Вы находитесь на странице: 1из 121

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

UNIVERSITATEA DUNREA DE JOS DIN GALAI FACULTATEA:TIINA I INGINERIA PRODUSELOR ALIMENTARE SPECIALIZARE :C.E.P.A

PROIECT DE DIPLOM STUDIUL EFECTELOR DE CONTAMINARE A ALIMENTELOR CU MICOTOXINE

Coordonator tiinific, Prof. dr. ing. Clemansa Tofan

2008

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

CUPRINS
Cuprins..1 Justificarea alegerii temei de licen.5 Introducere....6 Partea nti - PARTEA DOCUMENTAR Capitolul 1- Micotoxinele....................................................................................7
1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 1.2.6

Ce sunt micotoxinele?..................................................................................7 Principalele tipuri de micotoxine de importan economic........................8 Aflatoxinele...........................................................................................9 Ochratoxina A.....................................................................................13 Patulina................................................................................................17 Zearalenon.........................................................................................18 Fumonisinele.......................................................................................20 Tricotecinele........................................................................................21 1.3 Prezena micotoxinelor n diverse produse alimentare...............................24 Capitolul 2- Factori care influeneaz producerea micotoxinelor.....................30 2.1 Biogeneza micotoxinelor............................................................................30 2.2 Formarea micotoxinelor..............................................................................32 2.3 Influena factorilor extrinseci asupra apariiei micotoxinelor.....................34 2.3.1 Temperatura...........................................................................................34 2.3.2 Umiditatea..............................................................................................37 2.3.3 Tensiunea superficial...........................................................................39 2.3.4 Presiunea osmotic................................................................................39 2.3.5 Lumina...................................................................................................40 2.3.6 Integritatea fizic a boabelor i a nveliului produselor vegetale.............................................................................................40 2.4 Influena factorilor intrinseci asupra apariiei micotoxinelor.....................41 2.4.1 Natura substratului................................................................................ 41
2

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

2.4.2 Influena pH-ului asupra dezvoltrii mucegaiurilor..............................42 2.4.3 Nutrieni minerali..................................................................................43 2.4.4 Potenialul de oxido- reducere..............................................................46 2.4.5 Bacterii..................................................................................................47 2.4.6 Microflora..............................................................................................47 2.4.7 Insectele ................................................................................................48 2.5 Descrierea mucegaiurilor cu potenial toxicogen...................49 2.5.1 Principalele genuri de mucegaiuri din industria alimentar..48 2.5.2 Caracterizarea principalelor specii de mucegaiuri cu potenial toxicogen.....50 2.5.2.1 Aspergillus flavus52 2.5.2.2 Aspergillus nidulans53 2.5.2.3 Aspergillus versicolor..54 2.5.2.4 Aspergillus candidus............55 2.5.2.5 Aspergillus ochraceus..........56 2.5.2.6 Aspergillus tereus............57 2.5.2.7 Aspergillus fumigatus..............58 2.5.2.8 Fusarium graminearum....59 2.5.2.9 Penicilium expansum...60 2.5.2.10 Trichotecium roseum.61 Capitolul 3 - Metode de limitare i reducere a coninutului n micotoxine a unor produse alimentare de origine vegetal......................................................62 3.1 Strategii preventive: limitarea contaminanilor......................................62 3.1.1 Practici recomandate naintea recoltrii............................................66 3.1.2 Practici recomandate n timpul recoltrii..........................................68 3.1.3 Practici privind uscarea cerealelor....................................................69 3.1.4 Practici recomandate la depozitarea cerealelor.................................70 3.1.5 Practici recomandate n timpul transportului produselor..................71
3

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

3.1.6 Evitarea ptrunderii insectelor, psrilor i roztoarelor n timpul transportului........................................................................................................71 3.2 Strategii curative: decontaminarea..........................................................71 3.2.1 Metode fizice.....................................................................................72 3.2.1.1 Eliminarea fraciunilor alterate.................................................72 3.2.1.2 Denaturarea toxinelor...............................................................74 3.2.2 Denaturarea chimic..........................................................................75 3.2.3 Adsorbia toxinelor............................................................................78 3.2.4 Metode biologice de decontaminare..................................................85 Capitolul 4 - Metode de determinare a micotoxinelor....................................88 4.1 Pregtirea preliminar a probelor............................................................88 4.1.1 Eantionarea......................................................................................90 4.2 Metode calitative.....................................................................................95 4.2.1 Metode imunologice.........................................................................96 4.2.1.1 Testele RIA...............................................................97 4.2.1.2 Testele ELISA...........................................................................97 4.2.2 Metode de imunoafinitate................................................................99 4.2.2.1 Minicoloanele...........................................................................99 4.2.2.2 Coloane de imunopurificare......................................................99 4.3 Metode cantitative................................................................................100 4.3.1 Teste kit..........................................................................................100 4.3.2 Cromatografie n strat subire (TLC).............................................100 4.3.3 HPLC(high performance liquid chromatographycromatografie cu lichid de nalt performan).................................................101

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Partea a doua PARTEA EXPERIMENTAL


1.

Analiza microbiologic a cerealelor..........................................................103 1.1 Evaluarea calitativ.................................................................................103 Evidenierea mucegaiurilor productoare de aflatoxine............................106 Analiza calitativ a aflatoxinelor...............................................................108

2. 3.

3.1 Pregtire inocul......................................................................................108 3.2 Inoculare i incubare..............................................................................109 3.3 Extracie.................................................................................................109 Concluzii..........................................................................................................115 Bibliografie......................................................................................................118

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Justificarea alegerii temei de cercetare


Micotoxinele prezente n mod natural n diverse produse alimentare constituie o problem serioas de siguran alimentar, mai ales n anumite regiuni ale globului n care condiiile climatice sau standardele din agricultur sunt precare. Exist dovezi convingtoare care arat o asociere ntre expunerea la aflatoxine i cancerul primar de ficat. Micotoxinele produc pagube importante i n zootehnie. Organizaia pentru Alimente i Agricultur (FAO) estimeaz c pe plan mondial pn la 25 % din culturile alimentare sunt semnificativ contaminate cu micotoxine. Cele mai importante micotoxine care prezint riscuri semnificative pentru sntatea omului sunt sintetizate de mucegaiurile care cresc pe cereale, n special porumb, dar i gru, orz, ovz i orez. Consecinele consumului de alimente contaminate cu aflatoxin asupra sntii omului sunt estimate indirect pe baza efectului observat la animale. Susceptibilitatea omului la aflatoxin nu este foarte bine cunoscut datorit raritii cazurilor. Date cu privire la doza de risc pentru oameni au fost obinute cu ocazia unor intoxicaii colective izbucnite, una n India n 1974 n cursul creia au fost afectate aproape 400 de persoane din care o treime au murit i alta n Kenia n 1982, unde au fost spitalizate 20 de persoane dintre care au decedat 12. Investigaiile din care aceste focare de aflatoxicoz au dus la concluzia c ele s-au datorat ingestiei repetate a unei cantiti de 38-55 micrograme de aflatoxin/kg corp mai multe zile la rnd. Cercetrile fcute de veterinari americani, sugereaz c unii aditivi alimentari cum este BHT (butil-hidroxitoluen, sau E 321) ar putea fi folosii n viitor ca msur de protecie fa de efectele nedorite ale alimentelor contaminate cu aflatoxin. Vivacitatea i viteza de rspndire n condiiile naturale este uimitoare. De exemplu: dintr-un spor de Penicillium aflat pe un mediu nutritiv, must de mal cu agar, dup a doua zi de la germinarea acestuia s-au format 100.000 spori i n urmtoarele 24 ore nc 2 10 spori. Pe un bob de gru mucegit cu Penicillium verrucosum var. Cyclopium s-au numrat 25 milioane spori. O portocal mucegit este purttoare a aproximativ 15 miliarde de spori.
6

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

INTRODUCERE
Dintotdeauna consumatorul a fost preocupat ca alimentele puse la dispoziia lui s fie sigure din punct de vedere igienico-sanitar, s nu i provoace mbolnviri. Astzi, aceast cerin a devenit tot mai insistent, ntruct consumul de alimente pregtite pe scara industrial a crescut foarte mult i deoarece, tot mai des, consumatorul afl c alimentele sunt cauza multor mbolnviri, uneori a unor decese, consumatorul este aadar vizat c nu n toate cazurile, alimentele consumate sunt de o calitate igienico-sanitar corespunzatoare. Contaminarea produselor cu mucegaiuri, ridic aspecte importante legate de pierderea inocuitii alimentului. Atenia deosebit acordat mucegaiurilor este datorat caracteristicilor anumitor specii de fungi de a elabora i elibera n aliment metabolii secundari numii micotoxine, care au o structur chimic mai mult sau mai puin cunoscut, dar i capacitatea dovedit de a modifica structuri normal biologice. Micotoxinele, ca metabolii ai anumitor tipuri de mucegaiuri au astfel efecte nocive att asupra sntaii omului, ct i asupra animalului care consum alimente contaminate cu acestea. Evoluia tehnicilor de recoltare i transformare a produselor agricole, transportul alimentelor pe distane lungi i prezentarea consumatorilor prin stocarea prelungit constituie condiii care dac sunt realizate necorespunztor, devin favorabile dezvoltrii microorganismelor nedorite i n particular, a mucegaiurilor. Micotoxinele sunt metabolii ai mucegaiurilor cu o structur chimic mai mult sau mai puin cunoscut care au capacitatea de a modifica structuri biologice anormale, cu efecte degradante att la om,ct i la animale. Aceste toxine pot fi coninute n sporii de mucegai sau de cele mai multe ori eliminate n substratul de cretere (aliment). Oamenii de tiin le-au descoperit la nceputul anilor 1960 odat cu izbucnirea bolii curcanilor x din Anglia. Aproape 100.000 de curcani au fost ucii deoarece alunele pe care le-au consumat erau contaminate cu Aspergillus flavus, un mucegai ce produce micotoxine.

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

PARTEA DOCUMENTAR CAPITOLUL 1 Micotoxinele


1.1 Ce sunt micotoxinele? Termenul de micotoxin vine de la cuvntul grecesc mycos care inseamn ciuperc i de la cuvntul latin toxicum care nseamn otrav. Ele desemneaz metabolii secundari secretai de mucegaiurile care aparin n principal genurilor Aspergillus, Penicillium i Fusarium, prezente n mod natural n aerul ambient, pe pmnt i pe culturi. Micotoxinele sunt considerate ca fiind parte din contaminani alimentari cei mai semnificativi n ceea ce privete impactul asupra sntii publice, securitii alimentare i asupra economiei a numeroaselor ri. Ele se gsesc pe o mare varietate de produse alimentare nainte, n timpul i dup recolt. Afecteaz numeroase produse agricole, anume cereale, fructele, nucile, boabele de cafea, orezul i plantele oleaginoase, care sunt substraturi foarte sensibile la contaminarea cu mucegaiuri i la producerea de micotoxine. Contaminarea produselor de ctre micotoxine se realizeaz n cazul cnd ntrunesc condiiile de mediu pe cmp pentru apariia lor, precum i procedee neadecvate de recoltare, de stocare i de transformare atunci cnd sunt cumulate. Prin diversitatea efectelor lor toxice i a propietilor lor sinergice, micotoxinele prezint un risc pentru consumatorul alimentelor contaminate. Tabel 1. Specii fungice productoare de micotoxine Micotoxine Aflatoxina B1, B2,G1,G2 Ochratoxina A, B, C Zearalenon Desoxinivalenol, Fusarenon, Toxina T2 Fumonisine Citrinina Patulina Acidul penicilic Moniliformina Mucegaiuri Aspergillus parasiticus,Aspergillus flavus Aspergillus ochraceus,Aspergillus carbonarius, Penicillium verrucosum Fusarium roseum, Fusarium sp. Fusarium tricinatum, Fusarium sp. F. moniliforme, F. proliferatum, Fusarium sp. P. citrinum P. patulum A. ochraceus, A. Cyclopium A. proliferatum

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

1.2 Principalele tipuri de micotoxine de importan economic


Un consum de alimente contaminate cu anumite tipuri de mucegaiuri poate provoca la om i la animal, efecte nefavorabile pentru sntate, de la apariia unor forme de hepatite exudative, pn n prezent la consumatorii cronici a unor hepatoame (cancer hepatic). Majoritatea micotoxinelor au capacitate cancerigen. Mecanismul cancerigen al acestora se manifest prin capacitatea lor de a se fixa pe ADN, cu producerea de alterri la acest nivel i cu determinarea de schimbri, sub form de mutaii. Din gama mare de micotoxine atenia este ndreptat spre aflatoxine, ochratoxine, sterigmatocistine, patulina. Micotoxinele pot avea asupra organismului uman i animal o serie de efecte negative (fig. 1).

Fig. 1. Efecte toxice asociate micotoxinelor

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine 1.2.1. Aflatoxine Dup accidentele observate n 1960 n cresctoriile de curci (100.000 psri moarte), numeroase cercetri au fost conduse spre un grup de molecule cu nalte proprietai toxice: aflatoxinele. Aflatoxinele constituie un grup de 18 compui cu structuri apropiate unde 4 compui au forme foarte frecvent ntlnite n alimente: B1, B2, G1 si G2. Din punct de vedere chimic, aflatoxinele sunt un ansamblu dintre o cumarin i trei furani (figura 2). Sunt molecule cu mas molecular mic (312 - 330 g/mol), foarte puin solubile. Sunt solubile n ap, insolubile n solveni nepolari. Foarte solubile n solveni organici (cloroform i alcool metilic), fiind uor de extras. La lumina ultraviolet, sunt fluorescente (albastru pentru AFB, verde pentru AFG, AFM1 prezint o fluorescen albastru-mov).

Fig. 2 Structura chimic a aflatoxinelor

10

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Sunt micotoxine produse de mucegaiuri din genul Aspergillus: Aspergillus flavus i Aspergillus parasiticus, mucegaiuri prezente n multe locuri i sunt puin exigente la cretere: temperatura cuprins ntre 6 si 50C, sursa de carbon i azot i o valoare a aw mai mare de 80%. Din acest motiv, numeroase produse alimentare destinate consumului pot conine aflatoxine n cantiti uneori importante: alune, porumb, gru, fistic, cacao, cafea, manioc, soia. Metabolizate de diverse enzime microzomiale, aflatoxinele sunt eliminate sub form de glucorani pe cale urinar, prin lapte sau bil, dar pot aprea anumii derivai epoxidici. Fiind electrofile, ele reacioneaz la grupuri nucleofile de ADN sau de proteine. Microzomii hepatici, conin enzime cu nalt activitate, capabile s oxideze numeroase substraturi lipofile. Aceste reacii necesit prezena oxigenului i a NADPH (redus). Un atom de oxigen este fixat pe substrat i altul este redus n ap (NADP este oxidat). Astfel, aflatoxinele sunt toxice pentru numeroase organisme vegetale i animale procariote i eucariote (alge, ciuperci, bacterii). Aflatoxinele au de asemenea un efect puternic teratogen i pot provoca moartea n cteva ore sau cteva zile , n funcie de cantitatea de micotoxin i sensibiltatea animalului. Aflatoxinele au pe de alt parte un rol asupra fosforilrilor i lipogenezei. n concluzie, aflatoxinele sunt recunoscute ca fiind cei mai cancerigeni compui naturali, i este posibil s se obin o relaie liniar ntre incidena cancerului primitiv de ficat i logaritmul procentului de aflatoxin ingerat. Intoxicaia acut cu aflatoxin se traduce prin moarte i n general cu simptome de depresie, anorexie, diaree, icter sau anemie. Mai presus de orice, leziunile hepatice (necrozele i cirozele) evolueaz n final cu hepatome sau carcinome. Formele cronice ale aflatoxicozelor se traduc printr-o scdere a performanelor de cretere a animalelor, anemie, icter lejer i o evoluie canceroas n final. O doz de 0.2g/kg timp de 470 zile declaneaz un hematom la oareci.

11

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Mecanismul aciunii aflatoxinelor: Aflatoxina B1 ptrunde n celul i este fie metabolizat de monooxigenaz n reticulul endoplasmatic obinndu-se produi metabolici hidroxilai care sunt ulterior metabolizai la glucuronid i conjugai sulfurai; fie este oxidat obinndu-se epoxidul reactiv care este hidrolizat spontan i se poate lega de proteine devenind citotoxic. Epoxidul poate reaciona cu ADN-ul sau cu proteinele, sau poate fi transformat de o glutation, S-transferaza la (GSH) conjugat. Datorit efectelor negative asupra organismului animal i uman, limitele maxime admise de aflatoxine n produsele alimentare sunt cuprinse ntre 0.05-15 (g/kg) (tabel 2). Aflatoxina M1 n 1963 s-a demonstrat c la vite, aflatoxina B1 este absorbit cu hrana contaminat, este metabolizat ntr-un derivat numit aflatoxina M1 care este regsit n lapte. 0.5-4% de aflatoxin B1 ingerat se regsesc sub form de aflatoxina M1 n lapte. Aceast micotoxin pstreaz , la o treapt inferioar, importantele proprieti cancerigene ale aflatoxinei B1. Astfel, efectul cumulativ legat cu ingerarea regulat a acestor toxine, face s se expun la mari riscuri copii i sugarii, marii consumatori de lapte i produse lactate. Aceste riscuri sunt cu att mai importante deoarece aflatoxina M1 rezist la tratamentele uzuale de conservare i procesare a produselor lactate. Aflatoxina M1 se regsete n totalitate n laptele smntnit i n produsele lactate (iaurt, brnz), se regsete foarte puin n unt. Aceasta este legat de prezena interaciunilor hidrofobe ntre aflatoxina M1 i cazein.

12

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Tabel 2. Aflatoxine - limitele maxime admise

Produs

Nivelul maxim de aflatoxina (g/kg) B1 B1+B2+G1+G2 M1


4.0 15.0 10.0 -

Aflatoxine Arahide, nuci i fructe uscate Arahidele, nucile i fructele uscate i produsele procesate din 2.0 acestea, destinate consumului direct sau folosite ca ingredient alimentar Arahidele supuse sortrii sau altui tratament fizic,nainte 8.0 de a fi consumate de ctre om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar Nucile i fructele uscate supuse sortrii sau altui tratament 5.0 fizic, nainte de a fi consumate de catre om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar Cereale (inclusiv hrica, Fagopyrum sp) Cereale (inclusiv hrica) i produsele procesate din acestea 2.0 destinate consumului uman direct sau folosite ca ingredient alimentar Cereale (inclusiv hrica) cu excepia porumbului, destinate 2.0 sortrii sau altui tratament fizic, nainte de consumul de ctre om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar Porumbul destinat sortrii sau altui tratament fizic, nainte 5.0 de a fi consumat de ctre om sau de a fi folosit ca ingredient alimentar Lapte (lapte batut, lapte pentru fabricarea produselor pe baz de lapte i laptele tratat prin cldura, aa cum este definit prin legislatia sanitara veterinara in vigoare Urmatoarele specii de condimente: 5.0 - Capsicum spp. (fructele uscate ale acestuia, intregi sau macinate, inclusiv chilli, pudra de chilli, cayennesi paprika) - Piper spp.(fructele acestuia, inclusiv piper alb sau negru) - Myristica fragrans (nucoara) - Zingiber officinale (ghimbir) - Curcuma longa (turmeric) Alimentele pentru copii i alimentele pe baz de cereale 0.10 procesate, pentru sugari i copii de vrst mic Formulele pentru sugari i formulele n continuare inclusiv laptele pentru sugari i laptele n continuare Alimente cu destinaie nutriional special destinate n special 0.10 sugarilor

4.0 4.0 10.0 10.0

0.05 -

0.025 0.025

13

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

1.2.2. Ochratoxina A Ochratoxina A a fost izolat pentru prima dat n 1965, de un grup de cercettori sud africani. Din punct de vedere chimic este o molecul de 3-metil-5 cloro-8 hidroxi-3,4 dehidroizocumarina, legat prin legatur peptidic, la nivelul gruprilor carboxil n C7, cu o grupare aminic a L- fenilalanina (figura 3).

Exist i alte ochratoxine ca ochratoxina B, care este derivat al ochratoxinei A i ochratoxina C ester etilic. Aceste diferene de structur, au efecte marcante asupra potenialului toxic. Ochratoxina A este micotoxina cea mai toxic i cea mai rspndit. Ochratoxina A are o mas molecular de 403,8 g/mol, cu un punct de topire la 90C, cnd se cristalizeaz n xilen. Spectrul de adsorbie UV variaz cu pH-ul i polaritatea solvantului. Ochratoxina A posed un maxim de adsorbie de 333 nm, cu un coeficient de extincie molar de 5500 ml cm n metanol. Este o micotoxin toxic, o doz de 2 ppm este suficient pentru a opri creterea animalului. Este un contaminant frecvent al cerealelor, al cafelei, nucilor, fructelor uscate, piperului. Ochratoxina A este un metabolit secundar, elaborat de diferite mucegaiuri din genurile Aspergillus i Penicillium. Producia de ochratoxina A este legat de temperatura, umiditatea mediului ambiant i coninutul de ap al suportului contaminant. Valorile minimale ale umiditii pentru producia de ochratoxin oscileaz ntre 0,83 i 0,90, n funcie de mucegaiul studiat. Temperatura optim pentru producia de ochratoxin de ctre Aspergillus ochraceus este de 28C, sinteza poate avea loc la temperaturi cuprinse ntre 15 si 37 C. Penicillium veridicatum ns crete ntr-o gam de temperaturi care variaz ntre 4 si 30C n prezena unei umiditi de 22%. n regiunile reci, ochratoxina este produs de mucegaiuri din

14

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine genul Penicillium, iar n regiunile calde , ochratoxina este sintetizat de mucegaiuri din genul Aspergillus . Producia de ochratoxin A este legat de psihologia proprie a fiecrei specii de mucegai i de parametrii ecologici. n Europa i Canada, Penicilium verrucosum este considerat ca fiind principalul mucegai productor de ochratoxina A n cereale, formndu-se n general pe alimente acide. Concentraiile de ochratoxina A, regsite n alimente sunt foarte variate, i sunt cuprinse ntre cteva ng/kg pn la multe zeci de mg/kg. Mucegaiurile productoare de ochratoxina A pot produce i alte toxine sau pot cu alte mucegaiuri s produc toxine diferite ca citrinina sau aflatoxine. Un fenomen de sinergism cu ochratoxina A se poate deci produce i poate complica analiza efectelor toxice, ceea ce nu poate fi atribuit exclusiv ochratoxinei A.

Prezena ochratoxinei A n alimente prezint un pericol pentru sntatea uman i animal. Ochratoxina A, odat ingerat este absorbit parial la nivelul stomacului prin difuzia pasiv a formei neionizate. Totui, acest mecanism pasiv nu contribuie dect la absorbia sczut a ochratoxinei A. Principala cale de absorbie este nivelul intestinal. Procentul de absorbie al ochratoxinei A la nivel intestinal este de 66, 56, 56 si 40% la porc, obolan, iepure i pui. Este apoi distribuit la diferite organe. Urmeaz apoi ciclul enterohepatic. Se pot ntlni cantiti mici de ochratoxina A liber n snge. Ochratoxina A are o mare afinitate pentru

15

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine anumite proteine plasmatice de care este fixat (aproximativ 90%). Se fixeaz pe albumina seric i pe o macromolecul seric neidentificat cu masa molecular de 20KDa. Fixarea ochratoxinei de aceste proteine este un fenomen saturat. Mecanismul prin care ochratoxina A se leag de proteine este puin cunoscut. S-a artat c ochratoxina A sub forma de di-anion, este legat la nivelul a dou poziii de fixare pe albumina seric. Aceste poziii de fixare aparin subunitilor II A si II B a albuminei serice. S-a artat de asemenea c aceste legturi pot fi deplasate prin legturi anionice, ca aspartamul, fenilalanina i anti-inflamatorii. Aceast fixare ntrzie transportul ochratoxinei, la nivelul diferitelor organe, i contribuie la dezvoltarea efectelor cronice i toxice ale acestei toxine. Profilul toxicogenic al ochratoxinei A variaz foarte mult n funcie de specie. La om, calea de eliminare a ochratoxinei este nc foarte lung, i a fost estimat la o lun. Pe de alt parte, eliminarea ochratoxinei A a fost descompus n dou faze: una rapid cu o trecere a OTA n snge de 20 ore, i una secund, mult mai lent, unde trecerea OTA n sange este de 25,5 zile. OTA este distribuit la organe, unde este metabolizat n vederea eliminrii sale.

EFECTE PATOGENICE/TOXICE-OTA
Mecanismul de aciune ipotetic al ochratoxinei A: Ochratoxina A (OTA) este transportat n celul prin intermediul transportorilor organici anionici multispecifici. Structura chimic a OTA conine o grupare izocumarinic legat de fenilalanina (PHE). Multe studii au demonstrat faptul c OTA poate altera procesele care implic fenilalanina i multe dintre efectele biologice ale OTA pot fi prevenite parial prin suplimentarea cu fenilalanina sau substane analoage.

16

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine


O CO 2H CH 2 CH N H Cl H C OH

Ochratoxina H A
CH 3

Legare de proteine plasmatice

ADN aduct Afectarea proceselor care implica metabolismul fenilalaninei (PHE) Inhibarea sintezei proteice Legare de proteine citosolice si organelare Inhibarea enzimelor folosind PHE ca si substrat

Datorit efectelor negative pe care le are ochratoxina A asupra sntii omului i animalului, limitele maxime admise n produsele alimentare sunt cuprinse ntre 2 10 ppb (tabel 3).
Tabel 3. Limite maxime admise pentru ochratoxina A

Produsul Ochratoxina A Cereale (inclusiv orez si hrisca) i produse cerealiere derivate Cereale brute (inclusiv orez si hrisca brute) Toate produsele derivate din cereale (inclusiv produse cerealiere procesate si boabe de cereale destinate consumului uman direct) Stafide uscate Cafea crud prjit i cafea prjit i mcinat cu excepia cafelei solubile Cafea solubila (cafea instant) Vin (vin rosu, alb roze) i alte tipuri de vin si/sau bauturi racoritoare pe baza de must de struguri Suc de struguri, suc de struguri ca ingredient n alte buturi rcoritoare, inclusiv nectarul de struguri i sucul de struguri concentrat aa cum este reconstituit Must de struguri i must de struguri concentrat destinat consumului uman direct Alimente pentru copii i alimente pe baz de cereale procesate pentru sugari i copii de vrst mic

Nivelul maxim (g/kg sau ppb) 5.0 3.0 10.0 5.0 10.0 2.0 2.0 2.0 0.50

17

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Alimente cu destinaie nutriional special destinate n special sugarilor Cafea verde, fructe uscate altele decat stafidele, cacao i produsele din cacao, vinurile licoroase, produsele din carne, condimentele i lemnul dulce (Glycyrrhiza glabra) 1.2.3. Patulina Este o lacton nesaturat, produs de numeroase mucegaiuri, dar cel mai frecvent de Aspergillus clavatus, o ciuperc a microflorei granelor, Penicillium expansum, agent de mucegire a merelor n depozite i Bassochlamys nivea i Bassochlamys fulva prezente sub forma lor imperfect. 0.50 -

n alimentaia animal, este o micotoxin foarte frecvent n furajele depozitate ude i n cerealele cultivate n sladarii. Este folosit de asemenea n farmacii ca antibiotic pentru a lupta mpotriva stafilococilor, ns toxicitatea sa a dus la abandonarea acestei ntrebuinri. Efectele patulinei se manifest prin leziuni congestive la nivelul plmnilor, rinichilor i splinei, dar poate provoca o degenerescen de neuroni n cortexul cerebral, putnd rezulta diferite simptome nervoase (paralizii, etc.). Poate avea efecte toxice asupra globulelor albe (leucocite), ct i proprieti cancerigene. Potrivit Monitorului oficial al Romniei din 26 noiembrie 2006 limita maxim admis pentru coninutul de patulin este de 10 g/kg. (tabel 4).

18

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine


Tabel 4. Limite maxime admise pentru coninutul de patulin

Produsul Patulina Suc de fructe i nectar de fructe, n special suc de mere i sucurile de fructe ca ingrediente pentru alte buturi; Suc de fructe concentrat dup reconstituirea conform instruciunilor productorilor Buturi spirtoase, cidru i alte buturi fermentate derivate din mere sau coninnd suc de mere Produsele solide de mere, inclusiv compot de mere, piure de mere destinat consumului direct Suc de mere i produse solide din mere, inclusiv compot de mere i piure de mere pentru sugari i copii de vrst mic i etichetate i comercializate ca destinate sugarilor si copiilor de vrst mic.Alte alimente pentru copii altele dect cele pe baz de cereale procesate 1.2.4. Zearalenon

Nivelul maxim (g/kg sau ppb) 50.0

50.0 25.0 10.0

Poate fi produs de diferite specii de Fusarium: Fusarium culmorum, Fusarium graminearum i Fusarium Crookwellense. Este un compus cristalin, de culoare alb. A fost numit iniial toxina F2. Condiiile optime pentru a se produce sunt umiditate ridicat i temperatur sczut.

Fig. 5. Structura chimica a zearalenonei

19

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Se prezint ca o lacton nesaturat a acidului exorcilic (figura. 5). Este termostabil i rezist la o depozitare prelungit. Prin hidrogenare, se reduce funcia cetonic n alcool astfel nct se obin izomerii zearalenonei: izomerul este folosit ca stimulent de cretere pentru ovine. Nu are efecte toxice cronice. Porcul este animalul cel mai sensibil. Contaminarea fungic intervine pe cmp, porumbul prezentnd un mucegai rou. Dar producia de toxine se realizeaz n principal n timpul depozitarii. Nu prezint efecte toxice cronice. Limita maxim admis pentru coninutul de zearalenon este de 20 g/kg (tabel 6).
Tabel 5. Limite maxime admise pentru coninutul de zearalenon

Produsul Zearalenona Cereale neprocesate altele dect porumbul Porumbul neprocesat Fina de cereale cu excepia finii de porumb Fina de porumb, puda de porumb, srot i ulei rafinat de porumb Pine, produse de patiserie, biscuiti Batoane de porumb i cereale pentru micul dejun pe baz de porumb Batoane din alte cereale si cereale pentru micul dejun altele dect cele pe baz de porumb Alimente pe baza de porumb procesat pentru sugari i copii de vrsta mic Alimente pe baz de alte tipuri de cereale pentru sugari i copii de vrsta mic

Nivelul maxim (g/kg sau ppb) 100 75 50 50 20

EFECTE PATOGENICE/TOXICE-ZEARALENONA
Mecanismul de aciune al zearalenonei: Zearalenona (Z), asemenea poliestrogenilor (PE) i al estrogenilor din mediu (AE), traverseaz pasiv membrana celular i se leag de receptorii estrogeni. Complexul receptor -Z ajunge n nucleu foarte rapid unde se leag de receptori nucleari specifici i genereaz raspunsuri estrogene prin activarea genelor: acest lucru are ca rezultat producerea de ARN mitocondrial (mARN) care codific n mod normal producerea de proteine care apar n mod normal prin legarea de receptorii estrogeni.

20

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Receptor estrogen

Z PA Proteina indus hormonal PE

Z mARN

Complex ribozomal mARN

1.2.5. Fumonisinele Sunt produse de diferite specii de Fusarium, n special de Fusarium moniliforme. Cele mai toxice fumonisine sunt fumonisina B1 i fumonisina B2. Se gsesc n principal n porumb i produsele pe baz de porumb. Are o structur liniar din 20 atomi de carbon cu grupri metil, hidroxil i doi substituieni cu masa mai mare (figura 6). Au de asemenea o funcie aminic primar care ii confer o reactivitate interesant i o solubilitate n mediu apos. Sunt hepatotoxice, nefrotoxice. Se gsesc de obicei n porumb, dar i n orez, mirodenii, bere.

Fig. 6. Structura chimic a fumonisinelor

21

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

EFECTE PATOGENICE/TOXICE-FUMONISINE
Consecine: cantitatea crescut de sfinganin a produs moartea celulei; cantitatea sczut de ceramid a produs moartea celulei; a alterat semnalele transmise prin cile mediate de baz sfingoid 1-fosfat; a alterat funcionarea n procesele modulate de lipide, sfingomielina i glicosfingolipide; se observ niveluri crescute de baze sfingoide 1-fosfat n ser i n urin.

1.2.6. Trichotecinele Au fost asociate nc de la nceputul secolului cu consumul de cereale ameitoare (de fapt mucegite) n Siberia, avnd ca simptome grea, vrsturi, ameeli i tulburri vizuale. Dup descoperirea lor n anul 1974, s-a putut constata c sunt responsabile de Aleucie Toxic Alimentar ( descreterea numrului de globule albe), ca o consecin a consumului de cereale mucegite. n plus s-a vzut c tricotecinele sunt capabile s induc reacii chimice cu irigaii severe, inflamaii, descuamri ale pielii n contact cu micotoxina. Sub acest nume, sunt cunoscute mai mult de 75 de micotoxine, produse de Fusarium, dar i de Tricothecium, Mycothecium. Toxicitatea poate fi folosit ca arm clinic dar se poate folosi i n chimioterapii datorit efectelor benefice. Sunt grupate n tricotecine de tip A ( Toxina T-2 si HT-2) i de tip B (desoxinivalenolul, nivalenolul). Sunt formate dintr-un nucleu 12, 13 epoxitricotecine, format din patru cicluri sixterpenice cu o dubl legtur i un epoxid stabil. Cei cinci substituieni care pot fi inserai pe acest nucleu formeaz 148 compui cunoscui, grupai n patru grupe.

22

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Grupele A i B sunt cele mai frecvente, i sunt caracterizate prin prezena sau nu a unei funcii atomice n poziia C8. Au o mare stabilitate i rezist att la tratamente termice ct i alcaline. Toxicitatea este legat de numrul radicalilor substituii n nucleul central. Nu se acumuleaz n organism, sunt eliminate prin fecale i urin. Toxina T-2 este produs de numeroase specii de Fusarium, n special de Fusarium tricinctum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium solani i Fusarium equiseti . - formula brut : C24H34O9, - masa molecular : 466,50 g/mol, - solubila n solveni organici polari ca acetona sau acetonitrilul ; - stabila n solveni ca acetatul de etil. Toxina HT-2, este produs de numeroase specii de Fusarium, n special de Fusarium sporotrichioides i Fusarium poae : - formula brut : C22H32O8, - masa molecular : 424,5 g/mol, - solubil n solveni organici polari, - stabil n diferii solventi ca acetatul de etil. Desoxinivalenolul (DON), trichotecina cea mai rspndita n lume i este produs de F. graminearum i F. culmorum : - formul brut : C15H20O6, - masa molecular : 296,36 g/mol, - solubil n etanol, metanol, acetat de etil i ap, - stabil n acetat de etil la -18 C. Dintre trichotecine, cea mai frecvent ntlnit este desoxinivalenolu. Limita maxim admis conform Monitorului oficial al Romniei din 26 noiembrie 2006 este de 200ppb (tabel 6).

23

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Tabel 6. Limite maxime admise pentru coninutul de desoxinivalenol

Produsul

Nivelul maxim (g/kg sau ppb) 1250 1750 750 500 750 200

Desoxinivalenol (DON) Cereale neprocesate altele dect grul dur, ovz i porumb Grul dur i ovzul Porumb neprocesat Fina de cereale, inclusiv fina de porumb Pine, produse de patiserie, biscuii, batoane de cereale i cereale pentru micul dejun Paste fainoase (uscate) Alimente pentru copii i alimente pe baza de cereale procesate pentru sugari i copii de vrst mic

Modul de aciune la nivel molecular al DON i al altor tricotecene: DON ptrunde n celul prin difuzie i se leag de ribozomii activi care transmit un semnal la proteinkinazele activate de ARN (PKR) i la hematopoetokinaza celular (HCK). Are loc fosforilarea protein-kinazelor activate (MAPKS) i se obine activarea factorului de transcripie avnd ca rezultat efectele cronice i imunotoxice.

EFECTE PATOGENICE/TOXICE-TRICHOTECINE

24

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

1.3 Prezena micotoxinelor n diverse produse alimentare


Micotoxinele n cereale Practica a demonstrat faptul c, la depozitarea cerealelor, a produselor de mcini i panificaie apare n anumite condiii o microflor care favorizeaz creterea mucegaiurilor i producerea de micotoxine. Mucegaiurile existente n depozitele de cereale se nmulesc cnd umiditatea relativ a aerului se situeaz ntre 80-85 %, iar temperatura ajunge la peste 26 C. Produsele atacate la rndul lor devin sursa de infecie, acumulnd toxine. Aflatoxinele au fost puse n eviden n pine, produse de panificaie, crupe de porumb i n unele tipuri de pine dietetic. n cereale pe lng ochratoxina A s-a pus n eviden i ali metabolii toxici ai fungilor, cei mai muli din genurile Aspergillus i Penicillium, care trec i n produsele de mcini, concentraiile cele mai mari nregistrndu-se n tre. i n fina depozitat n condiii de umiditate ridicat pot aprea fungi care produc micotoxine (Fusarium, Mucor, Penicillium, Aspergillus). Porumbul recoltndu-se la o umiditate ridicat poate favoriza apariia mucegaiurilor (Aspergillus flavus) chiar nc din cmp. Orezul poate fi contaminat cu micotoxine, inclusiv aflatoxine, dar prin autoclavare aflatoxinele sunt inactivate. Micotoxinele din produsele de mcini pot trece n pine numai cnd se folosesc materii prime puternic contaminate. Este de remarcat faptul c fermentarea aluatului reduce n mic msur cantitatea de aflatoxine, coacerea nu are nici un efect asupra lor, dar adaosul n aluat de substane oxidante ( tipul bromailor) pot determina reduceri importante n aflatoxine. Cercetrile efectuate au scos n eviden c pentru inhibarea dezvoltrii microorganismelor n pine se pot folosi diveri fungistatici ca: acidul sorbic i palmitatul de sorboil. Pinea de secar cu aciditate ntre 8.8-9.7 grade de aciditate, nu permite aciditatea, formarea ochratoxinelor, iar pe cea de gru se dezvolt cantiti mici din toate cele 4 tulpini izolate. Micotoxinele n semine oleaginoase i n ulei i seminele oleaginoase (arahidele etc.) pot fi atacate de mucegaiuri (inclusiv Aspergillus flavus) care dau natere aflatoxinelor; momentele critice fiind recoltarea i depozitarea, condiii de clim, de pstrare etc.

25

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Umiditatea arahidelor (apa) n perioade ploioase poate ajunge la 30%; recomandndu-se uscarea imediat a acestora pentru a preveni contaminarea cu aflatoxine. La obinerea uleiului prin presare cantitatea mare de micotoxine rmne n turte, numai 5% trece n ulei, respectiv aflatoxinele din ulei reprezint 10% din cantitatea existent n boabe, ceea ce nu reprezint un pericol mare. Prin prjire la arahide se reduce coninutul de substane toxice. Floarea soarelui respectiv seminele sunt i ele mediu bun pentru dezvoltarea aflatoxinelor. Uleiul din semine de floarea soarelui, conine cantiti mici de aflatoxine, deoarece prin procesul de rafinare, (tratare cu alcali) i filtrare (prin plci de celuloz-azbest) se reduce cantitatea de toxine, iar dac se execut decolorarea n prezena acidului citric detoxifierea este mai complet. Micotoxinele din legume i fructe Legumele i fructele pot fi i ele contaminate cu mucegaiuri care pot sintetiza micotoxine. Astfel la morcovi Aspergillus parasilicus sintetizeaz Aspergillus flavus, iar pe suprafaa citricelor se dezvolt Aspergillus parasilicus. Dezvoltarea mucegaiurilor pe fructe, n sucuri formeaz n majoritatea cazurilor patulina, cantiti mai mici s-au gsit n sucuri de pere, gutui, struguri, excepii fcnd sucurile de tomate i prune; n sucul de mere concentrat patulina nu se reduce. i pe fructele uscate se pot forma aflatoxine. Zahrul are efect de protecie asupra micotoxinelor, ceea ce a fcut ca patulina s existe i n gemuri. Micotoxine n cafea i cacao n cafea verde mucegit s-a identificat Aspergillus ochraceus, iar cu frecven mai mic Aspergillus flavus i Aspergillus versicolor; prin prjire se distrug 75%. Boabele de cacao conin micotoxine, produse de Aspergillus parasilicus. Micotoxine n buturi fermeentate n buturile alcoolice au fost depistate aflatoxine, mai frecvent n cidru, prin fermentarea pulpei. Cercetrile efectuate pe 150 de probe de vin nu a evideniat aflatoxine. Malificarea necorespunztoare a orzului poate forma aflatoxine, n bere trec 5-10% din cele existente n mal.

26

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Micotoxinele n carne i preparate din carne Micotoxinele pot infecta carnea animalelor ca urmare a ingerrii de furaje mucegite, cea mai mare cantitate din micotoxin ochratoxin se acumuleaz n rinichi. Ochratoxina are o termostabilitate ridicat; prin prjire se reduce concentraia de micotoxin, dar n esutul gras nu se schimb. Preparatele din carne pot fi contaminate cu mucegaiuri din genurile: Penicillium, Aspergillus, Fusarium. i salamurile fermentate-uscate pot fi contaminate cu tulpini de Penicillium i mai multe tulpini de Aspergillus. Dezvoltarea mucegaiurilor are loc atunci cnd pstrarea produselor se face n condiii nefrigorifice, iar pentru prevenirea dezvoltrii acestora este necesar adugarea de sorbat de potasiu. S-a constatat c o surs de infectare a preparatelor de carne cu mucegaiuri o constituie i condimentele. Micotoxinele n lapte i produsele lactate Furajele cu coninut mare de aflatoxine determin la vaci, prezena n lapte a unui metabolit al aflatoxinei B1, denumit milktoxin, care este detectat chiar din primele zile de la ingerare, declannd o degerescena a celulelor ficatului. Cantitatea de toxin este mai mare n lapte iarna fa de primvara. i n laptele praf cercetrile au pus n eviden existena unui numr mare de mucegaiuri, ca urmare a depozitrilor n condiii necorespunztoare. Laptele praf contaminat cu Aspergillus versicolor produce diaree puternic, iar Penicillium ciclopium produce simptome nervoase. n brnzeturi micotoxinele apar ca urmare a prezenei mucegaiurilor att n mediul ambiant ct i n urma proceselor tehnologice. Absena microorganismelor fungice s-a constatat la telemea i n unele cazuri la cacavalul tip Dobrogea. Valorile maxime de micotoxine s-au constatat la sortimentele pstrate un timp mai ndelungat. Cu ct consistena pastei este mai tare, cu att filamentele de mucegai ptrund mai greu n profunzime, numrul cel mai mic de mucegaiuri se nregistreaz la brnzeturile oprite; n brnzeturile topite frecvena aflatoxinelor este mult mai mic dect la celelalte tipuri. Cercetrile au artat c mucegaiurile Penicillium caseicolum, Penicillium camemberti i Penicillium roqueforti nu formeaz toxine. Totui, cercetrile ntreprinse de Scott au evideniat faptul c Penicillium camemberti i Penicillium roqueforti utilizate la fabricarea brnzeturilor sunt capabile s produc substane toxice (patulina, acid penicilic i alcaloizi toxici). 27

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Conform Ordinului nr. 1050/97/1145/505/2005 sunt admise urmatoarele limite maxime pentru aflatoxine in produse, care sunt prezentate in tabelul de mai jos.
Tabel 7. Nivel maxim admis pentru aflatoxine conform Ordin nr. 1050/97/1145/505/2005
Nr. crt. Produs B1 1 Arahide, nuci i fructe uscate i produse procesate din acestea destinate consumului uman direct sau folosite ca ingredient alimentar Arahide supuse sortrii sau altui tratament fizic, nainte de a fi consumate de ctre om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar Nuci i fructe uscate supuse sortrii sau altui tratament fizic nainte de a fi folosite ca ingredient alimentar Cereale (inclusiv hric, Fagopyrum sp.) i produse procesate din acestea destinate consumului uman direct sau folosite ca ingredient alimentar Cereale (inclusiv hric, Fagopyrum sp.) cu excepia porumbului, destinate sortrii sau altui tratament fizic, nainte de consumul uman sau ca ingredient alimentar Porumb destinat sortrii sau altui tratament fizic, nainte de a fi consumat de ctre om sau de a fi folosit ca ingredient alimentar Lapte (lapte brut, lapte pentru fabricarea produselor pe baz de lapte i lapte tratat prin cldur, aa cum este definit prin legislaia sanitar-veterinar n vigoare) Condimente (piper, nucoar, ghimbir, turmeric, chilli, pudr de chilli, paprika) Alimente pentru copii i alimente pe baz de cereale procesate, pentru sugari i copii de vrst mic Alimente cu destinaie nutritional special, pentru sugari 2 Nivel maxim de aflatoxin (g/kg = ppb) B1+B2+G1+G2 4 M1 -

2 3 4

8 5 2

15 10 4

6 7

5 -

10 -

0,05

8 9 10

5 0,10 0,10

10 -

0,025

28

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Datorit faptului c micotoxine se gsesc n unele produse alimentare, pentru a proteja sntatea consumatorilor ntr-o serie de ri s-au luat msuri de limitare a cantitii de micotoxine.

Tabel 8. Limita concentraiei admisibile (LCA) de aflatoxine n diferite ri Nr crt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ara Produse alimentare LCA Mg/kg aflatoxin Toate produsele alimentare 40 Unt de cocos (export), fina din arahide 50 Nuci, produse cu nuci, unt de cocos, alune comestibile i derivate 15 Produse importate de U.E, produse din 5-10 Brazilia (arahide si fina de arahide). Toate produsele alimentare (admite limitele impuse de U.E) Arahide din import (si derivatele de prelucrare). Fina de arahide Toate produsele alimentare Toate produsele alimentare Arahide Toate produsele alimentare Toate produsele alimentare Toate produsele alimentare Arahide de consum i alte alimente Produse alimentare 5-10 50 30 20 10 50 5 5-10 5-10 20 5

Belgia Brazilia Canada Danemarca Frana Italia India Israel Japonia Anglia Polonia Suedia Germania S.U.A Romnia

Micotoxinele n preparatele enzimatice fungice O preocupare important a cercetrii tiinifice actuale o constituie i problema folosirii preparatelor enzimatice n industria alimentar, ca urmare a eficienei economice, reducerii timpului de fabricaie i a consumurilor specifice, mbuntirii calitii produselor. Acestea n majoritatea cazurilor fiind de natur fungic s-a ridicat problema verificrii inocuitii lor, deoarece n condiii de cultur exist posibilitatea dezvoltrii de micotoxine. Prerile specialitilor n aceast direcie sunt contradictorii, deoarece mucegaiurile Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, etc, produc toxine doar n anumite condiii de cultur. De remarcat este faptul c la preparatele obinute, la aceleai mucegaiuri apar diferene de toxicitate.

29

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Preparatele enzimatice nepurificate care sunt obinute din aspergili pot s duc la apariia unor dereglri profunde, datorit includerii unor metabolii toxici (aflatoxine, ochratoxine, acid aspergilic etc). n urma analizrii preparatelor enzimatice din Rhizopus s-a constatat aciunea lor negativ asupra organismului animal, ceea ce a determinat scoaterea acestora din fabricaie. S-au izolat dou micotoxine n preparatele pectolitice obinute din Sclerotinina sclerotium i care au aciune toxic asupra ficatului, dar i un posibil efect cancerigen (tabel 9) Tabel 9. Posibiliti de reducere a coninutului de micotoxine n prod. alim. Nr. crt. 1. 2. Metoda aplicat Prevenirea dezvoltrii mucegaiurilor toxicogene Procedee prin extracie cu solveni organici Efecte Reducerea dezvoltrii mucegaiurilor toxicogene Aflatoxinele se dizolv n acetia

CAPITOLUL 2 Factori care influeneaz producerea micotoxinelor


Micotoxinele sunt metabolii secundari produi de mucegaiuri aparinnd n principal genurilor Aspergillus, Penicillium i Fusarium.

30

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine n condiii nefavorabile de temperatur i umiditate, mucegaiurile care contamineaza alimentele au capacitatea de a elabora metabolii toxicogeni. Prin consumul de nutreuri contaminate cu micotoxine, acestea sunt preluate de animal care le poate metaboliza doar partal. De la animal, micotoxinele ajung la om prin consumul de carne, n care micotoxinele sunt cumulate, prin consumul de ou, lapte i produse lactate, n care micotoxinele sunt excretate. Acestea devin alimente nocive pentru om, adica i pierd inocuitatea. Condiiile de toxicogenez sunt n general mai restrictive dect cele necesare creterii mucegaiurilor.

2.1 Biogeneza micotoxinelor


Formarea micotoxinelor poate avea loc la toate stadiile din cmp i pn la comercializarea produselor pentru consumul animal i uman. Natura micotoxinelor produse i care contamineaz alimentele depinde de speciile fungice, de condiiile ecologice i de stabilitatea acestor toxine n mediu alimentar. Micotoxinele nu contituie o clas chimic. Sunt metabolii secundari care nu joac un rol evident n economia microorganismelor: n comparaie cu metabolismul primar care este cu temeinicie acelai pentru toate metabolismul secundar, foarte important la mucegaiuri, aduce o mare diversitate de metaboliii secundari sunt foarte adesea elaborai de familia de produi chimici vecini, din punct de vedere toxicologic, aceasta explic n parte c pentru aceeai doz de toxin, efectele sunt foarte grave i mai puin specificate n intoxicaiile naturale fa de intoxicaiile experimentale efectuate cu o micotoxin pur. Natura produselor care se acumuleaz n aval, depinde de caracterele individuale ale suselor i de condiiile de mediu. La ora actual se cunosc n jur de 200 de specii de mucegaiuri care au capacitatea de a forma micotoxine. fiinele vii, metabolismul secundar depinde de speciile considerate, n acest caz, susele; molecule, din care micotoxinele;

31

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Fig. 7. Biosinteza micotoxinelor

Originea chimic a micotoxinelor este foarte divers, unele deriv din aminoacizi (alcaloizii de ergot, acidul aspartic, acidul ciclopiazolic, slaframina, glioxina, roquefortin, sporodesina), altele sunt policetoacizii ( aflatoxinele, ochratoxina, patulina, citrinina, acidul penicilic, sterigmatocistina, zeararlenona), iar altele sunt derivai terpenici ( fusarenona, desoxinivalenolul, varidina, toxina T-2). Micotoxinele se formeaz la finalul fazei exponeniale i nceputul fazei staionare a creterii mucegaiului (figura. 8).

Fig. 8 Fazele de cretere fungic i localizarea sintezei micotoxinelor

2.2 Formarea micotoxinelor


32

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Formarea micotoxinelor pe produsele alimentare presupune parcurgerea urmtoarelor etape: 2.2.1. Infestarea cu mucegai este favorizat de temperaturi ridicate i de umiditatea redus a solului

2.2.2 Colonizarea favorizat de atacul de insecte: - distrugerea barierelor fizice faciliteaz raspndirea infeciei pe produs; - distrugerea pericardului favorizeaz infecia interiorului boabelor; - descreterea umiditii boabelor 35%;

2.2.3. Producerea de micotoxine favorizat de: - temperaturi ridicate; - precipitaii reduse-stres hidric al plantelor; - ali factori limitativi ai plantelor cu boabe n curs de formare; - prolina, factor, semnal de stres n plante induce sinteza toxinelor n tulpinele toxicogene;

33

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Creterea microbian i producia de toxine este influenat de numeroi factori (fig. 9). Este important s cunoatem modul n care aceti factori influeneaz calitativ i cantitativ, dezvoltarea microorganismelor i producia de toxine pentru a putea stabili condiiile optime de depozitare a cerealelor.

Fig. 9. Factori care favorizeaza creterea fungica i producia de toxine

. Pentru a ntelege modul n care celula microbian reacioneaz la condiiile mediului ambient, diferii factori au fost mparii arbitrar n trei mari grupe, cu precizia c n condiiile naturale, bioefectul acestora poate fi cumulativ sau sinergic: .a. 34 Factori extrinseci sunt factorii exogeni, ai mediului natural/industrial: temperatura, umezeala relativ a aerului, concentraia de oxigen, radiaii, factori mecanici, factori chimici,

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Factori intrinseci sunt factori dependeni de natura alimentului care influeneaz

creterea i activitatea culturilor starter dar i de natura alterrii specifice a produselor alimentare-compoziia chimic i concentraia n nutrieni, pH, rH, structura anatomic, substane chimice . Factori implicii sunt factori biologici determinai de relaiile ce se pot stabili ntre diferitele grupe de microorganisme care alctuiesc microbiota alimentului respectiv.

2.3 Influena factorilor extrinseci asupra apariiei micotoxinelor


2.3.1 Temperatura Temperatura are influen asupra speciei de mucegai, dar i asupra produselor de metabolism. Procesele metabolice se desfoar n limite stricte de temperatur, specifice fiecrui microorganism. Acest factor poate favoriza sau inhiba dezvoltarea microorganismelor, iar n anumite cazuri poate chiar determina moartea acestora. Efectul temperaturii asupra dezvoltrii microorganismelor se datorete influenei pe care aceasta o exercit asupra: - strii de agregare a apei, n funcie de care se mrete sau se micoreaz disponibilitatea apei; - vitezei reaciilor enzimatice; - plasticitii membranei celulare i citoplasmei; - macromoleculele pe care le pot denatura; Mucegaiurile se dezvolt la temperaturi diferite. Exist pentru fiecare specie, un grad de temperatur la care dezvoltarea se face cu cea mai mare intensitate. Aceast temperatur se numete temperatura optim de dezvoltare. Deasupra i sub temperatura optim, dezvoltarea mucegaiurilor slbete, i cnd atinge un anumit punct, superior sau inferior, nceteaz de a se mai dezvolta chiar dac mediul nutritiv ramne acelai. Temperatura superioar optimului, la care se mai poate observa o foarte slab dezvoltare a mucegaiurilor, se numete temperatura maxim iar cea inferioar, temperatura minim de dezvoltare. Cnd temperatura se ridic deasupra maximului de temperatur, mucegaiul este distrus. Dac temperatura scade sub minimul de temperatur, mucegaiul nu este distrus ci se gsete ntr-o stare de via foarte lent, favorabil conservrii. Temperatura optim pentru creterea mucegaiurilor este cuprins ntre 25-30C iar limita maxim este de 40-45C (tab.10). Exist totui mucegaiuri care se pot dezvolta fr probleme 35

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine la temperaturi de 55C Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, dar i mucegaiuri care sunt capabile s se dezvolte la temperaturi de 0C, Penicillium cyclopium. Tabel 10. Temperaturi minime necesare pentru dezvoltarea unor mucegaiuri i pentru producia de micotoxine. Mucegai Aspergillus flavus Aspergillus clavatus Aspergillus ochraceus Penicillium expansum Penicillium cyclopium Penicillium cyclopium Fusarium roseum C 10 10 10-12 0 0 0 15 Micotoxina Aflatoxine Patulina Ochratoxina Patulina Ochratoxina Acid penicilic Zearalenona C 10 12 12 0-24 0-24 4 10

Se observ c sunt unele situaii n care exist o apropiere ntre temperatura minim necesar pentru creterea mucegaiului i cea la care are loc producerea de micotoxine. Exist totui unele excepii cnd temperatura de dezvoltare a mucegaiului este cuprins ntre 6-45C cu un optim la 37C iar producia de micotoxine are loc ntr-un interval de temperatur cuprins ntre 11-36C cu un maxim la 30C. Fusarium roseum (productor de zearalenon) se dezvolt bine ntre 24-27C, iar producia de micotoxine are loc la temperaturi cuprinse ntre 10-12C. Totui, sunt varieti ale lui Fusarium roseum, ca Fusarium roseum gibbsosum i Fusarium roseum semitectum care au capacitatea de a produce n orz la 25C, cantiti de zearalenon echivalente cu producia de micotoxin la temperatura de 10C. Plecnd de la aceste temperaturi minime necesare pentru creterea anumitor mucegaiuri, putem spune c sunt condiii optime pentru o cretere i proliferare fungic la o valoare optim mai mare de 0.75, o temperatur mai mare 20C i o umiditate a substratului de 14%. Mucegaiurile se mpart n linii mari, dup temperatura de dezvoltare n: mezofile, termofile, termotolerante si psichrofile. Majoritatea mucegaiurilor sunt mezofile. Tabel nr.11 Exigenele termice pentru dezvoltarea mucegaiurilor Mezofile Maxim Minim Optim Termofile Temperatura <50C >0C 15-30C

36

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Maxim Minim Termotolerante Maxim Minim Optim Psihrofile Maxim Minim Optim 50C 20C 50C >0C 15-40C 20C <50C 0-17C

La temperaturi foarte joase, de pn la -19C, mucegaiurile nu sunt omorte, sporii lor supravieuiesc i rmn api germinrii atunci cnd se ntorc n condiii normale. Aceast mare stabilitate a mucegaiurilor la temperaturi joase permite n micotec conservarea uoar surselor prin tehnici de liofilizare. n atmosfera cu temperaturi ridicate, tunelele de uscare a alimentelor tocate, se observ o microflor fungic foarte abundent n care domin speciile termofile sau termorezistente ca: Aspergillus flavus i Aspergillus fumigatus. Rhiyopus pusillus, izolat n diverse substraturi (cacao, cereale, boabe de mutar), este capabil s se dezvolte pn la 57C. Fr s creasc, poate avea spori care s supravieuiasc la temperaturi foarte ridicate, i de asemenea, acest oc termic stimuleaz dup acea germinare; este cazul ascosporilor de B. Fulva, un contaminant al sucului de fructe i ascosporii de Neurospora cras care se gsete n lemnul ars i n brutrii, tubul germinativ dezvoltndu-se dup expunerea timp de 5-20 minute la temperaturi mai mari de 100C.

37

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

2.3.2 Umiditatea Cantitatea de ap existent n mediul ambiant i n substraturi este unul din factorii importani pentru dezvoltarea mucegaiurilor i pentru producia de micotoxine. n atmosfer exist o umezeal relativ de 70-90% i prin pstrarea alimentelor, n timp, n funcie de temperatur i compoziia produsului are loc o absorbie a vaporilor de ap din aer, instalndu-se o stare de echilibru, cu creterea cantitii de ap liber i a indicelui de activitate a apei. Este tiut faptul c mucegaiurile apar dup o cretere accidental a umiditii. ns, nu doar cantitatea de ap influeneaz ci i forma de prezentare a acesteia (liber sau legat). Apa liber este apa din interiorul celulelor i poate fi eliminat fr a interveni n procesele vitale. Apa legat face parte integrat din celule. Pentru germinare, sporii de mucegai au nevoie ca ap s se gseasc n form liber. Exist dou uniti relaionate cu cantitatea de ap: umiditate relativ de echilibru (HRE): este cantitatea de ap care dispun microorganismele, fiind echilibrul ntre coninutul de ap liber al produsului i vaporii de ap existeni n mediul ambient. Se exprim n procente i variaz de la un produs la altul n funcie de coninutul acestuia n glucide sau materie gras. apa disponibil sau activitatea apei (aw) este relaia existent ntre apa liber din alimente i capacitatea microorganismelor pentru proliferare. Activitatea apei ne indic care este cantitatea de ap disponibil pentru dezvoltarea microorganismelor. aw se exprim ca relaia existent ntre tensiunea vaporilor de ap n substratul (P) i apa pur (Po), la aceeai temperatur, (aw =P/Po). Dac umiditatea alimentului este n echilibru cu umiditatea relativ de echilibru a atmosferei, aw este numeric echivalent cu aceasta (aw = HRE/100). Valorile a w la diverse grupe de mucegaiuri variaz n funcie de temperatur i substrat. Comportamentul diferit al mucegaiurilor n funcie de exigena lor fa de valoarea aw, face ca aceasta s se mpart n: specii xerofile la care germinarea sporilor este posibil la o valoare a aw mai mic de 80%, n special specii din genul Aspergillus repens, Aspergillus glaucus, Aspergillus versicolor, Aspergillus flavus, Aspergillus nidulans; 2121 2

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine specii mezofile cu o exigen la apa cuprins ntre 80-90% Penicillium cyclopium, Penicillium expansum, Alternaria, Cladosporium cladosporioides; specii hidrofile (superioare 90%) Epicoccum nigrum, Fusarium ssp, Mucorales; Tabel 12. Valori ale aw necesare pentru dezvoltarea unor mucegaiuri i pentru producia de micotoxine Mucegai Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Penicillium expansum Penicillium patulum Aspergillus clavutus Aspergillus achraceus Aspergillus ochraceus Penicillium cyclopium Penicillium viridicatum Penicillium citrinum Penicillium martensii aw 0.78 0.70 0.85 0.83 0.85 0.77 0.77 0.82 0.83 0.80 0.79 Micotoxin Aflatoxine Aflatoxine Patulina Patulina Patulina Ochratoxine Acid penicilic Ochratoxine Ochratoxine Citrina Acid penicilic aw 0.83 0.80 0.99 0.95 0.99 0.88 0.90 0.90 0.90 0.88 0.99

Se observ c majoritatea mucegaiurilor se dezvolt plecnd de la valori ale aw-0.7. n general sunt rare cazurile n care anumite mucegaiuri germineaz la valori ale aw cuprinse ntre 0.6 i 0.7. Totui producia de micotoxine este nul sau foarte sczut la valori ale a w mai mici de 0.85, iar creterea mucegaiurilor toxicogene se poate realiza ntr-un interval al aw cuprins ntre 0.70-0.85.

3121 3

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

2.3.3 Tensiunea superficial Microorganismele sunt influenate de tensiunea superficial a mediului n care se gsesc. Substanele care coboar tensiunea superficial ntrzie sau mpiedic dezvoltarea mucegaiurilor, aceste substane pot s aib, de asemenea, influen asupra morfologiei i sporulrii. 2.3.4 Presiunea osmotic Presiunea osmotic poate provoca modificri brute ale structurii celulare (plasmoliza, turgescena) i modificri ale morfologiei microorganismelor.

4121 4

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Mucegaiurile sunt microorganisme osmofile (se pot dezvolta pe medii cu presiune osmotic mare) i din acest motiv, ele pot altera produsele alimentare care conin o cantitate mare de zahr (miere, dulcea, etc.). Ele se pot dezvolta pe produse care conin max. 70% zahr. 2.3.5 Lumina Aciunea luminii depinde de specia microorganismelor. n general se poate spune c lumina este duntoare mucegaiurilor. Aciunea vtmtoare a luminii crete cu scderea luminii de und a razelor luminoase. Din spectrul luminos cele mai vtmtoare sunt razele violete, iar din spectrul invizibil, radiaiile ultraviolete. Aciunea duntoare a razelor ultraviolete depinde de intensitatea i durata lor de aciune asupra mucegaiurilor, acestea putnd fi mpiedicate sau oprite din activitatea lor, ori complet distruse. Cnd aciunea luminii se exercit asupra unei culturi i nu numai asupra unui singur microorganism, se deosebete alturi de aciunea direct, i aciunea indirect asupra mediului de cultur. Astfel, n mediile de cultur care au fost expuse la lumin solar sau la radiaiile UV, s-a gsit ntotdeauna ap oxigenat, rezultat din oxidarea apei, oxidare produs de raze, care constituie un toxic pentru microorganism. Prin urmare, aciunea luminii asupra microorganismului, se exercit fie direct, asupra celulei nsi, fie indirect, prin producerea apei oxigenate. 2.3.6 Integritatea fizic a boabelor i nveliului produselor vegetale Factorul acesta asigur calitatea produselor n timpul conservrii i face mai dificil atacul mucegaiurilor. Produsele cerealiere sunt protejate de mediul exterior, de tegumente care sunt o barier foarte eficace mpotriva penetrrii microorganismelor. Aceast eficacitate scade dup recoltare, deoarece anvelopa protectoare este eliminat sau lezat. Structura intern reprezentat de pereii celulozici, diminueaz nmulirea i deci proliferarea germenilor n masa produselor alimentare. Microorganismele emit astfel n mediul exterior hidrolaze care le permit s treac aceast barier. Structura i starea fizico-chimic a materiei are un rol important asupra creterii germenilor.

5121 5

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Tegumentele intacte ale boabelor ngreuneaz accesul mucegaiului. Boabele sfrmate sunt mai susceptibile invaziei i creterii fungice dect boabele ntregi deoarece partea intern a bobului este cea mai vulnerabil la aciunea mucegaiurilor datorit compoziiei chimice a acestuia.

2.4 Influena factorilor intrinseci asupra apariei micotoxinelor


2.4.1 Natura substratului n general, substratul optim este cel glucidic. Mucegaiurile nu sunt exigente din punct de nutriional, ele hrnindu-se cu micro i macro elementele care exist n substratul unde se dezvolt. Aflatoxina este secretat n special pe amidon, iar zearenona se formeaz pe un substrat celulozic.

6121 6

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

2.4.2 Influena pH-ului asupra dezvoltrii mucegaiurilor Aciunea pH-ului asupra creterii microorganismelor se situeaz la trei nivele: mediu permeabilitatea membranei activitatea metabolic Disponibilitatea anumitor nutrieni n mediul de cultur este modificat prin echilibrul ionic. La pH acid, ionii de magneziu formeaz compui insolubili, la pH bazic, zincul, calciul i ionii ferici sunt complexai. Sub aceast form aceti ioni indispensabili ca i cofactori ai enzimelor sunt dificil de folosit. Permeabilitatea membranelor este n egal msur afectat de variaiile de concentraii n ioni de H + i OH - . n mediul acid pearmeazele cationice sunt saturate n ioni de hidrogen, ceea ce limiteaz sau anuleaz transportul aciunilor indispensabili. n mediul alcalin ionii hidroxil care satureaz membrana impiedic transferul de anioni indispensabili. Reaciile enzimatice au un optim de cretere. Totui variaiile de pH citoplasmatic vor stabili o ncetinire a activitii enzimatice i creterii. Enzimele nu au toate acelai comportament n funcie de pH, hidrolazele extracelulare fiind mai sensibile dect enzimele citoplasmatice. Citoplasma este de asemenea protejat de schimbul limit de pH extracelular. Membrana citoplasmatic este puin permeabil la molecule foarte ionizate n general i la ioni de H + n particular, i citoplasma are funcie tampon foarte eficace pe de alt parte. Aciunea pH-ului este legat de conservatorii sau inhibitorii familiei acizilor organici, acizi slabi. Mucegaiurile suport un interval mare de valori ale pH-ului 2.5-7.5, suportnd mai bine un mediu acid dect unul alcalin. Este bine de specificat faptul c mucegaiurile pot modifica pH-ul, folosind ca surs acizii organici ai alimentelor. Keller SE au studiat efectul pH-ului asupra produciei de fumonisine B1 de ctre Fusarium proliferatum n mediul lichid limitat n azot. Au dedus c exist un prag care separ dou compartimente fiziologice. La un pH mai mare de 5, Fusarium proliferatum se dezvolt normal i produce puine toxine, n timp ce la un pH mai mic de 5, creterea este mai puin important, iar producia de toxine este superioar.

7121 7

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

2.4.3 Nutrieni minerali Microorganismele, pentru dezvoltare au nevoie de ap, o surs de energie, de azot, de sruri minerale i eventual de oxigen i/sau factori de cretere. Microorganismele care se ntlnesc pe produsele alimentare sunt chimio-organotrofe i folosesc mai degrab hidraii de carbon ca surs de energie dect acizii grai sau substanele azotoase. Monomerii sau moleculele mici sunt ncorporate n citoplasm prin transport membranar, polimerii trebuie s fie ns hidrolizai n prealabil. Produsele alimentare conin n general toi nutrienii necesari dezvoltrii microorganismelor, dar diferenele de compoziie observate au un efect selectiv asupra florei microbiene. Sunt n relaie cu compoziia substratului, fierul i zincul, fiind elementele cele mai importante pentru creterea fungic. Lipsa anumitor elemente are ca rezultat o cretere fungic foarte sczut. Nutriia mucegaiurilor Prin analiza chimic s-a stabilit c celula conine urmtoarele elemente: C, N, O, H, P, S, Si, Cl, K, Ca, Mg, Fe, Na precum i urme de Mn, Al, Zn, B. Cele mai frecvente elemente sunt: N, C, H, O, P, S, K, Mg i uneori Fe, respectiv Mn. Primele opt elemente sunt cu siguran absolut indispensabile vieii microorganismelor. Folosirea dar nu i indispensabile sunt: Na, Ca, Mn, Cl, Si, etc. Calciul este la puine specii de microbiene. Proporia acestor elemente, indispensabile sau utile de asemenea este deosebit. Unele se gsesc n cantitate mult mai mare dect altele. Cele dinti servesc ca baz pentru formarea esuturilor microorganismelor (membrana, protoplasma, nucleu) i din aceast cauz au fost numite elemente plastice, spre deosebire de celelalte, care se gsesc n cantiti foarte mici sau n urme i care au fost numite elemente catalitice sau fiziologice servind ca activatori. n aceast categorie intr Fe, Mn, care mresc activitatea oxidazelor, sau Ca care joac rol n nutriia azotat i n transformarea substanelor azotate prin microorganismelor fixatoare de azot. Elementele catalitice au fost studiate amnunite de Gabriel Bertrand, care le-a denumit i elemente oligodinamice. Pentru procurarea acestor elemente indispensabile sau numai utile, microorganismele au nevoie de diferite substane din care s ii procure elementele necesare. Nu orice substan, ns, care conine aceste elemente, poate servi ca aliment pentru ele. 8121 8

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Se d numele de aliment, sau poate servi ca aliment orice substan de la care un microorganism dat poate cpta elementele i energia necesar organizrii sale far a mai utiliza cldura solar. Descompunerile produse de microorganisme trebuie s aib loc cu degajare de cldur pentru a le furniza energia de care au nevoie. De obicei, n transformrile microbiene, rmne puin cldur care ridic temperatura mediului. Descompunerile microbiene endoterme nu sunt posibile dect dac alturi se produce un fenomen exoterm, care s dea cldura disponibil. n orice caz, bilanul caloriferic i ansamblul reaciilor trebuie s fie exoterm. Alimentele absorbite de microorganisme sunt utilizate pentru nlocuirea produselor de dezasimilare i pentru formarea de noi substane necesare creterii i dezvoltrii vieii lor. Toate modificrile interne sau externe ale celulelor, reaciile fizico-chimice, funciunile biologice i de reproducere, sunt strns legate de transformrile pe care le sufer alimentele absorbite. Dintre elemente, unele ca protidele, aminoacizi i srurile amoniacale, furnizeaz alimentele azotoase necesare sintezei substanei vii. Altele ca glucidele iau de asemenea parte la formarea protoplasmei i nucleului, dar n primul rnd sunt alimente productoare de energie; prin descompunere, ele pun n libertate cldura necesar reaciilor endoterme. Din aceast cauz aceste alimente s-au numit alimente energetice. Valoarea alimentar a unui element oarecare este reprezentat prin raportul P/ P , n care P este greutatea culturii obinute n mediu complet i P greutatea culturii lipsit de elementul cruia i se determin valoarea alimentar. Cele mai interesante studii au fost fcute cu mucegaiul Aspergillus niger. nceputul acestor studii dateaz de acum 70 ani servind i astzi n introducerea fundamental n fiziologia microorganismelor. Raulin, un elev al lui Pasteur, a alctuit un mediu de cultur format din compui chimici bine definii (acid tartric, zahr i sruri minerale) care s ofere posibilitatea maxim de dezvoltare a acestui microorganism. Mediul lui Raulin cuprinde urmtoarele substane: - Apa - Zahr - Acid tartaric - Nitrat de amoniu - Fosfat de amoniu 1500 cm3 70 g 4g 4g 0.6 g - sulfat de fier - silicat de potasiu 0.07 g 0,07 g 9121 9 - carbonat de magneziu - sulfat de amoniu - sulfat de zinc 0,4 g 0,25 g 0,07 g

- Carbonat de potasiu 0.6 g

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Reacia acestui mediu este acid. Pentru a realiza maximum de dezvoltare a mucegaiului, trebuie ca nsmnarea s se fac n strat subire n condiii aerobe, iar cultura s fie inut la 37C, ntr-o atmosfer umed. Dup 24 ore de la nsmnare, suprafaa lichidului se acoper cu o membran albicioas care se ngroa repede, se ncreete i a patra zi capt la suprafa o culoare neagr, datorit formrii sporilor. Pentru evaluarea greutii recoltei, dup trei zile de la cultivare se culege tot miceliul, se stoarce, se usuc i se cntrete. Dup alte trei zile se procedeaz la fel cu noua recolt care s-a mai format i care este ultima. Cantitatea total de miceliu din cele dou recolte este de 25 g. Alimente minerale Eliminnd pe rnd fiecare element mineral din lichidul Raulin, se poate determina importana pe care o au n dezvoltarea culturilor sau utilitatea lor specific. Utilitatea specific a unui element este raportul dintre greutatea microorganismului i a elementului considerat sau mai bine zis creterea greutii realizate pentru fiecare unitate din greutatea elementului adugat. De exemplu pentru greutatea recoltei de 22.5 g s-au ntrebuinat 0 mg oxid de zinc- utilitatea specific=225000/40=562. Prin suprimarea acidului fosforic, recolta scade la 1/182; a magneziului, la 1/91; a potasiului, la 1/25; a acidului sulfuric, la 1/25, etc. Aceste rezultate sunt identice cu cele ce s-ar obine de la o plant superioar cultivat n condiii experimentale identice. Cu totul altfel se prezint n cazul celorlalte elemente. Dac se suprim zincul, recolta scade la 1/10, iar prin suprimarea fierului la 1/2. Cum se poate explica rolul acestor elemente, care se gsesc n cantiti infinitezimale n mediul de cultur i care totui au o aciune asa de important? Dac se reconstituie mediilor elementele respective de care sunt lipsite, la zinc, recolta revine la normal, pe cnd prin adugarea fierului nu-i mai revine. Raulin a dedus prin urmare c zincul este aliment, n timp ce fierul nu este. Fierul nu poate fi considerat dect un antidot care neutralizez anumite toxine excretate chiar de Aspergillus i care sunt vtmtoare dezvoltrii sale. Dup Javilier, culturile de Aspergillus n mediul lui Raulin, libere de zinc, nu ating, dup 4 zile de dezvoltare, dect 0.37 din greutatea realizat n condiii normale; condiiile continu s apar mai departe. Pe lng aceasta, 60% din zahr, n absena zincului, ramne neutilizat.

10121 10

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Dac se adaug zinc 1/10000000 n raport cu mediul, se ajunge la recolta normal tip, tot zahrul fiind consumat. Zincul favoreaz de asemenea i fixarea siliciului, fierul i manganului de ctre Aspergillus, fiind ns lipsit de efect asupra fixrii magneziului, sulfului i azotului. Chiar el este fixat n ntregime de mucegai, cu condiia s nu depeasc cantitatea de 1/250000 n raport cu mediul. Dup cum unele doze foarte mici de substane minerale sunt indispensabile creterii microorganismelor, tot aa altele devin vtmtoare, chiar n doze extrem de mici. Astfel, suplimatul mpiedic germinarea sporilor n doza de 1/500000, iar azotul de argint n doza de 1/1600000. De asemenea dozele: de zinc 1/25000, de clorur de platin 1/8000, de sublimat 1/51200, de sulfat de cupru 1/2400 i de nitrat de argint 1/1600000 sunt toxice. Sensibilitatea aspergillului fa de srurile de argint este aa de mare nct acesta nu se poate dezvolta sub nici o form n vase din acest metal. Alimente hidrocarbonate Dup modul cum i procur azotul i carbonul, microorganismele au fost mprite n dou grupe: autrotofe i heterotrofe Microorganismele autrotofe fiind dotate cu pigmeni ca i plantele verzi i procur carbonul din bioxid de carbon. Microorganismele heterotrofe, fiind lipsite de clorofil, nu-i pot procura carbonul din atmosfer ci trebuie s-l obin din diferite substane, n special din hidraii de carbon. Este evident necesitatea exigenei unui criteriu dup care unele microorganisme pot prefera un aliment sau altul. Unul din criteriile cele mai des ntlnite este i acela al configuraiei sterice a moleculei organice. Astfel, mucegaiul Penicillium glaucum atac de obicei, din acidul tartric inactiv, enantiomorful dextrogir, lasnd direct pe cel levogir. Acelai lucru l face i Aspergillus niger. De asemenea, din cei doi acizi lactici, Penicillium glaucum prefer enantionul levogir celui dextrogir. 2.4.4 Potenialul de oxido- reducere (O2/CO2) Aciunea oxigenului asupra metabolismului microbian se poate manifesta n trei moduri: - modificarea potenialului de oxido-reducere. Prezena O2 dizolvat indic un potenial redox pozitiv, absena sa ns n medii organice bogate n compui reductori acizi organici, radicali SH (zaharuri reductoare) se traduce prin potenial negativ. - acceptul final al electronilor pentru aerobioza strict i facultativ;

11121 11

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine - ageni ai stresului oxidativ prin intermediul formelor sale active (peroxid sau superoxid); Oxigenul poate fi procurat de microorganisme din aer, din apa cum i din diferite substane care l conin. Rolul principal ns n nutriie i n funciunea celulei microbiene l joac oxigenul din aer i cel din compuii organici. Majoritatea mucegaiurilor sunt aerobe i din acest motiv au nevoie de O2 pentru a crete i pentru reaciile lor metabolice. O lips parial de O2, condiioneaz creterea mucegaiurilor, iar lipsa acestuia duce la moartea acestora. Este cazul lui Penicillium, care poate suporta i condiii extreme. O diminuare a concentraiei n O2 i o cretere a concentraiei de CO2, provoac o scdere a toxicogenezei, mai important dect creterea. n cazul fumonisinei B 1, n condiii de O2 sczut, creterea mucegaiului va fi sczut, consumul de glucoz va fi important i producia de micotoxin va fi nul. 2.4.5 Bacteriile Barrios si col. (1996) au artat c inocularea bacteriilor lactice cu trei zile naintea inoculrii lui Aspergillus parasiticus provoac o diminuare a creterii i produciei de micotoxine. Acest fenomen are un efect de competiie pentru substrat i pH. 2.4.6 Microflora Aziz N.H. si col. (1997a i1997b) au studiat efectul microflorei netoxice a porumbului n producia de aflatoxine de ctre Aspergillus flavus. Au artat c Tricoderma viride inhib creterea mucegaiului i reduce sau anuleaz producia de aflatoxin B1 chiar dac boabele de porumb au fost sau nu sterilizate. Dac inocularea lui Tricoderma viride este ulterioar inoculrii lui Aspergillus, nivelul de aflatoxin B1 se diminuiaz semnificativ. Aceast diminuare atinge cam 31%. Efectul microflorei acioneaz asupra acumulrii toxinelor. n termen ecologic, exist o competiie pentru substraturi: doar sursele foarte competitive i care posed un vast spectru de substraturi metabolizabile se dezvolt. n plus, anumite surse pot degrada micotoxinele. Un efect inhibitor al microflorei spontane a fost de asemenea demonstrat de ONeil K.si col. (1996).

12121 12

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Analiznd producia de trichotecine i zearalenon de Fusarium culmorum pe porumb, ei au artat ca pe boabele sterilizate prin nclzire sau radiaii, cantitatea de micotoxin este superioar fa de cea prezent pe grnele nesterilizate. Aceast diferen apare deoarece n primul caz substratul este lipsit de microorganisme, flora spontan fiind prezent n cel de al doilea caz. Marin si col. (1998) au studiat influena unei flore competitive n creterea i producia de fumonisine de ctre Fusarium moniliforme i Fusarium proliferatum. La o temperatur de 15-25C i o valoare a aw de 0.98, colonizarea mediului de ctre cele 2 specii de Fusarium este mult mai mic dect Aspergillus flavus i Aspergillus ochraceus, dar n acelai timp, producia de fumonisine este stimulat de aceste dou mucegaiuri. 2.4.7 Insectele Insectele intervin indirect n producia de micotoxine, ele fiind vectorii sporilor. n plus, insectele ptrund n zonele interioare ale grnelor prin rnile pe care le produc. Contaminarea dup recoltare a alunelor i porumbului cu Aspergillus flavus este corelat cu un atac al insectele. Acestea pot fi prezente n spaiile de depozitare crend o contaminare important i n consecin constituie o cauz a prezenei micotoxinelor. Rodiquez de Bosque a artat c 2 factori sunt n relaie cu creterea aflatoxinelor n porumb: semnatul trziu i pagubele cauzate de insecte.

13121 13

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

2.5 Descrierea mucegaiurilor cu potenial toxicogen


2.5.1 Principalele genuri de mucegaiuri din industria alimentar Genurile i speciile de mucegaiuri cu inciden n industria alimentar (microbiota util i de alterare), sunt grupate n diviziunile Zygomycota (Zygomycetes), Ascomycota (Ascomycetes) i Deuteromycota (Deteromycetes) (Gueguen, M. 1994). Din diviziunea Zygomyceta, pentru industria alimentar, prezint interes mucegaiurile din ordinul Mucorales: familia Mucoraceae, (genurile: Mucor, Rhizopus i Absidia) i familia Thamnidiaceae (genul Thamnidium). Acestea sunt denumite mucegaiuri inferioare i au thal septat monocelular coenocitic (miceliu neseptat, ramificat aerian i imersat n substrat). Ele sunt uor identificate prin caracterele morfologice ale aparatului reproductor pe cale asexuat, cnd sporii se formeaz n interiorul unui sporange terminal (sporocist) purtat de un sporangiofor (sporangistofor), care poate s se prelungeasc sau nu n interiorul sporangelui cu o columel. Reproducerea pe cale sexuat se realizeaz prin zigospori. Unele specii sunt heterothalice, n timp ce pentru altele stadiul de zigospori este necunoscut. Genul Rhizomucor a fost creat cu puin timp n urm i cuprinde speciile termofile ale genului Mucor (Rhizomucor pusillus) ce prezint stoloni i rhizoizi. Studii efectuate de Kirk (1986) i Cannon (1988) privind nomenclatura genurilor din ordinal Mucorales. Au relevat ca genurile Mucor i Rhizopus nu trebuie considerate ca genuri separate. Dac codul de nomenclatur botanic ar fi fost riguros aplicat genul Mucor ar fi trebuit unit cu Rhizopus, iar anumite specii din genul Rhizopus regrupate n gen Ascophora. Totui, lund n considerare importana economic a mucegaiurilor din cele dou genuri Mucor i Rhizopus, ele continu s fie acceptate n vechea form (Scriban.r,s.a 1993) n diviziunea Ascomycota, sunt incluse mucegaiuri superioare cu miceliu septat care se reproduc pe cale sexuat prin ascospori ce se formeaz n asce nchise n formaiuni specifice numite: Chleistothecium (Ploctomycetes) i Perithecium (Pyrenomycetes-genurile Eurotiul i Byssochlomys). Unele mucegaiuri din aceast diviziune pot prezenta i reproducere asexuat i n acest caz ele se regsesc i n Deuteromycota, dar cu alt denumire.

14121 14

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Deuteromycota include mucegaiurile superioare cu thal septat care se reproduc numai pe cale asexuat, denumite fungi imperfeci. Capacitatea de reproducere pe cale asexuat a fost pierdut n cursul evoluiei acestor mucegaiuri. Sporii formai prin reproducere asexuat se numesc conidiospori (conidii). Diferitele moduri de formare a conidiosporilor sunt utilizate drept criterii de identificare a mucegaiurilor din aceast subdiviziune. Pentru industria alimentar prezint interes mucegaiurile din clasa Hyphomycetes, ce dispun de o diversitate metabolic deosebit. Aici sunt incluse principalele genuri cu aplicaii n procesele biotehnologice, dar i ageni de alterare ai produselor alimentare. 2.5.2 Caracterizarea principalelor specii de mucegaiuri cu potenial toxicogen Intervenia nefast a ciupercilor filamentoase n industria alimentar este ntlnit la mai multe niveluri. Cerealele pot fi contaminate cu mucegaiuri n plin cmp i n timpul depozitrii. Mucegaiurile care se dezvolt pe cmp ca i cele care se dezvolt pe materiale de putrefacie necesit o umiditate ridicat (20-25%) pentru creterea lor (Hesseltine, 1976), n timp ce mucegaiurile de depozitare sunt capabile s creasc pe un strat cu un coninut de umiditate de 10-18% (Lillehoj & Elling, 1983). Speciile cu activitate fitopatogen sunt foarte periculoase pentru producia materiilor prime alimentare brute. Mucegaiurile saprofite contamineaz alimentele i degradeaz din punct de vedere calitativ. Anumite specii sunt toxicogene i elibereaz n aliment micotoxine care reprezint un grav pericol din punct de vedere sanitar.

15121 15

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Tabel 13. Principalele mucegaiuri care se gasesc n diferite alimente Mucegai


Aspergillus Fusarium Penicillium Alternaria Claviceps

Toxina

Produs
preparate din carne Gru, porumb,orz,orez,secar,nuci Fructe i sucuri de fructe,gru,orez,brnz,nuci Fructe,legume i produse derivate,mere i roii Gru,secara i orez

Aflatoxina, sterigmatocistina ochratoxina A Porumb,arahide,orez,fasole,lapte Fusarine,Moniliformine, Tricotecine,Zearalenona,Fumonisine Patulina,citrinina,ochratoxina A Alternariol,Acid tenuazonic Ergot

Toxicogeneza cum s-ar numi condiiile de sintez i elaborare a micotoxinelor, este un fenomen de mare complexitate. Condiiile optime de toxicogenez depind de o combinaie de factori: temperatura, umiditatea i nivelul de oxigenare a substratului. Expresia specie toxicogen poate fi interpretat n funcie de mecanismul care d natere apariiei toxinelor: - fie substana este un metabolit secundar, propiu sursei fungice considerate, este cazul majoritii micotoxinelor secretate de ciuperci n timpul depozitrii produselor alimentare. Rezult astfel o mare diversitate de familii chimice: derivaii ai acizilor aminici: acidul aspergilic, roquefortine i derivai ai terpenelor: DON, tricotecine; - fie mucegaiul poate transforma un substrat netoxic ntr-un produs toxic prin bioconversie; este cazul acidului cumaric prezent n cantitai mici n sulfin, care poate fi transformat n dicumarol, un puternic anticoagulant pentru diferite mucegaiuri; - fie mucegaiul parazit poate provoac o deviaie a metabolismului normal al plantei, consecin a formrii produilor toxici care nu exist n plantele sntoase.

2.5.2.1 Aspergillus flavus 16121 16

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Caractere coloniale Colonia pe mediul solid se dezvolt rapid, 50-70 mm este plan, dens, catifelat, de culoare, alb-glbuie; la maturitate, odat cu dezvoltarea uniform a conidioforilor, culoarea devine galben-verzui spre galben brun. Reversul coloniei se coloreaz n galben spre brun. Aspect microscopic Conidioforii sunt lungi, cu nlimi cuprinse ntre 400-1000 m i diametrul de 3-13 m, pereii sunt groi, cu aspect rugos incolori. Vezicula are form alungit la nceput, apoi capt form sferic cu diametrul de 20-40 m i este fertil pe din suprafa. Pe vezicul se pot dezvolta direct fialide, fie metule cu fialide egale n dimensiuni. Fialidele, aranjate ntr-un singur strat msoar (10-15)x(3-5) m; cele aranjate n straturi duble au nlimi egale, de 7-10 m i cu diametrul de 3-4 m pentru cele secundare. Rspndire i rol Este rspndit n natur i poate fi izolat de pe semine de porumb, orz, alune, orez, cartofi, mazre, mere, finuri, lapte praf. Aspergillus flavus are o afinitate deosebit pentru alune i semine oleaginoase. n condiii necorespunztoare de pstrare, ca urmare a contaminrii nainte de recoltare, se poate produce mucegirea masiv a boabelor de porumb, alune, semine oleaginoase cu importante pierderi economice. Aspergillus flavus crete ntr-un domeniu larg de temperatur (12-48C). Valoarea minim de a w 0.78 la 33C, valoarea optim de pH = 7.5. Conidiosporii au rezisten termic redus cu D60 = 1 minut. Poate produce micotoxine cu denumirea generic de aflatoxine.

17121 17

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine 2.5.2.2 Aspergillus nidulans Caractere coloniale Colonia este catifelat de culoare verde-verde nchis cu formare n centru de peritheci de culoare alb- glbui. Reversul coloniei apare de culoare rou purpuriu. Aspect microscopic Conodioforii sunt sinuoi de culoare brun, cu lungime 6-100 m i diametrul 2.5-3 m, capul conidial este columnar, cu dimensiuni (40-80)x(25-30) m. Vezicula este semisferic, cu diametrul de 8-10m. Fialidele biseriate se dezvolt n partea superioar a veziculei. Fialidele primare ca i cele secundare sunt scurte i au dimensiunile (5-6)x(2-3) m. Fialosporii sunt globoi, cu suprafaa rugoas i dimetrul 3-3.5 m. La maturitate, prin dezintegrare se formeaz asci, cu cte opt ascospori lenticulari, cu perei netezi, cu dou inele situate central, de culoare roie i dimensiuni 3.5-4.5 m. Rspndire i rol Se ntlnesc n sol, resturi vegetale, diferite semine depozitate, pe pine. Poate elabora toxina sterigmatocystina (nidulina).

18121 18

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine 4.2.2 Aspergillus versicolor

Caractere coloniale Colonia se dezvolt lent i are un aspect compact, catifelat. Zona central a coloniei este mai nalt i poate prezenta la margini striaiuni radiale. La maturitate, colonia prezint o culoare glbui-verde ca mazrea i o bordur alb ngust, revers se coloreaz n galben portocaliu spre rou.

Aspect microscopic Capul conidial este semisferic, radial cu diametrul 100-200 m. Conidioforii sunt relativ lungi, cu dimensiuni (500-600)x(4-8) m, sunt netezi, incolori, iar la maturitate se coloreaz n glbui. Vezicula este semisferic sau elipsoidal, fertile pe 1/2 sau 2/3 din suprafa i are diametrul cuprins ntre 12-20 m. Fialidele sunt biseriate aproximativ egale, cele primare au dimensiuni cuprinse ntre (7-10)x(3-4) m, iar cele secundare au dimensiuni de (5-10)x(2-2.5) m. Fialosporii sunt globoi cu suprafaa fin rugoas i cu dimensiuni de 3.5-5 m.

Rspndire i rol Este ntalnit n sol, pe resturi vegetale n descompunere, cereale, finuri, furaje, semine oleaginoase, produse insilozate, produce micotoxina sterigmatocystina cu efect hepatotoxic.

19121 19

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

4.2.3

Aspergillus candidus

Caractere coloniale Formeaz colonii catifelat-psloase de culoare alb-albastru-cenuiu spre verde i nlime de 3 mm. Colonia prezint circumferine radiale i margine alb cu revers incolor, brun la maturitate.

Aspect microbiologic Conidioforii au nlime de 1.3 mm, diametrul 20-30 m, sunt netezi i hialini. La captul superior prezint o vezicul clavat alungit ( ca o mciuca) cu dimensiunea (200300)x(40-60) m. Fialidele uniseriate, care acoper toat suprafaa veziculei msoar (2.53.5)x(2-3) m, cu dimensiuni mai mari la baza i apexul veziculei fialosporii sunt elipsoidali netezi, cu dimensiuni (2.5-3)x(3.5-4.5) m.

Rspndire i rol Este o specie ntlnit n sol, pe pri ale plantelor n stadiul de putrezire. A fost izolat de pe diverse semine (porumb germinat, carne, fructe). Poate produce micotoxina patulina.

4.2.5 Aspergillus ochraceus 20121 20

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Caractere coloniale Colonia are diametrul de 3-5 cm, prezint zone concentrice i exudate. Are culoare galben-portocalie spre rou, aspect granulat. Aspect microscopic Conidioforii cu lungimi variabile i diametrul de pn la 10m, au suprafaa fin rugoas i sunt colorai n galben. Capul conidial este de form sferic i la maturitate se separ n dou sau mai multe grupri compacte. Vezicula este globoas sau elipsoidal, fertile pe ntreaga suprafa. Fialidele sunt biseriate: fialidele primare cu lungimi variabile cuprinse ntre 15-30 m, iar cele secundare au dimensiuni ntre (7-10)x(1.5-2.5) m. Fialosporii sunt sferici, elipsoidali, cu suprafaa alb rugoas i diametrul ntre 3.5-5 m. Produce rar scleroi ovali, de culoare galben -brun.

Rspndire i rol Este frecvent ntalnit n sol, pe resturi vegetale, boabe de orez, porumb, semine oleaginoase, furaje, produse alimentare. n condiii de facultativ anaerobioza la fermentarea boabelor de cafea este responsabil pentru formarea unui miros plcut. Dintre micotoxinele elaborate n condiii favorabile de sporulare fac parte: ochratoxina, aflatoxine i acidul penicilic. Prin consum de produse mucegite se produce hepatotoxicoze la animale.

21121 21

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

4.2.6

Aspergillus tereus

Caractere coloniale Colonia apare cu perimetru circular, aspect catifelat i uneori prezint zone radiale. Culoarea coloniei variaz, de la centru spre periferie, de la cafeniu-brun la bej, reversul este glbui spre brun. Uneori elaboreaz un exudat de culoare portocalie. Aspect microscopic Conidioforii sunt scuri, drepi sau curbai cu lungimi egale i dimensiuni ntre (100-250)x(4.5-5.5) m, incolori, cu perei netezi capul conidial, este columnar, lung pn la 500 m i diametrul 10-16 m. Fialidele sunt biseriate i se dezvolt pe 1/2 max 2/3 din suprafaa veziculei. Fialidele primare au dimensiuni cuprinse ntre (5-7.2)x(2-2.5) m, iar cele secundare (5.5-7.50)x(1.5-2) m. Fialosporii sunt de form globoas, cu suprafaa neted, diametrul cuprins ntre (1.8-3.5) m dispui n lanuri lungi. Rspndire i rol Poate fi izolat de pe furaje, semine, cereale depozitate. Este termofil i are viteza rapid de cretere chiar la 37C, fiind frecvent ntlnit n zona tropical i temperat. Poate produce acizi organici: succinic, oxalic, enzime proteolitice. Are potenial toxicogen produce micotoxine: citrinina i patulina.

22121 22

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

4.2.7

Aspergillus fumigatus

Caractere coloniale Pe Agar Czaper-Dox, dup incubare de 7 zile la 25C, coloniile au dimensiuni de circa 4-5 cm, culoare albastr-verzui i aspect pulverulent datorit sporulrii intense. Aspect microscopic La stereolup, se disting destul de facil capetele aspergilare cu aspect columnar. Hifele sunt septate i dau natere unor conidiofori a cror extremite distal se termin printr-o vezicul cu aspect clavat, de 20-30 m diametru. Vezicula este tapetat n jumtatea superioar cu un singur rnd de celule de culoare verzuie, cu dimensiuni de (6-8)x(2-3) m - fialidele, care vor genera lanurile de conidii. Conidiile au form sferic sau subsferic, aspect verucos i diametru 2.5-3 m. Rspndire i rol Aspergillus fumigatus este un fung filamentos ubicuitar, saprobiot n sol, unde joac un rol important n reciclarea carbonului i azotului din resturile vegetale. Fiind un fung contaminant, el se izoleaz destul de frecvent din aerul ambiant, din ap i de pe diverse suprafee, inclusiv din clinici i spitale. Din prelevatele clinice, izolarea sa este destul de facil, prin utilizarea mediilor uzuale de cultivare.

23121 23

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

4.2.8 Fusarium graminearum

Caractere morfologice Colonia dezvoltat pe mediu selectiv are un aspect pslos, dens i se extinde rapid n plac. Culoarea este roz-cenuiu spre auriu-brun. Reversul este colorat n portocaliu-brun cu nuane mai deschise spre margine.

Aspect microscopic n preparat microscopic se pot observa: macroconidii- se formeaz pe conidiofori simpli sau ramificai de obicei n mnunchi, care au form falcat sau fusiform, cu 5 septuri, cu dimensiuni ce variaz ntre (30-62)x(3.04.5)m. Nu formeaz microconidii. chlamidosporii- sunt mono sau pluricelulari, de obicei globoi, care se formeaz intercalar, de-a lungul hifelor sau la nivelul macroconidiilor, sunt netezi sau rugoi, hialini sau de culoare brun-pal, cu dimensiuni de (10-12)m. Rspndire i rol Se dezvolt optim la 24-26C, pH 6.7-7.2. Este rspndit n natur i este fitopatogen al gramineelor (putrezirea n coroan la plante de gru i porumb). Poate s paraziteze i alte plante (mazre, cartofi, banane). Poate elabora micotoxine de tipul scirpene (zearalenone) prin ingerarea produselor mucegite se pot produce gastroenterotoxicoze la porcine ovine i cai.

24121 24

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

4.2.9 Penicillium expansum

Caractere coloniale Formeaz colonii cu diametrul de 30-40 mm de culoare verde-albstrui cu aspect catifelat. n zona central si cea marginal, colonia are aspect floconos. Formeaz n timp inele circadiene, n care, sunt zone cu miceliu nalt care alterneaz cu zone cu miceliu scund. Reversul este colorat n brun -nchis sau portocaliu-brun. Produce exudat incolor sau brun portocaliu foarte deschis i un pigment solubil portocaliu-brun.

Aspect microscopic Conidioforii au perei netezi, cu lungimi de 200-500m i poart penicili terverticilai. Prezint fialide fie cu form de fiol, fie cu form cilindric, cu dimensiuni de (8-ll)x (2-2.5)m. Formeaz conidii elipsoidale cu perei netezi cu dimensiuni de (3-4)x(2.53.5)m. Rspndire i rol Este un mucegai psihrofil (poate crete la 6C, crete viguros la 0C). Se dezvolt optim la 28C. Temperatura maxim de dezvoltare este de 35C. Necesit pentru germinare un aw de 0.82-0.83. Nu necesit prezena unor cantiti mari de O2 pentru a se dezvolta. Este prezentat n mod frecvent la mere i pere la care produce putrezirea brun. A fost izolat i de pe cpuni i tomate. Apare pe cereale mai puin frecvent dect alte specii ale genului. Foarte rspndit pe alimente cum sunt carnea i produsele din carne. Produce micotoxine de tipul patulinei i citrininei.

25121 25

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

4.2.10 Trichotecium roseum Caractere coloniale Formeaz colonii cu diametrul de 50-60 mm, pufoase, cu miceliu colorat n roz, roz portocaliu. Reversul este colorat similar, mai puin intens sau cu nuane de brun.

Aspect microscopic Prezint conidiofori lungi, neramificati septai care poart la capt conidii ce se formeaz una peste alta i sunt dispuse de o parte i de alta a conidioforului formnd lanuri n V. Conidiile au forma elipsoidal pn la pirinform, prezint un singur sept transversal, au perei subiri, netezi i dimensiuni de (16-20)x(8-12) m. Prima conidie format rmne vertical n timp ce celelalte, care se formeaz sub ea, sunt nclinate alternativ spre dreapta i spre stnga.

Rspndire i rol Se dezvolt n intervalul de temperatur cuprins ntre 15-35C, cu un optim la 25C i pn la o valoare a aw de 0.9. Este foarte rspndit n natur, n special pe lemnul care putrezete. A fost izolat de pe cereale diverse specii de alune, fasole si carne, dar nu este considerat agent de alterare a produselor alimentare. A fost deasemenea izolat de pe pereii pivnielor. Produce micotoxina denumit tricotecin.

26121 26

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

CAPITOLUL 3
Metode de limitare i reducere a coninutului n micotoxine a unor produse alimentare de origine vegetala
Prezena micotoxinelor, pune o problem de securitate sanitar a alimentelor. Punerea la punct a tratamentelor industriale pentru decontaminarea i detoxifierea produselor alimentare contaminate a devenit un obiectiv major pentru securitatea sanitar a alimentelor. naintea folosirii procedeelor decontaminare, modul de strategie const n observarea practicilor care permit limitarea contaminanilor. Stpnirea etapelor nainte de recoltare, n timpul recoltrii i n timpul depozitrii permite prevenirea contaminrii, factorii de mediu fiind determinai pentru a preveni contaminarea cu mucegaiuri i micotoxinelor lor. 3.1 Strategii preventive: limitarea contaminanilor

Punerea la punct a unui plan de control i analiza a punctelor critice (HACCP-Hazard Analysis Critical Control Point). Sistemul HACCP, o metod pentru protecia igienicob - sanitar a alimentelor, este unul dintre diferitele procedee propuse pentru a garanta producere igienico- sanitar a alimentelor care a ntrunit sufragiile majoriti organismelor internaionale n domeniu. Sistemul HACCP face posibil prevenirea contaminrilor i/sau reducerea la un nivel acceptabil a potenialelor riscuri inerente procesului productive sau produsului finit. Este greit s se considere c sistemul HACCP reprezint o metod care determin eliminarea n totalitate a riscurilor pentru obinerea de alimente sigure; sistemul HACCP accept i posibilitatea de a reduce riscurile la un nivel acceptabil. Acest aspect reprezint o noutate introdus de sistemul HACCP, care oblig la o respectare riguroas a principiilor preventive coninute de el; nerespectarea acestor principii n oricare dintre fazele procesului de producie pune n pericol ntreg sistemul. 27121 27

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Principiile sistemului HACCP sunt eseniale. n 1993, Comisia Codex Alimentarius i apoi OMS (Organizaia Mondial a Sntaii) n 1995, au pus bazele teoretice ale controlului prin intermediul sistemului HACCP, enunnd urmtoarele principii: Identificarea riscurilor asociate cu producerea alimentelor n toate fazele fluxului tehnologic, evaluarea lor comparativ i a nocivitii fa de consummator, descriind i msurile de control sau de prevenire; Identificarea pe fluxul tehnologic a punctelor critice de control care, meninute sub Stabilirea limitelor critice care nu trebuie depite pentru a ne asigura c punctul critic Proiectarea de eventuale aciuni corective, n cazul n care monitorizarea indic faptul Proiectarea procedurilor pentru a verifica dac ntreg sistemul HACCP ndeplinete Documentarea tuturor procedurilor adoptatea pentru realizarea planului HACCP. Aplicarea sistemului HACCP presupune parcurgerea logic a 12 etape specifice unui plan de lucru HACCP, caracteristic pentru fiecare proces i/sau produs analizat: definirea scopului; constituirea i organizarea echipei HACCP; descrierea produsului i identificarea utilizrii intenionate; elaborarea diagramei de flux tehnologic; identificarea pericolelor poteniale; evaluarea riscurilor poteniale; determinarea punctelor critice de control; stabilirea limitelor critice; stabilirea sistemului de monitorizare; stabilirea aciunilor corective; stabilirea procedurilor de verificare; stabilirea documentaiei i a nregistrrilor. Demersul este bazat pe dezvoltarea unei strategii de prevenire, de control, de bune practice industriale i control al calitii la toate etapele produciei. Presupune punerea n eviden a 28121 28 control, sunt n msur s previn, s elimine sau s reduc pn la limite acceptabile riscul; este sub control; c un anumit punct critic de control nu mai este sub control; obiectivele fixate;

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine punctelor de risc, ca i a punctelor critice, punerea la punct a soluiilor finale de lupt, ca i dezvoltarea metodelor de verificare. Ropkins i Beck (2003) au propus un plan HACCP pentru limitarea contaminrii cu compui organici a produselor alimentare n timpul perioadei de depozitare, transformare i distribuie. Procedurile operaionale standard sunt definite i trebuie respectate n fiecare etap. Pentru a asigura calitii sanitare n timpul depozitrii, trebuie ca spaiile de depozitare s fie dotate cu instalaii conforme i proprii. Contaminarea extern prin aer i ap, trebuie s fie supravegheat. Din practicile care trebuie respectare pentru limitarea contaminrii alimentelor amintim: curarea echipamentelor, o bun igien personal i purtarea mbrcmintei de securitate. Pentru fiecare produs, echipa HACCP trebuie s studieze dac micotoxinele care constituie un pericol pentru sntate sunt susceptibile de a fi prezente i dac da, care sunt acelea. Eliminarea complet a micotoxinelor din alimente contaminate nu se poate realiza la ora actual, obiectivul fiind acela de a reduce la minim apariia acestor toxine prin bune practice agricole. Principiile pentru prevenirea i reducerea micotoxinelor difer n funcie de cultur, climat i practice agricole locale. Este important ca productorii s considere c bunele practice agricole (BPA) reprezint primul mod de a lupta mpotriva contaminrii cerealelor cu micotoxine, apoi aplicarea bunelor practice de fabricaie (BPF), depozitarea, transformarea i distribuia cerealelor destinate alimentaiei umane i animale. Elaborarea codurilor de folosire naionale fondate pe principii generale i reducerea codurilor specifice pentru anumite specii de cereale va ameliora aplicabilitatea acestor principii, n particular pentru culture ca porumbul. Aceste principii descriu factorii care favorizeaz infectarea, dezvoltarea i producia de toxine n culture cerealiere la nivelul expoatrii ca i metodele de lupt mpotriva acestor toxine. Trebuie subliniat c strategia trebuie aplicat att n timpul semnrii, ct i n timpul recoltrii i dup recoltare, dar va depinde de cultura, condiiile climatice i va trebui s se in cont de specificitatea local a culturilor i modul de producie n vigoare n fiecare ar sau regiune. n consecin, toate interveniile n lanul de aprovizionare vor trebui aplicate, la intervale regulate, evaluarea riscurilor, luarea msurilor pentru prevenirea sau reducerea la minimum a contaminrii cu mucegaiuri fiind de asemenea obligatorie. Aceste evaluri care in cont de tipul de cultur considerat (gru, porumb, etc.), se arat a fi foarte utile.

29121 29

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Calea de transmitere a infeciei i dinamica formrii toxinelor difer de la o cultur la alta i sunt influenate de factori agricoli. Sistemele de cultur n care este inclus porumbul n rotaie prezint un risc ridicat. Grul i alte cereale produse n acelai sistem de cultur n rotaie sau n apropierea acestuia trebuie s fac de asemenea obiectul unei gestionri i a unei inspecii riguroase. Contaminarea cerealelor cu mucegaiuri se datoreaz aciunii mai multor factori. Bunele practice nu permit controlarea tuturor factorilor, de exemplu, condiiile climatice. Parametrii agroclimatici care favorizeaz producia de micotoxine sunt: incidena infeciei cu fungi potenial toxigeni a porumbului (procente); severitatea contaminrii cu aflatoxina Bl (ng/g); media temperaturii minime din august; media umiditii maxime din iulie; numrul sptmnilor din timpul perioadei de vegetaie n care media temperaturii media temperaturii maxime din iulie; media umiditii minime din iulie; numrul de sptmni din timpul perioadei de vegetaie n care media sptmnala a variabila compensatorie indicnd localitile cu 0-5 sptmni n care temperatura variabila compensatorie indicnd localitatea cu 11-15 sptmni n care temperatura constanta funciei lineare; numrul de sptmni din timpul perioadei de vegetaie n care media sptmnal a numrul de sptmni din timpul perioadei de vegetaie n care media sptmnal a numrul de sptmni din timpul perioadei de vegetaie n care media sptmnal a numrul de sptmni din timpul perioadei de vegetaie n care media sptmnal a

maxime sptmnale a depit 32C;

umiditii maxime a depit 90%; sptmnala maxima a depit 32C; sptmnala maxima a depit 32C;

umiditii maxime a depit 90%; temperaturii maxime a depit 38C; temperaturii minime a depit 21C; umiditii minime a depit 55 %.

30121 30

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine n plus, nu toi factorii au aceeai importan i aceti factori diferii pot de asemenea antrena o contaminare cu micotoxine. n consecin, este important s se adopte o strategie integrat innd cont de toi factorii de risc. n particular, trebuie s se evite acumularea diferiilor factori de risc n funcie de interaciunile lor posibile. Este de asemenea primordial s se in cont de rezultatele obinute n anii precedeni n materie de prevenire i formare a mucegaiuri lor i micotoxinelor pentru ai exploata n vederea definirii msurilor care trebuie luate pentru a preveni formarea micotoxinelor n urmtorii ani. Principiile prezentate mai sus duc la principalii factori de care trebuie s se in cont n lupta mpotriva contaminrii cu micotoxine n cmp; rotirea culturilor, gestionarea solului, alegerea speciile sau hibrizilor i folosirea adecvat a fungicidelor. n ceea ce privete gestionarea riscurilor, legat de contaminarea cu micotoxine, aplicarea bunelor practici agricole, descrise de un comitet de experi FAO/WHO n 2000, poate permite limitarea pe ct posibil contaminarea cu micotoxine.

3.1.1 Practici recomandate naintea recoltrii ROTIREA CULTURILOR Rotirea culturilor constituie n general un mod eficace de a reduce riscul contaminrii n funcie de sursaa fungic i specia cultivat. Este foarte eficient pentru a reduce contaminarea cerealelor de iarna n particular. Culturile care nu sunt contaminate de specii de Fusarium, care afecteaz n general cerealele, precum cartofii, trifoiul, lucerna sau alte legume, trebuie s fie cultivate prin rotaie pentru a reduce contaminarea cmpului. Cerealele cu bobul mic, cum ar fi grul, trebuie s fie semnate numai dup o evaluare a riscurilor de infecie cu mucegaiuri. Interaciunea semnificativ descoperit ntre cultura precedent i gestionarea solului a pus n eviden importana rmielor de la cultura gazd n ciclul vieii patogenilor. S-a constat c, coninutul n desoxinivalenol este mult mai mare n cazul cultivrii grului dup o cultur contaminat cu ssp de Fusarium, dect porumbul sau alte cereale.

31121 31

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine ALEGEREA SPECIILOR SAU A HIBRIZILOR Se recomand s se aleag hibrizi sau specii mai bine adaptate la natura solului, sau la condiiile climatice i la practicile agricole uzuale. Acest lucru reduce stresul vegetalelor i va proteja mai mult cultura mpotriva unei infecii fungice. Se recomand s se foloseasc, cnd exist, specii de semine selecionate pentru rezistena la mucegaiuri sau insecte parazite. Alegerea speciilor pentru rezistena lor la infestarea cu mucegaiuri se face innd cont i de riscul infestrii. PLANIFICAREA CULTURILOR Pe ct este posibil, culturile trebuie s fie planificate pentru a evita condiiile climatice care prelungesc coacerea n cmp nainte de recoltare. Uscarea trebuie de asemenea considerat ca fiind un factor de risc n cazul contaminrii cu mucegaiuri. Trebuie s se evite plantarea apropiat a plantelor. Din acest motiv se recomand respectarea spaiilor ntre rnduri i ntre plante. Informaia referitoare la aceste spaii poate fi furnizat de productorii de semine. GESTIONAREA SOLULUI I A CULTURILOR La cultivare, trebuie s se in cont de riscurile eroziunii i de buna gestionare a solului. Toate practicile agricole distrug sau ascund reziduurile culturilor infectate, aratul permind dup toate aparenele reducerea contaminrii culturii urmtoare cu mucegaiuri. Pmntul trebuie semnat astfel nct s se lase o suprafa de semnat rugoas, o zon de semnat grosier, pentru a favoriza infiltrarea apei i reducerea la minimum a riscului de eroziune a solului i nutrienilor si. Se recomand pe ct posibil pregtirea suprafeelor destinate semanrii prin arare, nlturarea speciilor rmase pe cmp de la cultura precedent, precum i nlturarea tijelor i a altor rmie vegetale care pot servi ca substrat pentru dezvoltarea mucegaiurilor productoare de micotoxine. n zonele care sunt expuse eroziunii, practicile de lucru pot fi cuplate cu cele de conservare. O atenie deosebit trebuie acordat gestionrii reziduurilor recoltei susceptibile de a favoriza contaminarea culturii urmtoare cu mucegaiuri; aceste reziduuri trebuie s fie sfrmate ct de fin posibil i ncorporate n sol astfel nct s se faciliteze descompunerea lor. Trebuie s se evite pe ct posibil stresul plantelor. Exist numeroi factori de stres: seceta, frigul, carenele n nutrieni i reaciile nedorite ntre materialele folosite pentru cultur. 32121 32

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Referitor la msurile luate pentru a evita stresul plantelor, de exemplu irigaiiile, trebuie s se reduc la minim riscul ulterior de infestare fungic prin evitarea irigrii prin stropire n timpul dezvoltrii organelor florale. Irigarea este o metod valabil pentru reducerea stresului cauzat plantelor n anumite condiii de cretere. Un aport optim de nutrieni este esenial pentru a evita o slbiciune" a plantei, susceptibil favorizrii unei infestri cu mucegaiuri. Trebuie s se asigure un aport n nutrieni specifici plantei. Tratamentele seminelor cu fungicide sunt eficace mpotriva numeroaselor tipuri de semine. Este recomandat s se aplice msuri de prevenire, pe ct posibil, pentru a reduce la minimum infestrile fungice i pagubele cauzate de insecte i s se foloseasc, dac e nevoie, insecticide i fungicide agreate si omologate pentru lupta mpotriva mucegaiurilor. Dac este inoportun folosirea pesticidelor, cum este cazul agriculturii biologice, trebuie s se fac apel la practici adecvate. Trebuie subliniat c aplicarea fungicidelor n timp util este crucial pentru lupta mpotriva infestrilor fungice. Aceste tratamente trebuie s se bazeze pe informaii meteorologice i/sau anchete asupra recoltelor. Infestarea se deruleaz de obicei n timpul nfloririi, ceea ce nseamn c micotoxinele pot fi produse. Dac o infestare fungic este descoperit ulterior n cultur, trebuie s se in cont de manipularea produselor, de amestecarea i folosirea cerealelor. Specii de mucegaiuri cu potenial toxicogen au fost izolate pe un numr mare de ierburi i specii de ierburi cu frunzele late. S-a artat c o densitate ridicat de ierburi implic o infestare mare cu mucegaiuri. Ierburile prezente n culturi trebuie s fie combtute prin mijloace mecanice sau prin ierbicide omologate sau alte practici de nlturare. S-a stabilit c culcarea la pmnt" a plantelor are un efect semnificativ asupra cantitii de micotoxine n cereale. n consecin, plantele culcate la pamnt trebuie evitate n timpul recoltrii, n special daca ele sunt umede i prezint primele semne ale germinrii. Pentru a evita culcarea la pmnt" a culturilor, se recomand folosirea judicioas a ngrsmintelor i aplicarea regulatorilor de cretere. Trebuie s se evite scurtarea excesiv a tijelor.

3.1.2 Practici recomandate n timpul recoltrii Evaluarea calitii cerealelor naintea recoltrii, innd cont de limitele unei eantionri reprezentative i o analiz rapid pe teren. Separarea, dac este posibil, a cerealelor pe baza

33121 33

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine exigenelor calitii pieei - de exemplu - pentru producia de pine sau hran pentru animale i calitatea culturii vechi - umed, curat sau uscat. Recoltarea s se fac pe ct posibil atunci cnd coninutul de ap al plantei s fie adecvat. ntrzierea recoltrii cerealelor deja contaminate cu mucegaiuri poate provoca o cretere sensibil a coninutului de micotoxine n cultur. Trebuie s se in cont de posibilitatea uscrii n cazul n care cultura nu poate fi recoltat n condiii optime de coninut de ap. nainte de recoltare trebuie s se verifice dac echipamentul care va fi folosit la recoltare i depozitare este n stare bun. O defeciune n aceast perioad critic poate duna calitii cerealelor i favoriza formarea micotoxinelor. Trebuie de asemenea verificat i etalonat echipamentul necesar pentru msurarea coninutului de ap. Trebuie s se evite pe ct posibil sfrmarea mecanic a cerealelor i contactul cu solul n timpul recoltrii. Cerealele cu boabe zbrcite i mici pot prezenta mai multe micotoxine dect cele cu dimensiune normal. Este posibil reducerea coninutului de micotoxine prin eliminarea boabelor zbrcite prin reglare corect a combinei sau printr-o triere post- recoltare pentru a elimina boabele stricate i alte particule strine. 3.1.3 Practici recomandate privind uscarea cerealelor Trebuie s se determine coninutul de ap al culturii naintea recoltrii sau imediat dup recoltare. Eantioanele prelevate n acest scop trebuie s fie ct mai reprezentative. Se recomand pe ct posibil uscarea cerealelor pentru a atinge coninutul de ap recomandat pentru depozitare. n cazul cerealelor umede care trebuie s fie uscate, se va reduce la minimum perioada cuprins ntre recoltare i uscare. n consecin, va trebui, n anumite cazuri, s se planifice recoltarea n funcie de capacitatea de uscare. Cerealele trebuie s fie uscate astfel nct coninutul n ap s fie inferior celui care va permite dezvoltarea mucegaiurilor n timpul depozitarii. O activitate a apei inferioar valorii de 0,65 corespunde n general unui coninut n ap mai mic de 15%. Trebuie s se stabileasc valori precise ale coninutului de ap, innd cont de condiiile locale de depozitare. Este o necesitate pentru prevenirea dezvoltrii unui anumit numr de specii fungice care se pot gsi n cereale naintea uscrii. Dac cerealele umede trebuie s fie depozitate far s fie uscate, mucegaiurile se vor dezvolta n cteva zile i vor provoca renclzirea lor. Cerealele trebuie s fie uscate astfel nct s se reduc la minimum pagubele cauzate de dezvoltarea mucegaiurilor. Aerarea cerealelor umede poate evita supranclzirea naintea 34121 34

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine uscrii. Evitarea pe ct posibil a amestecrii loturilor de cereale care prezint riscuri diferite de contaminare. Pentru a reduce variaia coninutului de ap n lot, cerealele se pot transfera n alt instalaie sau n alt depozit dup uscare.

3.1.4 Practici recomandate la depozitarea cerealelor Pentru mrfurile ambalate trebuie s se asigure c sacii sunt curai i uscai i sunt aezai pe palei sau au intercalat ntre ei un strat impermeabil. Aerarea pe ct posibil a cerealelor, prin trecerea circular a aerului n zone de depozitare pentru a menine o temperatur apropiat i uniforma n toate aceste zone. Controlul regulat al coninutului de ap i temperatura cerealelor depozitate n timpul depozitrii este necesar. Un miros neplcut poate arta c boabele sunt ncinse, n cazul n care locul depozitrii este nchis, lipsit de ventilaie. Msurarea temperaturii cerealelor depozitate la intervale determinate n timpul depozitarii. O cretere a temperaturii poate indica o dezvoltare microbiana i/sau o infestare cu insecte. Separarea prilor aparent infestate i prelevarea de eantioane pentru analiz. Scderea temperaturii cerealelor rmase i aerarea este o metod eficient pentru a mpiedica dezvoltarea mucegaiurilor. Evitarea folosirii cerealelor contaminate pentru producia de alimente destinate consumului uman i animal. Folosirea metodelor de ntreinere dupa reducerea la minimum a prezenei insectelor i formarea mucegaiurilor n depozite. Folosirea insecticidelor i fungicidelor agreate sau altor metode adaptate. Alegerea produselor chimice care nu influeneaz calitatea cerealelor i folosirea acestora n cantiti prescrise. Folosirea unui agent de conservare agreat (de exemplu acizi organici - acidul propionic) poate avea efecte benefice pentru cerealele destinate alimentaiei animale. Acidul propionic i srurile sale sunt fungistatice i sunt uneori folosite pentru conservarea cerealelor recoltate umede, evitnd pe ct posibil incingerea sau mucegirea naintea aplicrii tratamentului. Aceste produse trebuie s fie aplicate rapid cu ajutorul echipamentelor adecvate astfel nct s se obin o repartiie uniform n tot lotul tratat. Daca cerealele sunt tratate dup o perioad de depozitare umed, prezena agentului de conservare nu constituie o garanie a necontaminrii. 3.1.5 Practici recomandate n timpul transportului produselor 35121 35

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Mainile destinate transportului cerealelor trebuie s fie uscate i lipsite de mucegaiuri vizibile, insecte i alte materiale contaminate. Dac este necesar, trebuie s se curee i dezinfecteze nainte i dup folosire, fiind adaptate destinaiei prevzute. Folosirea fumigatelor i ierbicidelor omologate poate fi util. Se vor proteja cerealele, n timpul transportului, de umezeal. Se vor evita fluctuaiile de temperatur i interveniile care ar putea provoca o condensare a suprafeei cerealelor, ceea ce va conduce la o cretere localizata a nivelului umiditii care va favoriza dezvoltarea mucegaiurilor i formarea micotoxinelor.

3.1.6 Evitarea ptrunderii insectelor, pasrilor si roztoarelor n timpul transportului. Totui, aplicarea practicilor agricole nu este suficient pentru a mpiedica contaminarea. Strategiile de decontaminare sunt dezvoltate pentru a face fa acestei probleme.

3.2. Strategii curative: decontaminarea Jemmali (1979) i Park si col. (1988) au propus criterii specifice pentru validarea procedurilor de decontaminare a micotoxinelor n produsele alimentare. Pentru a fi considerat eficace, acest procedeu trebuie s rspund urmtoarelor exigente: o o o o o o o trebuie s inactiveze, distrug sau s elimine toxina; nu trebuie s genereze sau s lase reziduuri toxice n produs; trebuie s menin calitile nutritive ale alimentului; trebuie s fie acceptabil pentru alimentaia uman i animal; nu trebuie s modifice n mod semnificativ proprietile tehnologice ale produsului; trebuie s distrug dac este posibil sporii i mucegaiurile; O alt strategie const n limitarea efectelor toxice ale micotoxinelor prin ingerarea de ageni chelai ai toxinei ca aluminosilicaii de sodiu sau calciu hidratai, sau cu ajutorul aditivilor alimentari (vitamine, aspartam, melatonine, piroxicam sau acid lactic i acid ascorbis), contribuind la protecia parial a organismului fa de toxicitatea micotoxinelor.

3.2.1. Metode fizice 36121 36

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Metodele fizice pot fi clasificate n dou categorii: metode care conduc la eliminarea fraciunilor alterate; metode care produc denaturarea toxinelor. Rezultatele obinute n funcie de tipul de aliment i de toxinele n cauz sunt prezentate n tabelul 7. 3.2.1.1 Eliminarea fraciunilor alterate Pentru eliminarea prtilor alterate de materie prima se intervine cu diferite metode de curire sau separare. Aceste metode, uneori foarte simple prezint un interes evident n cazul contaminrilor localizate sau cnd distribuia toxinei n produs este eterogen.

a)

Curirea

O simpl triere manual a produselor contaminate cu mucegaiuri permite o diminuare nsemnat a coninutului de toxin. Aceast triere poate fi mrit dac se realizeaz n mod electronic. Plutirea i segregarea prin densitate a cerealelor contaminate cu mucegaiuri permit reducerea coninutului mediu de micotoxin cu peste 90%; 95% din aflatoxine sunt localizate n boabele care plutesc pe ap. Cernerea porumbului contaminat cu fumonisine permite reducerea coninutului de toxine, boabele sparte conin de 10 ori mai multe micotoxine dect boabele intacte. Curarea, polizarea i aspirarea boabelor de gru, permit o eliminare parial a desoxinivalenolului, 60-80% rmnnd totui n fin

b)

Mcinarea fin, nmuiere i separare Studii efectuate pentru porumb au artat c mcinarea fin a acestuia permite separarea

diferitelor fraciuni a cror nivel de contaminare cu toxine este variabil. n timpul unei mcinri umede, aflatoxina B1 se regsete n principal n apa de nmuiere a porumbului (39-42%) i n fibre (30-38%), restul fiind repartizat n gluten (13-17%), germeni (6-10%) i amidon (1%). Zearalenona este concentrat n gluten (49-56%) i n substanele solubile (17-26%), dar este absent n amidon. Substanele solubile zdrobite conin de patru ori mai mult zearalenon dect originalele i fraciunile de gluten. Totui, aceste fraciuni reprezint 14-19% din porumb, reprezentnd 72-75% din prile contaminate cu zearalenon. 37121 37

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Fumonisinele se concentreaz n apa de nmuiere. Pentru porumbul puin contaminat, (1.0pg/kg), nici o fraciune nu a putut fi detectat n fraciunile tratate. Pentru porumbul foarte contaminat (13.9mg/kg), o parte din toxin este regsit n apa de nmuiere i de tratament, alte fraciuni contaminate se gsesc n ordine descresctoare n: gluten >fibre>germen. n ceea ce privete desoxinivalenolul, marea parte a toxinei se gsete n apa de nmuiere, dei cantiti msurabile rmn n amidon. La fel s-a artat c 67% din toxina T-2 este eliminat prin apa de nmuiere i de tratament. n sfrit, 43% din ochratoxina A se regsete n apa de tratament a porumbului i n substanele solubile de tratament ulterior, 4% n germen i 51% n crupe. Nivelul de contaminare al diferitelor fraciuni de porumb este diferit dac mcinarea se realizeaz uscat. Aflatoxinele se regsesc concentrate n fraciunile germen" i nveli". Crupele i fina (produse principale) care nu conin dect puin materie gras, conin doar 6-10% din cantitatea de aflatoxine. Aflatoxina B1 se gsete de asemenea n partea periferic a boabelor de gru tari. n ceea ce privete zearalenona, toate fraciunile uscate conin micotoxine, doar 3-10% pot fi eliminate prin mcinare uscat. Pentru aflatoxine nivelul cel mai ridicat se regsete n fraciunile cu cantiti mari de materii grase. n concluzie, eliminarea fraciunilor alterate trebuie s fie preconizat de fiecare dat cnd este posibil. Eficacitatea sa este legat de natura invaziei fungice (contaminare de suprafa sau de profunzime) i de caracteristicile toxinelor (concentraia aflatoxinelor n fraciunile bogate n grsimi, concentraia fumonisinelor hidrosolubile n apa de nmuiere). Dac echipamentul de separare este standardizat, anumite metode pot prezenta interes n tratamentul anumitor materii prime (cernerea porumbului de exemplu n vederea diminurii nivelului contaminrii cu fumonisine).

Tabel 14. Compararea eficienei metodelor fizice de decontaminare Metoda Produs Toxina Eficiena 38121 38

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Curire i eliminare Triere electronica/manuala Plutire i separare (densitate) Cernere Curire i polizare Mcinare si separare Mcinare umeda nmuiere Mcinare uscata Tratamente termice Cldura umed Prjire Cldura uscata Cldura Iradiere

arahide

aflatoxine

++ +++

arahide, porumb aflatoxine porumb gru porumb porumb gru porumb porumb toate produsele porumb toate produsele fina toate produsele toate produsele

fumonisine +++ deoxinivalenol aflatoxine zearalenone fumonisine deoxinivalenol ochratoxina A aflatoxine zearalenona aflatoxine fumonisine aflatoxine ochratoxine tricotecene aflatoxine +/+/++ ++ ++ +/+/+ sau + sau + sau ++ -

+++ : eliminarea sau denaturare mai mult de 90%; ++: eliminare sau denaturare cuprins ntre 70-90%;+ : eliminare sau denaturare cuprins ntre 50-70%; -: eliminare n anumite fraciuni; + sau: eliminare moderat, variabila dupa tratamentul efectuat.

3.2.1.2 Denaturarea toxinelor Denaturarea prin tratament fizic a micotoxinelor presupune intervenirea mecanismelor de degradare complex bazat pe o deshidratare a micotoxinelor sau intervenia reaciilor radicale. Aceste metode prezint doua inconveniente majore: las produse de degradare n materia prim. Toxicitatea acestor reziduuri trebuie s tratamentul alimentelor poate modifica mult valoarea nutritiv. fie evaluat;

Tratamente termice

39121 39

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Aflatoxinele sunt rezistente la degradare termica i nu sunt distruse cu apa clocotit, prin autoclavare sau prin numeroase procedee termice de transformare a alimentelor. Mai mult de 50% din coninutul de aflatoxine sunt regsite n alimente dup gtirea orezului. Aflatoxina Bl rezist la cldur, iar aflatoxina Ml rezist la pasteurizare. Diferitele tehnici de prjire a cafelei, porumbului sau arahidelor permit o diminuare parial a coninutului de aflatoxine n produsele finite. Fumonisinele sunt de asemenea considerate ca fiind rezistente la cldur. Ochratoxina A este sensibil la tratamentele termice, mai ales n cazul n care acestea se fac n lipsa apei. nclzirea finii la 250C timp de 40 minute, permite o reducere cu 76% a nivelului de contaminare, 62% din coninutul de ochratoxina A dispare n timpul preparrii biscuiilor, chiar dac micotoxina nu este degradat n timpul fabricrii pinii. Desoxinivalenolul este cel mai stabil la tratamentele termice dect toate micotoxinele testate. Iradiere Efectele radiaiilor asupra micotoxinelor sunt puin cunoscute. O iradiere de 2.5 Mrad nu degradeaz aflatoxinele ntr-un aliment pe baz de alune, n timp ce expunerea la UV a uleiului de arahide sau cocos contaminat artificial va permite reducerea coninutului de aflatoxine. Aceste efecte sunt mai puin importante n cazul unei contaminri naturale a alimentelor. Aplicarea unei doze de raze X asupra unui aliment pentru a distruge aflatoxinele are ca efect distrugerea alimentului. n concluzie denaturarea fizica a toxinelor nu poate fi propus ca o metod sistematic de decontaminare. Amintim totui c diferite tratamente (termice n special) sunt aplicate materiei prime sau alimentelor n timpul pstrrii sau fabricrii. Aceste tratamente pot diminua parial toxicitatea alimentelor produse, dar nu trebuie considerate n nici un caz ca fiind tehnici de asanare" a materiei prime contaminate.

3.2.2. Denaturare chimic O modificare a structurii micotoxinelor poate fi efectuat prin diferite tipuri de reacii chimice (hidroliza epoxizilor i esterilor, oxidri). Metoda folosit este obligatoriu specific structurii compusului degradat, i pentru aceeai familie de micotoxine. Efectele diferitelor tratamente chimice ale alimentelor conform toxinelor n cauz sunt prezentate n tabelul 15. 40121 40

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Tabel 15. Compararea metodelor chimice de decontaminare Metoda Acizi si baze Amoniacare Toxina Eficiena +++ ? + i? ? ? + + +

aflatoxine fumonisine Nixtamalizare aflatoxine fumonisine Nixtamalizare+H2O2 fumonisine Oxidani si redactori Apa oxigenat aflatoxine Bisulfiti aflatoxine Glucoz, fructoz fumonisine

+++: denaturare i diminuare important a toxicitii; +: efect benefic; -: efect nefast; ?: denaturare far modificarea toxicitii.

3.2.2.1 Acizi si baze Aflatoxinele pot fi degradate n mediu foarte acid sau foarte alcalin, dar timpul necesar acestei degradri face inaplicabil folosirea direct a acizilor sau bazelor pe alimente. O decontaminare eficient poate fi obinut prin asociere cu presiunea, temperatura i compui alcalini. Aceste tehnici au fost perfecionate i sunt cunoscute astzi sub denumirea de amoniacare i nixtamalizare. Amoniacarea porumbului, arahidelor i altor materii prime este larg utilizat pentru a diminua coninutul n aflatoxine din alimente. Este o metod eficace de decontaminare a hranei animaliere, folosit dupa muli ani n Statele Unite, n Frana, Sudan, Brazilia, Mexic i n Africa de Sud. O utilizare simultan a temperaturilor nalte i a presiunilor nalte face metoda mult mai eficace. Tratamentul cu amoniac la presiuni atmosferice i la temperatura mediului ambiant reduce coninutul n fumonisine din materialul de cultur, dar nu reduce toxicitatea unui produs atunci cnd este administrat pe cale oral la oareci. O reducere de 79% a coninutului de fumonisine n porumb poate fi observat dup un tratament de amoniacare la presiune nalt i temperatura mediului ambiant urmat de un tratament la presiune joas i temperatur nalt. Nixtamalizare sau tratament alcalin la cldura, utilizat la elaborarea pesmetului de porumb, reduce semnificativ coninutul de aflatoxine. Totui studii ulterioare au artat c o parte din aflatoxine sunt regenerate n timpul acidifierii produselor. Dei nixtamalizarea reduce coninutul de fumonisine Bl din alimente prin hidroliza micotoxinelor, toxicitatea lor nu este diminuat. Aceast tehnic nu este deci o strategie 41121 41

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine valabil de detoxifiere a fumonisinelor. A fost propus o metod de nixtamalizare modificat, prin adugare de peroxid de hidrogen i bicarbonat de sodiu. Folosirea pe alimente contaminate, conduce la o reducere cu 40% a mortalitii creveilor de mare (prin comparare cu alimentele tratate fr adugare de peroxid de hidrogen i bicarbonat de sodiu). Trecerea n mediu acid sau alcalin nu conduce la accelerarea degradrii micotoxinelor. Patulina va fi astfel mult mai sensibil n mediu acid dect n condiii de pH apropiat de valori ale neutralitii.

3.2.2.2 Oxidani i reducatori Am amintit deja c adugarea peroxidului de hidrogen la o metod de nixtamalizare clasic amelioreaz eficacitatea lor n denaturarea fumonisinelor. Folosirea peroxidului de hidrogen a fost propus pentru denaturarea aflatoxinei Ml. Degradarea toxinei este accelerat prin adugare de riboflavine care vor cataliza formarea oxigenului reactiv plecnd de la peroxidul de hidrogen. Bisulfitul de sodiu sau de potasiu permit o degradare parial a aflatoxinelor 50% din toxinele din soluie apoas la un pH de 5.5 vor fi degradate dup 150 ore n prezena a 3000 ppm bisulfit. Timpul necesar acestei degradri scade prin creterea temperaturii. Efectul bisulfitului va fi obinut i pe porumb contaminat. O diminuare a toxicitii in vitro a aflatoxinelor B1 va fi observat cnd se nclzesc n prezena glucozei i fructozei. Oxidanii i reductorii folosii singuri nu prezint un interes sczut n contaminarea alimentelor cu micotoxine. Folosirea reductorilor poate fi eficace n alte circumstane cum ar fi contaminarea sucului de mere cu patulina. Aceast micotoxin este astfel degradat cu ajutorul dioxidului de sulf. O soluie cu 2000 ppm dioxid de sulf permite distrugerea a 90% din patulina din sucul de fructe (concentraia iniial de 15 ppm). Acidul ascorbic accelereaz degradarea patulinei i acidului penicilic din sucul de mere. Cu ajutorul vitaminei C (5%) la un suc de mere contaminat (300 ppb) va permite o reducere a nivelului de contaminare cu aproximativ 80%, dup 15 zile de conservare la 4C.

3.2.3. Adsorbia toxinelor

42121 42

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Imobilizarea unui xenobiotic prin legtura noncovalent a adsorbanilor constituie o metoda de decontaminare" din ce n ce mai mult folosite cnd micotoxinele sunt prezente n alimente. Aceast tehnic poate fi performant pentru anumite toxine sub rezerva alegerii apropiate a adsorbantului. Termenul de adsorbie a toxinelor poate avea de asemenea o eficien foarte sczut cnd este folosit n alimentaia animal pentru alte motive: proprietile fluidifiante ale argilelor, efectele benefice ale anumitor adsorbani, obinuina, din motive comerciale. Obiectivele sunt precizarea interesului pe care i pot avea adsorbanii n folosirea lor cu materii prime contaminate cu micotoxine. 3.2.3.1 Argilele Termenul de argil corespunde compuilor formai din silicai lamelari, mai mult sau mai puin hidratai, provenite din alterarea silicailor cu structura tridimensional. Cnd aluminiul este prezent aceti compui sunt numii aluminosilicati. Absorbia puternic a aflatoxinelor de aceti compui, asociat cu o diminuare net a toxicitii alimentelor contaminate este dup toate aparenele originea argumentului actual pentru adsorbani. Efectele benefice ale argilelor n alimentaia animal n absena contaminrii cu micotoxine, au fost foarte mult studiate. Aceti compui interfer cu absorbia oligoelementelor, efectele nefaste fiind de asemenea raportate. Aluminosilicaii de sodium i de calciu hidratat Cele mai cunoscute sunt HSCAS" (aluminosilicaii de sodiu i calciu hidratat). Aluminosilicaii de sodiu i de calciu (tabel 16) constituie clasa de alunimosilicai foarte studiai pentru proprietile sale adsorbante. Aceti compui fac parte din familia zeolitelor avnd un deficit n sarcina pozitiv, constituind exceleni adsorbani de cationi.

Aluminosilicaii prezint remarcabile proprieti adsorbante vis-a vis de aflatoxine, complexul format fiind stabil pentru un gram de pH activ de 2.5-10. Aflatoxinele astfel adsorbite sunt imobilizate, mai puin de 10% pot fi extrase cu solveni organici. Aceast adsorbie este un proces care se realizeaz rapid i intens. 1 mg de HCSAS poate fixa mai mult de 200 nmoli AFB1. Aceast puternic fixare explic faptul c sunt necesare cantiti

43121 43

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine foarte mici de HCSAS n alimente pentru a diminua efectele negative ale aflatoxinelor. Este acompaniat de o diminuare a coninutului de A FM 1 n lapte. Proprietile adsorbante ale HCSAS au fost testate i pentru alte micotoxine. Rezultatele obinute vis-a vis de zearalenon sau ochratoxina A sunt pariale, iar n ceea ce privete tricotecinele rezultatele sunt neltoare. Tabel 16. Formule brute ale HSCA Nume Mezolita Stilbita Tomsonita Gmelinite Heulandite Formule Na2Ca2A16Si9O30-8H2O NaCa2 A15 Si 13 036-14H20 NaCa2A15Si5O20-6H2O (Na2,Ca)A12Si4012-6H20 (Ca,Na)2.3Al3(Al,Si)2Sii3036-12H20

Zeolitele Zeolitele sunt substane cristalizate cu o structur format din tetraede interconectate de

SiO4 i AlO4. Pentru a face parte din familia zeolitelor, aluminosilicaii trebuie s respecte proporia de 0.5 ntre (Si+Al)/O. Tetraedrul aluminosilicailor este ncrcat negativ, lsnd un spaiu mare ntre molecule, izolnd cationi (de obicei Ca 2+ i/sau Ca 2+ ). n zeolitele folosite ca absorbant spaiile libere sunt interconectate, formnd un spaiu mare capabil s adsoarb compui cu mas mai mare dect sodiu sau calciu. Pe de alt parte, aceti compui se deshidrateaz i hidrateaz foarte uor, modificndu-i astfel structura. n ceea ce privete adsorbia micotoxinelor, efectele zeolitelor au fost testate n prezena aflatoxinelor. Adsorbia AFB n soluie n diferite medii a fost n jur de 60% in vitro. Aceast adsorbie, dei inferioar n prezena compuilor azotai, va diminua toxicitatea alimentelor care conin 2.5 ppm aflatoxine. Originea zeolitei este fundamental. Un studiu comparativ ntre 5 forme arat diferene de protecie, importana toxicitii alimentelor contaminate cu aflatoxine la pui. Zeolitele sunt sintetizate, n special de sodiu, devenind mai active. Adugarea de 5% zeolit anionic de sintez ntr-un aliment care conine 250 ppm zearalenon previne efectele toxinei la obolani (ctig n greutate). Nu a fost observat nici o protecie cu zeolit cationic de sintez. Originea zeolitelor folosite nu este menionat iar

44121 44

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine nivelul de contaminare cu zearalenon este ridicat, fcnd aceste rezultate dificil de exploatat n practic.

Bentonitele Bentonita este o argil, format prin mbtrnirea cenuelor vulcanice. Termenul de

bentonit regrupeaz deci diferite produse cu aceeai origine dar cu compoziie diferit. Compuse din aluminiu i siliciu fac parte din marea categorie a aluminosilocailor. Unele sunt bogate n sodiu altele n calciu, potasiu sau magneziu: toate conin oligoelemente i urme de metale toxice (tabel 17). Originea bentonitei va fi foarte important ns n capacitatea de a adsorbi toxinele. Bentonita de sodiu este cel mai mult folosit n alimentaia animal. Avnd n vedere marea sa suprafa intern, acest compus adsoarbe n jur de 6-7 ori greutatea sa n ap. Capacitatea sa de schimb cationic este n jur de 80-85 meq/100g. Utilizrile bentonitei sunt multiple. n alimentaia animal este folosit n principal pentru proprietile sale: 3%; agent anti-aglomerant n forme, pentru a evita formarea bulgarilor; adsorbant al apei pentru a reduce pierderile de ap din depozite; sursa de oligo-elemente, n principal seleniu i magneziu. agent de legtur n alimente (pelei), nivelul su de ncorporare variaz ntre 1.5-

n terapie, bentonita a fost folosit ca adsorbant n tratamentul de intoxicare. Proprietile sale adsorbante vis-a vis de aflatoxine au fost explorate: In vitro, 2% bentonit adsoarbe ntre 94-100% AFB1 (400pg) soluie n tampon fosfat la pH 4,5. Capacitatea adsorbant variaz n funcie de natura bentonitei folosit. O extracie cu cloroform a complexelor formate furnizeaz un procent de recuperare care variaz ntre 5-25%. n lapte, 2% bentonit adsoarbe 80% din doza de AFB1 (3-6ppb). Procente de adsorbie similare sunt observate la pH 2, i pe amestec biologic complex reprezentativ de lichide intestinale. Studii fcute pe alimente mucegite arat c 10% bentonit adsoarbe 70% din AFB 1 prezent (44.6ppb). In vivo, cu ajutorul bentonitei de sodiu, toxicitatea aflatoxinelor din alimentele contaminate scade . Un nivel de ncorporare de 5% prezint efecte optime. O protecie vis-a 45121 45

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine -vis de efectele teratogene ale aflatoxinelor a fost observat la obolani. Pentru bentonite, ca i pentru alte argile, nu sunt inhibate toate efectele negative ale aflatoxinelor. Efectele bentonitei au fost de asemenea testate i pentru toxicitatea toxinei T-2. La obolani, aciunea negativ a acestei micotoxine este diminuat prin administrarea bentonitei n alimentul contaminat cu 3 ppb toxina T-2. Efectul protector al bentonitei este mult diminuat cnd nivelul de ncorporare n raie depete 5-10%. Efectul benefic poate fi asociat cu o adsorbie a toxinei, dar i unei modificri a vitezei de tranzit intestinal. Nicele foarte ridicate de ncorporare face aceste rezultate dificil de aplicat n cazul alimentaiei animale. Bentonita (2-5%) nu a avut nici un efect asupra toxicitii zearalenonei (3 ppm) i nivalenolului (11.5 ppm) la porc. Nivelurile mari de contaminare cu toxine (zearalenona 3 ppm i nivalenol 11.5 ppm) poate satura proprietile adsorbante ale bentonitei. Proprietile adsorbante vis-a vis de ochratoxina A sunt variabile n funcie de pH; insuficient totui n toate cazurile pentru diminuarea concentraiilor plasmatice n toxin. Montmorrilonita permite, n soluie de 2%, o adsorbie de 95% din coninutul de AFBI prezent ntr-o soluie tampon fosfat la pH de 6,5. O extracie cu cloroform a complexelor formate furnizeaz un procentaj de recuperare care variaz ntre 10-57%. Rezultate similare sunt obinute n mediu lichid unde compoziia este asemntoare cu cea a lichidelor intestinale. Echilibrul este atins dup o or, iar complexul format este stabil pentru un pH cuprins ntre 2,5-7. Un gram montmorrilonit permite adsorbia a mai mult de un miligram aflatoxine.

Tabel 17. Compoziia tipic a unei bentonite Element Si02 AI2O3 Fe203 MgO Procentaj 60-65% 15-20% <5% <5% Impuriti Umiditate Pietri Arsenic Cadmiu Procentaj 5-10% < 1% 0.1-10 ppm 0.1-10 ppm 46121 46

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Na20 CaO K20 Ti02 < 5% > 1% > 1% > 1% Cupru Mercur Plumb Zinc 0.1-10 ppm 0.1-10 ppm 0.1-10 ppm 0.1-10 ppm

Ali filosilicai Kalinul ( A12Si205(OH)4) sau silicatul de aluminiu este un flosilicat folosit n tratarea

ulcerelor gastrice; este de asemenea dotat i cu proprieti adsorbante. In vitro, concentraia de 2% permite adsorbia de 87% din coninutul de AFBI (8 ppm) prezent ntr-o soluie tampon fosfat (6.5). Totui, adsorbit este uor reversibil, aproximativ 77% din toxina rmne extractibil cu cloroform. Permite de asemenea decontaminarea arahidelor i previne efectele toxinei la obolani n cazul unei contaminri a alimentelor de 5 ppm AFB1 ( adaos de 0.2-1% kaolin) Acest efect devine insuficient dac nivelul de contaminare este mult mai mare (20 ppm). Sepiolita ((MgO)2(Si02)3, 2H20 sau silicatul de magneziu este de asemenea un filosilocat. Folosind 2% sepiolit se poate adsorbi peste 87% din coninutul de AFB1 (8 ppm) prezent ntr-o soluie tampon fosfat (pH 6,5). Aceast adsorbie este reversibil, peste 77% din toxin rmnnd extractibil cu cloroform. Se explic astfel efectele protectoare ale sepolitelor 0.5% n aliment vis-a- vis de toxicitatea AFB1 (800 ppm) la porc. Carbonul activ este o pudr neagr nehidrolizabil, obinut prin piroliza diferitelor tipuri de materii organice. Carbonul activ este folosit in vivo pentru adsorbia toxicilor i toxinelor la om i animal. Capacitile sale adsorbante variaz n funcie de porozitatea sa ( suprafaa de contact) i de mediul n care se regsete ( apos, concentraia n materie organic i sare, pH.). Adsorbia specific variaz ntre 500 m 2 /g - 3500 m 2 /g. Carbonul activ este foarte des folosit n cazul separrii micotoxinelor n vederea dozrii lor. Este folosit n vederea unei decontaminri a alimentelor lichide, n special a sucului de mere. Persistena unei coloraii cafenii nchise n produsul tratat face dificil folosirea lui in alimentaia umana. Datorita prezentei sale sub forma de pudra si puterea de colorare, folosirea n alimentaia uman este de asemenea delicat. Folosirea carbonului n extracia micotoxinelor ca i frecvena utilizrii n tratamentul intoxicaiilor acute explic totui utilizarea sa experimental mai mult dect n cazul decontaminrii. 47121 47

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Capacitatea adsorbant a carbonului activ vis-a vis de aflatoxine a fost pus n eviden totui. 100 mg carbon sunt capabile sa adsoarb 1 mg toxin n prezena a 2% serumalbumina bovina i 0.5% ulei de porumb, la pH 7. Complexul format este stabil, i protejeaz toxicitatea AFB1: diminuarea semnelor hepatotoxice (mrcri plasmatice i leziuni hepatice), creterea procentajului de supravieuire, creterea eliminrii micotoxinelor i metaboliilor lor prin excreii fecale. Aceste efecte au fost observate mai bine n cazul intoxicaiilor acute dect n cazul celor cronice, la animalele nerumegatoare i la pasri. Totui semnele unei aflatoxicoze nu au putut fi evitate, ceea ce sugereaz c folosirea carbonului activ este insuficient pentru a garanta salubritatea alimentelor contaminate cu aflatoxine. Efectele benefice ale carbonului super activ" (capacitate mare de adsorbie) au fost puse n eviden n cazul administrrii toxinei T-2. O cretere a procentului de supravieuire a fost observat n cazul administrrii unei doze letale la obolani. Acest efect a fost parial observat la administrarea micotoxinelor, poate fi legat de adsorbia moleculeor i metaboliilor si eliminai prin excreii biliare. Este acompaniat de o diminuare a semnelor de necroz tisular. Efectele protectoare pot fi mrite prin administrarea concomitent a corticoidelor. Carbonul activ permite o adsorbie a toxinei aplicat pe o piele lezat. Totui, protecia legat de administrarea carbonului activ (0,5 % de aliment), la puii care primesc un aliment contaminat cu 6 ppm toxina T-2 nu este dovedit. n ceea ce privete ochratoxina A, carbonul activ este un adsorbant eficace in vitro, el nu este capabil ns s diminueze toxicitatea micotoxinei in vivo la pui. Acest efect poate fi consecutiv la o diminuare a capacitii adsorbante a carbonului n alimente, n raport cu coninutul lor ridicat n substane organice. Un net efect protector a fost observat n cazul administrrii unor doze mari de carbon n aliment (5-10%) contaminate cu ochratoxina A (1 ppm), fiind nsoit totui de o diminuare a concentraiilor plasmatice n vitamina E.

3.2.3.2 Rinile Rinile sunt polimeri de sintez formai din cerpetene macromoleculare tridimensionale prezentnd grupri active susceptibile fixrii de compui organici sau minerali prin legturi cu energie sczut. Rinile curente sunt rinile schimbtoare de cationi de tipul R-SO 3; 48121 48

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine R-PO3 ; R-COO i rini schimbtoare de anioni de tipul [R-N(CH3)3] . Aceti compui sunt folosii n separarea micotoxinelor n vederea dozrii ulterioare. Rinile schimbtoare de anioni sunt folosite pentru proprietile lor adsorbante in vivo. Colestiramina este folosit n tratamentul hipercolesterolemiei. Proprietile sale adsorbante sunt testate in vitro pe zearalenona (concentraia de 1%). 1 g colestiramina este capabil s adsoarb peste 2 ng toxine n mediu cu compoziie apropiat de coninutul gastric sau intestinal. La obolani, folosirea unui nivel de 5% n aliment va diminua nivelul de reziduuri prezente n ficat i rinichi. La oareci, rina (2.5% n aliment) va duce la creterea greutii corporale dupa ngerarea unui aliment contaminat cu 6 ppm zearalenon. Proprietile adsorbante ale colestiraminei au pus n eviden administraia ochratoxinei A. La obolani, rina (2% din aliment) va fi susceptibil de diminuarea concentraiilor plasmatice n OTA ( ncorporat n aliment n concentraie de 1 ppm), de o cretere a eliminrii prin excreie fecal i diminuare prin excreie urinar. Aceste efecte sunt mai puin marcante pentru un aliment bogat n lipide saturate, ceea ce corespunde unei diminuri a ciclului enterohepatic al toxinei. Fixarea ochratoxinei A pe rini va fi n competiie cu srurile biliare, cu o mare afinitate. Aceast fixare va fi acompaniat de o diminuare a neprotoxicitii ochratoxinei A la obolani. Astfel, colestiramina prezint proprieti adsorbante interesante vis-a vis de micotoxinele anionice. Proprietile adsorbante ale polimerilor divinil - benzen - stiren, alt rin capabil s fixeze anioni, a fost testat. n vivo, adugarea acestui adsorbant n hrana obolanilor (5%) modific toxicocinetica zearalenonei administrat pe cale oral a dozei de 100 mg/kg, i diminuarea efectelor negative a alimentelor contaminate cu 3 ppm toxina T-2 administrat timp de 2 sptmni. Rezultatele obinute n acest ultim experiment sunt asemntoare cu cele obinute cu bentonit, dar superioare celor obinute cu o rin schimbtoare de cationi. Polivinilpirolidonele folosite ntr-un nivel de 0.2% n aliment, vor fi incapabile s protejeze efectele toxice ale desoxinivalenolului la porc. Folosirea concentraiei de 0,3% n aliment, va diminua toxicitatea aflatoxinelor la pui (2,5 ppm un amestec care conine mai mult de 80% AFB1 administrat timp de 3 sptmni).

3.2.4. Metode biologice de decontaminare 49121 49

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Se ncearc degradarea n mediu natural a micotoxinelor cu microorganisme sau enzime. Identificarea potenialului de degradare cu microorgansime este prima etap de dezvoltare a procedeelor. Aceast activitate de decontaminare trebuie s poat fi transferat pe produsele contaminate cu micotoxine. Prin decontaminare biologic" se ntelege transformarea enzimatic a micotoxinei ntr-un compus mai puin toxic. Diluarea" nivelului de contaminare cu micotoxine, prin amestecarea unui lot sntos i un lot contaminat este o practic interzis n Europa (reglementat prin CE N466/2001) dar, nainte era totui o metod frecvent folosit. Degradarea ochratoxinei A prin metode biologice a fost pus n eviden n timpul procesului de insilozare. Ochratoxina A prezent n orz poate fi degradat de flora microbian existent. OTA poate fi degradat de asemenea de bacteriile prezente n rumenul vacilor, ceea ce face ca aceste animale s fie mult mai rezistente la micotoxine dect animalele monogastrice. Ochratoxina A este hidrolizata n ochratoxina i fenilalanina sau este esterificat n ochratoxina A. Eubacterium BBSH 797, bacterie izolat din rumen a fost caracterizat de Schtzmayr si col (2005) pentru potenialul sau de degradare a ochratoxinei A n -ochratoxina. Capacitatea de degradare a ochratoxinei A n -ochratoxina cu Acinobacter calcoaceticus, izolat de asemenea din rumen, a fost pus n eviden in vitro pe mediu sintetic la 25-30C (Hwang i Dranghen, 1994). Enzimele naturale au de asemenea capacitatea de a degrada ochratoxina A. Degradarea ochratoxinei A n diverse produse neidentificate, a fost pus n eviden n suspensii de celule de gru, orz sau porumb. Aceste transformri enzimatice cuprind reacii de hidroliz, de metilare care contribuie uneori la pierderea potenialului toxic al moleculelor ( Ruhland si col, 1994, 1996a i 1996b). O lipaz, izolat plecnd de la Aspergillus niger degradeaz ochratoxina A n ochratoxina (Stander si col. 2000). Alte activiti enzimatice ct i alte microorganisme au fost caracterizate pentru potenialul lor de degradare a ochratoxinei A. Ochratoxina este degradat de surse de Rhizopus stolonifer i Rhizopus microsporus cu o eficacitate care poate atinge 96% pe grul umed (Varga si col, 2005). Rhizopus stolonifer este un patogen ai plantelor care contamineaz dupa recoltare. 50121 50

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Speciile Rhizopus sunt principalele ciuperci izolate n zycomycose; cu toate acestea Rhizopus stolonifer, este rar menionat ca patogen uman. Se propune folosirea acestor surse pentru decontaminarea cerealelor. Caracterizarea potenialului de degradare ai ochratoxinei A de anumite microorganisme care aparin florei microbiene naturale a alimentului contaminat prezint un interes mult mai mare dect caracterizarea activitilor enzimatice. Sursele de mucegaiuri, izolate plecnd de la ciorchinele de strugure, sunt capabile se degradeze ochratoxina A pn la un nivel mai mare de 80% pe mediu sintetic. (Abrunhosa si col, 2002). Dou ci de degradare diferite au fost puse n eviden n funcie de specie, implicnd activitatea carboxipeptidazei, conducnd la transformarea ochratoxinei A n -ochratoxina. n plus, aceast capacitate de degradare a ochratoxinei A a fost identificat n sursele ochratoxicogene i n sursele netoxicogene. Aceste surse aparin florei microbiene naturale a strugurelui. Folosirea surselor netoxicogene pentru eliminarea ochratoxinei A din struguri poate fi luat n considerare. Bacteriile lactice i drojdiile intervin n procedeele de fermentaie agroalimentar, prezentant potenial pentru decontaminarea micotoxinelor din produsele alimentare (Shetty si Jespersen, 2005). Degradarea ochratoxinei A din lapte a fost pus n eviden de bacteriile din iaurt; Lactobacilius, Streptococcus si Bifidobacterium (Skrinjar si col, 1996). Sacharomyces cerevisiae, are capacitatea de a elimina ochratoxina A. Adsorbia micotoxinelor de drojdii a fost pus n eviden prin folosirea unui amestec de drojdii sterile i reziduuri ale fermentaiei berii: mecanismul dispariiei ochratoxinei A in vitro presupune adsorba micotoxinei pe peretele drojdiei (Grunkemerer, 1990). Eliminarea ochratoxinei cu ajutorul drojdiilor este superioar atunci cnd drojdiile folosite sunt moarte, atingnd aproximativ 90%. Acest lucru confirm ipoteza potrivit creia, eliminarea ochratoxinei A este rezultatul unui fenomen de adsorbie, n care, volumul de celul joac un rol n capacitatea de eliminare (Bejaouii si col, 2004). n plus, folosirea acestor drojdii vii, sau moarte, nu atrage modificri ale calitii vinului. Acest procedeu poate fi considerat ca fiind promotor pentru decontaminarea ochratoxinei A din vin. Fermentaia alcoolic cu Sacharomyces cerevisiae cu must contaminat cu desoxinivalenol i zearalenon a artat rezultate dup 7-9 zile de fermentare, desoxinivalenolul a fost stabil. Din coninutul iniial de zearalenon, 69% a fost convertit n 51121 51

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine -zearalenol, 8,1% n -zearalenol. Marea parte a metabolizrii zearalenonei s-a produs dup 1-2 zile de fermentaie. Folosirea fibrelor vegetale - capabile de a adsorbi imobilizarea micotoxinelor n tractul gastro-intestinal este de asemenea o metod biologic folosit la decontaminare. Activitile enzimatice au fost identificate pentru degradarea ochratoxinei dar punerea la punct ca procedee de decontaminare, rmne s fie rezolvat. Potenialul de degradare a micotoxinelor cu microorgansime prezent n mod natural n siloz sau n produsele alimentare, prezint un interes pentru a reduce expunerea animalului i omului la aceste toxine. Totui, la ora actual, nici un procedeu nu este pus la punct.

CAPITOLUL 4

Metode de determinare a micotoxinelor


52121 52

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

4.1 Pregtirea preliminar a probelor


Micotoxinele prezint un real pericol att pentru animale ct i pentru om, i este obligatoriu ca manipularea probelor s se fac cu grij i s se lucreze n condiii care s mpiedice contaminarea materialelor i a atmosferei. n plus, anumite mucegaiuri care produc aceste substane sunt ele nsui toxice: este exemplul lui Aspergillus flavus i Aspergillus parasiticus pentru care s-au diagnosticat trei tipuri de simptome la om: infecie, alergie i toxicoz. Infecia reprezint o invazie a esuturilor vii n timp ce alergia este o manifestare de hipersensibilitate la o antigen fungic. Toxicozele sunt maladii rezultate n urma expunerii, n general prin ingerare, prin inhalare sau prin contact direct, la micotoxine produse de mucegaiuri. Trebuie s se insiste asupra faptului c atmosfera este un bun vector de contaminare cu micotoxine. Securitatea trebuie sa fie maxim. Personalul din laborator trebuie s fie familiarizat cu reglementrile privind securitatea. Mai mult, un control medical al pesonalului este recomandat i trebuie s se realizeze un set complet de analize la snge. Gestionarea riscurilor de laborator trebuie s cuprind trei puncte: 1. identificarea sursei periculoase i a efectelor posibile asupra sntaii n cazul nefolosirii echipamentului adecvat;. 2. punerea la punct a metodelor de manipulare a toxinelor i microorganismelor; 3. nelegerea sensului responsabilitii pentru a permite aplicarea msurilor de securitate

Manipularea mucegaiurilor Culturile trebuie s fie pstrate n eprubete, plci Petri. Pentru manipularea eantioanelor se recomand s se lucreze n cabine securizate biologic. Pentru protecie, personalul trebuie s poarte n permanen sor, mnui i masc.

53121 53

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Manipularea produselor mucegite Produsele mucegite nu trebuie s fie manipulate niciodat fr mnui i analizele se vor face n aa fel nct s se evite pe ct posibil inhalarea particulelor toxice. Analiza eantioanelor test Securitatea manipulrii este foarte important n timpul acestei operaii. Este primordial minimizarea contaminrii atmosferice cu vapori toxici si particule de praf. Contactul direct cu toxinele pure sau n soluie trebuie s fie evitat prin folosirea echipamentului de pipetare mecanic. Toate suprafeele de lucru ca i echipamentele folosite n timpul extraciei trebuie s fie obligatoriu decontaminate dup utilizare. Hranirea animalelor cu alimente contaminate Cnd animalele de laborator sunt hrnite cu alimente care conin toxine trebuie s se poarte n orice moment echipamentul de protecie. Alimentele trebuie s fie corect etichetate i depozitate cu grij pentru a evita confuziile. Decontaminarea laboratorului Sticlria de laborator i suprafeele care au intrat n contact cu toxinele sunt splate cu NaClO 0,5%. Carcasele n care au fost inute animalele de laborator sunt incinerate.

4.1.1, Eantionarea Studii au artat c peste 90% din erorile de cuantificare a micotoxinelor se datoreaz eantionrii necorespunztoare; trebuie deci s ne asigurm c eantioanele prelevate pentru a fi analizate sunt reprezentative. Este important deci s se prezinte un plan de eantionare care s fac parte din reglementrile privind controlul contaminrii cu micotoxine. n ultimii ani, o atenie deosebit a fost 54121 54

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine acordat ameliorrii i asigurrii calitii analizelor fcute pentru identificarea

contaminanilor din produsele din alimentaia uman i animal. Pentru stabilirea normelor comerciale, contaminanii trebuie s fie corect identificai si cantitile determinate s fie sczute. Micotoxinele nu fac excepie de la aceste reguli i analiza lor prezint dificulti particulare n ceea ce privete obinerea eantioanelor reprezentative iar analiza trebuie s permit identificarea nivelurilor sczute de micotoxine (sub 500 ppm). Eantionarea constitue o etap crucial n determinarea coninutului de micotoxine dintr-un lot de produse alimentare. Deoarece cantitatea de micotoxin nu este proporional cu cantitatea de mucegaiuri prezent, sunt foarte rar distribuite uniform n eantion. Contrar metodelor analitice, sistemele de eantionare nu pot face obiectul ncercrilor interlaboratoriale i n general, un plan de eantionare este propus pe baza unui studiu statistic al repartiiei toxinelor msurate, apoi el este adoptat n mod oficial. Publicaia colectiv a UNDP si FAO a definit clar procedurile de eantionare pentru diferite micotoxine. Se ine cont de tipul produsului i de dimensiunea lotului. n fiecare caz, numrul minim de subeantioane prelevate este precizat, ca i dimensiunea unitar minim a fiecruia dintre ele. n plus, cantitatea subesantionului prelevat pentru analiz i modul n care este prelevat sunt specificate. Comisia europeana a editat o directiv n care se specific metodele analitice de eantionare pentru controlul oficial la nivelul anumitor contaminani n produsele alimentare. Procedura de eantionare poate fi rezumata intr-o secvena de apte etape, indicate n figura nr.10

Figura 10. Etapele eantionrii

Scopul eantionrii

Identificarea punctelor de eantionare 55121 55

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Identificarea loturilor

Alegerea metodei de eantionare

Prelevarea eantioanelor

Prepararea eantionului

Condiionarea eantionului

nainte de toate, trebuie s se determine cu precizie scopul eantionrii si apoi se identific punctele de eantionare. Modul de eantionare difer n funcie de modul n care produsele sunt depozitate n vrac sau n ambalaje (saci, cutii metalice, butelii). Odat ce modul de condiionare a fost determinat, trebuie s se localizeze cu precizie, punctele de eantionare. A treia etap const n identificarea loturilor care trebuie s fie reprezentativ pentru sistemul analizat. Nu trebuie omis metoda de eantionare care trebuie s fie ct mai apropiat de analiza noastr, se disting trei tipuri de metode:

Eantionare uniform n acest caz, se preleveaz o cantitate mic de prob din fiecare porie. n acest tip de

eantionare, cantitatea prelevat este testat. Eantioanele trebuie sa fie deci reduse; aceast procedur este numit divizare i este realizat de un divizor care preleveaz o fraciune identic din fiecare eantion n parte.

Eantionare selectiv 56121 56

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Acest tip de eantionare presupune prelevarea prilor cele mai susceptibile a fi contaminate din lot. Aceast tehnic se aplic de exemplu n cazul unui lot de cereale unde investigaia se va face doar pe grnele care prezint un stadiu avansat de mucegire. Eantionare aleatorie Acest tip de eantionare se efectueaz n cazul n care e nevoie de multe eantioane, de calitate diferit, care provin dintr-un lot neuniform. La aceast tehnic, numrul eantioanelor, cantitile lor totale i perioada de prelevare nu sunt determinate nainte de eantionare. Eantionarea strict aleatorie este complicat, i se face apel la tehnicile complexe de prelevare aleatorie. Prelevarea eantionului reprezentativ pentru lot este urmtoarea etap a eantionrii. Cea de-a asea etap const n prepararea eantionului, mai bine spus, separarea eantionului de impuritile de dimensiuni mari pe care le conine. Ultima etap presupune condiionarea eantionului n vederea determinrilor. n mod frecvent, eantioanele reprezentative cntresc ntre 3 i douzeci kilograme. 4.1.1.1 Variante de eantionare, de pregtire a eantionului i analitice Se poate spune c etapa de eantionare este de obicei sursa cea mai mare de erori n secvena analitica, mai bine spus n secvena de eantionare, prepararea eantionului i analizei. Varianta( St ), exprimat de reprezentativitatea eantionului trebuie s fie ct se poate de sczut, sau cel mult egal cu suma variantelor de eantionare (Ss2), de preparare a eantionului (Ssp2) i de analiz (Sa2): St - Ss + SSp + Sa Determinarea acestor variante se poate face n manier empiric plecnd de la formule stabilite n prealabil. De exemplu, n cazul arahidelor, Whitaker i colaboratorii si au stabilit urmtoarele relaii: Ss2= (49,0546*MLU955 - 0,39 ML1,7867) /Ws Unde Ss este varianta eantionrii ML este concentraia n aflatoxin n lot n ppb Ws este masa de arahide n eantion in kg Ssp2= (0,978 MS1J867-0,0178 Ms1'9339)/Wsp Unde Ssp2 este varianta de preparare a eantionului 57121 57
2

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Ms este concentraia n aflatoxine n eantion n ppb Wsp este masa de arahide mcinat n subeantion n kg Sa2= (l/na)*(0,00482 MSS1J518) Unde Sa2 este varianta analitic pentru analiza HPLC na- este numrul de analize repetate Mss este concentraia de aflatoxin n subeantion n ppb. 4.1.1.2. Conceptul i evaluarea unui plan de eantionare Factorii urmtori sunt eseniali n stabilirea unui plan de eantionare: - tipul de marf - concentraia maxim n toxine permis n lot - concentraia maxim permis n eantion (concentraia critic) - dimensiunea eantionului - numrul subeantioanelor; - numrul eantioanelor; - metoda de obinere a eantionului; - metoda analitic;

Trebuie s se tie c exist dou tipuri de riscuri legate de planul de eantionare: riscul productorului (Producer Risk, PR), care este acela de a respinge un lot sigur, i cel al consumatorului (Consumer Risk, CR), care este acela de a accepta un lot contaminat. Dup determinarea prii relative a fiecruia dintre cele dou riscuri se poate construi o curb unic numit curba caracteristic de operare (Operating Characteristic curve, OC curve) care pe abscis are reprezentat probabilitatea [P(M)] c planul de eantionare s accepte un lot n funcie de concentraia n aflatoxina M n lot. Forma acestei curbe va fi influenat de urmtorii parametri: concentraia critic permis n eantion; mrimea eantionului; 58121 58

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine mrimea subeantionului i gradul de fragmentare; metoda analitic (tipul si numrul analizelor). Probabilitatea c un lot s fe acceptat se poate exprima astfel: P(M)=p(X<Xc/M) Unde X este concentraia n toxin a eantionului Xc este concentraia critic a eantionului M este concentraia n aflatoxina a lotului. Pentru analiza micotoxinelor, se vor prelua cte 4 eantioane identice cantitativ: - primul pentru analiza propriu-zis; - dou pentru eventualele analize complementare; - ultima este pstrat ca referin

Dupa principiul Gafta Rules, dac cantitatea de micotoxin gsit n prima prob este mai mare de 50% fa de limita autorizat, cea de-a doua analiz va fi efectuat pe cel deal doilea eantion. Dac rezultatele furnizate de aceast dat sunt inferioare limitelor, atunci, lotul va fi acceptat. Dac ce-a de a doua analiz prezint valori mai mari dect normele tolerate dar inferioare primei probe, se va realiza o nou analiz pe cel de al treilea eantion. Dac rezultatele celei de a treia analiz sunt conforme cu normele n vigoare, lotul este acceptat, dac nu este respins. Metodele care permit evidenierea micotoxinelor n produsele alimentare sunt scindate n dou categorii calitative i cantitative menionnd n egal msura i testele kit" care permit analiza pe teren i furnizeaz date referitoare la prezena sau absena contaminanilor, dar trebuie s fie confirmat de o analiz complementar de laborator. Cele din urm, reprezint un protocol recunoscut i normalizat de AOAC (Association of Official Analytical Chemist). Totui, nainte de a fi normalizat, un protocol de analiz propus de un laborator trebuie s fie validat prin teste iterlaboratoriale, organizate dup normele ISO 43. Diferitele metode de referin se pot clasa dup principiul lor fundamnental de funcionare n tehnici fizico-chimice sau imunochimice; totui noi le vom mpri n funcie de performana lor, n tehnici calitative: minicoloanele, coloanele de imunoafinitate, testul ELISA (poate fi considerat i test cantitativ); i tehnici calitative: cromatografie n strat 59121 59

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine subire (TLC), cromatografie gazoas (CG) i cromatografie lichid de nalt rezoluie (HPLC). 4.2. Metode calitative n aceast seciune vom trata metodele care n general sunt folosite ca metode rapide de detecie a micotoxinelor. Aceste metode sunt folosite ca etape prealabile de purificare a micotoxinelor. Dup cum tim, metodele calitative folosesc fluorometria cu lumina UV pentru a determina concentraia molar a soluiei. Pentru interpretarea corect a msurilor realizate, ne vom folosi de dou legi care descriu absorbia luminii de materie: Legea lui Lambert: Legea lui Beer : Unde: A = log A=Cd I0 I

A = absorbana sau densitatea optic a soluiei; I = intensitatea luminii emise Io = intensitatea luminii transmise C = concentraia substanei absorbante = coeficeintul de extincie al substanei absorbante

n practic, n cazul unui spectofotometru UV cu un fascicol, scala absorbanei este adus la zero cu un solvant folosit ca martor. Celula care conine soluia de analizat este apoi plasat n spectrofotometru i citirea poate ncepe. Fiecare micotoxin are o valoare a absorbanei bine specificat.

Tabel 19. : Parametri spectrofotometrici pentru diferite micotoxine Micotoxina Masa moleculara Aflatoxina B 312 Aflatoxina Bl 312 Aflatoxina B2 314 Aflatoxina Gl 328 Aflatoxina 62 330 Aflatoxina Ml 328 Ochratoxina A 403 Ochratoxina B 369 Ochratoxina A etil ester 431 Solvant Benzen :acetonitril (98 :2) v/v Chloroform Benzen :acetonitril (98 :2) v/v Benzen :acetonitril (98 :2) v/v Benzen .acetonitri! (98 :2) v/v Chloroform Benzen :acid acetic (99 :1) v/v Benzen :acid acetic (99 :1) v/v Benzen :acid acetic (99 :1) v/v Absorbanta max (nm) 353 353 355 355 357 357 333 320 333 60121 60

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Ochratoxina B etil ester Patulina Patulina Sterigmatocistina Citrinina Zearalenona Zearalenona Zearalenona 397 154 154 324 259 318 318 318 Benzen :acid acetic (99 :1) v/v Etanol absolut Metanol Benzen Chloroform Etanol Etanol Etanol 320 276 275 325 322 236 274 316

4.2.1. Metode imunologice Testele imunologice constituie astzi metodele rapide de detecie a aflatoxinelor i a altor micotoxine n alimente. Anticorpii policloni i monocloni folosii sunt agenii de legtur folosii. Se tie c micotoxinele sunt molecule non antigene cu masa molecular mic, anticorpii policloni sunt produi indirect prin rspunsul imunitar al animalelor la un complex micotoxin-protein. Raportul molecular micotoxin-protein este foarte important pentru intensitatea rspunsului imunitar. Poziia i tipul de legtur ntre toxin i protein sunt de asemenea critice. Anticorpii monocloni sunt secretai prin fusiunea celulelor n splina oarecilor i legarea celulelor miceliene datorit polietilen glicolului. Imunogeneza este administrat prin injectri repetate de cantiti mici de protein (40-300 g). Recunoaterea imunologic este bazat pe complementarismul spaial al grupelor specifice al antigenelor cu cei doi anticorpi. Anticorpii sunt reactivul cheie n testul immunologic i trebuie s fie obligatoriu corect preparat i caracterizat. Caracteristicile utile pentru selecionarea unui anticorp convenabil sunt: constanta de afinitate, specificitatea i randamentul. Se cunosc trei tipuri de teste imunologice : Testele RIA (radioimmunoassays), testele ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), i testele pe coloana de imunoafinitate. n ultima categorie sunt incluse minicoloanele sau coloanele de imunoafinitate.

4.2.1.1. Testele RIA n testele RIA, aflatoxina este marcat din punct de vedere al radioactivitii. Aflatoxina nemarcat sau aflatoxina n soluie test i aflatoxina marcat intr n competiie pentru numrul limit de legaturi la anticorpi. Cantitatea de aflatoxina n eantion este invers proporional cu cantitatea de aflatoxin marcat n soluie. Avantajul acestor teste este acela 61121 61

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine c necesit o cantitate sczut de anticorpi. Prezint totui i dezavantaje n ceea ce privete radioactivitatea, folosirea marcajelor izotopice.

4.2.1.2 Testele ELISA Dou formate principale ale testelor ELISA sunt dezvoltate: testele competitive i testele non-competitive. n testul ELISA tipic, legtur unui complex micotoxin-enzim cu anticorpi imobilizai este inhibat prin prezena micotoxinei n soluia test. Enzimele legate, catalizeaz transformarea substratului ntr-un complex colorat. Intensitatea culorii este invers proporional cu concentraia de aflatoxine. Peroxidaza care catalizeaz oxidarea substratului tetrametilbenzidina ntr-un complex bleu este enzima de marcaj cel mai des ntlnit. Metoda ELISA este frecvent ntlnit n cazul laboratoarelor centrale unde sunt frecvent realizate numeroase teste. Pentru o viziune rapid i tot odat detaliat a variantelor metodei, este prezentat tabelul 2.12.

Principiul metodei ELISA Testul se bazeaz pe reacia antigen - anticorp. Godeurile de microtitrare sunt acoperite cu anticorpi captur, directionai mpotriva anticorpilor anti - micotoxin. n fiecare godeu, att pentru standard, ct i pentru prob, se adaug conjugatul enzimatic i anticorpii anti micotoxin. Micotoxina liber i conjugatul enzimatic concureaz pentru siturile de legare ale anticorpilor de acoperire ai godeurilor (metoda imunoenzimatic competitiv). Conjugatul enzimatic nelegat este ndeprtat n faza de splare. Se adaug substrat/cromogen, observndu-se virarea culorii de la rou la albastru. Adugarea reactivului de stopare al reaciei determin modificarea culorii albastre n galben. Citirea probelor se realizeaz la 450 nm. Absorbana este invers proporional cu concentraia micotoxinei din prob. Tabel 20. : Aplicaii ale metodei ELISA n determinarea micotoxinelor n alimentaie. Toxina Modul de extracie Splare Limita de detecie 0/g/kg) Eantion

62121 62

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Aflatoxina B1 Metanol :ap 55 :45 Fragmentare n CHCI3, (v/v) evaporare, rediluare n eantion :solvant 1 :5 tampon salin de fosfat (v/w) (PBS) CHCl3 Evaporare si eantion:solvant 1 :5 descompunere in PBS (w/v) Metanol :tampon salin Concentrare prin fosfat 1 :1 (v/w) evaporare, diluare cu PBS Metanol :apa 55 :45 Diluare cu un tampon (v/v) CHCI3 eantion:solvant 1:5 (w/v) CHCl3 eantion:solvant 1:5 (w/v) CHCI3 eantion :solvant 1:5 (w/v) Metanol mprire n volume egale de NaHC03 mprire ntre 1,4 x NaHC03 (30 g/l) n metanol:apa 4 :10 (v/v) Evaporare i descompunere n PBS Splare pe cartu C18 i mprire n soluie 1 M NaHC03 2,9 Alune Unt de alune

Af latoxina Bl

Porumb

Aflatoxina Bl Aflatoxina Bl Ochratoxina

0,1 5-10 2,5

Arahide Alune,porumb Grau

Ochratoxina

0,5

Rinichi de porc

Ochratoxina Ochratoxina

0,06 0,5-1

Gru Gru

3-acetyl desoxynivaleol Toxina T2

Metanol :apa 6:4 (v/v) Diluare cu un tampon Cartu C18 Sep-Pak n faz invers

1 0,2

Orez Serum, lapte, urin

4.2.2. Metode de imunoafinitate Coloanele de imunoafinitate sunt preparate prin adsorbie de anticorpi pe un suport inert (tuburi de microtitrare , membrane, bile de sticl). Micotoxinele sunt prelevate de soluiile test prin anticorpi imunospecifici. Dupa ce impuritile din cartu au fost splate, micotoxinele sunt desorbite n metanol i transferate pe coloan n faza invers pentru a fi separate. Apoi determinarea se face cu UV. Folosirea coloanelor de imunoafinitate pentru prelevarea i concentrarea micotoxinelor prezint mai multe avantaje: creterea selectivitii, posibilitatea prelevrii din volume mari i asocierea cu alte tehnici analitice. Aceast tehnic 63121 63

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine prezint de asemena avantajul de a fi foarte rapid (10-15 minute) i nu presupune necesitatea unui personal calificat. Inconvenientul major al acestei tehnici este folosirea unei cantiti importante de anticorpi. Trebuie specificat faptul ca n cazul anumitor micotoxine ca aflatoxinele, o derivaie prealabil trebuie s fie realizat pentru a putea folosi tehnica fluorimetric cu lumina UV. 4.2.2.1. Minicoloanele Aceasta metod a fost inventat n 1976 n Tailanda. Aflatoxina este extras n metanol apos, urmat de o limpezire prin precipitare cu acetat de zinc sau sulfat de amoniu saturat. Aceast ultim metod permite mai ales reducerea coninutului de specii interferate. Aflatoxina este apoi pus n fluorisilul din minicoloan. Fluorescenta este apoi detectat cu ajutorul Luminii UV la 365 nm i comparat cu standardele. Metoda care face referire la calibrarea aflatoxinelor n cereale cu o limit de detecie de 20 ppb este metoda HoladayVelasco numit i minicoloane HV. Aceast metod a fost acreditat n 1980 de Federal Grain Inspection Service. Coloana (25cm-6mm) este realizat din aluminiu, silicagel i din fluorisil. Sulfatul de sodiu sau calciul anhidru este de asemenea folosit pentru a nltura toate urmele de umiditate. Metoda necesit o purificare prealabil a extractului, care se face de obicei printr-o simpl filtrare. 4.2.2.2.. Coloane de imunopurificare Spre deosebire de minicoloane care sunt de obicei folosite ca metode de calibrare, coloanele de imunoafinitate normale sunt mai degrab folosite n timpul unei purificri prealabile a eantionului naintea dozrii cantitative prin HPLC, de exemplu. Imunopurificarea const n purificarea aflatoxinelor sau ochratoxinelor plecnd de la extracia unui eantion prin trecere pe coloane de imunoafinitate care conin un suport prevzut cu anticorpi dirijai n mod special mpotriva micotoxinelor.

4.3. Metode cantitative 4.3.1. Teste kit Testele kit permit determinarea coninutului de micotoxine n laboratoare nespecializate. Testele kit folosite funcioneaz dup dou metode: metoda cromatografiei n strat subire i 64121 64

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine metoda imunologic. Avantajul folosirii testelor kit TLC este acela c un singur test poate fi folosit pentru determinarea mai multor micotoxine. Testele kit bazate pe metodele imunologice au avantajul uurinei i rapiditii metodei. 4.3.2 Cromatografie n strat subire (TLC) Cromatografia n strat subire este o metod folosit ncepnd cu anul 1990 pentru analiza aflatoxinelor. Pentru cromatografia n strat subire limita de detecie pentru dozarea aflatoxinelor este de 2 ppb, iar cea pentru tricotecine limita este de 50 ppb. De obicei, aceast metod este urmat de un test ELISA n cazul n care furnizeaz un rspuns pozitiv. S-a artat c cromatografia n strat subire poate fi aplicat n egal msur i n cazul analizei tricotecenelor, n particular a desoxinivalenolului (DON) i al zearalenonei (ZON). Principiul metodei Extracia micotoxinelor n solveni organici i separarea lor prin cromatografie n strat subire, identificarea micotoxinelor separate n lumina ultraviolet la lungimile de und de 254 nm i 366 nm fa de substana etalon i confirmarea prezenzei micotoxinelor identificate n spoturi prin reacii de derivatizare.

4.3.3 HPLC (high performance liquid chromatography- cromatografie cu lichid de nalt performan) Metoda HPLC realizeaz cuantificare de mare precizie. Este o metod de referin i poate realiza cuantificarea compusului de analizat aflat n cantiti foarte mici (ng). n cazul metodei HPLC dezvoltate limita de detecie poate ajunge pn la 0,02 ppm, n timp ce limita de cuantificare este de 0,06 ppm. HPLC este o metod folosit pentru analiza numeroaselor micotoxine ca: zearalenin, ochratoxina A, fumonisina B1, vomitoxina i alfatoxine. Dei este o metod cu un pre ridicat, care necesit experiena i timp, aceast metod este foarte mult folosit ca tehnica de confirmare n cazul determinrilor folosind cromatografia n strat subire sau folosind teste de imunoafinitate. Avantajele acestei metode raportat la 65121 65

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine cromatografia n strat subire: precizie. Exist dou tipuri de cromatografie cu lichid de nalt performan: cu faza normal i cu faza invers (RP-HPLC). Dac prima a avut o perioad de glorie acum 20 de ani, astzi cel mai des folosit este cea de a doua. Totui trebuie specificat faptul c n cazul folosirii (RP-HPLC), fluorescena aflatoxinelor B1 i G1 scade. Ansamblul cromatografic HPLC este un sistem compus dintr-un modul de separare i unul de detecie. Modulul de separare controleaz urmtorii parametri cromatografici: programare metoda, compoziie solvent, viteza de eluie, splarea garniturilor, injecia probei, semnalarea a unor evenimente externe, operarea detectorului prin interfaa IEEE- 488, termostatare coloan, termostatare probe, degajare eluent. Modul de separare const din dou sisteme- un sistem de administrare a solventului (compus din 4 pompe i o valv de realizare a gradientului) i un sistem de administrare a probei (compus din autosampler cu 5 carusele a cte 24 de flacoane i un injector automat) Modul de deteie - este un detector performant UV/Vis, cu dou canale, destinat aplicaiilor HPLC i opereaz n domeniul 190- 700 nm. Soft-ul prin intermediul cruia se fac achiziiile de date, ct i prelucrarea lor, este MILLENIUM. Proba de la care se pleac este reprezentat de cereale mcinate. Fiind o prob solid, trebuie s se fac extracia prealabil a compusului de analizat, DON fiind solubil n solveni folosii n mod curent pentru extracie. Deoarece extractul este foarte complex este necesar realizarea unei separri prealabile, care are rolul de a nltura eventualii interfereni, dar i de a proteja coloana cromatografic. Pentru separare s-a optat pentru utilizarea a dou tipuri de coloane, pe de o parte, coloane de iminoafinitate DONprep, care leag micotoxina, la trecerea acesteia prin coloana, de anticorpul specific aflat n umplutura coloanei, iar pe de alt parte, coloane multifuncionale, Mycosep 225 i coloana Multisep 216, care las s treac micotoxina prin coloana, n timp ce compui de interferen sunt reinui n umplutura coloanei. n selectarea metodei HPLC i a condiiilor iniiale se pornete de la proba de analizat. n urma extraciei i a separrii se obine o prob care conine molecule cu mase moleculare mici. Caracteristicile chimice ale compusului de analizat, DON-ul, indic abordarea unei cromatografii cu faza invers. Alegerea coloanei de separare se face cunoscnd ca DON-ul are masa molecular mai mic de 2000, este solubil n solveni apoi, nu este ionic i nici polar. Coloana de separare 66121 66

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine aleas pentru analiz este Symetry C18, avnd lungimea de 25 cm i diametrul interior de 0,46 cm. Faza staionar este octadecilsilanul, care prezint o retenie foarte bun deoarece lungimea lanului hidrocarbonat grefat pe suportul silanic este mare (18 atomi de carbon). Dimensiunea porilor este de 100 , iar dimensiunea particulelor este de 5 m, opiunea fiind justificat de masa molecular mic a compusului de analizat.

Partea a doua :PARTEA EXPERIMENTAL


1. Analiza microbiologic a cerealelor
Analiza microbiologica este indispensabil att pentru a asigura produsului o calitate i o conservabilitate mai bune, ct i pentru a garanta calitatea igienic i sigurana consumatorilor. Pentru tehnicile de analiz microbiologic, cantitative i calitative s-au cumprat din Piaa Central Galai cereale: porumb, orz i secar destinate consumului uman 67121 67

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine i animal. Probele au fost evaluate calitativ pentru a studia gradul de contaminare cu mucegaiuri. 1.1 Evaluarea calitativa- aprecierea aspectului coloniilor dezvoltate prin cultivarea boabelor de cereale pe medii selective (MMA) , n condiii de aerobioz la temperatura de 25 C. Materiale necesare: S-au folosit 15 probe de porumb, 14 probe gru, 13 probe orz i 10 probe de secar, medii de cultura specifice (must de mal cu agar), plci Petri. Mod de lucru: Mediul de cultur de MMA este fluidificat, repartizat n plci Petri. Dup solidificarea mediului se adaug n fiecare plac cu o penset steril boabe de porumb, gru, orz i secar. Plcile sunt termostatate la 25C timp de 5 zile. Coloniile de mucegai dezvoltate n plcile Petri sunt izolate (metoda n strii) i analizate microscopic si macroscopic. Dup termostatare s-a observat c gradul de contaminare a cerealelor cu mucegai este relativ mare ( tabel nr.1.) Astfel din 15 probe de porumb analizate, 80% au fost contaminate cu mucegai, la 14 probe de gru 71 % au fost contaminate cu mucegai, din 13 probe de orz 85 % au fost contaminate i din 10 probe de secar 70% au fost contaminate cu mucegai.

Tabel 21. Gradul de contaminare a cerealelor cu mucegai NUMR CEREALE PROBE Porumb Gru Orz Secar 15 14 13 10 PROBE CONTAMINATE CU MUCEGAI (%) 80 71 85 70

Identificarea microscopic s-a realizat cu ajutorul preparatelor umede. Obinerea preparatelor umede Principalele etape pentru executarea unui preparat umed: 68121 68

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine - pregtirea lamei i lamelei- lama curat i degresat se sterilizeaz trecnd ambele fee prin flacra becului de gaz. Lamela se terge cu hrtie de filtru; - realizarea suspensiei de celule pe lam se depune o pictur de ap steril pe lama de sticl sterilizat, n zona central. Pentru recoltarea celulelor aflate n medii lichide se folosete ansa sau pipet steril, iar pentru recoltarea microorganismelor aflate pe medii dense (solide sau solidificate) se folosete firul metalic. - realizarea preparatului ntre lam i lamel dup obinerea suspensiei de celule, lamela curat se sprijin i se deplaseaz pe lam la un unghi de 45, pn cnd devine tangent la pictur, apoi se las s cad peste aceasta. Lichidul n exces se absoarbe pe marginile lamelei cu hrtie de filtru. Un preparat bun nu trebuie s prezinte bule de aer, acestea putnd determina aglomerri de celule i ngreun studiul preparatului microscopic. Dup analiza microscopic i macroscopic a coloniile de mucegai dezvoltate pe mediul de cultur dup perioada de termostatare s-a observat prezena urmatoarelor specii de mucegai Aspergillus sp., Penicillium, Fusarium, Mucor i Rhizopus (Fig.nr.11,12,13, 14,). n urma graficilor obinute s-a observat c n probele de porumb a predominat ntr-un procent de 60% Aspergillus sp. n comparaie cu celelalte specii care au fost ntr-un procent mai mic Penicillium 20%, Fusarium 13% i Rhizopus 7%. n comparaie cu probele de gru procentul de Aspergillus a fost mai mic de numai 36% dar a predominat Penicillium ntr-un procentaj de 43% i procentul cel mai mic de 21% Fusarium. n probele de orz au fost observate mai multe speciile de micotoxine n numr de 5 iar procentul cel mai mare avndu-l tot Aspergillus ca i n probele de porumb celelalte avnd un procent de Penicillium 23%, Fusarium 15%, Rhizopus 15% i Mucor 8%. n probele de secar s-au observat doar 3 specii de micotoxine n care Fusarium a reprezentat 50% , Aspergillus 30% i Penicillium 20%.

69121 69

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Fig. 11. Principalele specii de mucegai prezente pe porumb

Fig. 12 Principalele specii de mucegai prezente pe gru

70121 70

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Fig.13 Principalele specii de mucegai prezente pe orz

Fig.14 Principalele specii de mucegai prezente pe secar

2. Evidenierea mucegaiurilor productoare de aflatoxine


Metoda se bazeaz pe cultivarea mucegaiurilor izolate sub form de culturi pure din alimente mucegite, pe mediu optim pentru elaborarea aflatoxinelor i determinarea calitativ sau semicantitativ a micotoxinelor prin cromatografie i studiu n lumin U.V cu lungimea de und 365 nm. Modul de lucru: Din culture pure ale mucegaiurilor din genul Aspergillus de pe cereale, cu ajutorul firului se recolteaz cantiti mici de spori i se fac inoculri n zona central a plcilor Petri n care se afl n prealabil repartizat mediul Hara cu agar( tabel.nr.2.) Plcile se incubeaz la 28 C timp de 5-7 zile, condiii optime pentru elaborarea aflatoxinelor. Dup acest interval, plcile se expun la radiaii ultraviolete cu = 365 nm. Deoarece culturile analizate au prezentat o zon fluorescent n jurul coloniei (fig nr.15), se presupune c mucegaiul prezint caracter toxicogen . Tabel nr.22. Compozitia mediului HARA Reactiv (NH4)H2PO4 K2HPO4 Cantitate 10 g 1g Reactiv Zaharoz HgCl2 Cantitate 30 g 5x 104 71121 71

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine MgSO47 H2O KCl FeSO47H2O 0,5 g 0,5 g 0,01 G Glucoz Agar 0,5 g 20 g

Fig.nr.15 Coloniile speciei Aspergillus cultivate pe Mediu HARA incubate la 25C timp de 7 zile observate cu i fr lumina UV

3.

Analiza calitativ a aflatoxinelor


Pentru analiza calitativ au fost realizate patru medii de cultur, un mediu lichid sintetic

(tabel nr.23) i trei medii solide pe baz de cereale (tabel nr.24). Mediul pe baza de cereale a fost obinut prin fierberea amestecului de cereale cu ap timp de 30 minute, filtrat i s-a adus la 1 litru cu ap distilat din fiecare mediu cte 100 ml au fost repartizate n pahare Erlenmeyer i sterilizate timp de 20 min. La 121C. Tabel 23 Compoziia mediului lichid sintetic Component Pepton Extract drojdie Cantitate 5g 20 g Component Sucroz Ap distilat Cantitate 40 g 1l

Tabel 24 Compoziia mediului pe baz de cereale Component Cereale mcinate (porumb,gru,orz i secar) Ap distilat 3.1 Pregtire inocul Cantitate 30 g 1l

72121 72

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Mucegaiul a fost crescut 7 zile pe MMA la 25 C, a sporulat. Sporii au fost suspendai n ap distilat cu 0,005 % agent Tween 80. Cu camera Thoma s-au numrat sporii i pentru a obine o suspensie cu 107 spori pentru inoculare s-au realizat diluii decimale. Numrare cu Camera Thoma Pentru numrare se plaseaz o pictur din suspensia de 73ositiv de analizat pe platforma central, n dreptul suprafeei delimitate. Peste suspensie se plaseaz o lamel care se sprijin pe cele dou platforme la terale i astfel ntre lamel i citometru se creeaz o pelicul de lichid cu nlime egal cu denivelarea platformei centrale (0,1 mm). Astfel, volumul de lichid plasat pe fiecare ptrel elementar este 1 cm3 . Preparatul obinut se 4*106

studiaz la microscop cu obiectiv cu grosisment x40, cnd n cmpul microscopic poate fi vizualizat un grup de 16 ptrele elementare, din care se numr celulele a cror suprafa se afl mai multe cmpuri microscopice ( n = 100) i se calculeaz numrul mediu de celule pe un ptrel elementar: n=

n
10*16

Numrul de celule prezente ntr-un cm3 de suspensie de analizat se determin cu formula: N= n4 106 k n care : n este numrul mediu de celule pe un ptrel elementar; k- coeficientul de diluie 3.2 Inoculare i incubare n mediu proaspt preparat s-a inoculate o suspensie cu 107 spori. Mediile au fost agitate 10 min. Pentru repartizarea sporilor n tot mediul. Mediile inoculate au fost termostatate la 28C, timp de 14 zile, staionar(fig. nr 6).

73121 73

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Fig. 16 Mediile de cultur dup perioada de termostatare 3.3 Extracie Dup terminarea perioadei de termostatare, s-a adaugat la fiecare prob 100 ml chloroform apoi s-a agitat timp de 24 h, 200 rot./min la 25C. Separarea de cloroform s-a fcut cu plnii de separare. Extracia cu cloroform se va repeta i cele dou extracte se vor amesteca i vor fi analizate prin cromatografie n strat subire. Extractele obinute au fost examinate la lampa U.V pentru a vedea fluorescena care indica prezena aflatoxinelor.

Fig. 19 Extractele obinute observate cu i fr lumina U.V Aparatura necesar pentru cromatografia n strat subire camera de vizualizare n ultraviolete cu filter de 254 nm i 366 nm; - plci pentru cromatografie n strat subire gata preparate cu strat de silicagel 60 G de 0.3 mm grosime sau plci sticla preparate n laborator cu dimensiunile de 200x200 mm sau 100x200 mm;

74121 74

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine - tanc pentru cromatografie sau camera cromatografic n form de U (vas paralelipipedic din sticl); - Shaker - rotovapor; - seringa Hamilton 10 l; - cilindri gradai de 50 ml, 100 ml, 250 ml; - ablon pentru aplicarea spoturilor pe plac; Reactivi cloroform; sulfat de sodiu anhidru; aflatoxine: B1; amestec de aceton ap 85:15 (V/V); amestec alcool metilic -ap 85:15 (V/V); - system de de solveni de developare: toluene- acetat de etil acid formic n proporie de 6:3:1(V/V/V); Prepararea sistemului de cromatografie n strat subire Plcile de sticl s-au spalat bine cu detergent, s-a cltit bine cu mult ap curent, apoi cu ap distilat i s-a uscat. nainte de ntinderea absorbantului s-a ters cu tampon de tifon cu alcool sau aceton, apoi cu tifon curat i uscat. Pe plcile astfel pregtite s-a aplicat amestecul absorbant cu ajutorul dispozitivului de aplicat absorbantului pe plac. Pentru a obine plci cu strat absorbant bine fixat s-a substituit 20 ml amidon 10 %. Grosimea stratului adsorbant aplicat pe plac trebuie s fie de 0.3 mm. Plcile s-a lsat s se usuce la temperature camerei n poziie orizontal timp de 12 h. Apoi sunt activate prin introducere n etuv, la 110C, timp de 1 h, dup care s-a scos imediat, sau s-a putut pstra ntr-un exsicator cu clorur de calciu. Dac s-a inut mai mult nainte de ntrebuinare trebuie activate din nou. Aplicarea spoturilor pe placa cromatografic 75121 75 silicagel G 60 clorur de metilen aceton (98: 2) amestec eter etilic eter de petrol(20 :30)

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Placa cromatografic pregtit, s-a aezat pe o suprafa plan, s-a marcat linia de start la 2 cm de la marginea plcii i s-a marcat linia pn la care trebuie s migreze 76ositiv solventului care se situeaz la 15 cm fa de linia de start. Reziduul rmas la evaporare conform punctului 1, s-a reluat cu solvent de spotulare din care s-a luat 10 l cu o micropipet i s-a aplicat pe placa cromatografic sub form de spoturi rotunde cu diametrul de 5 mm. Pe o plac cromatografic cu dimensiunile de 200x200 mm s-a putut aplica maximum opt spoturi la o distan de minim 1 cm fa de marginile laterale. Din soluiile etalon de micotoxine cu concentraia de 1 mg/ml i din proba de analiz s-a aplicat cu o microsering spoturi de 10 l soluie pe placa cromatografic n cele poziii posibile astfel: n poziia 1 se aplic 10 l soluie de aflatoxin B1(soluia etalon Ridasreen cu o concentratie de aflatoxine totale de 4050 ppt achiziionat de la firma Diamedix. S.R.L fig.nr.10); n poziia 2 se aplic 10 l soluie din prima prob de analiz; - n poziia 3 se aplic 10l soluie din a doua prob de analiz; n poziia 4 se aplic 10 l soluie din a treia prob de analiz; n poziia 5 se aplic 10 l soluie din a patra prob de analiz;

Fig.17.Soluia etalon de aflatoxin

Developarea

n tancul de developare s-a introdus amestecul de solveni de developare pn la o nlime de max 5 mm. Partea interioar a tancului s-a cptuit cu hrtie de filtru care s imbibe cu solvenii de developare pentru a asigura o atmosfer saturat cu vaporii developantului i pentru a evita evaporarea acestuia de pe plac n timpul developrii. Dup executarea acestor operaii tancul s-a nchis, s-a lsat 2030 minute pentru saturarea atmosferei cu vapori. 76121 76

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Dup care s-a introdus placa cromatografic cu captul pe care s-au aplicat spoturile n sistemul de solveni de developare din tanc. S-a nchis etan cu capacul i s-a lsat la developat pn cnd frontul solventului a atins linia marcat la 15 cm de linia de start. S-a scos placa, i s-a uscat la temperatura camerei timp de cteva minute.

Fig. 18 Operaia de developare

Identificarea micotoxinelor Pe placa cromatografic s-a examinat la lampa U.V (fig.18) i s-a ncercuit zonele cu fluorescen asemntoare cu a etaloanelor i s-a pulverizat cu soluie de derivatizare. Dup pulverizare, placa cromatografic s-a introdus n etuv timp de 2..3 minute, la o temperatur de 60C. Se examineaz din nou placa la lumina ultraviolet i dac fluorescena a suferit modificri similare celor din etaloane s-a confirmat prezena micotoxinei n proba analizat. Tipurile de micotoxine, raportul zonelor de fluorescen asemntoare etaloanelor i culoarea fluorescenei n ultraviolete sunt redate n tabelul 25. Raportul zonelor de fluorescen asemntoare cu cele ale etaloanelor (Rt) se calculeaz cu formula : Rt = d1/d2 n care : d1- distana dintre linia de start i centrul zonei fluorescente a micotoxinei, n mm; d2- distana dintre linia de start i linia pn la care a migrat frontal solventul, n mm;

77121 77

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

Fig. Nr. 18 Lampa U.V Derivatizarea i confirmarea micotoxinelor Pentru confirmarea unei micotoxine, se stabilete pe placa cromatografic zona asemntoare cu cea a etalonului micotoxinei respective i se pulverizeaz cu soluie de derivatizare. Dup pulverizare zona i etalonul devin de culoare careacteristic micotoxinei. Dup realizarea analizelor se ntocmesc buletine de analiz n care trebuie s se menioneze urmtoarele: datele necesare pentru identificarea lotului; rezultatele obinute; SR 9597/19:1993

Tabel 25 Caracteristici de identificare a micotoxinelor prin cromatografie n strat subire Nr. Denumirea Rt Culoarea Culoarea n Substanel Culoarea n crt micotoxinei i n UV la UV la 336 e de UV la 366 forma 254 nm nm vizualizar nm dup e apreciere 1 Aflatoxina B1 0.21 Albastru Albastru Acid Galben strlucitor strlucitor sulfuric 20 verzui % 2 Aflatoxina B2 0.18 Albastru Albastru Acid Galben violet strlucitor sulfuric 20 verzui % 3 Aflatoxina G1 0.15 Albastru Verde Acid Galben verzui strlucitor sulfuric 20 verzui % 4 Afaltoxina G2 0.12 Verde Verde Acid Galben 78121 78

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine strlucitor 5 6 Zearalenona (T2) Ochratoxina A 0.55 0.42 Albastru deschis Bleu strlucitor strlucitor sulfuric 20 % Verde Amestec albstrui de diazotare Bleu intens Hidroxid strlucitor de sodium 0.1N Acid sulfuric 50% n metanol

Vizibil brun nchis Albastru intens strlucitor Bleu-verde intens strlucitor

Concluzii
Micotoxinele sunt substane chimice unele simple sau unele complexe; metabolii produi de miceii dezvoltai pe un substrat care poate s produc mbolnvirea celor ce consum produsul respectiv. Cercetrile efectuate a pus n eviden 240 de mucegaiuri toxicogene, identificndu-se peste 2000 substane toxice, iar o anumit specie de mucegai poate produce un complex de substane cu structuri diferite i aceeai toxin poate fi produs de mai multe mucegaiuri. Prezena micotoxinelor n alimente nu constituie o problem nou, dar este o problem de actualitate. Eradicarea total a acestor contaminani de origine natural este dificil, folosirea metodelor de decontaminare prezentnd un interes major. Diversitatea propietilor fizice i

79121 79

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine chimice ale diferitelor familii de micotoxine care prezint risc pentru sntate face ca fiecare metod de decontaminare s fie diferit de la caz la caz. Amoniacarea materiilor prime asociat sau nu cu folosirea adsorbanilor din familia aluminosilicailor prezint un interes major n cazul contaminrii cu aflatoxine. n ceea ce privesc alte micotoxine, numrul metodelor fiind ineficiente, nici o metod chimic sau fizic nu poate reprezenta o metod garantat pentru o decontaminare total. Eliminarea fizic (curire i separare) a materiilor prime contaminate ofer un interes foarte mare. Prevenirea dezvoltrii mucegaiurilor, pe cmp, sau n timpul depozitrii constituie deci un mod de a lupta mpotriva unei contaminri a alimentelor cu fumonisine, tricotecine, zearalenona, ochratoxine. Folosirea ulterioar a tratamentelor fizice sau chimice cu ajutorul adsorbanilor nu poate fi considerat ca fiind o metod eficient. Eficacitatea sczut a acestor tratamente n termen de decontaminare micotoxicologic nu nseamn c aceste metode nu trebuie s fie folosite. Datorit adaptrii la diferite condiii de mediu, micotoxinele se ntlnesc n toate mediile naturale. Se gsesc n special pe sol, de unde ajung n aer sub form de spori sau fragmente de hife. Temperatura i umiditatea sunt principali factori care favorizeaz contaminarea cerealelor cu micotoxine. ntre aceti factori exist o strns legtur, la care este posibil dezvoltarea microorganismelor; astfel cu ct este mai ridicat coninutul n ap al boabelor, cu att este mai extins zona de temperatur la care se observ creterea numeric a microbiotei. Analiznd valorile temperaturii i ale aw, putem spune c sunt condiii optime pentru creterea i proliferarea fungic la t>20C, aw-0.75 i umiditatea 14 %. Prevenirea contaminrii cerealelor cu micotoxine presupune: Aplicarea practicilor bune de lucru; Determinarea coninutului de ap al cerealelor i spaiului de depozitare; Verificarea temperaturii; Meninerea unei valori a activitii apei de 0.7 sau inferioar verificarea temperaturi;

Trebuie s se realizeze verificri regulate de temperatur (la o saptmn sau maxim dou) pentru a evita pierderi considerabile de produs. O cretere anormal a temperaturii, poate fi semnul unui debital degradrii cerealelor.

80121 80

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine Depozitarea se va realiza n silozuri cu sisteme de ventilaie, care au rolul de a menine cerealele la o temperatur suficient de sczut i permite deasemenea n anumite cazuri, obinerea unei uscri lente. Recoltarea se va face la manipularea complet a plantei; Prevenirea infestrii cu insecte; Folosirea de soiuri rezistente la contaminarea cu micotoxine; Astzi, tot mai mult problema micotoxinelor din nutreuri i alimente este abordat nu numai din prisma profilaxiei infestrii i dezvoltrii fungilor, ci i prin cea a reducerii efectelor duntoare a micotoxinelor din hrana contaminat (inclusiv intensificarea rspunsului imun al organismului). Modul acesta de a privi lucrurile pleac de la modificrile nutriionale datorate micotoxinelor. Dar, exist nenumrate date care arat c n ciuda rezultatelor pozitive obinute n domeniul cercetrii micotoxinelor din hran, mai sunt nc multe necunoscute. n permanen sunt descoperite noi micotoxine dar limitarea efectelor acestora i a cantitilor de reziduuri n produsele animalelor ridic rspunderi tot mai mari biotehnologiilor responsabile de protecia consumatorilor. Att micotoxinele, ct i fungi care le produc au ca efecte deteriorarea i descompunerea plantelor i a alimentelor, n diferite grade. n principiu acestea pot invada i crete pe orice tip de hran i n orice moment, att naintea recoltrii, ct i n timpul depozitrii, precum i n alimentele prelucrate sau n amestecul de hran. Detectarea lor n sau pe hran depinde de tipul hranei, organismele implicate i gradul de invazie. Studiile au demonstrat c porumbul este cereala cea mai susceptibil privind contaminarea cu aflatoxine, n special n clima care favorizeaz dezvoltarea miceilor Aspergillus flavus i Aspergillus parasiticus n culturi, precum i n finuri furaje. Problemele puse de micotoxine sunt relativ recente, tehnicile care permit analiza lor i legislaia ntr-o continu evoluie. La ora actual HPLC, se impune ca metod tehnica de lucru pentru analiza cantitativ a majoritii micotoxinelor. Cum a demonstrat acest studiu al metodologiei analitice analiza micotoxinelor constituie o problem complex i necesit supervizarea i controlul organismelor competente, validnd testele interlaboratoriale ale tehnicilor specifice fiecrei micotoxine. Aceste tehnici sunt de dou tipuri: calitative i cantitative. Cromatografie n strat subire continu s fie o metod oficial de analiz; este o metod ieftin, rapid i practic se pot analiza simultan mai multe micotoxine prezint probleme n cazul multideteciei deoarece este dificil ca n acelai timp s se realizeze mai mult de o 81121 81

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine purificare (sistemul de limpezire folosit poate fi foarte eficient pentru un tip de produs i mai puin eficient pentru alt tip de produs). HPLC este o tehnic din ce n ce mai utilizat i este aplicat n mai multe metode oficiale; este scump i nu permite multidetecii datorit coloanelor de imunoafinitate care sunt specifice fiecrei micotoxine n parte. ELISA este o metod care permite att determinarea cantitativ ct i calitativ a micotoxinelor.

Bibliografie
1. GABRIELA BAHRIM, ANCA NICOLAU, CLEMANSA TOFAN, MARGARETA ZARA, Mirobiologia produselor alimentare Tehnici i analize de laborator, Editura AGIR 2002. 2. CLEMANSA TOFAN, Microbiologie alimentar, Editura AGIR, Bucureti, 2004. 3. VALENTINA DAN, BRAD SEGAL, RODICA SEGAL, VITALIE TEODORU, Determinarea calitii produselor alimentare, Editura CERES, 1985. 4. N. GEORGESCU, C. SAVU, Sigurana alimentelor, riscuri i beneficii, Editura SEMNE, Bucureti, 2004. 5. LATGE J-P, Aspergillus fumigatus and aspergillosis, Clinical Microbiologz Rewiewes, 1999. 6. CLEMANSA TOFAN, Igiena i securitatea produselor alimentare, Editura AGIR, 2004 7. GABRIELA BAHRIM, VALENTINA DAN,CRISTINA KRAMER, ANCA NICOLAU, MARGARETA ZARA, Memorator pentru mucegaiuri, Editura Evrika, Brila. 8. VALENTINA DAN, Microbiologia cerealelor i produselor derivate, Universitatea Galai, 1975. 82121 82

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine 9. ABDEL-WAHHAB M.A., NADA S.A. et AMRA H.A., Effect of aluminosilicates and bentonite on aflatoxin-induced developmental toxicity in rat. J. Appl. Toxicol., 1999, 10. ABO-NORAG M., EDRINGTON T.S., KUBENA L.F., HARVEY R.B. et PHILLIPS T.D., Influence of a hydrated sodium calcium aluminosilicate and virginiamycin on aflatoxicosis in broiler chicks. Poult. Sci., 1995. 11. ADEMOYERO A.A. et DALVI R.R., Efficacy of activated charcoal and other agents in the reduction of hepatotoxic effects of a single dose of aflatoxin B1 in chickens. Toxicol. Lett., 1983. 12. ANGENAULT J. : La chimie: dictionnaire encyclopdique, Pages, Dunod, Paris, 1991. 13. ANONYMOUS : Classe silicates, http://www2.biam2.org/www/ Cla88482.html, page consulte le 10 octobre 2000. 14. ANONYMOUS , The zeolite group of minerals, http://mineral.galleries. com/minerals/silicate/zeolites.htm, page consulte le 10 octobre 2000 15. BENNETT G.A., RICHARD J.L. et ECKHOFF S.R. : Distribution of fumonisins in food and feed products prepared from contaminated corn. Adv. Exp. Med. Biol., 1996, 392, 317-22. 16. BONNA R.J., AULERICH R.J., BURSIAN S.J., POPPENGA R.H., BRASELTON W.E. et WATSON G.L., Efficacy of hydrated sodium calcium aluminosilicate and activated charcoal in reducing the toxicity of dietary aflatoxin to mink. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 1991. 17. BRACKETT R.E. et MARTH E.H., Ascorbic acid and ascorbate cause disappearance of patulin from buffer solutions and apple juice. J. Food Protect., 1979. 18. CARSON M.S. et SMITH T.K., Role of bentonite in prevention of T2 toxicosis in rats. J. Anim. Sci., 1983. 19. CHANG H.L., determination chromatography Off. Anal. Chem., DEVRIES J.W., LARSON P.A. et PATEL H.H., Rapid of deoxynivalenol (vomitoxin) by liquid using modified Romer column cleanu., J. Assoc. 1984.

20. CONWAY H.F., ANDERSON R.A. et BAGLEY E.B., Detoxification of aflatoxin-contaminated corn by roasting. Cereal Chem., 1978. 83121 83

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

21. DALVI R.R. et ADEMOYERO A.A. : Toxic effects of aflatoxin B1 in chickens given feed contaminated with Aspergillus flavus and reduction of the toxicity by activated charcoal and some chemical agents. Avian Dis., 1984. 22. DALVI R.R. et MCGOWAN C., Experimental induction of chronic aflatoxicosis in chickens by purified aflatoxin B1 and its reversal by activated charcoal, phenobarbital, and reduced glutathione. Poult. Sci., 1984. 23. DECKER W.J. et CORBY D.G., Activated charcoal adsorbs aflatoxin B1. Vet. Hum. Toxicol., 1980. 24. DICKENS J.W. et WHITAKER T.B., Efficacity of electronic color sorting and hand picking to remove aflatoxin contaminated kernes from commercial lot of shelled peanuts. Peanut Sci., 1975. 25. DOKO M.B. et VISCONTI A., Occurrence of fumonisins B1 and B2 in corn and corn-based human foodstuffs in Italy. Food Addit.Contam., 1994. 26. DOYLE M.P. et MARTH E.H., Bisulfite degrades aflatoxins: effect of citric acid and methanol and possible mechanism of degradation. J. Food Protect., 1978. 27. DOYLE M.P. et MARTH E.H., Bisulfite degrades aflatoxins: effect of temperature and concentration of bisulfite. J. Food Protect., 1978. 28. FRIEND D.W., TRENHOLM H.L., YOUNG J.C., THOMPSON B.K. et HARTIN K.E., Effect of adding potential vomitoxin (deoxinivalenol) detoxicants for a F. graminearum inoculated corn supplement to wheat diets fed to pigs. Can. J. Anim. Sci., 1984. 29. GUERRE P., Principales mycotoxicoses observes chez les ruminants. Le Point Vtrinaire, 1998. 30. GUERRE P., GALTIER P. et BURGAT V., Le mtabolisme : un facteur de susceptibilit la toxicit des aflatoxines. Revue Md. Vt., 1996. 31. HUFF W.E., KUBENA L.F., HARVEY R.B. et PHILLIPS T.D., Efficacy of hydrated sodium calcium aluminosilicate to reduce the individual and combined toxicity of aflatoxin and ochratoxin A. Poult. Sci., 1992. 32. AZERST G, The affects of misture and temperature on growth and spore germination in some fungi, J.STORED Prod. Res.5.(1969). 84121 84

Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine

33. FROBISHER M., Fundamental of Microbiology, London, 1965. 34. Mycotoxin prevention and control in foodgrains: Aflatoxin sampling and determination in bulk maize for export, Pin PithayaAcharlyakul, 1998. www.fao.org/inpho/vlibrarz/x0036e/x0036EOf.htm). 35. Mycotoxin : (Woodson- Tenent Laboratories)(http://www.wtlabs.com/mzco.htm). 36. Mycotoxin prevention and control in foodgrains: Aflatoxin analytical methods for groundnuts, D.M. Willson, 1999. 37.Mycotoxin prevention and controlin foodgrains: Palstc minicolumn for aflatoxin detection, Sritsit Karunyavanij,(www.fao.org/inpho/vlibrary/xoo36e/x0036Eoh.htm) 38.Mycotoxin prevention and control in foodgrainns: Aflatoxin anlytical methods for groundnuts,D.M. Wilson, 1999. 39. Pagini web www.mold.ph www.mycology.adelaide.edu.au www.vscht.cz www.tamagawa.ac.ip ]

85121 85