично замещает неактивные формы ТТГ у людей с
врожденным гипотиреозом, компенсируя отсутствие у них
функционально активного ТТГ (Wondisford, 2002). У человека
GPA2/GPB5-гетеродимер экспрессируется в семенниках,
яичниках, сетчатке глаз, в то время как в гипофизе
экспрессируется в основном мономерная GPA2-субъединица. У
крысы тиростимулин выявлен в яичниках, где он стимулирует
рецепторы ТТГ, экспрессируемые в клетках гранулезы,
демонстрируя паракринную активность (Baquedano et al., 2010).
Уникальной особенностью рецептора ТТГ является
наличие для него так называемого «внутреннего агониста» –
декапептида, включающего участок Asp403–Asn406, в С-концевом
сегменте шарнирной области внеклеточного домена (эктодомена)
рецептора ТТГ, непосредственно перед его трансмембранным
доменом (Kleinau et al., 2004; Mueller et al., 2006; Chen et al.,
2012). Этот пептид по фармакологической активности является
270
агонистом рецептора ТТГ, но его агонистическое действие
выявляется только в сравнительно высоких, миллимолярных,
концентрациях (Bruser et al., 2016; Schoneberg et al., 2016). В
основе регуляторного действия этого пептида лежит его
способность специфично взаимодействовать с внеклеточными
участками трансмембранного домена рецептора ТТГ, конкретно –
с его первой внеклеточной петлей, что облегчает переход
рецептора в активированное состояние (Vlaeminck-Guillem et al.,
2002; Kleinau et al., 2004; Bruser et al., 2016).
В настоящее время ТТГ, как и другие эндогенные
регуляторы рецептора ТТГ, практически не используется в
клинической медицине, что связано с его онкогенным
потенциалом и другими побочными эффектами, а также с низкой
стабильностью, иммуногенностью и высокой стоимостью. В то
же время роль ТТГ в регуляции физиологических и
биохимических процессов как в норме, так и при различных
патологиях исключительно важна. В условиях метаболических
расстройств, в зависимости от их этиопатогенеза и
функциональной активности щитовидной железы, могут
применяться как лиганды рецептора ТТГ с активностью полных
агонистов, так и с активностью инверсионных агонистов и
нейтральных антагонистов. В свою очередь, лиганды с
активностью инверсионных агонистов и антагонистов рецептора
ТТГ могут быть эффективны при лечении аутоиммунных
заболеваний щитовидной железы, вызванных стимулирующими
антителами к рецептору ТТГ (Davies, Latif, 2019). Они также
могут применяться для коррекции значительного повышения
уровня ТТГ при различных формах гипотиреоза. Как препараты
ТТГ, так и различные по химической структуре и молекулярным
механизмам действия регуляторы рецептора ТТГ другой природы
не используют в клинике для коррекции дефицита тиреоидных
гормонов и лечения аутоиммунной тиреоидной патологии.
Исключение составляют препараты ТТГ, которые применяют,
причем, как правило, однократно, для повышения поглощения
радиоактивных изотопов йода тироцитами при радиоизотопной
271
диагностике узлового зоба и злокачественных опухолей
щитовидной железы (Duntas, Cooper, 2008; Galofré et al., 2013).
Вследствие этого в последние годы ведется интенсивная
разработка синтетических аллостерических регуляторов
рецептора ТТГ на основе низкомолекулярных его лигандов с
активностью полных и инверсионных агонистов и нейтральных
антагонистов (см. Раздел 6.5).
6.2. Структурно-функциональная организация

Рецептор ТТГ относится к рецепторам, функционально

сопряженным с G-белками (GPCR), и вместе с близкими ему
рецепторами лютеинизирующего (ЛГ) и
фолликулостимулирующего (ФСГ) гормонов составляет одно
подсемейство (Fredriksson et al., 2003; Vassart et al., 2004b).
Особенностью представителей этого подсемейства является
значительный по размеру внеклеточный домен (эктодомена), в
котором локализован высокоаффинный (ортостерический) сайт
рецептора. Эктодомен включает около 400 аминокислотных
остатков и условно может быть разделен на две основные
структурные части. Первая из них – субдомен, который
сформирован 11 повторяющимися участками, обогащенными
остатками лейцина (leucine-rich repeats, LRR), в то время как
вторая часть – это шарнирная область (hinge region), обогащенная
остатками цистеина, которая выполняет функции спейсера и
расположена между LRR-субдоменом и серпантинным доменом.
В свою очередь, трансмембранный домен образован
гидрофобными спиральными участками и соединяющими их
внеклеточными и цитоплазматическими петлями (рис. 6-2)
(Vassart et al., 2004a, 2004b; Kleinau et al., 2011b).
272
273
Рис. 6-2. Структурная организация рецептора тиреотропного
гормона.
ТТГ специфически связывается с ортостерическим сайтом
эктодомена рецептора ТТГ, причем β-субъединица ТТГ связывается
с локализованными в эктодомене обогащенными остатками лейцина
повторами (LRR), в то время как α-субъединица ТТГ также
взаимодействует с шарнирной, обогащенной остатками цистеина
областью эктодомена, и важную роль в этом взаимодействии играет
локализованный в шарнирной области сульфатированный остаток
тирозина. Семь гидрофобных участков, пронизывающих
плазматическую мембрану, и соединяющие их петли формируют
трансмембранный домен. Наряду с ТТГ, рецептор может быть
активирован с помощью других лигандов, которые способны
связываться с внеклеточными петлями и далее с полостью
трансмембранного домена рецептора ТТГ (по Kleinau et al., 2017).
Установлено, что ТТГ и специфичные к рецептору ТТГ

антитела взаимодействуют исключительно с эктодоменом
рецептора ТТГ (Smits et al., 2003; Caltabiano et al., 2008; Sanders et
al., 2007, 2008; Chen et al., 2010).
6.2.1. Внеклеточный домен рецептора ТТГ
В LRR-субдомене и шарнирной области эктодомена

имеются шесть аспарагин-содержащих сайтов для N-
гликозилирования (Asn-Xaa-Ser/Thr), причем для нормальной
экспрессии и функциональной активности рецептора ТТГ
необходимо гликозилирование, по крайней мере, четырех таких
сайтов (Russo et al., 1991; Oda et al., 1999; Nagayama et al., 2000;
Nunez Miguel et al., 2017a, 2017b). Участки LRR имеют от 20 до
30 аминокислотных остатков и сходны по структуре с LRR-
повторами, локализованными в рецепторах ЛГ и ФСГ (Kleinau,
Krause, 2009). Участки LRR имеют форму изогнутой косы с
небольшим поворотом при движении от N-конца к C-концу (рис.
6-3).
274
275
Рис. 6-3. Модель эктодомена рецептора ТТГ (А), а также
шарнирного участка эктодомена (Б).
(А) LRR-субдомен рецептора ТТГ включает основной
высокоаффинный (ортостерический) сайт для связывания как ТТГ,
так и аутоантител к рецептору ТТГ. Они специфично связываются с
сайтом, локализованным в вогнутой части LRR-субдомена,
который образован β-складчатыми структурами. Боковые цепи
гидрофобных аминокислотных остатков расположены
преимущественно во внутренней полости этого субдомена и
вовлечены в стабилизацию его пространственной структуры, в то
время как боковые группы ароматических аминокислотных
остатков стабилизируют меж-LRR-взаимодействия и имеют
большое значение для формирования ортостерического сайта и для
связывания ТТГ и аутоантител. LRR-субдомен включает 11
повторов (r1–r11), что соответствует последовательности 24–288. В
С-концевой части LRR-субдомена, на выпуклой его стороне,
расположен 11-й повтор, который включает остатки цистеина
(Cys283 и Cys284). Эти остатки образуют дисульфидные мостики с
двумя цистеинами, локализованными в С-концевом сегменте
шарнирной области, стабилизируя, тем самым, комплекс между
LRR-субдоменом и шарнирным участком. Показано, что замены
остатка Ser281, локализованного вблизи С-конца LRR-субдомена, на
другие аминокислоты приводят к мутантным рецепторам с
конститутивно повышенной активностью, что является причиной
врожденного тиреотоксикоза (Duprez et al., 1997, Kopp et al., 1997).
Остаток лизина в положении 183, локализованный в седьмом LRR,
играет ключевую роль в связывании лиганда, будучи важнейшей
аминокислотой, формирующей ортостерический сайт. Его замена
на аргинин приводит к изменению специфичности связывания
рецептора ТТГ и индуцирует его функциональное взаимодействие с
ХГЧ (Jaeschke et al., 2006a; Ho et al., 2008).
(Б) Представлены N- и C-концевые фрагменты шарнирной области
рецептора ТТГ – участки 289–304 и 382–409. Остаток Cys398,
расположенный в небольшой по протяженности β-складчатой
структуре, а также следующий за ним Cys408 участвуют в
образовании дисульфидных связей с Cys283 и Cys284 LRR-
субдомена. Третий дисульфидный мостик образован остатками
Cys301 и Cys390, локализованными в шарнирной области и
стабилизирующими ее циклическую структуру. Важную роль в
связывании гормона играет остаток сульфатированного тирозина,
локализованный в положении 385 (Costagliola et al., 2002) (по
Kleinau et al., 2017).
276
Боковые цепи гидрофобных аминокислотных остатков

формируют внутреннюю полость LRR-субдомена и
стабилизируют его структуру, в то время как боковые цепи
ароматических аминокислотных остатков необходимы для
поддержания устойчивости цепи участков LRR и вовлечены в
связывание гормона. Интересно, что на кристаллической
структуре эктодомена рецептора ТТГ отчетливо видны только
девять участков LRR (Sanders et al., 2007, 2008), в то время как
анализ первичной структуры эктодомена, его молекулярное
моделирование, а также данные сайт-направленного мутагенеза
свидетельствуют о наличии 11 таких участков (Kleinau et al.,
2017). В пользу формирования 11 LRR свидетельствует и тот
факт, что в LRR-субдомене родственного рецептора ФСГ также
выявлено 11 таких участков (Jiang et al., 2012).
В отличие от сходных по длине и структурной
организации первых десяти LRR, 11-й участок, расположенный в
С-концевой области LRR-субдомена, на границе с шарнирной
областью, формирует относительно короткую спираль и
включает два остатка цистеина в положениях 283 и 284, которые,
как полагают, способны образовывать дисульфидные связи с
двумя остатками цистеина, локализованными в шарнирной
области рецептора (Ho et al., 2001; Jiang et al., 2012). Образуемые
этими цистеинами дисульфидные мостики исключительно важны
как для оптимального взаимного расположения LRR-субдомена и
шарнирной области эктодомена, так и для взаимодействия
эктодомена и трансмембранного домена. Мутации, влияющие на
устойчивость С-концевой спирали LRR-субдомена и
препятствующие образованию дисульфидных связей, критичны
для функциональной активности рецептора ТТГ. Так замены
остатка серина в положении 281 приводят к конститутивно
активному рецептору ТТГ, что вызывает врожденный
гипертиреоз (Duprez et al., 1997; Kopp et al., 1997). Причина этого
состоит в дестабилизации спирали 11-го LRR, следствием чего
277
является нарушение функционального сопряжения между
эктодоменом и трансмембранным доменом рецептора ТТГ (Ho et
al., 2001, 2008; Jaeschke et al., 2006a).
Несмотря на то, что шарнирная область в рецепторе ТТГ,
как и в других рецепторах гипофизарных гликопротеиновых
гормонов, структурно и функционально связывает LRR-субдомен
с трансмембранным доменом, обеспечивая, тем самым, ключевой
этап сигнальной трансдукции, о ее структурных особенностях и
молекулярных механизмах функционирования известно немного
(Jiang et al., 2014). Это обусловлено тем, что структурная
организация и набор конформаций шарнирной области рецептора
ТТГ в значительной степени определяются соседними с ней LRR-
субдоменом и внеклеточными петлями трансмембранного
домена, а структура этой области в изолированном состоянии не
имеет ничего общего с таковой в полноразмерном рецепторе,
встроенном в липидный матрикс плазматической мембраны
(Kleinau et al., 2011b).
Рецептор ТТГ может подвергаться протеолитическому
расщеплению по двум сайтам, локализованным в шарнирной
области (Chazenbalk et al., 1997; Rapoport et al., 2016). В
результате такого расщепления нарушается целостность
дисульфидных мостиков, расположенных как внутри шарнирной
области, так и связывающих ее с LRR-субдоменом. Этот
механизм протеолитического расщепления обеспечивает
высвобождение «рецепторной субъединицы A» (включает LRR-
субдомен и N-концевую часть шарнирной области) от
«рецепторной субъединицы B» (включает С-концевую часть
шарнирной области и серпантинный домен). Такое разъединение
доменов является важнейшим и совершенно уникальным
механизмом регуляции активности рецептора ТТГ и зависимых
от него сигнальных каскадов (Loosfelt et al., 1992; Couet уе al.,
1996; Chazenbalk et al., 1997; Misrahi, Milgrom, 1997; Quellari et
al., 2003; Vassart, Costagliola, 2004). В результате
протеолитического расщепления в шарнирной области рецептора
ТТГ генерируется так называемый «С-пептид», который
278
включает примерно 50 аминокислотных остатков, а субъединицы
А и В остаются связанными дисульфидными мостиками. Такое
связывание высоко лабильно и подвержено влиянию различных
факторов, в первую очередь изменениям окислительно-
восстановительного баланса. Функции «С-пептида» и его
дальнейшая судьба до конца не выяснены (Vu et al., 2009; Kleinau
et al., 2017). В результате сайт-специфичного протеолиза
рецептора ТТГ к нему могут генерироваться специфичные
антитела. Образование стимулирующих, ингибирующих и
нейтральных антител к рецептору ТТГ является важнейшим
механизмом регуляции функций щитовидной железы и
тиреоидного статуса, а также индукции ТТГ-зависимых
злокачественных опухолей (Chazenbalk et al., 2004; Davies et al.,
2005; Kaczur et al., 2007; Latif et al., 2009; Mizutori et al., 2009; Vu
et al., 2009; Rapoport et al., 2015, 2016). Не исключено, что
элиминация эктодомена способствует удалению комплексов
«антитело-эктодомен», тем самым, предотвращая нежелательные
регуляторные воздействия аутоантител на активность рецептора
ТТГ.
Шарнирная область рецептора ТТГ включает
последовательность 289–409, причем значительная ее часть,
последовательность 305–380 (Kleinau et al., 2011b), имеет слабо
упорядоченную структуру, как показали исследования
соответствующего участка в рецепторе ФСГ (Jiang et al., 2012).
Эта центральная часть шарнирной области удаляется в процессе
сайт-специфичного протеолиза в форме «С-пептида». Полагают,
что последовательность 305–380 в большей степени необходима
для правильного сворачивания молекулы рецептора ТТГ, а также
для обеспечения подвижности функционально важных N- и C-
концевых сегментов шарнирной области, содержащих
цистеиновые остатки и другие детерминанты, определяющие
взаимодействие эктодомена и трансмембранного домена
рецептора ТТГ (Krause et al., 2012; Bruser et al., 2016).
Установлено, что третий внеклеточный дисульфидный мостик,
образованный остатками Cys301 и Cys390, обеспечивает тесный
279
контакт между N- и С-концевыми сегментами шарнирной
области, и это позволяет стабилизировать гиперциклическую
структуру всего «hinge region». Стабилизация комплекса между
LRR-субдоменом и шарнирной областью осуществляется при
участии еще двух дисульфидных связей. Одна дисульфидная
связь образована остатком Cys398, локализованным в
сравнительно короткой β-складчатой структуре на С-конце
шарнирной области, и остатком Cys283, расположенным в
параллельной ей С-концевой β-складчатой структуре LRR-
субдомена. Другая дисульфидная связь образована остатком
Cys284 LRR-субдомена и остатком Cys408, расположенным
непосредственно перед началом серпантинного домена.
Остаток сульфатированного Tyr385, локализованный на С-
конце шарнирной области, в преддверии обогащенного остатками
цистеина участка, также может быть вовлечен в связывание
гормона, находясь в кармане, образованном его α- и β-
субъединицами. Таким образом, в шарнирной области
локализованы детерминанты, ответственные не только за
передачу сигнала с эктодомена на трансмембранный домен, но и
сами участвующие в связывании гормона. Замены остатка Tyr385
в значительной степени нарушают связывание ТТГ с рецептором,
причем сходная картина отмечается и при связывании
гонадотропинов с их рецепторами (Costagliola et al., 2002; Bonomi
et al., 2006; Bruysters et al., 2008).
6.2.2. Трансмембранный домен рецептора ТТГ
В настоящее время точная пространственная структура

трансмембранного домена рецептора ТТГ, как и рецепторов
гонадотропинов, не известна. Для моделирования
пространственной структуры рецептора ТТГ используют
известные пространственные структуры других GPCR,
относящихся к классу А. При этом применяют различные
алгоритмы молекулярного моделирования, которые успешно
апробированы для других типов GPCR (Worth et al., 2009;
280
Costanzi, 2012, 2013, Costanzi, Wang, 2015). Разработка модели
трансмембранного домена рецептора ТТГ сыграла большую роль
в объяснении патогенетических механизмов, в которые
вовлечены присутствующие в серпантинном домене рецептора
ТТГ мутации, помогла в разработке низкомолекулярных
лигандов этого рецептора, а также в расшифровке ТТГ-
зависимых механизмов активации внутриклеточных сигнальных
каскадов, включающих различные типы гетеротримерных G-
белков и β-аррестины (Moore et al., 2006; Ringkananont et al., 2006;
Neumann et al., 2010b, 2011; Labadi et al., 2015; Latif et al., 2016a,
2016b).
На начальном этапе моделирования в качестве шаблонов
использовали кристаллические структуры неактивных
конформаций светочувствительного рецептора родопсина (PDB
1F88, Palczewski et al., 2000) и β2-адренергического рецептора
(PDB 2RH1, Cherezov et al., 2007), а также активных
конформаций опсина (PDB 3CAP, Park et al., 2008), опсина в
комплексе с С-концевым пептидом G-белка трансдуцина (PDB
3DQB, Scheerer et al., 2008), метародопсина II (PDB 3PXO или
PDB 3PQR, Choe et al., 2011), β2-адренергического рецептора в
комплексе с агонистом и Gs-белком (PDB 3SN6, Rasmussen et al.,
2007, 2011) и A2-аденозинового рецептора в комплексе с
агонистом и фрагментом Gs-белка (PDB 5G53, Carpenter et al.,
2016). Выбор конкретной структуры GPCR в качестве шаблона
для конструирования трансмембранного домена рецептора ТТГ
во многом определяется сходством первичной и вторичной
структур отдельных функционально важных сегментов
рецепторов, распределением функционально важных
аминокислотных остатков в этих сегментах и рядом других
структурных особенностей (Kleinau et al., 2008).
По первичной структуре и некоторым структурным
особенностям трансмембранный домен рецептора ТТГ наиболее
близок таковому β2-адренергического рецептора, но, как и в
других случаях, при сравнении трансмембранных доменов этих
рецепторов выявляются существенные структурные различия,
281
что сказывается на качестве получаемой трехмерной модели
трансмембранного домена рецептора ТТГ. В последние годы сам
набор установленных с помощью рентгеноструктурного анализа
структур GPCR, пригодных для молекулярного моделирования, в
значительной степени расширился (Costanzi et al., 2014; Isberg et
al., 2016; Munk et al., 2016). И это открывает новые возможности
для поиска шаблонов при конструировании трансмембранного
домена рецептора ТТГ. Наряду с этим в настоящее время широко
применяют гибридные подходы, основанные на применении
сразу нескольких шаблонов GPCR, одни из которых
используются для моделирования гидрофобных
трансмембранных участков, другие – для конструирования
гидрофильных внеклеточных и цитоплазматических петель
(Worth et al., 2009). Этот подход, основанный на использовании в
качестве шаблонов отдельных фрагментов GPCR, был успешно
применен для конструирования трансмембранного домена
рецептора ТТГ (Worth et al., 2011).
Наиболее поразительное различие между
трансмембранными доменами рецептора ТТГ и других GPCR
связано со структурой пятой ТМС. В большинстве рецепторов в
позиции 5.50 (нумерация в соответствии с классификацией
Ballesteros, Weinstein, 1995; с поздними усовершенствованиями
Isberg et al., 2015) пятой ТМС локализован
высококонсервативный остаток пролина, который изгибает
конформацию пятой ТМС и скручивает ее по направлению ко
второй внеклеточной петле, в то время как в рецепторе ТТГ в
позиции 5.50 пятой ТМС находится остаток аланина (Ala593).
Замена спиралеразрушающего остатка пролина на аланин
приводит к стабилизации пятой ТМС в α-спиральной
конформации и предотвращает излом этого участка (Kleinau et
al., 2011a; Chantreau et al., 2015). Помимо рецептора ТТГ, пролин
в позиции 5.50 пятой ТМС отсутствует также в рецепторе 1-го
типа сфингозин-1-фосфата (замена на аланин), пуринового
рецептора P2Y12 (замена на аспарагин) и рецептора
лизофосфатидной кислоты (замена на треонин), что приводит к
282
повышению спиральности пятой ТМС и отсутствию в ней излома
и скручивания, подобно тому, как это происходит и в рецепторе
ТТГ (Hanson et al., 2012; Zhang et al., 2014; Chrencik et al., 2015).
Еще одной структурной особенностью рецептора ТТГ
является локализация остатка метионина в положении 637 в
шестой ТМС (6.48), где в большинстве GPCR располагается
остаток триптофана. Замена остатка метионина на триптофан в
рецепторе ТТГ приводит к его переходу в конститутивно
активированное состояние (Kleinau et al., 2010a). Анализ замен
аминокислотных остатков в ТМС рецептора ТТГ показывает, что
наиболее важны взаимодействия между пятой и шестой ТМС и
между третьей и пятой ТМС. Нарушения этих взаимодействий
приводят к изменению базальной активности рецептора ТТГ и
вызывают его переход в гиперактивированное состояние,
ассоциированное не только со стимуляцией синтеза тиреоидных
гормонов, но и с усилением пролиферации и повышением
онкогенного потенциала (Kleinau, Biebermann, 2014; Vassart,
Kleinau, 2014).
Для построения более точной модели трансмембранного
домена рецептора ТТГ разработан модифицированный подход, в
соответствии с которым шаблоны выбирались отдельно для
каждой ТМС, а также для спирали 8, локализованной в
проксимальном к мембране участке цитоплазматического С-
концевого домена (Worth et al., 2009). Для этого создана
специальная база данных GPCR-Sequence-Structure-Feature-
Extractor (SSFE) (http://www.ssfa-7tmr.de/ssfe) (Worth et al., 2011),
в которой имеются последовательности не менее 27
кристаллических структур GPCR класса A. В общей сложности
для моделирования трансмембранного домена рецептора ТТГ
были выбраны 6 из 27 шаблонов рецепторов, находящихся в
неактивной конформации, которые представлены в таблице 6-1.
283
Таблица 6-1. Фрагменты кристаллических структур GPCR,
используемые для построения модели серпантинного домена
рецептора ТТГ
Спираль Подобие, Рецептор Причина выбора
% шаблона
ТМС1 60 ACM2_HUMAN— Высокое сходство АКП
3UON
ТМС2 57 ACM4_HUMAN— Мотив DXXXG (2.50–
5DSG 2.54), высокое сходство
АКП
ТМС3 53 AA2AR_HUMAN— Мотив GC (3.24–3.25)
4EIY
ТМС4 50 OPSD_TODPA— Остаток пролина (4.60),
2Z73 высокое сходство АКП
ТМС5 52 LPAR1_HUMAN— Нет остатков пролина
4Z34 (5.50), фенилаланина
(5.47) и аспарагина
(5.47), высокое
сходство АКП
ТМС6 47 OX1R_HUMAN— Мотивы FXXCWXP
4ZJ8; (6.44– 6.50) и PXS
OX2R_HUMAN— (6.50–6.52), высокое
4S0V; сходство АКП
P2Y12_HUMAN—
4NTJ
ТМС7 50 OPSD_TODPA— Высокое сходство АКП
2Z73
H8 55 AA2AR_HUMAN— Высокое сходство АКП
4EIY
Сокращения: ACM2_HUMAN и ACM4_HUMAN – мускариновые
ацетилхолиновые рецепторы 2-го и 4-го типов (человек);
OX1R_HUMAN и OX2R_HUMAN – орексиновые рецепторы 1-го и 2-го
типов (человек); AA2AR_HUMAN – A2-аденозиновый рецептор
(человек); OPSD_TODPA – родопсин (японский летающий кальмар
Todarodes pacificus); P2Y12_HUMAN – P2Y-пуриновый рецептор 12-го
типа (человек); LPAR1_HUMAN – рецептор 1-го типа лизофосфатидной
кислоты (человек). АКП – аминокислотная последовательность; H8 –
спирализованный восьмой псевдотрансмембранный участок. Позиции
мотивов и аминокислот даны по (Ballesteros, Weinstein, 1995; с
поздними дополнениями Isberg et al., 2015).
284
В качестве шаблона для второй ТМС рецептора ТТГ была
выбрана вторая ТМС m4-мускаринового рецептора (PDB 5DSG),
поскольку этот участок, как и в рецепторе ТТГ, содержит мотив
DXXXG в позициях от 2.50 до 2.54. В качестве шаблона для
третьей ТМС рецептора ТТГ была выбрана третья ТМС A2-
аденозинового рецептора (PDB 4EIY), что обусловлено
совпадением мотива Gly-Cys в позициях 3.24 и 3.25 третьей ТМС.
В качестве шаблона для пятой ТМС была выбрана пятая ТМС
рецептора 1-го типа лизофосфатидной кислоты (PDB 4Z34),
поскольку в позиции 5.50, как и в рецепторе ТТГ, отсутствует
остаток пролина. Для шестой ТМС в качестве шаблонов
подходящими являются сразу три рецептора – орексиновые
рецепторы 1-го (PDB 4ZJ8) и 2-го типов (PDB 4S0V) и
пуриновый рецептор P2Y12 (PDB 4NTJ). Наиболее оптимальной
здесь оказалась шестая ТМС орексинового рецептора 1-го типа
человека, имеющая наибольшее количество совпадающих
мотивов и наилучшее среди трех рецепторов разрешение
кристаллической структуры.
На рис. 6-4 представлено сравнение практического
использования двух различных подходов для конструирования
пространственной модели трансмембранного домена рецептора
ТТГ – по шаблону одного, β2-адренергического, рецептора и при
комбинированном использовании нескольких шаблонов GPCR,
находящихся в неактивной конформации.
Видно, что в модели с одним шаблоном имеются
дополнительные изгибы и выпуклости во второй и пятой ТМС,
изменена ориентация высококонсервативного остатка цистеина в
третьей ТМС, а также изменена пространственная ориентация
боковых цепей Val421 (1.39) и Leu587 (5.44), локализованных,
соответственно, в первой и пятой ТМС. Показано, что
ориентация Val421 и Leu587 несовместима с тем фактом, что
мутации в этих положениях приводят к конститутивно активным
формам рецептора ТТГ (Chantreau et al., 2015).
В то же время в модели, сконструированной на основании
нескольких шаблонов, эта проблема в значительной степени
285
решается (Worth et al., 2011; Kleinau et al., 2017). Необходимо
отметить, что стратегии, основанные на применении нескольких
шаблонов, но при этом использующие и другие алгоритмы
приводят к хорошим результатам и являются
высокопродуктивными для построения наиболее реалистичных
трехмерных структур рецептора ТТГ (Nunez Miguel et al., 2017b).
Модель трансмембранного домена рецептора ТТГ в
активном состоянии может быть построена с использованием в
качестве шаблонов кристаллических структур опсина,
метародопсина, A2-аденозинового и β2-адренергического
рецепторов. В этом случае отмечается смещение шестой ТМС от
положения этого участка в неактивной конформации примерно
на 8–14 Å, что характерно для большинства GPCR класса А
(Manglik, Kobilka, 2014). При этом, как и в случае генерации
структуры трансмембранного домена рецептора ТТГ в
неактивном состоянии, модель, основанная на одном шаблоне
(β2-адренергический рецептор в комплексе с агонистом и Gs-
белком, PDB 3P0G) дает менее приемлемый результат в
сравнении с моделью, использующей множественные шаблоны,
что в наибольшей степени относится к конформациям второй и
пятой ТМС (Kleinau et al., 2017).
Для оценки конформации внеклеточных и
цитоплазматических петель применяли различные подходы –
SSFE integrated Superlooper2 (Ismer et al., 2016), метод Монте-
Карло (Ali et al., 2015) и протоколы ROSETTA (Schaarschmidt et
al., 2016).
286
287
Рис. 6-4. Модель трансмембранного домена рецептора ТТГ в
неактивном состоянии, сконструированная с использованием
фрагментов различных гомологичных GPCR (по Kleinau et al., 2017).
(A) Модель трансмембранного домена рецептора ТТГ, построенная с
использованием нескольких шаблонов трансмембранных доменов
других GPCR, находящихся в неактивной конформации. В центральной
части второй ТМС имеется мотив DXXXG (положения аминокислот от
2.50 до 2.54), формирующий излом полипептидной цепи. В третьей
ТМС, включающей мотив Gly-Cys (положения 3.24 и 3.25), имеется
внеклеточный излом, в то время как в четвертой ТМС во внеклеточном
пространстве расположен остаток пролина (положение 4.60). В
центральной части пятой ТМС локализована α-спираль (A5.50, N5.47). В
шестой ТМС рецептора ТТГ имеется сильный излом, который
сформирован гексапептидным мотивом FXXCWP (позиции аминокислот
от 6.44 до 6.50) и небольшим мотивом PXS (позиции аминокислот от
6.50 до 6.52).
(Б) Сравнение моделей трансмембранного домена рецептора ТТГ, одна
из которых построена с использованием нескольких шаблонов, в то
время как другая с использованием в качестве шаблона β2-
адренергического рецептора (PDB 2RH1), находящегося в неактивной
конформации. Модель, построенная с использованием β2-
адренергического рецептора, имеет ряд дополнительных изгибов во
второй и пятой ТМС, а также отличается по ориентации боковых цепей
остатков Val421 (1.39) и Leu587 (5.44). Замены этих остатков приводят к
конститутивно активным формам рецептора ТТГ с высоким онкогенным
потенциалом (Chantreau et al., 2015).
6.3. Структурные и функциональные основы

сигнальной трансдукции через рецептор тиреотропного
гормона
Изменения в эктодомене рецептора ТТГ, вызываемые

его связыванием с ТТГ и другими лигандами
Эндогенными регуляторами сигнала, передаваемого через
рецептор ТТГ, являются ТТГ, специфичные антитела к рецептору
ТТГ и тиростимулин, причем основными молекулярными
детерминантами, ответственными за связывание с
288
гормональными агентами и антителами, являются LRR-субдомен
и шарнирная область, формирующие эктодомен (Kleinau, Krause,
2009; Kleinau et al., 2013). Исключительно важную роль в
связывании ТТГ и других эндогенных регуляторов играет
сульфатированный остаток тирозина в положении 385 в С-
концевом участке шарнирной области (Costagliola et al., 2002;
Bonomi et al., 2006). Другие аминокислотные остатки шарнирной
области, которые участвуют в связывании гормональных агентов,
также имеют отрицательно заряженные боковые группы. Это
указывает на важную роль электростатических взаимодействий в
таком связывании и в «переформатировании» комплекса между
LRR-субдоменом и шарнирной областью при гормональной
активации (Mueller et al., 2008, 2009, 2011; Kleinau et al., 2011b). В
целом шарнирная область является важнейшим структурным
элементом рецептора ТТГ, определяющим процессы связывания
лигандов и преобразования генерируемого ими сигнала в волну
конформационных перестроек, достигающую
цитоплазматических петель рецептора. Значение шарнирной
области во многом обусловлено ее топологией, поскольку она
является структурным и функциональным связующим звеном
между основным участником сигнальной трансдукции, LRR-
субдоменом, и трансмембранным доменом (Vlaeminck-Guillem et
al., 2002; Mueller et al., 2006; Mizutori et al., 2008; Chen et al., 2010,
2011, 2012; Hamidi et al., 2011; Jaeschke et al., 2011).
Результатом связывания ТТГ с рецептором являются
изменения взаимодействий между С-концевой спиралью LRR-
субдомена и контактирующими с ней N- и C-концевыми
сегментами шарнирной области. При этом возможны две
ситуации. При связывании гормона могут нарушаться
взаимодействия между отрицательно заряженными боковыми
группами аминокислотных остатков шарнирной области и
положительно заряженными остатками LRR-субдомена
(Schaarschmidt et al., 2014). Или, напротив, могут возникать новые
электростатические контакты между LRR-субдоменом, в том
числе остатком Glu251, и шарнирной областью, изменяющие их
289
взаимную ориентацию и взаимодействие с трансмембранным
доменом (Chen et al., 2010).
Важно отметить, что некоторые аминокислотные остатки
LRR-субдомена могут непосредственно взаимодействовать с
внеклеточными петлями трансмембранного домена рецептора
ТТГ и, тем самым, передавать сигнал, минуя шарнирную область.
Одним их таких остатков является Ser281, который находится в
короткой α-спирали на стыке между LRR-субдоменом и
шарнирной областью (Krause et al., 2012). Этот остаток способен
взаимодействовать с первой внеклеточной петлей рецептора ТТГ
(Jaeschke et al., 2006a; Schaarschmidt et al., 2016). Замены остатка
Ser281 на другие аминокислотные остатки критически влияют на
функциональную активность рецептора ТТГ, переводя его в
перманентно активированное состояние (Duprez et al., 1997; Kopp
et al., 1997; Ho et al., 2001, 2008; Jaeschke et al., 2006a).
Основной функциональной характеристикой шарнирной
области является ее отчетливо выраженное ингибирующее
влияние на функциональную активность рецептора ТТГ (Zhang et
al., 1995, 2000; Vlaeminck-Guillem et al., 2002; Chen et al., 2003), а
также влияние на специфичность взаимодействия рецептора как с
ТТГ, так и с другими эндогенными регуляторами (Tesmer et al.,
2005). В этой связи необходимо отметить, что сравнительно
короткий участок Asp403–Asn406, расположенный на С-конце
шарнирной области, может рассматриваться, как «внутренний»
аллостерический агонист рецептора ТТГ (Kleinau et al., 2004;
Mueller et al., 2006; Chen et al., 2012). Синтетический пептид,
включающий этот участок, характеризуется активностью
специфичного агониста рецептора ТТГ, действие которого
обусловлено взаимодействием с первой внеклеточной петлей
рецептора (Vlaeminck-Guillem et al., 2002; Kleinau et al., 2004;
Bruser et al., 2016). Существование такого внутреннего
аллостерического агониста является достаточно уникальным
случаем для GPCR и указывает на сложный характер регуляции
функционального сопряжения эктодомена и серпантинного
домена в рецепторе ТТГ (Schoneberg et al., 2016).
290
Изменения в трансмембранном домене рецептора ТТГ,

вызываемые связыванием с ТТГ и другими лигандами
Как известно по результатам многочисленных
исследований механизмов активации GPCR, одним из
механизмов является изменение взаимной ориентации и
конформаций трансмембранных спиралей. Это выражается в
изменении (как правило, очень небольшом) угла наклона этих
спиралей, их смещении друг относительно друга, а также в
изменении геометрии их изгибов, скручиваний и дугих
деформаций. Все эти изменения непосредственно связаны с
изменениями конформации расположенного внутри
трансмембранного домена ортостерического сайта при
связывании с ним лиганда или, как это наблюдается в случае
рецепторов ТТГ и гонадотропинов, при изменении конформации
локализованного в трансмембранном домене аллостерического
сайта.
В отсутствие гормонального воздействия GPCR
пребывает в неактивном состоянии, которое стабилизировано
множественными специфичными взаимодействиями между
аминокислотными остатками, локализованными в
трансмембранном домене рецептора и в его преддвериях –
интерфейсах, образованных N- и C-концевыми сегментами ТМС
и проксимальными к мембране участками внеклеточных и
цитоплазматических петель рецептора. Результатом связывания с
гормоном является ослабление или нарушение таких
взаимодействий и формирование новых контактов, что повышает
подвижность гидрофобных спиралей, образующих
трансмембранный домен, и позволяет им принять новое
положение, соответствующее одной из активных конформаций
рецептора. В реальных условиях устанавливается динамическое
равновесие между несколькими активными конформациями,
каждая из которых стабилизирована своим уникальным набором
специфичных взаимодействий. В конечном итоге эти
конформационные перестройки обеспечивают эффективное
291
взаимодействие рецептора с трансдукторными и эффекторными
белками (Kobilka, Deupi, 2007; Kobilka, Schertler, 2008; Ahuja,
Smith, 2009; Kobilka, 2011). Показано, что наибольшие изменения
при связывании лиганда происходят в шестой ТМС вокруг
остатка пролина (6.50), расположенного в центральной части
спирали и образующего ее изгиб, что обеспечивает
формирование полости внутри трансмембранного домена, в
которой локализован ортостерический или аллостерический сайт
(Scheerer et al., 2008; Rasmussen et al., 2011). В рецепторе ТТГ
шестая ТМС и расположенный в ней остаток пролина также
играют определяющую роль в передаче сигнала через
трансмембранный домен рецептора, тем более что мутации в
шестой ТМС рецептора ТТГ приводят к конститутивно
активированным его формам и являются первопричинами ряда
патологий, связанных с гиперфункцией щитовидной железы
(Kreuchwig et al., 2013; Vassart et al., 2014).
В трансмембранном домене рецептора ТТГ, наряду с
шестой ТМС, в том числе с локализованным в ней остатком
Met637, важное значение имеет пятая ТМС, которая, в отличие от
большинства других GPCR, не содержит пролин и образует
высокоупорядоченную α-спираль. Взаимодействие между тремя
трансмембранными сегментами – третьей, пятой и шестой ТМС,
не только определяет топологию трансмембранного домена, но
также модулирует процесс перехода рецептора ТТГ из
неактивного в активное состояние. Нарушение этого
взаимодействия приводит к нарушению работы молекулярной
машины трансмембранного домена и является причиной
дисфункций ТТГ-зависимой сигнальной трансдукции. Так у
мутантного рецептора с двойной заменой в третьей и пятой ТМС
– Val509(3.40)Ala/Ala593(5.50)Val, вследствие замены двух остатков
аланина на гидрофобные остатки валина, гидрофобные
взаимодействия между третьей и пятой ТМС сохраняются
(Karges et al., 2005). В результате такой мутантный рецептор
сохраняет активность, в то время как мутантные рецепторы ТТГ
только с какой-то одной заменой, Val509Ala или Ala593Val,
292
функционально не активны. Изучение кристаллических структур
других GPCR показывает, что при переходе в активную
конформацию также имеет место взаимодействие между
гидрофобными остатками третьей, пятой и шестой ТМС. Так,
например, в случае β2-адренергического рецептора имеется
тесный контакт между остатками Pro211(5.50), Ile121(3.40) и Phe282(6.44)
(Rasmussen et al., 2011). Такое близкое пространственное
расположение трех гидрофобных остатков из различных ТМС
обозначают, как «PIF (Pro-Ile-Phe) мотив» или «контактный
мотив» (Kobilka, 2011). Несмотря на то, что в рецепторе ТТГ
аминокислотные остатки в указанных позициях отличаются, они
также способны образовывать «контактный мотив» – в этом
случае гидрофобные контакты образуют остатки Ala593(5.50),
Val509(3.40) и Met637(6.48). Взаимодействие между этими остатками,
как и в случае β2-адренергического рецептора, существенно
меняется при активации рецептора ТТГ. Как уже отмечалось,
замены каждого из этих аминокислотных остатков, меняющие
паттерн взаимодействий в трансмембранном домене, приводят к
конститутивно активированным формам рецептора ТТГ. Среди
подробно исследованных в настоящее время мутаций в
наибольшей степени изучены замены Ala593Asn (Sykiotis et al.,
2003), Val509Ala (Karges et al., 2005) и Met637Trp (Kleinau et al.,
2010a).
Наряду с перечисленными выше гидрофобными
аминокислотными остатками, в процессе передачи сигнала могут
участвовать и другие аминокислотные остатки, локализованные в
различных локусах трансмембранного домена рецептора ТТГ. Их
идентификация осуществляется как на основе молекулярного
моделирования, так и с учетом данных сайт-направленного
мутагенеза, приводящего как к функционально активным, так и к
функционально неактивным рецепторам. Наиболее изучены
остаток Lys660 на границе шестой ТМС и третьей внеклеточной
петли (Claus et al., 2005), остаток Lys565 во второй внеклеточной
петле (Kleinau et al., 2007), остаток Asp474 на границе со второй
ТМС (Neumann et al., 2005a), остаток Glu409 на границе между
293
шарнирной областью эктодомена и первой ТМС (Bruser et al.,
2016). Показана функциональная важность остатков Asp633
(шестая ТМС) и Asn670 (седьмая ТМС), расположенных в
центральной части трансмембранного домена (Neumann et al.,
2001; Claeysen et al., 2002; Urizar et al., 2005a), а также остатков
Tyr601 (Biebermann et al., 1998) и Asp619 (Parma et al., 1993; Claus et
al., 2006), расположенных в ТМС на границе с третьей
цитоплазматической петлей рецептора. Вследствие этого, в
отличие от преимущественно гидрофобных контактов между
триадой третьей, пятой и шестой ТМС, парные взаимодействия
между второй, третьей, шестой и седьмой ТМС характеризуются
в основном наличием гидрофильных контактов, например, в
высоко консервативных позициях 2.50 (Asp) или 7.50 (Asn)
(Neumann et al., 2001; Urizar et al., 2005a). Эти гидрофильные
контакты также включают молекулы воды, которые
локализованы вблизи боковых групп гидрофильных
аминокислотных остатков и участвуют в электростатических
взаимодействиях и водородных связях (Worth et al., 2009). Таким
образом, образуется сеть различных взаимодействий между
боковыми группами высоко консервативных, функционально
важных аминокислотных остатков, в которые могут быть
вовлечены молекулы воды, и эта сеть удерживает ТМС в
неактивной (в отсутствие гормонального стимула) или в какой-
либо из активных конформаций при связывании GPCR c
ортостерическим или аллостерическим лигандом (Angel et al.,
2009; Salon et al., 2011; Mason et al., 2012; Katritch et al., 2014).
Компьютерная симуляция GPCR методом молекулярной
динамики предполагает существование «внутреннего коннекта»
через трансмембранный домен, сформированный как
структурированными молекулами воды, так и гидрофильными
боковыми группами аминокислот, которые образуют комплексы
со структурированной водой и таким образом пребывают в
гидратированном состоянии (Shpakov, Pertseva, 2007). В
неактивном состоянии боковые группы гидрофобных
аминокислот образуют поперечные слои, которые
294
«перегораживают» этот «внутренний путь», в то время как после
связывания рецептора с агонистом эти слои разрушаются,
восстанавливая непрерывность сети молекул структурированной
воды и гидратированных гидрофильных групп внутри
трансмембранного домена рецептора.
Эта модель очень близка развиваемой нами на
протяжении двух десятков лет концепции GPCR, как прототипа
водородного насоса. В рамках этой концепции после связывания
лиганда в трансмембранном домене рецептора индуцируется
поток заряженных частиц – протонов. Причем они могут
передаваться либо в форме катиона гидроксония, через кластеры
структурированной воды, либо эстафетным путем через
протонирование и депротонирование боковых гидрофильных
групп некоторых аминокислотных остатков (Shpakov, 2002;
Shpakov, Pertseva, 2007, 2008). Второй, эстафетный, механизм
предпочтителен, поскольку позволяет контролировать и
модулировать протонный ток с помощью различных внешних
воздействий. В качестве переносящих протоны аминокислотных
остатков наибольший интерес представляет тирозин, поскольку
его гидроксильная группа в фенильном кольце сравнительно
легко протонируются и депротонируются. К тому же боковая
цепь тирозина подвижна и способна легко менять свою
конформацию, что необходимо для транслокации протонов
(Shpakov, 2002).
В полном соответствии с этим, недавно было
установлено, что остаток тирозина в позиции 7.53 NPXXY-
мотива исключительно важен для нормального
функционирования трансмембранного домена GPCR (Yuan et al.,
2015). Согласно концепции протонного насоса как модели
функционирования GPCR поток заряженных частиц,
инициированный связыванием лиганда с ортостерическим сайтом
рецептора, достигает гуаниннуклеотидсвязывающего сайта
гетеротримерного G-белка, меняет устойчивость его комплекса с
ГДФ и, тем самым, вызывает замену ГДФ на ГТФ, индуцируя
295
переход G-белка в активированное состояние (Shpakov, 2002;
Shpakov, Pertseva, 2007, 2008).
Таким образом, активация рецептора гормоном может
приводить к перестройкам и расширению «внутреннего пути» от
лиганд-связывающего сайта до цитоплазматических петель
рецептора, образующих G-белок-связывающую и G-белок-
активирующую поверхности (Standfuss et al., 2011; Blankenship et
al., 2015). Нельзя исключить того, что различные эндогенные
аллостерические регуляторы могут существенным образом
влиять на функционирование и целостность «внутреннего пути»
в трансмембранном домене GPCR, а также на функциональное
состояние «заглушек» на этом пути, образуемых боковыми
группами гидрофобных аминокислотных остатков. Сходный
механизм может реализовываться для широкого спектра
аллостерических регуляторов с активностью антагонистов и
инверсионных агонистов, среди которых различные ионы,
липиды и их производные, «чужие» гормоны и другие
биомолекулы (см. Главу 2). Универсальным инверсионным
агонистом для большого числа GPCR класса A являются ионы
натрия, которые связываются с сайтом, расположенным между
второй и седьмой ТМС рецептора, и препятствуют его
эффективной гормональной активации (Katritch et al., 2014).
После активации рецептора конформация Na+-связывающего
сайта меняется, и ионы натрия удаляются из трансмембранного
домена предположительно во внеклеточное пространство.
Разработка и применение низкомолекулярных
аллостерических регуляторов рецептора ТТГ, о которых речь
пойдет ниже, позволила выявить еще ряд аминокислотных
остатков и структурных элементов трансмембранного домена,
которые вовлечены в процесс сигнальной трансдукции. Важно
отметить, что замена большинства этих остатков приводит к
конститутивно активированным формам рецептора ТТГ,
ассоциированным с патологией тиреоидной системы. Среди них
активирующие мутации, представляющие собой замены Val421Ile,
Tyr466Ala, Thr501Ala, Leu587Val, Met637Cys, Met637Trp, Ser641A
296
Tyr643Phe, Leu645Val и Tyr667Ala (Kleinau et al., 2010a), а также
инактивирующие мутации, такие как Val424Ile, Leu467Val,
Tyr582Ala, Tyr582Phe, Tyr643Ala и Leu665Val (Haas et al., 2011).
Обнаружение этих функционально важных остатков позволило
предсказать возможные механизмы действия низкомолекулярных
аллостерических агонистов на активность рецептора ТТГ, и
выявить новые взаимосвязи между фармакологической
активностью и особенностями химической структуры этих
агонистов (Hoyer et al., 2013) (подробнее о низкомолекулярных
аллостерических лигандах рецептора ТТГ см. в разделе 6.5).
Изменения в цитоплазматических петлях рецептора

ТТГ, вызываемые его связыванием с гормоном
Рецептор ТТГ связывается сразу с несколькими типами
гетеротримерных G-белков, а также с рядом других сигнальных
белков, включая β-аррестины, и за эти процессы отвечают
сегменты цитоплазматических петель и их интерфейсов с ТМС.
Поэтому идентификация функционально важных для
взаимодействия с G-белками и β-аррестинами аминокислотных
остатков в цитоплазматических петлях рецептора ТТГ является
одной из приоритетных задач современной тиреоидологии. Для
этого широко используются сайт-направленный мутагенез
(Chazenbalk et al., 1990; Kosugi et al., 1994; Kosugi, Mori, 1994a,
1994b; Claus et al., 2006; Kleinau et al., 2010b), а также
клинические исследования пациентов с патологией щитовидной
железы (de Roux et al., 1996; Camilot et al., 2005; Nishihara et al.,
2007; Cangul et al., 2010).
Исследования мутантных рецепторов ТТГ показали, что
все три цитоплазматические петли, а также гидрофобная спираль
H8, локализованная в проксимальной к мембране части
цитоплазматического С-концевого домена, имеют в своей
структуре аминокислотные остатки и их кластеры,
непосредственно влияющие на процесс сигнальной трансдукции.
При этом, однако, при замене отдельных аминокислотных
остатков или их кластеров меняется специфичность активации
297
определенных сигнальных каскадов. Это позволило выявить те
сегменты цитоплазматических петель, которые отвечают за
эффективность и избирательность взаимодействия рецептора ТТГ
с определенными типами G-белков и β-аррестинов (Kleinau et al.,
2010b; Venkatakrishnan et al., 2016). Показано, например, что
инактивирующая мутация Phe525Lys нарушает активацию
рецептором Gq/11-белка и зависимых от него сигнальных путей,
но при этом никак не влияет на функциональное сопряжение
мутантного рецептора ТТГ с Gs-белком и активацию цАМФ-
зависимых внутриклеточных каскадов (Neumann et al., 2005b).
Несмотря на то, что в большинстве GPCR первая
цитоплазматическая петля не несет существенной
функциональной нагрузки при взаимодействии с нижележащими
эффекторными белками, в рецепторе ТТГ она включает остаток
Arg450, расположенный на границе этой петли и второй ТМС,
замена которого приводит к неактивному рецептору. Такие
инактивирующие мутации выявлены у пациентов с врожденным
гипотиреозом и резистентностью щитовидной железы к ТТГ
(Nagashima et al., 2001; Mizuno et al., 2009; Narumi et al., 2011;
Chang et al., 2012). Основываясь на данных молекулярного
моделирования, было предсказано, что остаток Arg450 может
непосредственно взаимодействовать с C-концевой α5-спиралью
α-субъединицей Gs-белка, ответственной за сопряжение
рецептора ТТГ с Gs-белком и аденилатциклазой (Kleinau et al.,
2010b). Центральная часть первой цитоплазматической петли
функционально взаимодействует с β-субъединицами G-белков,
вследствие чего различные мутации в ней, такие как замены
Leu440Ala, Thr441Ala и His443Ala, снижают стимуляцию
фосфолипазы Cβ и уровень инозитол-3,4,5-трифосфата, но почти
не влияют на активность аденилатциклазы и внутриклеточный
уровень цАМФ (Kleinau et al., 2010b).
Важную роль во взаимодействии с G-белками играет
вторая цитоплазматическая петля, в которой критическими для
активации как Gs-, так и Gq/11-белков являются остатки Met527,
Arg528 и Asp530, в то время как остатки Ile523, Phe525 и Leu529 важны
298
для активации Gq/11-белков и зависимых от них
фосфоинозитидных путей, но в меньшей степени вовлечены в
активацию Gs-белков и аденилатциклазного сигнального пути
(Neumann et al., 2005b; Claus et al., 2006). Замены остатков Met527,
Asp530 и Arg531 на аланин снижали базальный уровень цАМФ в
клетках, нарушая сопряжение между Gs-белком и рецептором
ТТГ, наделенным только базальной активностью (Kleinau et al.,
2008, 2017). Как и в подавляющем большинстве GPCR, третья
цитоплазматическая петля рецептора ТТГ включает целый ряд
ключевых молекулярных детерминант для связывания и
активации Gs- и Gq/11-белков. При этом имеются основания
полагать, что G-белок-связывающие поверхности рецептора для
различных типов гетеротримерных G-белков в значительной
степени перекрываются, будучи сформированы различными
комбинациями сегментов второй и третьей цитоплазматических
петель. Важность третьей цитоплазматической петли
обусловлена еще и тем, что она является внутриклеточным
спейсером для пятой и шестой ТМС, конформация которых в
наибольшей степени меняется при связывании рецептора с
гормоном или аллостерическим регулятором. Показано, что
одиночные замены остатков Tyr605, Val608, Lys618, Lys621 и Ile622
приводят к избирательному ингибированию ТТГ-опосредуемой
стимуляции Gq/11-белков (Biebermann et al., 1998; Claus et al.,
2006), в то время как замены остатков Asp617 и Asp619 переводят
рецептор ТТГ в конститутивно активированную форму, в
которой он в отсутствие гормона стимулирует активность Gs-
белков и цАМФ-зависимых сигнальных каскадов (Van Sande et
al., 1995; Claeysen et al., 2002; Claus et al., 2006; Nishihara et al.,
2007).
Анализ характера мутаций в цитоплазматических петлях
рецептора ТТГ показал, что Gq/11-сопряженные пути более
чувствительны к одиночным заменам аминокислотных остатков в
этих петлях в сравнении с Gs-сопряженными путями. На
основании этого сделано заключение, что регуляторные
механизмы, опосредующие ТТГ-зависимую регуляцию
299
кальциевого сигналинга, включающие Gq/11-белки, более тонко
настроены, чем регуляторные механизмы, опосредующие
стимуляцию аденилатциклазы и цАМФ-зависимых
транскрипционных факторов, реализуемую через Gs-белки. Это
хорошо согласуется с тем фактом, что базальная активность
рецептора ТТГ и его конститутивно активированных форм
проявляется в повышении уровня внутриклеточного цАМФ, что
предполагает взаимодействие рецептора ТТГ с Gs-белками в
отсутствие лиганда, в то время как активность
фосфоинозитидных путей и кальциевый сигналинг при этом не
меняются (Kleinau, Biebermann, 2014).
В отличие от G-белков, локализация и функциональное
значение молекулярных детерминант, ответственных за
взаимодействие с β-аррестинами, в рецепторе ТТГ исследованы
недостаточно, несмотря на то что функциональная важность
такого взаимодействия не вызывает сомнений. Взаимодействие
рецептора ТТГ с β-аррестинами необходимо как для активации
ТТГ-зависимых β-аррестиновых каскадов, так и для запуска
процессов эндоцитоза и рециклизации лиганд-рецепторного
комплекса, включающего рецептор ТТГ (Frenzel et al., 2006;
Neumann et al., 2010a; Werthmann et al., 2012; Boutin et al., 2014).
Как известно, β-аррестины способны специфично
взаимодействовать только с теми участками цитоплазматических
петель рецептора и его С-концевого домена, которые
подвергаются фосфорилированию с помощью GRK-киназ. Это
обусловлено тем, что β-аррестины эффективного связываются
только с теми β-аррестин-связывающими сайтом рецептора,
которые содержат некоторое количество фосфатных групп. В
соответствии с этим, рецептор ТТГ в неактивной форме или
наделенный базальной активностью не способен
взаимодействовать с β-аррестинами и потому не подвергается
эндоцитозу.
Взаимодействие β-аррестина с рецептором можно
разделить на два основных этапа – образование начального
комплекса, так называемого «pre-complex», в котором β-аррестин
300
связывается с рецептором с низким сродством, и дальнейшее
образование активного комплекса, в котором β-аррестин
связывается с рецептором с высокой аффинностью. Образование
начального комплекса обусловлено замещением С-концевого
домена молекулы β-аррестина, который тесно связан с N-
концевым доменом β-аррестина, на фосфорилированный С-
концевой домен рецептора. В результате N-концевой домен β-
аррестина, обогащенный большим числом положительно
заряженных аминокислотных остатков, высвобождается для
взаимодействия с другими участками рецептора, что приводит к
общей перестройке молекулы β-аррестина и существенно
повышает ее сродство к рецептору (Kim et al., 2013; Shukla et al.,
2013). Ключевым событием формирования активного комплекса
между β-аррестином и рецептором является проникновение
пальцеобразной петли β-аррестина в углубление, образованное
цитоплазматическими петлями активированного рецептора, что
индуцирует многоцентровое высокоаффинное связывание между
ними. При этом пальцеобразная петля β-аррестина в процессе
взаимодействия принимает спиральную конформацию, а
ключевым мотивом, который взаимодействует с ней и
расположен в углублении β-аррестин-связывающего сайта
является высококонсервативный в большинстве GPCR мотив
E(D)RY, расположенный в интерфейсе, который образован
второй цитоплазматической петлей и третьей ТМС (Szczepek et
al., 2014; Kang et al., 2015). Спираль β-аррестина, образуемая его
пальцеобразной петлей, и С-концевая α5-спираль α-субъединицы
G-белка, представляющая собой основную детерминанту для
связывания с рецептором, в процессе образования комплекса с
рецептором проникают в одно и то же углубление и
взаимодействуют с одним и тем же E(D)RY-мотивом, что
отчетливо видно при анализе кристаллических структур
комплексов рецепторов с β-аррестинами и α-субъединицей G-
белка (Szczepek et al., 2014; Kang et al., 2015).
301
Множественные сигнальные каскады, регулируемые
через посредство рецептора ТТГ
Как отмечалось выше, активация рецептора ТТГ
гормоном или стимулирующими антителами приводит к
активации не одного, а сразу нескольких внутриклеточных
сигнальных каскадов, что определяется способностью рецептора
ТТГ функционально взаимодействовать со всеми четырьмя
известными у человека и позвоночных классами αβγ-
гетеротримерных G-белков – Gs-, Gq/11-, Gi/o- и G12/13-белками
(Laugwitz et al., 1996; Buch et al., 2008; Boutin et al., 2014).
Определяющее значение для контроля роста и дифференцировки
тироцитов, а также для стимуляции процессов синтеза и секреции
тиреоидных гормонов, имеют активируемые ТТГ цАМФ-
зависимый и фосфоинозитидный сигнальные каскады.
цАМФ-зависимый сигнальный каскад запускается при
активации Gs-белков и сопряженной с ними аденилатциклазы,
катализирующей синтез цАМФ. Образовавшийся цАМФ
связывается с регуляторными субъединицами протеинкиназы А,
что приводит к их диссоциации от каталитических субъединиц,
активации фермента и индуцирует серин/треониновое
фосфорилирование множества эффекторных белков – мишеней
протеинкиназы А. В свою очередь, фосфоинозитидный каскад в
тироцитах запускается через посредство активации Gq/11-белков и
фосфоинозитид-специфичной фосфолипазы Сβ, которая
осуществляет синтез из фосфоинозитидов двух вторичных
посредников – инозитол-1,4,5-трифосфата и диацилглицерина.
Инозитол-1,4,5-трифосфат взаимодействует со специфичными к
нему кальциевыми каналами, локализованными в
эндоплазматическом ретикулуме, индуцируя высвобождение
кальция из внутриклеточных депо. Диацилглицерин через
посредство чувствительных к нему изоформ протеинкиназы С
регулирует уровень внутриклеточного кальция и активность ряда
эффекторных белков, включая митогенактивируемые
протеинкиназы. Повышение концентрации цАМФ и Ca2+ в
цитоплазме тироцитов является тем механизмом, который
302
стимулирует биосинтез и секрецию тиреоидных гормонов –
тироксина и трийодтиронина. Необходимо отметить, что
активация цАМФ-зависимого и фосфоинозитидного каскадов
может осуществляться не только при действии ТТГ или
стимулирующих рецептор ТТГ аутоантител, но также и при
удалении эктодомена, что снимает его ингибирующее влияние на
трансмембранный домен рецептора ТТГ и переводит последний в
перманентно активированное состояние. Рецептор ТТГ,
лишенный эктодомена, в 4–6 раз более эффективно в сравнении с
полноразмерным рецептором повышает уровень цАМФ и в 4–10
раз уровень фосфоинозитидов в клетках-мишенях.
Через посредство активации Gi/o-белков осуществляется
снижение вызываемой ТТГ стимуляции аденилатциклазы
(отрицательная обратная связь), а через посредство активации
G13-белков регулируется функциональная активность каскада
митогенактивируемых протеинкиназ (Buch et al., 2008).
Обнаружено также, что βγ-димер, образующийся вследствие
диссоциации G-белков в ответ на гормональную активацию
рецептора ТТГ, стимулирует активность основных компонентов
3-фосфоинозитидного пути – ферментов фосфатидилинозитол-3-
киназы и протеинкиназы В (Akt-киназы), усиливая, тем самым,
экспрессию зависимых от них генов. Установлено, что
источником βγ-димера в тироцитах могут быть как Gs-, так и Gi/o-
белки (De Gregorio et al., 2007; Zaballos et al., 2008). Несмотря на
то, что наибольший вклад в общий пул βγ-димера, как правило,
вносят Gi/o-белки, в случае ТТГ показана отчетливая взаимосвязь
между стимуляцией Gs-белка, как донатора βγ-димера, и
активацией основного эффекторного звена 3-фосфоинозитидного
каскада – Akt-киназы (De Gregorio et al., 2007).
Наряду с активацией гетеротримерных G-белков,
связывание рецептора ТТГ с гормоном или стимулирующими
антителами приводит к активации β-аррестиновых сигнальных
путей (Boutin et al., 2014; Morshed et al., 2018). Показано, что
эффективная концентрация ТТГ, необходимая для транслокации
молекул β-аррестинов 1-го и 2-го типов к молекуле
303
активированного рецептора ТТГ, составляет около 300 нМ. Это
значение в 16 раз превосходит таковое, необходимое для
стимуляции аденилатциклазы, и сопоставимо со значением
эффективной концентрации ТТГ, необходимой для стимуляции
фосфоинозитидного каскада (Urizar et al., 2005b; Boutin et al.,
2014). Транслокация β-аррестинов индуцируется при связывании
гомодимерной формы рецептора ТТГ как с одной, так и с двумя
молекулами ТТГ, но при соотношении рецептора и гормона 2:2
эффективность процесса транслокации β-аррестинов
существенно повышается (Boutin et al., 2014). Молекулярные
механизмы стимуляции β-аррестиновых каскадов,
функционально сопряженных с рецепторами ТТГ, описаны в
основном в остеобластах (Boutin et al., 2014, 2016), которые
являются одними из мишеней ТТГ и содержат большое число
рецепторов этого гормона, и в печени (Niu et al., 2018), а также в
условиях стимуляцими рецептора ТТГ стимулирующими
антителами (Morshed et al., 2018). В то же время эффекты ТТГ на
пролиферацию, дифференцировку и развитие тироцитов также
указывают на возможность непосредственного участия в этих
процессах β-аррестинов (Postiglione et al., 2002).
6.4. Олигомеризация рецептора тиреотропного гормона
В функционально активном состоянии подавляющее

большинство GPCR образуют димерные и олигомерные
комплексы, которые могут включать как одинаковые протомеры
рецепторных молекул, так и протомеры, представляющие собой
различные типы GPCR (Li et al., 2002; Harikumar et al., 2008; Ng et
al., 2012; Ng, Chow, 2015). Димеризация и олигомеризация
являются важнейшими механизмами, которые лежат в основе
регуляции и модуляции чувствительности и селективности GPCR
к лигандам. Структурно-функциональная организация
рецепторных комплексов имеет решающее значение для
избирательной активации внутриклеточных сигнальных
каскадов, а также для даун-регуляции и рециклизации
304
рецепторных молекул и их транслокации в плазматическую
мембрану (Bouvier, 2001; George et al., 2002; Uberti et al., 2005;
Levoye et al., 2006; White et al., 2007; Ciruela et al., 2010; Lohse,
2010; Smith et al., 2010). Соответственно, через посредство
комплексообразования GPCR осуществляется «настройка»
системы регуляции гормонами – лигандами GPCR,
физиологических и биохимических процессов в организме,
включая различные стадии онтогенетического развития и
воздействие широкого спектра патогенетических факторов и
внешних воздействий. Нарушение процесса олигомеризации, а
также снижение стабильности гомо- и гетероолигомерных
рецепторных комплексов являются одними из первопричин
ослабления и «искажения» сигнальной трансдукции и развития
патологических состояний, что должно учитываться при
разработке новых стратегий для их лечения и профилактики
(Rivero-Muller et al., 2010; Tschische et al., 2011; Tadagaki et al.,
2012a, 2012b; Kleinau et al., 2016; Ploier et al., 2016). Все
вышесказанное применимо к рецепторам ТТГ и может быть
сформулировано в виде основных положений, представленных
ниже и впервые сформулированных в 2017 году Gunnar Kleinau и
сотрудниками (Kleinau et al., 2017).
1) Димеризация и олигомеризация рецептора ТТГ
отмечаются уже на ранних стадиях процессинга молекулы
рецептора, еще в эндоплазматическом ретикулуме, что имеет
важное значение как для нормального протекания
посттрасляционной модификации рецептора ТТГ, так и для его
дальнейшей эффективной транслокации и правильного
встраивания в плазматическую мембрану (Latif et al., 2001;
Kaczur et al., 2003; Persani et al., 2007).
2) В процессе комплексообразования рецептор ТТГ, как
полагают, образует в большей степени не димеры, а олигомерные
структуры более высокого порядка (Zoenen et al., 2012). В
процессе олигомеризации участвует эктодомен рецептора, но
устойчивость и структурная организация олигомерных
комплексов зависят в основном от взаимодействия между
305
боковыми поверхностями трансмембранных доменов
составляющих их протомеров (Urizar et al., 2005b).
3) Для активации Gs- и Gq/11-зависимых сигнальных
каскадов необходимо связывание двух молекул ТТГ с
комплексом рецептора ТТГ, что и обусловливает полноценный
физиологический ответ на гормональную стимуляцию (Allen et
al., 2011b).
4) Физиологические эффекты инактивирующих мутаций в
рецепторе ТТГ часто обусловлены нарушением его
комплексообразования, причем фенотипический эффект от таких
мутаций может выявляться даже в том случае, когда
инактивирующая мутация находится в гетерозиготном состоянии
(Calebiro et al., 2005; Tenenbaum-Rakover et al., 2009).
5) Установлено, что мутации, генерирующие
конститутивно активированную форму рецептора ТТГ, не влияют
на димеризацию и олигомеризацию рецептора, что
свидетельствует в пользу того, что в базальном состоянии
рецептор ТТГ «по умолчанию» остается в форме функционально
активного олигомерного комплекса (Biebermann et al., 2012;
Zoenen et al., 2012).
Одним из интригующих вопросов остается выявление
структурных детерминант в молекулах рецептора ТТГ, которые
отвечают за формирование и стабильность образуемых ими
комплексов. Основываясь на изучении большого числа GPCR, в
настоящее время постулируются следующие наиболее значимые
взаимодействия между протомерами GPCR, обеспечивающие
стабильность и функциональную активность GPCR-комплексов:
между второй цитоплазматической петлей одного протомера и
четвертой ТМС другого протомера (Bakker et al., 2004; Guo et al.,
2005; Mancia et al., 2008), между четвертой и пятой ТМС
(Gorinski et al., 2012), между пятой и шестой ТМС (Wu et al.,
2010), между пятыми ТМС разных протомеров (George et al.,
1998; Yanagawa et al., 2011; Hu et al., 2013), а также между первой
ТМС и восьмым псевдотрансмембранным доменом H8 (Park et
al., 2008; Wu et al., 2012; Huang et al., 2013).
306
Как отмечалось выше, в процессе олигомеризации
рецептора ТТГ основную роль играет трансмембранный домен, в
первую очередь его боковые гидрофобные поверхности, в то
время как эктодомен выполняет в большей степени
вспомогательную функцию, в том числе опосредует влияние
лигандов, связанных с рецептором ТТГ, на устойчивость
олигомерных комплексов (Davies et al., 2002; Urizar et al., 2005b;
Latif et al., 2010a, 2010b). Показано, что, как и в случае κ-
опиоидного рецептора, важную роль в стабилизации
олигомерного комплекса рецептора ТТГ играет взаимодействие
между спиралью H8, локализованной в С-концевом сегменте С-
концевого домена, и первой ТМС (Latif et al., 2015).
Стабильность димерного комплекса также обеспечивается
взаимодействием между вторыми ТМС протомеров рецептора
ТТГ. Важно отметить, что при таком построении димерного
комплекса достигается оптимальное взаимное расположение
эктодоменов, не препятствующее свободному доступу к ним
молекул ТТГ (Kleinau et al., 2017).
Другая, также вполне вероятная модель построения
комплекса предполагает наличие контакта между пятыми ТМС
различных протомеров, а также между пятой и шестой ТМС
различных протомеров. Такая модель симметричного
расположения протомеров является широко распространенной
для GPCR класса А. Однако в таком симметричном комплексе
рецептора ТТГ возникают стерические препятствия для
расположения эктодоменов, что затрудняет высокоаффинное
связывание с ними ТТГ. Вследствие этого, правильность такой
модели образования комплексов в случае рецептора ТТГ не столь
высока. В то же время, полностью исключать ее нельзя,
поскольку для некоторых GPCR-комплексов отмечено
присутствие более чем одной их формы, которые различаются
контактирующими между собой ТМС протомеров (Huang et al.,
2013). В случае олигомерных комплексов рецептора ТТГ и
гонадотропинов в одном таком комплексе априори могут
присутствовать различные контакты между ТМС, что
307
определяется микроокружением рецептора и лиганд-
опосредуемой оккупацией его ортостерического и(или)
аллостерического сайтов (Chazenbalk et al., 1996; Urizar et al.,
2005b).
6.5. Низкомолекулярные лиганды рецептора

В качестве альтернативы ТТГ в последние годы ведутся

разработки аллостерических регуляторов рецептора ТТГ на
основе низкомолекулярных соединений, в основном
гетероциклической природы, которые специфично
взаимодействуют с аллостерическим сайтом рецептора,
локализованным в его трансмембранном домене (Neumann,
Gershengorn, 2011; Neumann et al., 2014; Шпаков, 2015, 2016,
2017; Latif et al., 2016a, 2016b). При связывании эктодомена
рецептора ТТГ с гормоном или с аутоантителами
аллостерический сайт, расположенный в полости
трансмембранного домена, остается свободным, будучи заполнен
молекулами воды. В результате активации рецептора
ортостерическими лигандами меняется конформация
трансмембранного домена и, как следствие, аллостерического
сайта, что вызывает изменения во взаимодействии
цитоплазматических петель рецептора ТТГ с G-белками и
другими компонентами внутриклеточных сигнальных каскадов.
В свою очередь, связывание лигандов с аллостерическим сайтом
рецептора приводит к изменению связывающих характеристик
ортостерического сайта и меняет эффективность передачи
сигналов, генерируемых ТТГ и аутоантителами. Изменение
конформации аллостерического сайта после связывания с
лигандом генерирует волну конформационных перестроек,
которая достигает G-белок-связывающего и G-белок-
активирующего сайтов, формируемых цитоплазматическими
участками рецептора ТТГ и их интерфейсами с ТМС. В
308
результате с высокой селективностью активируются или,
напротив, подавляются определенные внутриклеточные каскады
(Neumann et al., 2014, 2016; Шпаков, 2015). По
фармакологической активности лиганды аллостерического сайта
рецептора ТТГ могут быть отнесены к различным классам
аллостерических регуляторов – позитивным (PAM) и негативным
(NAM) модуляторам, к позитивным модуляторам, наделенным
собственной агонистической активностью (ago-PAM), а также к
«чистым» полным агонистам, инверсионным агонистам и
нейтральным антагонистам.
Первые аллостерические регуляторы рецептора ТТГ были
созданы на основе синтезированного в 2002 году голландскими
учеными тиенопиримидинового производного с активностью
аллостерического агониста рецептора ЛГ, который также обладал
незначительной активностью по отношению к рецептору ТТГ
(van Straten et al., 2002). Основываясь на структурных
особенностях этих регуляторов, с использованием молекулярного
моделирования была предложена пространственная структура
аллостерического сайта рецептора ТТГ. Это позволило
разработать большое число низкомолекулярных лигандов
рецептора ТТГ с различным фармакологическим профилем,
которые являются новым поколением регуляторов тиреоидной
системы (Heitman, Ijzerman, 2008; Шпаков, Шпакова, 2010; Lane,
IJzerman, 2014; Neumann, Gershengorn, 2011; Neumann et al., 2014,
2016; Nataraja et al., 2015; Шпаков, 2015, 2016, 2017; Latif et al.,
2016a, 2016b).
6.5.1. Низкомолекулярные аллостерические полные агонисты

Первые низкомолекулярные лиганды рецептора ТТГ были

открыты в 2006 году при тестировании биологической
активности тиенопиримидиновых производных, аналогов
соединений Org41841 и Org43553, которые ранее были
охарактеризованы, как аллостерические агонисты рецептора ЛГ
309
(Moore et al., 2006) (см. Главу 5). Еще тогда было высказано
обоснованное предположение о том, что структурно-
функциональное сходство рецепторов ТТГ и ЛГ, в том числе их
аллостерических сайтов, локализованных в трансмембранном
домене, обусловливает способность аллостерических лигандов,
специфичных по отношению к рецептору ЛГ, взаимодействовать
также с аллостерическим сайтом рецептора ТТГ. При
исследовании серии замещенных тиено[2,3-d]пиримидинов было
показано, что соединение Org41841 и его структурный аналог, N-
трет-бутил-5-амино-4-(3-метоксифенил)-2-(метилтио)тиено[2,3-
d]пиримидин-6-карбоксилат, в котором атом азота в амидной
группе замещен на атом кислорода, не только являются
аллостерическими агонистами рецептора ЛГ, но и влияют на
активность рецептора ТТГ, хотя и с меньшей эффективностью
(Moore et al., 2006).
Группа немецких и американских ученых под
руководством Мэрвина Гершенгорна детально проанализировала
фармакологическую значимость каждой функциональной группы
в молекулах Org41841 и Org43553 и их аналогов, определяющих
взаимодействие этих тиенопиримидиновых производных с
рецептором ТТГ. Метилирование аминогруппы, которая связана
с тиенопиримидиновым остовом, полностью лишала полученное
соединение специфической биологической активности. Это
указывает на то, что NH2-группа образует водородную связь с
одним из высококонсервативных и функционально важных
аминокислотных остатков в аллостерическом сайте рецептора
ТТГ. Структурный анализ показал, что этим остатком является
Glu3.37. Необходимо отметить, что замена Glu3.37 на аланин
полностью лишает рецептор ТТГ способности функционально
взаимодействовать с соединением Org43553 и его аналогами,
содержащими незамещенную аминогруппу (Jäschke et al., 2006b).
Показано также, что водороды этой NH2-группы критичны для
активации рецептора ЛГ (Moore et al., 2006) (см. Главу 5).
Далее исследовали функциональное значение другого
фармакофора – трет-бутиламидной группы, присоединенной к
310
тиенопиримидиновому остову. В результате было показано, что
метилирование амидного азота в полной мере сохраняет
агонистическую активность в отношении рецептора ЛГ, но при
этом лишает соединение способности влиять на активность
рецептора ТТГ. При этом замена атома азота на кислород,
превращающая амидную связь в сложноэфирную, при наличии
того же трет-бутильного остатка, существенно снижает
агонистическую активность в отношении рецептора ЛГ, но
сравнительно слабо влияет на активность полученного
производного в отношении рецептора ТТГ (Moore et al., 2006).
Исследование аллостерических агонистов рецепторов
ТТГ и ЛГ позволило предположить сходство их аллостерических
сайтов и выявить в них те аминокислотные остатки, которые
критичны для связывания аллостерических лигандов. В
результате этого и с учетом данных по биологической активности
химерных рецепторов, включающих трансмембранные участки
рецепторов ТТГ и ЛГ, в 2006 году была сконструирована первая
пространственная модель аллостерического сайта рецептора ТТГ
(Jäschke et al., 2006a, 2006b), которая впоследствии
совершенствовалась и уточнялась (Hoyer et al., 2013).
Установлено, что аллостерический сайт в рецепторе ТТГ
сформирован аминокислотными остатками, расположенными в
третьей, четвертой, пятой, шестой и седьмой ТМС, и сверху
прикрыт сегментами второй внеклеточной петли. В отличие от
рецептора ЛГ, вход в аллостерический сайт рецептора ТТГ более
узкий и сформирован в основном гидрофобными
аминокислотными остатками. В его формировании принимают
участие высоко гидрофобные и значительные по размеру
аминокислотные остатки, расположенные в интерфейсах между
второй внеклеточной петлей и соседними с ней сегментами
четвертой и пятой ТМС, а также в интерфейсе, образованном
третьей внеклеточной петлей и шестой ТМС.
Группа немецких ученых под руководством Герды
Краузе, опираясь на данные исследований мутантных форм
рецептора ТТГ, а также на результаты молекулярного докинга
311
наделенного агонистической активностью соединения Org41841
и разработанного позднее соединения c52, мягкого
аллостерического антагониста рецептора ТТГ (Neumann et al.,
2008), предложила трехмерную модель аллостерического сайта
рецептора ТТГ и идентифицировала продуктивные
взаимодействия при его связывании с лигандом (Hoyer et al.,
2013). Данные сайт-направленного мутагенеза свидетельствуют о
том, что в области аллостерического сайта и его преддверия
имеется целый ряд аминокислотных остатков, замены которых
либо переводят рецептор в конститутивно активированное
состояние (активирующие мутации), либо, напротив, вызывают
ослабление его функциональной активности (инактивирующие
мутации). Среди активирующих мутаций – Val421Ile (первая
ТМС), Tyr466Ala (вторая ТМС), Thr501Ala (третья ТМС), Leu587Val
(шестая ТМС), Met637Cys (шестая ТМС), Met637Trp (шестая ТМС),
Ser641Ala (шестая ТМС), Tyr643Phe (шестая ТМС), Leu645Val
(шестая ТМС) и Tyr667Ala (седьмая ТМС) (Montanelli et al., 2004;
Kleinau et al., 2010a). Наибольший эффект на взаимодействие с
низкомолекулярными лигандами среди перечисленных
активирующих мутаций оказывает замена остатка Met637 (6.48) на
остаток триптофана в шестой ТМС рецептора ТТГ. Это совпадает
с тем, что замена метионина в этой позиции вызывает
наибольший активирующий эффект на рецептор ТТГ в
свободном от лиганда состоянии. Интересно, что в большинстве
GPCR в позиции 6.48 расположен именно триптофан, который
определяет аффинность ортостерического сайта к агонистам и
стабильность активной конформации рецептора. Таким образом,
можно предположить, что в процессе эволюции рецепторов
гипофизарных гликопротеиновых гормонов в рецепторе ТТГ этот
остаток мог быть заменен на метионин, что было обусловлено
изменением функционального значения сайта, расположенного в
трансмембранном домене рецептора – изначально
ортостерический сайт эволюционировал в аллостерический сайт.
Инактивирующие мутации в рецепторе ТТГ локализованы
в двух основных их кластерах. Первый кластер включает
312
аминокислотные остатки Val502 (третья ТМС), Leu552 (четвертая
ТМС), Tyr582 (пятая ТМС) и Met572 (вторая внеклеточная петля)
(Kleinau et al., 2007, 2008; Haas et al., 2011). Второй кластер
включает Val424 (первая ТМС), Leu467 (вторая ТМС) и Leu665
(седьмая ТМС) (Alberti et al., 2002; Haas et al., 2011).
Инактивирующие мутации стабилизируют рецептор ТТГ в
неактивной конформации, препятствуя его активации
агонистами. При этом, поскольку антагонисты также
стабилизируют неактивную конформацию рецептора, то
инактивирующие мутации не препятствуют их эффективному
связыванию с рецептором.
Молекулярный докинг соединений Org41841 и c52 не
выявил значительных различий их локализации в
аллостерическом сайте рецептора ТТГ, за исключением
смещенной ориентации молекул (рис. 6-5). Поскольку агонист
Org41841 меньше по размеру, то он легче проникает в
трансмембранный домен и способен эффективно
взаимодействовать с находящимся в глубине аллостерического
сайта остатком Met637 (6.48), являющимся ключевым игроком при
активации рецептора. Антагонист c52 не способен «дотянуться»
до этого остатка, что и не позволяет ему стабилизировать
активную конформацию рецептора. При этом длинный боковой
заместитель в ароматическом кольце соединения c52 образует
контакты с боковыми цепями аминокислотных остатков в
области рецептора ТТГ, где локализовано большинство
инактивирующих мутаций. Наиболее важную роль в том, что
соединение c52 не способно эффективно взаимодействовать с
Met637, играет остаток Tyr667, локализованный в седьмой ТМС,
которая вовлечена в гидрофобные или ароматические
взаимодействия с молекулой антагониста и заслоняет от него
остаток метионина (рис. 6-5) (Hoyer et al., 2013).
На основе полученных при изучени соединений Org41841
и c52 сведений о пространственной структуре аллостерического
сайта рецептора ТТГ, Сьюзан Нейман и ее коллеги разработали
серию новых низкомолекулярных агонистов этого рецептора
313
(Neumann et al., 2009; Neumann, Gershengorn, 2011). Среди них
наибольший интерес вызывает соединение N-(4-(5-(3-(фуран-2-
илметил)-4-оксо-1,2,3,4-тетрагидрохиназолин-2-ил)-2-
метоксибензилокси)фенил)ацетамид (NCGC00168126–01) с
активностью полного агониста рецептора ТТГ.
При действии на клетки с экспрессированным рецептором
ТТГ соединение NCGC00168126–01 (10-7–10-5 М) повышало
уровень цАМФ (EC50, 660 нМ) и по эффективности было
сопоставимо с ТТГ. Биотестирование более 100 аналогов
соединения NCGC00168126–01 позволило обнаружить еще более
эффективный агонист рецептора ТТГ – соединение N-(4-(5-(3-
бензил-5-гидрокси-4-оксо-1,2,3,4-тетрагидрохиназолин-2-ил)-2-
метоксибензилокси)фенил)ацетамид (NCGC00165237–01). Оно
стимулировало активность аденилатциклазы со значением EC50
40 нМ. Соединения NCGC00168126–01 и NCGC00165237–01
были селективными в отношении рецептора ТТГ и слабо влияли
на стимуляцию аденилатциклазы гонадотропинами в клетках с
экспрессированными в них рецепторами ЛГ и ФСГ.
Для доказательства того, что низкомолекулярные
агонисты взаимодействуют с аллостерическим сайтом рецептора
ТТГ, было изучено влияние соединения NCGC00165237–01 на
активность мутантного рецептора, лишенного эктодомена, и
потому не способного активироваться при действии на него ТТГ.
В клетках с экспрессированным мутантным рецептором
максимальный стимулирующий аденилатциклазу эффект
NCGC00165237–01 менялся незначительно (снижался на 17 %),
хотя значение EC50 при этом заметно повышалось – до 1.7 мкМ.
Полученные данные указывают на то, что низкомолекулярные
агонисты взаимодействуют с аллостерическим сайтом,
расположенным в трансмембранном домене рецептора.
314
Оrg41841
c52
315
Рис. 6-5. Гомологическая модель рецептора тиреотропного гормона.
Показан аллостерический связывающий карман рецептора ТТГ,
расположенный в его трансмембранном домене. Связанный с этим
карманом инверсионный агонист Org 41841 взаимодействует с
остатками Ser505, Leu570, Val586, Met637 и Tyr657, замены которых приводит
к конститутивно активированному рецептору. Низкоаффинный
антагонист c52 связывается с небольшим смещением к внеклеточному
преддверию трансмембранного домена рецептора. Структурно агонист и
антагонист являются сходными, за исключением удлиненной боковой
цепи в ароматическом кольце антагониста. Именно этот
дополнительный заместитель взаимодействует с остатками Met572 и
Tyr582, замена которых приводит к снижению или потере рецептором
базальной активности. Аминокислотные остатки Ile568, Ile640 и Tyr643
взаимодействуют с боковыми цепями, локализованными в
ароматических кольцах обоих соединений, и способны влиять на их
регуляторные эффекты (по Hoyer et al., 2013).
Эффективность такого взаимодействия снижается у

мутантного рецептора, лишенного эктодомена, что, как полагают,
связано со стабилизирующим влиянием последнего на
конформацию аллостерического сайта. В то же время, замена на
аланин локализованного в пятой ТМС остатка аспарагина
(N5.47A), образующего водородную связь с гидроксильными
группами 5-гидрокси-4-оксо-1,2,3,4-тетрагидрохиназолина,
приводила к блокированию стимулирующего аденилатциклазу
эффекта NCGC00165237–01 при сохранении соответствующего
эффекта ТТГ. Таким образом, аминокислотные остатки, которые
формируют аллостерический сайт рецептора ТТГ,
взаимодействующие с низкомолекулярными агонистами,
критичны для регуляции рецептора этими агонистами, но слабо
или вовсе не влияют на активацию рецептора гормоном, который
связывается с ортостерическим сайтом, локализованным в
эктодомене (Neumann et al., 2009).
Соединение NCGC00165237–01 проявляло все основные
физиологические эффекты ТТГ. Показано, что инкубация
тироцитов человека (24 ч) с 30 мкМ соединения NCGC00165237–
01 повышала экспрессию тиреоглобулина в них в той же степени,
что и обработка с помощью 18 нМ ТТГ. Соединение
316
NCGC00165237–01 повышало экспрессию других зависимых от
ТТГ генов, кодирующих тиреопероксидазу, Na+/I--симпортеры и
D2-дейодиназу, хотя и менее эффективно в сравнении с ТТГ. В
случае D2-дейодиназы повышалась не только экспрессия гена, но
и функциональная активность фермента, что ускоряло
превращение тироксина в трийодтиронин (Neumann et al., 2009).
При внутрибрюшинном введении мышам соединения
NCGC00165237–01 в дозе 0.5 мг/животное или перорально в дозе
2.5 мг/животное наблюдали значительное повышение уровня
общего тироксина, которое в случае внутрибрюшинного
введения было сопоставимым с таковым для ТТГ. Отмечено
значительное повышение поглощения радиоактивного йода
щитовидной железой крыс при их обработке соединением
NCGC00165237–01, что обусловлено стимуляцией экспрессии
генов, кодирующих тиреоглобулин, прекурсор тиреоидных
гормонов, и тиреопероксидазу – фермент, катализирующий
связывание йода с остатками тирозина в молекуле
тиреоглобулина (Neumann et al., 2009).
Разработка низкомолекулярных агонистов рецептора ТТГ
является перспективным направлением для создания лекарств,
которые могут заменить рекомбинантный ТТГ при йодной
диагностике метастазов и рецидивов рака щитовидной железы.
Существующий тест основан на стимуляции рекомбинантным
ТТГ человека поглощения 131I у пациентов с различными
формами рака щитовидной железы (Duntas, Cooper, 2008; Galofré
et al., 2013). Однако из-за сравнительно низкой аффинности
связывания рекомбинантного ТТГ с рецепторами требуются
высокие дозы дорогостоящего препарата этого гормона, а его
введение возможно только парентерально. Вследствие этого,
низкомолекулярные агонисты, такие как соединение
NCGC00165237–01, особенно с учетом сохранения их активности
при пероральном способе введения, могут стать хорошей
альтернативой рекомбинантному ТТГ в качестве стимуляторов
поглощения радиоактивного йода.
317
Низкомолекулярные агонисты способны активировать
мутантные формы рецептора ТТГ с заменами аминокислотных
остатков в лигандсвязывающих участках эктодомена и потому
нечувствительных к действию ТТГ (Allen et al., 2011a). В
культуре клеток HEK-EM293 с экспрессированными в них
мутантными формами рецептора ТТГ (замены Cye41Ser или
Leu252Pro в эктодомене) низкомолекулярный агонист C2 повышал
уровень цАМФ, в то время как ТТГ в этом случае был не активен.
В то же время мутация Leu467Pro в аллостерическом сайте,
которая препятствовала связыванию рецептора ТТГ с
низкомолекулярным агонистом, полностью блокировала его
стимулирующее влияние на активность аденилатциклазы (Allen
et al., 2011a). Эти данные указывают на то, что аллостерические
агонисты рецептора ТТГ могут быть эффективными при
субклиническом гипотиреозе, который часто ассоциирован с
резистентностью тканей щитовидной железы к действию ТТГ
вследствие мутаций в эктодомене рецептора ТТГ.
6.5.2. Низкомолекулярные позитивные аллостерические

модуляторы рецептора тиреотропного гормона
Известно, что ослабление ТТГ-зависимых каскадов

негативно сказывается на функционировании опорно-
двигательного аппарата, поскольку ТТГ играет исключительно
важную роль в формировании костной ткани. В
экспериментальных условиях показано, что применение ТТГ
препятствует потере костной ткани и стимулирует ее формивание
(Abe et al., 2007; Sampath et al., 2008; Sun et al., 2008). Однако
длительное применение ТТГ, вызывающее гиперактивацию ТТГ-
зависимых систем в тироцитах и в других клетках-мишенях, в
которых экспрессируются рецепторы ТТГ, повышает риск
развития ТТГ-зависимых опухолей. Те же проблемы могут
возникнуть при использовании полных аллостерических
агонистов рецептора ТТГ, которые, как отмечалось выше,
способны стимулировать поглощение радиоактивного йода при
318
диагностике и лечении рака щитовидной железы. Как отмечалось
выше (см. Главу 2), низкомолекулярные лиганды GPCR,
наделенные активностью PAM, являются более «мягкими»
активаторами рецептора ТТГ, которые лишь в небольшой
степени усиливают регуляторные эффекты его эндогенных
агонистов и при этом сами не стимулируют ТТГ-зависимые
сигнальные каскады. Соответственно, PAM для рецептора ТТГ
могут рассматриваться, как перспективные препараты для
предотвращения остеопороза, вызывающие восстановление
функциональной активности клеток костной ткани.
Исследование механизмов стимулирующего воздействия
ТТГ на остеобласты и образование костной ткани показало, что
они включают активацию β-аррестиновых сигнальных каскадов,
в которых сопрягающим компонентом между рецептором ТТГ и
эффекторными белками является β1-аррестин. Это
продемонстрировано при изучении влияния рекомбинантного
ТТГ на дифференцировку и пролиферативную активность
культуры остеобластов и родственных им клеточных культур
(Boutin et al., 2014, 2016). При исследовании культуры
остеобласт-подобных U2OS-клеток человека, в которых был
экспрессирован рецептор ТТГ, установлено, что ТТГ через
посредство β1-аррестина стимулирует экспрессию генов,
специфичных для остеобластов, в том числе генов, кодирующих
остеопонтин и щелочную фосфатазу, в то время как другие
эффекты ТТГ реализуются через независимые от β-аррестинов
цАМФ-зависимые и кальциевые сигнальные пути (Boutin et al.,
2016). Соответственно, поиск PAM для рецептора ТТГ
проводился в основном среди низкомолекулярных лигандов этого
рецептора, специфичных в отношении β-аррестиновых каскадов.
В результате разработано соединение [N-(1-фенилэтил)-2-
(1-пиперазинил)-4-хиназолинамин (NCGC00379308 или D3-βArr),
которое селективно повышает траслокацию β1-аррестина к
рецептору ТТГ, но при этом не влияет на активность Gs- и Gq/11-
опосредуемых сигнальных каскадов, демонстрируя, тем самым,
специфичность в отношении β-аррестинового сигналинга
319
(Neumann et al., 2018). Показано, что соединение NCGC00379308
стимулирует траслокацию β1-аррестина в пять раз интенсивнее,
чем ТТГ, и, наряду с этим, вызывает отчетливо выраженное
потенцирование ТТГ-индуцированной транслокации β1-
аррестина. Само соединение NCGC00379308 при обработке им
U2OS-клеток человека практически не влияло на экспрессию
ТТГ-зависимых генов OPN и ALPL, кодирующих остеопонтин и
щелочную фосфатазу, но при этом в значительной степени
потенцировало стимулирующий генную экспрессию эффект ТТГ.
При совместном воздействии NCGC00379308 и ТТГ уровень
мРНК генов OPN и ALPL был в 5.5 и 1.6 раза выше, чем при
воздействии только одного ТТГ. В дополнение к этому,
соединение NCGC00379308 потенцировало ТТГ-
индуцированную секрецию белка остепонтина. Совокупность
полученных данных свидетельствует о том, что соединение
NCGC00379308 может рассматриваться, как PAM для рецептора
ТТГ. Оно потенцирует эффекты ТТГ на рост и дифференцировку
предшественников остеобластов через β-аррестиновые
механизмы (Neumann et al., 2018).
6.5.3. Низкомолекулярные антагонисты и инверсионные

агонисты рецептора тиреотропного гормона
Разработка низкомолекулярных аллостерических

лигандов рецептора ТТГ с активностью инверсионных агонистов
и нейтральных антагонистов является еще более актуальной
задачей в сравнении с разработкой низкомолекулярных полных
аллостерических агонистов и PAM (Neumann, Gershengorn, 2011;
Marcinkowski et al., 2019). При гипертиреозе, в первую очередь
при болезни Грейвса, активирующие рецептор ТТГ антитела
вызывают гиперстимуляцию щитовидной железы, в значительной
степени повышают концентрацию тиреоидных гормонов и, тем
самым, нарушают функционирование гипоталамо-гипофизарно-
тиреоидной оси (Rapoport, McLachlan, 2007). В настоящее время
подходы для эффективного лечения гипертиреоза отсутствуют, и
320
это в первую очередь связано с отсутствием фармакологических
препаратов, наделенных свойствами антагонистов рецептора ТТГ
(Bahn, 2012).
Основываясь на модели аллостерического сайта
рецептора ТТГ, в 2008 году разработано соединение
NIDDK/CEB-52, (E)-N-трет-бутил-5-амино-4-(4-(3-метоксипроп-
1-енил)фенил)-2-(метилтио)тиено[2,3-d]пиримидин-6-
карбоксамид со свойствами антагониста рецептора ТТГ
(Neumann et al., 2008). Для повышения гидрофобности в пара-
положении фенильного кольца была введена
метоксипропиленовая группа, что повысило способность
соединения NIDDK/CEB-52 проникать в аллостерический сайт
рецептора. В присутствии 30 мкМ NIDDK/CEB-52
стимулирующий эффект ТТГ на активность аденилатциклазы
снижался на 71 %, причем значение IC50 для ингибирующего
эффекта NIDDK/CEB-52 составило 4.2 мкМ. Инкубация
культуры клеток HEK-EM 293, в которых был экспрессирован
рецептор ТТГ, с соединением NIDDK/CEB-52 (30 мкМ) на 28–79
% ингибировала стимулирующий эффект активирующих
рецептор ТТГ антител на продукцию цАМФ. Инкубация
тироцитов человека совместно с ТТГ и NIDDK/CEB-52 (10 мкМ)
в течение суток вызывала трехкратное снижение
стимулированной ТТГ экспрессии гена, кодирующего
тиреопероксидазу, в сравнении с тироцитами, которые
обрабатывали только одним ТТГ. При этом агонистическая
активность NIDDK/CEB-52 в отношении рецептора ТТГ
отсутствовала, что указывает на принадлежность этого
соединения к классу нейтральных антагонистов (Neumann et al.,
2008).
Однако, несмотря на высокую селективность в отношении
рецептора ТТГ, соединение NIDDK/CEB-52 также в
незначительной степени влияло на активность рецептора ЛГ,
действуя, как его инверсионный агонист, что при применении
NIDDK/CEB-52 в клинике способно привести к нежелательным
побочным эффектам (Neumann et al., 2008). Вследствие этого
321
исследования по созданию нейтральных антагонистов рецептора
ТТГ были продолжены.
Первый шаг в создании нейтральных антагонистов был
сделан Сьюзан Нейман и ее коллегами в 2010 году (Neumann et
al., 2010b). При изучении активности структурных аналогов
соединения NCGC00165237–01 были обнаружены 11 соединений,
которые в различной степени, но с высокой селективностью,
подавляли активность рецептора ТТГ. Одно из них, соединение
NCGC00161856, 2-(3-((2,6-диметилфенокси)метил)-4-
метоксифенил)-3-(фуран-2-илметил)-2,3-дигидрохиназолин-
4(1H)-он, имело активность инверсионного агониста. В отличие
от NIDDK/CEB-52, соединение NCGC00161856 подавляло не
только стимулированную ТТГ, но и базальную активность
рецептора ТТГ. Оно на 58 % снижало базальную активность
рецептора ТТГ (IC50=3 мкМ) и на 86 % ТТГ-индуцированное
повышение уровня цАМФ (IC50=0.78 мкМ). В присутствии
NCGC00161856 снижалась аффинность рецептора ТТГ к
гормону, что выражалось в сдвиге вправо кривой доза-эффект
для стимулирующего аденилатциклазу эффекта ТТГ.
Дальнейшие исследования позволили разработать
соединение NCGC00229600 (2-{3-[(2,6-диметилфенокси)метил]-
4-метоксифенил}-3-(пиридин-3-илметил)-2,3-дигидрохиназолин-
4(1H)-он), которое ингибировало базальную и стимулированную
ТТГ активность рецептора ТТГ эффективнее, в сравнении с
соединением NCGC00161856 (Neumann et al., 2011). Соединение
NCGC00229600 на 30–75 % снижало стимулирующий
аденилатциклазу эффект активирующих рецептор ТТГ антител в
культуре тироцитов человека, но не снижало специфическое
связывание антител с рецептором. Оно также снижало
вызываемую ТТГ и активирующими антителами стимуляцию
аденилатциклазы в первичной культуре фибробластов, которые
были получены из ретроорбитальной области пациентов с
болезнью Грейвса и характеризовались повышенной экспрессией
рецептора ТТГ (Neumann et al., 2012). В присутствии 30 мкМ
NCGC00229600 стимулирующий эффект антител на активность
322
аденилатциклазы снижался на 66 %. Ингибирующее действие
NCGC00229600 было высокоселективным и не затрагивало
стимуляцию аденилатциклазы гормонами, действующими через
рецепторы, отличные от рецептора ТТГ. Так стимулирующий
эффект BW245C, агониста рецептора простагландина D2, в
ретроорбитальных фибробластах не менялся в присутствии даже
высоких миллимолярных концентраций соединения
NCGC00229600. Способность соединения NCGC00229600
подавлять активность рецептора ТТГ в ретроорбитальных
фибробластах важна с точки зрения клинической
эндокринологии, поскольку вызываемая активирующими
антителами гиперстимуляция аденилатциклазы и цАМФ-
зависимых сигнальных каскадах в этих клетках – одна из
основных причин офтальмопатии, грозного симптома болезни
Грейвса (Wiersinga, 2011).
В ходе дальнейшей разработки нейтральных антагонистов
рецептора ТТГ, более селективных в сравнении с NIDDK/CEB-
52, разработаны два соединения – NCGC00242595, 2-[3-[(2,6-
диметилфенил)сульфанилметил]-4-метоксифенил]-3-(фуран-2-
илметил)-1,2-дигидрохиназолин-4-он, и NCGC00242364, N-[4-[[5-
[3-(фуран-2-илметил)-4-оксо-1,2-дигидрохиназолин-2-ил]-2-
метоксифенил]метокси]-3,5-диметилфенил]ацетамид (Turcu et
al., 2013; Neumann et al., 2014). Соединение NCGC00242595
ингибировало продукцию цАМФ, стимулированную
активирующими антителами к рецептору ТТГ в культуре
недифференцированных орбитальных фибробластов с
экспрессированным в них рецептором ТТГ, и подавляло
вызываемую этими антителами продукцию гиалуроновой
кислоты и фосфорилирование Akt-киназы, которые также
осуществляются через посредство активации антителами
рецептора ТТГ. При этом влияния на базальную активность
рецептора и базальный уровень продукции гиалуроновой
кислоты соединение NCGC00242595 не оказывало (Turcu et al.,
2013).
323
На основе соединения NCGC00242595 разработан еще
более мощный нейтральный антагонист рецептора ТТГ –
соединение NCGC00242364, которое со значением IC50, равным
2.1 мкМ, ингибировало ТТГ-индуцированную стимуляцию
аденилатциклазы, но не влияло при этом на стимулирующий
аденилатциклазу эффект ЛГ (Neumann et al., 2014). При
обработке с помощью NCGC00242364 самок мышей линии
BALB/c, которые в течение трех дней получали низкие дозы
тиролиберина, уровень свободного тироксина снижался на 44 %,
а экспрессия генов, кодирующих Na+/I--котранспортер и
тиреопероксидазу, снижалась на 75 и 83 %, соответственно.
Обработка соединением NCGC00242364 мышей, которым
вводили стимулирующие рецептор ТТГ антитела, снижала
уровень тироксина на 38 % и экспрессию генов Na+/I--
котранспортера и тиреопероксидазы на 73 и 40 %. Эти данные
указывают на высокую эффективность соединений
NCGC00242595, NCGC00242364 и их аналогов при лечении
болезни Грейвса. Исключительно важно, что эти соединения не
влияли на базальную активность рецептора ТТГ. Это позволяет
избежать развития гипотиреоза, что является одним из
возможных нежелательных эффектов при использовании
аллостерических инверсионных агонистов рецептора ТТГ
(Neumann, Gershengorn, 2011; Neumann et al., 2014).
Инверсионные агонисты рецептора ТТГ в большей степени
пригодны для лечения неаутоиммунных гипертиреоидных
состояний, которые вызваны активирующими мутациями в
рецепторе ТТГ.
Совсем недавно синтезировано гетероциклическое
соединение S37a, которое содержит семь центров хиральности,
причем функционально активным был только один из изомеров
этого соединения (Marcinkowski et al., 2019). Показано, что в
микромолярных концентрациях соединение S37a подавляло
активацию аденилатциклазы и накопление цАМФ внутри
HEK293-клеток с экспрессированным в них рецептором ТТГ при
их обработке не только ТТГ, но и стимулирующими
324
моноклональными антителами TSAb M22 человека и KSAb1
мыши, а также низкомолекулярным аллостерическим агонистом
C2. Соединение S37a препятствовало повышению
внутриклеточного уровня цАМФ, которое вызывали
олигоклональными антителами TSAb, характерными для
пациентов с болезнью Грейвса. Продемонстрировано, что
соединение S37a при пероральном введении мышам
характеризуется высокой биодоступностью (53 %) и не оказывает
каких-либо токсических эффектов на организм животных, что
позволяет рекомендовать его для дальнейших клинических
испытаний (Marcinkowski et al., 2019).
Шпаков А.О. Новые достижения в разработке и изучении механизмов

действия низкомолекулярных агонистов рецепторов тиреотропного и
лютеинизирующего гормонов // Цитология. 2015. Т. 57. № 3. C. 167–176.
Шпаков А.О. Тиреоидная система в норме и при сахарном диабете 1-го
и 2-го типов / Санкт-Петербург: Издательство Политехнического университета.
2016. 222 с. ISBN 978-5-7422-5525-3.
Шпаков А.О. Фармакологические подходы для коррекции дисфункций
щитовидной железы в условиях сахарного диабета // Биомедицинская химия.
2017. Т. 63. Вып. 3. С. 219–231. doi: 10.18097/PBMC20176303219.
Шпаков А.О., Шпакова Е.А. Низкомолекулярные регуляторы
рецепторов полипептидных гормонов, содержащих LGR-повторы //
Биомедицинская химия. 2010. Т. 56. № 3. С. 303–318.
Abe E., Sun L., Mechanick J., Iqbal J., Yamoah K., Baliram R., Arabi A.,
Moonga B.S., Davies T.F., Zaidi M. Bone loss in thyroid disease: role of low TSH and
high thyroid hormone // Ann. N. Y. Acad. Sci.. 2007. V. 1116. P. 383–391. doi:
10.1196/annals.1402.062.
Ahuja S., Smith S.O. Multiple switches in G protein-coupled receptor
activation // Trends Pharmacol. Sci. 2009. V. 30. P. 494–502. doi:
10.1016/j.tips.2009.06.003.
Alberti L., Proverbio M.C., Costagliola S., Romoli R., Boldrighini B.,
Vigone M.C., Weber G., Chiumello G., Beck-Peccoz P., Persani L. Germline
mutations of TSH receptor gene as cause of nonautoimmune subclinical
hypothyroidism // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. V. 87 (6). P. 2549–2555. doi:
10.1210/jcem.87.6.8536.
Ali M.R., Latif R., Davies T.F., Mezei M. Monte Carlo loop refinement and
virtual screening of the thyroid-stimulating hormone receptor transmembrane domain
325
// J. Biomol. Struct. Dyn. 2015. V. 33. P. 1140–1152. doi:
10.1080/07391102.2014.932310.
Allen M.D., Neumann S., Gershengorn M.C. Small-molecule thyrotropin
receptor agonist activates naturally occurring thyrotropin-insensitive mutants and
reveals their distinct cyclic adenosine monophosphate signal persistence // Thyroid.
2011a. V. 21 (8). P. 907–912. doi: 10.1089/thy.2011.0025.
Allen M.D., Neumann S., Gershengorn M.C. Occupancy of both sites on the
thyrotropin (TSH) receptor dimer is necessary for phosphoinositide signaling //
FASEB J. 2011b. V. 25 (10). P. 3687–3694. doi: 10.1096/fj.11-188961.
Angel T.E., Chance M.R., Palczewski K. Conserved waters mediate
structural and functional activation of family A (rhodopsin-like) G protein-coupled
receptors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 8555–8560. doi:
10.1073/pnas.0903545106.
Bahn R.S. Autoimmunity and Graves’ disease // Clin. Pharmacol. Ther.
2012. V. 91 (4). P. 577–579. doi: 10.1038/clpt.2012.10.
Bakker R.A., Dees G., Carrillo J.J., Booth R.G., Lopez-Gimenez J.F.,
Milligan G., et al. Domain swapping in the human histamine H1 receptor // J.
Pharmacol. Exp. Ther. 2004. V. 311. P. 131–138. doi: 10.1124/jpet.104.067041.
Ballesteros J.A., Weinstein H. Integrated methods for the construction of
three-dimensional models and computational probing of structure-function
relationships in G-protein coupled receptors // Methods Neurosci. 1995. V. 25. P.
366–428. doi: 10.1016/S1043-9471(05)80049-7.
Baquedano M.S., Ciaccio M., Dujovne N., Herzovich V., Longueira Y.,
Warman D.M., Rivarola M.A., Belgorosky A. Two novel mutations of the TSH-beta
subunit gene underlying congenital central hypothyroidism undetectable in neonatal
TSH screening // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2010. V. 95 (9). P. E98–E103. doi:
10.1210/jc.2010-0223.
Biebermann H., Schoneberg T., Schulz A., Krause G., Gruters A., Schultz
G., Gudermann T. A conserved tyrosine residue (Y601) in transmembrane domain 5
of the human thyrotropin receptor serves as a molecular switch to determine G-protein
coupling // FASEB J. 1998. V. 12 (14). P. 1461–1471. doi:
10.1096/fasebj.12.14.1461.
Biebermann H., Winkler F., Handke D., Teichmann A., Gerling B.,
Cameron F., Eichhorst J., Grüters A., Wiesner B., Kühnen P., Krude H., Kleinau G.
New pathogenic thyrotropin receptor mutations decipher differentiated activity
switching at a conserved helix 6 motif of family A GPCR // J. Clin. Endocrinol.
Metab. 2012. V. 97 (2). P. E228–E232. doi: 10.1210/jc.2011-2106.
Blankenship E., Vahedi-Faridi A., Lodowski D.T. The high-resolution
structure of activated opsin reveals a conserved solvent network in the transmembrane
region essential for activation // Structure. 2015. V. 23. P. 2358–2364. doi:
10.1016/j.str.2015.09.015.
Bonomi M., Busnelli M., Persani L., Vassart G., Costagliola S. Structural
differences in the hinge region of the glycoprotein hormone receptors: evidence from
326
the sulfated tyrosine residues // Mol. Endocrinol. 2006. V. 20. P. 3351–3363. doi:
10.1210/me.2005-0521.
Boutin A., Eliseeva E., Gershengorn M.C., Neumann S. beta-Arrestin-1
mediates thyrotropin-enhanced osteoblast differentiation // FASEB J. 2014. V. 28. P.
3446–3455. doi: 10.1096/fj.14-251124.
Boutin A., Neumann S., Gershengorn M.C. Multiple transduction pathways
mediate thyrotropin receptor signaling in preosteoblast-like cells // Endocrinology.
2016. V. 157 (5). P. 2173–2181. doi: 10.1210/en.2015-2040.
Bouvier M. Oligomerization of G-protein-coupled transmitter receptors //
Nat. Rev. Neurosci. 2001. V. 2. P. 274–286. doi: 10.1038/35067575.
Bruser A., Schulz A., Rothemund S., Ricken A., Calebiro D., Kleinau G.,
Schoneberg T. The activation mechanism of glycoprotein hormone receptors with
implications in the cause and therapy of endocrine diseases // J. Biol. Chem. 2016. V.
291. P. 508–520. doi: 10.1074/jbc.M115.701102.
Bruysters M., Verhoef-Post M., Themmen A.P. Asp330 and Tyr331 in the C-
terminal cysteine-rich region of the luteinizing hormone receptor are key residues in
hormone-induced receptor activation // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 25821–25828.
doi: 10.1074/jbc.M804395200.
Buch T.R., Biebermann H., Kalwa H., Pinkenburg O., Hager D., Barth H.,
Aktories K., Breit A., Gudermann T. G13-dependent activation of MAPK by
thyrotropin // J. Biol. Chem. 2008. V. 283 (29). P. 20330–20341. doi:
10.1074/jbc.M800211200.
Calebiro D., de Filippis T., Lucchi S., Covino C., Panigone S., Beck-Peccoz
P., et al. Intracellular entrapment of wild-type TSH receptor by oligomerization with
mutants linked to dominant TSH resistance // Hum. Mol. Genet. 2005. V. 14. P.
2991–3002. doi: 10.1093/hmg/ddi329.
Caltabiano G., Campillo M., De Leener A., Smits G., Vassart G.,
Costagliola S., et al. The specificity of binding of glycoprotein hormones to their
receptors // Cell Mol. Life Sci. 2008. V. 65. P. 2484–2492. doi: 10.1007/s00018-008-
8002-9.
Camilot M., Teofoli F., Gandini A., Franceschi R., Rapa A., Corrias A.,
Bona G., Radetti G., Tatò L. Thyrotropin receptor gene mutations and TSH resistance:
variable expressivity in the heterozygotes // Clin. Endocrinol. (Oxf.). 2005. V. 63 (2).
P. 146–151. doi: 10.1111/j.1365-2265.2005.02314.x.
Cangul H., Morgan N.V., Forman J.R., Saglam H., Aycan Z., Yakut T., et al.
Novel TSHR mutations in consanguineous families with congenital nongoitrous
hypothyroidism // Clin. Endocrinol. (Oxf.). 2010. V. 73. P. 671–677. doi :
10.1111/j.1365-2265.2010.03849.x.
Carpenter B., Nehme R., Warne T., Leslie A.G., Tate C.G. Structure of the
adenosine A(2A) receptor bound to an engineered G protein // Nature. 2016. V. 536.
P. 104–107. doi: 10.1038/nature18966.
327
Chang W.C., Liao C.Y., Chen W.C., Fan Y.C., Chiu S.J., Kuo H.C., et al.
R450H TSH receptor mutation in congenital hypothyroidism in Taiwanese children //
Clin. Chim. Acta. 2012. V. 413. P. 1004–1007. Doi: 10.1016/j.cca.2012.02.027.
Chantreau V., Taddese B., Munier M., Gourdin L., Henrion D., Rodien P.,
et al. Molecular insights into the transmembrane domain of the thyrotropin receptor //
PLoS One. 2015. V. 10. P. e0142250. doi: 10.1371/journal.pone.0142250.
Chazenbalk G.D., Chen C.R., McLachlan S.M., Rapoport B. Does
thyrotropin cleave its cognate receptor? // Endocrinology. 2004. V. 145. P. 4–10. doi:
10.1210/en.2003-1002.
Chazenbalk G.D., Kakinuma A., Jaume J.C., McLachlan S.M., Rapoport B.
Evidence for negative cooperativity among human thyrotropin receptors
overexpressed in mammalian cells // Endocrinology. 1996. V. 137. P. 4586–4591. doi:
10.1210/endo.137.11.8895321.
Chazenbalk G.D., Nagayama Y., Russo D., Wadsworth H.L., Rapoport B.
Functional analysis of the cytoplasmic domains of the human thyrotropin receptor by
site-directed mutagenesis // J. Biol. Chem. 1990. V. 265 (34). P. 20970–20975.
Chazenbalk G.D., Tanaka K., Nagayama Y., Kakinuma A., Jaume J.C.,
McLachlan S.M., et al. Evidence that the thyrotropin receptor ectodomain contains not
one, but two, cleavage sites // Endocrinology. 1997. V. 138. P 2893–2899. doi:
10.1210/en.138.7.2893.
Chen C.R., Chazenbalk G.D., McLachlan S.M., Rapoport B. Evidence that
the C terminus of the A subunit suppresses thyrotropin receptor constitutive activity //
Endocrinology. 2003. V. 144. P. 3821–3827. doi: 10.1210/en.2003-0430.
Chen C.R., McLachlan S.M., Rapoport B. Thyrotropin (TSH) receptor
residue E251 in the extracellular leucine-rich repeat domain is critical for linking TSH
binding to receptor activation // Endocrinology. 2010. V. 151. P. 1940–1947. doi:
10.1210/en.2009-1430.
Chen C.R., McLachlan S.M., Rapoport B. Evidence that the thyroid-
stimulating hormone (TSH) receptor transmembrane domain influences kinetics of
TSH binding to the receptor ectodomain // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. P. 6219–
6224. doi: 10.1074/jbc.M110.211003.
Chen C.R., Salazar L.M., McLachlan S.M., Rapoport B. The thyrotropin
receptor hinge region as a surrogate ligand: identification of loci contributing to the
coupling of thyrotropin binding and receptor activation // Endocrinology. 2012. V.
153. P. 5058–5067. doi: 10.1210/en.2012-1376.
Cherezov V., Rosenbaum D.M., Hanson M.A., Rasmussen S.G., Thian F.S.,
Kobilka T.S., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-
adrenergic G protein-coupled receptor // Science. 2007. V. 318. P. 1258–1265. doi:
10.1126/science.1150577.
Choe H.W., Kim Y.J., Park J.H., Morizumi T., Pai E.F., Krauss N., et al.
Crystal structure of metarhodopsin II // Nature. 2011. V. 471. P. 651–655. doi:
10.1038/nature09789.
328
Chrencik J.E., Roth C.B., Terakado M., Kurata H., Omi R., Kihara Y., et al.
Crystal structure of antagonist bound human lysophosphatidic acid receptor 1 // Cell.
2015. V. 161. P. 1633–1643. doi: 10.1016/j.cell.2015.06.002.
Ciruela F., Vilardaga J.P., Fernandez-Duenas V. Lighting up multiprotein
complexes: lessons from GPCR oligomerization // Trends Biotechnol. 2010. V. 28. P.
407–415. doi: 10.1016/j.tibtech.2010.05.002.
Claeysen S., Govaerts C., Lefort A., Van Sande J., Costagliola S., Pardo L.,
et al. A conserved Asn in TM7 of the thyrotropin receptor is a common requirement
for activation by both mutations and its natural agonist // FEBS Lett. 2002. V. 517. P.
195–200. doi: 10.1016/S0014-5793(02)02620-0.
Claus M., Jaeschke H., Kleinau G., Neumann S., Krause G., Paschke R. A
hydrophobic cluster in the center of the third extracellular loop is important for
thyrotropin receptor signaling // Endocrinology. 2005. V. 146. P. 5197–5203. doi:
10.1210/en.2005-0713.
Claus M., Neumann S., Kleinau G., Krause G., Paschke R. Structural
determinants for G-protein activation and specificity in the third intracellular loop of
the thyroid-stimulating hormone receptor // J. Mol. Med. 2006. V. 84. P. 943–954.
doi: 10.1007/s00109-006-0087-8.
Costagliola S., Panneels V., Bonomi M., Koch J., Many M.C., Smits G., et
al. Tyrosine sulfation is required for agonist recognition by glycoprotein hormone
receptors // EMBO J. 2002. V. 21. P. 504–513. doi: 10.1093/emboj/21.4.504
Costanzi S. Homology modeling of class a G protein-coupled receptors //
Methods Mol. Biol. 2012. V. 857. P. 259–279. doi: 10.1007/978-1-61779-588-6_11.
Costanzi S. Modeling G protein-coupled receptors and their interactions
with ligands // Curr. Opin. Struct. Biol. 2013. V. 23. P. 185–190. doi:
10.1016/j.sbi.2013.01.008.
Costanzi S., Wang K. The GPCR crystallography boom: providing an
invaluable source of structural information and expanding the scope of homology
modeling // Adv. Exp. Med. Biol. 2014. V. 796. P. 3–13. doi: 10.1007/978-94-007-
7423-0_1.
Couet J., de Bernard S., Loosfelt H., Saunier B., Milgrom E., Misrahi M.
Cell surface protein disulfide-isomerase is involved in the shedding of human
thyrotropin receptor ectodomain // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 14800–14805. doi:
10.1021/bi961359w.
Davies T.F., Ando T., Lin R.Y., Tomer Y., Latif R. Thyrotropin receptor-
associated diseases: from adenomata to Graves disease // J. Clin. Invest. 2005. V.115
(8). P. 1972–1983. doi: 10.1172/JCI26031.
Davies T.F., Latif R. Editorial: TSH Receptor and Autoimmunity // Front.
Davies T., Marians R., Latif R. The TSH receptor reveals itself // J. Clin.
Invest. 2002. V. 110. P. 161–164. doi: 10.1172/JCI0216234.
De Gregorio G., Coppa A., Cosentino C., Ucci S., Messina S., Nicolussi A.,
D'Inzeo S., Di Pardo A., Avvedimento E. V., Porcellini A. The p85 regulatory subunit
329
of PI3K mediates TSH-cAMP-PKA growth and survival signals // Oncogene. 2007.
V. 26 (14). P. 2039–2047. doi: 10.1038/sj.onc.1210011.
Deladoëy J., Vuissoz J.M., Domené H.M., Malik N., Gruneiro-Papendieck
L., Chiesa A., Heinrich J.J., Mullis P.E. Congenital secondary hypothyroidism due to
a mutation C105Vfs114X thyrotropin-beta mutation: genetic study of five unrelated
families from Switzerland and Argentina // Thyroid. 2003. V. 13 (6). P. 553–559. doi:
10.1089/105072503322238818.
de Roux N., Misrahi M., Brauner R., Houang M., Carel J.C., Granier M., Le
Bouc Y., Ghinea N., Boumedienne A., Toublanc J.E., Milgrom E. Four families with
loss of function mutations of the thyrotropin receptor // J. Clin. Endocrinol. Metab.
1996. V. 81 (12). P. 4229–4235. doi: 10.1210/jcem.81.12.8954020.
Duntas L.H., Cooper D.S. Review on the occasion of a decade of
recombinant human TSH: prospects and novel uses // Thyroid. 2008. V. 18 (5). P.
509–516. doi: 10.1089/thy.2007.0331.
Duprez L., Parma J., Costagliola S., Hermans J., Van Sande J., Dumont
J.E., et al. Constitutive activation of the TSH receptor by spontaneous mutations
affecting the N-terminal extracellular domain // FEBS Lett. 1997. V. 409. P. 469–474.
doi: 10.1016/S0014-5793(97)00532-2.
Estrada J.M., Soldin D., Buckey T.M., Burman K.D., Soldin O.P.
Thyrotropin isoforms: implications for thyrotropin analysis and clinical practice //
Thyroid. 2014. V. 24 (3). P. 411–423. doi: 10.1089/thy.2013.0119.
Fares F. The role of O-linked and N-linked oligosaccharides on the
structure-function of glycoprotein hormones: development of agonists and antagonists
// Biochim. Biophys. Acta. 2006. V. 1760 (4). P. 560–567. doi:
10.1016/j.bbagen.2005.12.022.
Fares F.A., Levi F., Reznick A.Z., Kraiem Z. Engineering a potential
antagonist of human thyrotropin and thyroid-stimulating antibody // J. Biol. Chem.
2001. V. 276 (7). P. 4543–4548. doi: 10.1074/jbc.M008093200.
Fekete C., Lechan R.M. Central regulation of hypothalamic-pituitary-
thyroid axis under physiological and pathophysiological conditions // Endocr. Rev.
2014. V. 35 (2). P. 159–194. doi: 10.1210/er.2013-1087.
Fredriksson R., Lagerstrom M.C., Lundin L.G., Schioth H.B. The G-protein-
coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic
analysis, paralogon groups, and fingerprints // Mol. Pharmacol. 2003. V. 63. P. 1256–
1272. doi: 10.1124/mol.63.6.1256.
Frenzel R., Voigt C., Paschke R. The human thyrotropin receptor is
predominantly internalized by beta-arrestin 2 // Endocrinology. 2006. V. 147. P.
3114–3122. doi: 10.1210/en.2005-0687.
Galofré J.C., Chacón A.M., Latif R. Targeting thyroid diseases with TSH
receptor analogs // Endocrinol. Nutr. 2013. V. 60 (10). P. 590–598. doi:
10.1016/j.endonu.2012.12.008.
George S.R., Lee S.P., Varghese G., Zeman P.R., Seeman P., Ng G.Y.,
O'Dowd B.F. A transmembrane domain-derived peptide inhibits D1 dopamine
330
receptor function without affecting receptor oligomerization // J. Biol. Chem. 1998. V.
273 (46). P. 30244–30248. doi: 10.1074/jbc.273.46.30244.
George S.R., O’Dowd B.F., Lee S.P. G-protein-coupled receptor
oligomerization and its potential for drug discovery // Nat. Rev. Drug Discov. 2002.
V. 1. P. 808–820. doi: 10.1038/nrd913.
Gorinski N., Kowalsman N., Renner U., Wirth A., Reinartz M.T., Seifert R.,
et al. Computational and experimental analysis of the transmembrane domain 4/5
dimerization interface of the serotonin 5-HT(1A) receptor // Mol. Pharmacol. 2012. V.
82. P. 448–463. doi: 10.1124/mol.112.079137.
Guo W., Shi L., Filizola M., Weinstein H., Javitch J.A. Crosstalk in G
protein-coupled receptors: changes at the transmembrane homodimer interface
determine activation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 17495–17500.
doi: 10.1073/pnas.0508950102.
Haas A.K., Kleinau G., Hoyer I., Neumann S., Furkert J., Rutz C., Schulein
R., Gershengorn M.C., Krause G. Mutations that silence constitutive signaling
activity in the allosteric ligand-binding site of the thyrotropin receptor // Cell. Mol.
Life Sci. 2011. V. 68. P. 159–167. doi: 10.1007/s00018-010-0451-2.
Hamidi S., Chen C.R., Mizutori-Sasai Y., McLachlan S.M., Rapoport B.
Relationship between thyrotropin receptor hinge region proteolytic posttranslational
modification and receptor physiological function // Mol. Endocrinol. 2011. V. 25. P.
184–194. doi: 10.1210/me.2010-0401.
Hanson M.A., Roth C.B., Jo E., Griffith M.T., Scott F.L., Reinhart G., et al.
Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor // Science. 2012. V. 335. P.
851–855. doi: 10.1126/science.1215904.
Harikumar K.G., Morfis M.M., Sexton P.M., Miller L.J. Pattern of intra-
family hetero-oligomerization involving the G-protein-coupled secretin receptor // J.
Mol. Neurosci. 2008. V. 36. P. 279–285. doi: 10.1007/s12031-008-9060-z.
Heitman L.H., Ijzerman A.P. G protein-coupled receptors of the
hypothalamic-pituitary-gonadal axis: a case for Gnrh, LH, FSH, and GPR54 receptor
ligands // Med. Res. Rev. 2008. V. 28 (6). P. 975–1011. doi: 10.1002/med.20129.
Ho S.C., Goh S.S., Li S., Khoo D.H., Paterson M. Effects of mutations
involving cysteine residues distal to the S281HCC motif at the C-terminus on the
functional characteristics of a truncated ectodomain-only thyrotropin receptor
anchored on glycosylphosphatidyl-inositol // Thyroid. 2008. V. 18. P. 1313–1319.
doi: 10.1089/thy.2008.0240.
Ho S.C., Van Sande J., Lefort A., Vassart G., Costagliola S. Effects of
mutations involving the highly conserved S281HCC motif in the extracellular domain
of the thyrotropin (TSH) receptor on TSH binding and constitutive activity //
Endocrinology. 2001. V. 142. P. 2760–2767. doi: 10.1210/en.142.7.2760.
Hoyer I., Haas A.K., Kreuchwig A., Schülein R., Krause G. Molecular
sampling of the allosteric binding pocket of the TSH receptor provides discriminative
pharmacophores for antagonist and agonists // Biochem. Soc. Trans. 2013. V. 41. P.
213–217. doi: 10.1042/BST20120319
331
Hu J., Hu K., Liu T., Stern M.K., Mistry R., Challiss R.A., et al. Novel
structural and functional insights into M3 muscarinic receptor dimer/oligomer
formation // J. Biol. Chem. 2013. V. 288. P. 34777–34790. doi:
10.1074/jbc.M113.503714.
Huang J., Chen S., Zhang J.J., Huang X.Y. Crystal structure of oligomeric
beta1-adrenergic G protein-coupled receptors in ligand-free basal state // Nat. Struct.
Mol. Biol. 2013. V. 20. P. 419–425. doi: 10.1038/nsmb.2504.
Isberg V., de Graaf C., Bortolato A., Cherezov V., Katritch V., Marshall
F.H., et al. Generic GPCR residue numbers – aligning topology maps while minding
the gaps // Trends Pharmacol. Sci. 2015. V. 36. P. 22–31. doi:
10.1016/j.tips.2014.11.001.
Isberg V., Mordalski S., Munk C., Rataj K., Harpsoe K., Hauser A.S., et al.
GPCRdb: an information system for G protein-coupled receptors // Nucleic Acids
Res. 2016. V. 44. P. D356–D364. doi: 10.1093/nar/gkv1178.
Ismer J., Rose A.S., Tiemann J.K., Goede A., Preissner R., Hildebrand P.W.
SL2: an interactive webtool for modeling of missing segments in proteins // Nucleic
Acids Res. 2016. V. 44. P. W390–W394. doi: 10.1093/nar/gkw297.
Jaeschke H., Neumann S., Kleinau G., Mueller S., Claus M., Krause G., et
al. An aromatic environment in the vicinity of serine 281 is a structural requirement
for thyrotropin receptor function // Endocrinology. 2006a. V. 147. P. 1753–1760. doi:
10.1210/en.2005-1138.
Jäschke H., Neumann S., Moore S., Thomas C.J., Colson A.O., Costanzi S.,
Kleinau G., Jiang J.K., Paschke R., Raaka B.M., Krause G., Gershengorn M.C. A low
molecular weight agonist signals by binding to the transmembrane domain of thyroid-
stimulating hormone receptor (TSHR) and luteinizing hormone/chorionic
gonadotropin receptor (LHCGR) // J. Biol. Chem. 2006b. V. 281 (15). P. 9841–9844.
doi: 10.1074/jbc.C600014200.
Jaeschke H., Schaarschmidt J., Gunther R., Mueller S. The hinge region of
the TSH receptor stabilizes ligand binding and determines different signaling profiles
of human and bovine TSH // Endocrinology. 2011. V. 152. P. 3986–3996. doi:
10.1210/en.2011-1389.
Jiang X., Dias J.A., He X. Structural biology of glycoprotein hormones and
their receptors: insights to signaling // Mol. Cell. Endocrinol. 2014. V. 382. P. 424–
451. doi: 10.1016/j.mce.2013.08.021.
Jiang X., Liu H., Chen X., Chen P.H., Fischer D., Sriraman V., et al.
Structure of follicle-stimulating hormone in complex with the entire ectodomain of its
receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109. P. 12491–12496. doi:
10.1073/pnas.1206643109.
Kaczur V., Puskas L.G., Nagy Z.U., Miled N., Rebai A., Juhasz F., et al.
Cleavage of the human thyrotropin receptor by ADAM10 is regulated by thyrotropin
// J. Mol. Recognit. 2007. V. 20. P. 392–404. doi: 10.1002/jmr.851.
Kaczur V., Puskas L.G., Takacs M., Racz I.A., Szendroi A., Toth S., et al.
Evolution of the thyrotropin receptor: a G protein coupled receptor with an intrinsic
332
capacity to dimerize // Mol. Genet. Metab. 2003. V. 78. P. 275–290. doi:
10.1016/S1096-7192(03)00036-2.
Kang Y., Zhou X.E., Gao X., He Y., Liu W., Ishchenko A., et al. Crystal
structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser // Nature. 2015.
V. 523. P. 561–567. doi: 10.1038/nature14656.
Karges B., Krause G., Homoki J., Debatin K.M., de Roux N., Karges W.
TSH receptor mutation V509A causes familial hyperthyroidism by release of
interhelical constraints between transmembrane helices TMH3 and TMH5 // J.
Endocrinol. 2005. V. 186. P. 377–385. doi: 10.1677/joe.1.06208.
Katritch V., Fenalti G., Abola E.E., Roth B.L., Cherezov V., Stevens R.C.
Allosteric sodium in class A GPCR signaling // Trends Biochem. Sci. 2014. V. 39. P.
233–244. doi: 10.1016/j.tibs.2014.03.002.
Kim Y.J., Hofmann K.P., Ernst O.P., Scheerer P, Choe HW, Sommer ME.
Crystal structure of pre-activated arrestin p44 // Nature. 2013. V. 497. P. 142–146.
doi: 10.1038/nature12133.
Kleinau G., Biebermann H. Constitutive activities in the thyrotropin
receptor: regulation and significance // Adv. Pharmacol. 2014. V. 70. P. 81–119. doi:
10.1016/B978-0-12-417197-8.00003-1.
Kleinau G., Claus M., Jaeschke H., Mueller S., Neumann S., Paschke R.,
Krause G. Contacts between extracellular loop two and transmembrane helix six
determine basal activity of the thyroid-stimulating hormone receptor // J. Biol. Chem.
2007. V. 282 (1). P. 518–525. doi: 10.1074/jbc.M606176200.
Kleinau G., Haas A.K., Neumann S., Worth C.L., Hoyer I., Furkert J., Rutz
C., Gershengorn M.C., Schulein R., Krause G. Signaling-sensitive amino acids
surround the allosteric ligand binding site of the thyrotropin receptor // FASEB J.
2010a. V. 24 (7). P. 2347–2354. doi: 10.1096/fj.09-149146.
Kleinau G., Hoyer I., Kreuchwig A., Haas A.K., Rutz C., Furkert J., et al.
From molecular details of the interplay between transmembrane helices of the
thyrotropin receptor to general aspects of signal transduction in family A G-protein-
coupled receptors (GPCRs) // J. Biol. Chem. 2011a. V. 286. P. 25859–25871. doi:
10.1074/jbc.M110.196980.
Kleinau G., Jaeschke H., Mueller S., Worth C.L., Paschke R., Krause G.
Molecular and structural effects of inverse agonistic mutations on signaling of the
thyrotropin receptor–a basally active GPCR // Cell. Mol. Life Sci. 2008. V. 65. P.
3664–3676. doi: 10.1007/s00018-008-8450-2.
Kleinau G., Jaschke H., Neumann S., Lattig J., Paschke R., Krause G.
Identification of a novel epitope in the thyroid-stimulating hormone receptor
ectodomain acting as intramolecular signaling interface // J. Biol. Chem. 2004. V.
279. P. 51590–51600. doi: 10.1074/jbc.M404748200.
Kleinau G., Jaeschke H., Worth C.L., Mueller S., Gonzalez J., Paschke R.,
et al. Principles and determinants of G-protein coupling by the rhodopsin-like
thyrotropin receptor // PLoS One. 2010b. V. 5. P. e9745. doi:
10.1371/journal.pone.0009745.
333
Kleinau G., Krause G. Thyrotropin and homologous glycoprotein hormone
receptors: structural and functional aspects of extracellular signaling mechanisms //
Endocr. Rev. 2009. V. 30. P. 133–151. doi: 10.1210/er.2008-0044.
Kleinau G., Muller A., Biebermann H. Oligomerization of GPCRs involved
in endocrine regulation // J. Mol. Endocrinol. 2016. V. 57. P. R59–R80. doi:
10.1530/JME-16-0049.
Kleinau G., Mueller S., Jaeschke H., Grzesik P., Neumann S., Diehl A., et
al. Defining structural and functional dimensions of the extracellular thyrotropin
receptor region // J. Biol. Chem. 2011b. V. 286. P. 22622–22631. doi:
10.1074/jbc.M110.211193.
Kleinau G., Neumann S., Gruters A., Krude H., Biebermann H. Novel
insights on thyroid-stimulating hormone receptor signal transduction // Endocr. Rev.
2013. V. 34. P. 691–724. doi: 10.1210/er.2012-1072.
Kleinau G., Worth C.L., Kreuchwig A., Biebermann H., Marcinkowski P.,
Scheerer P., Krause G. Structural-Functional Features of the Thyrotropin Receptor: A
Class A G-Protein-Coupled Receptor at Work // Front. Endocrinol. (Lausanne). 2017.
V. 8. P. 86. doi: 10.3389/fendo.2017.00086.
Kobilka B.K. Structural insights into adrenergic receptor function and
pharmacology // Trends Pharmacol. Sci. 2011. V. 32. P. 213–218. doi:
10.1016/j.tips.2011.02.005.
Kobilka B.K., Deupi X. Conformational complexity of G-protein-coupled
receptors // Trends Pharmacol. Sci. 2007. V. 28. P. 397–406. doi:
10.1016/j.tips.2007.06.003.
Kobilka B., Schertler G.F. New G-protein-coupled receptor crystal
structures: insights and limitations // Trends Pharmacol. Sci. 2008. V. 29. P. 79–83.
doi: 10.1016/j.tips.2007.11.009.
Kopp P., Muirhead S., Jourdain N., Gu W.X., Jameson J.L., Rodd C.
Congenital hyperthyroidism caused by a solitary toxic adenoma harboring a novel
somatic mutation (serine281 – >isoleucine) in the extracellular domain of the
thyrotropin receptor // J. Clin. Invest. 1997. V. 100. P. 1634–1639. doi:
10.1172/JCI119687.
Kosugi S., Kohn L.D., Akamizu T., Mori T. The middle portion in the second
cytoplasmic loop of the thyrotropin receptor plays a crucial role in adenylate cyclase
activation // Mol. Endocrinol. 1994. V. 8. P. 498–509. doi: 10.1210/me.8.4.498.
Kosugi S., Mori T. The amino-terminal half of the cytoplasmic tail of the
thyrotropin receptor is essential for full activities of receptor function // Biochem.
Biophys. Res. Commun. 1994a. V. 200. P. 401–407. doi: 10.1006/bbrc.1994.1463.
Kosugi S., Mori T. The first cytoplasmic loop of the thyrotropin receptor is
important for phosphoinositide signaling but not for agonist-induced adenylate
cyclase activation // FEBS Lett. 1994b. V. 341. P. 162–166. doi: 10.1016/0014-
5793(94)80449-4.
Krause G., Kreuchwig A., Kleinau G. Extended and structurally supported
insights into extracellular hormone binding, signal transduction and organization of
334
the thyrotropin receptor // PLoS One. 2012. V. 7. P. e52920. doi:
10.1371/journal.pone.0052920.
Kreuchwig A., Kleinau G., Krause G. Research resource: novel structural
insights bridge gaps in glycoprotein hormone receptor analyses // Mol. Endocrinol.
2013. V. 27. P. 1357–1363. doi: 10.1210/me.2013-1115.
Labadi A., Grassi E.S., Gellen B., Kleinau G., Biebermann H., Ruzsa B., et
al. Loss-of-function variants in a Hungarian cohort reveal structural insights on TSH
receptor maturation and signaling // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2015. V. 100. P.
E1039–E1045. doi: 10.1210/jc.2014-4511.
Lane J.R., IJzerman A.P. Allosteric approaches to GPCR drug discovery //
Drug Discov. Today Technol. 2013. V. 10 (2). P. 219–221. doi:
10.1016/j.ddtec.2013.01.006.
Latif R., Ali M.R., Mezei M., Davies T.F. Transmembrane domains of
attraction on the TSH receptor // Endocrinology. 2015. V. 156. P. 488–498. doi:
10.1210/en.2014-1509.
Latif R., Graves P., Davies T.F. Oligomerization of the human thyrotropin
receptor: fluorescent protein-tagged hTSHR reveals post-translational complexes // J.
Latif R., Lau Z., Cheung P., Felsenfeld D.P., Davies T.F. The “TSH receptor
glo assay” – a high-throughput detection system for thyroid stimulation // Front.
Endocrinol. 2016a. V. 7. P. 3. doi: 10.3389/fendo.2016.00003.
Latif R., Michalek K., Davies T.F. Subunit interactions influence TSHR
multimerization // Mol. Endocrinol. 2010a. V. 24. P. 2009–2018. doi:
10.1210/me.2010-0001.
Latif R., Michalek K., Morshed S.A., Davies T.F. A tyrosine residue on the
TSH receptor stabilizes multimer formation // PLoS One. 2010b. V. 5. P. e9449. doi:
10.1371/journal.pone.0009449.
Latif R., Morshed S.A., Zaidi M., Davies T.F. The thyroid-stimulating
hormone receptor: impact of thyroid-stimulating hormone and thyroid-stimulating
hormone receptor antibodies on multimerization, cleavage, and signaling //
Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 2009. V. 38. P. 319–341. doi:
10.1016/j.ecl.2009.01.006.
Latif R, Realubit R.B., Karan C., Mezei M., Davies T.F. TSH Receptor
Signaling Abrogation by a Novel Small Molecule // Front. Endocrinol. (Lausanne).
2016b. V. 7. P. 130. doi: 10.3389/fendo.2016.00130.
Laugwitz K.L., Allgeier A., Offermanns S., Spicher K., Van Sande J.,
Dumont J. E., Schultz G. The human thyrotropin receptor: a heptahelical receptor
capable of stimulating members of all four G protein families // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 1996. V. 93. P. 116–120.
Levoye A., Dam J., Ayoub M.A., Guillaume J.L., Couturier C., Delagrange
P., et al. The orphan GPR50 receptor specifically inhibits MT1 melatonin receptor
function through heterodimerization // EMBO J. 2006. V. 25. P. 3012–3023. doi:
10.1038/sj.emboj.7601193.
335
Li X., Staszewski L., Xu H., Durick K., Zoller M., Adler E. Human receptors
for sweet and umami taste // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 4692–4696.
doi: 10.1073/pnas.072090199.
Lohse M.J. Dimerization in GPCR mobility and signaling // Curr. Opin.
Pharmacol. 2010. V. 10. P. 53–58. doi: 10.1016/j.coph.2009.10.007.
Loosfelt H., Pichon C., Jolivet A., Misrahi M., Caillou B., Jamous M., et al.
Two-subunit structure of the human thyrotropin receptor // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 1992. V. 89. P. 3765–3769. doi: 10.1073/pnas.89.9.3765.
Mancia F., Assur Z., Herman A.G., Siegel R., Hendrickson W.A. Ligand
sensitivity in dimeric associations of the serotonin 5HT2c receptor // EMBO Rep.
2008. V. 9. P. 363–369. doi: 10.1038/embor.2008.27.
Manglik A., Kobilka B. The role of protein dynamics in GPCR function:
insights from the beta2AR and rhodopsin // Curr. Opin. Cell. Biol. 2014. V. 27. P.
136–143. doi: 10.1016/j.ceb.2014.01.008.
Marcinkowski P., Hoyer I., Specker E., Furkert J., Rutz C.,
Neuenschwander M., Sobottka S., Sun H., Nazare M., Berchner-Pfannschmidt U., von
Kries J.P., Eckstein A., Schülein R., Krause G. A New Highly Thyrotropin Receptor-
Selective Small-Molecule Antagonist with Potential for the Treatment of Graves'
Orbitopathy // Thyroid. 2019. V. 29 (1). P. 111-123. doi: 10.1089/thy.2018.0349.
Mason J.S., Bortolato A., Congreve M., Marshall F.H. New insights from
structural biology into the druggability of G protein-coupled receptors // Trends
Pharmacol. Sci. 2012. V. 33. P. 249–260. doi: 10.1016/j.tips.2012.02.005.
Misrahi M., Milgrom E. Cleavage and shedding of the TSH receptor // Eur.
J. Endocrinol. 1997. V. 137. P. 599–602. doi: 10.1530/eje.0.1370599.
Mizuno H., Kanda K., Sugiyama Y., Imamine H., Ito T., Kato I., et al.
Longitudinal evaluation of patients with a homozygous R450H mutation of the TSH
receptor gene // Horm. Res. 2009. V. 71. P. 318–323. doi: 10.1159/000223415.
Mizutori Y., Chen C.R., Latrofa F., McLachlan S.M., Rapoport B. Evidence
that shed thyrotropin receptor A subunits drive affinity maturation of autoantibodies
causing Graves’ disease // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2009. V. 94. P. 927–935. doi:
10.1210/jc.2008-2134.
Mizutori Y., Chen C.R., McLachlan S.M., Rapoport B. The thyrotropin
receptor hinge region is not simply a scaffold for the leucine-rich domain but
contributes to ligand binding and signal transduction // Mol. Endocrinol. 2008. V. 22.
P. 1171–1182. doi: 10.1210/me.2007-0407.
Montanelli L., Van Durme J.J., Smits G., Bonomi M., Rodien P., Devor E.J.,
Moffat-Wilson K., Pardo L., Vassart G., Costagliola S. Modulation of ligand
selectivity associated with activation of the transmembrane region of the human
follitropin receptor // Mol. Endocrinol. 2004. V. 18 (8). P. 2061–2073. doi:
10.1210/me.2004-0036.
Moore S., Jaeschke H., Kleinau G., Neumann S., Costanzi S., Jiang J.K.,
Childress J., Raaka B.M., Colson A., Paschke R., Krause G., Thomas C.J.,
Gershengorn M.C. Evaluation of small-molecule modulators of the luteinizing
336
hormone/choriogonadotropin and thyroid stimulating hormone receptors: structure-
activity relationships and selective binding patterns // J. Med. Chem. 2006. V. 49 (13).
P. 3888–3896. doi: 10.1021/jm060247s.
Morshed S.A., Ma R., Latif R., Davies T.F. Biased signaling by thyroid-
stimulating hormone receptor-specific antibodies determines thyrocyte survival in
autoimmunity // Sci. Signal. 2018. V. 11 (514). P. eaah4120. doi:
10.1126/scisignal.aah4120.
Mueller S., Kleinau G., Jaeschke H., Neumann S., Krause G., Paschke R.
Significance of ectodomain cysteine boxes 2 and 3 for the activation mechanism of
the thyroid-stimulating hormone receptor // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 31638–
31646. doi: 10.1074/jbc.M604770200.
Mueller S., Kleinau G., Jaeschke H., Paschke R., Krause G. Extended
hormone binding site of the human thyroid stimulating hormone receptor: distinctive
acidic residues in the hinge region are involved in bovine thyroid stimulating hormone
binding and receptor activation // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 18048–18055. doi:
10.1074/jbc.M800449200.
Mueller S., Kleinau G., Szkudlinski M.W., Jaeschke H., Krause G., Paschke
R. The superagonistic activity of bovine thyroid-stimulating hormone (TSH) and the
human TR1401 TSH analog is determined by specific amino acids in the hinge region
of the human TSH receptor // J. Biol. Chem. 2009. V. 284. P. 16317–16324. doi:
10.1074/jbc.M109.005710.
Mueller S., Szkudlinski M.W., Schaarschmidt J., Gunther R., Paschke R.,
Jaeschke H. Identification of novel TSH interaction sites by systematic binding
analysis of the TSHR hinge region // Endocrinology. 2011. V. 152. P. 3268–3278.
doi: 10.1210/en.2011-0153.
Munk C., Isberg V., Mordalski S., Harpsoe K., Rataj K., Hauser A.S., et al.
GPCRdb: the G protein-coupled receptor database – an introduction // Br. J.
Pharmacol. 2016. V. 173. P. 2195–2207. doi: 10.1111/bph.13509.
Nagashima T., Murakami M., Onigata K., Morimura T., Nagashima K.,
Mori M., et al. Novel inactivating missense mutations in the thyrotropin receptor gene
in Japanese children with resistance to thyrotropin // Thyroid. 2001. V. 11. P. 551–
559. doi: 10.1089/105072501750302859.
Nagayama Y., Nishihara E., Namba H., Yamashita S., Niwa M.
Identification of the sites of asparagine-linked glycosylation on the human thyrotropin
receptor and studies on their role in receptor function and expression // J. Pharmacol.
Exp. Ther. 2000. V. 295 (1). P. 404–409.
Nakabayashi K., Matsumi H., Bhalla A., Bae J., Mosselman S., Hsu S.Y.,
Hsueh A.J. Thyrostimulin, a heterodimer of two new human glycoprotein hormone
subunits, activates the thyroid-stimulating hormone receptor // J. Clin. Invest. 2002.
V. 109 (11). P. 1445–1452. doi: 10.1172/JCI14340.
Narumi S., Nagasaki K., Ishii T., Muroya K., Asakura Y., Adachi M., et al.
Nonclassic TSH resistance: TSHR mutation carriers with discrepantly high thyroidal
337
iodine uptake // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2011. V. 96. P. E1340–E1345. doi:
10.1210/jc.2011-0070.
Nataraja S.G., Yu H.N., Palmer S.S. Discovery and development of small
molecule allosteric modulators of glycoprotein hormone receptors // Front Endocrinol
Neumann S., Claus M., Paschke R. Interactions between the extracellular
domain and the extracellular loops as well as the 6th transmembrane domain are
necessary for TSH receptor activation // Eur. J. Endocrinol. 2005a. V. 152. P. 625–
634. doi: 10.1530/eje.1.01891.
Neumann S., Eliseeva E., Boutin A., Barnaeva E., Ferrer M., Southall N.,
Kim D., Hu X., Morgan S.J., Marugan J.J., Gershengorn M.C. Discovery of a Positive
Allosteric Modulator of the Thyrotropin Receptor: Potentiation of Thyrotropin-
Mediated Preosteoblast Differentiation In Vitro // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2018. V.
364 (1). P. 38-45. doi: 10.1124/jpet.117.244095.
Neumann S., Eliseeva E., McCoy J.G., Napolitano G., Giuliani C., Monaco
F., Huang W., Gershengorn M.C. A new small-molecule antagonist inhibits Graves'
disease antibody activation of the TSH receptor // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2011.
V. 96. P. 548–554. doi: 10.1210/jc.2010-1935.
Neumann S., Geras-Raaka E., Marcus-Samuels B., Gershengorn M.C.
Persistent cAMP signaling by thyrotropin (TSH) receptors is not dependent on
internalization // FASEB J. 2010a. V. 24. P. 3992–3999. doi: 10.1096/fj.10-161745.
Neumann S., Gershengorn M.C. Small molecule TSHR agonists and
antagonists // Ann. Endocrinol. (Paris). 2011. V. 72 (2). P. 74–76. doi:
10.1016/j.ando.2011.03.002.
Neumann S., Huang W., Eliseeva E., Titus S., Thomas C.J., Gershengorn
M.C. A small molecule inverse agonist for the human thyroid-stimulating hormone
receptor // Endocrinology. 2010b. V. 151. P. 3454–3459. doi: 10.1210/en.2010-0199.
Neumann S., Huang W., Titus S., Krause G., Kleinau G., Alberobello A.T.,
Zheng W., Southall N.T., Inglese J., Austin C.P., Celi F.S., Gavrilova O., Thomas C.J.,
Raaka B.M., Gershengorn M.C. Small molecule agonists for the thyrotropin receptor
stimulate thyroid function in human thyrocytes and mice // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 2009. V. 106 (30). P. 12471–12476. doi: 10.1073/pnas.0904506106.
Neumann S., Kleinau G., Costanzi S., Moore S., Jiang J.K., Raaka B.M.,
Thomas C.J., Krause G., Gershengorn M.C. A low-molecular-weight antagonist for
the human thyrotropin receptor with therapeutic potential for hyperthyroidism //
Endocrinology. 2008. V. 149 (12). P. 5945–5950. doi: 10.1210/en.2008-0836.
Neumann S., Krause G., Chey S., Paschke R. A free carboxylate oxygen in
the side chain of position 674 in transmembrane domain 7 is necessary for TSH
receptor activation // Mol. Endocrinol. 2001. V. 15. P. 1294–1305. doi:
10.1210/mend.15.8.0672.
Neumann S., Krause G., Claus M., Paschke R. Structural determinants for g
protein activation and selectivity in the second intracellular loop of the thyrotropin
receptor // Endocrinology. 2005b. V. 146. P. 477–485. doi: 10.1210/en.2004-1045.
338
Neumann S., Nir E.A., Eliseeva E., Huang W., Marugan J., Xiao J., Dulcey
A.E., Gershengorn M.C. A Selective TSH receptor antagonist inhibits stimulation of
thyroid function in female mice // Endocrinology. 2014. V. 155 (1). P. 310–314. doi:
10.1210/en.2013-1835.
Neumann S., Padia U., Cullen M.J., Eliseeva E., Nir E.A., Place R.F.,
Morgan S.J., Gershengorn M.C. An enantiomer of an oral small-molecule TSH
receptor agonist exhibits improved pharmacologic properties // Front. Endocrinol.
(Lausanne). 2016. V. 7. Article 105. doi: 10.3389/fendo.2016.00105.
Neumann S., Pope A., Geras-Raaka E., Raaka B.M., Bahn R.S.,
Gershengorn M.C. A drug-like antagonist inhibits thyrotropin receptor-mediated
stimulation of cAMP production in Graves' orbital fibroblasts // Thyroid. 2012. V. 22
(8). P. 839–843. doi: 10.1089/thy.2011.0520.
Ng H.K., Chow B.K. Oligomerization of family B GPCRs: exploration in
inter-family oligomer formation // Front. Endocrinol. 2015. V. 6. P. 10. doi:
10.3389/fendo.2015.00010.
Ng S.Y., Lee L.T., Chow B.K. Receptor oligomerization: from early evidence
to current understanding in class B GPCRs // Front. Endocrinol. 2012. V. 3. P. 175.
doi: 10.3389/fendo.2012.00175.
Nishihara E., Nagayama Y., Amino N., Hishinuma A., Takano T., Yoshida
H., et al. A novel thyrotropin receptor germline mutation (Asp617Tyr) causing
hereditary hyperthyroidism // Endocr. J. 2007. V. 54. P. 927–934. doi:
10.1507/endocrj.K07-088.
Niu S., Li H., Chen W., Zhao J., Gao L., Bo T. Beta-Arrestin-1 Mediates
Liver Thyrotropin Regulation of Cholesterol Conversion Metabolism via the Akt-
Dependent Pathway // Int. J. Endocrinol. 2018. V. 2018. P. 4371396. doi:
10.1155/2018/4371396.
Nunez Miguel R., Sanders J., Furmaniak J., Rees Smith B. Glycosylation
pattern analysis of glycoprotein hormones and their receptors // J. Mol. Endocrinol.
2017a. V. 58 (1). P. 25–41. doi: 10.1530/JME-16-0169.
Nunez Miguel R., Sanders J., Furmaniak J., Smith B.R. Structure and
activation of the TSH receptor transmembrane domain // Auto Immun. Highlights.
2017b. V. 8. P. 2. doi: 10.1007/s13317-016-0090-1.
Oda Y., Sanders J., Roberts S., Maruyama M., Kiddie A., Furmaniak J., et
al. Analysis of carbohydrate residues on recombinant human thyrotropin receptor // J.
Clin. Endocrinol. Metab. 1999. V. 84. P. 2119–2125. doi: 10.1210/jcem.84.6.5756.
Palczewski K., Kumasaka T., Hori T., Behnke C.A., Motoshima H., Fox
B.A., et al. Crystal structure of rhodopsin: a G protein-coupled receptor // Science.
2000. V. 289. P. 739–745. doi: 10.1126/science.289.5480.739.
Park J.H., Scheerer P., Hofmann K.P., Choe H.W., Ernst O.P. Crystal
structure of the ligand-free G-protein-coupled receptor opsin // Nature. 2008. V. 454.
P. 183–187. doi: 10.1038/nature07063.
339
Parma J., Duprez L., Van Sande J., Cochaux P., Gervy C., Mockel J., et al.
Somatic mutations in the thyrotropin receptor gene cause hyperfunctioning thyroid
adenomas // Nature. 1993. V. 365. P. 649–651. doi: 10.1038/365649a0.
Persani L., Calebiro D., Bonomi M. Technology Insight: modern methods
to monitor protein-protein interactions reveal functional TSH receptor oligomerization
// Nat. Clin. Pract. Endocrinol. Metab. 2007. V. 3. P. 180–190. doi:
10.1038/ncpendmet0401.
Persani L., Borgato S., Romoli R., Asteria C., Pizzocaro A., Beck-Peccoz P.
Changes in the degree of sialylation of carbohydrate chains modify the biological
properties of circulating thyrotropin isoforms in various physiological and
pathological states // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1998. V. 83 (7). P. 2486–2492. doi:
10.1210/jcem.83.7.4970.
Ploier B., Caro L.N., Morizumi T., Pandey K., Pearring J.N., Goren M.A.,
et al. Dimerization deficiency of enigmatic retinitis pigmentosa-linked rhodopsin
mutants // Nat. Commun. 2016. V. 7. P. 12832. doi: 10.1038/ncomms12832.
Postiglione M.P., Parlato R., Rodriguez-Mallon A., Rosica A., Mithbaokar
P., Maresca M., Marians R.C., Davies T.F., Zannini M.S., De Felice M., Di Lauro R.
Role of the thyroid-stimulating hormone receptor signaling in development and
differentiation of the thyroid gland // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99 (24). P.
15462–15467. doi: 10.1073/pnas.242328999.
Quellari M., Desroches A., Beau I., Beaudeux E., Misrahi M. Role of
cleavage and shedding in human thyrotropin receptor function and trafficking // Eur.
J. Biochem. 2003. V. 270. P. 3486–3497. doi: 10.1046/j.1432-1033.2003.03718.x.
Rapoport B., Aliesky H.A., Chen C.R., McLachlan S.M. Evidence that TSH
receptor A-subunit multimers, not monomers, drive antibody affinity maturation in
Graves’ disease // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2015. V. 100. P. E871–E875. doi:
10.1210/jc.2015-1528.
Rapoport B., McLachlan S.M. The thyrotropin receptor in Graves’ disease //
Thyroid. 2007. V. 17 (10). P. 911–922. doi: 10.1089/thy.2007.0170.
Rapoport B., McLachlan S.M. TSH receptor cleavage into subunits and
shedding of the A-subunit; a molecular and clinical perspective // Endocr. Rev. 2016.
V. 2016. P. 23–42. doi: 10.1210/er.2015-1098.2016.1.test.
Rasmussen S.G., Choi H.J., Rosenbaum D.M., Kobilka T.S., Thian F.S.,
Edwards P.C., et al. Crystal structure of the human beta2 adrenergic G-protein-
coupled receptor // Nature. 2007. V. 450. P. 383–387. doi: 10.1038/nature06325.
Rasmussen S.G., DeVree B.T., Zou Y., Kruse A.C., Chung K.Y., Kobilka
T.S., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex //
Nature. 2011. V. 477. P. 549–555. doi: 10.1038/nature10361.
Ringkananont U., Van Durme J., Montanelli L., Ugrasbul F., Yu Y.M.,
Weiss R.E., et al. Repulsive separation of the cytoplasmic ends of transmembrane
helices 3 and 6 is linked to receptor activation in a novel thyrotropin receptor mutant
(M626I) // Mol. Endocrinol. 2006. V. 20. P. 893–903. doi: 10.1210/me.2005-0339.
340
Rivero-Muller A., Chou Y.Y., Ji I., Lajic S., Hanyaloglu A.C., Jonas K., et
al. Rescue of defective G protein-coupled receptor function in vivo by intermolecular
cooperation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. P. 2319–2324. doi:
10.1073/pnas.0906695106.
Russo D., Chazenbalk G.D., Nagayama Y., Wadsworth H.L., Rapoport B.
Site-directed mutagenesis of the human thyrotropin receptor: role of asparagine-linked
oligosaccharides in the expression of a functional receptor // Mol. Endocrinol. 1991.
V. 5. P. 29–33. doi: 10.1210/mend-5-1-29.
Salon J.A., Lodowski D.T., Palczewski K. The significance of G protein-
coupled receptor crystallography for drug discovery // Pharmacol. Rev. 2011. V. 63.
P. 901–937. doi: 10.1124/pr.110.003350.
Sampath T.K., Simic P., Sendak R., Draca N., Bowe A.E., O’Brien S.,
Schiavi S.C., McPherson J.M., Vukicevic S. Thyroid-stimulating hormone restores
bone volume, microarchitecture, and strength in aged ovariectomized rats // J. Bone
Miner. Res. 2007. V. 22 (6). P. 849–859. doi: 10.1359/jbmr.070302.
Sanders J., Chirgadze D.Y., Sanders P., Baker S., Sullivan A., Bhardwaja
A., et al. Crystal structure of the TSH receptor in complex with a thyroid-stimulating
autoantibody // Thyroid. 2007. V. 17. P. 395–410. doi: 10.1089/thy.2007.0041.
Sanders P., Young S., Sanders J., Kabelis K., Baker S., Sullivan A., et al.
Crystal structure of the TSH receptor (TSHR) bound to a blocking-type TSHR
autoantibody // J. Mol. Endocrinol. 2011. V. 46. P. 81–99. doi: 10.1530/JME-10-
0127.
Schaarschmidt J., Huth S., Meier R., Paschke R., Jaeschke H. Influence of
the hinge region and its adjacent domains on binding and signaling patterns of the
thyrotropin and follitropin receptor // PLoS One. 2014. V. 9. P. e111570. doi:
10.1371/journal.pone.0111570.
Schaarschmidt J., Nagel M.B., Huth S., Jaeschke H., Moretti R., Hintze V.,
et al. Rearrangement of the extracellular domain/extracellular loop 1 interface is
critical for thyrotropin receptor activation // J. Biol. Chem. 2016. V. 291. P. 14095–
14108. doi: 10.1074/jbc.M115.709659.
Scheerer P., Park J.H., Hildebrand P.W., Kim Y.J., Krauss N., Choe H.W.,
et al. Crystal structure of opsin in its G-protein-interacting conformation // Nature.
2008. V. 455. P. 497–502. doi: 10.1038/nature07330.
Schoenmakers N., Alatzoglou K.S., Chatterjee V.K., Dattani M.T. Recent
advances in central congenital hypothyroidism // J. Endocrinol. 2015. V. 227 (3). P.
R51–R71. doi: 10.1530/JOE-15-0341.
Schoneberg T., Kleinau G., Bruser A. What are they waiting for? – tethered
agonism in G protein-coupled receptors // Pharmacol. Res. 2016. V. 108. P. 9–15. doi:
10.1016/j.phrs.2016.03.027.
Shpakov A.O. Transmembrane proton pump as a model of functioning of
the receptor of serpentine type // Proc. 21st Conference of European comparative
endocrinologists, Bonn, Germany. August 26–30, 2002. Abstracts. P. 170.
341
Shpakov A.O., Pertseva M.N. The peptide strategy as a novel approach to
the study of G protein-coupled signaling systems / In: Signal Transduction Research
Trends (Grachevsky N.O., ed.), Nova Science Publishers, Inc., N.Y. 2007. P. 45–93.
10.1016/S1937-6448(08)01004-6.
Shukla A.K., Manglik A., Kruse A.C., Xiao K., Reis R.I., Tseng W.C., et al.
Structure of active beta-arrestin-1 bound to a G-protein-coupled receptor
phosphopeptide // Nature. 2013. V. 497. P. 137–141. doi: 10.1038/nature12120.
Smith N.J., Milligan G. Allostery at G protein-coupled receptor homo- and
heteromers: uncharted pharmacological landscapes // Pharmacol. Rev. 2010. V. 62. P.
701–725. doi: 10.1124/pr.110.002667.
Smits G., Campillo M., Govaerts C., Janssens V., Richter C., Vassart G., et
al. Glycoprotein hormone receptors: determinants in leucine-rich repeats responsible
for ligand specificity // EMBO J. 2003. V. 22. P. 2692–2703. doi:
10.1093/emboj/cdg260.
Standfuss J., Edwards P.C., D’Antona A., Fransen M., Xie G., Oprian D.D.,
et al. The structural basis of agonist-induced activation in constitutively active
rhodopsin // Nature. 2011. V. 471. P. 656–660. doi: 10.1038/nature09795.
Sun L., Vukicevic S., Baliram R., Yang G., Sendak R., McPherson J., Zhu
L.L., Iqbal J., Latif R., Natrajan A., Arabi A., Yamoah K., Moonga B.S., Gabet Y.,
Davies T.F., Bab I., Abe E., Sampath K., Zaidi M. Intermittent recombinant TSH
injections prevent ovariectomy-induced bone loss // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008.
V. 105 (11). P. 4289–4294. doi: 10.1073/pnas.0712395105.
Sykiotis G.P., Neumann S., Georgopoulos N.A., Sgourou A.,
Papachatzopoulou A., Markou K.B., et al. Functional significance of the thyrotropin
receptor germline polymorphism D727E // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003.
V. 301. P. 1051–1056. doi: 10.1016/S0006-291X(03)00071-8.
Szczepek M., Beyriere F., Hofmann K.P., Elgeti M., Kazmin R., Rose A., et
al. Crystal structure of a common GPCR-binding interface for G protein and arrestin
// Nat. Commun. 2014. V. 5. P. 4801. doi: 10.1038/ncomms5801.
Tadagaki K., Jockers R., Kamal M. History and biological significance of
GPCR heteromerization in the neuroendocrine system // Neuroendocrinology. 2012a.
V. 95. P. 223–231. doi: 10.1159/000330000.
Tadagaki K., Tudor D., Gbahou F., Tschische P., Waldhoer M., Bomsel M.,
et al. Human cytomegalovirus-encoded UL33 and UL78 heteromerize with host
CCR5 and CXCR4 impairing their HIV coreceptor activity // Blood. 2012b. V. 119.
P. 4908–4918. doi: 10.1182/blood-2011-08-372516.
Tenenbaum-Rakover Y., Grasberger H., Mamanasiri S., Ringkananont U.,
Montanelli L., Barkoff M.S., et al. Loss-of-function mutations in the thyrotropin
receptor gene as a major determinant of hyperthyrotropinemia in a consanguineous
community // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2009. V. 94. P. 1706–1712. doi:
10.1210/jc.2008-1938.
342
Tesmer V.M., Kawano T., Shankaranarayanan A., Kozasa T., Tesmer J.J.
Snapshot of activated G proteins at the membrane: the Galphaq-GRK2-Gbetagamma
complex // Science. 2005. V. 310. P. 1686–1690. doi: 10.1126/science.1118890.
Tschische P., Tadagaki K., Kamal M., Jockers R., Waldhoer M.
Heteromerization of human cytomegalovirus encoded chemokine receptors //
Biochem. Pharmacol. 2011. V. 82. P. 610–619. doi: 10.1016/j.bcp.2011.06.009.
Turcu A.F., Kumar S., Neumann S., Coenen M., Iyer S., Chiriboga P.,
Gershengorn M.C., Bahn R.S. A small molecule antagonist inhibits thyrotropin
receptor antibody-induced orbital fibroblast functions involved in the pathogenesis of
Graves ophthalmopathy // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2013. V. 98 (5). P. 2153–2159.
doi: 10.1210/jc.2013-1149.
Uberti M.A., Hague C., Oller H., Minneman K.P., Hall R.A.
Heterodimerization with beta2-adrenergic receptors promotes surface expression and
functional activity of alpha1D-adrenergic receptors // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005.
V. 313. P. 16–23. doi: 10.1124/jpet.104.079541.
Urizar E., Claeysen S., Deupi X., Govaerts C., Costagliola S., Vassart G., et
al. An activation switch in the rhodopsin family of G protein-coupled receptors: the
thyrotropin receptor // J. Biol. Chem. 2005a. V. 280. P. 17135–17141. doi:
10.1074/jbc.M414678200.
M., Smits G., Vassart G., Costagliola S. Glycoprotein hormone receptors: link
between receptor homodimerization and negative cooperativity // EMBO J. 2005b. V.
24. P. 1954–1964. doi: 10.1038/sj.emboj.7600686.
Van Sande J., Parma J., Tonacchera M., Swillens S., Dumont J., Vassart G.
Somatic and germline mutations of the TSH receptor gene in thyroid diseases // J.
Clin. Endocrinol. Metab. 1995. V. 80. P. 2577–2585. doi: 10.1210/jc.80.9.2577.
Vassart G., Costagliola S. A physiological role for the posttranslational
cleavage of the thyrotropin receptor? // Endocrinology. 2004a. V. 145. P. 1–3. doi:
10.1210/en.2003-1225.
Vassart G., Kleinau G. TSH receptor mutations and diseases / In: De Groot
L.J., Beck-Peccoz P., Chrousos G., Dungan K., Grossman A., Hershman J.M., et al.,
Eds. Endotext. South Dartmouth, MA: MDTEXT.COM, INC. 2014.
Vassart G., Pardo L., Costagliola S. A molecular dissection of the
glycoprotein hormone receptors // Trends Biochem. Sci. 2004b. V. 29. P. 119–126.
doi: 10.1016/j.tibs.2004.01.006.
Venkatakrishnan A.J., Deupi X., Lebon G., Heydenreich F.M., Flock T.,
Miljus T., et al. Diverse activation pathways in class A GPCRs converge near the G-
protein-coupling region // Nature. 2016. V. 536. P. 484–487. doi:
10.1038/nature19107.
Vlaeminck-Guillem V., Ho S.C., Rodien P., Vassart G., Costagliola S.
Activation of the cAMP pathway by the TSH receptor involves switching of the
ectodomain from a tethered inverse agonist to an agonist // Mol. Endocrinol. 2002. V.
16. P. 736–746. doi: 10.1210/mend.16.4.0816.
343
Vu M.T., Radu A., Ghinea N. The cleavage of thyroid-stimulating hormone
receptor is dependent on cell-cell contacts and regulates the hormonal stimulation of
phospholipase C // J. Cell. Mol. Med. 2009. V. 13. P. 2253–2260. doi:
10.1111/j.1582-4934.2008.00422.x.
Werthmann R.C., Volpe S., Lohse M.J., Calebiro D. Persistent cAMP
signaling by internalized TSH receptors occurs in thyroid but not in HEK293 cells //.
FASEB J. 2012. V. 26. P. 2043–2048. doi: 10.1096/fj.11-195248.
White J.F., Grodnitzky J., Louis J.M., Trinh L.B., Shiloach J., Gutierrez J.,
et al. Dimerization of the class A G protein-coupled neurotensin receptor NTS1 alters
G protein interaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 12199–12204.
doi: 10.1073/pnas.0705312104.
Wiersinga W.M. Autoimmunity in Graves' ophthalmopathy: the result of an
unfortunate marriage between TSH receptors and IGF-1 receptors? // J. Clin.
Endocrinol. Metab. 2011. V. 96 (8). P. 2386–2394. doi: 10.1210/jc.2011-0307.
Wondisford F.E. The thyroid axis just got more complicated // J. Clin.
Invest. 2002. V. 109 (11). P. 1401–1402. doi: 10.1172/JCI15865.
Worth C.L., Kleinau G., Krause G. Comparative sequence and structural
analyses of G-protein-coupled receptor crystal structures and implications for
molecular models // PLoS One. 2009. V. 4. P. e7011. doi:
10.1371/journal.pone.0007011.
Worth C.L., Kreuchwig A., Kleinau G., Krause G. GPCR-SSFE: a
comprehensive database of G-protein-coupled receptor template predictions and
homology models // BMC Bioinformatics. 2011. V. 12. P. 185. doi: 10.1186/1471-
2105-12-185.
Wu B., Chien E.Y., Mol C.D., Fenalti G., Liu W., Katritch V., et al.
Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide
antagonists // Science. 2010. V. 330. P. 1066–1071. doi: 10.1126/science.1194396.
Wu H., Wacker D., Mileni M., Katritch V., Han G.W., Vardy E., Liu W.,
Thompson A.A., Huang X.P., Carroll F.I., Mascarella S.W., Westkaemper R.B.,
Mosier P.D., Roth B.L., Cherezov V., Stevens R.C. Structure of the human kappa-
opioid receptor in complex with JDTic // Nature. 2012. V. 485 (7398). P. 327–332.
doi: 10.1038/nature10939.
Yanagawa M., Yamashita T., Shichida Y. Comparative fluorescence
resonance energy transfer analysis of metabotropic glutamate receptors: implications
about the dimeric arrangement and rearrangement upon ligand bindings // J. Biol.
Chem. 2011. V. 286. P. 22971–22981. doi: 10.1074/jbc.M110.206870.
Yuan S., Palczewski K., Peng Q., Kolinski M., Vogel H., Filipek S. The
mechanism of ligand-induced activation or inhibition of mu- and kappa-opioid
receptors // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2015. V. 54. P. 7560–7563. doi:
10.1002/anie.201501742.
Zaballos M.A., Garcia B., Santisteban P. Gbetagamma dimers released in
response to thyrotropin activate phosphoinositide 3-kinase and regulate gene
344
expression in thyroid cells // Mol. Endocrinol. 2008. V. 22 (5). P. 1183–1199. doi:
10.1210/me.2007-0093.
Zhang K., Zhang J., Gao Z.G., Zhang D., Zhu L., Han G.W., et al. Structure
of the human P2Y12 receptor in complex with an antithrombotic drug // Nature. 2014.
V. 509. P. 115–118. doi: 10.1038/nature13288.
Zhang M.L., Sugawa H., Kosugi S., Mori T. Constitutive activation of the
thyrotropin receptor by deletion of a portion of the extracellular domain // Biochem.
Biophys. Res. Commun. 1995. V. 211. P. 205–210. doi: 10.1006/bbrc.1995.1797.
Zhang M., Tong K.P., Fremont V., Chen J., Narayan P., Puett D.,
Weintraub B.D., Szkudlinski M.W. The extracellular domain suppresses constitutive
activity of the transmembrane domain of the human TSH receptor: implications for
hormone-receptor interaction and antagonist design // Endocrinology. 2000. V. 141
(9). P. 3514–3517. doi: 10.1210/endo.141.9.7790.
receptor homomers // Nat. Commun. 2012. V. 3. P. 1007. doi : 10.1038/ncomms1991.
345
ГЛАВА 7
Аутоантитела как регуляторы функций

GPCR
7.1. Концепция аутоантигенности
В настоящее время описаны более восьмидесяти

аутоиммунных заболеваний и, по меньшей мере, еще для сорока
заболеваний предполагается возможность их аутоиммунного
происхождения. Встречаемость аутоиммунных заболеваний
варьирует от менее 5 случаев на 100 000 человек (хронический
аутоиммунный гепатит, увеит) до более 500 случаев на 100 000
человек (ревматоидный артрит, аутоиммунный тиреоидит).
Спектр возможных симптомов затрагивает почти все обменные
процессы в организме. Многочисленные исследования пар
монозиготных близнецов, эксперименты с животными и
культурами клеток, а также изучение генетических моделей
позволили доказать наследственную предопределенность многих
аутоиммунных заболеваний. В то же время механизмы, лежащие
в основе перехода предрасположенности в реальную патологию,
в большинстве случаев не выяснены, хотя очевидно, что
ключевым событием в этиопатогенезе этих заболеваний является
потеря аутотолерантности к собственным антигенам. Наиболее
частыми причинами аутоиммунных заболеваний являются
инфекционные и травматические нарушения гистогематических
барьеров, что делает доступными антигены, которые в норме
изолированы от иммунной системы (Root-Bernstein, 2007), а
также паранеопластические процессы и нарушения компонентов
иммунной системы, в первую очередь главного комплекса
гистосовместимости и системы комплемента (Bajic et al., 2015).
346
Немаловажную роль в этом играют неблагоприятные факторы
окружающей среды, делающие уникальным развитие патологии в
каждой конкретной ситуации (Cho, Feldman, 2015). Однако в
большинстве случаев молекулярные причины, лежащие в основе
развития аутоиммунных заболеваний, до сих пор остаются
невыясненными.
В настоящее время выдвинуты и развиваются несколько
гипотез, объясняющих причинно-следственные связи при
развитии аутоантигенности (Шпаков и др., 2017). Согласно одной
из них, появление антител к собственным белкам обусловлено
молекулярной мимикрией чужеродного антигена, попавшего в
организм хозяина. В этом случае выработанные в ходе
иммунного ответа специфические Т-клетки или антитела
начинают перекрестно реагировать с тканями организма-хозяина
(Smulski et al., 2006). Примером этого является американский
трипаносомоз – болезнь Чагаса. Другая гипотеза предполагает
существование более сложной системы взаимодействий между
компонентами иммунной системы, и основана на выработке
анти-идиотипических антител (Sherer, Shoenfeld, 2000; Hampe,
2012). Как известно, в норме роль анти-идиотипических антител
заключается в регуляции иммунного ответа, в поддержании его
на уровне, обеспечивающем адекватную защиту организма от
внешних воздействий. Предполагается, что нарушение такой
регуляции может привести к появлению или чрезмерному
распространению аутореактивных клеточных клонов.
Установлено, что анти-идиотипические антитела могут быть
вовлечены в патогенез сахарного диабета 1-го типа, синдрома
Шегрена, аутоиммунного тиреоидита и других аутоиммунных
заболеваний. Необходимо отметить, что обе гипотезы являются
взаимодополняющими, поскольку основываются на сбоях,
возникающих на разных уровнях функционирования иммунной
системы.
Несмотря на разнообразие вовлеченных в аутоиммунные
процессы молекулярных механизмов, ответ иммунной системы
на антиген сводится к двум вариантам: «чужой» (или
347
неправильно опознанный «свой») антиген может быть разрушен с
помощью фагоцитоза или нейтрализован с помощью антител или
Т-клеточных рецепторов. Обычно реализуются оба варианта, что
ведет к элиминации угрозы и формированию иммунологической
памяти, которая обеспечивает более эффективный ответ на
повторное введение антигена, а в случае аутоиммунного процесса
обусловливает усложнение симптоматики и нарастающее
усугубление симптомов аутоиммунного заболевания. Изучение
роли антител представляет большой интерес, поскольку их
мишенями могут быть функционально важные белки, в том числе
гормональные рецепторы, локализованные на поверхности
плазматической мембраны.
Воздействие антител на рецепторы приводит к изменению
их функционального состояния и меняет активность зависимых
от них внутриклеточных сигнальных каскадов. Антитела могут
функционировать как аллостерические регуляторы с активностью
антагонистов, полных и инверсионных агонистов, а также как
отрицательные и положительные модуляторы рецепторов (Jo,
Jung, 2016). Наибольший интерес представляет изучение
воздействия аутоантител на GPCR, поскольку с этим связан
широкий спектр аутоиммунных процессов и вызываемых ими
аутоиммунных заболеваний.
7.2. Аутоантитела к адренергическим рецепторам
Адренергические рецепторы подразделяют на два класса

– α и β, каждый из которых включает несколько подклассов. β1-,
β2- и β3-Адренергические рецепторы через посредство
гетеротримерных Gs-белков стимулируют фермент
аденилатциклазу (АЦ), что приводит к повышению
внутриклеточного уровня цАМФ и активации цАМФ-зависимых
транскрипционных факторов. При этом β2- и β3-адренергические
рецепторы способны также взаимодействовать с Gi/o-белками,
через которые они осуществляют ингибирование активности АЦ.
α1-Адренергические рецепторы через посредство Gq/11-белков
348
стимулируют активность фосфоинозитид-специфичной
фосфолипазы Сβ и, тем самым, повышают уровень
внутриклеточного кальция, способствуя его выходу из
внутриклеточных депо и активируя различные изоформы
протеинкиназы С, чувствительные к катионам кальция и(или)
форболовым эфирам. В свою очередь, α2-адренергические
рецепторы, сопряженные с Gi/o-белками, контролируют
внутриклеточный уровень цАМФ и функциональную активность
фосфоинозитидных сигнальных путей (Hieble, 2007).
При определенных условиях внеклеточные участки
адренергических рецепторов могут стать мишенями для
выработки аутоантител, которые в дальнейшем функционируют
как специфичные аллостерические агонисты или антагонисты. В
отличие от адреналина и других лигандов адренергических
рецепторов, которые взаимодействуют с ортостерическим
сайтом, локализованным внутри трансмембранного домена
рецептора, антитела, представляющие собой значительные по
размеру белки, взаимодействуют с его внеклеточными петлями,
которые гидрофильны и содержат специфичные для этих антител
антигенные детерминанты. Функциональная активность антител
зависит от характера их взаимодействия с рецептором и от числа
центров связывания с ним, что было отчетливо
продемонстрировано при изучении связывания моно- и
бивалентных антител с β2-адренергическими рецепторами
(Mijares et al., 2000).
Из очищенных с помощью аффинной хроматографии
антител к участку 173–180 второй внеклеточной петли (ВП) β2-
адренергического рецептора, были получены моновалентные Fab-
фрагменты. В культуре кардиомиоцитов крысы они эффективно
связывались с β2-адренергическим рецептором и блокировали его
взаимодействие с агонистами, препятствуя стимуляции ими
активности АЦ. Взаимодействие бивалентных антител с
кардиомиоцитами приводило к активации зависимых от β2-
адренергических рецепторов сигнальных путей и вызывало
сокращение кардиомиоцитов. Стимулирующий эффект антител
349
ингибировался инверсионным β2-агонистом ICI-118551. В том
случае, когда моновалентные Fab-фрагменты в присутствии анти-
IgG антител образовывали димерный комплекс, их регуляторные
эффекты на активность β2-адренергического рецептора были
сходными с теми, которые оказывали бивалентные антитела. На
основе этого сделан вывод о том, что двухцентровое связывание
бивалентных антител с молекулами рецептора способствует его
димеризации, что, как и в случае других GPCR, приводит к
повышению активности β2-адренергического рецептора (Mijares
et al., 2000). Бивалентные антитела ко второй ВП β1-
адренергического рецептора также обладали активностью
агонистов и через посредство Gs-белков стимулировали
активность АЦ. При этом они не влияли на сигнальные каскады,
реализуемые через β-аррестины, что указывает на специфичность
антител в отношении определенных внутриклеточных
сигнальных путей, реализуемых через β1-адренергические
рецепторы (Li et al., 2015).
Патофизиологические последствия стимуляции β-
адренергических рецепторов аутоантителами обусловлены более
длительным временем их активации в сравнении с классическими
лигандами, что приводит к усилению процессов десенситизации
и интернализации рецепторов. В экспериментах на крысах и
кроликах показано, что длительная иммунизация животных с
помощью пептида 197–222, который соответствует второй ВП β1-
адренергического рецептора, приводит к десенситизации β1-
адренергических рецепторов и снижению их плотности на
поверхности кардиомиоцитов, что является одной из основных
причин развития сердечно-сосудистой патологии (Fukuda et al.,
2004; Buvall et al., 2006). Снижение чувствительности
кардиомиоцитов к агонистам также может быть вызвано
значительным повышением экспрессии и функциональной
активности рецепторной киназы GRK2, специфичной для β1-
адренергического рецептора, которая фосфорилирует его
цитоплазматические участки и препятствует нормальному
350
связыванию агонистов с ортостерическим сайтом рецептора
(Buvall et al., 2006).
Антитела к β1-адренергическому рецептору могут быть
одной из основных причин дилатационной и ишемической
кардиомиопатии, на что указывает их присутствие у
значительной части пациентов с этими патологиями, а также
результаты экспериментов на животных (Jahns et al., 1999; Jane-
wit et al., 2007; Staudt et al., 2007; Bornholz et al., 2014). Показано,
что специфичные к β1-адренергическому рецептору антитела
связываются со второй ВП рецептора, нарушают связывание с
ним агонистов и сами запускают зависимые от β1-агонистов
сигнальные каскады, повышая уровень цАМФ в кардиомиоцитах,
и этот их эффект подавляется β-блокатором бисопрололом (Jahns
et al., 1999). В результате активной иммунизации мышей с
помощью рекомбинантного β1-адренергического рецептора
человека образовывались антитела подклассов G2a и G2b и
небольшое количество G1-антител. При внутривенном введении
этих антител здоровым животным развивались классические
симптомы кардиомиопатии. В кардиомиоцитах отмечали
значительное повышение внутриклеточной концентрации ионов
кальция, что приводило к усилению частоты и амплитуды их
сокращений. Длительная обработка кардиомиоцитов антителами
in vitro и in vivo приводила к индукции апоптоза и гибели
кардиомиоцитов, что было связано с гиперактивацией
протеинкиназы А, вызываемой антителами через посредство β1-
адренергического рецептора (Jane-wit et al., 2007). Антитела к β1-
адренергическому рецептору также выявлены у пациентов с
болезнью Грейвса с тяжелыми формами аритмии, причем
доказана положительная корреляция между присутствием этих
антител и выраженностью нарушений сердечного ритма
(Stavrakis et al., 2009).
С выработкой антител к β1- и β2-адренергическим
рецепторам связывают развитие хронических форм
кардиомиопатии у пациентов с болезнью Чагаса. Триггером
аутоиммунного процесса в этом случае является молекулярная
351
мимикрия антигенов возбудителя этой болезни, трипаносом
Trypanosoma cruzi, под рецепторные белки кардиомиоцитов.
Участком β1-адренергического рецептора, на который
развивается перекрестная иммунореактивность, является С-
концевой фрагмент рибосомального Р2β-белка Trypanosoma cruzi
(Mahler et al., 2004; Smulski et al., 2006). Антитела, выработанные
к синтетическому пептиду R13 (EEEDDDMGFGLFD), который
соответствует этому фрагменту, взаимодействовали со второй ВП
β1-адренергического рецептора со значением Kd равным 10 мкМ,
причем активными были только димерные формы антител,
которые включали два одноцепочечных фрагмента scFv C5.
Наряду с этим, димерная форма scFv C5 вызывала стимуляцию
активности АЦ в клетках линии CHO-K с экспрессированным в
них β1-адренергическим рецептором человека (Smulski et al.,
2006). Необходимо отметить, что антитела к рибосомальному
белку трипаносомы также перекрестно связывались с m2-
мускариновым рецептором. Обнаружена положительная
корреляция между наличием антител к β1-адренергическому
рецептору и m2-мускариновому рецептору, с одной стороны, а
также выраженностью желудочковой аритмии и дисфункциями
синусового узла, с другой (Mahler et al., 2004). При иммунизации
грызунов пептидными антигенами трипаносомы Trypanosoma
cruzi не было выявлено заметного изменения функций сердца,
что во многом обусловлено относительно слабой аутоиммунной
реакцией. Вероятно, для выраженной аутоиммунной реакции
необходимы дополнительные факторы, в том числе вовлечение
T-клеточного иммунного ответа, которые имеют место у
человека, но отсутствуют у экспериментальных животных
(Bonney et al., 2013).
Антитела к α1-адренергическому рецептору часто
обнаруживают у пациентов с различными вариантами
артериальной гипертензии – злокачественной гипертензией (Fu et
al., 1994), гипертонической болезнью (Luther et al., 1997),
рефрактерной (Wenzel et al., 2008) и легочной гипертензией
(Dandel et al., 2013). В основе патогенетического воздействия
352
антител к α1-адренергическому рецептору на функции сердечно-
сосудистой системы лежит их способность вызывать сокращение
мышц стенок кровеносных сосудов. Показано, что антитела
специфически связываются с участком 192–218 второй ВП α1-
адренергического рецептора, который участвует в узнавании
лигандов. Чем тяжелее форма артериальной гипертензии, тем
выше встречаемость и титр антител к α1-адренергическому
рецептору.
Антитела к α1- и β2-адренергическим рецепторам
обнаружены в сыворотке крови у пациентов со средними и
поздними стадиями болезни Альцгеймера и сосудистой
деменцией, причем у большинства из них имелись антитела к
обоим типам рецепторов (Karczewski et al., 2012). В отличие от
артериальной гипертензии, в этом случае антитела к α1-
адренергическому рецептору специфически взаимодействовали с
пептидом 89–100, соответствующим первой ВП рецептора.
Следует отметить, что роль первой ВП в связывании агонистов и
функционировании α1-адренергических рецепторов практически
не изучена. Полученные данные указывают на то, что
специфичность антител к различным эпитопам α1-
адренергического рецептора в значительной степени определяет
их роль в этиологии и патогенезе аутоиммунных заболеваний.
Это должно учитываться при диагностике аутоиммунных
заболеваний и при разработке подходов для их лечения.
Из крови пациента, страдающего идиопатической
ортостатической гипотензией, были выделены продуцируемые
лимфоцитами моноклональные антитела C5F2, активирующие β2-
адренергический рецептор, которые взаимодействовали с N-
концевым сегментом его второй ВП. Антитела C5F2
стимулировали активность АЦ в клетках с экспрессированным в
них β2-адренергическим рецептором человека, и вызывали
мощную вазодилатацию на изолированных артериолах крыс.
Действие антител полностью блокировалось пептидом,
соответствующим второй ВП β2-адренергического рецептора, и
β2-антагонистом ICI-118551 (Li et al., 2012, 2013).
353
Ортостатическая гипотензия может быть ассоциирована не
только с выработкой аутоантител к β2-адренергическому
рецептору, но и антител к α1- и β1-адренергическим рецепторам
(Li et al., 2014). Антитела подклассов G1–G3 к β2-
адренергическому рецептору были обнаружены у пациентов с
синдромом хронической усталости, однако их роль в патогенезе
заболевания пока не установлена (Loebel et al., 2016).
7.3. Аутоантитела к мускариновым рецепторам
У млекопитающих имеются пять типов мускариновых

рецепторов, причем m1-, m3- и m5-рецепторы функционально
сопряжены с Gq/11-белками и активируют фосфолипазу Сβ, в то
время как m2- и m4-рецепторы сопряжены с Gi/o-белками и
ингибируют активность АЦ, снижая внутриклеточный уровень
цАМФ. Мускариновые рецепторы локализованы, главным
образом, на постсинаптических мембранах клеток, причем m1-,
m4- и m5-рецепторы наиболее широко представлены в ЦНС, в то
время как m2- и m3-рецепторы играют важную роль в
функционировании сердечно-сосудистой и дыхательной систем,
регулируя сократимость стенки кровеносных сосудов (Wang et
al., 2001).
Большинство антител к мускариновым рецепторам
распознают их вторую ВП и характеризуются высокой
специфичностью в отношении различных типов этих рецепторов.
Из сыворотки крови пациентов, страдающих параноидальной
шизофренией, выделены иммуноглобулины класса G,
специфично взаимодействующие со второй ВП m1-
мускаринового рецептора. Они обладали активностью агонистов,
вызывая специфическую активацию этого рецептора и зависимых
от него сигнальных каскадов. При действии на нейроны
фронтальной коры мозга крыс антитела к m1-мускариновому
рецептору повышали в них уровень цГМФ, усиливали зависимую
от фосфолипазы Сβ продукцию инозитол-1,4,5-трифосфата и
транслокацию протеинкиназы С к ее внутриклеточным мишеням
354
(Borda et al., 2002). Показано, что у 30 % пациентов с
шизофренией, расстройствами настроения и другими
психическими отклонениями в сыворотке крови также
обнаруживаются антитела к m1-мускариновому рецептору, но
выявить прямые корреляции между их присутствием и
конкретными симптомами психических расстройств не удалось
(Tanaka et al., 2003). Присутствие антител к m1-мускариновому
рецептору является признаком протекающих в ЦНС
аутоиммунных процессов, природа, которых, в настоящее время
не установлена.
Антитела к m2-мускариновому рецептору обнаружены у
пациентов с болезнью Чагаса (Goin et al., 1994). Присутствие
антител ко второй ВП m2-мускаринового рецептора
продемонстрировано у пациентов с аритмическими
осложнениями при болезни Грейвса (Stavrakis et al., 2009), с
комплексным регионарным болевым синдромом (Kohr et al.,
2011) и дилатационной кардиомиопатией (Fu et al., 1993).
Инкубация антител ко второй ВП m2-мускаринового рецептора с
мембранами вызывала снижение числа связывающих мест для
m2-агонистов, а также повышала значение Kd для их
высокоаффинного связывания, что указывает на ингибирующее
влияние антител на зависимые от m2-мускариновых рецепторов
сигнальные каскады (Fu et al., 1993).
Не меньшим разнообразием характеризуются патологии,
ассоциированные с антителами к m3-мускариновым рецепторам.
С высокой частотой анти-m3-антитела встречаются у больных
синдромом Шегрена, а также у пациентов с первичным
билиарным циррозом печени, который часто сопутствует
синдрому Шегрена (Koo et al., 2008; Berg et al., 2010; Tsuboi et al.,
2014; Kim et al., 2015). Они были также выявлены при синдроме
хронической усталости и при ортостатической гипотензии (Li et
al., 2012; Loebel et al., 2016). При этом у здоровых людей
антитела к m3-мускариновым рецепторам встречаются
исключительно редко. Первоначально было показано, что
основными сайтами связывания антител с этими рецепторами
355
являются участки 205–230 и 514–527, локализованные во второй
и третьей ВП (Koo et al., 2008). В дальнейшем с помощью
синтетических циклических пептидов локализация этих участков
была уточнена – 205–221 во второй ВП и 520–527 в третьей ВП
(Kim et al., 2015). Антитела, выделенные из сыворотки крови
пациентов с первичным синдромом Шегрена, усиливали
взаимодействие m3-мускариновых рецепторов с молекулами
главного комплекса гистосовместимости класса I и вызывали их
интернализацию, что приводило к нарушению работы
холинергической системы (Kim et al., 2015). У большинства
пациентов с характерными для билиарного цирроза сильно
выраженными нарушениями структуры печени выявлены
антитела против первой ВП m3-мускаринового рецептора, что
позволило предложить их в качестве маркера для
дифференциальной диагностики этого заболевания (Tsuboi et al.,
2014).
7.4. Аутоантитела к ангиотензиновым рецепторам
Пептидный гормон ангиотензин-II вызывает сужение

сосудов, повышает артериальное давление, контролирует
высвобождение альдостерона корковым слоем надпочечников.
Свои эффекты на функции сердечно-сосудистой системы он
реализует в основном через AT1-ангиотензиновые рецепторы,
которые широко представлены в организме (Murphy et al., 1991;
Karnik et al., 2015). AT1-ангиотензиновые рецепторы
функционально сопряжены с гетеротримерными Gq/11- и Gi/o-
белками и через них осуществляют стимуляцию
фосфоинозитидного обмена (Gq/11, Gi/o) и ингибирование
активности АЦ (Gi/o) (Higuchi et al., 2007). Сопряженные с Gi2/i3-
белками AT2-ангиотензиновые рецепторы менее распространены
и отвечают лишь за узкий круг специфичных эффектов
ангиотензина-II (Batenburg et al., 2004; Caruso-Neves et al., 2005).
Антитела к AT1-ангиотензиновым рецепторам
обнаружены у 90 % беременных женщин с преэклампсией –
356
тяжелым заболеванием, развивающимся на поздних сроках
беременности (Wallukat et al., 1999). И хотя точные причины
преэклампсии не установлены, предполагается, что важную роль
в ее развитии играют ренин-ангиотензиновая система и
иммунные механизмы. Антитела к AT1-ангиотензиновому
рецептору принадлежат к подклассу G3 и реагируют с участком
165–191 второй ВП AT1-ангиотензинового рецептора. Как и в
случае адренергических рецепторов, сайт связывания антител с
AT1-ангиотензиновым рецептором отличается от сайта
связывания ангиотензина-II и локализован не внутри
трансмембранного домена, а в гидрофильных ВП, что указывает
на аллостерический характер взаимодействий (Wallukat et al.,
1999). Антитела стимулируют активность AT1-ангиотензинового
рецептора, что, вероятно, связано с вызываемой ими
стабилизацией активной конформации рецептора,
обеспечивающей продуктивное взаимодействие с G-белками.
Тяжесть и прогноз преэклампсии положительно коррелируют с
титром антител и сроками их появления в сыворотке крови
беременных женщин (Walther et al., 2005; Siddiqui et al., 2010; Xia,
Kellems, 2011, 2013; Herse, LaMarca, 2013).
Антитела к AT1-ангиотензиновому рецептору влияют на
окислительно-восстановительный баланс, агрегацию клеток и
процессы воспаления. При действии на культуру
гладкомышечных клеток и трофобластов человека они
стимулируют активность НАДФН-оксидазы и повышают
продукцию активных форм кислорода. Наряду с этим, антитела к
AT1-ангиотензиновому рецептору усиливают экспрессию и
активность провоспалительного фактора NF-κB и снижают
экспрессию гена, кодирующего ингибитор NF-κB (Dechend et al.,
2003). В мезанглиальных клетках и тромбоцитах антитела к AT1-
ангиотензиновому рецептору, выделенные из сыворотки крови
пациенток с преэклампсией, усиливают синтез ингибитора
активатора плазминогена, что является причиной характерной
для преэклампсии гиперкоагуляции (Xia et al., 2003; Bobst et al.,
2005). Следует отметить, что для беременных женщин с
357
преэклампсией характерны усиление воспалительных процессов,
нарушение функций эндотелия, гиперактивация системы
комплемента, тромбозы и повышение уровня активных форм
кислорода и НАДФН-оксидазной активности в плаценте
(Dechend et al., 2003; Xia, Kellems, 2011).
Антитела к AT1-ангиотензиновому рецептору выявлены у
пациентов со злокачественной гипертонической болезнью,
вторичной злокачественной гипертензией, вазоренальной
гипертензией и, лишь в небольшом числе случаев, у здоровых
доноров (Fu et al., 2000; Dörffel et al., 2003; Dragun et al., 2005;
Dragun, 2007; Okruhlicova et al., 2007). Из сыворотки крови
пациентов с гипертензией выделены антитела к AT1-
ангиотензиновому рецептору, которые оказывали
положительный хронотропный эффект на культуру
кардиомиоцитов новорожденных крысят (Fu et al., 2000). У части
пациентов со злокачественной гипертонической болезнью были
выявлены антитела подклассов G1 и G3 с агонистической
активностью по отношению к AT1-ангиотензиновому рецептору,
которые специфично связывались с двумя эпитопами второй ВП
рецептора – ENTNIT (173–178) и AFHYESQ (181–187).
Связывание антител с AT1-ангиотензиновыми рецепторами,
расположенными на эндотелиальных клетках почечных сосудов,
приводило к повышению активности ERK1/2-киназ и
транскрипционных факторов AP-1 и NF-κB, причем антагонист
рецептора лозартан полностью блокировал эти эффекты антител
(Dragun et al., 2005). Антитела, выделенные из сыворотки
пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, усиливали
пролиферацию тучных клеток сердца и их размер (Okruhlicova et
al., 2007), а также вызывали повышение экспрессии генов,
кодирующих молекулы клеточной адгезии и, как следствие,
усиливали адгезию моноцитов на эндотелиальных клетках
сосудов (Dörffel et al., 2003). Как известно, повышение числа
тучных клеток и усиление адгезионных процессов являются
факторами риска для развития заболеваний сердечно-сосудистой
системы.
358
В крови пациентов с легочной артериальной
гипертензией, ассоциированной с системным склерозом, были
выявлены антитела как к AT1-ангиотензиновому рецептору, так и
к рецептору эндотелина А-типа (Becker et al., 2014). При этом
повышение титра антител положительно коррелировало со
степенью тяжести заболевания и смертностью от него. В
изолированных перфузированных легких крысы антитела
специфично взаимодействовали с рецепторами и повышали
внутриклеточный уровень ионов кальция в эндотелиоцитах. О
специфичности этого эффекта свидетельствует тот факт, что
селективные антагонисты AT1-ангиотензинового и ETA-
эндотелинового рецепторов блокировали стимулирующие
эффекты антител на кальциевую сигнализацию. Вызываемая
антителами стимуляция внутридольковых сегментов кольца
легочной артерии крысы усиливала вазоконстрикторные ответы
на ангиотензин-II и эндотелин-1. Полученные данные
свидетельствуют о том, что аутоантитела к AT1-
ангиотензиновому и ETA-эндотелиновому рецепторам могут
служить биомаркерами для диагностики легочной артериальной
гипертензии, ассоциированной с системным склерозом, причем
оба типа аутоантител могут способствовать развитию этого
заболевания, повышая реактивность эндотелия сосудов и
индуцируя легочную васкулопатию (Becker et al., 2014).
Стимулирующие антитела к AT2-ангиотензиновому
рецептору в настоящее время выявлены только у пациентов с
первичным альдостеронизмом, который характеризуется
повышенным образованием в организме альдостерона. Их
активность блокируется PD 123319, селективным антагонистом
AT2-ангиотензинового рецептора, что может быть использовано
для снижения гиперпродукции альдостерона (Liles et al., 2015).
Весьма интересен тот факт, что применение антител к AT2-
ангиотензиновому рецептору приводит к нейтрализации
негативных эффектов, которые вызывают антитела к AT1-
ангиотензиновому рецептору. Выработанные при иммунизации
кроликов антитела к N-концевому участку второй ВП AT2-
359
ангиотензинового рецептора предотвращают развитие
вазоконстрикторного эффекта, вызванного стимулирующими
антителами против внеклеточного N-концевого сегмента AT1-
ангиотензинового рецептора (Liles et al., 2015).
7.5. Аутоантитела к рецептору тиреотропного гормона
Аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы

страдает до 5% населения (Tomer, Huber, 2009). Наиболее
распространенным среди них является диффузный токсический
зоб (болезнь Грейвса), который формируется в результате
аутоиммунной атаки на рецепторы тиреотропного гормона (ТТГ).
Факт наличия антител к рецепторам ТТГ при этом заболевании
известен давно и используется для его дифференциальной
диагностики еще с начала 1980-х годов, когда появились первые
коммерческие диагностические тест-системы, позволяющие
идентифицировать эти антитела (Ginsberg, von Westarp, 1986).
Рецептор ТТГ локализован преимущественно на
поверхности тироцитов, но иногда обнаруживается на
поверхности адипоцитов, фибробластов и других клеток (Bahn et
al., 1998). Он включает большой внеклеточный домен
(эктодомен), состоящий из 9 обогащенных остатками лейцина
повторов, которые образуют характерную, подковообразную
структуру, на вогнутой поверхности которой находятся участки
связывания с ТТГ и антителами. В активном состоянии рецептор
ТТГ образует димерный или олигомерный комплекс (Urizar et al.,
2005; Latif et al., 2010; Allen et al., 2011). Связывание рецептора
ТТГ с гормоном стимулирует синтез и высвобождение
тиреоидных гормонов тироцитами и контролирует рост и
дифференцировку этих клеток.
Антитела к рецептору ТТГ обладают активностью
агонистов, инверсионных агонистов и антагонистов, но в ряде
случаев они слабо влияют на базальную активность рецептора,
вызывая изменение гормональной регуляции рецепторной
активности и функционируя, тем самым, как нейтральные
360
антитела (аллостерические модуляторы) (Núñez Miguel et al.,
2012; McLachlan, Rapoport, 2013; Davies, Latif, 2019).
Стимулирующие антитела связываются с рецептором ТТГ,
находящимся в неактивной конформации, и конкурируют с ТТГ
за сайты связывания в эктодомене рецептора. Они специфично
взаимодействуют с эпитопами эктодомена, экранируют лиганд-
связывающий сайт, делая его недоступным для ТТГ, и при этом
активируют рецептор и запускают сигнальные каскады,
усиливающие синтез и секрецию тиреоидных гормонов.
Блокирующие (ингибирующие) антитела подавляют связывание
ТТГ с рецептором, но сами при этом не активируют ТТГ-
зависимые сигнальные каскады.
Большинство стимулирующих и блокирующих антител
связываются с линейными и «конформационными» эпитопами,
локализованными в обогащенных остатками лейцина повторах
эктодомена рецептора ТТГ, в то время как стимулирующие и
нейтральные антитела могут взаимодействовать и с шарнирной
областью, соединяющей эктодомен с гидрофобным
трансмембранным доменом. В шарнирной области наибольший
интерес представляют участки 322–341 и 337–356, которые
являются основными мишенями для нейтральных и
стимулирующих антител (Ando et al., 2004; Morshed et al., 2010).
При этом стимулирующие антитела, в отличие от нейтральных и
блокирующих антител, могут связываться одновременно с
шарнирной областью и эктодоменом рецептора. Показано, что
более половины пациентов с болезнью Грейвса имеют
положительную реакцию на эти антитела. Моноклональные
антитела к шарнирной области рецептора ТТГ, выделенные из
сыворотки крови животных с экспериментальным
аутоиммунным тиреоидитом, стимулировали активность
рецептора ТТГ, повышали уровень цАМФ в тироцитах,
активировали 3-фосфоинозитидный путь, каскад
митогенактивируемых протеинкиназ, различные изоформы
протеинкиназы С и повышали активность провоспалительного
фактора NF-kВ (Morshed et al., 2010). Эти данные указывают на
361
отчетливо выраженное функциональное сходство между ТТГ и
стимулирующими антителами к рецептору ТТГ, а также на то,
что гормон и антитела взаимодействуют с общими или сильно
перекрывающимися сайтами, локализованными в эктодомене
рецептора.
Аутоиммунные заболевания щитовидной железы, в том
числе болезнь Грейвса, развиваются в результате
комбинированного воздействия генетических факторов и
неблагоприятных факторов окружающей среды. Показано, что
повышенная продукция интерферона-α при вирусных
заболеваниях или назначаемые пациентам препараты
интерферона способны спровоцировать развитие аутоиммунного
тиреоидита. Так, у 15 % пациентов с гепатитом С, которых
длительное время лечили интерфероном, развивается
аутоиммунный тиреоидит, причем антитела к рецептору ТТГ
выявляются в половине случаев (Mandac et al., 2006). Один из
предполагаемых механизмов действия интерферона состоит в
том, что он вызывает снижение иммунной толерантности,
модулируя экспрессию генов через эпигенетические механизмы.
Это происходит вследствие воздействия интерферона-α на
структуру хроматина в области первого интрона гена,
кодирующего рецептор ТТГ, как раз в том месте, где
расположены однонуклеотидные полиморфизмы,
ассоциированные с болезнью Грейвса. В результате в тимусе
снижается экспрессия мРНК для рецептора ТТГ, что ведет к
нарушению опосредованных T-клетками механизмов
центральной толерантности и увеличивает риск развития
аутоиммунных реакций на эктодомен рецептора ТТГ (Stefan et al.,
2014). В настоящее время идентифицировано несколько генов,
полиморфизмы в которых ассоциированы с развитием
аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. Среди них
гены, кодирующие молекулы главного комплекса
гистосовместимости II класса (HLA-DR), гены негативных
регуляторов активации Т-клеток (CTLA-4 и PTPN22), ген
рецептора, ответственного за активацию В-клеток (CD40), а
362
также гены тироглобулина (Tg) и рецептора ТТГ (TSHR) (Stefan
et al., 2014). Идентификация таких полиморфизмов и выяснение
роли цитокинов и факторов окружающей среды в этиологии и
патогенезе аутоиммунных заболеваний щитовидной железы
является одним из наиболее перспективных направлений в
предотвращении и ранней диагностике таких заболеваний.
7.6. Аутоантитела к меланокортиновым рецепторам
Все пять типов меланокортиновых рецепторов (МКР)

сопряжены с гетеротримерными G-белками и активируются α-
меланоцитстимулирующим гормоном (α-МСГ) и другими
пептидами меланокортинового семейства, продуктами сайт-
специфичного протеолиза их предшественника – про-
опиомеланокортина. МКР регулируют функции сердечно-
сосудистой, репродуктивной и гипоталамо-гипофизарно-
надпочечниковой систем, контролируют пищевое поведение,
углеводный и жировой обмен. МКР 1-го типа расположены
преимущественно в меланоцитах кожи, МКР 2-го типа – в
надпочечниках и адипоцитах, МКР 5-го типа – в экзокринных
железах и в некоторых периферических тканях, в то время как
МКР 3-го и 4-го типов экспрессируются, главным образом, в
структурах ЦНС. Ослабление функциональной активности и
нарушение регуляции меланокортиновых сигнальных путей в
мозге вызывает нарушения пищевого поведения и
энергетического обмена, снижает чувствительность
периферических тканей к инсулину, что, в конечном итоге,
приводит к патологическому ожирению, метаболическому
синдрому и сахарному диабету 2-го типа (Shpakov et al., 2011,
2015; Шпаков, Деркач, 2012; Begriche et al., 2013; Kievit et al.,
2013). МКР 3-го типа функционируют как ауторецепторы,
регулируя по механизму обратной отрицательной связи
активность сигнальных каскадов, опосредуемых через МКР 4-го
типа (Renquist et al., 2011). В ряде случаев МКР 3-го типа
способны функционально заменять МКР 4-го типа, как это
363
показано нами при генетически обусловленном подавлении
активности МКР 4-го типа и его сигнальных путей (Romanova et
al., 2018; Derkach et al., 2019).
Роль аутоантител к МКР 3-го и 4-го типов в регуляции
периферического метаболизма экспериментально
продемонстрирована нами и другими авторами при активной
иммунизации животных пептидами, соответствующими
внеклеточным участкам этих рецепторов. Иммунизация крыс
пептидом, соответствующим N-концевому домену МКР 4-го
типа, приводила к развитию фенотипа, наблюдаемого при
гипоталамической блокаде МКР 4-го типа, для которого
характерны гиперфагия, избыточная масса тела, повышенные
концентрации триацилглицеридов (Peter et al., 2007; Hofbauer et
al., 2008). В условиях in vitro эти антитела демонстрировали
свойства аллостерических инверсионных агонистов и
антагонистов, которые не конкурировали с меланокортиновыми
пептидами за места связывания на молекуле МКР 4-го типа. При
введении антител в третий желудочек мозга, у здоровых крыс
повышалось потребление пищи, которое сохранялось в течение
72 ч после этой процедуры. При этом внутривенное введение не
было эффективным (Peter et al., 2007). Полученные результаты
побудили к поиску антител к МКР 4-го типа у людей,
страдающих избыточной массой тела и ожирением (Peter et al.,
2009). При обследовании 216 пациентов с ожирением, в 28
случаях были идентифицированы антитела к N-концевому
участку МКР 4-го типа, причем их присутствие положительно
коррелировало с индексом массы тела и выраженностью
ожирения. Антитела, полученные из крови 12 пациентов,
специфично связывались с нативным рецептором, и пять из них
ингибировали стимулированную меланокортиновыми пептидами
активность АЦ. При введении в третий желудочек мозга
здоровых крыс антитела к МКР 4-го типа усиливали потребление
пищи и этот эффект сохранялся в течение 48 ч (Peter et al., 2009).
Нами показано, что длительная, в течение года,
иммунизация крыс синтезированным нами БСА-
364
конъюгированным пептидом, который соответствует
внеклеточному участку K-[TSLHLWNRSSHGLHG11–25]-A N-
концевого домена МКР 4-го типа, приводила к аутоиммунному
заболеванию. Это заболевание характеризовалось повышением
массы тела, массы абдоминального и эпидидимального жира, а
также комплексом метаболических расстройств, среди которых
были нарушенная толерантность к глюкозе, инсулиновая
резистентность, значительное повышение уровня общего
холестерина и его атерогенных комплексом с липопротеидами
низкой и очень низкой плотности, увеличение соотношения
липопротеидов низкой и высокой плотности и индекса
атерогенности (Деркач и др., 2014б; Шпаков и др., 2015а). При
изучении тиреоидного статуса у иммунизированных животных
было выявлено снижение уровня общего трийодтиронина и
тенденция к повышению уровня ТТГ, что указывает на развитие
гипотиреоидного состояния. Одной из причин этого было
снижение на 41% стимулирующего эффекта ТТГ (10-8 М) на
активность АЦ в мембранах, выделенных из тканей щитовидной
железы крыс, иммунизированных пептидом 11–25, что указывает
на ослабление чувствительности тироцитов к регуляторному
действию ТТГ в условиях такой иммунизации. Необходимо
отметить, что снижение уровня трийодтиронина, основного
эффекторного гормона тиреоидной системы, играет важную роль
в развитии метаболических нарушений и является веским
доказательством взаимосвязи между дефицитом
меланокортиновой сигнализации и развитием гипотиреоза
(Деркач и др., 2015а).
Метаболические изменения, вызываемые антителами к
МКР 4-го типа, тесно взаимосвязаны с изменениями активности
гормональных систем, в том числе аденилатциклазной
сигнальной системы, что может лежать в основе развития
функциональных нарушений в ЦНС и на периферии и быть
одной из причин заболеваний нервной, сердечно-сосудистой,
эндокринной и других систем организма в условиях дефицита
опосредуемой через МКР 4-го типа меланокортиновой
365
сигнализации. Нами показано, что в мозге крыс, которых в
течение года иммунизировали пептидом 11–25, менялась
чувствительность аденилатциклазной сигнальной системы как к
агонистам МКР 3-го и 4-го типов, так и к агонистам
дофаминовых рецепторов 1-го типа и серотониновых рецепторов
1-го типа. Эти данные указывают на функциональную
взаимосвязь между меланокортиновой и моноаминергическими
системами мозга (Шпаков и др., 2015а). В миокарде
иммунизированных крыс снижались стимулирующие АЦ
эффекты изопротеренола и норадреналина, агонистов β1/β2-
адренергических рецепторов, и повышались, хотя и в небольшой
степени, стимулирующие АЦ эффекты BRL-37344 и CL-316243,
селективных агонистов β3-адренергических рецепторов.
Результатом было изменение соотношения β1/β2/β3-сигнальных
путей в пользу β3-адренергической сигнализации, что является
фактором повышенного риска и(или) признаком кардиомиопатии
и характерно для метаболического синдрома и сахарного диабета
2-го типа (Shpakov, Derkach, 2013). Значительные изменения
функциональной активности были выявлены в эпидидимальном
жире иммунизированных крыс, где не только снижались
стимулирующие эффекты β1-, β2- и β3-агонистов на активность
АЦ, но и уменьшалась активность АЦ, стимулированная
негормональными агентами, в том числе гуаниновыми
нуклеотидами. Эти данные свидетельствуют об ослаблении
липолиза, осуществляемого через гормональную активацию
аденилатциклазной сигнальной системы в жировой ткани крыс,
иммунизированных пептидом 11–25 МКР 4-го типа. Следствием
ослабления липолиза, как известно, является накопление
жировой ткани, дислипидемия и липотоксичность, усугубляющие
функционирование мозга и периферических тканей.
Для моделирования ассоциированных с МКР 3-го типа
аутоиммунных заболеваний Jean-Christophe Peter и соавторы
иммунизировали крыс пептидами, которые соответствуют
участкам первой (103–123) и третьей ВП (265–283) МКР 3-го
типа (Peter et al., 2010). Антитела, выделенные из крови
366
иммунизированных этими пептидами крыс, специфично
связывались с нативным рецептором и влияли на активность АЦ,
причем антитела к первой ВП проявляли активность
положительных аллостерических модуляторов, в то время как
антитела к третьей ВП обладали свойствами неконкурентных
аллостерических антагонистов. Иммунизированные животные не
прибавляли в весе, но при этом у них нарушался липидный обмен
(Peter et al., 2010).
Для индукции аутоиммунной модели дефицита МКР 3-го
типа нами синтезирован БСА-конъюгат пептида A-
[PTNPYC(Acm)IC(Acm)TTAH269–280]-A, соответствующего
третьей ВП МКР 3-го типа. Его использовали для многократной
иммунизации самцов крыс, в результате чего через 13 месяцев
после первой иммунизации в крови животных отмечали
устойчиво высокие титры антител к МКР 3-го типа. Выделенные
антитела подавляли стимулирующие эффекты агонистов МКР 3-
го типа на активность АЦ в гипоталамических мембранах крысы,
не влияя на стимулирующие АЦ эффекты других гормональных
регуляторов. У иммунизированных пептидом 269–280 крыс
отмечали небольшое снижение массы тела при значительном
повышении удельной массы жировой ткани, что свидетельствует
о жировом перерождении тканей. В крови повышались уровни
триглицеридов и атерогенного холестерина, связанного с
липопротеидами низкой плотности, а также увеличивался индекс
атерогенности. Несмотря на повышение секреции инсулина в
ответ на глюкозную нагрузку, отмечали снижение
чувствительности тканей к гормону и ослабление инсулин-
индуцированной утилизации глюкозы (Деркач и др., 2014а;
Шпаков и др., 2015б). Наряду с изменениями углеводного и
липидного обмена, у иммунизированных крыс были выявлены
признаки гипотиреоидного состояния (Деркач и др., 2015а). Все
вышесказанное свидетельствует о том, что скрининг антител к
МКР 3-го и 4-го типов представляется весьма важным с точки
зрения диагностики и изучения этиопатогенеза метаболических и
эндокринных расстройств, в основе которых лежит
367
аутоиммунное ингибирование меланокортиновой сигнальной
системы мозга.
7.7. Аутоантитела к серотониновым рецепторам
Серотонин является не только важнейшим

нейрогормоном, но также участвует в регуляции воспалительных
процессов и иммунных функций организма. Нарушения такой
регуляции могут стать причиной аутоиммунных и хронических
воспалительных заболеваний. В ЦНС и на периферии выявлено
18 подтипов серотониновых рецепторов, среди которых 15
серотониновых рецепторов относятся к суперсемейству GPCR и
подразделяются на 6 типов. Через них серотонин контролирует
поведение, эмоции, когнитивные функции, потребление пищи,
функции сердечно-сосудистой и пищеварительной систем.
Поскольку серотониновые рецепторы широко представлены в
различных отделах мозга, то поиск антител к ним осуществляется
в основном у пациентов с заболеваниями ЦНС. В образцах
сыворотки крови и цереброспинальной жидкости у пациентов с
аутизмом, эпилепсией, шизофренией и другими психическими и
нейрологическими заболеваниями выявлены специфичные
антитела ко второй ВП серотонинового рецептора 1А-подтипа (5-
HT1A) (Todd et al., 1985; Yuwiler et al., 1992; Verdot et al., 1998;
Tanaka et al., 2003). Несмотря на доказанную взаимосвязь между
этими антителами и дисфункциями ЦНС, роль антител к 5-HT1A-
серотониновому рецептору в патогенезе перечисленных выше
заболеваний нервной системы и молекулярные механизмы их
действия пока не установлены.
С целью расшифровки влияния длительного
аутоиммунного ингибирования 5-HT1B-серотониновых
рецепторов на метаболические показатели и когнитивные
функции, нами проведены эксперименты по многократной
иммунизации самцов крыс БСА-конъюгированным пептидом
[QAKAEEEVSEC(Acm)-VVNTDH189–205]-A (Acm –
ацетамидометильная группа), соответствующим второй ВП этого
368
рецептора. Показано, что в мозге иммунизированных крыс в
значительной степени менялась функциональная активность
аденилатциклазной сигнальной системы, в том числе ее
регуляция 5-HT1B-агонистами. Ингибирующий АЦ эффект
селективного 5-HT1B-агониста 5-нонилокситриптамина снижался,
в то время как соответствующий эффект 5-HT1A-агониста 8-OH-
DPAT, напротив, усиливался, что, как мы полагаем, связано с
запуском компенсаторных механизмов, направленных на
сохранение регулируемых серотонином ингибирующих АЦ
каскадов в условиях дефицита функционально активных 5-HT1B-
серотониновых рецепторов. У иммунизированных животных
ослаблялись функции гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси,
что выражалось в снижении уровня тиреоидных гормонов и ТТГ
(Деркач и др., 2015б). Эти данные позволили впервые установить
функциональную взаимосвязь между длительным снижением
активности 5-HT1B-серотониновых рецепторов и зависимых от
них сигнальных путей, с одной стороны, и развитием патологии
тиреоидной системы, с другой. При оценке поведенческих
реакций у крыс в X-образном лабиринте через 12 месяцев после
первой иммунизации было установлено, что иммунизированные
крысы в сравнении с контрольными животными чаще совершают
активные переходы из одной темной зоны в другую, имеют
достоверно более высокое число стоек и выглядываний из темной
зоны, а также активнее передвигаются без замираний.
Полученные данные указывают на то, что иммунизация крыс
пептидом 189–205 5-HT1B-серотонинового рецептора повышает
двигательную и исследовательскую активность, и это
свидетельствует о снижении, в сравнении с контролем, уровня
тревожности у иммунизированных животных (Жарова и др.,
2017). Поскольку у крыс при этом менялись связывающие
характеристики и активность 5-HT1B-серотониновых рецепторов,
то выявленные изменения в поведении животных указывают на
прямую взаимосвязь между активностью этих рецепторов и
развитием депрессии.
369
Иммунизация самок мышей с помощью пептидов 165–185
и 164–177, соответствующих второй ВП 5-HT4-серотонинового
рецептора, приводила к развитию у них системной красной
волчанки и потере фертильности. У самок с умеренным уровнем
иммунного ответа и признаками системной красной волчанки
присутствие материнских аутоантител к этому рецептору было
ассоциировано с развитием атриовентрикулярной блокады у
новорожденных мышат (Eftekhari et al., 2001). Эти данные стали
основой для изучения роли антител к 5-HT4-серотониновому
рецептору в развитии дисфункций проводящей системы сердца.
Скрининг матерей, родивших детей с врожденной блокадой
сердца, выявил у 16 % из них аутоантитела к 5-HT4-
серотониновому рецептору. При этом у большинства матерей с
положительной реакцией на эти антитела дополнительно были
обнаружены антитела к белку SSA/Ro52, который является
фактором риска для развития полной поперечной блокады сердца
у плода (Kamel et al., 2005). Необходимо отметить, что антитела
ко второй ВП 5-HT4-серотонинового рецептора способны
перекрестно связываться с участком 365–382 белка SSA/Ro52
(Eftekhari et al., 2001). Вероятно, отбор клона В-лимфоцитов,
специфичного по отношению к 5-HT4-серотониновому
рецептору, вносит определенный вклад в развитие нарушений
проведения электрического импульса от предсердий в желудочки
сердца у плода. Поиск антител к пептиду
GIIDLIEKRKFNQNSNSTYCV, соответствующему участку 165–
185 второй ВП 5-HT4-серотонинового рецептора, у пациентов с
сердечной недостаточностью выявил специфичные к нему
антитела у каждого пятого из них (Breidert et al., 2012). Несмотря
на достигнутые успехи, вопрос о том, является ли присутствие
антител к 5-HT4-серотониновому рецептору значимым
прогностическим фактором сердечно-сосудистой патологии или
должно рассматриваться лишь как свидетельство избыточного
иммунного ответа, остается открытым.
370
7.8. Аутоантитела к дофаминовым рецепторам
Длительное время обсуждается вопрос о возможном

участии антител к дофаминовым рецепторам в патогенезе
психических заболеваний (Tanaka et al., 2003; Dale et al., 2012).
Как известно, нейротрансмиттер дофамин, регулирующий
множество физиологических и биохимических процессов в ЦНС
и на периферии, активирует два класса рецепторов –
сопряженные с Gs-белками дофаминовые рецепторы 1-го и 5-го
типов и сопряженные с Gi/o-белками дофаминовые рецепторы 2-
го, 3-го и 4-го типов. Показано, что у сравнительно небольшой
части пациентов с психическими заболеваниями обнаруживаются
антитела, специфичные к дофаминовым рецепторам 2-го типа, но
у них также присутствуют и антитела к другим классам
рецепторов (Tanaka et al., 2003). Антитела к дофаминовым
рецепторам 2-го типа выявлены у больных аутоиммунным
энцефалитом, причем в 12 случаях они могли являться основной
причиной заболевания. У пациентов с положительной реакцией
на антитела к дофаминовым рецепторам 2-го типа отмечали
признаки паркинсонизма, дистонии и хореи, дефицит внимания,
эмоциональную лабильность, психозы (Dale et al., 2012). При
этом ни у одного из пациентов с психическими расстройствами
антител к дофаминовым рецепторам 1-го типа обнаружено не
было. Таким образом, полученные данные позволяют высказать
предположение о возможности вовлечения антител к
дофаминовым рецепторам 2-го типа в этиопатогенез некоторых
заболеваний ЦНС.
7.9. Стратегии лечения аутоиммунных заболеваний,

вызванных антителами к GPCR
Наиболее широко для лечения аутоиммунных

заболеваний, вызванных антителами к GPCR, применяют
методологию плазмофореза (Felix et al., 2002; Baba et al., 2010;
Dandel et al., 2013). Удаление иммуноглобулинов класса G из
371
плазмы крови пациентов с дилатационной кардиомиопатией
приводило к улучшению функций сердечно-сосудистой системы.
Извлеченные из крови фракции антител в условиях in vitro
повышали внутриклеточную концентрацию ионов кальция в
изолированных кардиомиоцитах и вызывали сокращение
колоний кардиомиоцитов (Felix et al., 2002). Селективное
удаление из плазмы крови пациентов антител только одного
патогенного субкласса G3 снижало симптоматику
кардиомиопатии, и при этом не угнетало иммунную систему
(Baba et al., 2010). Идентификация иммунодоминантных участков
в молекулах рецепторов, подвергшихся аутоиммунным атакам,
позволяет разработать высокоспецифичные методы для удаления
патологических аутоантител. Так в группе пациентов с
идиопатической дилатационной кардиомиопатией была
проведена аффинная иммуноадсорбция аутоантител, специфично
реагирующих с пептидом, соответствующим второй ВП β1-
адренергического рецептора, что улучшало симптоматику
заболевания, причем этот положительный эффект
иммуноадсорбции сохранялся в течение года (Wallukat et al.,
2002).
Другой подход, направленный на коррекцию расстройств,
обусловленных присутствием в крови антител к GPCR с
агонистической активностью, состоит в применении селективных
антагонистов сайтов связывания этих антител на рецепторах, а
также в использовании синтетических пептидов, которые
специфично связываются с антителами и, тем самым, их
нейтрализуют. У пациентов с рефрактерным отторжением
трансплантата почек, имеющих высокий титр стимулирующих
антител к AT1-ангиотензиновому рецептору, специфичный
антагонист этого рецептора, лозартан, полностью предотвращал
отторжение трансплантата (Dragun et al., 2005). Эффективным
является применение содержащего D-аминокислоты ретро-
инверсо-пептида, включающего антигенные детерминанты
второй ВП AT1-ангиотензинового рецептора, при лечении
кроликов с гипертензией, индуцированной их иммунизацией
372
пептидом, структурно соответствующим второй ВП этого
рецептора. Даже однократная внутривенная инъекция
иммунизированным кроликам ретро-инверсо-пептида в дозе 1
мг/кг приводила к снижению артериального давления с 122±11 до
82±6 мм Hg (Li et al., 2015). В настоящее время стадию
клинических испытаний проходит разработанный в 2012 году
циклический пептид, соответствующий второй ВП β1-
адренергического рецептора, который эффективно нейтрализует
антитела к этому рецептору и, тем самым, препятствует развитию
и прогрессированию сердечно-сосудистой патологии (Münch et
al., 2012).
Таким образом, число заболеваний, при которых
выявляются антитела к внеклеточным участкам GPCR, неуклонно
растет, причем эти антитела идентифицированы и при тех
заболеваниях, развитие которых никак не связывали с
аутоиммунными процессами. На рисунке 7-1 обобщены сведения
об аутоиммунных заболеваниях, ассоциированных с
аутоантителами к GPCR.
Все представленные данные свидетельствуют о
необходимости скрининга пациентов с различными патологиями
на присутствие специфичных антител к GPCR, а также об
актуальности разработки подходов, направленных на
нейтрализацию патологических аутоантител к этим рецепторам.
Важно отметить, что различные классы антител к GPCR сами
могут быть использованы как терапевтические агенты и как
функциональные зонды для изучения механизмов регуляции
физиологических и биохимических процессов. Так,
блокирующие антитела к рецептору ТТГ могут быть эффективны
при лечении злокачественных опухолей щитовидной железы.
Расшифровка и изучение молекулярных механизмов образования
аутоантител и их функционального взаимодействия с GPCR
важны не только для понимания природы аутоиммунных
процессов и влияния аутоантител на активность гормональных
сигнальных систем, но и для расшифровки механизмов передачи
гормонального сигнала в клетку. Необходимо отметить, что
373
аутоантитела к другим классам сенсорных белков, в том числе к
рецепторам, наделенным тирозинкиназной активностью, и к
различным типам ионных каналов, включая ионотропные
рецепторы, также играют важную роль в развитии аутоиммунных
заболеваний (Жарова, Шпаков, 2016; Шпаков и др., 2017).
Рис. 7-1. Взаимосвязь между различными заболеваниями нервной и

сердечно-сосудистой систем и выработкой аутоантител на различные
типы GPCR.
Условные обозначения: AT1R – ангиотензиновый рецептор 1-го типа;
α1AR, β1AR – α1- и β1-адренергические рецепторы; 5HT4R –
серотониновый рецептор 4-го типа; D2R – дофаминовый рецептор 2-го
типа; ETAR – эндотелиновый рецептор А-типа; M1-mAChR, M2-mAChR
– мускариновые ацетилхолиновые рецепторы 1-го и 2-го типов;
GABABR – метаботропный рецептор γ-аминомасляной кислоты; mGlu1R,
mGlu5R – метаботропные глутаматные рецепторы 1-го или 5-го типов;
IgG – иммуноглобулины класса G (по van der Westhuizen et al., 2015).
Деркач К.В., Мойсеюк И.В., Шпакова Е.А., Шпаков А.О. Тиреоидный

статус у крыс, иммунизированных пептидами, производными внеклеточных
374
участков меланокортиновых рецепторов 3-го и 4-го типов и серотонинового
рецептора 1B-подтипа // Журн. эвол. биохим. физиол. 2015а. T. 51. № 4. С. 243–
250.
Деркач К.В., Шпакова Е.А., Жарова О.А., Бондарева В.М., Шпаков А.О.
Влияние иммунизации крыс БСА-конъюгированным пептидом 269–280
меланокортинового рецептора 3-го типа на метаболические показатели и
функции щитовидной железы // Цитология. 2014а. Т. 56. № 11. C. 850–857.
Деркач К.В., Шпакова Е.А., Жарова О.А., Шпаков А.О. Метаболические
изменения у крыс, иммунизированных БСА-конъюгатом пептида,
производного N-концевого участка меланокортинового рецептора 4-го типа //
Доклады Академии наук. 2014б. Т. 458. № 1. C. 102–105.
Деркач К.В., Шпакова Е.А., Тарасенко И.И., Жарова О.А., Шпаков А.О.
Иммунизация пептидом 189–205, производным серотонинового рецептора 1В-
подтипа, меняет чувствительность аденилатциклазы к гормонам в мозге крыс //
Доклады Академии наук. 2015б. Т. 463. № 3. C. 358–361.
Жарова О.А., Шпаков А.О. Роль аутоантител к внеклеточным участкам
ионотропных рецепторов в этиологии и патогенезе аутоиммунных заболеваний
// Рос. Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2016. Т. 102. № 7. C. 773–791.
Жарова О.А., Титов А.Л., Шпакова Е.А., Деркач К.В., Шпаков А.О.
Влияние иммунизации крыс пептидом, производным второй внеклеточной
петли 1B-серотонинового рецептора // Сб. тез. Всероссийского симпозиума
«Стресс: физиологические эффекты, патологические последствия и способы их
предотвращения», 10–13 октября 2017 г., Санкт-Петербург. С. 120–121.
Шпаков А.О., Деркач К.В. Пептидергические сигнальные системы мозга
при сахарном диабете // Цитология. 2012. Т. 54. № 10. С. 733–741.
Шпаков А.О., Деркач К.В., Жарова О.А., Шпакова Е.А. Функциональная
активность аденилатциклазной системы в мозге крыс с метаболическим
синдромом, вызванным иммунизацией пептидом 11–25 меланокортинового
рецептора 4-го типа // Нейрохимия. 2015а. Т. 32. № 1. С. 37–47.
Шпаков А.О., Деркач К.В., Жарова О.А., Шпакова Е.А., Бондарева В.М.
Изменение чувствительности аденилатциклазы к гормонам в мозге, миокарде и
семенниках крыс, иммунизированных БСА-конъюгированным пептидом 269–
280 меланокортинового рецептора 3-го типа // Биологические мембраны. 2015б.
Т. 32. № 1. С. 20–32.
Шпаков А.О., Жарова О.А., Деркач К.В. Аутоантитела к внеклеточным
участкам сопряженных с G-белками рецепторов и рецепторов-тирозинкиназ, как
одна из причин аутоиммунных заболеваний // Журн. эвол. биохим. физиол.
2017. Т. 53. № 2. C. 84–98.
Allen M.D., Neumann S., Gershengorn M.C. Occupancy of both sites on the
thyrotropin (TSH) receptor dimer is necessary for phosphoinositide signaling //
FASEB J. 2011. V. 25 (10). P. 3687–3694. doi: 10.1096/fj.11-188961.
375
Ando T., Latif R., Daniel S., Eguchi K., Davies T.F. Dissecting linear and
conformational epitopes on the native thyrotropin receptor // Endocrinology. 2004. V.
145 (11). P. 5185–5193. doi: 10.1210/en.2004-0789.
Baba A., Akaishi M., Shimada M., Monkawa T., Wakabayashi Y., Takahashi
M., Nagatomo Y., Yoshikawa T. Complete elimination of cardiodepressant IgG3
autoantibodies by immunoadsorption in patients with severe heart failure // Circ. J.
2010. V. 74 (7). Р. 1372–1378.
Bahn R.S., Dutton C.M., Natt N., Joba W., Spitzweg C., Heufelder A.E.
Thyrotropin receptor expression in Graves' orbital adipose/connective tissues:
potential autoantigen in Graves' ophthalmopathy // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1998.
V. 83 (3). P. 998–1002. doi: 10.1210/jcem.83.3.4676.
Bajic G., Degn S.E., Thiel S., Andersen G.R. Complement activation,
regulation, and molecular basis for complement-related diseases // EMBO J. 2015. V.
34 (22). P. 2735–2757. doi: 10.15252/embj.201591881.
Batenburg W.W., Garrelds I.M., Bernasconi C.C., Juillerat-Jeanneret L., van
Kats J.P., Saxena P.R., Danser A.H. Angiotensin II type 2 receptor-mediated
vasodilation in human coronary microarteries // Circulation. 2004. V. 109 (19). P.
2296–2301. doi: 10.1161/01.CIR.0000128696.12245.57.
Begriche K., Girardet C., McDonald P., Butler A.A. Melanocortin-3 receptors
and metabolic homeostasis // Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 2013. V. 114. P. 109–146.
doi: 10.1016/B978-0-12-386933-3.00004-2.
Becker M.O., Kill A., Kutsche M., Guenther J., Rose A., Tabeling C.,
Witzenrath M., Kühl A.A., Heidecke H., Ghofrani H.A., Tiede H., Schermuly R.T.,
Nickel N., Hoeper M.M., Lukitsch I., Gollasch M., Kuebler W.M., Bock S., Burmester
G.R., Dragun D., Riemekasten G. Vascular receptor autoantibodies in pulmonary
arterial hypertension associated with systemic sclerosis // Am. J. Respir. Crit. Care
Med. 2014. V. 190 (7). P. 808–817. doi: 10.1164/rccm.201403-0442OC.
Berg C.P., Blume K., Lauber K., Gregor M., Berg P.A., Wesselborg S., Stein
G.M. Autoantibodies to muscarinic acetylcholine receptors found in patients with
primary biliary cirrhosis // BMC Gastroenterol. 2010. V. 10. P. e120. doi:
10.1186/1471-230X-10-120.
Bobst S.M., Day M.C., Gilstrap L.C. 3rd, Xia Y., Kellems R.E. Maternal
autoantibodies from preeclamptic patients activate angiotensin receptors on human
mesangial cells and induce interleukin-6 and plasminogen activator inhibitor-1
secretion // Am. J. Hypertens. 2005. V. 18 (3). P. 330–336. doi:
10.1016/j.amjhyper.2004.10.002.
Bonney K.M., Gifford K.M., Taylor J.M., Chen C.I., Engman D.M. Cardiac
damage induced by immunization with heat-killed Trypanosoma cruzi is not antibody
mediated // Parasite Immunol. 2013. V. 35 (1). P. 1–10. doi: 10.1111/pim.12008.
Borda T., Perez Rivera R., Joensen L., Gomez R.M., Sterin-Borda L.
Antibodies against cerebral M1 cholinergic muscarinic receptor from schizophrenic
patients: molecular interaction // J. Immunol. 2002. V. 168 (7). P. 3667–3674. doi:
10.4049/jimmunol.168.7.3667.
376
Bornholz B., Roggenbuck D., Jahns R., Boege F. Diagnostic and therapeutic
aspects of β1-adrenergic receptor autoantibodies in human heart disease //
Autoimmun. Rev. 2014. V. 13 (9). P. 954–962. doi: 10.1016/j.autrev.2014.08.021.
Breidert M., Wördehoff S., Hansen A., Eftekhari P. Autoantibodies against
serotoninergic 5-HT4 receptor in patients with heart failure // Horm. Metab. Res.
2012. V. 44 (1). P. 70–74. doi: 10.1055/s-0031-1295474.
Buvall L., Bollano E., Chen J., Shultze W., Fu M. Phenotype of early
cardiomyopathic changes induced by active immunization of rats with a synthetic
peptide corresponding to the second extracellular loop of the human beta-adrenergic
receptor // Clin. Exp. Immunol. 2006. V. 143 (2). P. 209–215. doi: 10.1111/j.1365-
2249.2005.02986.x.
Caruso-Neves C., Kwon S.H., Guggino W.B. Albumin endocytosis in proximal
tubule cells is modulated by angiotensin II through an AT2 receptor-mediated protein
kinase B activation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102 (48). P. 17513–17518.
doi: 10.1073/pnas.0507255102.
Cho J.H., Feldman M. Heterogeneity of autoimmune diseases:
pathophysiologic insights from genetics and implications for new therapies // Nature
Med. 2015. V. 21 (7). P. 730–738. doi: 10.1038/nm.3897.
Dale R.C., Merheb V., Pillai S., Wang D., Cantrill L., Murphy T.K., Ben-Pazi
H., Varadkar S., Aumann T.D., Horne M.K., Church A.J., Fath T., Brilot F.
Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric
disorders // Brain. 2012. V. 135 (Pt. 11). P. 3453–3468. doi: 10.1093/brain/aws256.
Dandel M., Wallukat G., Englert A., Hetzer R. Immunoadsorption therapy for
dilated cardiomyopathy and pulmonary arterial hypertension // Atheroscler. Suppl.
2013. V. 14 (1). P. 203–211. doi: 10.1016/j.atherosclerosissup.2012.10.029.
Davies T.F., Latif R. Editorial: TSH Receptor and Autoimmunity // Front.
Dechend R., Viedt C., Müller D.N., Ugele B., Brandes R.P., Wallukat G., Park
J.K., Janke J., Barta P., Theuer J., Fiebeler A., Homuth V., Dietz R., Haller H.,
Kreuzer J., Luft F.C. AT1 receptor agonistic antibodies from preeclamptic patients
stimulate NADPH oxidase // Circulation. 2003. V. 107 (12). P. 1632–1639. doi:
10.1161/01.CIR.0000058200.90059.B1.
Derkach K., Zakharova I., Zorina I., Bakhtyukov A., Romanova I., Bayunova
L., Shpakov A. The evidence of metabolic-improving effect of metformin in Ay/a
mice with genetically-induced melanocortin obesity and the contribution of
hypothalamic mechanisms to this effect // PLOS One. 2019. V. 14 (3). P. e0213779.
doi: 10.1371/journal.pone.0213779.
Dörffel Y., Wallukat G., Bochnig N., Homuth V., Herberg M., Dörffel W.,
Pruss A., Chaoui R., Scholze J. Agonistic AT1 receptor autoantibodies and monocyte
stimulation in hypertensive patients // Am. J. Hypertens. 2003. V. 16 (10). P. 827–
833. doi: 10.1016/s0895-7061(03)00982-8.
377
Dragun D. The role of angiotensin II type 1 receptor-activating antibodies in
renal allograft vascular rejection // Pediatr. Nephrol. 2007. V. 22 (7). P. 911–914. doi:
10.1007/s00467-007-0452-z.
Dragun D., Müller D.N., Bräsen J.H., Fritsche L., Nieminen-Kelhä M.,
Dechend R., Kintscher U., Rudolph B., Hoebeke J., Eckert D., Mazak I., Plehm R.,
Schönemann C., Unger T., Budde K., Neumayer H.H., Luft F.C., Wallukat G.
Angiotensin II type 1-receptor activating antibodies in renal-allograft rejection // N.
Engl. J. Med. 2005. V. 352 (6). P. 558–569. doi: 10.1056/NEJMoa035717.
Eftekhari P., Roegel J.C., Lezoualc'h F., Fischmeister R., Imbs J.L., Hoebeke
J. Induction of neonatal lupus in pups of mice immunized with synthetic peptides
derived from amino acid sequences of the serotoninergic 5-HT4 receptor // Eur. J.
Immunol. 2001. V. 31 (2). P. 573–579. doi: 10.1002/1521-4141.
Felix S.B., Staudt A., Landsberger M., Grosse Y., Stangl V., Spielhagen T.,
Wallukat G., Wernecke K.D., Baumann G., Stangl K. Removal of cardiodepressant
antibodies in dilated cardiomyopathy by immunoadsorption // J. Am. Coll. Cardiol.
2002. V. 39 (4). P. 646–652. doi: 10.1016/s0735-1097(01)01794-6.
Fu L.X., Magnusson Y., Bergh C.H., Liljeqvist J.A., Waagstein F., Hjalmarson
A., Hoebeke J. Localization of a functional autoimmune epitope on the muscarinic
acetylcholine receptor-2 in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy // J. Clin.
Invest. 1993. V. 91 (5). P. 1964–1968. doi: 10.1172/JCI116416.
Fu M.L., Herlitz H., Schulze W., Wallukat G., Micke P., Eftekhari P., Sjögren
K.G., Hjalmarson A., Müller-Esterl W., Hoebeke J. Autoantibodies against the
angiotensin receptor (AT1) in patients with hypertension // J. Hypertens. 2000. V. 18
(7). P. 945–953.
Fu M.L., Herlitz H., Wallukat G., Hilme E., Hedner T., Hoebeke J.,
Hjalmarson A. Functional autoimmune epitope on α1-adrenergic receptors in patients
with malignant hypertension // Lancet. 1994. V. 344 (8938). P. 1660–1663. doi:
10.1016/s0140-6736(94)90456-1.
Fukuda Y., Miyoshi S., Tanimoto K., Oota K., Fujikura K., Iwata M., Baba A.,
Hagiwara Y., Yoshikawa T., Mitamura H., Ogawa S. Autoimmunity against the
second extracellular loop of β1-adrenergic receptors induces early afterdepolarization
and decreases in K-channel density in rabbits // J. Am. Coll. Cardiol. 2004. V. 43 (6).
P. 1090–1100. doi: 10.1016/j.jacc.2003.09.057.
Ginsberg J., von Westarp C. Clinical applications of assays for thyrotropin-
receptor antibodies in Graves' disease // CMAJ. 1986. V. 134 (10). P. 1141–1147.
Goin J.C., Borda E., Leiros C.P., Storino R., Sterin-Borda L. Identification of
antibodies with muscarinic cholinergic activity in human Chagas' disease:
pathological implications // J. Auton. Nerv. Syst. 1994. V. 47 (1-2). P. 45–52.
Hampe C.S. Protective role of anti-idiotypic antibodies in autoimmunity-
lessons for type 1 diabetes // Autoimmunity. 2012. V. 45 (4). P. 320–331. doi:
10.3109/08916934.2012.659299.
378
Herse F., LaMarca B. Angiotensin II type 1 receptor autoantibody (AT1-AA)-
mediated pregnancy hypertension // Am. J. Reprod. Immunol. 2013. V. 69 (4). P.
413–418. doi: 10.1111/aji.12072.
Hieble J.P. Subclassification and nomenclature of alpha- and beta-
adrenoceptors // Curr. Top. Med. Chem. 2007. V. 7. P. 129–134.
Higuchi S., Ohtsu H., Suzuki H., Shirai H., Frank G.D., Eguchi S. Angiotensin
II signal transduction through the AT1 receptor: novel insights into mechanisms and
pathophysiology // Clin. Sci. (Lond). 2007. V. 112 (8). P. 417–428. doi:
10.1042/CS20060342.
Hofbauer K.G., Lecourt A.C., Peter J.C. Antibodies as pharmacologic tools
for studies on the regulation of energy balance // Nutrition. 2008. V. 24 (9). P. 791–
797. doi: 10.1016/j.nut.2008.06.001.
Jahns R., Boivin V., Siegmund C., Inselmann G., Lohse M.J., Boege F.
Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with
reduced cardiac function in chronic heart failure // Circulation. 1999. V. 99 (9). P.
649–654. doi: 10.1016/j.nut.2008.06.001.
Jane-wit D., Altuntas C.Z., Johnson J.M., Yong S., Wickley P.J., Clark P.,
Wang Q., Popović Z.B., Penn M.S., Damron D.S., Perez D.M., Tuohy V.K. Beta1-
adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically
inducing cardiomyocyte apoptosis // Circulation. 2007. V. 116 (4). P. 399–410. doi:
10.1161/CIRCULATIONAHA.106.683193.
Jo M., Jung S.T. Engineering therapeutic antibodies targeting G-protein-
coupled receptors // Exp. Mol. Med. 2016. V. 48. P. e207. doi:
10.1038/emm.2015.105.
Kamel R., Eftekhari P., Clancy R., Buyon J.P., Hoebeke J. Autoantibodies
against the serotoninergic 5-HT4 receptor and congenital heart block: a reassessment
// J. Autoimmun. 2005. V. 25 (1). P. 72–76. doi: 10.1016/j.jaut.2005.04.005.
Karczewski P., Hempel P., Kunze R., Bimmler M. Agonistic autoantibodies to
the α1-adrenergic receptor and the β2-adrenergic receptor in Alzheimer's and vascular
dementia // Scand. J. Immunol. 2012. V. 75 (5). P. 524–530. doi: 10.1111/j.1365-
3083.2012.02684.x.
Karnik S.S., Unal H., Kemp J.R., Tirupula K.C., Eguchi S., Vanderheyden
P.M., Thomas W.G. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. XCIX.
Angiotensin receptors: Interpreters of pathophysiological angiotensinergic stimuli //
Pharmacol. Rev. 2015. V. 67 (4). P. 754–819. doi: 10.1124/pr.114.010454.
Kievit P., Halem H., Marks D. L., Dong J. Z., Glavas M. M., Sinnayah P.,
Pranger L., Cowley M. A., Grove K. L., Culler M. D. Chronic treatment with a
melanocortin-4 receptor agonist causes weight loss, reduces insulin resistance, and
improves cardiovascular function in diet-induced obese rhesus macaques // Diabetes.
2013. V. 62 (2). P. 490–497. doi: 10.2337/db12-0598.
Kim N., Shin Y., Choi S., Namkoong E., Kim M., Lee J., Song Y., Park K.
Effect of antimuscarinic autoantibodies in primary Sjögren's syndrome // J. Dent. Res.
2015. V. 94 (5). P. 722–728. doi: 10.1177/0022034515577813.
379
Kohr D., Singh P., Tschernatsch M., Kaps M., Pouokam E., Diener M.,
Kummer W., Birklein F., Vincent A., Goebel A., Wallukat G., Blaes F. Autoimmunity
against the β2 adrenergic receptor and muscarinic-2 receptor in complex regional pain
syndrome // Pain. 2011. V. 152 (12). P. 2690–2700. doi: 10.1016/j.pain.2011.06.012.
Koo N.Y., Li J., Hwang S.M., Choi S.Y., Lee S.J., Oh S.B., Kim J.S., Lee E.B.,
Song Y.W., Park K. Functional epitope of muscarinic type 3 receptor which interacts
with autoantibodies from Sjogren's syndrome patients // Rheumatology (Oxford).
2008. V. 47 (6). P. 828–833. doi: 10.1093/rheumatology/ken064.
Latif R., Michalek K., Davies T.F. Subunit interactions influence TSHR
multimerization // Mol. Endocrinol. 2010. V. 24 (10). P. 2009–2018. doi:
10.1210/me.2010-0001.
Li H., Kem D.C., Reim S., Khan M., Vanderlinde-Wood M., Zillner C., Collier
D., Liles C., Hill M.A., Cunningham M.W., Aston C.E., Yu X. Agonistic autoantibodies
as vasodilators in orthostatic hypotension: a new mechanism // Hypertension. 2012.
V. 59 (2). P. 402–408. doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.111.184937.
Li H., Kem D.C., Zhang L., Huang B., Liles C., Benbrook A., Gali H., Veitla
V., Scherlag B.J., Cunningham M.W., Yu X. Novel retro-inverso peptide inhibitor
reverses angiotensin receptor autoantibody-induced hypertension in the rabbit //
Hypertension. 2015. V. 65 (4). P. 793–799. doi:
10.1161/HYPERTENSIONAHA.114.05037.
Li H., Yu X., Liles C., Khan M., Vanderlinde-Wood M., Galloway A., Zillner
C., Benbrook A., Reim S., Collier D., Hill M.A., Raj S.R., Okamoto L.E., Cunningham
M.W., Aston C.E., Kem D.C. Autoimmune basis for postural tachycardia syndrome //
J. Am. Heart Assoc. 2014. V. 3. P. e000755. doi: 10.1161/JAHA.113.000755.
Li H., Zuccolo J., Kem D.C., Zillner C., Lee J., Smith K., James J.A.,
Cunningham M.W., Yu X. Implications of a vasodilatory human monoclonal
autoantibody in postural hypotension // J. Biol. Chem. 2013. V. 288 (42). P. 30734–
30741. doi: 10.1074/jbc.M113.477869.
Liles C., Li H., Veitla V., Liles J.T., Murphy T.A., Cunningham M.W., Yu X.,
Kem D.C. AT2R autoantibodies block angiotensin II and AT1R autoantibody-induced
vasoconstriction // Hypertension. 2015. V. 66 (4). P. 830–835. doi:
Loebel M., Grabowski P., Heidecke H., Bauer S., Hanitsch L.G., Wittke K.,
Meisel C., Reinke P., Volk H.D., Fluge Ø., Mella O., Scheibenbogen C. Antibodies to
β adrenergic and muscarinic cholinergic receptors in patients with Chronic Fatigue
Syndrome // Brain Behav. Immun. 2016. V. 52. P. 32–39. doi:
10.1016/j.bbi.2015.09.013.
Luther H.P., Homuth V., Wallukat G. Alpha1-adrenergic receptor antibodies
in patients with primary hypertension // Hypertension. 1997. V. 29. P. 678–682.
Mahler E., Hoebeke J., Levin M.J. Structural and functional complexity of the
humoral response against the Trypanosoma cruzi ribosomal P2β protein in patients
with chronic Chagas' heart disease // Clin. Exp. Immunol. 2004. V. 136 (3). P. 527–
534. doi: 10.1111/j.1365-2249.2004.02480.x.
380
Mandac J.C., Chaudhry S., Sherman K.E., Tomer Y. The clinical and
physiological spectrum of interferon-α induced thyroiditis: toward a new
classification // Hepatology. 2006. V. 43 (4). P. 661–672. doi: 10.1002/hep.21146.
McLachlan S.M., Rapoport B. Thyrotropin-blocking autoantibodies and
thyroid-stimulating autoantibodies: potential mechanisms involved in the pendulum
swinging from hypothyroidism to hyperthyroidism or vice versa // Thyroid. 2013. V.
23 (1). P. 14–24. doi: 10.1089/thy.2012.0374.
Mijares A., Lesbesgue D., Wallukat G., Hoebeke J. From agonist to
antagonist: Fab fragments of an agonist-like monoclonal anti-β2-adrenoceptor
antibody behave as antagonist // Mol. Pharmacol. 2000. V. 58 (2). P. 373–379. doi:
10.1124/mol.58.2.373.
Morshed S.A., Ando T., Latif R., Davies T.F. Neutral antibodies to the TSH
receptor are present in Graves' disease and regulate selective signaling cascades //
Endocrinology. 2010. V. 151 (11). P. 5537–5549. doi: 10.1210/en.2010-0424.
Münch G., Boivin-Jahns V., Holthoff H.P., Adler K., Lappo M., Truöl S.,
Degen H., Steiger N., Lohse M.J., Jahns R., Ungerer M. Administration of the cyclic
peptide COR-1 in humans (phase I study): ex vivo measurements of anti-β1-
adrenergic receptor antibody neutralization and of immune parameters // Eur. J. Heart
Fail. 2012. V. 14 (11). P. 1230–1239. doi: 10.1093/eurjhf/hfs118.
Murphy T.J., Alexander R.W., Griendling K.K., Runge M.S., Bernstein K.E.
Isolation of a cDNA encoding the vascular type-1 angiotensin II receptor // Nature.
1991. V. 351 (6323). P. 233–236. doi: 10.1038/351233a0.
Núñez Miguel R., Sanders J., Sanders P., Young S., Clark J., Kabelis K.,
Wilmot J., Evans M., Roberts E., Hu X., Furmaniak J., Rees Smith B. Similarities and
differences in interactions of thyroid stimulating and blocking autoantibodies with the
TSH receptor // J. Mol. Endocrinol. 2012. V. 49 (2). P. 137–151. doi: 10.1530/JME-
12-0040.
Okruhlicova L., Morwinski R., Schulze W., Bartel S., Weismann P., Tribulova
N., Wallukat G. Autoantibodies against G-protein-coupled receptors modulate heart
mast cells // Cell. Mol. Immunol. 2007. V. 4 (2). P. 127–133.
Peter J.C., Bekel A., Lecourt A.C., Zipfel G., Eftekhari P., Nesslinger M.,
Breidert M., Muller S., Kessler L., Hofbauer K.G. Anti-melanocortin-4 receptor
autoantibodies in obesity // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2009. V. 94 (3). P. 793–800.
doi: 10.1210/jc.2008-1749.
Peter J.C., Nicholson J.R., Heydet D., Lecourt A.C., Hoebeke J., Hofbauer
K.G. Antibodies against the melanocortin-4 receptor act as inverse agonists in vitro
and in vivo // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2007. V. 292 (6). P.
R2151–R2158. doi: 0.1152/ajpregu.00878.2006.
Peter J.C., Zipfel G., Lecourt A.C., Bekel A., Hofbauer K.G. Antibodies raised
against different extracellular loops of the melanocortin-3 receptor affect energy
balance and autonomic function in rats // J. Recept. Signal. Transduct. Res. 2010. V.
30 (6). P. 444–453. doi: 10.3109/10799893.2010.534485.
381
Renquist B. J., Lippert R. N., Sebag J. A., Ellacott K. L., Cone R. D.
Physiological roles of the melanocortin MC3 receptor // Eur. J. Pharmacol. 2011. V.
660 (1). P. 13–20. doi: 10.1016/j.ejphar.2010.12.025.
Romanova I.V., Derkach K.V., Mikhrina A.L., Sukhov I.B., Mikhailova E.V.,
Shpakov A.O. The leptin, dopamine and serotonin receptors in hypothalamic POMC-
neurons in normal and obese rodents // Neurochemical Research. 2018. V. 43 (4). P.
821–837. doi: 10.1007/s11064-018-2485-z.
Root-Bernstein R. Antigenic complementarity in the induction of
autoimmunity: a general theory and review // Autoimmun. Rev. 2007. V. 6 (5). P.
272–277. doi: 10.1016/j.autrev.2006.09.003.
Sherer Y., Shoenfeld Y. The idiotypic network in antinuclear-antibody-
associated diseases // Int. Arch. Allergy Immunol. 2000. V. 123 (1). P. 10–15. doi:
10.1159/000024419.
Shpakov A., Chistyakova O., Derkach K., Bondareva V. Hormonal signaling
systems of the brain in diabetes mellitus / In: Neurodegenerative diseases —
processes, prevention, protection and monitoring (Ed. by R.C.-C. Chang). Rijeka,
Croatia: Intech Open Access Publ. 2011. P. 349–386.
Shpakov A.O., Derkach K.V. The functional state of hormone-sensitive
adenylyl cyclase signaling system in diabetes mellitus // J. Signal Transduction. 2013.
V. 2013. P. 594213. http://dx.doi.org/10.1155/2013/594213.
Shpakov A.O., Derkach K.V., Berstein L.M. Brain signaling systems in the
type 2 diabetes and metabolic syndrome: promising target to treat and prevent these
diseases // Future Science OA (FSO). 2015. V. 1 (3). FSO25. doi: 10.4155/fso.15.23.
Siddiqui A.H., Irani R.A., Blackwell S.C., Ramin S.M., Kellems R.E., Xia Y.
Angiotensin receptor agonistic autoantibody is highly prevalent in preeclampsia:
correlation with disease severity // Hypertension. 2010. V. 55 (2). P. 386–393. doi:
Smulski C., Labovsky V., Levy G., Hontebeyrie M., Hoebeke J., Levin M.J.
Structural basis of the cross-reaction between an antibody to the Trypanosoma cruzi
ribosomal P2β protein and the human β1 adrenergic receptor // FASEB J. 2006. V. 20
(9). P. 1396–1406. doi: 10.1096/fj.05-5699com.
Staudt A., Eichler P., Trimpert C., Felic S.B., Greinacher A. Fcγ receptor IIa
on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy
// J. Am. Coll. Cardiol. 2007. V. 49 (16). P. 1684–1692. doi:
10.1016/j.jacc.2006.11.051.
Stavrakis S., Yu X., Patterson E., Huang S., Hamlett S.R., Chalmers L., Pappy
R., Cunningham M.W., Morshed S.A., Davies T.F., Lazzara R., Kem D.C. Activating
autoantibodies to the β1 adrenergic and m2 muscarinic receptors facilitate atria
fibrillation in patients with Graves' hyperthyroidism // J. Am. Coll. Cardiol. 2009. V.
54 (14). P. 1309–1316. doi: 10.1016/j.jacc.2009.07.015.
Stefan M., Wei C., Lombardi A., Li C.W., Concepcion E.S., Inabnet W.B. 3rd,
Owen R., Zhang W., Tomer Y. Genetic-epigenetic dysregulation of thymic TSH
382
receptor gene expression triggers thyroid autoimmunity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2014. V. 111 (34). P. 12562–12567. doi: 10.1073/pnas.1408821111.
Tanaka S., Matsunaga H., Kimura M., Tatsumi K., Hidaka Y., Takano T.,
Uema T., Takeda M., Amino N. Autoantibodies against four kinds of neurotransmitter
receptors in psychiatric disorders // J. Neuroimmunol. 2003. V. 141 (1-2). P. 155–164.
Todd R.D., Ciaranello R.D. Demonstration of inter- and intraspecies
differences in serotonin binding sites by antibodies from an autistic child // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 1985. V. 82 (2). P. 612–616. doi: 10.1073/pnas.82.2.612.
Tomer Y., Huber A. The etiology of autoimmune thyroid disease: a story of
genes and environment // J. Autoimmun. 2009. V. 32 (3-4). P. 231–239. doi:
10.1016/j.jaut.2009.02.007.
Tsuboi H., Ohira H., Asashima H., Tsuzuki S., Iizuka M., Matsuo N., Kondo
Y., Matsumoto I., Sumida T. Anti-M3 muscarinic acetylcholine receptor antibodies in
patients with primary biliary cirrhosis // Hepatol. Res. 2014. V. 44 (14). P. E471–
E479. doi: 10.1111/hepr.12346.
M., Smits G., Vassart G., Costagliola S. Glycoprotein hormone receptors: link
between receptor homodimerization and negative cooperativity // EMBO J. 2005. V.
24 (11). P. 1954–1964. doi: 10.1038/sj.emboj.7600686.
Verdot L., Garreau B., Barthelemy C., Martineau J., Ferrer-Di-Martino M.,
Muh J.P., Hoebeke J. Immunoreactivity of sera to a peptide derived from the
serotonin 5-HT1A receptor in a group of children with developmental disorders:
possible role in non-autistic epilepsy // Int. J. Mol. Med. 1998. V. 1 (1). P. 185–189.
doi: 10.3892/ijmm.1.1.185.
Wallukat G., Homuth V., Fischer T., Lindschau C., Horstkamp B., Jüpner A.,
Baur E., Nissen E., Vetter K., Neichel D., Dudenhausen J.W., Haller H., Luft F.C.
Patients with preeclampsia develop agonistic autoantibodies against the angiotensin
AT1 receptor // J. Clin. Invest. 1999. V. 103 (7). P. 945–952. doi: 10.1172/JCI4106.
Wallukat G., Müller J., Hetzer R. Specific removal of β1-adrenergic
autoantibodies from patients with idiopathic dilated cardiomyopathy // N. Engl. J.
Med. 2002. V. 347 (22). P. 1806. doi: 10.1056/NEJM200211283472220.
Walther T., Wallukat G., Jank A., Bartel S., Schultheiss H.P., Faber R., Stepan
H. Angiotensin II type 1 receptor agonistic antibodies reflect fundamental alterations
in the uteroplacental vasculature // Hypertension. 2005. V. 46 (6). P. 1275–1279. doi:
10.1161/01.HYP.0000190040.66563.04.
Wang H., Han H., Zhang L., Shi H., Schram G., Nattel S., Wang Z. Expression
of multiple subtypes of muscarinic receptors and cellular distribution in the human
heart // Mol. Pharmacol. 2001. V. 59 (5). P. 1029–1036. doi: 10.1124/mol.59.5.1029.
Wenzel K., Haase H., Wallukat G., Derer W., Bartel S., Homuth V., Herse F.,
Hubner N., Schulz H., Janczikowski M., Lindschau C., Schroeder C., Verlohren S.,
383
Morano I., Muller D.N., Luft F.C., Dietz R., Dechend R., Karczewski P. Potential
relevance of α1-adrenergic receptor autoantibodies in refractory hypertension // PLoS
One. 2008. V. 3. P. e3742. doi: 10.1371/journal. pone.0003742.
Xia Y., Kellems R.E. Receptor-activating autoantibodies and disease:
preeclampsia and beyond // Expert Rev. Clin. Immunol. 2011. V. 7 (5). P. 659–674.
doi: 10.1586/eci.11.56.
Xia Y., Kellems R.E. Angiotensin receptor agonistic autoantibodies and
hypertension: preeclampsia and beyond // Circ. Res. 2013 (1). V. 113. P. 78–87. doi:
10.1161/CIRCRESAHA.113.300752.
Xia Y., Wen H., Bobst S., Day M.C., Kellems R.E. Maternal autoantibodies
from preeclamptic patients activate angiotensin receptors on human trophoblast cells
// J. Soc. Gynecol. Investig. 2003. V. 10 (2). P. 82–93.
Yuwiler A., Shih J.C., Chen C.H., Ritvo E.R., Hanna G., Ellison G.W., King
B.H. Hyperserotoninemia and antiserotonin antibodies in autism and other disorders //
J. Autism Dev. Disord. 1992. V. 22 (1). P. 33–45.
384
ГЛАВА 8
Пепдуцины – производные
цитоплазматических петель GPCR – и их
применение в медицине
Как отмечалось в Главе 1, функциональные

взаимодействия между рецепторами, сопряженными с G-белками
(GPCR), и нижележащими гетеротримерными G-белками и β-
аррестинами осуществляются через посредство различных по
локализации и протяженности участков цитоплазматических
петель (ЦП) рецепторов и их интерфейсов с трансмембранными
спиралями (ТМС). В большинстве GPCR основную роль во
взаимодействии с G-белками играют вторая и третья ЦП, в
которых локализованы как G-белок-связывающий, так и G-белок-
активирующий сайты рецептора, в то время как за
взаимодействие с β-аррестинами отвечают, в основном, третья
ЦП и различные сегменты расположенного в
цитоплазматическом пространстве C-концевого домена. После
связывания лиганда с GPCR конформация цитоплазматических
участков и их конгломератов меняется, что приводит к
изменению доступности локализованных в ЦП и С-концевом
домене сайтов, ответственных за связывание и активацию G-
белков и β-аррестинов. Результатом этого является специфичная
GPCR-опосредуемая активация внутриклеточных сигнальных
каскадов, которые включают различные ферменты-генераторы
вторичных посредников, в том числе аденилатциклазу (АЦ),
фосфоинозитид-специфичную фосфолипазу Сβ (ФЛСβ),
фосфатидилинозитол-3-киназу (ФИ-3-К), митогенактивируемые
385
протеинкиназы (МАПК), а также различные классы G-белок-
регулируемых ионных каналов.
В начале 1990-х годов было обнаружено, что
синтетические пептиды, соответствующие функционально
важным участкам, локализованным в ЦП GPCR (далее – GPCR-
пептиды), способны in vitro влиять на функциональную
активность рецепторов и регулируемых через них сигнальных
каскадов (Palm et al., 1989; Munch et al., 1991; Hedin et al., 1993;
Konig, Gratzel, 1994). Было показано, что биологическая
активность GPCR-пептидов, являющихся производными
первичной структуры ЦП рецепторов, зависит от целостности G-
белок-активирующего сайта, а также от сходства трехмерной
структуры GPCR-пептида и гомологичной ему области в
полноразмерном рецепторе. Поскольку G-белок-связывающий и
G-белок-активирующий сайты расположены, в основном, в
проксимальных к мембране сегментах ЦП и С-концевого домена
рецептора, то конформация этих сайтов в полноразмерном GPCR
в значительной степени стабилизируется соседними с ними
гидрофобными ТМС. В связи с этим имеются все основания
ожидать, что модификация GPCR-пептидов с помощью
сегментов ТМС или гидрофобных радикалов, имитирующих ТМ,
способна в значительной степени повысить эффективность и
селективность их действия. В последние годы это предположение
получило множество доказательств в ходе структурных и
функциональных исследований GPCR-пептидов,
модифицированных сегментами ТМС, которые по длине
соответствуют примерно двум третям TMС рецепторов, или
жирнокислотными радикалами, которые по физико-химическим
свойствам и, в первую очередь, по гидрофобности сходны с ТМС
(Covic et al., 2002a, 2002b, 2007; Kubo et al., 2006; Shpakov et al.,
2007, 2010, 2012a; Agarwal et al., 2010; O'Callaghan et al., 2012;
Derkach et al., 2015; Zhang et al., 2015; Gurbel et al., 2016; Covic,
Kuliopulos, 2018).
Липофильные производные GPCR-пептидов были
впервые синтезированы и изучены группой Athan Kuliopulos в
386
2002 году и названы пепдуцинами (Covic et al., 2002a, 2002b).
При изучении распределения пепдуцинов в клетках было
установлено, что они способны эффективно проникать через
липидный бислой плазматической мембраны и
взаимодействовать с различными классами внутриклеточных
белков, в первую очередь с гомологичными им GPCR. Это
позволяет использовать их не только в условиях in vitro, но и в
качестве фармакологических препаратов (Tressel et al., 2011; Tsuji
et al., 2013; Zhang et al., 2015; Gurbel et al., 2016; Covic, Kuliopulos,
2018). Способность легко преодолевать плазматическую
мембрану приводит к тому, что регуляторное действие
пепдуцинов на GPCR-зависимые сигнальные каскады
осуществляется при их более низких концентрациях в сравнении
с немодифицированными GPCR-пептидами. Важно отметить, что
липофильная часть молекулы пепдуцинов позволяет им прочно
заякориваться в плазматической мембране, что значительно
повышает их концентрацию вблизи GPCR и других
ассоциированных с мембраной сигнальных белков.
Наиболее значительным достижением в исследовании
GPCR-пептидов, которое во многом предопределило
современные подходы к их разработке и практическому
применению, является создание модели специфического
взаимодействия GPCR-пептидов с комплементарными им
участками гомологичного рецептора после проникновения
GPCR-пептидов внутрь клетки-мишени (Covic et al., 2002a; Kubo
et al., 2006; Shpakov, Shpakova, 2011; Tressel et al., 2011; Zhang et
al., 2015; Covic, Kuliopulos, 2018; Grisanti et al., 2018). При этом,
однако, нельзя исключить взаимодействия GPCR-пептида с
комплементарными участками, локализованными в
цитоплазматических участках негомологичного рецептора,
который образует гетероолигомерный комплекс с рецептором,
гомологичным пептиду (Shpakov, Shpakova, 2011). Таким
образом, действие GPCR-пептидов может быть реализовано
только в присутствии гомологичного рецептора или его гомо-
или гетероолигомерных комплексов и, как следствие,
387
характеризуется отчетливо выраженной рецепторной и тканевой
специфичностью (Covic et al., 2002a, 2002b, 2007; Shpakov et al.,
2007, 2010, 2012a; Tchernychev et al., 2010; Cisowski et al., 2011;
Janz et al., 2011; Forsman et al., 2012; Jamieson et al., 2012; Derkach
et al., 2015; Zhang et al., 2015; Gurbel et al., 2016; Covic, Kuliopulos,
2018). Специфичность и селективность регуляторного действия
GPCR-пептидов, являющихся производными ЦП и С-концевого
домена, на активность G-белков и внутриклеточных сигнальных
каскадов в условиях in vivo открывают новые перспективные
направления в создании на их основе регуляторов гормональных
сигнальных систем. Следует отметить, что пептиды –
производные первичной структуры TMС рецепторов – также
демонстрируют высокую биологическую активность in vitro и in
vivo (Shpakov, Shpakova, 2014). Они способны встраиваться в
липидный матрикс плазматической мембраны и специфично
взаимодействовать с комплементарными к участкам ТМС
гомологичного рецептора, меняя конформацию
трансмембранного домена GPCR и, как следствие, влияя на
процесс передачи через него гормонального сигнала (George et
al., 2003; Naider et al., 2005; Lee et al., 2009).
8.1. Молекулярные механизмы действия GPCR-

пептидов
В настоящее время рассматриваются два основных

молекулярных механизма действия GPCR-пептидов и их
липофильных производных, пепдуцинов, на G-белки и
внутриклеточные сигнальные каскады в целом (Covic et al.,
2002a, 2002b, 2007; Shpakov, Shpakova, 2011; Miller et al., 2009;
Tressel et al., 2011; Carr et al., 2014, 2016; Zhang et al., 2015; Covic,
Kuliopulos, 2018; Grisanti et al., 2018).
В соответствии с первым механизмом, который
предложен группой Athan Kuliopulos, GPCR-пептид,
соответствующий функционально важным для взаимодействия с
G-белками и(или) β-аррестинами участкам ЦП рецептора,
388
специфично взаимодействует с внутриклеточными
аллостерическими сайтами, сформированными ЦП рецептора и
цитоплазматическим входом в трансмембранный домен GPCR
(рис. 8-1). Предполагается, что GPCR-пептид способен
связываться со стимулирующим активность рецептора
аллостерическим сайтом и функционирует в этом случае как
полный агонист, стабилизируя или индуцируя активное
состояние GPCR, в том числе и в отсутствие лигандов
ортостерического сайта. Это обеспечивает эффективное
взаимодействие GPCR с нижележащими G-белками и β-
аррестинами (Covic et al., 2002a, 2002b). GPCR-пептид может
функционировать, как инверсионный агонист, связываясь с
аллостерическим сайтом, который наделен ингибирующими
свойствами, или как нейтральный антагонист, блокируя
стимулирующий аллостерический сайт. Это, в конечном итоге,
приводит к подавлению стимулированной агонистом активности
GPCR или снижает его базальную активность, предотвращая
передачу гормонального сигнала с рецептора на G-белки и β-
аррестины.
Независимо от характера активности GPCR-пептида, он
специфично взаимодействует с комплементарными участками
гомологичного ему рецептора, которые в полноразмерном GPCR
контактируют с тем участком, которому структурно
соответствует GPCR-пептид (рис. 8-1). Предполагают также, что
GPCR-пептиды способны влиять на комплексообразование
(димеризацию или олигомеризацию) GPCR, что во многих
случаях объясняет их специфическую биологическую активность
(Miller et al., 2009; Tressel et al., 2011; Zhang et al., 2015; Covic,
Kuliopulos, 2018).
В основе второго механизма действия GPCR-пептидов
лежит их способность непосредственно взаимодействовать с α-
субъединицей G-белка и влиять, тем самым, на функциональную
активность и сигнальные свойства G-белка и его комплекса с
GPCR (рис. 8-1).
389
Рис. 8-1. Молекулярные механизмы действия пепдуцинов – GPCR-

пептидов, модифицированных гидрофобными радикалами.
Специфическое взаимодействие GPCR-пептида (изолированный
светло-серый сегмент) с комплементарной ему черной областью
третьей ЦП, гомологичной GPCR-пептиду, приводит: 1) к нарушению
внутримолекулярного взаимодействия между светло-серым участком в
третьей ЦП GPCR с комплементарным ему черным сегментом; 2) к
изменению конформации комплементарной GPCR-пептиду области
рецептора, взаимодействующей с α-субъединицей G-белка; 3) к
стимуляции или, напротив, к ингибированию активности α-
субъединицы G-белка и нижележащих эффекторных ферментов.
Кружочком обозначен лиганд ортостерического сайта в
трансмембранном домене рецептора.
Основными мишенями GPCR-пептидов в случае

реализации второго механизма являются небольшой C-концевой
участок Gα-субъединицы, ответственный за селективное
взаимодействие различных типов G-белков с лиганд-
активированным GPCR, а также α4-спираль и α4/β6-петля,
локализованные вблизи этого участка, которые вовлечены в
390
функциональное взаимодействие рецептора с Gα-субъединицей,
например, с Gαi/o-субъединицей, и определяют специфичность
такого взаимодействия (Johnston, Siderovski, 2007).
Синтетические пептиды, соответствующие С-концевому
сегменту Gα-субъединиц, избирательно снижают регуляторные
эффекты GPCR-пептидов на активность G-белков и
опосредуемые ими сигнальные каскады (Nanoff et al., 2006;
Shpakov et al., 2007). Это свидетельствует о возможности
непосредственного взаимодействия между GPCR-пептидом и С-
концевым сегментом Gα-субъединицы. Для GPCR-пептидов,
соответствующих по первичной структуре третьим ЦП m2- и m3-
мускариновых рецепторов, показана их способность
взаимодействовать также с β-субъединицами G-белков (Wu et al.,
2000).
Ведущую роль во взаимодействии между GPCR-
пептидами и субъединицами G-белков отводят
электростатическим контактам между положительно
заряженными аминокислотными остатками GPCR-пептидов,
которые обычно имеют суммарный положительный заряд, и
отрицательно заряженными сегментами Gα- и Gβ-субъединиц.
Следует отметить, что электростатические взаимодействия также
ответственны за функциональное сопряжение между
полноразмерным рецептором и G-белками (Vahlberg et al., 2006;
Chakraborty et al., 2013). При этом положительно заряженные
аминокислотные остатки, расположенные в проксимальных к
мембране цитоплазматических участках GPCR, наиболее важны
для взаимодействия рецепторов с Gi/o- и Gq/11-белками, но менее
критичны для сопряжения GPCR с Gs-белками. Так эффективное
взаимодействие между положительно заряженными GPCR-
пептидами и Gi/o-белками продемонстрировано с помощью
эффективного связывания Gi/o-белков с сорбентом, к которому
были пришиты GPCR-пептиды – производные второй и третьей
ЦП Gi/o-сопряженного α2-адренергического рецептора (Vahlberg
et al., 2006; Balau et al., 2007).
391
В пользу прямого взаимодействия обогащенных
положительно заряженными аминокислотами GPCR-пептидов с
G-белками свидетельствуют полученные нами и другими
авторами данные о способности синтетических поликатионных
пептидов с регулярной структурой, пептидных токсинов
насекомых, некоторых пептидных гормонов позвоночных и
беспозвоночных животных и пептидных аутоиндукторов
бактерий, активировать и модулировать различные типы G-
белков, в первую очередь Gi/o-белки. Важно отметить, что по
первичной структуре эти пептиды не имеют заметной гомологии
с цитоплазматическими участками GPCR, но при этом сходны с
ними по распределению положительно заряженных
аминокислотных остатков и по способности образовывать
амфипатические α-спиральные структуры (Mousli et al., 1989;
Higashijima et al., 1990; Fukushima et al., 1998; Breitweg-Lehmann
et al., 2002; Шпаков и др., 2004, 2008; Mukai et al., 2008; Shpakov,
2009). Поскольку эти поликатионые пептиды не имеют
гомологии с определенными типами рецепторов, то их действие
на G-белок-зависимые сигнальные каскады клетки не является
избирательным, и они способны влиять на широкий спектр таких
каскадов, вызывая низкоспецифичные физиологические и
биохимические ответы. Результатом этого могут стать
нежелательные побочные эффекты и высокая токсичность
поликатионных пептидов. Вследствие этого, поликатионные
пептиды, не специфичные по отношению к определенному типу
GPCR, не представляют большого интереса, как
фармакологические препараты, и рассматриваются в основном
как транспортеры других биологически активных молекул внутрь
клетки.
Большое значение для эффективного взаимодействия с
GPCR имеет пространственная структура GPCR-пептида, а
именно ее соответствие таковой в гомологичном пептиду участке
полноразмерного рецептора. Это предопределяет способность
GPCR-пептида прочно фиксироваться в проксимальных к
мембране субдоменах GPCR и с высоким сродством связываться
392
с комплементарными участками ЦП рецептора. Одними из
подходов, которые используются для оптимизации структуры
GPCR-пептидов, являются: (1) их циклизация, позволяющая
имитировать пространственную структуру соответствующих
пептидам ЦП рецептора, (2) смещение и расширение границ
аминокислотной последовательности GPCR-пептидов,
позволяющее включить в их состав функциональные и
структурные детерминанты, необходимые для проявления ими
специфической активности, а также (3) модификация пептидов
липофильными радикалами (фрагментами ТМС,
жирнокислотными остатками), что обеспечивает их эффективное
взаимодействие с цитоплазматическим входом в гидрофобный
трансмембранный домен GPCR. Иллюстрацией этого являются
циклический пептид, производный третьей ЦП V2-
вазопрессинового рецептора, линейные пептиды,
соответствующие третьей ЦП соматостатиновых рецепторов 1-го
и 2-го типов, а также многочисленные липофильные производные
GPCR-пептидов (пепдуцины) (Granier et al., 2004; Shpakov,
Shpakova, 2011; Shpakova, Shpakov, 2011). В этой связи
необходимо подчеркнуть, что наиболее значимой модификацией,
которая критически влияет как на эффективность, так и на
селективность GPCR-пептидов является модификация их
гидрофобными радикалами, поскольку в подавляющем
большинстве случаев модифицированные таким образом
пептиды (пепдуцины) существенно превосходят по своей
активности немодифицированные аналоги (Covic et al., 2002a,
2002b; Shpakov et al., 2007, 2010, 2012a; O'Callaghan et al., 2012;
Derkach et al., 2015; Zhang et al., 2015; Gurbel et al., 2016; Covic,
Kuliopulos, 2018).
8.2. GPCR-пептиды как селективные регуляторы

сигнальной трансдукции
Еще тридцать лет назад были получены первые данные,

демонстрирующие, что синтетические пептиды,
393
соответствующие ЦП Gs-сопряженных адренергических и
дофаминовых рецепторов, способны специфично стимулировать
активность фермента АЦ и регулировать трансдукцию
гормонального сигнала, осуществляемую через эти рецепторы
(Palm et al., 1989; Munch et al., 1991; Hedin et al., 1993; Konig,
Gratzel, 1994). В дальнейшем были получены многочисленные
свидетельства того, что синтетические пептиды, являющиеся
производными первичной структуры цитоплазматических
участков различных типов GPCR, включая рецепторы биогенных
аминов, полипептидных и белковых гормонов, простагландинов,
жирных кислот и каннабиноидов, также обладают специфической
биологической активностью и способны регулировать и
модулировать внутриклеточные сигнальные каскады,
функционируя как внутриклеточные полные агонисты,
инверсионные агонисты и нейтральные антагонисты (Wess, 1997;
Shpakov, Pertseva, 2007; Miller et al., 2009; Shpakov, 2010, 2011;
Tressel et al., 2011; Derkach et al., 2015; Zhang et al., 2015; Gurbel et
al., 2016; Covic, Kuliopulos, 2018).
Действие GPCR-пептидов характеризуется
специфичностью: (1) в отношении гомологичных им рецепторов
или их комплексов с другими GPCR, (2) в отношении
определенных типов G-белков или β-аррестинов, а также (3) в
отношении различных типов клеток и тканей. Тканевая и
клеточная специфичность действия GPCR-пептидов определяется
уровнем экспрессии и функциональной активностью
гомологичного им рецептора в том или ином типе ткани или
популяции клеток.
Специфичность GPCR-пептидов по отношению к
рецепторам – производными первичной структуры ЦП которых
они являются – доказана большим числом экспериментальных
работ при изучении множества различающихся по своей
структурно-функциональной организации GPCR-пептидов и
гомологичных им рецепторов (Megaritis et al., 2000;
Mukhopadhyay, Howlett, 2001; Bavec et al., 2003; Licht et al., 2003;
Zhang et al., 2006; Shpakov et al., 2010, 2012a, 2012b, 2012c;
394
Shpakov, Shpakova, 2011; O'Callaghan et al., 2012; Derkach et al.,
2015; Zhang et al., 2015; Gurbel et al., 2016; Covic, Kuliopulos,
2018).
Нами установлено, что пептид KHSRKALKASL258–268 и
его модифицированный с C-конца пальмитоилированный аналог,
соответствующие по первичной структуре третьей ЦП Gs-
сопряженного серотонинового рецептора 6-го типа (5-HT6),
ингибируют стимулирующий эффект селективного 5-HT6-
агониста EMD-386088 на активность АЦ и ГТФ-связывающую
способность Gs-белков во фракциях плазматических мембран
мозга крысы, но не влияют на регуляторные эффекты агонистов
других типов серотониновых рецепторов (Shpakov et al., 2010).
Пептиды 306–316 и 300–316, соответствующие участкам третьей
ЦП Gi/o-сопряженного серотонинового рецептора 1B-подтипа (5-
HT1B), дозозависимо снижали как ингибирующее действие
серотонина на активность АЦ, так и соответствующие эффекты
агонистов 5-HT1-серотониновых рецепторов, в первую очередь
селективного 5-HT1B-агониста 5-нонилокситриптамина. Наряду с
этим, пептиды, производные 5-HT1B-серотонинового рецептора,
препятствовали стимуляции серотонином и 5-
нонилокситриптамином ГТФ-связывающей активности Gi/o-
белков. При этом они не влияли на ингибирующие АЦ эффекты
других гормонов и стимуляцию ими ГТФ-связывания Gi/o-белков
(Shpakov et al., 2012c). Установлено, что пептид,
соответствующий второй ЦП рецептора сфингозин-1-фосфата
(S1PR) 3-го типа, вызывал интернализацию гомологичного ему
рецептора, но при этом не влиял на функциональную активность
и интернализацию S1PR 1-го типа, несмотря на то, что оба типа
S1PR обладали значительным структурным и функциональным
сходством (Licht et al., 2003). Липофильные производные
пептидов, соответствующих ЦП протеаза-активируемых
рецепторов (protease-activated receptors, PAR), хемокиновых
рецепторов, релаксинового рецептора 1-го типа (RXFP1),
рецепторов лютеинизирующего (ЛГ) и тиреотропного гормонов
(ТТГ), также демонстрировали высокую рецепторную
395
специфичность (Covic et al., 2002a, 2002b; Shpakov et al., 2007,
2011; O'Callaghan et al., 2012; Derkach et al., 2015).
Установлено, что GPCR-пептиды селективно активируют
определенные типы G-белков, которые функционально
сопряжены с гомологичным им рецептором. Показано, что
пептиды, соответствующие участкам 301–317 и 329–344 третьей
ЦП CB1-каннабиноидного рецептора, специфично блокируют его
функциональное взаимодействие с Gi1- и Gi2-белками, но не
влияют на активность структурно и функционально родственного
им Gi3-белка, который не взаимодействует с CB1-
каннабиноидным рецептором (Mukhopadhyay, Howlett, 2001). В
свою очередь, GPCR-пептиды, структурно соответствующие
третьей ЦП Gs-сопряженных простациклинового рецептора,
рецепторов ЛГ и ТТГ, релаксинового рецептора RXFP1 и
рецептора глюкагоноподобного пептида-1, селективно
активировали Gs-белки, практически не влияя на другие типы G-
белков (Bavec et al., 2003; Licht et al., 2003; Shpakov et al., 2007,
2010, 2011, 2012a; Derkach et al., 2015). Показано также, что
GPCR-пептиды, структурно соответствующие
цитоплазматическим участкам сопряженных с Gi/o-белками μ- и
δ-опиоидных рецепторов, 5-HT1B-серотонового рецептора и
соматостатиновых рецепторов, избирательно повышают ГТФ-
связывающую способность и ГТФазную активность Gi/o-белков
(Megaritis et al., 2000; Shpakov, Shpakova, 2011).
В пользу клеточной и тканевой специфичности
регуляторных эффектов GPCR-пептидов свидетельствуют данные
о том, что они проявляют специфическую активность
преимущественно в тех типах клеток и тканей, где
экспрессированы гомологичные им рецепторы (Covic et al.,
2002b; Swift et al., 2006; Shpakov et al., 2010, 2011, 2012a, 2012b;
Derkach et al., 2015). В экспериментах с клеточными культурами
показано, что пептид, соответствующий N-концевому участку
третьей ЦП Gq/11-сопряженного PAR 1-го типа (PAR1), не
способен влиять на функциональную активность Gq/11-белков и
фермента ФЛСβ в клетках, где PAR1 отсутствует, или в клетках,
396
где экспрессируется мутантная форма рецептора, лишенная
внутриклеточного С-концевого домена (Covic et al., 2002b).
Предполагается, что при активации рецептора третья ЦП
взаимодействует с С-концевым доменом, обеспечивая тем самым
передачу гормонального сигнала на Gq/11-белки и далее на ФЛСβ.
Показано также, что пальмитоилированный пептид 374–386,
соответствующий проксимальному к мембране участку С-
концевого домена PAR1, вызывает стимуляцию ФЛСβ и
усиливает обмен фосфоинозитидов только в клеточных
культурах с экспрессированным в них PAR1 (Swift et al., 2006).
При изучении тканевой специфичности GPCR-пептидов нами
было показано, что пальмитоилированный с С-конца пептид
NKDTKIAKK-Nle-A562–572-K(Palm)A-амид, являющийся
производным третьей ЦП рецептора ЛГ, повышает активность
АЦ в основном в плазматических мембранах, выделенных из
ткани семенников. В свою очередь, модифицированный
пальмитатом пептид KHSRKALKASL258–268-K(Palm)A,
являющийся производным первичной структуры третьей ЦП 5-
HT6-серотонинового рецептора, активирует компоненты
аденилатциклазной сигнальной системы преимущественно в
мембранах тканей мозга крыс, в то время как
пальмитоилированный пептид QYNPRDKDTKIAKR-Nle-A612–627-
K(Palm)-A, соответствующий третьей ЦП рецептора ТТГ,
является активным почти исключительно в тканях щитовидной
железы крыс, где экспрессируется гомологичный ему рецепртор
ТТГ (Shpakov et al., 2012a, 2012b). Для всех изученных GPCR-
пептидов было продемонстрировано, что в тканях, где
гомологичные им рецепторы либо не экспрессируются, либо
экспрессируются в незначительных количествах, их
регуляторные эффекты на активность АЦ и Gs-белков
отсутствуют или выражены в небольшой степени. Эти
наблюдения хорошо согласуются с моделью действия GPCR-
пептидов, которая основана на взаимодействии между ними и
комплементарными участками гомологичного рецептора (рис. 8-
1).
397
Способность GPCR-пептидов избирательно регулировать
функциональную активность гормональных сигнальных систем и
влиять на зависимые от них фундаментальные клеточные
процессы, такие как рост, метаболизм, дифференцировка и
апоптоз, позволяет использовать их в качестве селективных и
специфичных сенсоров при исследовании структурной и
функциональной организации этих систем, при расшифровке
молекулярных механизмов передачи гормонального сигнала, а
также при идентификации и изучении внутриклеточных каскадов
и факторов транскрипции – мишеней действия гормональных
регуляторов. Наибольший интерес для практического
использования GPCR-пептидов представляет их способность
избирательно («таргетно») контролировать физиологические и
биохимические процессы в организме, что открывает широкие
перспективы для создания на основе GPCR-пептидов новых
поколений лекарственных препаратов.
Исследования GPCR-пептидов, являющихся
производными различных по локализации цитоплазматических
участков GPCR, проведенные в течение последних пятнадцати
лет, отчетливо демонстрируют, что модификация этих пептидов с
помощью гидрофобных радикалов, в первую очередь с помощью
остатка пальмитиновой кислоты, позволяет получить их
липофильные аналоги (пепдуцины) с повышенной активностью и
избирательностью действия как in vitro, так и in vivo (Covic et al.,
2002a, 2002b, 2007; Shpakov, Pertseva, 2007; Miller et al., 2009;
Shpakov, 2010, 2011; Tressel et al., 2011). Как упоминалось выше,
высокая эффективность пепдуцинов как регуляторов
биохимических и физиологических процессов in vivo
обусловлена, с одной стороны, их способностью сравнительно
легко проникать внутрь клетки через плазматическую мембрану,
прикрепляться к ее внутренней поверхности и эффективно
взаимодействовать с аллостерическими сайтами, которые
расположены в цитоплазматических субдоменах рецептора. В то
же время имеются данные о том, что некоторые
немодифицированные GPCR-пептиды также могут обладать
398
высокой активностью in vivo, как это, например, показано для
сравнительно короткого нонапептида KRX-725, который
структурно соответствует второй ЦП S1PR 3-го типа,
ответственного за проангиогенную активность (Licht et al., 2003).
Пептид KRX-725 имитировал регуляторные эффекты сфингозин-
1-фосфата, вызывая разрастание сосудистой сети и индуцируя
формирование плотных контактов между отростками сосудов в
кольце аорты (модель ангиогенеза ex vivo), стимулировал
процесс неоваскуляризации роговицы мыши (модель ангиогенеза
in vivo), причем его проангиогенные эффекты характеризовались
синергичностью с таковыми фактора роста эндотелия сосудов,
основного фактора роста фибробластов bFGF (basic fibroblast
growth factor) и факторов, вовлеченных в развитие и
дифференцировку стволовых клеток. Полученные результаты
дают основания полагать, что пептид KRX-725 является хорошим
кандидатом для создания лекарственных препаратов,
предназначенных для лечения заболеваний периферических
сосудов и ишемии миокарда, и может быть эффективен при
заживлении трофических язв, возникающих в условиях
диабетической патологии (Licht et al., 2003).
Наибольший прогресс в настоящее время достигнут при
разработке GPCR-пептидов, структурно соответствующих
цитоплазматическим участкам различных типов рецепторов PAR-
семейства. В настоящее время семейство PAR включает четыре
типа этих рецепторов, которые играют исключительно важную
роль в регуляции гемостаза и контроле функций тромбоцитов, в
том числе в развитии таких патологических состояний, как
тромбозы. Эти рецепторы вовлечены в регуляцию процессов
эмбрионального развития, воспаления, заживления ран, а также
являются ключевыми участниками процессов онкогенеза и
метастазирования (Gieseler et al., 2013). На основе GPCR-
пептидов – производных структуры PAR – создаются
лекарственные препараты, которые в ближайшее время могут
быть внедрены в клиническую практику. Поэтому рассмотрение
399
отдельных классов GPCR-пептидов будет начато именно с PAR-
производных пепдуцинов.
8.3. PAR-производные пепдуцины

8.3.1. Влияние PAR-производных пепдуцинов на
агрегацию тромбоцитов
Индуцированная тромбином активация тромбоцитов

усиливается в случае эрозии и разрыва атеросклеротических
бляшек, а также чрескожного коронарного вмешательства, что
приводит к артериальному тромбозу, одной из основных причин
инфаркта миокарда и ишемического инсульта. Тромбоциты
прилипают к внутренней поверхности поврежденных
кровеносных сосудов, агрегируют и вызывают выработку
тромбина. Тромбин активирует тромбоциты, причем эти его
регуляторные эффекты реализуются через PAR1 и PAR4, которые
локализованы в плазматической мембране тромбоцитов и
функционально сопряжены с различными типами G-белков – Gi/o,
Gq/11 и G12/13 (Kyriazis et al., 2012). Показано, что активирующий
эффект тромбина на агрегационные свойства тромбоцитов
реализуется преимущественно через PAR-опосредуемую
стимуляцию активности Gq/11-белков и ФЛСβ. После активации
ФЛСβ в тромбоцитах повышается уровень внутриклеточного
кальция вследствие его высвобождения из внутриклеточных
депо, а также активируются чувствительные к диацилглицерину
изоформы протеинкиназы С. В результате активируются и
начинают перемещаться в плазматическую мембрану αIIb/β3-
интегрины, что приводит к усилению агрегационной активности
тромбоцитов. Наряду с этим, усиливается высвобождение из
тромбоцитов АДФ, который связывается с P2Y12-
пуринергическими рецепторами, расположенными на
поверхности тромбоцитов, что вызывает усиление синтеза
тромбоксана A2, важнейшего медиатора процессов агрегации и
дегрануляции тромбоцитов.
400
Обычно для предотвращения агрегации тромбоцитов,
которая может возникать при острых коронарных синдромах и
чрескожном коронарном вмешательстве, используются аспирин,
снижающий выработку тромбоксана А2, антагонисты P2Y12-
пуринергического рецептора и ингибиторы гликопротеинового
комплекса тромбоцитов GPIIb/IIIa, который вовлечен в контроль
процессов адгезии и агрегации тромбоцитов. Однако все эти
подходы не очень эффективны и предотвращают не более 17 %
всех смертельных случаев, вызванных артериальным тромбозом
(Adams et al., 2011), что указывает на острую необходимость
разработки новых лекарственных препаратов, которые будут
эффективно контролировать PAR1- и PAR4-зависимые
сигнальные пути в тромбоцитах. Результаты исследований
синтетических пептидов, являющихся производными рецепторов
PAR-семейства, отчетливо указывают на то, что пепдуцины,
соответствующие ЦП PAR1 и PAR4, обладают высокой
специфической активностью in vitro и функционируют в качестве
модуляторов PAR1/PAR4-опосредуемой сигнальной трансдукции
при их использовании in vivo.
Показано, что пепдуцин Palm-ATGAPRLPST (P4pal-i1),
который структурно соответствует первой ЦП PAR4,
избирательно ингибирует передачу генерируемого тромбином
сигнала через гомологичный ему рецептор (Leger et al., 2006). Он
блокирует PAR4-опосредованный хемотаксис и предотвращает
агрегацию тромбоцитов, вызванную AYPGKF-амидом,
селективным агонистом PAR4, но при этом не оказывает
заметного влияния на те же процессы, которые реализуются через
PAR1, демонстрируя высокую специфичность в отношении
гомологичного ему PAR4. Совместное использование P4pal-i1 и
селективного PAR1-антагониста RWJ-56110 приводило к
полному исчезновению эффектов тромбина, что свидетельствует
о высокой эффективности одновременной блокады PAR1 и PAR4
(Leger et al., 2006). Совместное использование пепдуцина P4pal-i1
и тромболитика бивалирудина, действие которого основано на
его специфическом связывании с молекулой тромбина, вызывало
401
значительное увеличение эффективности обоих агентов и
полностью предотвращало агрегацию тромбоцитов, вызванную
субмаксимальной концентрацией (10 нМ) α-тромбина (Derian et
al., 2003; Leger et al., 2006). В экспериментах in vivo с
использованием модели окклюзии сонной артерии у морских
свинок было показано, что пепдуцин P4pal-i1 в дозе 0.13 мг/кг
продлевает время окклюзии и предотвращает развитие
артериального тромбоза. Комбинированное введение пепдуцина
P4pal-i1 и бивалирудина обеспечивало высокоэффективную
защиту от острой артериальной окклюзии и давало гораздо
лучшие результаты, чем применение только одного
бивалирудина (Leger et al., 2006).
Пепдуцин Palm-SGRRYGHALR (P4pal-10), который
соответствует третьей ЦП PAR4, был менее специфичным по
сравнению с пепдуцином P4pal-i1 и одновременно проявлял
активность PAR4-антагониста и инверсионного агониста PAR1
(Covic et al., 2002b; Dabek et al., 2011). Пепдуцин P4pal-10
полностью блокировал стимулирующий эффект PAR4-агониста
AYPGKF-амида на активность ФЛСβ и снижал на 36 %
соответствующий эффект PAR1-агониста SFLLRN-амида.
Пепдуцин уменьшал агрегацию тромбоцитов на 45–70 %,
индуцированную AYPGKF-амидом, но при этом оказывал слабо
выраженное влияние на агрегацию тромбоцитов,
индуцированную SFLLRN-амидом, и совершенно не влиял на
агрегацию тромбоцитов, которая вызывалась активацией
рецепторов, не принадлежащих к PAR-семейству (Covic et al.,
2002b). В условиях in vivo пепдуцин P4pal-10 предотвращал
тромбоз сонной артерии у мышей, вызванный их обработкой с
помощью треххлористого железа (Covic et al., 2007).
Пепдуцин Palm-RCLSSSAVANRS (P1pal-12) и его
укороченный аналог P1pal-7, соответствующий N-концевой части
третьей ЦП PAR1, ингибировали стимуляцию ФЛСβ и
предотвращали повышение внутриклеточного уровня Ca2+,
которые были вызваны PAR1-агонистом (Covic et al., 2002a,
2002b; Abdel-Latif, Smyth, 2012). При действии в микромолярных
402
концентрациях пепдуцин P1pal-12 снижал на 75–95 % агрегацию
тромбоцитов, вызванную PAR1-агонистом SFLLRN-амидом
(Covic et al., 2002a). Этот пепдуцин также частично ингибировал
вазорелаксацию аорты крысы, вызванную PAR1-агонистом
TFLLR-амидом, но не влиял на таковую, индуцированную PAR2-
агонистом SLIGRL-амидом (Kubo et al., 2006). Разработанный на
основе P1pal-7 препарат PZ-128, вторичная структура которого
сходна с таковой гомологичного ему С-концевого участка
третьей ЦП PAR1, в значительной степени ингибировал PAR1-
опосредованную агрегацию тромбоцитов и артериальный
тромбоз у морских свинок и обезьян (Zhang et al., 2012).
Терапевтический эффект PZ-128 усиливался в присутствии
антитромбоцитарного препарата клопидогрела, который снижает
связывание АДФ с пуринергическими рецепторами тромбоцитов
и предотвращает активацию гликопротеинового комплекса
GPIIb/IIIa, тем самым, ингибируя процесс агрегации
тромбоцитов. Обработка препаратом PZ-128 вызывала
восстановление функциональной активности тромбоцитов на
протяжении суток. Следует отметить, что у препарата PZ-128 не
было значимых побочных эффектов. Он не вызывал
кровотечения или свертывания крови у приматов и у пациентов с
чрескожным коронарным вмешательством. Основываясь на этих
результатах, Ping Zhang и соавторы пришли к выводу о том, что
PZ-128 является мощным ингибитором активности PAR1 и может
быть хорошей альтернативой низкомолекулярным антагонистам
этого рецептора, которые в настоящее время используются для
лечения артериального тромбоза (Zhang et al., 2012).
В настоящее время PZ-128 проходит первую фазу
клинических испытаний (NCT02561000, “Safety of PZ-128 in
Subjects Undergoing Non-Emergent Percutaneous Coronary
Intervention”) как препарат для лечения дисфункций коронарных
артерий (Gurbel et al., 2016; Covic, Kuliopulos, 2018; Grover et al.,
2018). В ходе клинических испытаний препарат PZ-128 вводили
путем непрерывной внутривенной инфузии в течение 1-2 ч (0.01-
2.00 мг/кг) 31 пациенту с ишемической болезнью сердца или с
403
множественными факторами риска заболеваний коронарных
артерий. Ингибирующее воздействие PZ-128 на агрегацию
тромбоцитов, стимулированную PAR1-агонистом SFLLRN-
амидом (8 мкмоль/л), зависело от дозы препарата. Оно составило
от 20 до 40 % при дозе 0.3 мг/кг, от 40 до 60 % при дозе 0.5 мг/кг
и 80–100 % при дозах от 1 до 2 мг/кг. Ингибирующий эффект 0.5
мг/кг PZ-128 являлся обратимым, и восстанавливался на 50 % с
помощью SFLLRN-амида в течение 24 ч. При этом не отмечали
значимого влияния PZ-128 на агрегацию, которая была
индуцирована PAR4-агонистом AYPGKF-амидом, АДФ или
коллагеном, что указывает на специфичность эффекта пепдуцина
в отношении PAR1. Период полувыведения PZ-128 из плазмы
крови составил от 1.3 до 1.8 ч, в то время как в моче пепдуцин не
определялся. При этом показано, что антитромбоцитарный
эффект PZ-128 не влияет на кровотечение, коагуляцию,
биохимические и метаболические показатели, а также на
параметры ЭКГ. Препарат хорошо переносится при его
внутривенном введении в терапевтической дозе 0.5 мг/кг.
Более длиный пепдуцин Pal-RCLSSSAVANRSKKSRALF
(P1pal-19), в отличие от пепдуцинов P1pal-12 и P1pal-7,
демонстрировал активность внутриклеточного полного агониста
PAR1. Он имитировал эффекты лиганд-активированного
рецептора, стимулировал активность Gq/11- и Gi/o-белков и
регулируемых через них сигнальных каскадов. Стимулирующие
эффекты P1pal-19 были сходны с таковыми у селективных
агонистов PAR1, TFLLR-амида и SFLLRN-амида (Covic et al.,
2002a, 2002b; Kubo et al., 2006). Таким образом, модификация
структуры PAR-производных пепдуцинов не только влияет на их
эффективность и селективность, но в некоторых случаях меняет
их функциональные свойства и мишени действия.
404
8.3.2. Влияние PAR-производных пепдуцинов на
ангиогенез, опухолевый рост и метастазирование
Опосредумые через PAR1 внутриклеточные сигнальные

пути исключительно важны для регуляции процесса опухолевого
ангиогенеза и, таким образом, вносят заметный вклад в контроль
инвазивных и метастатических процессов для широкого спектра
онкологических заболеваний, включая меланому, рак молочной
железы, рак яичников, рак легкого, рак толстой кишки и рак
предстательной железы (Covic, Kuliopulos, 2018). В опухолевых
клетках плотность PAR1 сильно увеличена, и это сопровождается
повышением активности фермента матриксной
металлопротеиназы 1-го типа (matrix metalloprotease-1, MMP1),
которая функционирует как PAR1-агонист (Agarwal et al., 2008;
Foley et al., 2012; Foley, Kuliopulos, 2014). Установлено, что
агонисты PAR1 усиливают онкогенез, инвазию и
метастазирование, тогда как PAR1-антагонисты, напротив,
эффективно подавляют эти процессы, предотвращая, тем самым,
генерализацию опухолевого процесса и улучшая прогноз
онкологического заболевания (Boire et al., 2005; Agarwal et al.,
2008).
В настоящее время достигнуты впечатляющие успехи в
разработке PAR1-пепдуцинов, которые эффективны при лечении
различных онкологических заболеваний (Covic, Kuliopulos, 2018;
Habault, Poyet, 2019). Одним из первых GPCR-пептидов с
отчетливо выраженной противоопухолевой активностью стал
пепдуцин P1pal-7 (PZ-128), антагонист PAR1, который, как
отмечалось выше, наделен тромболитической активностью. Этот
препарат ингибировал рост опухолей, подавлял метастазирование
и снижал выживаемость клеток при раке молочной железы,
яичников и легких (Agarwal et al., 2008; Yang et al., 2009; Foley et
al., 2012; Zhang et al., 2012; Gurbel et al., 2016; Covic, Kuliopulos,
2018). Следует отметить, что PAR1 не экспрессируется в
нормальном эпителии молочной железы, в то время как при
инвазивных карциномах молочной железы его экспрессия и
405
функциональная активность в значительной степени
повышаются, что приводит к подавлению апоптоза и повышению
выживаемости злокачественных клеток. Пепдуцин P1pal-7
вызывает ингибирование серин/треониновой протеинкиназы Akt,
ключевого антиапоптотического белка, что способствует
усилению апоптоза в ксенотрансплантатах опухоли молочной
железы, экспрессирующих PAR1 (Yang et al., 2009). Показано,
что пепдуцин P1pal-7, подобно ингибиторам MMP1, как в
отдельности (в режиме монотерапии), так и в сочетании с
Taxotere (Docetaxel), широко используемым противораковым
препаратом, эффективно подавлял рост ксенотрансплантатов
опухоли молочной железы и предотвращал их метастазирование
в легкое.
В условиях in vitro пепдуцин P1pal-7 и его удлиненный
аналог P1pal-12 почти полностью подавляли PAR1-зависимую
миграцию клеток карциномы яичников OVCAR-4 в асцитную
жидкость, полученную от пациентов с раком яичников (Agarwal
et al., 2008). Пепдуцины P1pal-7 и P1pal-12 также значительно
снижали миграцию других типов клеток карциномы яичников,
IGROV-1 и SKOV-3, в асцитную жидкость, полученную от
пациентов с асцитом опухолевого генеза, а также в среду с
инкубированными в ней фибробластами. Шестинедельное
лечение мышей с карциномой яичников пепдуцином P1pal-7
вызывало у них снижение плотности кровеносных сосудов на 84–
96 % как в центральной части, так и на периферии OVCAR-4-
опухоли, а также на 90 % снижало эти показатели в случае
SKOV-3-опухоли. Применение пепдуцина P1pal-7 усиливало
ингибирующий эффект препарата Taxotere на опухолевый
ангиогенез при раке яичников, осложненном
внутрибрюшинными метастазами. Совместное применение
пепдуцина P1pal-7 и Taxotere вызывало еще более выраженное, в
сравнении с монотерпией, подавление процессов инвазии
опухолевых клеток и метастазирования из брюшной полости в
органы грудной клетки (Agarwal et al., 2008). Эти данные
указывают на сильно выраженное ингибирующее влияние
406
пепдуцинов P1pal-7 и P1pal-12, функционирующих как
аллостерические PAR1-антагонисты, на рак яичников и их
потенцирующее воздействие на специфическую
противоопухолевую активность других препаратов,
используемых для подавления роста и метастазирования этого
вида опухолей.
Пепдуцины, являющиеся производными первой и третьей
ЦП PAR1, были также эффективны при лечении рака легких.
Хорошо известно, что экспрессия PAR1, в отличие от других
рецепторов PAR-семейства, заметно повышается при раке легких,
как это было продемонстрировано для малигнизированных
клеток, изолированных из опухолевой ткани пациентов с раком
легких. Пепдуцины с PAR1-антагонистической активностью,
соответствующие первой и третьей ЦП PAR1, в значительной
степени снижали PAR-опосредованную миграцию опухолевых
клеток (Cisowski et al., 2011). Показано также, что пепдуцин
P1pal-7, соответствующий по структуре третьей ЦП PAR1, с
высокой эффективностью ингибировал PAR1-опосредованную
активацию протеинкиназы ERK1/2, важнейшего компонента
каскада МАПК, и уменьшал рост опухоли легких в среднем на 75
%. Противоопухолевая активность пепдуцина P1pal-7 была
сравнима с таковой бевацизумаба (Avastin), представляющего
собой моноклональные антитела против фактора роста эндотелия
сосудов и наделенного активностью противоопухолевого
препарата и мощного ингибитора опухолевого ангиогенеза. Так
бевацизумаб в тех же условиях подавлял рост опухоли легких на
67 % (Cisowski et al., 2011). Пепдуцин P1pal-7 подавлял рост и
инвазивную активность клеток карциномы легких Льюис в
трехмерном матриксе (Foley et al., 2012). Пепдуцины,
соответствующие первой ЦП PAR1, в отличие от пепдуцина
P1pal-7, заметно не влияли на компоненты каскада МАПК, в том
числе на активность киназы ERK1/2, и не подавляли рост и
инвазивную активность опухолевых клеток при раке легких.
Пепдуцин Palm-AVANRSKKSRALF (P1pal-13),
являюшийся селективным аллостерическим агонистом PAR1,
407
оказывал выраженный проангиогенный эффект у мышей с
перевязкой сонной артерии (Sevigny et al., 2011). Лечение
животных P1pal-13 в течение трех недель в суточной дозе 2.5
мг/кг вызывало сильно выраженную гиперплазию в
поврежденной сонной артерии, причем этот эффект пепдуцина
требовал присутствия как PAR1, так и PAR2. В связи с этим было
высказано предположение, что PAR 1-го типа, вероятно, образует
функционально активный гетеродимерный комплекс с PAR2,
вследствие чего активация PAR1 пепдуцином является лишь
триггером для запуска PAR1/PAR2-зависимых сигнальных путей,
опосредующих стимуляцию ангиогенеза и процесса
неоваскуляризации.
8.3.3. Влияние PAR-производных пепдуцинов на процессы

воспаления
Наряду с регуляцией процессов свертывания крови,

ангиогенеза, опухолевого роста и метастазирования, PAR1-
опосредованные сигнальные пути играют заметную роль в
этиологии и патогенезе воспалительных заболеваний, включая
сепсис. Агонист-индуцированная активация PAR1 вызывает
сильное противовоспалительное действие и защищает
эндотелиальные клетки от разрушения (Kaneider et al., 2007).
Однако длительная, сильно выраженная активация PAR1 под
действием характерных для сепсиса высоких концентраций
тромбина может иметь и противоположный эффект, вызывая
нарушения функций эндотелиальных клеток, усугубляя сепсис и,
тем самым, повышая смертность пациентов (van der Poll, Levi,
2012; Asehnoune, Moine, 2013). Соответственно, пепдуцины с
активностью аллостерических PAR1-антагонистов могут быть
использованы для предотвращения и ослабления эндотелиальных
дисфункций, развивающихся при сепсисе и других
воспалительных заболеваниях.
Для изучения противовоспалительного эффекта
пепдуцинов – производных PAR1 – в условиях сепсиса была
408
использована модель бактериального перитонита у мышей,
индуцированная лигированием и пункцией слепой кишки.
Пепдуцины вводили подкожно либо сразу, либо через 4 ч после
пункции, а уровень смертности оценивали через семь дней после
индукции перитонита. Пепдуцин Palm-RSLSSSAVANRS (P1pal-
12S), полный антагонист PAR 1-го типа, который вводили в дозе
2.5 мг/кг параллельно с индукцией перитонита, увеличивал
выживаемость двух линий мышей, CF-1 и C57BL/6, в среднем до
50–60 %. У необработанных пепдуцином мышей смертность
составила 90–100 %. Интересно отметить, что инъекция
пепдуцина P1pal-12S через 4 ч после индукции перитонита уже
существенно не влияла на смертность животных. В то же время
пепдуцин Palm-AVANRSKKSRALF (P1pal-13) с активностью
PAR1-агониста, взятый в той же дозе, был не эффективен при
введении сразу после пункции, но увеличивал выживаемость
мышей линии CF-1 до 80 % при введении через 4 ч после
пункции, когда уже развивался выраженный сепсис. При этом у
мышей, нокаутных по гену Par1, кодирующему PAR1, ни один из
двух изученных пепдуцинов не влиял на сепсис. Это
свидетельствует в пользу того, что PAR1-производные
пепдуцины осуществляют контроль процесса воспаления через
регуляцию активности PAR1, причем механизмы их действия на
различных стадиях этого процесса различаются (Kaneider et al.,
2007).
Одним из наиболее опасных проявлений сепсиса является
септический шок – сложный синдром, который характеризуется
тяжелыми дисфункциями сердечно-сосудистой системы, включая
увеличение сердечного ритма, изменение микроциркуляции
крови, перераспределение кровотока между органами,
значительное снижение общего периферического сосудистого
сопротивления и уменьшение внутрисосудистого объема
жидкости (De Backer, 2006; Feih et al., 2013). Лечение мышей с
перитонеальным сепсисом на ранних стадиях развития этого
воспалительного заболевания с помощью PAR1-антагониста
P1pal-12S, а также их лечение с помощью PAR1-агониста P1pal-
409
13 с четырехчасовой задержкой обеспечивало животным защиту
от септического шока и предотвращало повреждение сосудов
легких (Kaneider et al., 2007). Лечение мышей с сепсисом с
помощью пепдуцина P1pal-12S через 8 ч после пункции не
снижало, а, напротив, повышало проницаемость сосудов легких,
в то время как инъекция пепдуцина P1pal-13 через 8 ч после
пункции слепой кишки была столь же эффективной, что и при
введении препарата с четырехчасовой задержкой. Эти данные
указывают на то, что оптимизация использования PAR1-
пепдуцинов с агонистической и антагонистической активностью
на ранних и поздних стадиях сепсиса может привести к
выраженному терапевтическому эффекту при этом заболевании.
Регуляция воспалительных процессов через PAR1 требует
присутствия функционально активного PAR2 для образования
гетеродимерного PAR1/PAR2-комплекса. Решающие
доказательства этого были получены с использованием
пепдуцинов, производных третьей ЦП PAR2. Пепдуцин Palm-
RSSAMDENSEKKRKSAIK270–287 (P2pal-18S) с заменой остатка
Arg284 на серин, взятый в концентрации 0.14–0.20 мМ, полностью
подавлял миграцию нейтрофилов человека в направлении
градиентов трипсина и селективного PAR2-агониста SLIGRL-
амида, а также ингибировал миграцию нейтрофилов мыши по
направлению к среде, содержащей 30 нМ трипсина (Sevigny et al.,
2011). В экспериментах по изучению хемотаксиса нейтрофилов
пепдуцин P2pal-18S с активностью PAR2-антагониста
продемонстрировал высокую рецепторную специфичность, о чем
свидетельствует отсутствие его влияния на близкородственные
рецепторы PAR 1-го и 4-го типов и хемокиновые рецепторы
CXCR1 и CXCR2. Было также показано, что пепдуцин P2pal-18S
ингибирует миграцию первичной культуры клеток
холангиокарциномы через коллагеновую мембрану, которая была
индуцирована трипсином и селективным PAR2-агонистом 2-
фуроил-LIGRLO-амидом (Kaufmann et al., 2012).
В экспериментах in vivo показано, что системное
введение пепдуцина P2pal-18S мышам вызвало 50%-ное
410
уменьшение у них отека, вызванного обработкой λ-каррагинаном,
и на 85 % снижало отек, вызванный PAR2-агонистом SLIGRL-
амидом (Sevigny et al., 2011). Даже небольшие изменения длины
PAR-производного пепдуцина и замены в нем отдельных
аминокислотных остатков оказывали значительное влияние на
его эффективность и селективность и, кроме того, существенно
меняли спектр его фармакологической активности и влияли на
селективность регуляции им внутриклеточных сигнальных
каскадов. Так добавление трех аминокислотных остатков к N-
концу пепдуцина P2pal-18S делало его мощным аллостерическим
PAR2-антагонистом (Sevigny et al., 2011). В свою очередь, замена
С-концевого остатка лизина на фенилаланин придавала
пепдуцину активность аллостерического инверсионного PAR2-
агониста. Пепдуцин P2pal-18S с заменой Lys287Phe не обладал
антагонистической активностью и функционировал, как слабый
аллостерический агонист PAR2. Изучение взаимоотношений
«структура-активность» в ряду аналогов пепдуцина P2pal-18S
позволяет выбрать синтетические стратегии для создания
различных по своему фармакологическому профилю и
специфической биологической активности пепдуцинов –
регуляторов воспалительных процессов, которые способны как
усиливать, так и ослаблять функциональные, метаболические и
гормональные изменения, вызванные воспалением.
Пепдуцин PZ-235, структурно соответствующий третьей
ЦП PAR2 и наделенный активностью антагониста этого
рецептора, продемонстрировал мощную противовоспалительную
активность как в модели хронического воспаления и фиброза
печени (Shearer et al., 2016), так и в модели атопического
дерматита (Barr et al., 2019). Известно, что хроническое
воспаление печени и фиброз при неалкогольном стеатогепатите
могут привести к циррозу и печеночной недостаточности.
Однако, эффективных терапевтических подходов,
предотвращающих такой сценарий, в настоящее время нет.
Одним из индукторов воспалительных реакций в печени является
PAR2, который экспрессируется в гепатоцитах и в звездчатых
411
клетках печени, вследствие чего разработка пепдуцинов с
активностью PAR2-антагонистов способна предовратить
негативные влияния PAR2-агонистов на функциональное
состояние печени. Лечение мышей с фиброзом печени,
индуцированным их обработкой четыреххлористым углеродом, с
помощью пепдуцина PZ-235 в значительной степени подавляло
проявления фиброза, уменьшало отложения коллагена, снижало
уровни провоспалительных цитокинов и другие биохимические
показатели неалкогольной жировой болезни печени, ослабляло
выраженность стеатоза, снижало уровни триглицеридов и
активность трансаминаз, а также на 50–100 % ингибировало
пролиферацию звездчатых клеток (Shearer et al., 2016). Пепдуцин
PZ-235 оказывал защитный эффект в отношении развития
гепатоцеллюлярного некроза и ослаблял PAR2-опосредованную
продукцию активных форм кислорода в гепатоцитах. Пепдуцин
PZ-235 образует хорошо структурированную амфипатическую α-
спираль, которая сходна со структурой участка третьей ЦП и
соседнего с ним сегмента шестой ТМС в гомологичном ему
рецепторе. Способность пепдуцина PZ-235 подавлять фиброз
печени, ослаблять гепатоцеллюлярный некроз, снижать стеатоз и
воспалительные процессы в печени указывает на
перспективность его применения для лечения этих заболеваний
(Shearer et al., 2016).
Наряду с участием в воспалительных процессах в печени
PAR2 вовлечены в образование очагов воспаления и генерацию
зуда при атопическом дерматите. Пепдуцин PZ-235 снижал в
среднем на 94–98 % PAR2-опосредованную экспрессию факторов
воспаления, в том числе ядерного фактора-κB (NF-κB), тимусного
стромального лимфопоэтина (thymic stromal lymphopoietin,
TSLP), фактора-α некроза опухолей (TNF-α) и эпидермального
дифференцировочного кератина K10 в кератиноцитах человека, а
также в среднем на 68–83 % снижал экспрессию интерлейкина-4
и интерлейкина-13 в тучных клетках человека (Barr et al., 2019). С
использованием моделей дерматита, индуцированного
оксазолоном и динитрофторбензолом, показано, что пепдуцин
412
PZ-235 снижает утолщение кожи на 43–100 % и уменьшает
частоту образования корки лейкоцитов на 57 %, а также
ингибирует хемотаксис лейкоцитов к PAR2-агонистам в условиях
ex vivo (Barr et al., 2019). Ежедневная обработка мышей с
дефицитом филагрина, которые в течение 8 недель подвергались
воздействию аллергенов пылевого клеща, с помощью пепдуцина
PZ-235 подавляла общую инфильтрацию лейкоцитов и Т-клеток
на 50–68 %, уменьшала толщину эпидермиса на 60–77%, и
снижала частоту возникновения утолщений, шелушений, ссадин
и общую степень поражения кожи на 46–56 %. Обнаружено
также, что при обработке мышей пепдуцином PZ-235 в два раза
ослабляется зуд, вызванный дегранулирующим тучные клетки
пептидом из яда осы, и этот эффект пепдуцина сопоставим с
защитным эффектом нокаута гена, кодирующего PAR2.
Основываясь на этих результатах, сделан вывод, что пепдуцины с
активностью аллостерических PAR2-антагонистов могут быть
эффективны при лечении атопического дерматита и зуда (Barr et
al., 2019).
8.3.4. Влияние PAR-производных пепдуцинов на острый

панкреатит
PAR2 с высокой интенсивностью экспрессируются в

различных типах клеток поджелудочной железы, включая клетки
эндотелия сосудов, нервные клетки, клетки иммунной системы,
клетки протоков поджелудочной железы и ацинарные клетки.
Нарушения функций этих рецепторов играют важную роль в
развитии острого панкреатита – тяжелого воспалительного
заболевания поджелудочной железы. Имеются свидетельства в
пользу того, что PAR2 замедляет развитие панкреатита,
вызванного обработкой соединениями, способствующими
продукции гормона роста (secretagogue). Активация PAR2 у крыс
с помощью селективных PAR2-агонистов приводит к снижению
тяжести secretagogue-индуцированного панкреатита (Namkung et
al., 2004). При этом у мышей, нокаутных по гену Par2,
413
кодирующему PAR2, тяжесть secretagogue-индуцированного
панкреатита была в значительной степени повышена по
сравнению с мышами дикого типа (Sharma et al., 2005).
В то же время PAR2 оказывает негативное воздействие
при экспериментальном панкреатите, вызванном солями
желчных кислот, что в клиническом плане более близко к
острому панкреатиту человека. Как известно, избыточная
продукция желчи и ее затекание в протоки поджелудочной
железы вызывает усиление секреции ферментов, разрушающих
ткани поджелудочной железы и индуцирующих некротические
изменения в них. Фармакологическая активация PAR2 усиливает
патологическое воздействие солей желчных кислот на ацинусы
поджелудочной железы в условиях in vitro, в то время как
делеция гена Par2 заметно снижает тяжесть экспериментального
панкреатита, вызванного солями желчных кислот (Laukkarinen et
al., 2008). Пепдуцин P2pal-18S, структурно соответствующий
третьей ЦП PAR2, который действует на PAR-зависимые
сигнальные каскады в ацинарных клетках как селективный
PAR2-антагонист, в значительной степени снижал тяжесть
экспериментального билиарного панкреатита у мышей при
введении как до, так и через 2 ч после инфузии солей желчных
кислот. При этом пепдуцин был неэффективен при введении
через 5 ч после индукции заболевания. В экспериментах in vitro
пепдуцин P2pal-18S защищал ацинарные клетки от повреждений,
вызванных солями желчных кислот (Michael et al., 2013). Отсюда
следует вывод о том, что PAR2-пепдуцины с антагонистической
активностью могут быть успешно использованы в клинике для
лечения пациентов с высоким риском развития острого
билиарного панкреатита. В противоположность этому, in vivo
пепдуцин P2pal-18S усиливал тяжесть secretagogue-
индуцированного острого панкреатита (Michael et al., 2013).
414
8.4. Пепдуцины – производные хемокиновых рецепторов
Как показано при исследовании клеток карциномы

яичников, вслед за активацией в них PAR1 с помощью
металлопротеиназ, в том числе MMP1, усиливается секреция
хемокинов с ангиогенной активностью, в первую очередь
интерлейкина-8 и хемокина CXCL1/GRO-α. Это вызывает
активацию расположенных в эндотелиальных клетках
хемокиновых рецепторов CXCR1 и CXCR2, которые специфично
активируются хемокинами CXCR1/2-семейства, что усиливает
пролиферацию эндотелиальных клеток и стимулирует их
миграцию (Agarwal et al., 2010). Известно, что хемокины CXCR1
и CXCR2 осуществляют контроль процессов выживания,
пролиферации и ангиогенеза эндотелиальных клеток сосудов.
Пепдуцин Palm-RTLFKAHMGQKHRAMR (X1/2pal-i3),
селективный аллостерический антагонист рецепторов CXCR1 и
CXCR2, который по первичной структуре соответствует третьей
ЦП этих рецепторов, в концентрации 300 нМ ингибировал
пролиферацию эндотелиальных клеток, индуцированную
интерлейкином-8 и хемокином CXCL1/GRO, а также в
значительной степени снижал MMP1-индуцированную
пролиферацию клеток эндотелия пупочной вены человека с
экспрессированным в них PAR1. Пептид YSRVGRSVTD
(X1/2LCA-i1), являющийся производным первой ЦП рецепторов
CXCR1 и CXCR2 и модифицированный с N-конца остатком
литохолевой кислоты, а также N-пальмитоилированный пептид
X1/2pal-i3 ингибировали образование трубок сосудов,
индуцированное интерлейкином-8, хемокином CXCL1/GRO или
компонентами среды, полученной от клеток OVCAR-4,
обработанных ММР1. Ингибирующий эффект пепдуцина
X1/2pal-i3 на формирование кровеносных сосудов в мышиной
модели ангиогенеза был сопоставимым с таковым известного
противоопухолевого препарата бевацизумаба. Трехнедельная
обработка мышей пепдуцином X1/2pal-i3 в 5 раз ослабляла
интенсивность ангиогенеза и в значительной степени уменьшала
415
прогрессирование развития опухоли в ксенотрансплантатах рака
яичников (Agarwal et al., 2010). Инъекция укороченного аналога
пепдуцина X1/2pal-i3, Palm-RTLFKAHMGQKHR, в дозе 2.5 мг/кг
мышам линии Apc–/+ приводила к снижению спонтанного
образования у них доброкачественных аденом кишечника
(Jamieson et al., 2012).
Хемокиновый рецептор CXCR4 и его лиганд, хемокин
CXCL12, называемый также производимым стромальными
клетками фактором-1 (stromal cell-derived factor-1, CXCL12/SDF-
1), участвуют в регуляции многих клеточных процессов. Они
контролируют транспорт лейкоцитов, В-клеточный лимфопоэз,
миелопоэз костного мозга, а также вовлечены в регуляцию
выживания и пролиферации гемопоэтических стволовых клеток
(Morrison et al., 1995; Nagasawa et al., 1996). Рецептор CXCR4 с
высокой интенсивностью экспрессируется во многих типах
опухолей, в том числе в злокачественных новообразованиях
головного мозга, в опухолях яичников, меланоме, в опухолевых
клетках колоректального рака, миелоидного и лимфоидного
лейкозов (Scala et al., 2005; Konoplev et al., 2007; Spoo et al., 2007).
Важно отметить, что некоторые из перечисленных выше
онкологических заболеваний имеют крайне неблагоприятный
прогноз и плохо поддаются лечению. Опухолевые клетки и их
микроокружение продуцируют большое количество хемокина
CXCL12/SDF-1, который связывается с рецептором CXCR4 и
активирует зависимые от него внутриклеточные ростовые и
антиапоптотические каскады. Результатом этого является
прогрессирование опухоли, активация опухолевого ангиогенеза, а
также усиление метастазирования и выживаемости опухолевых
клеток (Teicher, Fricker, 2010).
Как показано в доклинических и клинических
исследованиях, селективные антагонисты рецептора CXCR4, в
том числе CXCR4-пепдуцины, ингибируют передачу сигнала
через рецептор CXCR4 и, в сочетании с «классическими»
противоопухолевыми препаратами, эффективно подавляют рост
опухоли. Это указывает на перспективность их применения для
416
лечения CXCR4-ассоциированных опухолей (Burger, Peled, 2009;
Tavor, Petit, 2010; Janz et al., 2011).
N-пальмитоилированные пептиды, соответствующие
участку 63–74 первой ЦП и участку 224–239 третьей ЦП
рецептора CXCR4 человека, которые обозначены как PZ-218 и
PZ-210, специфически ингибируют CXCL12-индуцированные
ответы в нейтрофилах человека и мыши, а также блокируют
CXCL12-опосредованную миграцию клеток лимфомы и
лимфолейкоза (Kaneider et al., 2005; O'Callaghan et al., 2012).
Важно отметить, что аналоги пепдуцинов PZ-218 и PZ-210,
лишенные пальмитоильного радикала, а также аналог пепдуцина
PZ-218 с дополнительным С-концевым остатком лизина теряют
способность ингибировать хемотаксис клеток лейкемии и
лимфомы человека. Это указывает на то, что присутствие
гидрофобного пальмитата, а также распределение в пептиде
заряженных аминокислот являются важнейшими факторами,
определяющими антагонистическую активность CXCR4-
пепдуцинов в отношении гомологичного им рецептора
(O'Callaghan et al., 2012).
CXCR4-пепдуцины, используемые как отдельно, так и в
сочетании с препаратом ритуксимабом, представляющим собой
моноклональные антитела к ассоциированному с В-клетками
антигену CD20, эффективно подавляли выживаемость и
метастазирование диссеминированных ксенотрансплантатов
лимфомы, что можно использовать для разработки новой
стратегии лечения лимфоидных злокачественных
новообразований. Проапоптотический эффект ритуксимаба
полностью блокировался при обработке хемокином CXCL12,
агонистом рецептора CXCR4. В то же время при совместном
применении CXCR4-пепдуцина с антагонистической
активностью и препарата ритуксимаба ингибирующее действие
хемокина в отношении индукции процесса апопотоза
ритуксимабом не выявлялось. На основании сделан вывод о том,
что пепдуцины – производные рецептора CXCR4 – повышают
чувствительность клеток лимфомы к опосредованной
417
ритуксимабом гибели клеток, что указывает на синергизм
действия CXCR4-пепдуцинов с антагонистической активностью
и ритуксимаба (O'Callaghan et al., 2012).
Наряду с пепдуцинами, наделенными активностью
CXCR4-антагонистов, интенсивно разрабатываются CXCR4-
пепдуцины с активностью полных аллостерических агонистов
рецептора CXCR4, наибольший интерес среди которых
представляет пепдуцин ATI-2341, соответствующий участку
первой ЦП этого рецептора (Tchernychev et al., 2010). Показано,
что пепдуцин ATI-2341 вовлечен в реализацию хемотаксиса в
культуре клеток Т-лимфобластного лейкоза человека (CCRF-
CEM), экспрессирующих рецептор CXCR4, и в изолированных из
крови полиморфноядерных нейтрофилах, а также вовлечен в
мобилизацию полиморфноядерных нейтрофилов и
гемопоэтических стволовых клеток у человека и обезьян
(Tchernychev et al., 2010). Следует отметить, что в отличие от
используемого в клинике фактора SDF-1 (CXCL12), который
способствует мобилизации лимфоцитов в дополнение к
полиморфноядерным нейтрофилам и гемопоэтическим
стволовым клеткам, пепдуцин ATI-2341 не оказывает заметного
влияния на мобилизацию лимфоцитов, что указывает на
функциональную селективность его действия. Изучение мишеней
пепдуцина ATI-2341 показало его высокую селективность к
различным изоформам Gi/o-белков, в то время как фактор SDF-1
(природный CXCR4-агонист), наряду с Gi/o-белками,
стимулировал оба типа β-аррестинов и G13-белки, не являясь
избирательным по отношению к CXCR4-зависимым сигнальным
каскадам. Показано также, что пепдуцин ATI-2341 не вызывал
фосфорилирования цитоплазматических участков рецептора
CXCR4 GRK-киназами, что предотвращало десенситизацию
этого рецептора и сохраняло чувствительность клеток-мишеней к
регуляторному влиянию CXCR4-агонистов (Quoyer et al., 2013).
Таким образом, пепдуцины, являющиеся производными
цитоплазматических участков PAR1 и хемокиновых рецепторов
CXCR1, CXCR2 и CXCR4, обладают мощной противоопухолевой
418
активностью. В этом отношении они сопоставимы со многими
препаратами, широко применяемыми для лечения опухолей
репродуктивной системы и легкого, лимфоцитарных лейкозов и
других злокачественных новообразований, а в некоторых случаях
превосходят их по эффективности и селективности действия.
Противоопухолевый эффект пепдуцинов включает усиление
апоптоза злокачественных клеток, подавление агрегации
тромбоцитов и хемотаксиса, ингибирование опухолевого
ангиогенеза, что, в конечном итоге, приводит к снижению
выживаемости и роста опухоли. С помощью GPCR-пептидов,
производных PAR и хемокиновых рецепторов, обнаружены
новые механизмы онкогенеза и метастазирования, что важно для
дальнейшего развития таргетной противоопухолевой терапии.
8.5. GPCR-пептиды как регуляторы функций сердечно-

сосудистой системы
В 2014 году группой Jeffrey Benovic синтезированы и

изучены пепдуцины, соответствующие различным участкам
первой, второй и третьей ЦП β2-адренергического рецептора (β2-
АР) (Carr et al., 2014). В общей сложности были синтезированы
более 50 пептидов, модифицированных гидрофобными
радикалами. В результате были выявлены три группы
пепдуцинов, различающиеся механизмами действия на β2-АР и
сопряженные с ними Gs-белки. Первая группа представляла
собой пепдуцины, которые действовали независимо от рецептора
и непосредственно активировали Gs-белок (в соответствии с
описанным в разделе 8.1 вторым механизмом действия GPCR-
пептидов). Вторая группа пепдуцинов взаимодействовала с
комплементарными цитоплазматическими участками β2-АР (в
соответствии с описанным в разделе 8.1 первым механизмом
действия GPCR-пептидов), но при этом была селективна в
отношении β-аррестинового сигнального каскада, что, в
конечном итоге, приводило к десенситизации β2-АР-сигнальной
системы и снижению или полному блокированию ответа клетки
419
на β2-агонисты. Представители третьей группы пепдуцинов
зависимым от рецептора образом избирательно стимулировали
Gs-белок-опосредованные сигнальные пути. Результатом этого
была стабилизация активной конформации β2-АР, в которой
рецептор активировал Gs-белок и нижележащий цАМФ-
зависимый сигнальный каскад. При реализации такого механизма
стимуляции β2-АР не выявлялось или было слабо выражено
фосфорилирование рецептора специфичными GRK-киназами, что
предотвращало β-аррестин-опосредованную интернализацию
рецептора и сохраняло чувствительность клеток к регуляторному
влиянию β2-агонистов (Carr et al., 2014). Пепдуцины,
избирательно активирующие Gs-опосредованные или β-
аррестиновые сигнальные пути, представляют значительный
интерес для разработки на их основе фармакологических
препаратов и потому стали предметом дальнейшего изучения
(Carr et al., 2016; Grisanti et al., 2018).
В настоящее время установлено, что во время развития
застойной сердечной недостаточности повышается уровень
катехоламинов и усиливается их стимулирующее влияние на
адренергические сигнальные каскады в кардиомиоцитах, что
приводит к хронической активации как Gs-зависимых β1-АР, так
и Gi/o-зависимых β2-АР сигнальных путей. Результатом является
усиление апоптотических процессов в кардиомиоцитах и их
гибель, а также снижение экспрессии β1-АР и ослабление
инотропного резерва миокарда. Широко применяемые в
настоящее время β-блокаторы ослабляют чрезмерную
стимуляцию катехоламинами β-АР, ингибируя
проапоптотические каскады в миокарде и нормализуя уровень β1-
АР и инотропные эффекты катехоламинов, но это
сопровождается целым рядом серьезных побочных эффектов.
Для решения этих проблем необходима разработка селективных
регуляторов β1/2-АР-опосредуемых β-аррестиновых сигнальных
путей, независимых от G-белков, активация которых приводит к
транзиторной десенситизации β-АР и предотвращает гибель
кардиомиоцитов. Поскольку при застойной сердечной
420
недостаточности экспрессия β2-АР, в отличие от β1-АР, не
меняется, то наиболее подходящим кандидатом для запуска β-
аррестиновых путей является агонист β2-АР, способный
избирательно активировать β-аррестины. Наряду с β-аррестин-
специфичным β2-агонистом карведилолом, который связывается
с ортостерическим сайтом рецептора, в качестве такого агониста
может быть использован пепдуцин ICL1–9, структурно
соответствующий первой ЦП β2-АР, который взаимодействует с
аллостерическим сайтом рецептора (Carr et al., 2016). Будучи
сходным по эффективности с карведилолом, пепдуцин ICL1–9
стимулировал фосфорилирование β2-АР, индуцировал
рекрутирование β-аррестинов и последующую интернализацию
β2-АР, а также запускал β-аррестиновые сигнальные каскады в
культурах кардиомиоцитов. Необходимо отметить, что ICL1-9
был также способен индуцировать зависимую от β2-АР и β-
аррестинов и независимую от катионов кальция сократимость в
первичной культуре кардиомиоцитов взрослой мыши, в то время
как карведилол в этом отношении был не активен. Изучение
механизмов действия пепдуцина ICL1-9 показало, что он
усиливает активацию рецептора эпидермального фактора роста и
активность ERK1/2, основных компонентов каскада МАПК, в
культуре клеток HEK293, что свидетельствует о его мощном
ростстимулирующем и регенерационном потенциале (Carr et al.,
2016).
В дальнейшем был изучен кардиопротекторный эффект
пепдуцина ICL1-9 в модели острого ишемического повреждения
миокарда (Grisanti et al., 2018). Установлено, что
внутримиокардиальная инъекция мышам линии C57BL/6 этого
пепдуцина, осуществляемая во время травмирования животных,
уменьшала индуцированный ишемией/реперфузией размер
инфаркта миокарда, снижала гибель кардиомиоцитов и улучшала
функцию сердца при остром и длительном ремоделировании
миокардиального фиброза. При изучении механизмов действия
пепдуцина ICL1-9 было показано, что вызываемый им
антиапоптотический эффект в условиях ишемического
421
повреждения миокарда зависит от функционального состояния
β2-АР, а также от β-аррестинов 1-го (βarr1) или 2-го типов (βarr2),
поскольку у мутантных линий мышей, лишенных β2-АР и β-
аррестинов, кардиопротекторный эффект пепдуцина ICL1-9 был
подавлен. Интересен тот факт, что ключевую роль в механизмах
антиапоптотического эффекта пепдуцина ICL1-9 играет
RhoA/ROCK-сигнальный путь, в то время как Akt-киназа в этом
эффекте участвует опосредованно (Grisanti et al., 2018).
Полученные данные свидетельствуют о том, что пепдуцин ICL1–
9, функционируя как β2-АР-селективный аллостерический
регулятор, специфичный по отношению к β-аррестиновым
сигнальным каскадам, обладает выраженным
кардиопротекторным действием и может успешно
использоваться для лечения хронической сердечной
недостаточности и снижения реперфузионных повреждений
сердца (Carr et al., 2016; Grisanti et al., 2018).
8.6. GPCR-пептиды – регуляторы эндокринных функций
В настоящее время получено большое число данных об

эффективности GPCR-пептидов, как регуляторов и модуляторов
функций эндокринной и нейроэндокринной систем (Grasso et al.,
1995; Franzoni et al., 1997; Mukherjee et al., 1999; Plati et al., 2007;
Shpakov et al., 2007, 2011, 2012a; Hall et al., 2012; Shpakov,
Shpakova, 2011; Derkach et al., 2015). Следует, однако, отметить,
что в большинстве этих исследований была изучена активность
GPCR-пептидов in vitro, в то время как нами была изучена
активность пепдуцинов, являющихся производными первичной
структуры рецепторов ЛГ и ТТГ, in vivo при различных способах
их введения самцам крыс (Shpakova et al., 2012; Derkach et al.,
2015).
422
8.6.1. Пептиды – производные третьей цитоплазматической
петли рецептора лютеинизирующего гормона
Как отмечалось ранее (см. Главу 5), широко применяемые

для регуляции функциональной активности репродуктивной
системы гонадотропины имеют ряд серьезных недостатков. Так
показано, что рекомбинантные формы
фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), ЛГ и его
функционального и структурного гомолога – хорионического
гонадотропина человека (ХГЧ) – вызывают гиперактивацию
зависимых от них сигнальных каскадов. Это приводит к
развитию синдрома гиперстимуляции яичников, нарушениям
сперматогенеза и фолликулогенеза, снижению чувствительности
репродуктивных тканей к эндогенным гонадотропинам
(гонадотропиновой резистентности), а также к нарушению
функционирования гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси, как
результат изменений в ней системы отрицательных и
положительных обратных связей. Другой проблемой является
низкая селективность гонадотропинов, которые при воздействии
на клетки-мишени стимулируют сразу несколько
внутриклеточных сигнальных каскадов, что в условиях
системного применения гонадотропинов приводит к различным
побочным эффектам. Следует отметить, что природные формы
гонадотропинов более селективны в сравнении с их
рекомбинантными формами, но при этом они характеризуются
сравнительно низкой активностью, что типично для мочевых
форм ФСГ, или смещением физиологического паттерна действия
и высокой гетерогенностью, как это показано для плацентарной
формы ХГЧ, выделяемого из мочи беременных женщин. Более
того, в случае ЛГ природная форма гормона вообще не может
быть выделена в достаточных количествах, вледствие чего ЛГ в
клинике заменяют плацентарным ХГЧ, который не является
эквивалентным ему по спектру специфической биологической
активности, или используют не лишенный серьезных недостатков
рекомбинантный ЛГ.
423
Поскольку GPCR-пептиды и пепдуцины, их более
активные формы, взаимодействуют не с ортостерическим сайтом
рецептора ЛГ, локализованным в его значительном по размеру
эктодомене, а с его аллостерическими сайтами, расположенными
в цитоплазматических доменах рецептора, то их регулятрорное
действие в отношении активации определенного сигнального
каскада более специфично. Наряду с этим, аллостерические
агонисты не способны вызывать гиперактивацию рецептора, что
вытекает из механизмов их действия. Это предовращает
снижение чувствительности рецептора ЛГ к эндогенным
гонадотропинам. В ходе разработки пепдуцинов с активностью
аллостерических агонистов рецептора ЛГ на начальном этапе
нами был проведен структурный сравнительный анализ
цитоплазматических участков этого рецептора. В ходе такого
анализа было установлено, что ключевую роль во
взаимодействии с G-белками, в первую очередь с Gs-белками,
функционально сопряженными с АЦ, играет третья ЦП
рецептора ЛГ, а точнее ее С-концевая половина, обогащенная
положительно заряженными аминокислотными остатками,
которые обычно включены в G-белок-связывающий и G-белок-
активирующий сайты GPCR (Шпаков, 2002, 2003, 2009). При
выборе структуры GPCR-пептида – производного третьей ЦП
рецептора ЛГ – мы руководствовались тем, что этот пептид
должен иметь конформацию, сходную с таковой этого участка в
полноразмерном рецепторе, для чего необходима его
модификация гидрофобным радикалом, который будет
способствовать заякориванию GPCR-пептида в мембране и, тем
самым, стабилизировать его третичную структуру. Этот радикал
должен располагаться в том месте, где третья ЦП рецептора ЛГ
граничит с гидрофобной шестой ТМС, то есть близко к С-концу
полипептидной цепи.
Основываясь на этих критериях, нами был разработан и
синтезирован пальмитоилированный с C-конца пептид
NKDTKIAKK-Nle-A562–572-K(Palm)-A (562–572-K(Palm)A),
соответствующий С-концевому участку третьей ЦП рецептора
424
ЛГ, который в экспериментах in vitro и in vivo показал наличие
специфической биологической активности. Наряду с ним в
рамках сравнительного исследования были синтезированы и
изучены его аналоги – различающиеся по длине
немодифицированные пептиды 558–572 и 562–572, и
липофильные производные пептида 562–572, модифицированные
пальмитоильными и деканоильными радикалами с N- и C-концов,
а также разветвленные аналоги пептида 562–572 с дендримерной
структурой.
В результате проведенных исследований было
установлено, что более протяженный пептид L-Nle-
ATNKDTKIAKK-Nle-A558–572, модифицированный гидрофобным
радикалом пепдуцин 562–572-K(Palm)A, а также димерный
аналог, включающий сшитые через лизиновый мостик
последовательности 562–572 рецептора ЛГ стимулировали
активность АЦ в тестикулярных мембранах крыс со значениями
EC50 4.4, 2.3 и 3.5 мкМ (Shpakov et al., 2011). Сходные значения
EC50 для стимулирующего эффекта этих пептидов на активность
АЦ были получены в мембранах, выделенных из яичников самок
крыс. Показано также, что пептиды, производные третьей ЦП
рецептора ЛГ, стимулировали ГТФ-связывающую способность
G-белков, причем наиболее активным среди них был пепдуцин
562–572-K(Palm)A. Он превосходил как немодифицированый
аналог, так и более протяженный пептид 558–572. Это
подтверждает концепцию о том, что гидрофобный радикал,
имитирующий ТМ рецептора, исключительно важен для
активности GPCR-пептидов. С помощью подхода, включающего
АДФ-рибозилирование G-белков бактериальными токсинами,
была изучена специфичность пепдуцина 562–572-K(Palm)A и его
активных аналогов в отношении различных типов G-белков. В
результате было показано, что пепдуцин 562–572-K(Palm)A и его
аналоги специфично активируют чувствительные к холерному
токсину Gs-белки, но практически не влияют на активность Gi/o- и
Gq/11-белков. Действие пептидов было тканеспецифичным,
поскольку они влияли на активность АЦ и ГТФ-связывавние
425
только в тех тканях, где были экспрессированы рецепторы ЛГ
(Shpakov et al., 2012b).
Как отмечалось выше, важным при конструировании
пепдуцинов является выяснение того, в какой их позиции
находится гидрофобный радикал и каковы его физико-
химические свойства. При изучении различных вариантов
липофильных производных пептида 562–572, модифицированных
деканоильными и пальмитоильными радикалами с C-конца, с N-
конца или с обоих концов, было показано, что наиболее активен
среди них пепдуцин 562–572-K(Palm)A (Шпакова и др., 2013).
Пептиды, модифицированные с С-конца деканоатом, были менее
активны. Стимулирующий эффект пептида с двумя
деканоильными остатками достигал максимума при
концентрации 10 мкМ и в дальнейшем уже не менялся. Это
может быть связано с его способностью образовывать
мицеллоподобные структуры, что было экспериментально
доказано нами (Шпакова и др., 2017). Важно отметить, что в
случае других пептидов в микромолярных концентрациях такое
мицеллообразование отмечено не было. Образование
мицеллоподобных структур, как мы полагаем, ослабляет
взаимодействие пептида с рецептором и снижает его активность
как аллостерического регулятора рецептора ЛГ. Пептиды,
ацилированные с N-конца, независимо от длины
жирнокислотного радикала, практически не влияли на активность
АЦ (Шпакова и др., 2013). Таким образом, наши данные
подтверждают гипотезу о том, что гидрофобный радикал в
пептиде должен быть локализован в той позиции, в которой в
полноразмерном рецепторе ЛГ располагается ТМС, в нашем
случае шестая ТМС. Полученные результаты также
свидетельствуют о том, что в основе действия пепдуцинов лежит
их способность взаимодействовать с комплементарными
участками гомологичного рецептора, для чего необходимо
сходство ориентаций в примембранном пространстве пептида и
соответствующего ему участка в полноразмерном рецепторе.
Такое сходство обеспечивается эффективным заякориванием
426
пепдуцина 562–572-K(Palm)A вблизи цитоплазматического входа
в трансмембранный канал рецептора ЛГ с помощью C-концевого
гидрофобного пальмитата. Заякоривание пептида в мембране или
в гидрофобном коре цитоплазматической части рецептора также
стабилизирует его α-спиральную конформацию, что способствует
эффективному взаимодействию GPCR-пептида с рецептором ЛГ
и(или) Gs-белками (Shpakov, Shpakova, 2014; Шпакова и др.,
2017). Таким образом, нами впервые установлено, что
модификация остатком пальмитиновой кислоты пептида,
соответствующего С-концевому участку третьей ЦП рецептора
ЛГ, в значительной степени повышает его способность
стимулировать активность аденилатциклазной сигнальной
системы в репродуктивных тканях крыс, причем эта
модификация эффективна только в том случае, когда
гидрофобный радикал располагается на С-конце пептида,
мимикрируя шестую ТМС, и когда он сопоставим с этой ТМС по
размеру и гидрофобности.
Для изучения активности пепдуцина 562–572-K(Palm)A in
vivo осуществляли его внутрибрюшинное и интратестикулярное
введение самцам крыс линии Wistar (Деркач и др., 2014).
Показано, что при однократном внутрибрюшинном введении в
дозе 1.0 мг/кг пепдуцин 562–572-K(Palm)A и его
немодифицированный аналог, взятый в качестве контроля,
существенно не влияли на уровень тестостерона в крови самцов
крыс. Через 3 и 5 ч после инъекции пальмитоилированного
пептида наблюдали небольшое повышение уровня тестостерона,
но оно не было статистически значимым. Эти данные указывают
на отсутствие заметного влияния наиболее активного in vitro
пепдуцина 562–572-K(Palm)A на стероидогенез при его
внутрибрюшинном введении самцам крыс в дозе 1.0 мг/кг. При
интратестикулярном введении использовали более низкие дозы
пептидов, 50 и 200 мкг/кг, что обусловлено их доставкой
непосредственно к клеткам Лейдига – мишеням их регуляторного
действия. Немодифицированный пептид заметно не влиял на
уровень тестостерона, в то время как пепдуцин 562–572-
427
K(Palm)A при его введении в дозе 200 мкг/кг отчетливо повышал
концентрацию тестостерона в крови. Через 1, 3 и 5 ч после
инъекции пепдуцина 562–572-K(Palm)A уровень тестостерона
был выше такового в контроле на 74, 44 и 35 %, соответственно.
Интратестикулярное введение пепдуцина 562–572-K(Palm)A в
дозе 50 мкг/кг приводило лишь к небольшому повышению
концентрации тестостерона (Деркач и др., 2014). Полученные
результаты указывают на наличие стероидогенной активности у
пепдуцина 562–572-K(Palm)A, но при этом подчеркивают
необходимость разработки его лекарственных форм, которые
были бы активны не только при интратестикулярном, но при
внутрибрюшинном способе введения.
8.6.2. Пептиды – производные третьей цитоплазматической

петли рецептора тиреотропного гормона
Как отмечалось выше (см. Главу 6), в настоящее время

отсутствуют препараты, способные активировать синтез и
секрекцию тиреоидных гормонов тироцитами щитовидной
железы или, напротив, подавлять базальную или
стимулированую ТТГ продукцию ими тиреоидных гормонов.
Применение ТТГ ограничено его высоким онкогенным
потенциалом, а также высокой стоимостью и низкой
стабильностью препаратов рекомбинантного ТТГ. Фактически,
для стимуляции синтеза тиреоидных гормонов ТТГ применяют
только при необходимости стимуляции «закачки»
радиоактивного йода в тироциты при диагностике рака
щитовидной железы, причем ТТГ в этом случае применяется, как
правило, однократно. Соответственно, необходимо создание
полных агонистов, инверсионных агонистов и нейтральных
антагонистов рецептора ТТГ. Для этого могут быть использованы
два подхода. Первый из них, подробно представленный в Главе 6,
состоит в разработке низкомолекулярных аллостерических
регуляторов рецептора ТТГ. Другой подход, приведенный ниже и
интенсивно разрабатываемый нами, включает создание
428
пепдуцинов – аллостерических регуляторов рецептора ТТГ,
структурно соответствующих его цитоплазматическим участкам.
Нами синтезирован и исследован in vitro и in vivo
модифицированный с C-конца пальмитатом пепдуцин 612–
627(Palm), соответствующий по первичной структуре С-
концевому участку третьей ЦП рецептора ТТГ. Он дозозависимо
стимулировал активность чувствительной к ТТГ
аденилатциклазной сигнальной системы в мембранах,
выделенных из щитовидной железы крыс. Его действие было
специфичным по отношению к рецептору ТТГ, а эффективность
в значительной степени превосходила таковую для аналогов
пептида 612–627, в которых C-концевой остаток пальмитиновой
кислоты отсутствовал (Shpakov et al., 2012; Shpakova et al., 2012;
Шпаков и др., 2014).
В экспериментах in vivo было показано, что при
интраназальном введении самцам крыс Wistar пепдуцин 612–
627(Palm) повышал у них уровень тиреоидных гормонов, и этот
эффект являлся дозозависимым. В дозах 90 и 225 мкг/кг
пепдуцин достоверно повышал только уровень свободного
тироксина, в то время как в дозах 450 и 900 мкг/кг он усиливал
продукцию всех изучаемых форм тиреоидных гормонов –
свободного и общего тироксина и общего трийодтиронина. Его
максимальный стимулирующий эффект на уровень свободного
тироксина достигался через 2 ч после интраназального введения в
дозе 450 мкг/кг. При повышении дозы пепдуцина 612–627(Palm)
до 900 мкг/кг его максимальный стимулирующий эффект на
продукцию тироксина уже не менялся, достигая насыщения
(Деркач и др., 2015; Derkach et al., 2015).
Максимальный стимулирующий эффект пепдуцина 612–
627(Palm) на уровень общего трийодтиронина достигался через 2
ч после его интраназального введения в дозе 225 мкг/кг и заметно
не менялся при повышении дозы до 450 и 900 мкг/кг. Однако при
повышении дозы пепдуцина менялась временная динамика его
влияния на уровень общего трийодтиронина. В дозе 225 мкг/кг
через 6 ч после обработки его уровень не отличался от такового в
429
контроле, в то время как при использовании более высоких доз
пептида уровень общего трийодтиронина через 4 и 6 ч был
достоверно выше, чем в контроле. Отличия во временной
динамике повышения уровней свободного тироксина и общего
трийодтиронина под действием пепдуцина обусловлены тем, что
пептид сначала активирует рецептор ТТГ, что приводит к
стимуляции синтеза и секреции тироксина, который уже в
дальнейшем с помощью D2-дейодиназы в щитовидной железе и
других тканях превращается в трийодтиронин, и этот процесс
является времязатратным. Значения ED50 для стимулирующего
эффекта интраназально вводимого пепдуцина 612–627(Palm) на
уровни свободного тироксина и общего трийодтиронина
составили 87 и 78 мкг/кг, соответственно. Сделан вывод, что при
повышении дозы пепдуцина достигается более продолжительная
стимуляция тироцитов, но эффективность такой стимуляции уже
не меняется (Деркач и др., 2015).
При внутримышечном введении эффективность
стимулирующего влияния пепдуцина 612–627(Palm) на уровни
тиреоидных гормонов была выражена слабее. В случае
свободного тироксина достоверное повышение его уровня было
отмечено только через 2 и 4 ч после обработки пепдуцином в
дозах 900 и 1350 мкг/кг, в то время как для общего тироксина и
общего трийодтиронина различия с контролем не были
статистически значимыми. Максимальные стимулирующие
эффекты внутримышечно вводимого пепдуцина 612–627(Palm)
(900 мкг/кг) для свободного тироксина и общего трийодтиронина
составили 68 и 54 % от таковых при интраназальном введении.
Значение ED50 для стимулирующего эффекта внутримышечно
вводимого пепдуцина 612–627(Palm) на уровень свободного
тироксина составило 275 мкг/кг, и было в три раза выше значения
ED50 для интраназально вводимого пепдуцина. Выявленные
различия в стимулирующем эффекте пепдуцина 612–627(Palm)
при интраназальном и внутримышечном способах введения, как
мы полагаем, связаны с различиями в эффективности его
доставки к тироцитам, в которых локализованы рецепторы ТТГ.
430
Следует отметить, что интраназальный способ введения широко
применяется для доставки пептидных препаратов, как в ЦНС, так
и в периферические ткани, расположенные вблизи выходов
гипоталамических нейронов (Chapman et al., 2013). Нельзя
исключить, что при внутримышечном введении пептид более
интенсивно деградирует под действием протеаз, что обусловлено
наличием в его структуре кластеров положительно заряженных
аминокислот – мишеней этих ферментов (Деркач и др., 2015;
Derkach et al., 2015). Таким образом, пепдуцин 612–627(Palm),
который in vitro и in vivo проявляет активность внутриклеточного
аллостерического агониста рецептора ТТГ, может
рассматриваться как потенциально активный препарат,
предназначенный для стимуляции тиреоидогенной функции
щитовидной железы.
8.7. Некоторые перспективы использования и

разработки GPCR-пептидов
Представленные в этой главе данные свидетельствуют о

том, что в последние годы достигнут значительный прогресс в
области разработки высокоселективных и высокоэффективных
GPCR-пептидов, структурно соответствующих
цитоплазматическим участкам различных типов GPCR. Однако
потенциал и перспективы применения GPCR-пептидов в
клинической медицине до сих пор не реализованы. Для
дальнейшего прогресса в этой области необходимо решить ряд
проблем. Во-первых, требуется разработка новых подходов для
модификации GPCR-пептидов, которые позволили бы создать на
их основе активные аналоги с повышенной устойчивостью и
биодоступностью. Во-вторых, необходимо расширение спектра
изучаемых GPCR-пептидов, в первую очередь за счет увеличения
числа рецепторов, являющихся «лекалами» для создания GPCR-
пептидов. В настоящее время детальные исследования GPCR-
пептидов и их аналогов проведены для сравнительно небольшого
числа GPCR, среди которых рецепторы PAR-семейства,
431
некоторые типы хемокиновых рецепторов, серотониновые
рецепторы, β-АР, рецепторы гипофизарных гликопротеиновых
гормонов. Важно также апробировать новые подходы,
позволяющие повысить биодоступность GPCR-пептидов in vivo,
что необходимо для их применения в клинике. Учитывая
быструю деградацию GPCR-пептидов, особенно обогащенных
положительно заряженными аминокислотами, в желудочно-
кишечном тракте при пероральном введении, а также их
сравнительно низкую биодоступность при подкожном,
внутримышечном и внутрибрюшинном способах введения,
целесообразна разработка таких лекарственных форм GPCR-
пептидов, в которых была бы обеспечена их устойчивость к
протеолитическим ферментам и которые могли бы повысить
эффективность их доставки к клеткам-мишеням. В том случае,
когда мишени GPCR-пептидов расположены в ЦНС или вблизи
выходов гипоталамических нейронов целесообразно
использовать интраназальный способ введения, как успешно
продемонстрировано нами in vivo для пептида – производного
рецептора ТТГ, мишенями которого являются тироциты
щитовидной железы (Derkach et al., 2015).
Как обсуждалось ранее, передача гормонального сигнала
от активированного лигандом GPCR к внутриклеточным
мишеням опосредуется не только через посредство G-белков, но
и через β-аррестиновые сигнальные каскады (Shukla et al., 2011;
Reiter et al., 2012). Ключевая роль во взаимодействии рецептора с
β-аррестинами принадлежит его третьей ЦП и внутриклеточному
C-концевому домену (Shenoy, Lefkowitz, 2011). В ряде работ
изучена способность GPCR-пептидов регулировать β-
аррестиновые сигнальные пути (Gelber et al., 1999; Mukherjee et
al., 1999; Anthony et al., 2011; Cawston et al., 2012; Carr et al., 2014,
2016; Grisanti et al., 2018). Изучение механизмов действия GPCR-
пептидов на β-аррестиновые сигнальные пути способствует
созданию β-аррестин-специфичных GPCR-пептидов, которые
могут селективно регулировать зависимые от β-аррестинов
эффекторные системы клетки, не затрагивая при этом G-белок-
432
зависимые пути. Такие пептиды могут иметь большое значение в
качестве функциональных зондов, предназначенных для
изучения передачи гормонального сигнала через β-аррестины, а
также могут быть полезны в медицине, как новые селективные
внутриклеточные аллостерические агонисты и антагонисты,
специфичные по отношению к β-аррестиновым сигнальным
каскадам.
Деркач К.В., Шпакова Е.А., Бондарева В.М., Шпаков А.О.

Исследование дозо-зависимости стимулирующего влияния пептида,
производного рецептора тиреотропного гормона, на продукцию тиреоидных
гормонов у крыс // Трансляционная медицина. 2015. № 1(30). С. 15–21.
Деркач К.В., Шпакова Е.А., Шпаков А.О. Пальмитоилированный
пептид 562–572 рецептора лютеинизирующего гормона повышает уровень
тестостерона у самцов крыс // Бюл. экспер. биол. мед. 2014. Т. 158. № 8. С. 172–
176.
Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты в рецепторах
серпантинного типа, ответственные за их функциональное сопряжение с
гетеротримерными G-белками // Цитология. 2002. T. 44. № 3. C. 242–258.
Шпаков А.О. Участие заряженных аминокислотных остатков
цитоплазматических петель рецепторов серпантинного типа в процессе
передачи гормонального сигнала // Журн. эволюц. биохимии и физиологии.
2003. T. 39. № 3. C. 205–217.
Шпаков А.О. Структурно-функциональная организация рецепторов
полипептидных гормонов, содержащих LRR-повторы, и их взаимодействие с
гетеротримерными G-белками // Цитология. 2009. Т. 51. № 8. С. 638–649.
Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Баянова Н.В., Власов Г.П. Рецептор
серпантинного типа и гетеротримерный G-белок как мишени действия
полилизиновых дендримеров // Цитология. 2008. Т. 50. № 12. С. 1036–1043.
Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Воробьев В.И., Авдеева Е.В., Кузнецова
Л.А., Плеснева С.А., Чубей Н.М., Перцева М.Н., Власов Г.П. Разобщающее
действие катионных пептидов, содержащих гидрофобные радикалы, на
функциональное сопряжение рецепторов серпантинного типа с ГТФ-
связывающими белками // Цитология. 2004. T. 46. № 3. C. 268–276.
Шпаков А.О., Шпакова Е.А., Тарасенко И.И., Деркач К.В. Пептид 612–
627 рецептора тиреотропного гормона и его модифицированные аналоги как
регуляторы аденилатциклазы в щитовидной железе крыс // Цитология. 2014. Т.
56, № 7. C. 526–535.
433
Шпакова Е.А., Деркач К.В., Шпаков А.О. Биологическая активность
липофильных производных пептида 562–572 рецептора лютеинизирующего
гормона крысы // Докл. Академии наук. 2013. Т. 452. № 4. С. 453–456.
Шпакова Е.А., Сорокоумов В.Н., Акентьев А.В., Деркач К.В., Тенникова
Т.Б., Шпаков А.О. Взаимосвязь между мицеллообразованием и биологической
активностью пептида 562–572 рецептора лютеинизирующего гормона,
модифицированного деканоильными радикалами // Цитология. 2017. Т. 59. № 2.
C. 133–139.
Abdel-Latif A., Smyth S.S. Preventing platelet thrombosis with a PAR1
pepducin // Circulation. 2012. V. 126. P. 13–15. doi:
Adams M.N., Ramachandran R., Yau M.K., Suen J.Y., Fairlie D.P.,
Hollenberg M.D., Hooper J.D. Structure, function and pathophysiology of protease
activated receptors // Pharmacol. Ther. 2011. V. 130 (3). P. 248–282. doi:
10.1016/j.pharmthera.2011.01.003.
Agarwal A., Covic L., Sevigny L.M., Kaneider N.C., Lazarides K.,
Azabdaftari G., Sharifi S., Kuliopulos A. Targeting a metalloprotease-PAR1 signaling
system with cell-penetrating pepducins inhibits angiogenesis, ascites, and progression
of ovarian cancer // Mol. Cancer Ther. 2008. V. 7 (9). P. 2746–2757. doi:
10.1158/1535-7163.MCT-08-0177.
Agarwal A., Tressel S.L., Kaimal R., Balla M., Lam F.H., Covic L.,
Kuliopulos A. Identification of a metalloprotease-chemokine signaling system in the
ovarian cancer microenvironment: implications for antiangiogenic therapy // Cancer
Res. 2010. V. 70. P. 5880–5890. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-09-4341.
Anthony D.F., Sin Y.Y., Vadrevu S., Advant N., Day J.P., Byrne A.M., Lynch
M.J., Milligan G., Houslay M.D., Baillie G.S. β-Arrestin 1 inhibits the GTPase-
activating protein function of ARHGAP21, promoting activation of RhoA following
angiotensin II type 1A receptor stimulation // Mol. Cell. Biol. 2011. V. 31. P. 1066–
1075. doi: 10.1128/MCB.00883-10.
Asehnoune K., Moine P. Protease-activated receptor-1: key player in the
sepsis coagulation-inflammation crosstalk // Crit. Care. 2013. V. 17. P. 119.
doi:10.1186/cc12502.
Balau L.S., Vahlberg C., Petoral R.M., Uvdal K. Mixed monolayers to
promote G-protein adsorption: α2A-adrenergic receptor-derived peptides coadsorbed
with formyl-terminated oligopeptides // Langmuir. 2007. V. 23. P. 8474–8479. doi:
10.1021/la063447f.
Barr T.P., Garzia C., Guha S., Fletcher E.K., Nguyen N., Wieschhaus A.J.,
Ferrer L., Covic L., Kuliopulos A. PAR2 Pepducin-Based Suppression of
Inflammation and Itch in Atopic Dermatitis Models // J. Invest. Dermatol. 2019. V.
139 (2). P. 412–421. doi: 10.1016/j.jid.2018.08.019.
Bavec A., Hallbrink M., Langel U., Zorko M. Different role of intracellular
loops of glucagon-like peptide-1 receptor in G-protein coupling // Regul. Pept. 2003.
V. 111. P. 137–144. dx.doi.org/10.1016/S0167-0115(02)00282-3.
434
Boire A., Covic L., Agarwal A., Jacques S., Sherifi S., Kuliopulos A. PAR1
is a matrix metalloprotease-1 receptor that promotes invasion and tumorigenesis of
breast cancer cells // Cell. 2005. V. 120. P. 303–313. doi: 10.1016/j.cell.2004.12.018.
Breitweg-Lehmann E., Czupalla C., Storm R., Kudlacek O., Schunack W.,
Freissmuth M., Nürnberg B. Activation and inhibition of G protein by lipoamines //
Mol. Pharmacol. 2002. V. 61 (3). P. 628–636. doi: 10.1124/mol.61.3.628.
Burger J.A., Peled A. CXCR4 antagonists: targeting the microenvironment
in leukemia and other cancers // Leukemia. 2009. V. 23. P. 43–52. doi:
10.1038/leu.2008.299.
Carr R. 3rd, Du Y., Quoyer J., Panettieri R.A. Jr, Janz J.M., Bouvier M.,
Kobilka B.K., Benovic J.L. Development and characterization of pepducins as Gs-
biased allosteric agonists // J. Biol. Chem. 2014. V. 289 (52). P. 35668–35684. doi:
10.1074/jbc.M114.618819.
Carr R. 3rd, Schilling J., Song J., Carter R.L., Du Y., Yoo S.M., Traynham
C.J., Koch W.J., Cheung J.Y., Tilley D.G., Benovic J.L. beta-arrestin-biased signaling
through the beta2-adrenergic receptor promotes cardiomyocyte contraction // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 2016. V. 113 (28). P. E4107–E4116. doi:
10.1073/pnas.1606267113.
Cawston E.E., Harikumar K.G., Miller L.J. Ligand-induced internalization
of the type 1 cholecystokinin receptor independent of recognized signaling activity //
Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2012. V. 302. P. C615–C627. doi:
10.1152/ajpcell.00193.2011.
Cisowski J., O'Callaghan K., Kuliopulos A., Yang J., Nguyen N., Deng Q.,
Yang E., Fogel M., Tressel S., Foley C., Agarwal A., Hunt S.W. 3rd, McMurry T.,
Brinckerhoff L., Covic L. Targeting protease-activated receptor-1 with cell-penetrating
pepducins in lung cancer // Am. J. Pathol. 2011. V. 179 (1). P. 513–523. doi:
10.1016/j.ajpath.2011.03.025.
Chakraborty R., Pydi S.P., Gleim S., Bhullar R.P., Hwa J., Dakshinamurti
S., Chelikani P. New insights into structural determinants for prostanoid thromboxane
A2 receptor- and prostacyclin receptor-G protein coupling // Mol. Cell. Biol. 2013. V.
33 (2). P. 184–193. doi: 10.1128/MCB.00725-12.
Chapman C.D., Frey W.H., Craft S., Danielyan L., Hallschmid M., Schiöth
H.B., Benedict C. Intranasal treatment of central nervous system dysfunction in
humans // Pharm. Res. 2013. V. 30. P. 2475–2484.
Covic L., Gresser A.L., Talavera J., Swift S., Kuliopulos A. Activation and
inhibition of G protein-coupled receptors by cell-penetrating membrane-tethered
peptides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002a. V. 99. P. 643–648. doi:
10.1073/pnas.022460899.
Covic L., Kuliopulos A. Protease-Activated Receptor 1 as Therapeutic
Target in Breast, Lung, and Ovarian Cancer: Pepducin Approach // Int. J. Mol. Sci.
2018. V. 19 (8). pii: E2237. doi: 10.3390/ijms19082237.
435
Covic L., Misra M., Badar J., Singh C., Kuliopulos A. Pepducin-based
intervention of thrombin-receptor signaling and systemic platelet activation // Nat.
Med. 2002b. V. 8. P. 1161–1165. doi:10.1038/nm760.
Covic L., Tchernychev B., Jacques S., Kuliopulos A. Pharmacology and in
vivo efficacy of pepducins in hemostasis and arterial thrombosis // Handbook of Cell-
Penetrating Peptides. Taylor & Francis, N.Y. 2007. P. 245–257. doi:
10.1201/9781420006087.ch14.
Dabek M., Ferrier L., Annahazi A., Bézirard V., Polizzi A., Cartier C.,
Leveque M., Roka R., Wittmann T., Theodorou V., Bueno L. Intracolonic infusion of
fecal supernatants from ulcerative colitis patients triggers altered permeability and
inflammation in mice: role of cathepsin G and protease-activated receptor-4 //
Inflamm. Bowel Dis. 2011. V. 17 (6). P. 1409–1414. doi: 10.1002/ibd.21454.
De Backer D. Hemodynamic management of septic shock // Curr. Infect.
Dis. Rep. 2006. V. 8. P. 366–372.
Derian C.K., Damiano B.P., Addo M.F., Darrow A.L., D’Andrea M.R.,
Nedelman M., Zhang H.C., Maryanoff B.E., Andrade-Gordon P. Blockade of the
thrombin protease-activated receptor-1 with a small molecule antagonist prevents
thrombus formation and vascular occlusion in nonhuman primates // J. Pharmacol.
Exp. Ther. 2003. V. 304 (2). P. 855–861. doi: 10.1124/jpet.102.042663.
Derkach K.V., Shpakova E.A., Titov A.M., Shpakov A.O. Intranasal and
intramuscular administration of lysine-palmitoylated peptide 612-627 of thyroid-
stimulating hormone receptor increases the level of thyroid hormones in rats // Int. J.
Pept. Res. Ther. 2015. V. 21. P. 249–260.
Feihl F., Waeber B., Liaudet L. The hemodynamics of septic shock: a
historical perspective // Curr. Vasc. Pharmacol. 2013. V. 11. P. 133–138. DOI:
10.2174/1570161111311020003.
Foley C.J., Kuliopulos A. Mouse matrix metalloprotease-1a (Mmp1a) gives
new insight into MMP function // J. Cell. Physiol. 2014. V. 229. P. 1875–1880. doi:
10.1002/jcp.24650.
Foley C.J., Luo C., O'Callaghan K., Hinds P.W., Covic L., Kuliopulos A.
Matrix metalloprotease-1a promotes tumorigenesis and metastasis // J. Biol. Chem.
2012. V. 287. P. 24330–24338. doi: 10.1074/jbc.M112.356303.
Forsman H., Andréasson E., Karlsson J., Boulay F., Rabiet M.J., Dahlgren
C. Structural characterization and inhibitory profile of formyl peptide receptor 2
selective peptides descending from a PIP2-binding domain of gelsolin // J. Immunol.
2012. V. 189. P. 629–637. doi: 10.4049/jimmunol.1101616.
Franzoni L., Nicastro G., Pertinhez T.A., Tato M., Nakaie C.R., Paiva A.C.,
Schreier S., Spisni A. Structure of the C-terminal fragment 300-320 of the rat
angiotensin II AT1A receptor and its relevance with respect to G protein coupling // J.
Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 9734–9741. doi: 10.1074/jbc.272.15.9734.
Fukushima N., Kohno M., Kato T., Kawamoto S., Okuda K., Misu Y., Ueda
H. Melittin, a metabostatic peptide inhibiting Gs activity // Peptides. 1998. V. 19 (5).
P. 811–819. dx.doi.org/10.1016/S0196-9781(98)00027-8.
436
Gelber E.I., Kroeze W.K., Willins D.L., Gray J.A., Sinar C.A., Hyde E.G.,
Gurevich V., Benovic J., Roth B.L. Structure and function of the third intracellular
loop of the 5-hydroxytryptamine2A receptor: the third intracellular loop is α-helical
and binds purified arrestins // J. Neurochem. 1999. V. 72 (5). P. 2206–2214. doi:
10.1046/j.1471-4159.1999.0722206.x.
George S.R., Ng G.Y., Lee S.P., Fan T., Varghese G., Wang C., Deber C.M.,
Seeman P., O'Dowd B.F. Blockade of G protein-coupled receptors and the dopamine
transporter by a transmembrane domain peptide: novel strategy for functional
inhibition of membrane proteins in vivo // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003. V. 307 (2).
P. 481–489. doi: 10.1124/jpet.103.053843.
Gieseler F., Ungefroren H., Settmacher U., Hollenberg M.D., Kaufmann R.
Proteinase-activated receptors (PARs) - focus on receptor-receptor-interactions and
their physiological and pathophysiological impact // Cell. Commun. Signal. 2013. V.
11. P. 86. doi: 10.1186/1478-811X-11-86.
Granier S., Terrillon S., Pascal R., Demene H., Bouvier M., Guillon G.,
Mendre C. A cyclic peptide mimicking the third intracellular loop of the V2
vasopressin receptor inhibits signaling through its interaction with receptor dimer and
G protein // J. Biol. Chem. 2004. V. 279 (49). P. 50904–50914. doi:
10.1074/jbc.M405089200.
Grasso P., Leng N., Reichert L.E. A synthetic peptide corresponding to the
third cytoplasmic loop (residues 533 to 555) of the testicular follicle-stimulating
hormone receptor affects signal transduction in rat testis membranes and in intact
cultured rat Sertoli cells // Mol. Cell. Endocrinol. 1995. V. 110. P. 35–41.
Grisanti L.A., Thomas T.P., Carter R.L., de Lucia C., Gao E., Koch W.J.,
Benovic J.L., Tilley D.G. Pepducin-mediated cardioprotection via β-arrestin-biased
β2-adrenergic receptor-specific signaling // Theranostics. 2018. V. 8 (17). P. 4664–
4678. doi: 10.7150/thno.26619.
Grover S.P., Bergmeier W., Mackman N. Platelet Signaling Pathways and
New Inhibitors // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2018. V. 38 (4). P. e28–e35. doi:
10.1161/ATVBAHA.118.310224.
Gurbel P.A., Bliden K.P., Turner S.E., Tantry U.S., Gesheff M.G., Barr T.P.,
Kuliopulos A. Cell-Penetrating Pepducin Therapy Targeting PAR1 in Subjects With
Coronary Artery Disease // Arterioscler. Thromb. Vas. Biol. 2016. V. 36. P. 189–197.
doi: 10.1161/ATVBAHA.115.306777.
Habault J., Poyet J.L. Recent Advances in Cell Penetrating Peptide-Based
Anticancer Therapies // Molecules. 2019. V. 24 (5). pii: E927. doi:
10.3390/molecules24050927.
Hall B., Squires C., Parker K.K. Peptides of the Human 5HT1a Receptor
are Differential Activators of Gi // Int. J. Pept. 2012. V. 2012. P. 490734. doi:
10.1155/2012/490734.
Hedin K.E., Duerson K., Clapham D.E. Specificity of receptor-G protein
interactions: searching for the structure behind the signal // Cell. Signal. 1993. V. 5. P.
505–518. dx.doi.org/10.1016/0898-6568(93)90046-O.
437
Higashijima T., Burnier J., Ross E.M. Regulation of Gi and Go by
mastoparan, related amphiphilic peptides and hydrophobic amines // J. Biol. Chem.
1990. V. 265. P. 14176–14186.
Jamieson T., Clarke M., Steele C.W., Samuel M.S., Neumann J., Jung A.,
Huels D., Olson M.F., Das S., Nibbs R.J., Sansom O.J. Inhibition of CXCR2
profoundly suppresses inflammation-driven and spontaneous tumorigenesis // J. Clin.
Invest. 2012. V. 122 (9). P. 3127–3144. doi: 10.1172/JCI61067.
Janz J.M., Ren Y., Looby R., Kazmi M.A., Sachdev P., Grunbeck A., Haggis
L., Chinnapen D., Lin A.Y., Seibert C., McMurry T., Carlson K.E., Muir T.W., Hunt S.
3rd, Sakmar T.P. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the
chemokine receptor CXCR4 // J. Amer. Chem. Soc. 2011. V. 133 (40). P. 15878–
15881. doi: 10.1021/ja206661w.
Johnston C.A., Siderovski D.P. Structural basis for nucleotide exchange on
Gi subunits and receptor coupling specificity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V.
104. P. 2001–2006. doi: 10.1073/pnas.0608599104.
Kaneider N.C., Agarwal A., Leger A.J., Kuliopulos A. Reversing systemic
inflammatory response syndrome with chemokine receptor pepducins // Nat. Med.
2005. V. 11. P. 661–665. doi:10.1038/nm1245.
Kaneider N.C., Leger A.J., Agarwal A., Nguyen N., Perides G., Derian C.,
Covic L., Kuliopulos A. Role reversal for the receptor PAR1 in sepsis-induced
vascular damage // Nat. Immunol. 2007. V. 8 (12). P. 1303–1312. doi:
10.1038/ni1525.
Kaufmann R., Hascher A., Mussbach F., Henklein P., Katenkamp K.,
Westermann M., et al. Proteinase-activated receptor 2 (PAR2) in cholangiocarcinoma
(CCA) cells: effects on signaling and cellular level // Histochem. Cell. Biol. 2012. V.
138. P. 913–924. doi: 10.1007/s00418-012-1006-4.
Konig B., Gratzel M. Site of dopamine D1 receptor binding to Gs protein
mapping with synthetic peptides // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1223. P. 261–
266. doi.org/10.1016/0167-4889(94)90235-6.
Konoplev S., Rassidakis G.Z., Estey E., Kantarjian H., Liakou C.I., Huang
X., Xiao L., Andreeff M., Konopleva M., Medeiros L.J. Overexpression of CXCR4
predicts adverse overall and event-free survival in patients with unmutated FLT3
acute myeloid leukemia with normal karyotype // Cancer. 2007. V. 109 (6). P. 1152–
1156. doi: 10.1002/cncr.22510.
Kubo S., Ishiki T., Doe I., Sekiguchi F., Nishikawa H., Kawai K., Matsui H.,
Kawabata A. Distinct activity of peptide mimetic intracellular ligands (pepducins) for
proteinase-activated receptor-1 in multiple cells/tissues // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006.
V. 1091. P. 445–459. doi: 10.1196/annals.1378.087.
Kyriazis I., Ellul J., Katsakiori P., Panayiotakopoulos G., Flordellis C. The
multiple layers of signaling selectivity at protease-activated receptors // Curr. Pharm.
Des. 2012. V. 18. P. 161–174. doi: 10.2174/138161212799040484.
Laukkarinen J.M., Weiss E.R., van Acker G.J., Steer M.L., Perides G.
Protease-activated receptor-2 exerts contrasting model-specific effects on acute
438
experimental pancreatitis // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 20703–20712. doi:
10.1074/jbc.M801779200.
Lee W.K., Han J.J., Jin B.S., Boo D.W., Yu Y.G. Functional reconstitution of
the human serotonin receptor 5-HT6 using synthetic transmembrane peptides //
Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 390. P. 815–820. doi:
10.1016/j.bbrc.2009.10.055.
Leger A.J., Jacques S.L., Badar J., Kaneider N.C., Derian C.K., Andrade-
Gordon P., Covic L., Kuliopulos A. Blocking the protease-activated receptor 1–4
heterodimer in platelet-mediated thrombosis // Circulation. 2006. V. 113. P. 1244–
1245. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.105.587758.
Licht T., Tsirulnikov L., Reuveni H., Yarnitzky T., Ben-Sasson S.A. Induction
of pro-angiogenic signaling by a synthetic peptide derived from the second
intracellular loop of S1P3 (EDG3) // Blood. 2003. V. 102. P. 2099–2107. doi:
10.1182/blood-2002-12-3634.
Megaritis G., Merkouris M., Georgoussi Z. Functional domains of - and -
opioid receptors responsible for adenylyl cyclase inhibition // Receptors Channels.
2000. V. 7. P. 199–212.
Michael E.S., Kuliopulos A., Covic L., Steer M.L., Perides G.
Pharmacological inhibition of PAR2 with the pepducin P2pal-18S protects mice
against acute experimental biliary pancreatitis // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver
Physiol. 2013. V. 304. P. G516-G526. doi: 10.1152/ajpgi.00296.2012.
Miller J., Agarwal A., Devi L.A., Fontanini K., Hamilton J.A., Pin J.P.,
Shields D.C., Spek C.A., Sakmar T.P., Kuliopulos A., Hunt S.W. 3rd. Insider access:
pepducin symposium explores a new approach to GPCR modulation // Ann. N.Y.
Acad. Sci. 2009. V. 1180. P. 1–12. doi: 10.1111/j.1749-6632.2009.05326.x.
Morrison S.J., Uchida N., Weissman I.L. The biology of hematopoietic stem
cells // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1995. V. 11. P. 35–71. doi:
10.1146/annurev.cb.11.110195.000343.
Mousli M., Bronner C., Bueb J.L., Tschirhart E., Gies J.P., Landry Y.
Activation of rat peritoneal mast cells by substance P and mastoparan // J. Pharmacol.
Exp. Ther. 1989. V. 250. P. 329–335. dx.doi.org/10.1016/0014-5793(90)80023-C.
Mukai H., Kikuchi M., Fukuhara S., Kiso Y., Munekata E. Cryptide
signaling: amphiphilic peptide-induced exocytotic mechanisms in mast cells //
Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. V. 375. P. 22–26. doi:
10.1016/j.bbrc.2008.07.081.
Mukherjee S., Palczewski K., Gurevich V.V., Hunzicker-Dunn M. β-arrestin-
dependent desensitization of luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor is
prevented by a synthetic peptide corresponding to the third intracellular loop of the
receptor // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 12984–12989. doi:
10.1074/jbc.274.19.12984.
Mukhopadhyay S., Howlett A.C. CB1 receptor–G protein association:
subtype selectivity is determined by distinct intracellular domains // Eur. J. Biochem.
2001. V. 268. P. 499–505. doi: 10.1046/j.1432-1327.2001.01810.x.
439
Munch G., Dees C., Heckman M., Palm D. Multisite contacts involved in
coupling of the β-adrenergic receptor with the stimulatory guanine-nucleotide-binding
regulatory protein: structural and functional studies by β-receptor-site-specific
synthetic peptides // Eur. J. Biochem. 1991. V. 198. P. 357–364. doi: 10.1111/j.1432-
1033.1991.tb16023.x.
Muramatsu T., Suwa M. Statistical analysis and prediction of functional
residues effective for GPCR–G-protein coupling selectivity // Protein Eng. Des. Sel.
2006. V. 19. P. 277–283. doi: 10.1093/protein/gzl010.
Nagasawa T., Hirota S., Tachibana K., Takakura N., Nishikawa S.,
Kitamura Y., Yoshida N., Kikutani H., Kishimoto T. Defects of B-cell lymphopoiesis
and bone-marrow myelopoiesis in mice lacking the CXC chemokine PBSF/SDF-1 //
Nature. 1996. V. 382 (6592). P. 635–638. doi:10.1038/382635a0.
Naider F., Khare S., Arshava B., Severino B., Russo J., Becker J.M.
Synthetic peptides as probes for conformational preferences of domains of membrane
receptors // Biopolymers. 2005. V. 80. P. 199–213. DOI: 10.1002/bip.20183.
Namkung W., Han W., Luo X., Muallem S., Cho K.H., Kim K.H., Lee M.G.
Protease-activated receptor 2 exerts local protection and mediates some systemic
complications in acute pancreatitis // Gastroenterology. 2004. V. 126 (7). P. 1844–
1859. doi:10.1053/j.gastro.2004.03.019.
Nanoff C., Koppensteiner R., Yang Q., Fuerst E., Ahorn H., Freissmuth M.
The carboxyl terminus of the Gα-subunit is the latch for triggered activation of
heterotrimeric G proteins // Mol. Pharmacol. 2006. V. 69. P. 397–405. doi:
10.1124/mol.105.016725.
O'Callaghan K., Kuliopulos A., Covic L. Targeting CXCR4 with cell-
penetrating pepducins in lymphoma and lymphocytic leukemia // J. Biol. Chem. 2012.
V. 287. P. 12787–12796. doi: 10.1182/blood-2011-04-347518.
Palm D., Munch G., Dees C., Heckman M. Mapping of β-adrenoreceptor
coupling domains to Gs-protein by site-specific synthetic peptides // FEBS Lett. 1989.
V. 254. P. 89–93. doi: 10.1016/0014-5793(89)81015-4.
Plati J., Tsomaia N., Piserchio A., Mierke D.F. Structural features of
parathyroid hormone receptor coupled to Gαs-protein // Biophys. J. 2007. V. 92. P.
535–540. doi: 10.1529/biophysj.106.094813.
Quoyer J., Janz J. M., Luo J., Ren Y., Armando S., Lukashova V., Benovic J.
L., Carlson K. E., Hunt S. W., 3rd, Bouvier M. Pepducin targeting the C-X-C
chemokine receptor type 4 acts as a biased agonist favoring activation of the
inhibitory G protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V. 110 (52). P. E5088–
E5097. doi: 10.1073/pnas.1312515110.
Reiter E., Ahn S., Shukla A.K., Lefkowitz R.J. Molecular mechanism of β-
arrestin-biased agonism at seven-transmembrane receptors // Annu. Rev. Pharmacol.
Toxicol. 2012. V. 52. P. 179–197. doi: 10.1146/annurev.pharmtox.010909.105800.
Scala S., Ottaiano A., Ascierto P.A., Cavalli M., Simeone E., Giuliano P.,
Napolitano M., Franco R., Botti G., Castello G. Expression of CXCR4 predicts poor
440
prognosis in patients with malignant melanoma // Clin. Cancer Res. 2005. V. 11 (5).
P. 1835–1841. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-04-1887.
Sevigny L.M., Zhang P., Bohm A., Lazarides K., Perides G., Covic L.,
Kuliopulos A. Interdicting protease-activated receptor-2-driven inflammation with
cell-penetrating pepducins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. V. 108. P. 8491–8496.
doi: 10.1073/pnas.1017091108.
Sharma A., Tao X., Gopal A., Ligon B., Andrade-Gordon P., Steer M.L.,
Perides G. Protection against acute pancreatitis by activation of protease-activated
receptor-2 // Am. J. Physiol. 2005. V. 288 (2). P. G388–G385. doi:
10.1152/ajpgi.00341.2004.
Shearer A.M., Rana R., Austin K., Baleja J.D., Nguyen N., Bohm A., Covic
L., Kuliopulos A. Targeting Liver Fibrosis with a Cell-penetrating Protease-activated
Receptor-2 (PAR2) Pepducin // J. Biol. Chem. 2016. V. 291 (44). P. 23188–23198.
doi: 10.1074/jbc.M116.732743.
Shenoy S.K., Lefkowitz R.J. β-Arrestin-mediated receptor trafficking and
signal transduction // Trends Pharmacol. Sci. 2011. V. 32. P. 521–533. doi:
10.1016/j.tips.2011.05.002.
Shpakov A.O. Polycationic peptides as nonhormonal regulators of
chemosignaling systems // J. Evol. Biochem. Physiol. 2009. V. 45. № 4. P. 431–446.
doi: 10.1134/S002209300904001X.
Shpakov A.O. Natural and synthetic cationic peptides as regulators of
hormone-sensitive signaling systems and molecular mechanisms of their action //
Current Topics Pept. Protein Res. 2010. V. 11. P. 1–30.
Shpakov A.O. GPCR-based peptides: structure, mechanisms of action and
application // Global J. Biochem. 2011. V. 2. P. 96–123.
Shpakov A.O., Gur’yanov I.A., Kuznetsova L.A., Plesneva S.A., Shpakova
E.A., Vlasov G.P., Pertseva M.N. Studies of the molecular mechanisms of action of
relaxin on the adenylyl cyclase signaling system using synthetic peptides derived from
the LGR7 relaxin receptor // Neurosci. Behav. Physiol. 2007. V. 37. P. 705–714. doi:
10.1007/s11055-007-0071-y.
Shpakov A.O., Pertseva M.N. The peptide strategy as a novel approach to
the study of G protein-coupled signaling systems // In: Signal Transduction Research
Trends (Grachevsky N.O., ed.), Nova Science Publishers, Inc., New York. 2007. P.
45–93.
Shpakov A.O., Shpakova E.A. Development of non-hormonal regulators of
the adenylyl cyclase signaling system based on the peptides, derivatives of the third
intracellular loop of somatostatin receptors // Biochemistry (Moscow). Suppl. Ser. B:
Biomedical Chemistry. 2011. V. 5 (3). P. 246–252.
Shpakov A.O., Shpakova E.A. The use of peptides derived from G protein-
coupled receptors and heterotrimeric G proteins in the study of their structure and
functions. Chapter 4 // In: “Protein Purification and Analysis III - Methods and
Applications”. 2014. ISBN: 978-1-922227-65-2. iConcept Press Ltd.
441
http://www.iconceptpress.com/books/protein-purification-and-analysis-iii--methods-
and-applications/ 35 pages.
Shpakov A.O., Shpakova E.A., Derkach K.V. The sensitivity of the adenylyl
cyclase system in rat thyroidal and extrathyroidal tissues to peptides corresponding to
the third intracellular loop of thyroid-stimulating hormone receptor // Current Topics
Pept. Protein Res. 2012a. V. 13. P. 61–73.
Shpakov A.O., Shpakova E.A., Tarasenko I.I., Derkach K.V. Receptor and
tissue specificity of the effect of peptides corresponding to intracellular regions of the
serpentine type receptors // Biochemistry (Moscow). Suppl. Ser. A: Membrane Cell.
Biol. 2012b. V. 64. P. 16–25. doi: 10.1134/S1990747811060146.
Shpakov A.O., Shpakova E.A., Tarasenko I.I., Derkach K.V., Chistyakova
O.V., Avdeeva E.A., Vlasov G.P. The influence of peptides corresponding to the third
intracellular loop of luteinizing hormone receptor on basal and hormone-stimulated
activity of the adenylyl cyclase signaling system // Global J. Biochem. 2011. V. 2. P.
59–73.
Shpakov A.O., Shpakova E.A., Tarasenko I.I., Derkach K.V., Chistyakova
O.V., Vlasov G.P. Peptides derived from the third cytoplasmic loop of the serotonin
subtype 1B receptor selectively inhibit transmission of serotoninergic signals via their
homologous receptors // Neurosci. Behav. Physiol. 2012c. V. 42. P. 285–292. doi:
10.1007/s11055-012-9564-4.
Shpakov A.O., Shpakova E.A., Tarasenko I.I., Derkach K.V., Vlasov G.P.
The peptides mimicking the third intracellular loop of 5-hydroxytryptamine receptors
of the types 1B and 6 selectively activate G proteins and receptor-specifically inhibit
serotonin signaling via the adenylyl cyclase system // Int. J. Pept. Res. Ther. 2010. V.
16. P. 95–105. doi: 10.1007/s10989-010-9208-x.
Shpakova E.A., Shpakov A.O. Peptides corresponding to intracellular
regions of somatostatin receptors with agonist and antagonist activity // Dokl.
Biochem. Biophys. 2011. V. 437. P. 68–71. doi: 10.1134/S1607672911020049.
Shpakova E.A., Shpakov A.O., Chistyakova O.V., Moyseyuk I.V., Derkach
K.V. Biological activity in vitro and in vivo of peptides corresponding to the third
intracellular loop of thyrotropin receptor // Dokl. Biochem. Biophys. 2012. V. 433. P.
64–67. doi: 10.1134/S1607672912020020.
Shukla A.K., Xiao K., Lefkowitz R.J. Emerging paradigms of β-arrestin-
dependent seven transmembrane receptor signaling // Trends Biochem. Sci. 2011. V.
36. P. 457–469. doi: 10.1016/j.tibs.2011.06.003.
Spoo A.C., Lubbert M., Wierda W.G., Burger J.A. CXCR4 is a prognostic
marker in acute myelogenous leukemia // Blood. 2007. V. 109. P. 786–791. doi:
blood-2006-05-024844v1 109/2/786.
Swift S., Leger A.J., Talavera J., Zhang L., Bohm A., Kuliopulos A. Role of
the PAR1 receptor 8th helix in signaling: the 7-8-1 receptor activation mechanism // J.
442
Tavor S., Petit I. Can inhibition of the SDF-1/CXCR4 axis eradicate acute
leukemia? // Semin. Cancer Biol. 2010. V. 20. P. 178–185. doi:
10.1016/j.semcancer.2010.07.001.
Tchernychev B., Ren Y., Sachdev P., Janz J.M., Haggis L., O'Shea A.,
McBride E., Looby R., Deng Q., McMurry T., Kazmi M.A., Sakmar T.P., Hunt S. 3rd,
Carlson K.E. Discovery of a CXCR4 agonist pepducin that mobilizes bone marrow
hematopoietic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107 (51). P. 22255–
22259. doi: 10.1073/pnas.1009633108.
Teicher B.A., Fricker S.P. CXCL12(SDF-1)/CXCR4 pathway in cancer //
Clin. Cancer Res. 2010. V. 16. P. 2927–2931. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-09-2329.
Tressel S.L., Koukos G., Tchernychev B., Jacques S.L., Covic L., Kuliopulos
A. Pharmacology, biodistribution, and efficacy of GPCR-based pepducins in disease
models // Meth. Mol. Biol. 2011. V. 683. P. 259–275. doi: 10.1007/978-1-60761-919-
2_19.
Tsuji M., Ueda S., Hirayama T., Okuda K., Sakaguchi Y., Isono A.,
Nagasawa H. FRET-based imaging of transbilayer movement of pepducin in living
cells by novel intracellular bioreductively activatable fluorescent probes // Org.
Biomol. Chem. 2013. V. 11 (18), P. 3030–3037. doi: 10.1039/c3ob27445d.
Vahlberg C., Petoral R.M., Lindell C., Broo K., Uvdal K. α2A-adrenergic
receptor derived peptide adsorbates: A G-protein interaction study // Langmuir. 2006.
V. 22. P. 7260–7264. doi: 10.1021/la052801r.
van der Poll T., Levi M. Crosstalk between inflammation and coagulation:
the lessons of sepsis // Curr. Vasc. Pharmacol. 2012. V. 10. P. 632–638. doi:
10.2174/157016112801784549.
Wess J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in
receptor activation and selectivity of G-protein recognition // FASEB J. 1997. V. 11
(5). P. 346–354.
Wu G., Bogatkevich G.S., Mukhin Y.V., Benovic J.L., Hildebrandt J.D.,
Lanier S.M. Identification of Gβγ binding sites in the third intracellular loop of the
M3-muscarinic receptor and their role in receptor regulation // J. Biol. Chem. 2000. V.
275. P. 9026–9034. doi: 10.1074/jbc.275.12.9026.
Yang E., Boire A., Agarwal A., Nguyen N., O’Callaghan K., Tu P.,
Kuliopulos A., Covic L. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins
inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival
and metastasis // Cancer Res. 2009. V. 69 (15). P. 6223–6231. doi: 10.1158/0008-
5472.CAN-09-0187.
Zhang L., Bastepe M., Juppner H., Ruan K.H. Characterization of the
molecular mechanisms of the coupling between intracellular loops of prostacyclin
receptor with the C-terminal domain of the Gs protein in human coronary artery
smooth muscle cells // Arch. Biochem. Biophys. 2006. V. 454. P. 80–88.
dx.doi.org/10.1016/j.abb.2006.06.023.
443
Zhang P., Covic L., Kuliopulos A. Pepducins and other lipidated peptides as
mechanistic probes and therapeutics // Methods Mol. Biol. 2015. V. 1324. P. 191–
203. doi: 10.1007/978-1-4939-2806-4_13.
Zhang P., Gruber A., Kasuda S., Kimmelstiel C., O'Callaghan K., Cox D.H.,
Bohm A., Baleja J.D., Covic L., Kuliopulos A. Suppression of arterial thrombosis
without affecting hemostatic parameters with a cell-penetrating PAR1 pepducin //
Circulation. 2012. V. 126 (1). P. 83–91. doi:
444
Список основных сокращений:
α-АР, β-АР – α- и β-адренергические рецепторы

АЦ – аденилатциклаза
ВП – внеклеточная петля
ЛГ – лютеинизирующий гормон
МАПК – митогенактивируемая протеинкиназа
МКР – меланокортиновый рецептор
α-МСГ – α-меланоцитстимулирующий гормон
ТМС – трансмембранная спираль
ТТГ – тиреотропный гормон
ФИ-3-К – фосфатидилинозитол-3-киназа
ФЛСβ – фосфоинозитид-специфичная фосфолипаза Сβ
ФСГ – фолликулостимулирующий гормон
ХГЧ – хорионический гонадотропин человека
ЦП – цитоплазматическая петля
ago-PAM – положительный аллостерический модулятор с

активностью полного агониста
CGRP – кальцитонин-ген-родственный пептид
CLR – рецептор, родственный рецептору кальцитонина
Epac – обменный фактор семейства Epac (exchange protein directly
activated by cAMP)
GLP-1 – глюкагоноподобный пептид-1
GPCR (G protein-coupled receptors) – гормональные рецепторы,
сопряженные с гетеротримерными G-белками, семь раз
пронизываюшие плазматическую мембрану
GRK-киназа – GPCR-специфичная протеинкиназа
LRR – повторяющийся участок, обогащенный остатками лейцина
(leucine-rich repeats)
NAM – негативный аллостерический модулятор (negative
allosteric modulator)
PAM – положительный аллостерический модулятор (positive
allosteric modulator)
445
PAR – протеаза-активируемый рецептор
RAMP – белкок, модифицирующий рецепторную активность
(receptor-activity-modifying protein)
SAM – нейтральный аллостерический модулятор (silent allosteric
modulator)

GPCR Elibrary - 41337212 - 14699075

Загружено:

Сведения о документе

Оригинальное название

Авторское право

Доступные форматы

Поделиться этим документом

Поделиться или встроить документ

Параметры публикации

Этот документ был вам полезен?

Это неприемлемый материал?

Авторское право:

Доступные форматы

GPCR Elibrary - 41337212 - 14699075

Загружено:

Авторское право:

Доступные форматы

Содержание

1.1. Классификация и структурно-функциональная 13

5.1. Рецепторы гонадотропинов – структурно- 187

6.2.1. Внеклеточный домен рецептора ТТГ 273

Для обмена информацией между различными типами

Перцева М.Н., Шпаков А.О. Прокариотическое происхождение и

GPCR и их сигнальные системы

1.1. Классификация и структурно-функциональная

Наиболее распространенным суперсемейством сенсорных

Все гетеротримерные G-белки состоят из Gα-

В неактивном состоянии Gα-субъединица, имеющая в

Рис. 1-1. Цикл активации-инактивации αβγ-гетеротримерных G-

В рецепторах за взаимодействие с G-белками отвечают

Активация GPCR, функционально сопряженных с Gi/o-

1.3. Избирательная активация внутриклеточных

Одной из ключевых проблем современной молекулярной

1.4. Внутриклеточные сигнальные пути гонадотропинов

Показано, что активация рецепторов ЛГ и ФСГ

Рис. 1-3. Сигнальные каскады, активируемые при связывании ЛГ с

Рис. 1-4. Сигнальные каскады, активируемые при связывании ФСГ с

1.4.1. Влияние гонадотропинов на аденилатциклазную

Аденилатциклазная сигнальная система включает

Влияние ФСГ на аденилатциклазную сигнальную

Влияние гонадотропинов с ЛГ-активностью на

После гормональной активации рецептор ФСГ

1.4.3. Влияние фолликулостимулирующего и

Активация ФИ-3-К и комплекса mTOR играет важную

1.5. Внутриклеточные сигнальные пути тиреотропного

Активация рецептора ТТГ, так же как и в случае

Рис. 1-5. Сигнальные каскады, активируемые при связывании ТТГ с

Шпаков А.О. Молекулярные детерминанты в рецепторах

Аллостерические регуляторы GPCR

2.1. Механизмы действия и классификация

Ортостерические сайты близкородственных по

Рис. 2-1. Модели связывания аллостерических и ортостерических

Важную роль в аллостерической регуляции GPCR играют

Рис. 2-2. Эффекты аллостерических модуляторов на аффинность

Важно отметить, что сдвиг кривых «концентрация

Рис. 2-3. Битопические лиганды m2-мускаринового ацетилхолиноворго

Анализируя фармакологические свойства битопических

2.2. Оценка фармакологического профиля

Для идентификации фармакологического профиля

чувствительных красителей. Процедура включала начальное

2.3. Количественная оценка аллостерических

Как отмечалось выше, набор активных конформаций

2.4. Влияние олигомеризации рецепторов и их

Установлено, что GPCR в функционально активном

Поиск и оптимизации химических структур

Эндогенные аллостерические регуляторы

3.1. G-белки, как аллостерические регуляторы GPCR

Сами рецепторы, сопряженные с гетеротримерными G-

3.2. Аррестины и RAMP-белки, как аллостерические

Как отмечалось в Главе 1, важную роль в

Рис. 3-1. Кристаллическая структура N-концевого участка рецептора,

Второй представитель MRAP-белков, MRAP2,

3.3. Ионы, как аллостерические регуляторы GPCR

В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что

Рис. 3-2. Роль катионов натрия, как негативных аллостерических

С помощью сайт-направленного мутагенеза установлено,

Рис. 3-3. Модель трансмембранного домена A2A-аденозинового

Установление пространственной структуры GPCR на

3.4. Липиды, как аллостерические регуляторы GPCR

Согласно современным представлениям, липиды