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ESPECTROSCOPA DE FLUORESCENCIA MOLECULAR

INTRODUCCIN La fluorescencia es un proceso de emisin en el cual las molculas son excitadas por la absorcin de radiacin electromagntica. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energa en forma de fotones. una de las caractersticas ms atractivas de los mtodos de fluorescencia es su sensibilidad inherente, la cual es , con frecuencia, de uno a tres ordenes de magnitud mejor que las de la Espectroscopa de absorcin. No obstante, los mtodos de fluorescencia se aplican mucho menos que los mtodos de absorcin debido al nmero relativamente limitado de sistemas qumicos que se pueden hacer fluorescer. TEORA DE LA FLUORESCENCIA MOLECULAR

Diagrama parcial de energa para un sistema fotoluminiscente

Normalmente, el tiempo de vida media de una especie excitada es breve porque hay diversas formas en las cuales un tomo o una molcula excitada liberan su exceso de energa y se relajan a su estado fundamental. Dos de las

ms importantes de estos mecanismos son la relajacin (desactivacin) no radiante y la relajacin fluorescente.

Relajacin vibracional Relajacin no radiante Conversin interna

La relajacin vibracional , sealada por las flechas onduladas cortas entre los niveles de energa vibracionales, tiene lugar durante las colisiones entre molculas excitadas y las molculas del disolvente. Durante estas colisiones el exceso de energa vibracional se transfiere a las molculas del disolvente en una serie de etapas como se indica en la figura. La ganancia de energa vibracional del disolvente se refleja en un ligero incremento de la temperatura del medio. La relajacin vibracional es un proceso tan eficiente que el tiempo de vida promedio de un estado vibracional excitado es de 10-15 s aproximadamente. Tambin puede ocurrir el relajamiento no radiante entre el nivel vibracional inferior de un estado electrnico excitado y el nivel vibracional superior de otro estado electrnico. Este tipo de relajacin llamado algunas veces conversin interna, se ilustra por las flechas onduladas largas. En la figura se ilustra el otro proceso de relajacin: la fluorescencia. Se puede observar que las bandas de radiacin son producidas cuando las molculas fluorecen debido a que las molculas electrnicamente excitadas se pueden relajar a cualquiera estados vibracionales del estado electrnico fundamental. De igual forma que las bandas de absorcin molecular, las bandas de fluorescencia molecular estn formadas por una multitud de lneas espaciadas tan estrechamente que son muy difciles de resolver. El camino ms probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida media del estado excitado. Por tanto, si la desactivacin por fluorescencia es rpida con respecto a los procesos sin radiacin, se observa tal emisin. Por otro lado, si un camino sin radiacin tiene una constante de velocidad favorable, la fluorescencia no tiene lugar o es menos intensa. La fotoluminiscencia est limitada a un nmero relativamente pequeo de sistemas que incorporan caractersticas estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de desactivacin sin radiacin se reduzcan hasta el punto que la reaccin de emisin puede competir cinticamente. Se observa que las bandas de fluorescencia molecular estn formadas principalmente por bandas que tienen longitudes de onda ms largas y , por

tanto, energas menores que la banda de radiacin responsable de su excitacin. Este desplazamiento hacia longitudes de onda mayores se llama desplazamiento de Stokes. En aquellos casos en los que la radiacin absorbida sea emitida sin cambio en la longitud de onda (misma energa) se conoce como radiacin de resonancia o resonancia fluorescente. Debido a que las diferencias de energa entre los estados vibracionales es aproximadamente el mismo, tanto para el estado fundamental como para el excitado, la absorcin, o espectro de excitacin, y el espectro de emisin o fluorescencia de un compuesto frecuentemente aparece como una imagen especular de uno a otro con una sobreposicin que ocurre en la lnea de resonancia.

VARIABLES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA

1.- Rendimiento cuntico: El rendimiento cuntico o la eficacia cuntica de la fluorescencia es simplemente las relacin entre el nmero de molculas que emiten fluorescencia respecto al nmero total de molculas excitadas. Las molculas altamente fluorescentes, por ejemplo, la fluoresceina, tienen eficiencias cunticas que, en ciertas condiciones, se aproximan a la unidad. Las especies no fluorescentes tienen eficiencias que son prcticamente cero.

2.- Estructura: La fluorescencia ms intensa y la ms til es la que presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromticos. Los compuestos que contienen estructuras alifticas y alicclicas de carbonilo o estructuras con dobles enlaces muy conjugados pueden presentar tambin fluorescencia. La mayora de los hidrocarburos aromticos no sustituidos son fluorescentes en disolucin, la eficacia cuntica aumenta con el nmero de anillos y con su grado de conjugacin. La sustitucin en un anillo aromtico causa desplazamientos en la longitud de onda de absorcin mxima y los cambios correspondientes en los picos de fluorescencia. Adems, la sustitucin afecta frecuentemente la eficiencia de la fluorescencia como se demuestra en la siguiente TABLA

3.- Rigidez estructural: Empricamente se encuentra que la fluorescencia est particularmente favorecida en molculas que poseen estructuras rgidas. Por ejemplo, las eficacias cunticas para el fluoreno y el bifenilo estn prximas a 1'0 y 0'2, respectivamente, bajo condiciones similares de medida.

La influencia de la rigidez tambin tiene importancia en el aumento de la fluorescencia de ciertos quelatantes orgnicos cuando estn formando un complejo con un ion metlico. Por ejemplo, la fluorescencia de la 8hidroxiquinolena es mocho menor que la de su complejo con zinc:

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4.- Temperatura y disolvente: La eficacia cuntica de la fluorescencia disminuye en muchas molculas con el aumento de la temperatura, ya que el aumento de la frecuencia de las colisiones a temperatura elevada hace aumentar la probabilidad de desactivacin no radiante ( conversin externa ). Una disminucin en la viscosidad del disolvente tambin aumenta la probabilidad de conversin externa y produce el mismo resultado. 5.- Efecto del pH: La fluorescencia de un compuesto aromtico con sustituyentes cidos o bsicos en el anillo depende normalmente del pH. Tanto la longitud de onda como la intensidad de emisin son probablemente diferentes para la forma ionizada y no ionizada del compuesto. Por lo tanto ser muy frecuente en los mtodos fluorimtricos el control estricto del pH. 6.- Efecto de la concentracin: La potencia de la radiacin fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de excitacin que es absorbido por el sistema. F = K' (P 0 - P)

donde P 0 es la potencia del haz incidente sobre la disolucin y P es su potencia despus de atravesar la longitud b del medio. La constante K' depende de la eficacia cuntica del proceso de fluorescencia. Con objeto de relacionar F con la concentracin c escribimos la ley de Beer as:

P = 10 bc P 0

sustituyendo nos queda: F = K' P 0 (1 - 10- bc) Si desarrollamos el trmino exponencial como una serie de Maclaurin ser;

(2 '303 bc F = K ' P 0 2 '303 bc 2!

)2

(2 '303

bc 3!

)3

Siempre que 2'303bc < 0'05 podemos escribir que, F = K'P0 2'303 bc y si P 0 se mantiene constante, F = Kc

Cuando c es suficientemente elevada como para que la absorbancia multiplicada por 2'303 sea mayor que 0'05, los trminos de mayor orden de la expresin anterior no son despreciables y la linealidad se pierde. Este efecto es un resultado de autoapagamiento, en el cual las molculas del analito absorben la fluorescencia producida por otras molculas de analito.

fig.23.7Skoog448

INSTRUMENTACIN En la siguiente figura se muestra un esquema general de un espectrofluormetro.

Fig. Scimedia

Un monocromador selecciona una longitud de onda de excitacin, y la fluorescencia se examina con un segundo monocromador el cual se coloca de manera que forme un ngulo de 90 con la luz incidente. Manteniendo fija la ex y haciendo un barrido de la radiacin emitida, se obtiene un espectro de emisin. Si la em se mantiene constante y se hace variar la ex , se obtiene el espectro de excitacin. Fuentes: En la mayora de las aplicaciones se necesita una fuente ms intensa que las lmparas de volframio o de deuterio utilizadas para la medida de absorcin. Esto se debe, como qued demostrado anteriormente a que la magnitud de la seal de salida, y por tanto la sensibilidad, es directamente proporcional a la potencia de la fuente P0. Normalmente se utiliza una lmpara de arco de xenn o de mercurio. Filtros y monocromadores: En los fluormetros se utilizan tanto los filtros de interferencia como los de absorcin, mientras que los espectrofluormetros estn equipados con monocromadores de red. Detectores: La seal de fluorescencia tpica es de baja intensidad, por tanto, se necesitan factores de amplificacin altos para estas medidas. Los tubos fotomultiplicadores son los ms utilizados como detectores en instrumentos de fluorescencia sensibles.

Cubetas: Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilndricas como rectangulares fabricadas con vidrio o ms normalmente con slice. APLICACIONES DE LOS MTODOS DE FLUORESCENCIA En general, los mtodos de fluorescencia son de uno a tres ordenes de magnitud ms sensibles que los mtodos basados en la absorcin porque la sensibilidad de los primeros se puede reforzar, sea aumentando la energa del haz de excitacin o por amplificacin de la seal del detector. Es de destacar que ninguna de estas opciones mejora la sensibilidad de los mtodos basados en los procesos de absorcin porque el parmetro en la ley de Beer basado en la concentracin es el logaritmo de una proporcin

-logP0/P=abc Al aumentar la energa P 0 se incrementa proporcionalmente P y no tiene efecto sobre la sensibilidad. De manera parecida, incrementando la amplificacin de la seal del detector se influye en las dos magnitudes medidas de forma idntica, lo que evita cualquier mejora. Determinacin fluorimtrica de especies inorgnicas: Los mtodos fluorimtricos de determinacin de especies inorgnicas pueden ser de dos tipos. Los mtodos directos que implican la formacin de un quelato fluorescente y la medida de su emisin y un segundo grupo que se basa en la disminucin de la fluorescencia que resulta de la accin atenuadora de la sustancia que va a ser determinada. Esta ltima tcnica ha sido ms ampliamente utilizada en la determinacin de aniones. Los reactivos fluorimtricos que ms xito tienen para el anlisis de cationes son los que presentan estructuras aromticas con dos o ms grupos funcionales dadores que permitan la formacin de quelatos con el ion metlico. A continuacin se muestran las estructuras de los cuatro reactivos ms corrientes.

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En la siguiente Tabla se muestra una seleccin de algunos reactivos fluorimtricos y sus aplicaciones.

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Determinacin fluorimtrica de especies orgnicas y bioqumicas: El nmero de aplicaciones del anlisis fluorimtrico a especies orgnicas es muy elevado. Por ejemplo existen mtodos para la determinacin de sustancias tales como enzimas, agentes medicinales, productos naturales, esteroides, vitaminas, etc. Sin lugar a dudas, las aplicaciones ms importantes de la fluorimetra estn en el campo del anlisis de productos alimentarios, farmacuticos, muestras clnicas y productos naturales. La sensibilidad y selectividad del mtodo lo hace una herramienta particularmente valiosa en estos campos.