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REPRODUCCIN Y CRECIMIENTO MICROBIANO

REPRODUCCIN Y CRECIMIENTO MICROBIANO. Crecimiento individual y crecimiento de poblaciones. Matemtica del crecimiento microbiano. Fases de la curva de crecimiento de microorganismos. Mtodos para la estimacin del crecimiento microbiano. OBJETIVOS ESPECFICOS Al finalizar el tema el estudiante podr: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Describir el proceso de fisin binaria de las bacterias. Establecer la diferencia entre crecimiento individual y crecimiento de poblaciones. Definir Tiempo de Generacin. Calcular el Tiempo de Generacin por el mtodo grfico. Deducir la frmula de crecimiento exponencial. Dadas 3 de las variables de la frmula de crecimiento exponencial, calcular el dato que falta. Dados los resultados de un experimento de multiplicacin bacteriana, hacer la grfica correspondiente, identificando cada una de sus fases. Resumir las caractersticas de cada una de las fases de la curva de crecimiento microbiano.

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Enumerar los mtodos para medir el crecimiento microbiano y explicar, resumidamente, el fundamento de cada uno de ellos. Dados los resultados de una determinacin del nmero de clulas viables o del nmero de clulas viables, realizar los clculos correspondientes. Explicar el efecto que tienen los cambios en la concentracin de nutrientes, sobre el crecimiento bacteriano. Describir las modalidades de reproduccin de los hongos. Explicar el ciclo de multiplicacin de virus animales.

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PROCESOS DE REPRODUCCIN DE LAS BACTERIAS Entre los procesos de reproduccin de las bacterias tenemos: FISIN BINARIA Es un proceso en el cual de la divisin de una clula resultan dos (2) clulas, usualmente ambas clulas hijas tienen el mismo tamao y forma. Este es el proceso ms comn y sin duda el ms importante en el ciclo de crecimiento de las poblaciones bacterianas. En un cultivo en crecimiento la clula bacteriana aumenta de tamao, replica su ADN y la pared celular y la membrana citoplasmtica comienzan a crecer hacia adentro a partir de direcciones opuestas formando una particin conocida como septo. A cada lado del septo se ubica una copia del cromosoma bacteriano y los otros constituyentes celulares que le permitan a cada clula hija vivir como clula independiente. Luego se separan como dos clulas hijas resultantes de la divisin de la clula madre original.

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Existen en las bacterias otros procesos reproductivos pero son menos comunes, por ejemplo especies del gnero Streptomyces producen muchas esporas reproductivas por microorganismo y cada espora da origen a un nuevo microorganismo. Otras bacterias como las del gnero Nocardia, presentan extensos crecimientos filamentosos los cuales se fragmentan en pequeas unidades que al desarrollarse originan nuevos microorganismos. Algunas bacterias como las especies del gnero Hyphomicrobium se reproducen por gemacin, lo cual consiste en que una clula madre emite un brote, ste aumenta de tamao y posteriormente se separa como una nueva clula. CRECIMIENTO Se define crecimiento como un aumento en la cantidad de constituyentes y estructuras celulares, cuando hay crecimiento en ausencia de divisin celular hay aumento en el tamao y peso de la clula. Mientras que cuando el crecimiento es seguido de divisin celular hay un aumento en el nmero de clulas. Es importante distinguir entre el crecimiento de clulas individuales y el crecimiento de poblaciones, ya que en los microorganismos debido a su pequeo tamao no se hacen estudios de crecimiento individual sino estudios de crecimiento de poblaciones. El crecimiento de una poblacin es el aumento del nmero de clulas como consecuencia de un crecimiento individual y posterior divisin. El crecimiento de una poblacin ocurre de una manera exponencial. El crecimiento exponencial es una consecuencia del hecho de que cada clula se divide dando dos (2) clulas hijas, las cuales al dividirse darn cada una dos clulas hijas, as es que en cada perodo de divisin la poblacin se duplica. La velocidad de crecimiento exponencial se expresa como tiempo de generacin (G) y este se define como el tiempo que tarda una poblacin en duplicarse. Los tiempos de generacin varan ampliamente entre los microorganismos, algunos crecen rpidamente y presentan tiempos de generacin de unos 30 minutos y otros tienen tiempos de generacin de varias horas o incluso das. En la siguiente tabla se presenta un experimento de crecimiento partiendo de una clula (bacteria), que tiene un tiempo de generacin de 30 minutos.
Tiempo (horas) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 . . 10 Nmero de Log del nmero de clulas clulas 1 0 2 0,301 4 0,602 8 0,903 16 1,204 32 1,505 64 1,806 128 2,107 256 2,408 512 2,709 1024 3,0103 . . . . 1048576 6,021 3

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En un grfico de los resultados del nmero de clulas tanto en escala aritmtica como en escala logartmica en funcin del tiempo transcurrido, podemos observar que en el grfico aritmtico se obtiene una curva con una pendiente que crece constantemente, mientras que si transformamos el nmero de clulas en logaritmo y se grafican estos valores en escala logartmica y el tiempo en escala aritmtica se obtiene una lnea recta.

Este tipo de grfica semilogartmica es la forma ms simple para determinar el tiempo de generacin por el mtodo grfico, como podemos observar en la grfica siguiente.

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MATEMATICA DEL CRECIMIENTO EXPONENCIAL Cuando se inocula una bacteria en un medio y ha transcurrido el tiempo de generacin de este microorganismo, se forman dos clulas, despus de otra generacin cuatro clulas despus de la tercera generacin ocho clulas. Es decir en cada generacin sucesiva se duplica la poblacin. La relacin que existe entre el nmero de clulas y las generaciones de un cultivo creciendo en forma exponencial, puede deducirse matemticamente de la manera siguiente: Se designa como: x = N de bacterias al tiempo 0 y = N de bacterias al tiempo t t = tiempo en crecimiento exponencial Al tiempo 0 y = x Despus de: 1 generacin y = x.2

2 generaciones y = (x.2) 2 =22 x 3 generaciones y = (22 x) 2= 23 x n generaciones y = 2n x Para calcular n = (nmero de generaciones) Resolviendo la ecuacin (1) para n se tiene: log y = log x + n log 2 (1)

n=

logy logx log2

Si se sustituye en la ecuacin anterior log 2 por su valor 0.3010, se tiene que 1/0.3010 = 3.3 n = 3.3 log y/x Por consiguiente, aplicando la ecuacin anterior puede calcularse el nmero de generaciones que han tenido lugar, siempre que se conozca la poblacin inicial x, y la poblacin y despus del tiempo t. El tiempo de generacin G es igual a t (tiempo transcurrido en fase exponencial para llegar de x a y) dividido por el nmero de generaciones n, o sea: G= t/n

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Ejemplo Se tienen 1000 bacterias en un medio de cultivo ptimo y despus de 4 horas de incubacin, creciendo exponencialmente, se obtienen 100.000 bacterias. Calcule el tiempo de generacin. x = 1000 y = 100.000 T = 4 horas G =? n = 3.3 log y/x G =T / n G = 240 / 6.6 = 36,36 minutos n = 3.3 log 100.000/1000 = 6.6 generaciones

CURVA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO En la figura se ilustra una curva de crecimiento de una poblacin bacteriana. Esta curva se divide en cuatro fases denominadas fase de latencia, fase exponencial o fase logartmica, fase estacionaria y fase de muerte.

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Fase de latencia Cuando una poblacin bacteriana es inoculada en medio fresco, el crecimiento usualmente no comienza de inmediato sino despus de un tiempo llamado de latencia, que puede ser corto o largo dependiendo de las condiciones. La fase de latencia representa un periodo de transicin para los microorganismos cuando son transferidos a una nueva condicin. En esta fase se producen las enzimas necesarias para que ellos puedan crecer en un nuevo medio ambiente. En esta fase no hay incremento en el nmero de clulas, pero hay gran actividad metablica, aumento en el tamao individual de las clulas, en el contenido proteico, ADN y peso seco de las clulas. Si un cultivo que est creciendo en fase exponencial es inoculado al mismo medio de cultivo bajo las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de latencia y el crecimiento exponencial sigue a la misma velocidad. Si el inculo se toma de un cultivo viejo (fase estacionaria) y se inocula en el mismo medio, generalmente se presenta la fase de latencia esto se debe a que las clulas generalmente agotan una serie de coenzimas esenciales u otros constituyentes celulares y se requiere cierto tiempo para su resntesis. Tambin se observa latencia cuando el inculo est formado por clulas que han sido daadas pero no muertas, bien sea por tratamiento con calor, radiaciones o sustancias qumicas, puesto que requieren reparar dicho dao. En el caso de que una poblacin se transfiera de un medio de cultivo rico a un medio pobre, se observa latencia puesto que es necesario que las clulas para poder seguir creciendo tengan una serie de enzimas para poder sintetizar algunos metabolitos esenciales que no estn presentes en el medio. Fase exponencial o fase logartmica Es el perodo de la curva de crecimiento en el cual el microorganismo crece exponencialmente, es decir que cada vez que pasa un tiempo de generacin la poblacin se duplica. Bajo condiciones apropiadas la velocidad de crecimiento es mxima. Las condiciones ambientales (temperatura, composicin del medio de cultivo, etc.) afectan a la velocidad de crecimiento exponencial. Fase estacionaria En cultivos en recipientes cerrados una poblacin no puede crecer indefinidamente en forma exponencial. Las limitaciones del crecimiento ocurren ya sea por agotamiento de algn nutriente esencial, por acumulacin de productos txicos, porque se alcance un nmero de clulas elevado para el espacio disponible o por una combinacin de las causas anteriores. Este periodo durante el cual cesa el crecimiento se conoce como fase estacionaria. Fase de muerte Si la incubacin contina despus de que una poblacin microbiana alcanza la fase estacionaria, las clulas pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero va a comenzar una dismi7

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nucin progresiva en el nmero de clulas viables y cuando esto ocurre se dice que la poblacin ha entrado en fase de muerte. FORMA DE REPLICACIN DE LOS MICOPLASMAS Los micoplasmas se dividen por fisin, pero este proceso no va a ser idntico al de las otras bacterias, pues en el caso de los micoplasmas la divisin citoplasmtica no est sincronizada con la replicacin del genoma como ocurre en las otras bacterias, sino que la divisin citoplasmtica est retardada resultando en la formacin de filamentos multinucleados, los cuales posteriormente forman cadenas de clulas esfricas y luego se fragmentan dando origen a clulas individuales.

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REPRODUCCIN DE LAS RICKETTSIAS Las rickettsias se reproducen por fisin binaria. Ninguna especie ha sido cultivada extracelularmente y se desconocen sus requerimientos nutricionales. En el laboratorio se cultivan en el saco vitelino de embriones de pollo o en cultivos de tejidos. Generalmente crecen en el citoplasma de la clula husped REPRODUCCIN DE LAS CLAMIDIAS Las clamidias se replican por fisin binaria, pero sufren variaciones morfolgicas durante su ciclo de replicacin, el cual resumidamente consiste en lo siguiente: 1. Las formas infecciosas denominadas cuerpos elementales (C.E.), miden 0,3 m de dimetro aproximadamente, se unen a la clula husped. Los cuerpos elementales entran a la clula husped mediante un mecanismo similar a la fagocitosis, al cual se le denomina endocitosis. Una vacuola derivada de la membrana celular rodea los cuerpos elementales. Por un mecanismo no muy bien entendido, una hora despus, los cuerpos elementales sufren un proceso de reorganizacin y cambios metablicos, transformndose en unas estructuras que miden alrededor de 1 m de dimetro, y son menos densos que los cuerpos elementales, a estas estructuras se les denomina cuerpos iniciales (C.I.) o cuerpos reticulares (C.R.). Estos cuerpos reticulares o iniciales comienzan a dividirse por fisin binaria dentro de la vacuola, utilizando energa derivada del ATP generado por la clula husped, produciendo mltiples cuerpos reticulares. Despus de 24 a 72 horas los cuerpos iniciales se reorganizan y condensan para formar los nuevos cuerpos elementales. La clula husped se rompe y libera los cuerpos elementales que son capaces de infectar otras clulas.

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MEDICIN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO El crecimiento microbiano se mide por cambios sucesivos en el nmero de clulas o por el aumento de peso de la masa de las clulas. Hay varios mtodos para enumerar las clulas o estimar la masa de stas. 1. - Determinacin del nmero de clulas totales 1.1 Recuento directo mediante contadores electrnicos Los contadores electrnicos diseados para contar glbulos rojos se puede usar para este fin. Esencialmente un contador electrnico consta de dos cmaras que estn separadas por un material que no conduce la corriente, en este material no conductor hay un orificio de un tamao similar al de las clulas a ser contadas. Cada cmara contiene un electrodo, la suspensin de clulas a ser contadas se coloca en una de las cmaras y se aplica presin para que las clulas pasen a la otra cmara a travs del orificio, cada vez que una clula pasa a travs del orificio ocasiona un cambio en la conductividad elctrica que es registrado por un dispositivo electrnico y de esta manera el contador indica el nmero de clulas en esa suspensin. Las limitaciones de este mtodo son las siguientes: Se cuentan clulas vivas y muertas. Las suspensiones deben estar libres de partculas diferentes a los microorganismos que estamos contando por que el aparato no puede distinguir entre una u otra.

1.2 Recuento directo al microscopio Se determina directamente el nmero de clulas contndolas al microscopio con la ayuda de cmaras especiales que albergan un volumen conocido de liquido (Hemocitmetros, Cmara de Petroff- Hausser). El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rpida de estimar el nmero de clulas microbianas. Sin embargo, presenta algunas limitaciones: No se pueden distinguir las clulas vivas de las clulas muertas. Las clulas muy pequeas son difciles de contar. La precisin es difcil de lograr El mtodo no es adecuado para suspensiones celulares de baja densidad, es decir las soluciones deben contener aproximadamente 107 clulas/mL o ms. A continuacin se desarrolla, como ejemplo, el recuento directo al microscopio utilizando la cmara de Petroff-Hausser. En este mtodo la suspensin de la muestra se coloca en la cavidad cuadriculada de dimensiones conocidas de la cmara, y se tapa con el cubre objetos. Como se conoce el rea de las cuadrculas y la altura de la cmara de recuento, el volumen ocupado por la suspensin en cada cuadrculas queda determinado. Por tanto, para obtener el nmero de bacterias por mililitro de suspensin, todo lo que se requiere es contar el nmero de microorganismos en varias cuadriculas, calcular el promedio de recuento por cuadrcula y multiplicar este promedio por el factor correspondiente.
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Cmara de Petroff-Hausser

Rebordes que soportan el cubreobjetos

El retculo del fondo est dividido en 25 cuadrados Volumen de la cmara= 0,02 mm3
Aqu se coloca la muestra teniendo cuidado que no se derrame

rea de la cmara 1 mm2 Para calcular el nmero de clulas por mL de muestra: 12 x 25 = 300 (nmero de clulas en 0,02 mm3) 300 x 50= 15000 (nmero de clulas en 1 mm3) 150000 x 1000 = 1,5 x 107 (nmero de clulas en 1 mL)

Observacin al microscopio: se cuentan todas las clulas del cuadro grande= 12 clulas (en la prctica se cuentan varios cuadros y se hace el promedio

2. - Determinacin de clulas viables En los mtodos anteriores se determina el nmero de clulas totales, pero en muchos casos nicamente interesa contar clulas viables. Se define como clula viable, aquella clula que es capaz de dividirse y forma una progenie y la manera usual para realizar un recuento de clulas viables es determinando el nmero de clulas en la muestra, capaces de formar colonias sobre un medio de cultivo slido (agar) y esto se conoce como recuento en placa. En este procedimiento se realizan diluciones seriadas de la muestra y se inoculan pequeos volmenes conocidos, de cada una de las diluciones, en placas de Petri conteniendo un medio slido adecuado estril y se extiende con una varilla de vidrio (mtodo de siembra en placa por extensin o diseminacin) o en placas de Petri estriles a las cuales se les adiciona un medio slido fundido y enfriado a 45C y se mezclan bien (mtodo de siembra por incorporacin o de vertido en placa), luego se incuban en las condiciones optimas hasta que aparezcan las colonias correspondientes. Se asume que cada colonia proviene de la divisin sucesiva de una sola clula, conociendo el volumen sembrado y la dilucin de la cual proviene y contando el nmero de colonias en la placa correspondiente se puede calcular el nmero de clulas viables en la muestra. Debido a que es difcil saber si una sola
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bacteria dio origen a una colonia, se expresa usualmente el nmero de clulas viables como unidades formadoras de colonias (UFC). Para realizar el recuento se seleccionan las placas de la que contengan entre 25 y 250 colonias.

A pesar de las deficiencias que pueda presentar la tcnica del recuento en placas, se usa frecuentemente, y con resultados satisfactorios, para la estimacin de las poblaciones bacterianas en la leche, agua, y otros productos. Es fcil de realizar y se adapta a la medicin de poblaciones de cualquier densidad. En el siguiente esquema se presenta un ejemplo de un recuento en placa haciendo diluciones seriadas con un factor de dilucin de 100, para ello se toma 1 mL de la muestra, la cual puede ser un cultivo de bacterias o cualquier otra muestra que contenga bacterias en suspensin, se aade a un frasco de dilucin que contiene 99 mL del diluente adecuado, se agita y se toma de esta primera dilucin (1:100 10-2) 1 mL y se transfiere a un segundo frasco de dilucin que contiene 99 mL del diluente adecuado, se agita y se toma de esta segunda dilucin (1:10.000 10-4) 1 mL y se transfiere a un tercer frasco de dilucin que contiene 99 mL del diluente adecuado (esa corresponde a la dilucin 1:1.000.000 10-6). De cada se siembran por triplicado muestras de 1 mL y se incuban en posicin invertida por 24 horas o ms y se cuentan las colonias.

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Por ejemplo si el promedio de las 3 placas de la dilucin 1/1000, es de 32 colonias entonces el recuento es de 32.000 UFC/mL de muestra. Otro procedimiento de recuento de clulas viables es el de la tcnica de la membrana filtrante y consiste en hacer pasar la muestra que contiene los microorganismos a travs de una membrana de acetato de celulosa (0.45m) colocada en un dispositivo de filtracin. Los microorganismos quedan retenidos en la membrana filtrante, la cual se retira despus de terminado el proceso de filtracin y se coloca en una placa de Petri que contiene una almohadilla humedecida con un medio de cultivo adecuado. Despus del periodo de incubacin, aparecen sobre la superficie de la membrana las colonias originadas por el crecimiento de los microorganismos. Esta tcnica permite el anlisis de grandes cantidades de la muestra, tratndose por ejemplo de agua o de aire, pueden filtrarse a travs de la membrana grandes volmenes, concentrando as la poblacin microbiana.

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Determinacin de la masa microbiana Para muchos estudios especialmente aquellos relacionados con la bioqumica de los procesos de crecimiento, se prefiere determinar la masa de la poblacin ms que el nmero de clulas presentes. La masa se puede determinar directamente determinando el peso seco o hmedo de la muestra. Tambin se puede determinar el contenido de nitrgeno o el contenido de protenas o de ADN. Otra forma de estimar la masa celular de una manera indirecta es determinando la actividad metablica de la clula por ejemplo determinando el consumo de oxgeno o produccin de dixido de carbono. Asumiendo que la cantidad del producto metablico est en proporcin directa al nmero de bacterias presentes en la poblacin. Un mtodo ms sencillo y til para obtener la estimacin relativa de la masa bacteriana es utilizar mtodos pticos (turbidimtricos) que consisten en medir la turbidez, ya que, dentro de ciertos lmites, las suspensiones bacterianas dispersan la luz proporcionalmente a su concentracin.

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EFECTO DE LA CONCENTRACION DE NUTRIENTES SOBRE EL CRECIMIENTO Como podemos observar en la figura siguiente, a medida que aumenta la concentracin de nutrientes aumenta la velocidad de crecimiento hasta llegar a una concentracin que ya no es limitante y se sigue aumentando no aumentar la velocidad de crecimiento. Tambin la concentracin de nutrientes tiene efecto sobre la "cosecha mxima" o crecimiento total ya que una gran parte del nutriente es convertido en masa celular, si se limita la cantidad de nutriente se limitar tambin la cantidad de material celular.

PROCEDIMIENTOS DE REPRODUCCIN DE LOS HONGOS Los hongos pueden reproducirse por procesos asexuales y procesos sexuales. Reproduccin asexual Los procesos asexuales implican divisin de los ncleos y formacin de nuevos hongos sin participacin de gametos y sin fusin nuclear. Se conocen 3 mecanismos de reproduccin asexual: 1. 2. 3. 1. Esporulacin seguida de germinacin de las esporas. Gemacin. Fragmentacin de hifas. Esporas asexuales No presentan latencia, es decir ellas pueden germinar cuando dispongan de humedad an en ausencia de nutrientes. Existen varios tipos de esporas asexuales: a. Clamidosporas: sporas esfricas u ovoides de pared gruesa que se forman dentro de las hifas somticas. Son ms resistentes al calor y a la desecacin que las otras esporas asexuales. Conidiosporas: Son esporas delgadas que se encuentran en grupos o solas
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sobre hifas especializadas llamadas conidiforos. Algunos autores llaman conidiosporas a todas las esporas asexuales. c. Esporangiosporas: Son esporas que se forman dentro de una estructura en forma de saco denominada esporangio. La hifa que porta el esporangio se denomina esporangiforo. Astrosporas: Son esporas de paredes delgadas que se forman por fragmentacin de las hifas. Blastosporas: Son esporas que se forman por gemacin.

d.

e.

Clamidosporas 2. Gemacin

Conidiosporas

Esporangiosporas

Es el proceso de reproduccin asexual que prevalece en las levaduras, aunque algunas especies se dividen por fisin. 3. Fragmentacin de hifas Los fragmentos de hifas son capaces tambin de dar nuevas colonias. Reproduccin sexual Los hongos que tienen reproduccin sexual la hacen a travs de los siguientes pasos: 1. Un ncleo haploide de una clula donante (macho) penetra el citoplasma de una clula receptora (hembra). 2. Se fusionan los ncleos para formar un ncleo zigtico diploide. 3. Por meiosis el ncleo diploide origina cuatro ncleos cuales pueden ser recombinantes genticos. haploides, algunos de los

De este proceso de reproduccin sexual resultan las esporas sexuales, las cuales son usualmente ms resistentes al calor que las esporas asexuales, pero sin llegar a tener la extremada resistencia al calor que presentan las endosporas bacterianas y presentan laten-

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cia, es decir ellas slo germinan cuando son activadas ya sea por un calentamiento suave o por ciertas sustancias qumicas. Existen varios tipos de esporas sexuales: a. Zygosporas: Son esporas grandes de pared gruesa que resultan de la fusin de 2 gametos similares. Ascosporas: Se producen en una estructura en forma de saco, llamada asca, despus de la unin de 2 ncleos. Generalmente hay 8 ascosporas dentro de cada asca. Basidiosporas: Resultan de la unin de 2 ncleos sobre una estructura especializada en forma de maza conocida como basidio. Generalmente hay 4 por basidio. Oosporas: Estas se forman dentro de una estructura femenina denominada oogonio.

b.

c.

d.

Esporas sexuales CICLO DE MULTIPLICACIN VIRAL En general el ciclo de multiplicacin viral puede dividirse en una serie de fases, como son: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Adsorcin de la partcula viral a la clula husped. Penetracin del virus. Liberacin del cido nucleico. Replicacin del cido nucleico y sntesis de las protenas que forman parte del virus. Ensamblaje de las partculas virales. Liberacin de los virus maduros.

Adsorcin de la partcula viral a la clula husped Existe una alta especificidad en la interaccin del virus con su clula husped. Este proceso de adsorcin est mediado por receptores presentes tanto a nivel de la partcula viral como a nivel de la clula husped. Entre los receptores de esta ltima tenemos: polisacridos, lipoprotenas, glicoprotenas etc. En relacin a los virus, la localizacin de los receptores depen16

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de del tipo de virus; si se trata de un virus sin cubierta los receptores estn localizados en la cpsida. En aquellos virus que poseen cubierta lipdica, los receptores estn localizados en dicha cubierta. El proceso de adsorcin puede bloquearse aadiendo al medio anticuerpos dirigidos contra los receptores virales y en el caso de los virus que poseen cubierta, el proceso tambin puede impedirse tratndolos con solventes orgnicos. Penetracin del virus Una vez que el virus ha hecho contacto con la clula husped, la penetracin depende del tipo de virus. Si se trata de virus sin cubierta, stos son tomados por un proceso anlogo a la fagocitosis, que en el caso de los virus se denomina "viropexia", donde la membrana celular sufre una invaginacin y el virus penetra al interior como una vacuola fagoctica. En cambio que aquellos virus que poseen cubierta se fusionan con la membrana celular y lo que penetra es la nucleocpsida desnuda. Liberacin del cido nucleico Enzimas que normalmente estn presentes en la clula husped o que son inducidas por la presencia del virus, digieren la cpsida para liberar al cido nucleico para que pueda ser transcrito y replicado. Replicacin del cido nucleico y sntesis de las protenas que forman parte del virus Existen diferentes mecanismos de replicacin viral que dependen de la naturaleza del cido nucleico. De una manera general podemos sealar los siguientes: Virus cuyo genoma est constitudo por ADN La mayora de los ADN virus se replican en el ncleo, utilizando las enzimas de la clula husped, la ADN polimerasa sintetiza el ADN viral y las protenas virales tanto estructurales como funcionales sern transcritas a partir del genoma viral por la ARN-polimerasa ADN dependiente. Virus cuyo genoma est constitudo por ARN La mayora de los ARN virus se replican en el citoplasma, pero debido a que las clulas no replican ARN, es decir no sintetizan ARN usando como molde ARN, ellas no tienen las enzimas para realizar este proceso, de ah que los ARN virus se valgan de diferentes estrategias para lograr hacer la replicacin de su ARN, algunos ARN virus llevan la ARN transcriptasa en la partcula viral, otros tienen un genoma con polaridad mensajero que puede ser traducido directamente en los ribosomas y as sintetizar la ARN-transcriptasa requerida, y las otras protenas funcionales y estructurales requeridas.

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Ciclo de multiplicacin de un ADN virus

Ciclo de multiplicacin de un ARN virus

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Ensamblaje de las partculas virales Una vez que se haya replicado el genoma y producido las protenas que van a formar la cpsida, el prximo paso es el ensamblaje de los componentes para formar la nucleocpsida. Liberacin de la partcula viral Esta ltima fase del ciclo de multiplicacin viral, tambin depende del tipo de virus. Generalmente los virus sin cubierta producen la lisis de la clula husped con la subsiguiente liberacin de los virus. Por el contrario los virus que poseen cubierta, una vez formada la nucleocpsida, sta se acerca a la membrana celular, la cual ha sido modificada por la incorporacin de glicoprotenas codificadas por el virus. Finalmente la nucleocpsida adquiere la cubierta por un proceso semejante al de la gemacin, que se ilustra a continuacin.

Liberacin de virus con cubierta MTODOS PARA DETERMINAR LA INFECTIVIDAD DE UNA PREPARACIN VIRAL Estos mtodos se fundamentan en la capacidad que tienen los virus para multiplicarse dentro de la clula husped con la subsiguiente liberacin de partculas virales infecciosas que a su vez infectan nuevas clulas producindose as ciclos repetidos de multiplicacin viral. Mtodos cuantitativos Nos proporcionan el nmero de partculas infecciosas que existe en la preparacin viral. Recuento en placas Un ejemplo de este tipo de mtodo lo constituye la determinacin del nmero de unidades formadoras de placas/mL de la preparacin viral. Entindese por placa "una zona localizada de destruccin celular ocasionada por la multiplicacin viral". El mtodo se basa en la infeccin de un gran nmero de monocapas de clulas susceptibles con alcuotas de diluciones de la preparacin viral.
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Dilucin de la suspensin viral Volumen sembrado

10-4 0,2 mL

10-6 0,2 mL

10-8 0,2 mL

10-10 0,2 mL

en cada

placa
Monocapas de clulas susceptibles

Luego de que se haya sembrado el virus se deja transcurrir un tiempo dado con la finalidad de que se adsorban los virus a las clulas. Luego se cubren las monocapas con una capa de medio de cultivo solidificado con agar que previene la diseminacin de la progenie viral. A bajas diluciones se observa la destruccin total del cultivo celular, pero a diluciones elevadas puede asumirse que cada placa o lesin es iniciada por la infeccin de una sola partcula viral infecciosa. Con los virus que matan a las clulas, la lesin puede observarse con ayuda de luz transmitida; utilizando colorantes vitales puede aumentarse su contraste, por ejemplo Rojo neutro que es tomado nicamente por las clulas vivas. Dilucin Placa 1 Placa 2 Placa 3 10-4 INCONTABLE INCONTABLE INCONTABLE 10-6 INCONTABLE INCONTABLE INCONTABLE 10-8 235 265 254
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10-10 3 2 1
= 1,25 x 10
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Nmero de unidades formadoras de placas/mL de la suspensin viral = 251,33 UFP x 10 UFP/mL. 0,2 mL

Formacin de una placa

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Algunos virus no matan a las clulas que infectan, por lo tanto hay que recurrir a otros mtodos para poner en evidencia la multiplicacin viral localizada, por ejemplo anticuerpos fluorescentes. Mtodos para determinar el nmero de partculas virales totales Estas tcnicas no discriminan entre partculas infecciosas y no infecciosas. El ms utilizado es el mtodo de recuento al microscopio electrnico. Recuento al microscopio electrnico Los virus pueden contarse al microscopio electrnico. Como no es posible determinar exactamente el volumen de la preparacin viral para ser observada al microscopio electrnico se usa como referencia una suspensin de partculas de ltex de concentracin conocida. Se procesa para su observacin al microscopio electrnico y se cuenta el nmero de partculas virales y el nmero de partculas de ltex. Como se conoce la concentracin de partculas de ltex, fcilmente puede calcularse el nmero de partculas virales totales.

Recuento de partculas totales al microscopio electrnico

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BIBLIOGRAFA Davis, Dulbecco, Eisen and Ginsberg. 1990. Microbiology. Fourth Edition. J. B. Lippincott Company. Madigan M.T, Martingo J. M. y Jack Parker. 2004. Dcima Edicin. Brock Biologa de los Microorganismos Prentice Hall Prescott, L.; Harley, J.; Klein D. 1999. Microbiologa. Cuarta edicin. McGraw-Hill Interamericana. Tortora G. J., B. R. Funke and Ch. L. Case 2007. Introduccin a la Microbiologa 9na Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Wistreich and Lechtman. Microbiology. Fifth Edition. 1998. Macmillan Publishing. Co. Magaly Pedrique de Aulacio Norma De Castro Ctedra de Microbiologa - Facultad de Farmacia UCV Noviembre 2001 Revisin 2008

ACTIVIDADES ADICIONALES 1. En la determinacin del nmero de bacterias viables de una muestra de leche se obtiene el siguiente resultado: Placa Dilucin 10-2 10-3 10-4 10-5 1 2 3
Incontable

Volumen sembrado 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Incontable Incontable

174 18 1

159 25 3

168 29 2

Determinar cuntas bacterias hay por mL de leche 2. Explique resumidamente cmo determinara usted el nmero de bacterias presentes en una muestra de orina. 3. Se tom una muestra de agua y se le hizo un recuento usando la cmara de PetroffHausser y se obtuvo un resultado de 1012 bacterias/mL, simultneamente se le hizo un recuento en placas a la misma muestra de agua, dando ste un resultado de 5 x 105 ufc/mL. Explique resumidamente las posibles razones de la discrepancia entre los resultados.
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4. Busca en un diccionario de ingls tcnico la traduccin al espaol de las palabras siguientes

Binary fission Cell division Colony count Dead phase Direct count Elementary body Generation time Growth Growth rate Hemocitometer Inoculum Latency Latency phase Log phase Milk Sample Square Tissue culture Total crop Turbidity

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