Disser DenisenkoYA

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ
ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР «ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ

БИОТЕХНОЛОГИИ» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК»
На правах рукописи
Денисенко Юрий Андреевич
БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ГРИБНЫХ КСИЛАНАЗ 10-Й СЕМЬИ

ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ
03.01.04 Биохимия
03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Диссертация
на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Научный руководитель:
д.х.н., проф. Гусаков А.В.
Москва – 2018
Оглавление
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................................ - 6 -
ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................................... - 7 -
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................... - 12 -
ГЛАВА 1. СТРОЕНИЕ И СОСТАВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ РАСТЕНИЙ.................. - 12 -
1.1. КЛЕТОЧНАЯ СТЕНКА ............................................................................................... - 12 -
1.2. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ................................................ - 13 -
1.3. ПОЛИСАХАРИДЫ МАТРИКСА ............................................................................... - 15 -
ГЛАВА 2. КСИЛАНОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ И БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ

КСИЛАНАЗ .......................................................................................................................... - 19 -
2.1. КСИЛАНОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ФЕРМЕНТОВ ............................................ - 19 -
2.2. ЭНДО-1,4-Β-КСИЛАНАЗЫ......................................................................................... - 21 -
2.3. МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА ........................................................................................... - 23 -
2.4. КСИЛАНАЗЫ 10-Й И 11-Й СЕМЬИ ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ ............................... - 24 -
2.5. БИОХИМИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КСИЛАНАЗ .... - 27 -
2.6. БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ КСИЛАНАЗ ИЗ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР ................ - 28 -
2.6.1. TAXI-ТИП БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ КСИЛАНАЗ ...................................... - 29 -
2.6.2. XIP-ПОДОБНЫЕ БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ КСИЛАНАЗ.............................. - 32 -
ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КСИЛАНАЗ............ - 35 -
3.1. КСИЛАНАЗЫ В ЦЕЛЛЮЛОЗНО-БУМАЖНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ ........... - 35 -
3.2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КСИЛАНАЗ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА КОРМОВЫХ

ДОБАВОК............................................................................................................................. - 36 -
3.3. ДРУГИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ПРИМЕНЕНИЯ КСИЛАНАЗ .. - 37 -
Страница -2-
ГЛАВА 4. СПОСОБЫ УЛУЧШЕНИЯ ОПЕРАЦИОННЫХ ПАРАМЕТРОВ КСИЛАНАЗ
................................................................................................................................................ - 40 -
4.1. БИОИНЖЕНЕРИЯ ФЕРМЕНТОВ .............................................................................. - 40 -
4.2. ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И СТРУКТУРНЫЕ

ПАРАМЕТРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ............. - 42 -
4.2.1. ГИДРОФОБНЫЕ ЭФФЕКТЫ .................................................................................. - 44 -
4.2.2. СОЛЕВЫЕ МОСТИКИ И ИОННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ............................... - 45 -
4.2.3. Π–Π ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ...................................................................................... - 47 -
4.2.4. КАТИОННО–Π ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ................................................................... - 47 -
4.2.5. ДИСУЛЬФИДНЫЕ МОСТИКИ ............................................................................... - 48 -
4.2.6. ТЕРМИНАЛЬНЫЕ N- И C- УЧАСТКИ ФЕРМЕНТОВ ........................................ - 49 -
4.2.7. ЖЕСТКОСТЬ И ГИБКОСТЬ .................................................................................... - 51 -
4.2.8. ПЕТЛИ ........................................................................................................................ - 52 -
4.2.9. ГИДРАТАЦИЯ ПОВЕРХНОСТИ ............................................................................ - 53 -
4.3. ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ .......................................................................... - 53 -
4.4. НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТОВ ................ - 54 -
4.5. УЛУЧШЕНИЕ ДРУГИХ ОПЕРАЦИОННЫХ ПАРАМЕТРОВ КСИЛАНАЗ ........ - 55 -
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .......................................................................... - 58 -
ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ. ....................................... - 58 -
5.1. МАТЕРИАЛЫ. .............................................................................................................. - 58 -
5.1.1. ФЕРМЕНТЫ. .............................................................................................................. - 58 -
5.1.2. ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ (ФП) ...................................................................... - 58 -
5.1.3. МИКРООРГАНИЗМЫ .............................................................................................. - 58 -
5.1.4. СУБСТРАТЫ.............................................................................................................. - 59 -
5.1.5. РЕАКТИВЫ ................................................................................................................ - 59 -
5.2. МЕТОДЫ ....................................................................................................................... - 60 -
5.2.1. ВЫРАВНИВАНИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ...... - 60 -
5.2.2. АМПЛИФИКАЦИЯ ЦЕЛЕВЫХ ГЕНОВ XYLA, XYLE И XYL3 ............................ - 60 -
5.2.3. АМПЛИФИКАЦИЯ ГЕНОВ С ТОЧЕЧНЫМИ МУТАЦИЯМИ .......................... - 64 -
5.2.4. ТРАНСФОРМАЦИЯ ШТАММА-РЕЦИПИЕНТА P. VERRUCULOSUM B1-537- 65 -
5.2.5. ТРАНСФОРМАЦИЯ ШТАММА-РЕЦИПИЕНТА P. CANESCENS RN3-11-7 .... - 65 -
5.2.6. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ В КОЛБАХ......... - 65 -
5.2.7. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ ........................................................... - 66 -
5.2.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА ........................................................ - 66 -
5.2.9. ПРОВЕДЕНИЕ DS-NA-ПААГ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА .............................................. - 67 -
5.2.10. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ..................................................... - 67 -
5.2.11. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ................................................ - 67 -
5.2.12. ИЗУЧЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРНОЙ СТАБИЛЬНОСТИ ......................................... - 68 -
5.2.13. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРНОГО И РН-ОПТИМУМОВ АКТИВНОСТИ

КСИЛАНАЗ .......................................................................................................................... - 68 -
5.2.14. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ ИЗ ЭКСТРАКТА РЖИ

НА АКТИВНОСТЬ КСИЛАНАЗ ....................................................................................... - 69 -
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.......................................................................... - 70 -
ГЛАВА 6. ВЫБОР ПРОВОДИМЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН ........................ - 70 -
6.1. ОБЩАЯ СТРАТЕГИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ.................................... - 70 -
6.2. АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЗАМЕНЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА УВЕЛИЧЕНИЕ

ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ КСИЛАНАЗ ........................................................................... - 71 -
6.2.1. XYLA .......................................................................................................................... - 71 -
6.2.2. XYLE ........................................................................................................................... - 77 -
6.2.3. XYL3 ........................................................................................................................... - 79 -
6.3. АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЗАМЕНЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА ПРИДАНИЕ

УСТОЙЧИВОСТИ КСИЛАНАЗ К БЕЛКОВЫМ ИНГИБИТОРАМ ТИПА XIP ИЗ
ЗЛАКОВЫХ РАСТЕНИЙ ................................................................................................... - 80 -
ГЛАВА 7. ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ КСИЛАНАЗ ..................................... - 82 -
7.1. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ ................................................ - 82 -
7.2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ТРАНСФОРМАНТОВ ........................................................ - 84 -
7.3. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА КСИЛАНАЗ ............... - 85 -
7.3.1. XYLA .......................................................................................................................... - 85 -
7.3.2. XYLE ........................................................................................................................... - 88 -
7.3.3. XYL3 ........................................................................................................................... - 90 -
7.4. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ

КСИЛАНАЗ .......................................................................................................................... - 92 -
ГЛАВА 8. СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ КСИЛАНАЗ ДИКОГО ТИПА И ИХ

МУТАНТНЫХ ФОРМ ........................................................................................................ - 95 -
8.1. XYLA ............................................................................................................................. - 95 -
8.2. XYLE ............................................................................................................................ - 102 -
8.3. XYL3 ............................................................................................................................ - 106 -
8.4. ИССЛЕДОВАНИЕ ИНГИБИРОВАНИЯ КСИЛАНАЗ БЕЛКОВЫМИ

ИНГИБИТОРАМИ РЖИ ................................................................................................... - 110 -
ВЫВОДЫ........................................................................................................................... - 117 -
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................................. - 119 -
Список сокращений
а.к. Аминокислота
а.о. Аминокислотный остаток
ГГ Гликозидгидролазы
КМЦ Карбоксиметилцеллюлоза
КЖ Культуральная жидкость
ПААГ Полиакриламидный гель
п.о. Пара оснований
СП Степень полимеризации
ФП Ферментный препарат
Ds-Na Додецилсульфат натрия
TAXI Triticum aestivum Xylanase Inhibitor
XIP Xylanase Inhibiting Protein
XylA Эндо-1,4--ксиланаза А Penicillium canescens
XylE Эндо-1,4--ксиланаза Е Penicillium canescens
Xyl3 Эндо-1,4--ксиланаза III Trichoderma reesei
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования.

Клеточные стенки растений содержат огромный запас углерода, который
потенциально является источником многих полезных продуктов, однако этот углерод в
основном представлен в виде высокополимеризованной целлюлозы, других
полисахаридов и лигнина. Одними из таких полисахаридов являются ксиланы, которые
относятся к классу гемицеллюлоз и принадлежат к числу наиболее распространенных
полисахаридов на Земле. Ксиланазы и ксиланолитическая система ферментов в целом
участвуют в биодеградации ксиланов. Изучение возможности применения ксиланаз для
практических целей началось около 50 лет назад. Использование ферментов и
ферментных препаратов обусловлено их высокой активностью, специфичностью и
экологической безопасностью.
На данный момент можно выделить ряд областей, в которых ксиланазы играют
ключевую роль: биоотбеливание целлюлозы в целлюлозно-бумажной промышленности,
производство соков и вин, переработка сельскохозяйственных отходов, производство
ксилита и биоэтанола. Одним из важнейших направлений использования ксиланазных
ферментных препаратов является кормовая промышленность, где ксиланазы
используются в качестве добавки к комбикормам. Коммерческие ксиланазные
ферментные препараты производятся компаниями в России, США, Канаде, Японии,
Финляндии, Германии, Дании и других странах. Большинство таких препаратов
производится на основе мутантных штаммов микроскопических грибов из родов
Aspergillus, Trichoderma, Penicillium.
Использование ксиланаз в качестве биокатализаторов в биотехнологических
процессах накладывает на ферменты определенные требования, такие как высокая
каталитическая активность и термостабильность, возможность применения при
определенных значениях рН, устойчивость к ингибиторам и т.д. В частности, для
использования в качестве добавок к комбикормам ксиланазы должны обладать высокой
термостабильностью и резистентностью к белковым ингибиторам из злаков. Этот факт
стимулирует поиск новых ксиланаз с определенными операционными параметрами.
Свойства уже известных ксиланаз могут быть улучшены с помощью методов белковой
инженерии.
Цели и задачи исследования
Целями данной работы являлось увеличение методами белковой инженерии
температурной стабильности трех грибных ксиланаз из 10-й семьи ГГ: эндо-1,4-β-
ксиланаз А и Е (XylA и XylE) Penicillium canescens, эндо-1,4-β-ксиланазы III (Xyl3)
Trichoderma reesei, а также получение мутантных форм ксиланаз XylA и Xyl3, которые
обладают резистентностью к белковым ингибиторам злаков XIP (Xylanase Inhibiting
Protein). В соответствии с поставленными целями были сформулированы следующие
задачи:
 С помощью методов биоинформатики и компьютерного моделирования
выявить аминокислотные (а.к.) замены, которые потенциально могли бы привести к
увеличению термостабильности исследуемых ксиланаз. Выявить структурные факторы,
которые могли бы привести к устойчивости ксиланаз XylA и Xyl3 к белковым
ингибиторам типа XIP.
 Методом ПЦР провести амплификацию генов xylA, xylE и xyl3 с
измененными нуклеотидными последовательностями, кодирующих ферменты с а.к.
заменами, делециями или вставками. Получить генетические конструкции, несущие
измененные гены ксиланаз, и провести их трансформацию в штаммы-реципиенты.
 Произвести культивирование полученных штаммов и выделить
рекомбинантные ксиланазы дикого типа и их мутантные формы методами белковой
хроматографии. Определить биохимические параметры гомогенных мутантных форм
ксиланаз, изучить их свойства в сравнении со свойствами рекомбинантных форм дикого
типа и таким образом выявить влияние а.к. замен на исследуемые параметры ферментов.
Научная новизна и теоретическая значимость работы

Получен ряд мутантных форм ксиланаз XylA, XylE и Xyl3 с одинарными и двойными
а.к. заменами, а также с делециями или вставками в а.к. последовательность ферментов.
Определены биохимические параметры гомогенных рекомбинантных ксиланаз.
Показано, что ряд а.к. замен приводит к снижению термостабильности ксиланаз XylA,
XylE и Xyl3; несколько а.к. замен не повлияли на данный параметр. Получены
мутантные формы XylA L18F, XylE Y134R, XylE T196P, XylE Y134R/D248E,
обладающие более высокой термостабильностью по сравнению с рекомбинантными
формами ферментов дикого типа. Установлено, что XylA L18F проявляет повышенную
термостабильность за счет заполнения гидрофобной полости белковой глобулы более
объемным неполярным остатком фенилаланина, тогда как замены в XylE Y134R и
Y134R/D248E приводят к образованию новых солевых мостиков и, как следствие, к
увеличению температурной стабильности. Введение остатка пролина в начало -
спирали в XylE (а.к. замена T196P) оказало небольшое положительное влияние на
термостабильность за счет увеличения жесткости третичной структуры фермента.
Показано, что вставка дополнительных 5 аминокислотных остатков в пептидную петлю
в районе активного центра XylA и Xyl3 позволяет ферментам приобрести свойство
резистентности к белковым ингибиторам из злаков типа XIP.
Практическая значимость работы

Получены рекомбинантные мутантные формы XylA и XylE, которые демонстрируют
более высокую термостабильность по сравнению к ферментами дикого типа.
Температуры фазового перехода увеличились на 3,9; 2,7; 0,2; 2,3 °С для мутантных
форм XylA L18F, XylE Y134R, XylE T196P, XylE Y134R/D248E соответственно.
Получены рекомбинантные мутантные формы XylA-ins и Xyl3-ins, которые обладают
устойчивостью к белковым ингибиторам злаков типа XIP в отличие от ферментов
дикого типа. Полученные мутантные формы ксиланаз открывают перспективы для их
использования в качестве добавок к комбикормам для сельскохозяйственных животных
и птиц, а также в процессах биообработки растительного сырья, содержащего ксиланы.
Положения, выносимые на защиту

1. Аминокиcлотная замена L18F в XylA повышает температурную стабильность
фермента за счет более плотного заполнения гидрофобной полости белковой глобулы
объемным неполярным остатком фенилаланина.
2. Аминокислотные замены Y134R, Y134R/D248E и T196P в XylE приводят к
повышению термостабильности фермента за счет образования нового солевого
мостика или увеличения жесткости третичной структуры белка в результате введения
остатка пролина в начало -спирали.
3. XylE дикого типа (XylE-wt) обладает устойчивостью к белковым ингибиторам типа
XIP из экстракта ржи, тогда как XylA-wt и Xyl3-wt восприимчивы к действию данных
ингибиторов.
4. Вставка пяти аминокислотных остатков (GQGGA) в пептидную петлю, образующую
«ущелье» активного центра XylA и Xyl3, формирует устойчивость ферментов к
белкам типа XIP за счет создания стерических затруднений для связывания
ингибитора.
Личный вклад диссертанта

Представленные в диссертационной работе экспериментальные данные получены
автором лично или при непосредственном участии на всех этапах исследований,
включая планирование и выполнение экспериментов, обработку данных, оформление и
публикацию результатов.
Степень достоверности
Достоверность представленных в диссертационной работе данных определяется
использованием современных физико-химических методов исследования, выполнением
экспериментов на сертифицированном оборудовании, использованием стандартных
норм и протоколов, рекомендованных фирмами-производителями определенных
реактивов.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертация соответствует специальностям 03.01.04 – «биохимия» (пункты 2, 11,
17 паспорта специальности) и 03.01.06 – «биотехнология (в том числе
бионанотехнологии)» (пункты 1, 9, 11 паспорта специальности).
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены в виде тезисов и докладов на
российских и международных конференциях, школах, конгрессах: VIII Московский
международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»
(Москва, Россия, 2015); XXVII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные
направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2015);
XXII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых
«Ломоносов-2015» (Москва, Россия, 2015); II Международная научная конференция
«Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (Минск, Р.
Страница - 10 -
Беларусь, 2015); XI Молодежная школа-конференция с международным участием
«Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, Россия, 2016); V Съезд
физиологов СНГ и V съезд биохимиков России (Сочи, Россия, 2016); Международная
конференция «Биокатализ-2017» (МО, Россия, 2017); V Международная научно-
практическая конференция «Биотехнология: наука и практика» (Ялта, Россия, 2017);
Всероссийская научно-практическая конференция «Микробные технологии в
птицеводстве и животноводстве» (Казань, Россия, 2018).
Публикации
По результатам диссертационной работы опубликовано 15 печатных работ, из которых 5
опубликованы в журналах, индексируемых в Web of Science и Scopus, одна статья в
сборнике научных трудов, а также 9 тезисов докладов конференций.
Связь работы с государственными программами

Работа выполнена при поддержке Минобрнауки России, ФЦП «Исследования и
разработки по приоритетным направлениям развития научно технологического
комплекса России на 2014-2020 годы» (идентификационный номер ПНИЭР
RFMEFI60716X0159), а также с использованием научного оборудования ЦКП
«Промышленные биотехнологии» и АЦКП «Биоинженерия» ФИЦ Биотехнологии РАН.
Объем и структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной
части, описывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждений,
выводов и списка литературы. Работа изложена на 138 страницах, содержит 15 таблиц и
48 рисунков. Список литературы включает 211 ссылок.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. Строение и состав клеточной стенки растений
1.1. Клеточная стенка

Большинство растительных клеток покрыты клеточной стенкой. Клеточная стенка
определяет как морфологию, так и отчасти функцию клетки. Она непосредственно
может регулировать растяжение самой клетки, организуя ее пограничную зону; в то же
время представляет собой внеклеточную структуру, которая заключает каждую клетку в
наземных растениях, грибах и водорослях [1]. Она более твердая, толстая и более
прочная, чем внеклеточная матрица, произведенная животными клетками. Клеточная
стенка растений играет важную роль в процессе дифференцирования клеток. Типичные
клеточные стенки наземных растений состоят в основном из полисахаридов. Оболочка
клетки состоит из нескольких слоев, отличающихся друг от друга строением,
физическими свойствами и химическим составом.
Толщина самой клеточной стенки растений варьируется в широких пределах от 1
до 100 мкм в зависимости от породы дерева. Клеточная стенка состоит из двух
структурных частей: первичной стенки (P) и вторичной стенки (S). Клетки связываются
между собой межклеточным веществом, или истинной срединной пластинкой (ML). В
период развития клетки межклеточное вещество состоит из пектиновых веществ; в
зрелой клетке после одревеснения клеточной стенки основным компонентом становится
лигнин. Первичная стенка - тонкий слой, являющийся в период роста поверхности
единственной оболочкой, заключающей в себе протопласт, ее толщина составляет от 0,1
до 0,3 мкм. Данный слой состоит из различных веществ: целлюлозы, гемицеллюлоз,
пектиновых веществ, белков и лигнина, откладывающегося в период одревеснения.
Вторичная стенка в свою очередь состоит из трех слоев: внешнего S1, среднего S2 и
внутреннего S3; и характеризуется большим содержанием гемицеллюллоз, чем в
первичной стенке (Рисунок 1) [2].
Рисунок 1 - Схема распределения основных компонентов древесины в клеточной стенке.
(ML - межклеточное пространство; P - первичная стенка; S1, S2, S3 - внешний, средний
и внутренний слои вторичной стенки) [2].
1.2. Химический состав клеточной стенки

Основными компонентами клеточной стенки являются полисахариды, лигнин,
белки и вода. Наиболее важными химическими компонентами клеточной стенки
растений являются полисахариды. Полисахариды можно разделить на две большие
группы. Целлюлоза является основным представителем первой группы и наиболее
распространенным полисахаридом на Земле, синтез которой в природе оценивается в
100 миллиардов тонн в год [3]. Целлюлоза является основным компонентом клеточных
стенок растений и представляет собой линейный неразветвленный полимер, состоящий
из остатков D-глюкопиранозы, которые соединены между собой β-1,4-гликозидными
связями (Рисунок 2). Повторяющимся звеном является остаток целлобиозы. Средняя
степень полимеризации (СП) целлюлозы в первичной стенке составляет около 6000, во
вторичной – до 14000. Молекула целлюлозы достигает длины в несколько микрон с
диаметром 2-4 нм [4, 5]. Гидроксильные группы, связанные с углеродными атомами
остатка глюкозы C2, C3, C6 не замещены. Молекулы имеют лентообразную
конформацию, которая им позволяет параллельно упаковываться и образовывать
трехмерные микрофибриллы диметром до 25 нм. Молекулы целлюлозы имеют
кристаллическую структуру за счет образования обширных межмолекулярных
водородных и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий [6].
Рисунок 2 - Строение и конформация молекулы целлюлозы [1].
Микрофибриллы целлюлозы окружены матриксом, который состоит из

полисахаридов второй группы. Полисахариды матрикса, в свою очередь, являются
разветвленными и имеют аморфную структуру. Матрикс часто описывают как
аморфный, но это относительно, поскольку полисахариды матрикса располагаются
параллельно микрофибриллам. По химическому строению полисахариды второй группы
делятся на гемицеллюлозы и пектины.
Гемицеллюлозы не так сильно распространены в природе, как целлюлоза, и в
среднем составляют 20% от клеточной стенки растений [7]. Функциональная роль
гемицеллюлоз заключается в формировании промежуточного слоя между основными
компонентами клеточной стенки. В первичной клеточной стенке гемицеллюлозы
связывают целлюлозу и пектин, во вторичной – целлюлозу и лигнин [1]. СП
гемицеллюлоз значительно ниже СП целлюлозы: от 50 до 200 [8]. Полисахаридную
структуру клеточной стенки можно сравнить со структурой железобетона: целлюлозные
микрофибриллы эквивалентны стальным стержням, а полисахариды матрикса -
окружающему стержни бетону (Рисунок 3).
Рисунок 3 - Организация клеточной стенки высших растений [9].
Кроме полисахаридов в клеточной стенке высших растений присутствует лигнин.
Лигнин - это сложный сильно разветвленный полимер, состоящий из фенилпропановых
остатков. Основным компонентом лигнина хвойных пород деревьев является
конифериловый спирт, также присутствует п-кумаровый спирт. Лигнин в лиственных
породах деревьев состоит из кониферилового и синапового спиртов (Рисунок 4). Лигнин
служит главным компонентом клеточных стенок опорных тканей растений [8]. Лигнин
образует сеть, пронизывающую матрикс клеточной стенки и выполняющую важную
структурную роль в клеточной стенке [10].
Также в клеточной стенке растений содержатся неорганические соединения,
ферменты, структурные белки и вода.
Рисунок 4 – Строение спиртов, входящих в состав лигнина. 1 - 3-метокси-4-

оксикоричный (конифериловый); 2 - 4-оксикоричный (п-кумаровый). 3 - 3,5-диметокси-
4-оксикоричный (синаповый) спирты.
1.3. Полисахариды матрикса

Практически все полисахариды матрикса построены из двух или более различных
моносахаридов и имеют разветвленную структуру. Как уже говорилось, по химической
природе полисахариды матрикса можно разделить на 2 группы: пектины и
гемицеллюлозы. Данное разделение основано на растворимости полисахаридов:
пектины экстрагируются из клеточной стенки в результате 12-часовой обработки
кипящей водой, слабой кислотой или хелатирующих агентов [11], а гемицеллюлозы
экстрагируются при 25 °С в 4 М гидроксиде калия [1, 12].
Гемицеллюлозы составляют порядка 20% от клеточной стенки растений [11].
Гемицеллюлозы получили свое название из-за предположения Шульца в конце XIX
века, что данные полисахариды являются предшественниками целлюлозы и
представляют наполовину образованные молекулы целлюлозы (hemi (гр.) - полу) [13]. В
настоящее время термин гемицеллюлозы все еще используется. Не так давно
сообщалось [14], что гемицеллюлозы можно разделить на четыре подгруппы: ксиланы,
β-глюканы, маннаны и ксилоглюканы, каждая подгруппа существенно различается по
моносахариду основной цепи .
Ксилоглюканами называют полисахариды, основная цепь которых состоит из
остатков D-глюкопиранозы, соединенных β-1-4-гликозидными связями. При этом цепь
содержит множественные боковые группы, которые содержат главным образом ксилозу,
а также арабинозу, галактозу или фукозу. β-Глюканы состоят из остатков D-
глюкопиранозы, соединенных β-1-3- и β-1-4-гликозидными связями. Основная цепь
маннанов в основном состоит из β-1-4-связанных остатков маннозы, или в случае
глюкоманнанов, может содержать еще D-глюкопиранозу.
Ксиланы состоят из β-1-4-D-ксилопиранозных звеньев, которые могут содержать
боковые заместители в виде сахаров или олигосахаридов [15]. Ксиланы являются
преобладающими нецеллюлозными полисахаридами во многих древесных породах,
злаках, льне и других растениях. Ксиланы различных растений отличаются друг от
друга составом и строением. Эти различия могут использоваться в качестве
хемотаксономических признаков для определения групп растений.
В основной цепи ксилана остатки D-ксилопиранозы связаны гликозидными β-1-4-
связями. До 70% остатков D-ксилопиранозы ацетилированы, в основном по С3 атому
углерода. К некоторым остаткам присоединена 4-О-метил-α-D-глюкуроновая кислота
через гликозидную α-1-2-связь. К некоторым ксилозным остаткам может быть
присоединена α-1-3-глюкозидной связью α -L-арабинофураноза [16, 17] (Рисунок 5).
А Б В
Рисунок 5 - Строение основных моносахаридов, входящих в структуру ксилана. А - β-D-

ксилопираноза; Б - 4-О-метил-α-D-глюкуроновая кислота; В - α-L-арабинофураноза.
Ксиланы расположены в основном в среднем слое и выполняют функции
скрепляющего вещества за счет формирования ковалентных и нековалентных связей с
лигнином, целлюлозой и другими полимерами. Это необходимо для поддержания
целостности клеточной стенки растения. Ксиланы составляют основной объем
гемицеллюлоз в покрытосеменных растениях - 20-30% от общей сухой массы; но
присутствуют в меньшей степени у голосеменных растений, которые содержат 7-12%
ксиланов [18]. В некоторых однолетних травах и зерновых содержание ксилана
составляет до 50% [19].
Арабиноглюкуроноксилан (арабиноксилан) - гетерополисахарид, основная цепь
которого построена из 1,4-β-D-ксилопиранозных звеньев, а боковые группы
представляют собой 4-O-метил-D-глюкуроновую кислоту и L-арабинофуранозу,
соединенных с основной цепью в основном α-1,2-связью (Рисунок 6). Высокое
содержание боковых арабинозных заместителей обуславливает высокую вязкость
арабиноксиланов данного типа. Арабиноксиланы однодольных растений
этерифицированы по С5 атому L-арабинофуранозы феруловой или кумаровой
кислотами [20, 21]. СП арабиноксилана варьирует в пределах от 70 до 130.
Арабиноксиланы были обнаружены в пшенице, ржи, ячмене, овсе, рисе, сорго, а также в
некоторых других растениях: траве панголы, побегах бамбука и ржаной траве. Эти
полисахариды составляют важную часть клеточных стенок растений [19].
Рисунок 6 - Схематичная структура арабиноглюкуроноксилана.
Ацетилглюкуроноксилан (глюкуроноксилан) – основной ксилан твердых

(лиственных) пород деревьев. Это разветвленный полисахарид, главная цепь которого
построена из остатков D-ксилопиранозы, соединенных гликозидными связями.
Содержание его варьирует от 15 до 30% от сухой массы древесины. В основной цепи
глюкуроноксилан содержит D-ксилопиранозные остатки, соединенные β-1,4-связями,
70% которых ацетилировано по гидроксильной группе С2 или С3 углеродных атомов
ксилопиранозного кольца [1]. Кроме того, в среднем к каждому десятому ксилозному
звену в качестве боковой группы присоединена α-1,2-связью молекула 4-O-метил-D-
глюкуроновой кислоты (Рисунок 7). Число боковых глюкуроновых звеньев зависит от
породы, положения в стволе и возраста дерева. СП глюкуроноксилана твердых пород
деревьев составляет 150-200. Предполагается, что до 40% групп уроновых кислот в
глюкуроноксиланах находится не в свободном виде карбоксилат-ионов, а участвует в
образовании сложноэфирных связей [22].
Рисунок 7 - Схематичная структура глюкуроноксилана.
Гомоксилан (родименан) – полисахарид, построенный исключительно из β-D-

ксилопиранозных звеньев. Однако его основная цепь наряду с β-1,4-гликозидными
связями содержит в соотношении 2:1 также и β−1,3-связи (Рисунок 8). Источником
родименана служат морские водоросли рода Palmaria [23] Благодаря своему
уникальному строению, этот полисахарид часто используют в качестве модельного
субстрата для изучения механизма действия ксиланаз [24].
Рисунок 8 - Схематичная структура гомоксилана.
ГЛАВА 2. Ксиланолитические ферменты и белковые ингибиторы ксиланаз
За последние 50 лет по мере развития усилий по конверсии растительной
биомассы развивались и расширялись различные методы ее гидролиза. В настоящее
время использование ферментов в качестве биологических катализаторов для гидролиза
природных полисахаридов активно исследуется.
2.1. Ксиланолитическая система ферментов

Из-за неоднородности и сложности структуры ксиланов их ферментативный
гидролиз требует системы кооперативно действующих ферментов. Данная система
обычно состоит из эндо-1,4-β-ксиланаз, β-ксилозидаз, α-L-арабинофуранозидаз и
ацетилксиланэстераз. Присутствие такой многофункциональной ферментативной
системы распространено среди бактерий и грибов [12, 25]. Ферменты, участвующие в
гидролизе ксиланов и других гемицеллюлоз, условно можно разделить на две группы. К
первой группе стоит отнести ферменты, которые гидролизуют основную цепь
полисахарида. Ко второй группе следует отнести ферменты, которые удаляют боковые
заместители с основной цепи β-1,4-ксилана (debranching enzymes) [12].
Основными ферментами такой ксиланолитической системы являются эндо-1,4-
β-ксиланазы (КФ 3.2.1.8), часто называемые просто ксиланазами, которые
гидролизуют гликозидные связи основной цепи ксилана, образуя короткие фрагменты
ксилоолигосахаридов и сильно снижая степень полимеризации полисахарида [26].
Подробное описание ксиланаз приведено ниже. Высвобожденные олигосахариды могут
дополнительно деградироваться β-ксилозидазой.
β-Ксилозидазы (КФ 3.2.1.37) были обнаружены в грибах, растениях и дрожжах.
Они гидролизуют концевые связи с невосстанавливающего конца короткого
ксилоолигосахарида и образуют ксилопиранозу (Рисунок 9). Короткие
ксилоолигосахариды могут быть полностью преобразованы в ксилозу с помощью β-
ксилозидазы. Однако сродство к ксилоолигосахаридам уменьшается с увеличением
длины цепи олигомера. Поскольку гидролиз протекает с невосстанавливающего конца
ксилоолигосахарида, β-ксилозидазы не функционируют при наличии бокового
заместителя у концевого невосстанавливающего остатка ксилозы. Также β-ксилозидазы
способны гидролизовать арильные производные ксилоолигосахаридов [27].
α-L-Арабинофуранозидазы (КФ 3.2.1.55). Арабинофуранозидазы были
обнаружены в бактериях и грибах [28, 29]. Они катализируют отщепление боковых
остатков L-арабинофуранозы, присоединенных α-1,2- или α-1,3-связями к основной
цепи арабиноксиланов (Рисунок 9). Арабинофуранозидазы обладают широкой
субстратной специфичностью [30]. Некоторые АФ способны отщеплять ферулоил-L-
арабинозу. Это свойство может быть важным при гидролизе нативных арабиноксиланов,
которые, как правило, содержат в качестве заместителей остатки феруловой и п-
кумаровой кислот [31, 32] .
α-L-Глюкуронидазы (КФ 3.2.1.139). α-L-Глюкуронидазы были обнаружены в
грибах и бактериях [33, 34]. Они расщепляют α-1,2-гликозидную связь между остатками
4-O-метил-α-глюкуроновой кислоты и ксилозы в коротких фрагментах
глюкуроноксилана (Рисунок 9). Поскольку α-L-глюкуронидазы не гидролизуют
синтетические субстраты, их изучение крайне затруднено. Наиболее исследованы
бактериальные представители данного класса ферментов.
Ацетилксиланэстеразы (КФ 3.1.1.72). Ацетилксиланэстеразы были
обнаружены в грибах и бактериях [35, 36, 37]. Ацетилксиланэстеразы являются важной
группой ферментов для эффективного гидролиза ксиланов твердых пород деревьев.
Ацетилксиланэстеразы способны гидролизовать не только эфирные связи от
алифатических и сложных эфиров, но и удалять О-ацетильные группы у С2 и С3 атомов
ксилана (Рисунок 9). За счет удаления ацетильных групп обеспечивается лучший доступ
ксиланаз для гидролиза основной цепи полисахарида.
Ферулоилэстеразы (КФ 3.1.1.73). Ферулоилэстеразы также были обнаружены в
грибах и бактериях [38, 39], они гидролизуют связь между остатками феруловой
кислоты и арабинозы в арабиноксиланах (Рисунок 9), тем самым, остаток арабинозы
становится доступным воздействию арабинофуранозидазами.
Рисунок 9 - Теоретическая обобщенная структура ксилана и связи, которые
подвергаются гидролизу в процессе биодеградации ксилана. R1 - гидроксильная группа
или L-арабиноза; R2 – гидроксильная группа или остаток феруловой кислоты; R3 –
гидроксильная группа или остаток уксусной кислоты.
2.2. Эндо-1,4-β-ксиланазы
Истинные эндо-1,4-β-ксиланазы (КФ 3.2.1.8, 1,4-β-D-ксилан ксиланогидролазы) –
ферменты, состоящие из единственного каталитического домена и демонстрирующие
преимущественно эндо-1,4-β-ксиланазную активность. Они представляют собой
гликозидгидролазы (ГГ), которые гидролизуют ксилан. Согласно классификации
Хенриссата, ксиланазы в основном представлены в 10-й и 11-й семьях ГГ (бывшие F и G
соответственно) [40]; но также присутствуют в других семьях ГГ: 5, 8, 30, 43, 51, 98, 141
(Таблица 1). Представители этих семей отличаются между собой физико-химическими
свойствами, биохимическими параметрами, структурой и субстратной специфичностью.
Эндо-1,4-β-ксиланазы расщепляют гликозидные связи в ксилане, вызывая
снижение СП субстрата. Эти ферменты секретируются главным образом
микроорганизмами и участвуют в разрушении клеточных стенок растений, наряду с
другими ферментами, которые гидролизуют полисахариды, входящие в состав
клеточной стенки, а также гидролизуют ксилан во время созревания некоторых семян
(например, при соложении зерна ячменя) [41]. Ксиланазы также были обнаружены в
морских водорослях, простейших, ракообразных, насекомых, улитках и в семенах
растений [42]. Среди всех источников ксиланаз, мицелиальные грибы особенно
интересны, поскольку они секретируют эти ферменты во внешнюю среду, и уровни
экспрессии ксиланаз на порядки выше, чем у дрожжей и бактерий, что открывает
широкие перспективы для их биотехнологического применения. В бактериях ксиланазы
экспрессируются на значительно более низких уровнях активности, чем в грибах, и
также ограничены внутриклеточными или периплазматическими фракциями клетки.
Кроме того, ферменты, экспрессируемые в бактериях, не подвергаются
посттрансляционным модификациям - гликозилированию, рестрикции интронов и др
[42].
Первоначальным и основным продуктом гидролиза ксилана под действием
ксиланазы являются ксилоолигомеры, но на более позднем этапе ферментативной
реакции увеличивается содержание меньших олигомеров, таких как моно-, ди- и
трисахаридов β-D-ксилопиранозилов [43].
В целом, эндоксиланазы демонстрируют максимальную каталитическую
активность между 40 ° и 80 °C, а также между значениями рН 4,0 и 7,0. Отдельные
грибы могут экспрессировать эндоксиланазы с различными физико-химическими
параметрами [43].
Таблица 1 - Ксиланазы – представители разных семей гликозидгидролаз
А.о. – А.о. –
Семья Структура- Механизм
Клан донор нуклео
ГГ топология катализа
протона фил
5 (/)8-бочка GH-A Сохраняющий Glu Glu
8 (/)6-бочка GH-M Обращающий Glu Asp
11 -сэндвич GH-C Сохраняющий Glu Glu
43 -пропеллер GH-F Обращающий Glu Asp
51 (/)8-бочка GH-A Обращающий Glu Glu
98 - - Обращающий Glu Asp
141 -сэндвич - - Asp Asp
2.3. Механизм катализа
Как известно, ГГ осуществляют гидролиз гликозидных связей по двум
возможным механизмам (Рисунок 10). Оба механизма подразумевают наличие в
активном центре фермента по меньшей мере двух а.о., один из которых играет роль
общего основания (нуклеофила), а другой остаток – роль общего кислотно-основного
катализатора. Эти механизмы различаются стереохимическими характеристиками
продуктов ферментативной реакции.
«Обращающие» ферменты действуют по механизму одностадийного замещения,
при котором молекула воды атакует непосредственно аномерный центр, замещая таким
образом уходящую группу. При этом а.о., играющий роль общего основания,
депротонирует молекулу воды (нуклеофил), в то время как другой остаток выступает в
роли общей кислоты, протонируя атом кислорода уходящей группы (Рисунок 10.Б).
Реакция протекает через оксикарбокатионное переходное состояние, где карбокатион
частично стабилизируется депротонированной общей кислотой [44, 45].
«Сохраняющие» ферменты действуют по механизму двухстадийного замещения
через образование гликозил-фермента в качестве ковалентного интермедиата [46, 47].
Последовательность событий можно представить следующим образом: 1) остаток в
активном центре фермента, играющий роль общей кислоты, протонирует субстрат, 2)
карбоксилат-группа, находящаяся на противоположной стороне гликозидного кольца,
нуклеофильно атакует аномерный атом углерода с образованием гликозил-фермента, 3)
гликозил-фермент подвергается нуклеофильной атаке молекулой воды с
противоположной стороны гликозидного кольца (через оксикарбокатионное переходное
состояние), в результате чего образуется продукт с такой же конфигурацией аномерного
центра, как и в исходном субстрате (Рисунок 10.А). Ксиланазы 5-й, 10-й, 11-й, 30-й
семьи являются сохраняющими ферментами, a ксиланазы 8-й, 43-й, 51-й, 98-й семьи –
обращающими (Таблица 1).
Рисунок 10 – А - Схема действия карбогидраз по механизму двухстадийного замещения;
Б – по механизму одностадийного замещения.
2.4. Ксиланазы 10-й и 11-й семьи гликозидгидролаз

Как уже отмечалось, подавляющее большинство ксиланаз являются
представителями двух семей гликозидгидролаз – 10-й и 11-й. 10-я семья ГГ состоит из
эндо-1,4-β-ксиланаз (КФ 3.2.1.8), эндо-1,3-β-ксиланаз (КФ 3.2.1.32) и целлобиогидролаз
(КФ 3.2.1.91). Основными ферментами являются эндо-1,4-β-ксиланазы, однако изучения
субстратной специфичности показали, что последние могут проявлять активность и по
отношению к низкомолекулярным целлюлозным субстратам, в частности к арил-
целлобиозидам, целлоолигосахаридам, а также к КМЦ и β-глюкану [48]. Фактически
было обнаружено, что замена одного или двух остатков ксилозы на глюкозу приводит
лишь к снижению каталитической активности ксиланазы [49]. Несмотря на то, что
ксиланазы из разных семей различаются по субстратной специфичности, строению
молекул и механизму действия на субстрат, по сути, они выполняют одну функцию, и
вместе с остальным комплексом ксиланолитических ферментов участвуют в глубокой
биодеградации ксиланов.
11-ю семью ГГ составляют эндо-1,4-β-ксиланазы (EC 3.2.1.8) и эндо-1,3-β-
ксиланазы (EC 3.2.1.32). Ксиланазы 11-й семьи - более специфичные ферменты, которые
гидролизуют исключительно ксиланы и ксилоолигосахариды. Общими признаками для
ксиланаз из двух семей являются эндодеполимеразный тип действия, а также
«сохраняющий» механизм гидролиза с двойным замещением с точки зрения
стереохимии ферментативной реакции [50, 51].
Специфичность при гидролизе замещенных субстратов ксиланазами 10-й и 11-й
семьи определяется особенностями их молекулярного строения, организацией активного
центра, количеством и специфичностью субсайтов связывания с субстратом.
Каталитический домен ксиланаз 10-й семьи имеет массу 30-60 кДа и образует структуру
ТИМ-бочки (Рисунок 11.А).
А Б
Рисунок 11 - Структура ксиланаз. A - Эндо-1,4-β-ксиланаза 1 Thermoascus aurantiuscus

10-я семья ГГ (1GOK.PDB); Б - эндо-1,4-β-ксиланаза Thermomyces lanugnosusi 11-я
семья ГГ (1YNA.PDB).
В работах [52, 53, 54, 55] исследованы структуры Xyn10A Penicillium

simplicissimum, которая имеет очень высокую степень гомологии с ксиланазой
Penicillium canescens, и Xyn10A Thermoascus aurantiacus отдельно и в комплексе с
различными ксилоолигосахаридами. Показано, что оба фермента имеют пять субсайтов
связывания: три - со стороны невосстанавливающего конца (-1, -2, -3) и два - с
восстанавливающего конца (+1, +2). Способность ксиланаз 10-й семьи ГГ гидролизовать
связь между незамещенным и замещенным остатками ксилозы, по-видимому,
объясняется высокой специфичностью -1 субсайта связывания и низкой
специфичностью субсайтов находящихся по направлению к восстанавливающему концу
от расщепляемой гликозидной связи [56]. Связывание ксилопиранозного кольца в -1
субсайте осуществляется за счет сильного «стэкинг-взаимодействия» с имидазольной
группой триптофана. Боковые заместители ксилана – остатки арабинозы или 4-О-
метилглюкуроновой кислоты не имеют направленной ориентации в активном центре
ксиланаз 10-й семьи и довольно подвижны [47]. Крайние субсайты обладают низкой
энергией связывания, а результаты рентгеноструктурного и молекулярнодинамического
анализа свидетельствуют о высокой подвижности ксилопиранозных колец в данных
участках активного центра [57].
Каталитические домены ксиланаз 11-й семьи имеют массу порядка 20 кДа и
обладают фолдингом в виде β-сэндвича (Рисунок 11.Б). Молекула представляет собой
эллипсоидный домен, образованный двумя или тремя β-листами, сложенными по
отношению друг к другу практически под углом 900, и одной α-спирали. β-Листы
образуют ущелье активного центра, в котором расположены каталитические остатки и
остатки, отвечающие за связывание c субстратом.
Ксиланазы 11-й семьи имеют 6-7 субсайтов связывания, из которых, в отличие
от ферментов 10-й семьи, наиболее специфичны по отношению к ксилопиранозному
кольцу субсайты -2 и -3 [58].
Ксиланазы 10 семьи более эффективны для использования в конверсии
растительной биомассы, чем ксиланазы 11-й семьи, поскольку обладают лучшим
синергизмом с другими ферментами целлюлазного комплекса и имеют лучшую
температурную стабильность, особенно при нагревании совместно с растительной
биомассой [50]
Ферменты из 10-й семьи с заметно более высокой скоростью гидролизуют
линейные ксилоолигосахариды. Для ксиланаз 11-й семьи наблюдается значительное
увеличение скорости гидролиза при удлинении цепи ксилоолигосахарида. Авторами
других исследований были предложены общие принципы действия ксиланаз –
представителей 10-й и 11-й семьи ГГ, которые могут быть сформулированы следующим
образом [51]:
• Ксиланазы 10-й семьи способны атаковать связь с невосстанавливающего конца
между незамещенным и замещенным ксилозными остатками.
• Ксиланазы 11-й семьи гидролизуют 1,4-β-гликозидную связь между двумя
незамещенными остатками ксилозы.
• Для катализа ксиланазами 11-й семьи требуется наличие трех свободных
ксилопиранозных остатков между двумя замещенными, в то время как
ксиланазам 10-й семьи требуется два свободных ксилопиранозных остатка.
• Ксиланазы 10-й семьи значительно быстрее гидролизуют ксилоолигосахариды.
• Активность ксиланаз 11-й семьи увеличивается при увеличении длины цепи
ксилоолигосахаридов.
2.5. Биохимические и физико-химические свойства ксиланаз

Свойства ферментов, такие как pH- и температурный оптимумы действия,
стабильность, специфическая активность и устойчивость к ингибиторам, во многом
определяют возможность их применения в качестве биокатализаторов в различных
областях промышленности. Ксиланазы обладают довольно широкой вариативностью
данных параметров, однако в большинстве случаев свойства ксиланаз зависят от их
исходного источника, которым могут являться микроскопические грибы, бактерии,
дрожжи и даже растения. Некоторые свойства ксиланаз из различных источников
приведены в Таблице 2.
В основном pH-оптимум действия грибных ксиланаз обычно лежит в диапазоне
значений рН от 4 до 9; температурный оптимум находится в интервале от 50 до 70 °С
(Таблица 2). Известные бактериальные ксиланазы часто функционируют в нейтральном
и щелочном диапазоне pH. Температурный оптимум действия и стабильность ксиланаз,
выделенных из бактерий, находится в более широком диапазоне. Среди бактериальных
ферментов существуют представители как термофильных, так и психрофильных
ксиланаз.
Таблица 2 - Биохимические параметры некоторых эндо-1,4-β-ксиланаз.
Оптимум
Источник Семья ГГ ММ, кДа Ссылки
pH T 0C
ГРИБЫ:
Aspergillus oryzae 10 35 5,0 50 [59]
A. terreus 11 24 6,0 50 [60]

11 23 5,0 45
Acrophialophora nainiana 11 23 7,0 55 [61]
Penicillium capsulatum 10 22 3,8 48 [62]
P. oxalicum 11 21 4,0 55 [63]
P. simplicissium 10 35 5,6 67 [53]
Myceliophthora thermophila 11 23 6,0 60 [64]

11 25 6,0 60
Malbranchea flava 11 25 9,0 60 [65]
10 30 9,0 60
Thermomices lanuginisus 11 26 6,5 65 [66]
БАКТЕРИИ:
Acidothermus cellulolyticus KIBGE 10 61 6,0 60 [67]
IB29
Bacillus amyloliquefaciens 11 19 6,8-7,0 80 [68]
B. pumilus 11 25 8,4 60 [69]
Erwinia chrysanthemi 5 42 6,0 40 [70]
Promicromonospora sp MARS 11 22 8,0 65 [71]
Pseudoalteromona shaloplanktis 8 46 5,3-8,0 35 [72]
2.6. Белковые ингибиторы ксиланаз из злаковых культур

В настоящий момент известно, что ксиланазы ингибируются большим
количеством химических веществ, в числе которых ионы металлов, такие как Hg 2+, Ag+,
Cu2+, йод-уксусная кислота и др [1]. Относительно недавно было обнаружено, что
злаковые растения содержат ингибиторы ряда ферментов, таких как α-амилазы [73],
декстраназы [74] и ксиланазы [75]. Это обуславливается защитой растений от
патогенного вмешательства микроорганизмов, которые, благодаря секретируемым
ферментам, способны гидролизовать полисахариды в клеточной стенке растений [76].
Данные ингибиторы сильно ограничивают возможности применения ксиланаз в
кормовой и пищевой промышленности.
На сегодняшний день наиболее изучены два типа белковых ингибиторов,
выделенных из зерен однодольных растений. Первый ингибитор - TAXI (Triticum
aestivum Xylanase Inhibitor), второй - XIP (Xylanase Inhibiting Protein) [77].
Представители двух типов ингибиторов отличаются между собой по содержанию в
зернах различных злаковых культур, а также строением и специфичностью по
отношению к ксиланазам из 10-й и 11-й семьи ГГ. Стоит отметить, что ингибиторы
ксиланаз были обнаружены в пшенице, во ржи, и в меньшем количестве в ячмене и
кукурузе (Таблица 3).
Таблица 3 - Содержание белковых ингибиторов ксиланаз в зернах различных злаков
(мкг/г) [78].
Источник TAXI-тип XIP-тип
Пшеница 38 80
Твердая пшеница 11 14
Рожь 21-37 95
Ячмень 4-5 3
Кукуруза - 2
2.6.1. TAXI-тип белковых ингибиторов ксиланаз

Впервые ингибиторы типа TAXI были обнаружены и выделены из зерен пшеницы
(Triticum aestivum) [78]. Данная группа ингибиторов является наиболее изученной.
Белковые ингибиторы в ней были разделены на две группы: TAXI-I и TAXI-II. Белки
групп TAXI-I и TAXI-II обладают массой около 40 кДа, pI 8,8 и 9,3 соответственно, и не
содержат углеводов [79]. В злаковых растениях TAXI существуют в виде двух изоформ
- А и В. Вторая форма В образуется за результате ограниченного протеолиза исходной
формы A, состоящей из двух полипептидных цепей с молекулярной массой 29 и 11 кДа.
TAXI-I, TAXI-II специфичны по отношению как к грибным, так и к
бактериальным ксиланазам 11-й семьи ГГ, но не ингибируют ксиланазы 10-й семьи и
другие ксиланолитические ферменты: α-L-арабинофуранозидазы и β-ксилозидазы [80].
Активность TAXI-I проявлялась на всех ксиланазах 11-й семьи ГГ, в то время как TAXI-
II не ингибировал некоторые ксиланазы или демонстрировал слабое ингибирование [81,
79].
Ингибирование ксиланаз TAXI осуществляется по обратимому конкурентному
механизму. Соотношение фермента и ингибитора составляет 1:1. Было установлено, что
TAXI подобные ингибиторы проявляют максимум активности при кислом значении pH
и умеренной температуре (30-40 °С).
В 2004 году были получены кристаллические структуры TAXI-I и комплексов
ингибитора с ксиланазами 11-й семьи ГГ из A. niger и B. subtilis [82, 83]. TAXI-I состоит
из двух доменов, которые имеют вид β-барреля, и проявляет структурную гомологию с
семьей протеаз. В структуре ингибитора сохранилось ущелье между двумя доменами, в
котором находится активный центр у протеаз. Как показал анализ структуры комплекса
фермента с TAXI-I, ингибитор полностью блокирует активный центр ксиланазы. А.о.
TAXI-I H374 блокирует два а.о. в активном центре E79 и E170 и взаимодействует с D37,
при этом остатки L292, F375 и T376 ингибитора закрывают субсайты связывания
ксиланазы. При этом а.о. H374 расположен между двумя каталитическими остатками
ксиланазы – E79 и E170 (Рисунок 12).
Рисунок 12 – Структура комплекса TAXI-I и ксиланазы A. niger (1T6G.PDB) [82].
Молекулы фермента и ингибитора изображены серым и черным цветом соответственно
[84].
Для определения роли влияния H374 в TAXI-I а.о. гистидина был заменен на
аланин, глутамин и лизин методом сайт-направленного мутагенеза [85]. Изучение
параметров мутантных TAXI-I форм установило, что все а.к. замены привели к
увеличению констант скорости диссоциации комплекса ингибитора с ксиланазами A.
niger, T. longibrachiatum, B. subtilis в 3-80 раз, при этом константы скорости ассоциации
комплекса уменьшились до 8 раз. На основании полученных данных был сделан вывод,
что H374 играет большую роль в стабилизации комплекса с ксиланазами, чем в его
образовании.
2.6.2. XIP-подобные белковые ингибиторы ксиланаз
XIP впервые был обнаружен и выделен из пшеничной муки [86], а потом и из
других злаковых растений (Таблица 3). XIP обладает молекулярной массой порядка 30
кДа и pI 8,8, он гликозилирован, примерное содержание углеводов оценивается в 2 %.
XIP обладает довольно широким рН оптимумом от 4 до 7 [87].
Отличительной особенностью XIP подобных белковых ингибиторов является их
бифункциональность - они способны ингибировать ксиланазы как 10-й, так и 11-й семьи
ГГ. Присутствие XIP подавляет активность большинства ксиланаз из грибных
источников и не ингибирует активность ксиланаз из бактерий. Позже было обнаружено,
что ряд ксиланаз не проявляет чувствительности к XIP. К ним относятся ксиланаза
Talaromyces emersonii [88], XylA и XylB Fusarium graminearum [89, 90], XynA
Neocallimastix [91], XynB P. funiculosum [92], XynA и XynB M. thermophila [93]. Как и в
случае TAXI, белковые ингибиторы типа XIP действуют по обратимому конкурентному
механизму, со стехиометрией комплекса 1:1.
В 2003 и 2004 году были получены кристаллические структуры XIP и комплекса
ксиланазы Xyn10A A. nidulans и XIP [94, 95]. Молекула XIP имеет вид (β/α)8-барреля.
Было установлено, что ингибитор образует специфические взаимодействия с а.о.
ксиланазы на поверхности активного центра. Две ТИМ-бочки располагаются по
отношению друг к другу под углом 900. Одна из α−спиралей ингибитора
взаимодействует с петлями расположенными на поверхности ―ущелья‖ активного
центра ксиланаз 10-й семьи ГГ, закрывая при этом субсайты связывания фермента с
субстратом. Остаток ингибитора K234, расположенный на этой спирали, образует
солевой мостик с каталитическим остатком E131 и водородную связь через молекулу
воды с E239 ксиланазы Xyn10А A. nidulans (Рисунок 13.А). А.о. ингибитора H232
занимает положение ксилопиранозного кольца в субсайте связывания +2. Субсайты от -
3 до +1 взаимодействуют с K246, Y238, K234, N235 XIP соответственно. Важную роль в
образовании комплекса играют взаимодействия кластеров ароматических остатков
ксиланазы, расположенных в активном центре, и ингибитора.
При изучении комплекса XIP c ксиланазой Xyn11А P. funiculosum 11-й семьи ГГ
было установлено, что одна из петель ингибитора практически по всей длине пересекает
―ущелье‖ активного центра ксиланазы, закрывая субсайты связывания фермента с
субстратом, при этом остаток XIP R149 образует направленный солевой мостик с
каталитическим остатком E176 ксиланазы (Рисунок 13.Б) [95]. А.о. петли XIP
взаимодействуют с субсайтами связывания субстрата от -3 до -1.
Таким образом, XIP подобные ингибиторы ксиланаз имеют два независимых
центра связывания, один из которых отвечает за специфическое взаимодействие с
ксиланазами 10-й семьи, а другой - с ферментами 11-й семьи (Рисунок 13.В).
Хотя основной движущей силой ингибитора являются процессы связывания,
происходящие в ―ущельях‖ активных центров ксиланаз, нельзя недооценивать вклад
взаимодействий, протекающих на поверхности белков. Именно они во многом
определяют специфичность XIP. Напомним, что данный тип ингибиторов действует в
большинстве случаев только на грибные ксиланазы. А.к. выравнивание
последовательностей грибных и бактериальных ксиланаз позволило установить, что,
вероятно, устойчивость бактериальных ксиланаз 10-й и 11-й семьи ГГ к ингибированию
определяется разницей в организации петель, расположенных на поверхности активных
центров и формирующих ―ущелье‖ активного центра. Более длинные петли создают
стерические затруднения для образования комплекса ингибитора с ферментом. Так,
например, у большинства исследованных бактериальных ксиланаз 10-й семьи эти петли
имеют длину, большую на 4-29 а.о. по сравнению с ферментами грибных продуцентов.
В случае ксиланаз 11-й семьи длина инсерций варьирует значительно меньше (1-3 а.о.),
однако и этого достаточно для предотвращения взаимодействия XIP c ферментами [94].
Рисунок 13 - Структура комплекса XIP c ксиланазами 10-й и 11-й семьи ГГ (1TA3.PDB и
1TE1.PDB соответственно). [95]. A - Комплекс с ксиланазой 10A A. nidulans; Б -
Комплекс с ксиланазой 11A P. funiculosum; В - Теоретическая совмещенная структура
комплекса ингибитора с двумя ксиланазами, полученная совмещением 1TA3.PDB и
1TE1.PDB по XIP. Молекулы фермента и ингибитора изображены серым и черным
цветом соответственно [84].
ГЛАВА 3. Основные направления использования ксиланаз
В последние годы биотехнологическое использование ксиланов и ксиланаз
значительно выросло [96]. Основными направлениями использования ксиланаз в
промышленности являются кормовая, пищевая, целлюлозно-бумажная промышленность
(ЦБП), а также производство биотоплива [97].
3.1. Ксиланазы в целлюлозно-бумажной промышленности

В ЦБП для получения бумаги древесина на начальном этапе подвергается
Крафт-процессу - cульфатной или щелочной варке, при котором из древесины удаляется
до 90% лигнина и гемицеллюлоз. Сульфатный метод варки наиболее распространенный
способ производства целлюлозы в мире; его отличие от щелочной варки в том, что
полученная целлюлоза обладает лучшей механической прочностью. В результате варки
образуется целлюлозная пульпа, которая не имеет достаточной белизны для дальнейшей
эксплуатации из-за оставшегося лигнина [98]. В связи с чем производят ее отбеливание,
которое осуществляется различными окисляющими агентами. Для этого используют
хлор, оксид хлора, перекись водорода и озон [99]. Использование отбеливателей на
основе хлора приводит к тому, что в качестве побочных продуктов процесса получаются
токсичные вещества, такие как диоксины и полихлорфенолы. Такие токсичные отходы
устойчивы к биодеградации и наносят значительный вред окружающей среде.
Применение после Крафт-процесса ферментативной обработки целлюлозы -
биоотбеливания - позволяет на 15-20% уменьшить расходы и увеличить эффективность
отбеливания.
Впервые возможность применения ксиланаз для отбеливания целлюлозы была
показана в 1986 году [100]. Механизм, с помощью которого ферменты способствуют
повышению эффективности последующего отбеливания, еще до конца не ясен.
Возможно, ксиланазы, гидролизуя ксиланы, осажденные на волокнах целлюлозы,
увеличивают пористость пульпы и, соответственно, увеличивают ее доступность для
отбеливающих агентов [101, 102]. Существует также предположение, что ферменты
способствуют высвобождению хромофоров или остаточного лигнина, ассоциированных
или ковалентно связанных с углеводами [103].
После того, как целлюлозная масса прошла сульфатно-щелочную варку, ее
отмывают водой, однако pH и температура среды остаются достаточно высокими.
Поскольку процесс делигнификации идет непрерывно, это в значительной степени
ограничивает применение ферментов. Этот факт стимулирует получение и поиск
активных, термостабильных и стабильных в щелочных условиях ксиланаз.
Хотя основную роль в биоотбеливании целлюлозы отводят ксиланазам, не
исключено также участие и других ферментов, в частности β-маннаназ и эндоглюканаз,
обладающих широкой специфичностью [104].
3.2. Использование ксиланаз в качестве компонента кормовых добавок

Применение ксиланаз в качестве премикса при производстве комбикормов
является одним из основных направлений их использования. Введение ФП в корма
преследует две основные цели – повышение их усвояемости и увеличение
продуктивности питания сельскохозяйственных животных и домашней птицы [105]. В
настоящее время практически во всех странах мира использование ферментов для этих
целей стало повсеместным. Основным стимулом для развития применения ферментов
является возможность уменьшения расходов. При добавлении ферментов появляется
возможность переходить на менее дорогие и менее питательные рационы на основе
трудноусвояемых злаков, таких как рожь, ячмень, овес, непродовольственная пшеница.
Однако было показано, что замена кукурузы в кормовом рационе птиц на зерно
ячменя или ржи, приводит к замедлению их роста и в редких случаях даже к гибели
[106]. Главной причиной этого явления оказались водорастворимые полисахариды:
арабиноксилан (рожь и пшеница), β-глюкан (ячмень и овес) [107].
У жвачных животных полисахариды расщепляются ферментами микрофлоры
рубца и не создают препятствий нормальному протеканию процесса пищеварения. У
свиней и птиц частичное переваривание полисахаридов происходит лишь в толстом
отделе кишечника, с помощью ферментов симбиотических организмов. В тонком
кишечнике сильно набухающие полисахариды (ксиланы, β-глюканы) создают вязкую,
гелеобразную среду, в которой затруднен гидролиз основных питательных компонентов
и всасывание желудком продуктов гидролиза. Есть предположение, что данные
полисахариды выстилают стенки пищеварительного тракта, создавая механический
барьер для всасывания питательных веществ.
Основной функцией ферментных препаратов является деградация
полисахаридов с целью снижения вязкости корма и увеличения эффективности
усвояемости питательных веществ. Использование ксиланазных препаратов актуально в
случае кормов, включающих рожь и пшеницу, в зернах которых содержится большое
количество арабиноксиланов. Сельскохозяйственные животные и домашняя птица не
способны продуцировать собственные ксиланазы, поэтому добавление этих ферментов в
кормовые рационы, особенно на ранних стадиях развития организма животного,
позволяет добиться существенных результатов [108, 109]. Наряду с ксиланазными
ферментными препаратами в качестве премикса при производстве комбикормов также
используют препараты β-глюканаз, пектиназ, α-галактозидаз, амилаз, фитаз и ферментов
литического действия [105].
Стоит отметить, что наличие белковых ингибиторов в злаках, а также
особенности процесса пеллетизации кормовых смесей накладывают ряд ограничений
при использовании ферментов в качестве кормовых добавок. В связи с этим при
разработке ксиланазных препаратов для кормовой промышленности необходимо
учитывать ряд требований:
▪ Ксиланазы должны проявлять высокую активность в условиях (Т, pH),

близких к физиологическим;
▪ Ферменты должны быть стабильными в условиях пеллетезации, т.е. при

кратковременной обработке высокой температурой, которая необходима
для получения гранулированного корма;
▪ Наличие устойчивости у ксиланаз к воздействию белковых ингибиторов.

В случае отсутствия устойчивости к ингибированию эффективность
применения ферментов сильно снижается.
3.3. Другие перспективные направления применения ксиланаз

В заключение данной главы следует отметить ряд биотехнологических
процессов с участием ферментов ксиланазного комплекса. Однако, как правило,
необходимый эффект в этом случае достигается за счет совместного использования
ксиланаз с другими карбогидразами.
Так, в пищевой промышленности ксиланазы вместе с α-амилазами, глюкозо-
оксидазами, протеазами применяются при производстве хлеба. За счет добавления
ферментов при приготовлении теста происходит частичное разрушение
арабиноксиланов и крахмала злаков. Это способствует улучшению реологических
свойств теста и, в конечном счете, к увеличению объема и пористости хлеба [110].
Ацидофильные ксиланазы в комплексе с пектиназами используются при
производстве соков и вин. Добавление ферментов на стадиях отжима приводит
большему выходу сока, а также способствует сохранению естественных масел и
витаминов. Использование дрожжей с клонированным геном XynA A. nidulans при
производстве вина улучшает его естественный аромат [111].
Многие ученые полагают, что единственной реальной на сегодняшний момент
альтернативой бензину, используемого в качестве моторного топлива, может служить
этанол. При этом для его производства предполагается использовать возобновляемое
лигноцеллюлозное сырье, в виде отходов сельского хозяйства, целлюлозно-бумажной и
деревообрабатывающей промышленности. Для эффективного гидролиза
лигноцеллюлозного материала до глюкозы, конечной целью которого является
получение этанола, требуется согласованное действие комплекса гидролитических
ферментов. В первую очередь следует отметить необходимость наличия для данного
процесса сбалансированного количества экзо- и эндоглюканаз, которые гидролизуют
непосредственно целлюлозу. В то же время было показано, что немаловажную роль при
глубокой конверсии растительного сырья наряду с целлюлазами играют и так
называемые дополнительные ферменты (accessory enzymes). Ксиланазы, как
сопутствующие целлюлазам ферменты, разрушают ассоциированные комплексы
целлюлозы, ксилана и лигнина, препятствуют необратимой адсорбции целлюлаз на
лигнине и за счет этого в целом ускоряют процесс и увеличивают эффективность
конверсии растительного материала.
Также ксиланазы находят небольшое применение в фармацевтической
промышленности. Ксиланазы используются в комплексе с другими ферментами для
получения ксилоолигосахаридов, -D-ксилопиранозила, для последующего получения
ксилита и этанола [112]. Среди сахаров, используемых при производстве этанола, -D-
ксилопиранозильные остатки составляют от 5-20%. Ксилит является многоатомным
спиртом с подслащивающей способностью, сравнимой с сахарозой. Он подходит для
людей, страдающих диабетом и ожирением, рекомендуется для профилактики
остеопороза, респираторных инфекций и при расстройствах метаболизма почек. Хотя
ферментативный гидролиз ксилана с целью получения ксилита является перспективным,
в настоящее время ксилит в основном получают с помощью химических катализаторов
[113].
Таким образом, ксиланазы имеют широкий спектр применения в различных
отраслях промышленности, таких как: ЦБП, пищевой и кормовой промышленности, в
фармпроизводстве. Из-за того, что ксиланазы являются биодеградируемыми, они могут
применяться в пищевой промышленности. Использование ксиланаз в промышленности
приводит к более безопасному и экологичному производству. С применением генно-
инженерных подходов для получения новых форм ксиланаз, обладающих
определенными операционными параметрами, расширилась область применения
ксиланаз.
ГЛАВА 4. Способы улучшения операционных параметров ксиланаз
Для эффективного применения ферментов в биотехнологических процессах они
должны обладать необходимой операционной стабильностью. Например, необходимо
использовать термостабильные, активные, неингибируемые ксиланазы в качестве
премикса при производстве комбикормов. Одним из подходов к получению
операционно-стабильных ксиланаз является поиск организмов в природе, которые
секретируют подходящие по параметрам ферменты [114, 115]. Другим подходом
является улучшение параметров имеющегося фермента методами белковой инженерии,
иммобилизации или с помощью нанобиохимии. В связи с развитием генно-инженерных
методов, произошло значительное распространение промышленного производства
ксиланаз и ФП с необходимыми операционными параметрами.
4.1. Биоинженерия ферментов

Белковая инженерия наиболее широко используется для улучшения активности,
стабильности и других параметров существующего фермента или для того, чтобы
создать новый фермент, обладающий необходимыми свойствами [116]. Это может быть
достигнуто путем замены соответствующих остатков а.к. последовательности или
присоединением специфических молекул к определенным сайтам связывания в
ферменте, который, в свою очередь, может изменить свою трехмерную структуру.
Практически для осуществления а.к. замен используют 3 метода: сайт-направленный
мутагенез; направленная эволюция; направленная эволюция определенного участка а.к.
последовательности. Такими методами может быть улучшена как термостабильность,
так и другие параметры фермента, поскольку свойства фермента определяются, в
основном, его первичной структурой, т. е. а.к. последовательностью.
Как правило, биоинженерия фермента включает три этапа: первый этап
подразумевает выделение соответствующего фермента в гомогенном виде и
определение его структуры. Базы данных, содержащие полные а.к. последовательности
белков и функциональную информацию о ферментах, уже разработаны [117]; на втором
этапе имеющиеся данные сверяются с информацией о ферментах, а именно,
производятся множественные выравнивания а.к. последовательности исследуемого
фермента с а.к. последовательностями ферментов с лучшими параметрами, чтобы
определить его критические и консервативные а.к. участки, которые могут быть
заменены или наоборот должны быть обязательно сохранены [118]. Затем с помощью
различных вычислительных веб-серверов и молекулярного моделирования выполняется
анализ фермента с запланированными модификациями или вычисление теоретически-
оптимальных аминокислотных замен с целью, например, увеличения
термостабильности (BRENDA, AMENDA, FRENDA). Наконец, третий этап включает в
себя модификацию ферментов с использованием сайт-направленного мутагенеза или
метода направленной эволюции. В ряде работ показано успешное применение белковой
инженерии для повышения термостабильности ксиланаз [119, 120, 121, 122].
Метод сайт-направленного мутагенеза заключается в проведении точечных -
одинарных, двойных или множественных а.к. замен в ферменте. Метод требует знание
а.к. последовательности и трехмерной структуры белка или структуры близких по
гомологии белков. Пространственную структуру белка обычно получают при изучении
кристаллографических данных или используют современные компьютерные методы
моделирования. Методом сайт-направленного мутагенеза возможно увеличить
термостабильность фермента за счет изменения структуры глобулы. Наиболее
распространенные подходы предполагают создание дисульфидных мостиков,
увеличение плотности гидрофобных ядер, увеличение стекинг-взаимодействия
ароматических остатков, образование дополнительных водородных связей, ионных пар,
увеличение внутримолекулярного взаимодействия элементов вторичной структуры,
уменьшение площади гидрофобных участков поверхности белковой глобулы,
закрепление свободных концов а.к. цепи, увеличение числа внутримолекулярных связей
и увеличение жесткости третичной структуры.
Метод направленной эволюции осуществляется проведением множественных
случайных а.к. замен и отборе мутантных форм белка с улучшенными параметрами.
Достоинствами данного метода являются возможность применения ко всем ферментам
и отсутствие необходимости данных об а.к. последовательности и трехмерной
структуры фермента. Отрицательной стороной является скрининг десятков тысяч
мутантных форм на наличие положительных мутаций. Для этого необходим быстрый
или автоматизированный метод определения изменяемого параметра. Данный метод
позволяет улучшить температурную стабильность, активность фермента и другие
параметры. Например, в работе [123] была получена мутантная форма ксиланазы А 11-й
семьи ГГ Bacillus subtilis с 8 а.к. заменами
(Q7H/G13R/S22P/S31Y/T44A/I51V/I107L/S179C), которая обладала на 30 °С более
высоким температурным оптимумом, более высоким рН-оптимумом (на 0,5 единицы), и
в 3 раза лучшей стабильностью при щелочных значениях рН по сравнению с ферментом
дикого типа. В работе [124] термостабильность ксиланазы 10-й семьи ГГ Cellvibrio
mixtus была увеличена методом направленной эволюции с помощью двойной а.к.
замены A334V/G348D. Температура фазового перехода в итоге была увеличена на 2 °С
по сравнению ферментом дикого типа. Увеличение термостабильности ксиланазы 11-й
семьи ГГ afxynG1 Aspergillus fumigatus RT-1 наблюдалось для четырех мутантных форм
(T16A/T39I/L176Q, S68R, A60D и Q47P/S159R) после проведение направленной
эволюции [120]. Остаточная активность после 1 часа инкубирования при 70 °С
составила 24, 26, 33, 46% от начальной для мутантных форм T16A/T39I/L176Q, S68R,
A60D и Q47P/S159R соответственно, в то время как ксиланаза дикого типа полностью
потеряла активность через 50 мин инкубирования.
Направленная эволюция выбранного участка последовательности объединяет
достоинства вышеописанных методов и заключается в компьютерном моделировании
направленной эволюции, теоретический отбор положительных мутантных форм и
проведение вероятных замен методом сайт-направленного мутагенеза [125].
4.2. Внутримолекулярные взаимодействия и структурные параметры, влияющие

на термостабильность ферментов
Термостабильность является важным параметром промышленно значимых
гидролитических ферментов: понимание структурной основы стабильности будет
лежать в основе будущей биотехнологической и биофармацевтической эксплуатации
этих биокатализаторов. Важной задачей в науке о белках является раскрытие
принципов, с помощью которых модулируется термостабильность белков. Общая
картина заключается в том, что не существует универсального, уникального,
адаптивного механизма, а скорее существует сложное сочетание различных факторов,
которое часто отличается в зависимости от белка или семейства белков, В связи с этим,
возникает много сложностей при объяснении наблюдаемых эффектов.
Третичная структура белка образуется за счет множества различных
взаимодействий между а.о., включая гидрофобные, ионные, ароматические (π-π),
водородные связи, дисульфидные мостики и т.д. (Таблица 4) [126, 127]. Очевидно, что
а.к. замены, проводимые методами генной инженерии, направлены на усиление
имеющихся или образование новых взаимодействий.
Таблица 4 - Внутримолекулярные взаимодействия в белках и их свойства
Аминокислотные Свойства
взаимодействия
Гидрофобные Остаются почти постоянными
при температуре выше 25 °С.
эффекты Более гидрофобное ядро
наблюдается в термостабильных
белках. Ослабевают при низких
температурах, вызывая
денатурацию.
Солевые мостики Более распространены в
термостабильных белках.
Образуют сети для увеличения
термостабильности.
Другие ионные Стабилизация за счет

взаимодействий заряженных
взаимодействия остатков с водой.
Наблюдается меньшее
отталкивание
одноименнозаряженных ионов
при повышенной температуре.
π−π взаимодействия Чаще присутствуют в
термостабильных ферментах.
между Образуют π−π кластеры,
ароматическими увеличивая термостабильность.
Менее распространены в
остатками психрофильных ферментах
Катион-π Сильный стабилизационный

эффект около температур
взаимодействия фазового перехода белка.
Термостабильные белки чаще
содержат аргинин в этих
взаимодействиях.
Аминокислотные Свойства
Дисульфидные Увеличивают термостабильность
при нахождении в гибких
мостики (подвижных) областях белка. Не
влияют на термостабильность при
наличии в структурных участках.
4.2.1. Гидрофобные эффекты

Одним из основных стабилизирующих эффектов являются гидрофобные
взаимодействия. Гидрофобные взаимодействия являются движущей силой при
сворачивании белка в третичную структуру, поскольку именно гидрофобные боковые
группы а.о. стремятся избежать невыгодных взаимодействий с полярными группами или
молекулами воды. Данные взаимодействия практически не изменяются при увеличении
температуры от 25 ° до 100 °С относительно изменений других взаимодействий, однако
имеют критическое влияние на функциональность фермента при низких температурах.
При комнатной температуре, когда гидрофобные эффекты максимальны, неполярные
молекулы на поверхности фермента контактируют с водой, что приводит к
реорганизации молекул воды с целью уменьшения энтальпии. Результатом является
снижение энтропии растворителя. По мере увеличения температуры системе становится
более выгодным потерять уменьшение энтальпии, чем реорганизовывать
(структурировать) нагретую воду.
Важной структурой для стабилизации ферментов является гидрофобное ядро.
Белки из термофильных организмов обычно имеют более плотное гидрофобное ядро по
сравнению с их мезофильными гомологами [128]. Энергия взаимодействий в
гидрофобном ядре увеличивается на 9% от мезофилов к термофилам, и еще на 23% от
термофилов к гипертермофилам. Также наблюдалось значительное усиление
взаимодействий между гидрофобными и ароматическими, незаряженными полярными
а.о. при переходе от мезофилов к гипертермофилам [129]. Многократные исследования
показывают, что эффективность упаковки гидрофобного ядра, по-видимому, связана с
температурной стабильностью белка. Действительно, у термостабильных белков, не
наблюдается полости в центральных областях глобулы [130, 131].
Например, методом сайт-направленного мутагенеза были получены 4 мутантные
формы ксиланазы II T. reesei 11-й семьи ГГ. Исследование термостабильности
мутантных форм ксиланазы II с заменами S80T, S149T и S146T установило, что периоды
полуинактивации при 55 °C составили 20, 25, 23, 3 мин для фермента дикого типа и
мутантных форм S80T, S149T и S146T соответственно. Двойная а.к. замена S80T/S149T
привела к более существенному увеличению термостабильности ксиланазы II T. reesei,
период полуинактивации в данном случае составил 37 мин при 55°C. Положительный
эффект а.к. замены S80T авторы объясняют образованием новой водородной связи T80 c
I84, которая приводит к стабилизации всего β-листа, на котором располагаются I84 и
каталитический а.о. E85. А.к. замена S149T привела к более плотной упаковке
ферментной глобулы за счет образования новых гидрофобных взаимодействий между
T149 и V59 и I60 [132].
Для повышения термоустойчивости мезофильной ксиланазы AuXyn10A 10-й
семьи ГГ из Aspergillus usamii было использовано компьютерное моделирование [133], и
на основе сравнения значений β-факторов ксиланаза подверглась сайт-направленному
мутагенезу. В первой мутантной форме был заменен сегмент в N-конце фермента (Y25 -
P34) на соответствующий сегмент из более термостабильной ксиланазы Themoascus
aurantiacus (N14 - A32). Также была получена мутантная форма с двойной а.к. заменой
S286G/H288F. Вторая форма экспрессировалась, и определение ее температурной
стабильности показало, что температурный оптимум активности мутантной формы
увеличился на 10 °С, а время полуинактивации при 55 °С увеличилось в 10,4 раза по
сравнению с показателями фермента дикого типа и составило 72 мин. По мнению
авторов, значительное увеличение термостабильности наблюдается из-за усиления
гидрофобных взаимодейсвтвий между а.о. G286, F288 и F284 AuXyn10A и из-за
увеличения жесткости третичной структуры на С-конце ксиланазы.
4.2.2. Солевые мостики и ионные взаимодействия

Установленным является тот факт, что солевые мостики способствуют
увеличению термостабильности ферментов. Температурная стабильность,
обусловленная наличием солевых мостиков, была убедительно экспериментально
продемонстрирована с использованием осуществления двойных точечных мутаций
[134], а также компьютерного вычисления статистических потенциалов и
моделирования [135]. Эти взаимодействия в основном расположены на поверхности
белковой глобулы и часто обусловлены наличием аргинина, который может
одновременно участвовать в образовании двух солевых мостиков или водородных
связей. В работе [136] Xyn11A-LC 11-й семьи ГГ Bacillus sp. SN5 подвергли сайт-
направленному мутагенезу. На поверхности ксиланазы были заменены сразу три а.о. на
аргинин: Q51R, T55R и K111R с целью создания дополнительных солевых мостиков с
D14, D88 и E125 соответственно. Создание дополнительных ионных взаимодействий
привело к увеличению температурного оптимума активности и температуры фазового
перехода мутантной формы на 5 и 11,6 °C соответственно. Было установлено, что
количество заряженных групп на поверхности белковой глобулы растет с увеличением
термостабильности ферментов от психрофильных, мезофильных к термофильным
ферментам. Это привело к предположению, что прямые взаимодействия между
растворителем и заряженными поверхностными остатками обеспечивают лучшую
термостабильность при повышенных температурах [137]. Проведение точечных а.к.
замен на поверхности ферментной глобулы используется в качестве подхода к
увеличению термостабильности исследуемого фермента, однако успех данного подхода
зависит от многих факторов: типа замещения, окружения и своей роли в общей сети
ионных взаимодействий в белке [138, 139, 140].
Также ионные взаимодействия способствуют увеличению структурной жесткости
за счет образования взаимодействий между элементами вторичной структуры [141].
Отмечается, что ключевые узлы (скопления) солевых мостиков также вносят
существенный вклад в температурную стабильность [142]. С целью увеличения
термостабильности методом сайт-направленного мутагенеза были получены мутантные
формы ксиланазы GthC5Xyl Geobacillus thermodenitrificans C5 10-й семьи ГГ: R81P,
H82E, W185P, D186E, W185P/D186E, H82E/W185P/D186E [143]. По мнению авторов,
две а.к. замены H82E и D186E должны были привести к образованию новых
водородных, и, возможно, ионных взаимодействий. А.к. замены R81P и W185P должны
были привести к стабилизации ксиланазы за счет увеличения жесткости третичной
структуры. После изучения биохимических параметров гомогенных мутантных форм,
было уставлено, что время полуинактивации при 70 °С составило 8, 6, 16, 15, 15, 15, 70
мин для фермента дикого типа и мутантов R81P, H82E, W185P, D186E, W185P/D186E,
H82E/W185P/D186E соответственно. Таким образом, обе замены, H82E и D186E
привели к стабилизации GthC5Xyl – время полуинактивации увеличилось с 8 до 16 и 15
мин соответственно. Однако значительно больший эффект стабилизации наблюдался
при изучении параметров мутантной формы с тройной а.к. заменой H82E/W185P/D186E.
Ее время полуинактивации увеличилось в 15, 9, 5 раз при 65, 70, 75 °С соответственно, а
температурный оптимум – на 11 °С относительно формы дикого типа.
4.2.3. π–π взаимодействия

Взаимодействия между ароматическими остатками играют важную роль в
стабилизации белков [144]. Количество попарно π–π взаимодействий увеличивается с
увеличением температуры роста организма хозяина, от психрофилов к
гипертермофилам [145]. Более предпочтительными конформациями в белках из
термофильных организмов являются т-образные ортогональные и плиточные геометрии,
в то время как параллельная геометрия наблюдается меньше.
Значительное влияние π–π взаимодействий на термостабильность ксиланаз было
продемонстрировано в работе [146]. Авторами были проведены а.к. замены на N- и C-
концах ксиланазы Bacillus sp. NG-27 10-й семьи ГГ: F4A, F4W, W6A, Y343A.
Температура фазового перехода мутантных форм с а.к. заменами F4A, W6A, Y343A
уменьшилась на 4, 10, 10 °С относительно формы дикого типа соответственно. В то
время как а.к. замена F4W не повлияла на термостабильность ксиланазы. Значительное
уменьшение температурной стабильности трех мутантных форм авторы статьи
объясняют нарушением ароматических и Ван-Дер-Ваальсовых взаимодействий на N- и
C-конце ксиланазы. При замене фенилаланина на триптофан не произошло нарушения
ароматических взаимодействий на N-конце, и не наблюдалось изменения температурной
стабильности.
4.2.4. Катионно–π взаимодействия

Несколько исследований указывают на важность катионно-π взаимодействий для
термостабильности фермента [147, 148]. Наиболее важными являются катионно–π
взаимодействия с участием аргинина, заряд которого делокализован на гуанидиновой
группе. Более того, эксперименты с сайт-направленным мутагенезом показали, что
катионно–π взаимодействия слабо влияют на термостабильность при комнатной
температуре, а в некоторых случаях даже приводят к дестабилизации, но они оказывают
сильное стабилизирующее воздействие при повышенных температурах, особенно при
температурах близких к температуре плавления белка [149]. В белках из психрофильных
организмов наблюдается меньшее число катион–π взаимодействий, чем в белках из
термофильных источников, что согласуется с представлением, что адаптация к
пониженным температурам достигается ослаблением внутримолекулярных
взаимодействий для обеспечения достаточной гибкости ферментной глобулы [150].
4.2.5. Дисульфидные мостики

Установлено, что нарушение нативных дисульфидных мостиков в
термостабильных белках приводит к потере термостабильности за счет увеличения
конформационной энтропии [151, 152, 153]. С другой стороны, создание дисульфидных
связей дает противоречивые результаты, которые в решающей степени зависят от
положения, в котором вводится новое взаимодействие [154, 155]. Некоторые результаты
свидетельствуют о том, что внедрение дисульфидных мостиков в гибких регионах
способствует повышению термостабильности, в то время как введение в полностью
структурированных регионах не оказывает влияния или оказывает слабый эффект [156].
В психрофильных ферментах наблюдаемые дисульфидные мостики скорее имеют
функциональную роль, чем стабилизирующую, например, путем обеспечения
необходимой конформации в активных областях сайта [156, 157].
В работе [158] описывается, как группа исследователей методом сайт-
направленного мутагенеза ввела две дисульфидные связи в ксиланазе II 11-й семьи ГГ T.
reesei. Обе мутантные формы демонстрировали лучшую температурную стабильность.
Первый мутант (с дисульфидным мостиком между N-концом фермента и β-листом) и
второй мутант (с дисульфидным мостиком между α-спиралью и тем же β-листом)
показывали большее время полуинактивации при 60 °С – выше на 9,6 и 7,1 мин
соответственно по сравнению с ферментом дикого типа, для которого время
полуинактивации составляло 3,9 мин. Стабилизирующий эффект дисульфидного
мостика на структуру фермента наблюдается за счет уменьшения энтропии. Обе
мутантные формы сохраняли около 20% активности после инкубирования при 70 °С в
течение 10 мин, что не наблюдалось для фермента дикого типа. Стоит отметить, что в
результате увеличения жеcткости третичной структуры путем введения дисульфидных
мостиков, наблюдалось снижение удельной каталитической активности - на 50 и 15 %
для первой и второй мутантной формы соответственно. Кроме того, обе формы
фермента демонстрировали значительное улучшение стабильности фермента в
щелочной среде, а мутант с дисульфидной связью между N-концом и β-листом обладал
повышенной устойчивостью к действию кислот. В другом исследовании ксиланаза II 11-
й семьи ГГ T. reesei подверглась сайт-направленному мутагенезу. Были проведены две
а.к. замены S110C и N154C с целью создания дисульфидного мостика. В результате, как
сообщается, время полуинактивации при 65 °С увеличилось с 1 до 14 мин [159].
В целях улучшения термостабильности ксиланазы AoXyn11A из Aspergillus
oryzae группой ученых были получены две мутантные формы фермента методом сайт-
направленного мутагенеза [160]. Первая мутантная форма содержала двойную замену,
направленную на образование дисульфидного мостика между α-спиралью и β-листом
S108C/N152C, вторая содержала такую же двойную замену и одинарную замену G22A.
Двойная а.к. замена была выбрана на основе анализа трехмерной структуры более
термостабильной ксиланазы TlXynA11A Thermomyces lanuginosus и а.к. выравнивания
двух ксиланаз. В TlXynA11A дисульфидный мостик С110-С154 соединяет α-спираль и
β-лист и играет основную роль в термостабильности ксиланазы [161]. Температурный
оптимум активности увеличился на 5 и 10 °С, период полуинактивации при 50 °С
увеличился в 1,8 и 8,4 раза относительно ксиланазы дикого типа для первой и второй
мутантной формы соответственно.
4.2.6. Терминальные N- и C- участки ферментов

В ряде работ показано, что N-конец а.к. последовательности ферментов из 10-й и
11-й семей ГГ имеет большое влияние на термостабильность. В частности, несколько
термостабильных рекомбинантных форм ксиланаз были получены с помощью замены
N-концевого пептида на соответствующую структуру из более стабильных ксиланаз
[162, 125]. В 2014 году была получена кристаллическая структура ксиланазы из 11-й
семьи ГГ (XynCDBFV) из Neocallimastix patriciarum [163]. Было идентифицировано, что
XynCDBFV имеет самый длинный N-конец среди всех членов 11-й семьи ГГ. В
XynCDBFV N-конец складывается в α-спираль и плотно прикрепляется к β-листу по
средствам дисульфидного мостика. Показано, что N-конец играет важную роль в
температурной устойчивости XynCDBFV и что дисульфидный мостик является
критическим фактором, соединяющим N-конец с основной глобулой XynCDBFV.
Поэтому было сделано предположение, что С-конец также может иметь влияние на
температурную стабильность. Была проведена работа по сравнению С-концов
ксиланазы XynCDBFV и других ксиланаз из более термофильных источников.
Оказалось, что 4 а.о. 207-SSGS-210 являются консервативными у термостабильных
ксиланаз и отсутствуют у ксиланазы XynCDBFV. Тройной мутант (N207S, G208S,
A210S) ксиланазы XynCDBFV показал большую термостабильность и лучшую
каталитическую активность по сравнению с ферментом дикого типа.
Как описывалось ранее, для повышения термоустойчивости мезофильной
ксиланазы AuXyn10A из 10-й семьи ГГ из Aspergillus usamii было использовано
компьютерное моделирование [133], и на основе сравнения значений β-факторов
ксиланаза подверглась сайт-направленному мутагенезу. Был заменен сегмент в N-конце
фермента (Y25 - P34) на соответствующий сегмент из более термофильной ксиланазы
Themoascus aurantiacus (N14 - A32). Замена N-конца привела к небольшому увеличению
термостабильности, по сравнению с улучшением параметров мутантной формы с
двойной а.к. заменой. период полуинактивации при 55 °С увеличился с 6,9 до 8 мин.
Также в работе [164] ксиланазу 10-й семьи ГГ из Coprinus cinereus подвергли
сайт-направленному мутагенезу и получили мутантную форму фермента с удаленными
5 аминокислотными остатками (PVRRK) на С-конце последовательности. После
экспрессии рекомбинантной и мутантной формы в Pichia pastoris, последняя обладала
лучшей каталитической активностью, температурной стабильностью, SDS-
устойчивостью и рН-стабильностью в щелочной среде при рН от 6 до 9. Данный эффект
авторы статьи объясняют тем, что С-конец фермента заслонял собой каталитический
центр. Удаление 5 аминокислотных остатков привело к тому, что активный центр стал
более доступным для субстрата и имел большую аффиность к березовому
глюкуроноксилану.
Аналогичный результат был продемонстрирован в работе [165]. Методом сайт-
направленного мутагенеза была получена мутантная форма ксиланазы Orpinomyces sp.
PC-2 11-й семьи ГГ с удаленными 27 остатками на N-конце фермента. По мнению
авторов работы, длинный N-конец заслонял собой активный центр и обладал высокой
подвижностью. Мутантная форма ксиланазы демонстрировала на порядок большую
каталитическую активность и лучшую термостабильность по сравнению с ксиланазой
дикого типа.
4.2.7. Жесткость и гибкость

Глобальные структурные и динамические особенности ферментов, которые
обеспечивают термостабильность при повышенных температурах или адаптацию к
низким температурам требуют отдельного обсуждения Широкая серия
экспериментальных и вычислительных исследований продемонстрировала, что
термостабильность белка связана со свойствами жесткости и гибкости белковой
структуры [166, 167]. Наиболее стабильные белки, как правило, характеризуются
повышенной глобальной конформационной жесткостью по отношению к их
мезофильным гомологам, тогда как ферменты, адаптированные к низким температурам,
обычно проявляют более высокую гибкость.
Общая закономерность в соотношении гибкости и жесткости исследовалась во
многих работах. Температурная адаптация требует сложной корреляции между
локальной гибкостью и жесткостью ферментной глобулы, причем первая важна для
активности, а вторая - для правильной конформации и стабильности [168, 169].
Как уже отмечалось ранее, в целях улучшения термостабильности ксиланазы
AoXyn11A из A. oryzae были получены две мутантные формы фермента [164]. Первая
мутантная форма содержала двойную замену, направленную на образование
дисульфидного мостика между α-спиралью и β-листом S108C/N152C, вторая содержала
такую же двойную замену и одинарную замену G22A. Замену G22A авторы статьи
объясняют высоким значением β-фактора G22, который отображает распределение
(размытость) электронной плотности в результате температурных движений и
конфигурационного беспорядка. В результате выравнивания а.к. последовательностей
AoXyn11A и а.к. последовательности более термостабильной ксиланазы TlXyn11A было
установлено, что последняя содержит аланин в данном положении. А.к. замена G22A
привела к значительному снижению β-фактора G22 и окружающих а.о. относительно
мутантной формы с дисульфидным мостиком и формы фермента дикого типа. В
результате, оптимальная температура активности увеличилась на 5 и 10 °С, период
полуинактивации при 50 °С увеличился в 1,8 и 8,4 раза относительно ксиланазы дикого
типа для первой и второй мутантной формы соответственно. Можно предположить, что
увеличение жесткости глобулы привело к большей стабилизации, чем создание
дисульфидного мостика.
Введение двух а.о. пролина с целью увеличения термостабильности ксиланазы
Aspergillus sulphureus 11-й семьи ГГ было описано в работе [170]. Мутантные формы
T46P и S136P и форма с двойной а.к. заменой T46P/S136P демонстрировали немного
лучшую термостабильность, чем фермент дикого типа. Период полуинактивации при 60
°C составил 1,8; 2,5; 2,1; 1,9 мин для фермента дикого типа и мутантных форм T46P;
S136P; T46P/S136P соответственно. По мнению авторов работы, увеличение
термостабильности связано с увеличением жесткости третичной структуры, которое
происходит при введении а.о. пролина. Стоит отметить, что это незначительное
увеличение температурной стабильности. В той же работе описываются мутантные
формы ксиланазы с дополнительным дисульфидным мостиком: T53C/T142C;
T53C/T142C/T46P; T53C/T142C/S136P период полуинактивации которых при 60 °C
составил 32,5, 39,6 и 8 мин соответственно.
4.2.8. Петли
Петли тесно связаны с конформационной подвижностью белков и, как
непосредственное следствие, оказывают влияние на их термостабильность. Обычно
укорочение петли приводит к термостабилизации, но величина этого эффекта все еще до
конца не ясна, вероятно, потому, что она во многом зависит от белка и от окружения
петли. Термодинамическая потеря энтальпии из-за укорочения петли преодолевается
усилением конформационной энтропии сложенного состояния и/или потерей энтропии в
развернутом состоянии [171, 172].
Некоторые исследования указывают, что делеции специфических поверхностных
петель, а также введение остатков пролина для увеличения их жесткости, оказывают
минимальное влияние на термостабильность белков [173]. В других работах, напротив,
существенное увеличение термостабильности наблюдается в белках, в которых петли
были укорочены [176, 177]. Также наблюдалось увеличение температурной
устойчивости мезофильных белков, в которых были заменены петли на
соответствующие из гипертермостабильных гомологов [174]. Температурная
зависимость динамики петли была исследована вычислительными методами [175]. В
результате было установлено, что петли, связанные с каталитической активностью,
более гибкие при низкой температуре, а петли, связанные с устойчивостью, проявляют
противоположное динамическое поведение. В вышеописанной работе [120] была
получена мутантная форма ксиланазы afxynG1 Aspergillus fumigatus RT-1 с 3 а.к.
заменами: T16A/T39I/L176Q. Замены T16A и T39I располагались в области N-конца
ксиланазы, в то время как замена L176Q – в области С-конца. По мнению авторов
работы, данные а.к. замены привели к уменьшению гибкости и подвижности N- и C-
концов фермента, что привело к увеличению температурной стабильности ксиланазы
afxynG1.
4.2.9. Гидратация поверхности

Роль гидратации белковой поверхности и ее динамика в повышении
температурной стабильности до конца не изучена [176], хотя различные исследования
указывают на ее существенную роль [177].
Гидратация в термофильных белках, как правило, характеризуется повышенной
плотностью связей растворителя и фермента по сравнению с мезофильными белками.
Образование сети водородных связей на поверхности белка, могло бы предотвратить
температурную дестабилизацию, предотвращая проникновение молекул воды внутрь
глобулы [178]. Этот эффект усиливается в термостабильных белках, поскольку они
имеют меньшее количество неполярных остатков на поверхности [179].
В белках, адаптированных к низким температурам, вместо заряженных а.о. на
поверхности имеются больше неполярных остатков [180], что приводит к увеличению
общей конформационной гибкости белка.
4.3. Иммобилизация ферментов

Помимо подходов по изменению а.к. последовательности, существуют и другие
методы для увеличения температурной стабильности ферментов. Иммобилизация
фермента является важным методом, широко используемым для увеличения
операционных циклов ферментов, применяемых в биотехнологии. При этом нет
необходимости в восстановлении фермента после завершения цикла для дальнейшего
повторного использования. Кроме того, метод иммобилизации может значительно
повысить стабильность фермента в присутствии органических растворителей; большого
количества солей; при экстремальных значениях кислотности среды; при высокой
температуре. В основном, иммобилизация приводит к ужесточению структуры
фермента, который является нестабильным, особенно повышенных температурах.
Увеличения жесткости структуры ферментов можно добиться путем присоединения
специфических химических групп, которые могут ковалентно связываться с
поверхностью белковой глобулы для предотвращения инактивации фермента [181]. В
настоящее время, благодаря прогрессу в методах молекулярной биологии, появилась
возможность модифицировать ферменты для усиления иммобилизации путем создания
дополнительных связывающих остатков на поверхности [182, 183].
Несколько ферментов, в том числе ксиланаз, были иммобилизованы в целях
повышения их стабильности и активности [184, 185, 186, 187]. Недавно авторы
подготовили наногибридные леван-ксиланазы и иммобилизовали их в альгинат натрия.
Иммобилизованные наногибридные леван-ксиланазы сохраняли почти 80% активности
фермента в широких диапазонах значений рН 3-10 и температур 20-90 °С [188]. В
аналогичном исследовании щелочная ксиланаза Bacillus licheniformis была выделена и
очищена для последующей иммобилизации в альгинат кальция. Иммобилизованная
ксиланаза демонстрировала рН-оптимум активности в интервале от 8,0 до 9,0 и
температурный оптимум активности при 50-60 °С [189]. Рекомбинантная ксиланаза
Geobacillus sp. была иммобилизована в хитозан [186]. Иммобилизованная ксиланаза
демонстрировала большую на 10 °С оптимальную температуру активности по
сравнению с оптимумом нативной ксиланазы (55° и 65° C для нативного и
иммобилизованного фермента соответственно). Более того, эта иммобилизованная
ксиланаза могла быть повторно использована в 6 последовательных циклах реакции,
сохраняя 80% от своей начальной активности.
4.4. Нанотехнологии для улучшения свойств ферментов

Достижения в области нанотехнологий произвели революцию в прикладных
науках. Нанотехнология играет важную роль в повышении качеств многих
промышленных ферментов, включая ксиланазы [190, 191]. Этот подход включает
адсорбцию ферментов на наноматериалы, что может улучшить ферментативную
активность и термостабильность [196]. Наночастицы обладают уникальными
характеристиками в качестве иммобилизационных материалов. Были получены
магнитные наночастицы хитозана с покрытием Fe3O4 для иммобилизации ксиланазы A.
niger. Иммобилизованные ксиланазы сохраняли до 87,5% активности при высокой
температуре и демонстрировали лучшие биотехнологические параметры:
термостабильность и рН-стабильность [197].
4.5. Улучшение других операционных параметров ксиланаз

В ряде исследований была проведена работа по улучшению каталитической
активности ксиланаз и придании устойчивости ксиланаз к различным типам
ингибиторов. В целях увеличения каталитической активности гипертермофильную
ксиланазу 10-й семьи ГГ Xyl10E Bispora sp. MEY-1 подвергли сайт-направленному
мутагенезу. Были получены 4 мутантные формы: A160D, A160E, A161D и A161E. А.к.
замены располагались на петле, близкой к субсайтам связывания +1 и +2. В результате
изучения параметров гомогенных форм Xyl10E было установлено, что замены A160D и
A160E привели к уменьшению Km практически в 2 раза, и снизили Vmax и активность, в
то время как замены A161D и A161E привели к увеличению Vmax, каталитической
активности и к уменьшению Km. На основе данных молекулярнодинамического анализа
авторы отмечают, что расстояние между а.о. D161 и субстратом изменяется из-за
колебаний петли. При уменьшении расстояния D161 образует водородную связь с
продуктом, а колебание петли помогает его высвобождению. А.к. замена A160E в
составе Xyl10E привела к изменению конформации Y204, который играет ключевую
роль в образовании взаимодейсвия с субсайтом связывания +1. Изменение
дигедральных углов атомов Y204 N, Cβ, Cα и Cδ1 с 50° до 150° у формы дикого типа и
формы A160E соответственно является подтверждением изменения конформации Y204.
Данное изменение конформации тирозина привело к увеличению сродства фермента к
субстрату. Положительный эффект а.к. замен, направленных на увеличение
каталитической активности ксиланаз, также отмечался в ряде других работ [166, 192
,165, 193, 194].
Хотя ингибирование ксиланаз ингибиторами типа XIP и TAXI интенсивно
изучалось в течение последних 20 лет, количество публикаций исследований,
основанных на генно-инженерном подходе, довольно ограничено. Практически все эти
работы сосредоточены на сайт-направленном мутагенезе ксиланаз 11-й семьи ГГ с
целью выявления факторов, влияющих на устойчивость к ингибиторам XIP и TAXI.
Для простоты описания ксиланаз 11-й семьи их трехмерную структуру часто
представляют в виде согнутой ладони правой руки. «Ущелье» активного центра при
этом располагается между «большим» и остальными «пальцами» (Рисунок 12 в разделе
2.6.1). В работе [58] была получена мутантная форма ксиланазы A. niger с а.к. заменой
на «большом пальце» N117A. В результате ксиланаза потеряла чувствительность к
воздействию XIP. Через два года той же группой исследователей была получена
ксиланаза A. niger с а.к. заменой D37A. А.о. D37 располагается на «мизинце» и
находится недалеко от активного центра ксиланазы. В результате мутантная форма
приобрела устойчивость к ингибиторам типа TAXI-I и XIP. Данный факт
свидетельствует о взаимодействии D37 с обоими типами ингибиторов. По мнению
авторов работы, нарушение сети водородных взаимодействий вблизи активного центра
ферментов является причиной устойчивости мутантной формы D37A к ингибиторам, а
процесс ингибирования XIP происходит при последовательном взаимодействии
ингибитора с N77 и затем со всей областью вблизи активного центра. При этом
происходит поворот петли XIP прямо в активный центр ксиланазы [195].
Ксиланазу 11-й семьи ГГ B. subtilis подвергли сайт-направленному мутагенезу с
целью определения роли в ингибировании а.о., прилегающих к активному центру
ксиланазы [196]. Были выбраны 22 а.о., которые находились на разных «пальцах». В
результате были получены 62 мутантные формы. Три мутантные формы D11F, D11Y,
D11K располагались на «мизинце» и привели к полной потере чувствительности к
TAXI-, однако демонстрировали значительно меньшую каталитическую активность, чем
ксиланаза дикого типа. При замене соседнего G12 на объемные а.о. лизина, триптофана
и аргинина новые мутантные формы также демонстрировали потерю чувствительности
к TAXI-I и при этом сохраняли исходную каталитическую активность.

Таким образом, ферменты в качестве биологических катализаторов находят все
большее применение в различных биотехнологических процессах. Ксиланазы не
являются исключением и уже эффективно применяются в ЦБП, кормовой индустрии и в
некоторых отраслях пищевой промышленности. Улучшение операционных параметров
ксиланаз и изучение структурных факторов, влияющих на данные параметры, являются
важными задачами для исследователей с практической и фундаментальной точек
зрения. Основными операционными параметрами являются термостабильность, рН-
стабильность, каталитическая активность, устойчивость к ингибиторам. Ввиду того, что
многие биотехнологические процессы протекают при повышенных температурах,
большая часть работ направлена на увеличение температурной стабильности ксиланаз.
В качестве основных инструментов используют методы направленной эволюции, сайт-
направленного мутагенеза и методы иммобилизации. Для выбора проводимых а.к. замен
используют а.к. выравнивание с более термостабильными ксиланазами и изучение
параметров кристаллических структур (β-фактор, расстояние между а.о., энергию
сольватации и др) изменение которых могло бы привести к увеличению
термостабильности.
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 5. Материалы и методы экспериментов.
5.1. Материалы.
5.1.1. Ферменты.
В качестве ферментов для исследования использовали три ксиланазы 10-й семьи
ГГ:
1. эндо-1,4--ксиланаза А Penicillium canescens с молекулярной массой 31 кДа
«XylA» (Код UniProtKB Q5S7A8).
2. эндо-1,4--ксиланаза Е Penicillium canescens с молекулярной массой 40 кДа
«XylE» (Код UniProtKB C3VEV9).
3. эндо-1,4--ксиланаза III Trichoderma reesei с молекулярной массой 33 кДа «Xyl3»
(Код UniProtKB Q9P973).
5.1.2. Ферментные препараты (ФП)

В работе использовали ФП на основе штаммов-продуцентов грибов P. canescens и
P. verruculosum, которые были получены в лаборатории биотехнологии ферментов ФИЦ
Биотехнологии РАН:
1. ФП P. verruculosum с клонированной рекомбинантной ксиланазой А P. canescens
дикого типа («ФП XylA» № 769.2.2).
2. ФП P. verruculosum с клонированной рекомбинантной ксиланазой Е P. canescens
дикого типа («ФП XylE» № 3.424.1).
3. ФП P. canescens с клонированной рекомбинантной ксиланазой III T. reesei дикого
типа («ФП Xyl3» № 1627.2).
4. Для гидролиза клеточной стенки мицелия использовали коммерческий ФП T.
harzianum (Sigma, США).
5.1.3. Микроорганизмы
Для трансформации использовали штаммы-реципиенты P. verruculosum и P.
canescens, дефектные по гену нитратредуктазы (niaD) и не способные усваивать азот в
форме нитратов:
1. P. verruculosum B1-537 - лабораторный штамм-реципиент P. verruculosum (niaD).
2. P. canescens RN3-11-7 - лабораторный штамм-реципиент P. canescens (niaD).
5.1.4. Субстраты
В качестве основного субстрата для измерения активности и других
биохимических параметров гомогенных ксиланаз и ФП использовали глюкуроноксилан
из березы (Sigma, США). Также для изучения ферментативной активности использовали
арабиноксилан из пшеницы (Megazyme, Австралия). Для приготовления экстрактов ржи
с целью изучения устойчивости ксиланаз к белковым ингибиторам типа XIP из злаковых
растений использовали рожь (Урожай 2014 г., г. Витебск, Р. Беларусь).
5.1.5. Реактивы
Для амплификации целевых генов и получения экспрессионных конструкций
использовали высокоточную и высокопроцессивную Т4 полимеразу, буферы для
осуществления ПЦР и клонирования (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Для
скрининга бактериальных и грибных колоний использовали Red-TAQ полимеразу
(Bioline, США) и Phire полимеразу (Thermo Fisher Scientific Inc., США).
Для культивирования микроорганизмов использовали агаризованную среду
Луриа-Бертани (Carl Roth GmbH, Германия) и жидкую среду Луриа-Бертани (Ambresco,
США), бактериологический агар (Pancreac, Испания), неорганические соли марки ч.д.а.
или х.ч. (Helicon, ДиаМ и Реахим, Россия).
Для приготовления буферных растворов использовали реактивы марок х.ч., ч.д.а.
и о.с.ч. (Pharmacia Biotech, Sigma и Bio-Rad Laboratories, США), (Helicon, ДиаМ и
Реахим, Россия).
Для изготовления пластин из полиакриламидного геля для проведения
электрофореза в денатурирующих условиях использовали реактивы и наборы (Reanal,
Венгрия), (Sigma и Bio-Rad Laboratories, США).
5.2. Методы
5.2.1. Выравнивание аминокислотных последовательностей

Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей
производили с помощью автоматического онлайн сервиса ClustalW
(http://www.clustal.org/clustal2/).
5.2.2. Амплификация целевых генов xylA, xylE и xyl3

Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили амплификацию генов
на амплификаторе «My Cycler» (Bio-Rad Laboratories, США). В качестве матрицы для
амплификации генов хylA (GenBank AY756109) и xylE (GenBank FJ860894) использовали
геномную ДНК P. canescens. Для амплификации гена xyl3 (GenBank AB036796)
использовали геномную ДНК T. reesei. Геномную ДНК P. canescens и T. reesei выделяли
при помощи набора Dneasy Plant Mini Kit (QIAGEN, США) по стандартному протоколу
фирмы-производителя, используя грибной мицелий в качестве исходного материала.
Для амплификации целевых генов были разработаны олигонуклеотидные
последовательности, комплиментарные 5`- и 3`-концам целевых генов ксиланаз
(праймеры). Для амплификации xylA использовали праймеры (Таблица 5): №1 и №2; для
амплификации xylE: №35 и №36; для амплификации xyl3: №43 и №44. Для
амплификации генов использовали набор Long PCR enzyme Mix (Thermo Fisher Scientific
Inc, США) при следующих условиях: первичная денатурация – 95 °С (3 мин),
Таблица 5 - Название и структура олигонуклеотидов
№ Название
Структура олигонуклеотида 5‘ 3‘
Праймера праймера
XylA P. canescens
1 XylA-UpLIC caacagaagcaaccgacacaatggttcaactcaagactgct
2 XylA-LowLIC gaggagaagcccggttaaagcgcattggcgatag
3 H191R-fwd acggaatggtcagccgcgtcaagaagtg
4 H191R-rev acttcttgacgcggctgaccattccgt
5 N77D-fwd tgcccaatccgacggcaagctgatccgtgg
6 N77D-rev accacggatcagcttgccgtcggattgggca
7 I6V-fwd acaggcctctgtgagcgtcgatgccaaattc
8 I6V-rev aatttggcatcgacgctcacagaggcctgt
9 I6L-fwd acaggcctctgtgagccttgatgccaaattc
10 I6L-rev aatttggcatcaaggctcacagaggcctgt
11 Y125R-fwd ttacaagggcaagatcgcggcctgggt
12 Y125R-rev ttacccaggccgcgatcttgcccttgt
13 S246P-fwd ttgatattgctggcgccccgtctactgac
14 S246P-rev tcagtagacggggcgccagcaatatca
15 A293P-fwd actacaaccccaaggctccgtataacg
16 A293P-rev tagcgttatacggagccttggggttgtag
17 G83C-fwd acggcaagctgatccgttgtcacactctc
18 G83C-rev accgagagtgtgacaacggatcagcttgc
19 I124C-fwd acaagggcaagtgctacgcctgggtaag
20 I124C-rev acccaggcgtagcacttgcccttgtaacg
21 K9L-fwd tgtgagcattgatgccctattcaag
22 K9L-rev ttgaatagggcatcaatgctcacagag
23 T104E-fwd tcacggataagaacgagctcatcagtgtc
24 T104E-rev acactgatgagctcgttcttatccgtga
25 T160D-fwd tgctttcgaggacgctcggtctgtggac
26 T160D-rev gtccacagaccgagcgtcctcgaaagc
27 XylA-Ins-fwd ggtcagggtggtgcactgctgtttgacggcaactacaac
28 XylA-Ins-rev tgcaccaccctgaccaggggaagagctggagcgccatgaatc
29 QASVS-fwd ggcaacagcaggagctattgatgccaaattcaag
30 QASVS-rev agaggagggcgacacagtctaaagcgcattggcgatag
31 ASVS-fwd tcgactcccgacagattgatgccaaattcaaggctc
32 ASVS-rev tggcatcaatctgtcgggagtcgacaggtccgga
33 L18F-fwd tcatggcaagaagtattttggaaccattgg
34 L18F-rev aatggttccaaaatacttcttgccatgag
XylE P. canescens
35 XylE-UpLIC gcacaggcagcaggagctcctcacttgcccggcaacaaggac
36 XylE-LowLIC agagcaagccgagcaggtctagcacacactgcaaggctttccctc
37 Y134R-fwd acgtcgctgtcgctcttgggatgtggtcaac
38 Y134R-rev acatcccaagagcgacagcgacgtccgaagt
39 T196P-fwd agaaccccggtcctaagtcgaccgccgttcttc
40 T196P-rev tcgacttaggaccggggttctcgatacca
41 D248E-fwd aggccaacctggaagttgctgtcacggagct
42 D248E-rev tgacagcaacttccaggttggccttgatgt
Xyl3 T. reesei
43 Xyl3-UpLIC gcacaggcagcaggagctctccccaccgaaaccatccacct
44 Xyl3-LowLIC agagcaagccgagcaggttattgtaagatgccaacaatgct
45 Xyl3-Ins-fwd tggtcagggtggtgcccttctgtttgacgcaaacttc
46 Xyl3-Ins-rev agggcaccaccctgaccagggttggtgctggcacgccac
47 A188D-fwd tgcctttcgtgatgctcgagatgctgacccttc
48 A188D-rev atctcgagcagcacgaaaggcaatcgagac
49 Y219R-fwd tgaagactcgcgtctccaagtggatctctc
50 Y219R-rev tggagacgcgagtcttcaacccgttgaccttgc
денатурация в цикле – 95 °С (1,5 мин), отжиг – 50 °С (2 мин), синтез цепи в цикле – 68

°С (1,5 мин), финальный синтез – 68 °С (10 мин). Проводили 25 циклов ПЦР. По
завершении финального синтеза образцы инкубировали при 4 °С. Далее проводили
электрофорез в 1% агарозном геле для определения массы ПЦР-продуктов на приборе
PowerPac Basic (Bio-Rad Laboratories, США). В качестве маркеров использовали набор
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder SMO323 (Thermo Fisher Scientific Inc, США).
Полученный ПЦР-продукт выделяли из агарозного геля с помощью набора QiAquick Gel
Extraction Kit (QIAGEN, США) и растворяли в буфере EB (10 мМ Трис-Cl, pH 8,5).
ПЦР-продукт, который соответствовал последовательности гена xylA или xylE,
клонировали методом независимого лигирования в вектор pUC-CBHI. ПЦР-продукт,
который соответствовал последовательности гена xyl3, клонировали методом
независимого лигирования в вектор pXEGuniversal [197] (Рисунок 14). Для этого ПЦР-
продукт и вектор подвергали обработке Т4-ДНК полимеразой (Thermo Fisher Scientific
Inc, США) в присутствии dTTP и dATP соответственно, для генерации «липких» концов.
Концентрацию ПЦР-продукта и вектора определяли на спектрофотометре NanoDrop Lite
Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc, США) при длине волны 260 нм. Далее,
обработанный ПЦР-продукт лигировали в вектор, для этого смешивали 50 нг вектора и
150 нг ПЦР-продукта. Смесь инкубировали при 22 °С в течение 30 мин, а затем
инкубировали 30 мин при 80 °С для инактивирования Т4-ДНК полимеразы. Полученные
плазмиды (Рисунок 14) трансформировали в компетентные клетки E. coli MachI [F-
Φ80lacZM15 lacX74 hsdR (rK-,mK+) recA1398 endA1 tonA] по стандартной методике
[198]. Для скрининга бактериальных колоний использовали Red-TAQ полимеразу
(Bioline, США). Скрининг бактериальных колоний проводили по стандартной методике,
рекомендованной фирмой-производителем.
Культивирование клеток, отобранных после скрининга, проводили в жидкой
среде Луриа-Бертани с добавлением ампициллина 100 мкг/мл при 37 °С 200 об/мин в
течение 12-16 часов. Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора Spin Miniprep Kit
(QIAGEN, США). Выделенные плазмиды секвенировали по Сэнгеру в обоих
направлениях для проверки на соответствие последовательностям нативных генов [199].
А Б
Рисунок 14 – Схематическое изображение экспрессионных плазмид с генами А - xylA,

кодирующего ксиланазу XylA; Б - xylE, кодирующего ксиланазу XylE; В - xyl3,
кодирующего ксиланазу Xyl3.
5.2.3. Амплификация генов с точечными мутациями
Для внесения точечных мутаций в нуклеотидную последовательность генов xylA,
xylE, xyl3 осуществили дизайн специфических праймеров, в которых введена замена
нуклеотида, соответствующего точечной а.к. мутации (выделено жирным шрифтом и
подчеркиванием в Таблице 5). В случае введения вставки, размером 5 а.к., на 5`-конец
праймера были добавлены 15 п.о.
Введение точечных мутаций, а также введение вставок и делеций в целевые гены
ксиланаз проводили методом гнездового ПЦР (nested PCR). Для этого на первом этапе
амплифицировали полинуклеотидные последовательности, несущие соответствующую
замену на 5`-конце ПЦР-продукта. На втором этапе выделенные и очищенные ПЦР-
продукты использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР с использованием
концевых праймеров (Таблица 5: №1 и №2, №35 и №36, №43 и №44) имеющих сайты
независимого лигирования на 5`-концах для клонирования объединенного ПЦР-
продукта (гена ксиланазы с мутацией) в соответствующий вектор.
В случае введения двойных аминокислотных замен G83C/I124C и ASVS/L18F в
гене xylA, на первом этапе ПЦР синтезировали три ПЦР-продукта, используя три пары
праймеров (Таблица 5: №1 и №18, №17 и №20, №19 и №2) и (Таблица 5: №1 и №32,
№31 и №34, №33 и №2) соответственно. В случае введения двойной а.к. замены
Y134R/D248E в гене xylE на первом этапе ПЦР синтезировали три ПЦР-продукта,
используя три пары праймеров (Таблица 5: №35 и №38, №37 и №42, №41 и №36).
Выделенные и очищенные три ПЦР-продукта объединяли на втором этапе ПЦР с
помощью праймеров на конец гена xylA и xylE (Таблица 5: №1 и №2, №35 и №36,
соответственно). Условия проведения ПЦР соответствовали условиям, описанным в
части 5.2.2.
Полученные гены xylA и xylE, несущие точечные мутации, клонировали в вектор
pUC-CBHI методом независимого лигирования. Ген xyl3, несущий точечные мутации,
клонировали в вектор pXEGuniversal методом независимого лигирования [197].
Трансформацию в компетентные клетки E. coli MachI и культивирование клеток
проводили так же, как описано в части 5.2.2. Следует отметить, что методики
клонирования, трансформации в E. coli и последующей трансформации в штаммы-
реципиенты были предварительно оптимизированы при получении рекомбинантных
форм эндоглюканазы EG2 P. verruculosum и эндоглюканазы LAM Myceliophthora
thermophila с участием автора данной диссертационной работы, однако здесь не
приводятся, поскольку исследование этих ферментов не являлось целью диссертации.
5.2.4. Трансформация штамма-реципиента P. verruculosum B1-537

Плазмиды, содержащие гены xylA и xylE, котрансформировали в ауксотрофный
штамм-реципиент P. verruculosum B1-537 (niaD) совместно с плазмидой pSTA10 (10 и
1 мкг, соответственно), которая обеспечивала прототрофность рекомбинантных
штаммов P. verruculosum B1-537 по адаптированной методике, описанной Алексенко и
др [200]. Благодаря котрансформации с плазмидой pSTA10, несущей ген
нитратредуктазы, появлялась возможность селекции рекомбинантных штаммов серии на
средах с 10 мМ нитратом натрия. Трансформанты культивировали в течение 5 суток при
температуре 30 °С, после чего проводили первичный скрининг с помощью Phire
полимеразы (Thermo Fisher Scientific Inc, США). Скрининг проводили по стандартной
методике, рекомендованной фирмой-производителем.
5.2.5. Трансформация штамма-реципиента P. canescens RN3-11-7

Плазмиды, содержащие мутантные гены xyl3, котрансформировали в
ауксотрофный штамм-реципиент P. canescens RN 3-11-7 (niaD) совместно с плазмидой
pSTA10 (10 и 1 мкг соответственно), которая обеспечивает прототрофность
рекомбинантных штаммов P. canescens по методике, описанной Алексенко и др [200].
Благодаря котрансформации с плазмидой pSTA 10, несущей ген нитратредуктазы,
появлялась возможность селекции рекомбинантных штаммов серии на средах с 10 мМ
нитратом натрия. Трансформанты культивировали в течение 5 суток при температуре 30
°С, после чего проводили первичный скрининг с помощью Phire полимеразы (Thermo
Fisher Scientific Inc, США). Скрининг проводили по стандартной методике,
рекомендованной фирмой-производителем.
5.2.6. Культивирование рекомбинантных штаммов в колбах

Ферментацию отобранных штаммов проводили в качалочных колбах объемом 750
мл в течение 6 суток при 30 °С и 220 об/мин на термостатируемой качалке Multitron
Standart (Infors, Швейцария). Объем ферментационной среды составлял 100 мл.
Состав ферментационной среды для P. verruculosum (%): целлюлоза – 4; KH2PO4 - 1,5;
дрожжевой экстракт – 1; пшеничные отруби – 1; (NH4)2SO4 – 0,5; MgSO4*7H2O – 0,03;
CaCl2*2H2O – 0,03.
Состав ферментационной среды для P. canescens (%): кукурузный экстракт – 5; соевая
шелуха – 4,5; KH2PO4 – 2,5.
5.2.7. Выделение и очистка ферментов

Гомогенные рекомбинантные формы ксиланаз выделяли из культуральных
жидкостей (КЖ) и ФП методами гель-проникающей, анионобменной и гидрофобной
хроматографии. Фракционирование и очистку ферментов осуществляли на
хроматографической системе AKTA UPC (GE Healthcare, США).
Культуральную жидкость центрифуговали при 4000 об/мин на центрифуге
Universal 320 (Hettich zentrifugen, Германия). Белок, содержащийся в супернатанте,
высаливали сульфатом аммония. Затем осажденный белок перерастворяли в стартовом
буфере 20 мМ Bis-Tris (2-[Бис-(2-гидроксиэтил)амино-]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-
диол)/HCl, pH 6,8, и подвергали обессоливанию на колонке BioGel P2 (Bio-Rad, США),
уравновешенной тем же буфером. Обессоленную фракцию наносили на колонку с
анионобменным носителем Source 15 Q (GE Healthcare, США). В качестве элюентов
использовали буферы 20 мМ Bis-Tris/HCl, рН 6,8, и 20 мМ Bis-Tris/HCl + 1 M NaCl, рН
6,8. Фракционирование осуществляли в линейном градиенте концентрации NaCl от 0 до
1 М. Затем к фракциям добавляли сульфат аммония до концентрации 1,7 М, и
проводили их гидрофобную хроматографию на колонке с носителем Source 15 Iso (GE
Healthcare, США). В качестве элюентов использовали 50 мМ Na-ацетатный буфер +
1,7М (NH4)2SO4, рН 5,0, и 50 мМ Na-ацетатный буфер, рН 5,0. Разделение
осуществляли в линейно убывающем градиенте сульфата аммония от 1,7 до 0 М.
Выделенные гомогенные ксиланазы обессоливали и концентрировали с помощью
мембранных колонок VivaSpin 500 (Sartorius Stedium Biotech, Германия).
5.2.8. Определение концентрации белка

Концентрацию белка в КЖ и в растворах гомогенных белков определяли
модифицированным методом Лоури [201]. Измерения оптической плотности проводили
на спектрофотометре «Varian Cary 50 UV-Vis» (Agilent Technologies, США). В качестве
стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (Merck KGaA, Германия).
5.2.9. Проведение Ds-Na-ПААГ-электрофореза
Электрофорез КЖ и гомогенных ксиланаз проводили в денатурирующих
условиях с использованием пластин из полиакриамидного геля, который состоял из двух
частей. Верхний слой являлся концентрирующим (4% полиакриламида), нижний слой -
разделяющим (12% полиакриламида). Электрофорез проводили с использованием
системы Mini Protein II (Bio-Rad Laboratories, США). Белковые полосы в гелях
окрашивали красителем Кумасси бриллиантовый синий (Ferak, Германия). В качестве
маркеров использовали набор Unstained Protein MW Marker #26610 (Thermo Fisher
Scientific Inc, США).
5.2.10. Масс-спектрометрический анализ

Для проведения масс-спектрометрического анализа из соответствующих полос на
геле после проведения Ds-Na-ПААГ-электрофореза вырезали образцы размером 1 мм3.
Идентификацию ферментов проводили методом пептидного картирования. После
протеолиза белков под действием трипсина пептиды экстрагировали, используя 20%
ацетонитрил и 0,1% трифторуксусную кислоту. MALDI-TOF масс-спектрометрию
пептидов проводили на приборе «UltraflexXtreme» (Bruker Daltonik GmbH, Германия) в
центре коллективного пользования (ЦКП) «Промышленные биотехнологии» ФИЦ
Биотехнологии РАН. Анализ полученных данных осуществляли с помощью онлайн
сервиса MASCOT (http://www.matrixscience.com).
При идентификации мутантных форм ксиланаз анализ полученных данных
осуществляли путем сравнения масс полученных пептидов и масс теоретических
пептидов, рассчитанных при помощи онлайн сервиса PeptideMass
(http://web.expasy.org/peptide_mass/).
5.2.11. Определение активности ферментов

Активность КЖ и гомогенных ксиланаз определяли по начальным скоростям
образования восстанавливающих сахаров из ксилана модифицированным методом
Шомоди-Нельсона [202]. В качестве субстрата использовали глюкуроноксилан из
березы (Sigma, США), который растворяли в 0,1 М Na-ацетатном буфере (рН 5,0) в
концентрации 10 мг/мл. К 100 мкл запасного раствора субстрата добавляли 60 мкл 0,1 М
Na-ацетатного буфера, рН 5,0. Смесь прогревали при 50 °С в течение 5 мин. Далее к
прогретому субстрату добавляли 40 мкл фермента и отмечали начало реакции. Реакцию
проводили при 50 °С без перемешивания. По истечении 10 мин, к реакционной смеси
добавляли 200 мкл реактива Шомоди для прекращения ферментативной реакции. Далее
реакционную смесь инкубировали в течение 40 мин при 100 °С. После охлаждения в
холодной воде добавляли 200 мкл реактива Нельсона, перемешивали и инкубировали
при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем добавляли 400 мкл ацетона, 1000
мкл воды, центрифугировали при 13400 об/мин в течение 3 мин и проводили измерение
оптической плотности при длине волны 610 нм относительно фона. Измерения
оптической плотности проводили на спектрофотометре «Varian Cary 50 UV-Vis»
(Agilent Technologies, США). За единицу активности принимали такое количество
фермента, которое катализирует образование 1 мкмоль восстанавливающих сахаров за 1
мин при 50° С, pH 5,0 [203].
5.2.12. Изучение температурной стабильности

Изучение термостабильности гомогенных ксиланаз проводили путем измерения
остаточной активности по отношению к глюкуроноксилану. Гомогенный фермент (1-5
мкг/мл) инкубировали при 50, 55, 60 и 70 °С в 0,1 М Na-ацетатном буфере, рН 5,0. Через
некоторые временные интервалы отбирали аликвоту фермента, быстро охлаждали и
определяли его активность при 50 °С методом Шомоди-Нельсона, как описано в разделе
5.2.11.
Также для гомогенных форм ксиланаз определяли температуру фазового перехода
(плавления) методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСК) [204]
на приборе MicroCal VP-DSC (Malvern Instruments, Великобритания). В методе ДСК
теплоту определяли через тепловой поток – производную теплоты по времени.
Тепловые потоки измеряли по разнице температур в двух точках измерительной
системы в один момент времени. Далее, при увеличении температуры со скоростью 1
°С/мин определяли температуру плавления по тепловому эффекту конформационных
изменений в белковой глобуле методом ДСК. Концентрация белка составляла 1 мг/мл,
объем пробы - 300 мкл. Определение температур фазового перехода проводили в ЦКП
«Промышленные биотехнологии» ФИЦ Биотехнологии РАН.
5.2.13. Определение температурного и рН-оптимумов активности ксиланаз

Для определения температурного оптимума действия ксиланаз и их мутантных
форм измеряли активность методом Шомоди-Нельсона (5.2.11) по отношению к
глюкуроноксилану в диапазоне температур 30-80° С. Измерения проводились в 0,1 М
Na-ацетатном буфере, рН 5,0. Реакцию проводили в течение 10 мин.
Для определения рН-оптимума активности ксиланаз и их мутантных форм
измеряли активность методом Шомоди-Нельсона в диапазоне значений рН от 3 до 8 с
использованием 0,1 М цитрат-фосфатного буфера. Запасной раствор глюкуроноксилана
10 мг/мл готовили в дистиллированной воде. Фермент также растворяли в
дистиллированной воде. Измерения активности проводили при 50 °С. Реакцию
проводили в течение 10 мин.
5.2.14. Изучение влияния белковых ингибиторов из экстракта ржи на активность

ксиланаз
К 20 г ржаной муки добавляли 100 мл 0,1 М Na-ацетатного буфера, рН 5,0.
Раствор инкубировали при 40 °С в течение 3 ч и 250 об/мин в шейкер-инкубаторе ES-
200 (Biosan, Латвия). Далее раствор центрифуговали в течение 10 мин при 4000 об/мин
на центрифуге Universal 320 (Hettich zentrifugen, Германия). Супернатант фильтровали
через полиэстеровую ткань. Далее половину супернатанта помещали в лед, другую
половину инкубировали при 100 °С на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Далее
вторую половину опять центрифуговали в течение 5 мин 4000 об/мин на центрифуге
Universal 320 (Hettich zentrifugen, Германия). Таким образом, были получены нативный
и термоинактивированный экстракты ржи. Далее 45 мл экстракта загружали в ячейку
вибрационного вискозиметра SV-10 (A&D Company Limited, Япония) и прогревали в
течение 10 мин при 40 °С. Начальную вязкость экстракта определяли после его прогрева
до 40 °С. Далее в реакционную смесь вносили определенное количество фермента: 5
ксиланазных единиц активности на миллилитр экстракта, и отчитывали время реакции.
Вязкость экстракта фиксировали через 5, 10, 15, 20 мин после добавления фермента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 6. Выбор проводимых аминокислотных замен
6.1. Общая стратегия проведения исследований

Для исследования и получения термостабильных форм ксиланаз были выбраны
три эндо-1,4--ксиланазы 10-й семьи ГГ (Рисунок 15):
1. Ксиланаза А Penicillium canescens XylA (UniProtKB Q5S7A8); кристаллической
структуры данной ксиланазы нет, однако разрешены структуры ксиланазы А Penicillium
simpicissimum, которая демонстрирует 100% степень гомологии с XylА P. canescens. Из
имеющихся в PDB банке структур была выбрана трехмерная структура с наивысшим
разрешением 1BG4.PDB (1,75Å).
2. Ксиланаза E Penicillium canescens XylE, UniProtKB C3VEV9, 4F8X.PDB (1,47Å)
3. Ксиланаза III Trichoderma reesei Xyl3, UniProtKB Q9P973, 4XV0.PDB (1,97Å).
1 2 3
Рисунок 15 - Схематическое изображение трехмерных структур 1 - Xyl А Penicillium

simpicissimum; 2 – XylE P. canescens; 3 - Xyl3 T. reesei.
Ранее коллегами в лаборатории биотехнологии ферментов ФИЦ Биотехнологии

РАН были получены рекомбинантные штаммы и соответствующие ФП (см. 5.1.2.). XylA
и XylE были экспрессированы в лабораторном штамме-реципиенте Penicillium
verruculosum B1-537, Xyl3 была экспрессирована в лабораторном штамме-реципиенте
Penicillium canescens RN3-7-11.
Общую схему исследований по получению и изучению свойств рекомбинантных
форм ксиланаз дикого типа и несущих а.к. замены можно представить следующим
образом:
Выравнивание а.к. Получение Трансформация в E.
последовательностей, измененного гена coli. Препаративная
моделирование, выбор методом ПЦР, наработка ДНК,
а.к. замен клонирование гена в секвенирование
вектор
Трансформация Селективный отбор Ферментация в колбах

штамма-реципиента P. трансформантов на и проведение Ds-NA-
verruculosum или P. среде с NaNO3 ПААГ-электрофореза
canescens
Выделение и очистка Масс-спектрометрия Исследование свойств

ксиланаз методами рекомбинантных форм рекомбинантных форм
белковой ксиланаз ксиланаз.
хроматографии
6.2. Аминокислотные замены, направленные на увеличение термостабильности

ксиланаз
В результате проведения выравнивания а.к. последовательностей изучаемых
ксиланаз с последовательностями более термостабильных ксиланаз: MtXyl3 и MtXyl4
Myceliophthora thermophila (C.lucknowense) (AEN99941 и AEO58598 соответственно),
TaXynA Thermoascus aurantiacus (CAB65468) был предложен ряд а.к. замен, которые
потенциально могли бы привести к увеличению термостабильности (Рисунок 16).
Выбранные а.к. замены отмечены красным цветом и жирным шрифтом.
6.2.1. XylA
Поскольку а.к. последовательность XylA на 100% идентична а.к.
последовательности XylA P. simplicissimum, и для последней имеется разрешенная
трехмерная структура, выбранные а.к. замены были проверены с использованием
трехмерной структуры для XylA P. simplicissimum. Предложения, выработанные для
повышения термостабильности ксиланазы P. simplicissimum должны быть справедливы
и для фермента из P. canescens. Поиск стабилизирующих мутаций в а.к.
последовательности XylA на основании третичной структуры является более
эффективным, поскольку знание пространственной структуры позволяет определить
участки, обладающие повышенной подвижностью, и провести замены, которые могли
бы их стабилизировать.
Рисунок 16 - Аминокислотное выравнивание исследуемых ксиланаз и более

термостабильных ксиланаз MtXyl3 и MtXyl4 M. thermophila, TaXynA T.aurantiacus.
Увеличения температурной стабильности XylA планировали достичь за счет
оптимизации гидрофобных взаимодействий, создания дополнительных ионных связей,
создания дополнительного дисульфидного мостика, увеличения жесткости третичной
структуры и оптимизации структуры N-конца фермента.
Как известно, на начальной стадии температурной денатурации элементы
вторичной структуры сохраняются, однако испытывают пространственные сдвиги друг
относительно друга, и молекула переходит в состояние «расплавленной глобулы» -
переходному состоянию между активной и денатурированной формой фермента [205].
Данное состояние характеризуется потерей плотной упаковки боковых цепей а.к. внутри
фермента. В случае введения дополнительных водородных или ионных связей между
элементами вторичной структуры можно ожидать увеличения температурной
стабильности [206]. Стоит отметить, что ионные связи, в отличие от водородных, более
универсальные, поскольку обладают большим радиусом действия и требуют менее
строгой пространственной ориентации боковых цепей а.о. Анализ структуры на предмет
дополнительных фиксирующих взаимодействий показал, что данная структура является
достаточной закрепленной, т.е. для многих -спиралей N- или C-концы формируют
взаимодействия с внутренними а.о. фермента или между собой. Было обнаружено три
области, в которых можно осуществить дополнительную фиксацию -спиралей. Замена
N77D могла привести к образованию ионной связи между введенной аспарагиновой
кислотой и K38 и зафиксировать друг относительно друга две -спирали (Рисунок 17.4).
Замена T104E могла привести к фиксации -спирали относительно петли, образованной
a.о. 56-64, за счет образования ионной связи с R59 (Рисунок 17.5). Замена T160D могла
привести к образованию дополнительной связи между аспарагиновой кислотой и K110.
Указанные а.о. могли зафиксировать две -спирали друг относительно друга (Рисунок
17.7).
В рамках молекулярного моделирования сотрудником кафедры химической
энзимологии Химического факультета МГУ к.ф.-м.н. И.В. Упоровым был проведен
теоретический расчет потенциальной энергии и энергии сольватации рекомбинантной
формы белка и трех мутантных форм фермента с помощью вычислительных модулей
Discover3 и Solvation соответственно программного обеспечения Insight II (Accelrys
Software Inc., США). Результаты вычислений представлены в Таблице 6 и 7.
Таблица 6 - Потенциальная энергия молекул и еѐ составляющие (ккал/моль).
Энергия XylA XylA T104E XylA N77D XylA T160D
Общая 1347,48 1318,63 1324,99 1307,58
Внутренняя 2667,89 2658,33 2664,55 2676,03
Несвязанные взаимодействия -1320,41 -1339,69 -1339,56 -1368,45
Электростатические -1967,09 -1991,87 -1988,93 -2025,66

Таблица 7 - Энергия сольватации молекул (ккал/моль), вычисленная по

различным моделям
Энергия XylA XylA T104E XylA N77D XylA T160D
Сольватации
Ooi et al. [207] -199,78 -197,59 -192,83 -195,70
Vila et al. [208] -208,53 -219,67 -198,12 -191,22
Wesson & Eisenberg -482,44 -485,90 -476,54 -479,38
[209]
Из полученных данных следует, что теоретическое уменьшение потенциальной

энергии наблюдается для всех трех предложенных замен относительно рекомбинантной
формы дикого типа. Наименьшей общей потенциальной энергией обладает мутантная
форма T160D – 1307,58 ккал/моль. Взаимодействие белка с окружающим растворителем
характеризуется энергией сольватации. Меньшие значения этой энергии соответствуют
более благоприятному взаимодействию белковой молекулы с водой. Для оценки
энергии сольватации ферментов были предложены разные эмпирические модели [207 -
209]. Теоретические расчеты энергии сольватации показали, что замены N77D и T160D
приводят к повышению энергии сольватации по всем трем моделям вычислений.
Однако мутантная форма XylA T104E демонстрировала меньшую энергию сольватации
по двум моделям из трех.
Другим подходом к увеличению термостабильности является оптимизация
взаимодействий в гидрофобном ядре. Увеличение плотности гидрофобного ядра
белковой глобулы является одним из часто используемых и наиболее результативных
путей повышения температурной стабильности ферментов. Помимо декартовых
координат атомов, в PDB файлах приводятся значения -факторов, которые
характеризуют размытость электронной плотности. Увеличенное значение -факторов
свидетельствует о повышенной подвижности данного атома, что обуславливается
наличием «пустот» в белковой глобуле. На основе значений -факторов для структуры
1ВG4, а также на основе выравнивания а.к. последовательностей XylA с
термостабильными ксиланазами (Рисунок 16), был предложен ряд одинарных замен:
I6V, I6L, K9L, L18F, которые были направлены на оптимизацию гидрофобных
взаимодействий в ферментной глобуле XylA (Рисунок 17.1-3).
Согласно работе [54] остаток R124 в ксиланазе А T. auranticus играет ключевую
роль в обеспечении термостабильности фермента за счет образования солевого мостика
с E232. Поэтому, несмотря на то, что данный остаток аргинина не является
консервативным в других термостабильных ксиланаз (Рисунок 16), было решено
провести замену Y125R в XylA P. canescens, которая должна была привести к
образованию дополнительного солевого мостика с E233 (Рисунок 17.6).
А.к. замена H191R также должна была привести к образованию ионной пары с
E151 (Рисунок 17.8). Стоит отметить, что термостабильная TaXynA также содержит
аргинин в данном положении (Рисунок 16).
Также было предложено провести замены S246P и A293P. Они были направлены
на увеличение жесткости третичной структуры фермента за счет введения пролина в
начало -спирали (Рисунок 17.9 и 17.12). В работе [170] было показано, что введение
пролина в начало -спиралей приводит к небольшому увеличению температурной
стабильности ксиланазы Aspergillus sulphureus. Кроме того, остатки пролина в
указанных позициях являются консервативными у других термостабильных ксиланаз
(Рисунок 16).
Рисунок 17 – Схематическое изображение а.к. остатков в XylA после замены 1-
I6V; 2 - K9L; 3 - L18F; 4 - N77D; 5 - T104E; 6 - Y125R; 7 - T160D; 8 - H191R; 9 - S246P;
10 - G83C/I124C; 11 - del ASVS/L18F; 12 - A293P.
Двойная аминокислотная замена G83C/I124C была направлена на создание

дополнительного дисульфидного мостика (Рисунок 17.10), который, как известно,
может стабилизировать фермент, и имеется в двух ксиланазах M. thermophila и в XylE
(Рисунок 16).
Методом молекулярной динамики также были рассчитаны значения
среднеквадратичной флуктуации (RMSF) С-атомов каждого а.о. (кроме первого) в
процессе 25 нс траектировки. Показано, что значения среднеквадратичной флуктуации
второго, третьего и четвертого а.о. составляет 2,95; 2,13; 1,52 Å соответственно, в то
время как среднее значение RMSF в молекуле XylA составляет 0,62 Å (Рисунок 18).
Поскольку в ряде работ было показано, что делеции подвижных N- и C-концов могут
повлиять на термостабильность ферментов [133, 162-165, 210], было предложено
исследовать мутантные формы XylA с измененным N-концом: с делецией первых пяти
а.о. (1-5 QASVS) и с делецией четырех а.о. (2-5 ASVS) на N-конце с одинарной заменой
L18F (Рисунок 17.11).
RMSF (Å)
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
0 50 100 150 200 250 300
Номер аминокислотного остатка
Рисунок 18 – Среднеквадратичная флуктуация С-атома аминокислотного остатка XylA
6.2.2. XylE
Несмотря на то, что XylE является более термостабильным ферментом в
сравнении с XylA, дополнительного увеличения стабильности XylE планировалось
добиться за счет увеличения жесткости третичной структуры с помощью создания
дополнительной ионной связи и введения а.о. пролина на N-конце -спирали.
Рисунок 19 –Схематическое изображение а.к. остатков в XylE после замены 1 - Y134R; 2
- T196P; 3 - D248E; 4 - Y134R/ D248E.
1. А.к. замена Y134R была направлена на образование солевого мостика с D248

(Рисунок 19.1). Y134 и D248 находятся на N-концах двух -листов. Создание
дополнительной ионной связи между элементами вторичной структуры могло привести
к увеличению термостабильности ксиланаз за счет увеличения жесткости структуры.
Однако было опасение, что длина боковой группы D248 недостаточна для образования
ионной связи, поэтому было предложено также провести замену аспарагиновой кислоты
в данном положении на глутаминовую кислоту, которая имеет более длинную боковую
группу, то есть осуществить двойную замену Y134R/D248E (Рисунок 19.4). Стоит
отметить, что именно такие а.о. присутствуют в соответствующем положении в более
термостабильной ксиланазе TaXynA (Рисунок 16) [54]. Ионная связь, образованная этой
парой а.о., по мнению авторов, играет ключевую роль в термостабильности ксиланазы
TaXynA. Также стоило провести одинарную а.к. замену D248E для более полного
понимания влияния ионных взаимодействий в данных положениях на
термостабильность XylE (Рисунок 19.3).
2. А.к. замена T196P вводит остаток пролина в начало -спирали на ее N-конце.
Как уже отмечалось, введение пролина могло привести к увеличению жесткости
третичной структуры фермента (Рисунок 19.2). Стоит отметить, что у термостабильной
TaXynA в эквивалентном положении также расположен остаток пролина.
6.2.3. Xyl3
Увеличения температурной стабильности Xyl3 планировалось добиться за счет
увеличения структурной жесткости между элементами вторичной структуры с помощью
образования новых ионных взаимодействий.
1. Замена Y219R была направлена на увеличение температурной стабильности за
счет образования новой ионной связи с D179. Аналогично замене H191R в XylA,
образование ионной связи могло зафиксировать α-спираль относительно петли,
образованной а.о. 174-187 (Рисунок 20.1).
2. Замена A188D была направлена на образование новой ионной связи
аспарагиновой кислоты с R138. Аналогично замене T160D в XylA, образование ионной
связи могло зафиксировать две α-спирали друг относительно друга (Рисунок 20.2).
Рисунок 20 – Схематическое изображение а.к. остатков в Xyl3 после замены 1 - Y219R;

2 - A188D.
6.3. Аминокислотные замены, направленные на придание устойчивости ксиланаз к
белковым ингибиторам типа XIP из злаковых растений
Ксиланазы 10-й семьи ГГ из грибных источников устойчивы к действию
белковых ингибиторов злаков типа TAXI, однако большинство из них подвергаются
ингибированию XIP-подобными белками, при этом существует несколько исключений,
об устойчивости которых к ингибиторам ранее сообщалось [93, 87]. На Рисунке 21
представлено а.к. выравнивание 7 ксиланаз 10-й семьи ГГ. Верхние 3 ксиланазы (XylA,
Xyl3 и AnXlnC) ингибируются XIP, нижние 4 ксиланазы (XylE, MtXyl3, MtXyl4 и
AaXyl2) демонстрируют устойчивость к XIP ингибиторам. Как показали наши
исследования (см. п.8.4 ниже), к числу таких исключений принадлежит и XylE. Общей
особенностью, ксиланаз, устойчивых к ингибированию, является наличие двух а.к.
вставок (10-12 а.о. и 5 а.о. соответственно, они выделены жирным шрифтом на Рисунке
21) в их первичной структуре. Совмещение кристаллических структур ксиланаз XylE,
XylA и Xyl3 позволило установить, что 2 а.к. вставки в XylE образуют петли вблизи
активного центра ксиланазы. В связи с тем, что вставка из 5 а.о. (GQGGA в случае XylE)
располагается ближе к активному центру (см. рисунок 34 ниже), и, в частности, ближе к
каталитическому а.о. глутаминовой кислоты, который напрямую взаимодействует с XIP,
было предположено, что именно эта вставка отвечает за отсутствие ингибирования у 4
нижних ксиланаз (Рисунок 21, вставка отмечена стрелкой). Для проверки данной
гипотезы было решено получить мутантные формы ксиланаз XylA-ins и Xyl3-ins со
вставкой из 5 аминокислот – GQGGA – между P282 – L283 и P310 – L311
соответственно (Рисунок 21).
Рисунок 21 – Аминокислотное выравнивание исследуемых ксиланаз и ксиланаз AnXlnC
A. nidulans, MtXyl3 и MtXyl4 M. thermophila, AaXyl2 A. aculeatus.
Глава 7. Получение мутантных форм ксиланаз
7.1. Получение рекомбинантных штаммов

Сопоставление рекомбинантных форм ксиланаз и названия конструкций,
штаммов, КЖ или ФП, гомогенных форм ксиланаз, используемых в данной работе,
представлено в Таблице 8.
Таблица 8 – Обозначения рекомбинантных форм ксиланаз, названия конструкций,

штаммов, препаратов и гомогенных форм ферментов.
Название
Форма Название Название гомогенной
фермента конструкции штамма Название препарата формы
ксиланазы
XylA рекомб. pXylA PvXylA ФП XylA XylA-wt
XylA I6V pXylA I6V PvXylA I6V КЖ XylA I6V XylA I6V
XylA I6L pXylA I6L PvXylA I6L КЖ XylA I6L XylA I6L
XylA K9L pXylA K9L PvXylA K9L КЖ XylA K9L XylA K9L
XylA L18F pXylA L18F PvXylA L18F КЖ XylA L18F XylA L18F
XylA N77D pXylA N77D PvXylA N77D КЖ XylA N77D XylA N77D
PvXylA
XylA T104E pXylA T104E T104E КЖ XylA T104E XylA T104E
PvXylA
XylA Y125R pXylA Y125R Y125R КЖ XylA Y125R XylA Y125R
PvXylA
XylA T160D pXylA T160D T160D КЖ XylA T160D XylA T160D
PvXylA
XylA H191R pXylA H191R H191R КЖ XylA H191R XylA H191R
XylA S246P pXylA S246P PvXylA S246P КЖ XylA S246P XylA S246P
PvXylA
XylA A293P pXylA A293P A293P КЖ XylA A293P XylA A293P
XylA pXylA PvXylA КЖ XylA XylA
G83C/I124C G83C/I124C G83C/I124C G83C/I124C G83C/I124C
XylA del- pXylA del- PvXylA del- XylA del-
QASVS QASVS QASVS КЖ XylA del-QASVS QASVS
XylA del- pXylA del- PvXylA del- КЖ XylA del- XylA del-
ASVS/L18F ASVS/L18F ASVS/L18F ASVS/L18F ASVS/L18F
XylA-ins
GQGGA pXylA-ins PvXylA-ins КЖ XylA-ins XylA-ins
XylE рекомб. pXylE PvXylE ФП XylE XylE-wt

Название
Форма Название Название гомогенной
фермента конструкции штамма Название препарата формы
PvXylE ксиланазы
XylE Y134R pXylE Y134R Y134R КЖ XylE Y134R XylE Y134R
XylE T196P pXylE T196P PvXylE T196P КЖ XylE T196P XylE T196P
PvXylE
XylE D248E pXylE D248E D248E КЖ XylE D248E XylE D248E
XylE pXylE PvXylE КЖ XylE XylE
Y134R/D248E Y134R/D248E Y134R/D248E Y134R/D248E Y124R/D248R
Xyl3 рекомб. pXyl3 PcXyl3 ФП Xyl3 Xyl3-wt

PcXyl3
Xyl3 A188D pXyl3 A188D A188D КЖ Xyl3 A188D Xyl3 A188D
Xyl3 Y219R pXyl3 Y219R PcXyl3 Y219R КЖ Xyl3 Y219R Xyl3 Y219R
Xyl3-ins
GQGGA pXyl3-ins PcXyl3-ins КЖ Xyl3-ins Xyl3-ins
После получения ПЦР-продуктов, несущих целевые или измененные гены

ксиланаз, получения конструкций, проведения наработки ДНК-материала и
секвенирования по Сэнгеру была произведена трансформация конструкций в штаммы-
реципиенты. Трансформанты, выросшие на твердой среде с 10 мМ NaNO3, подвергали
ПЦР-скринингу на наличие целевого гена с использованием концевых праймеров. На
Рисунке 22 представлен пример первичного скрининга рекомбинантных штаммов. В
штамме PvXylA L18F наблюдали наличие целевого гена в трансформантах 1, 2, 3 и 5; в
то время как в штамме PvXylA T160D наличие целевого гена наблюдали в
трансформантах 1, 3, 6, 7, 8; а в конструкции pXylA H191R – в трансформантах 1, 2, 3, 5,
6, 7, 11, 16, 18. ПЦР-скрининг проводили для всех серий трансформантов.
Рисунок 22 - Скрининг грибных трансформантов pXylA методом ПЦР с грибных
колоний конструкций PvXylA L18F (1 – х), PvXylA T160D (3 – х), PvXylA H191R (4 – х).
Х – номер трансформанта.
7.2. Культивирование трансформантов

Отобранные после скрининга положительные трансформанты культивировали
при 30 °С в течение 6 суток в качалочных колбах. ПААГ-электрофореграммы некоторых
полученных КЖ представлены на Рисунке 23. Другие КЖ также были изучены с
помощью Ds-Na-ПААГ-электрофореза. Попытки экспрессии мутантных форм XylA
K9L, XylA T104E, XylA T160D, XylA del-QASVS не привели к успеху, несмотря на
наличие целевых генов с мутациями. Возможно, это было связано с некорректным
фолдингом мутантной формы фермента и ее последующим протеолизом. Все другие
мутантные формы XylA, XylE, Xyl3 успешно экспрессировались и наблюдались на
ПААГ- электрофореграммах в виде полос с массой 31, 40, 33 кДа соответственно.
Рисунок 23 – ПААГ-электрофореграммы КЖ. А - КЖ XylA L18F; Б - КЖ XylA-ins; В -
КЖ XylE Y134R; Г - КЖ Xyl3-ins.
7.3. Хроматографическое выделение и очистка ксиланаз
7.3.1. XylA
Полученную после культивирования КЖ с рекомбинантными формами XylA
центрифуговали для отделения твердых остатков среды. Затем белок, растворенный в
супернатанте, высаливали сульфатом аммония и перерастворяли в 20 мМ буфере Bis-
Tris/HCl, pH 6,8. Далее раствор обессоливали на колонке с носителем BioGel P10. В
случае сухого ФП, его сначала растворяли в 20 мМ буфере Bis-Tris/HCl, pH 6,8, затем
проводили центрифугирование и обессоливание супернатанта на колонке с носителем
BioGel P10. Обессоливание проводили в 20 мМ Bis-Tris/HCl буфере. Скорость потока
составляла 0,7 мл/мин. Разделение ферментов и солей было не полным, поэтому
фракцию с белком собирали не полностью (фракция 1, Рисунок 24А). Обессоленную
КЖ концентрировали и наносили на колонку с анионообменным носителем Source 15Q.
Не все ферменты связывались с носителем, в том числе XylA, которая элюировалась в
несвязавшейся фракции – Проскоке (П) (Рисунок 24Б). Остальные ферменты
элюировали в растущем градиенте буфера Bis-Tris/ HCl + 1 M NaCl от 0 до 1 М NaCl.
Скорость потока составляла 1 мл/мин. Затем к фракции Проскок добавляли сульфат
аммония до концентрации последнего 1,7 М, и соленый раствор белка наносили на
колонку с гидрофобным носителем Source 15 Iso. Разделение белков осуществляли в
убывающем градиенте 50 мМ Na-ацетатного буфера + 1,7 М (NH2)SO4 от 1,7 М до 0 М
(NH2)SO4. XylA элюировалаcь примерно на 40-45% несоленого 50 мМ Na-ацетатного
буфера, что соответствует концентрации 0,9-0,95 М сульфата аммония (фракция 2
Рисунок 24В). Скорость потока составляла 5 мл/мин. В результате последовательных
стадий хроматографического выделения получили все рекомбинантные формы XylA в
гомогенном виде. Чистоту оценивали с помощью Ds-Na-ПААГ-электрофореза (Рисунок
25 и 29).
Рисунок 24 - Схема хроматографического выделения XylA. A - обессоливание КЖ на
BioGel P10; Б - анионообменная хроматография на Source 15Q; В - гидрофобная
хроматография Source 15Iso.
Рисунок 25 - ПААГ-электрофореграмма гомогенных форм XylA. 1 – XylA-wt; 2 - XylA
I6V; 3 - XylA I6L; 4 - XylA L18F; 5 - XylA N77D; 6 - XylA Y125R; 7 - XylA H191R; 8 -
XylA S246P; 9 - XylA A293P; 10 - XylA G83C/I124C; 11 - XylA del-ASVS/L18F.
7.3.2. XylE
Полученную после культивирования КЖ с мутантными формами XylE P.
canescens центрифугировали для отделения твердых остатков среды. Затем белок,
растворенный в супернатанте, высаливали сульфатом аммония и перерастворяли в 20
мМ буфере Bis-Tris/HCl pH 6,8. В случае сухого ФП, его сначала растворяли в 20 мМ
буфере Bis-Tris/HCl, pH 6,8, затем проводили центрифугирование и обессоливание
супернатанта. Далее раствор обессоливали на колонке с носителем BioGel P10. Скорость
потока составляла 0,7 мл/мин. Разделение ферментов и солей было не полным, поэтому
фракцию с белком собирали не полностью (фракция 1, Рисунок 26А). Обессоленую КЖ
наносили на колонку с анионообменным носителем Source 15Q. Большая часть
ферментов элюировалась в растущем градиенте буфера Bis-Tris/HCl + 1 M NaCl натрия
от 0 до 1 М NaCl. Скорость потока составляла 1 мл/мин. XylE элюировалась при
концентрации соли примерно 0,6 М (фракция 4, Рисунок 26Б). К фракции 4 добавляли
сульфат аммония до концентрации последнего 1,7 М, и соленый раствор белка наносили
на колонку с гидрофобным носителем Source 15 Iso. Элюирование белков осуществляли
в убывающем градиенте 50 мМ Na-ацетатного буфера + 1,7 М (NH2)SO4 сульфата
аммония от 1,7 М до 0 М. Скорость потока составляла 5 мл/мин. XylE элюировалась
примерно при 45-50% несоленого 50 мМ Na-ацетатного буфера, что соответствует
концентрации 0,85 - 0,9 М сульфата аммония (фракция 1, Рисунок 26В). В результате
последовательных стадий хроматографического выделения были выделены все
рекомбинантные формы XylE в гомогенном виде. Чистоту оценивали с помощью
ПААГ-электрофореза, результаты которого представлены на Рисунке 27.
Рисунок 26 - Схема хроматографического выделения XylE P. canescens. A –

обессоливание на BioGel P10; Б - анионообменная хроматография на Source 15Q; В -
гидрофобная хроматография на Source 15Iso.
Рисунок 27 - ПААГ-электрофореграмма гомогенных форм Xyl Е. 1 – XylE-wt; 2 - XylE
Y134R; 3 - XylE T196P; 4 - XylE D248E; 5 - XylE Y134R/D248E.
7.3.3. Xyl3
Полученную после культивирования КЖ с мутантными формами Xyl3 T. reesei
центрифуговали для отделения твердых остатков среды. Затем белок, растворенный в
супернатанте, высаливали сульфатом аммония и перерастворяли в 20 мМ буфере Bis-
Tris/HCl, pH 6,8. В случае сухого ФП, его сначала растворяли в 20 мМ буфере Bis-
Tris/HCl, pH 6,8, затем проводили центрифугирование и обессоливание супернатанта.
Обессоливание проводили на колонке с носителем BioGel P10. Скорость потока
составляла 0,5 мл/мин. Разделение ферментов и солей было не полным, поэтому
фракцию с белком собирали не полностью (фракция 1, Рисунок 28А). Обессоленную
КЖ наносили на колонку с анионообменным носителем Source 15Q. Не все ферменты
связывались с носителем, в том числе Xyl3, которая элюировалась в несвязавшейся
фракции – Проскоке (Рисунок 28Б). Остальные ферменты элюировали в растущем
градиенте буфера Bis-Tris/HCl + 1 M NaCl от 0 до 1 М NaCl. Скорость потока составляла
1 мл/мин. Затем к фракции Проскок добавляли сульфат аммония до концентрации
последнего 1,7 М, и соленый раствор белка наносили на колонку с гидрофобным
носителем Source 15 Iso. Разделение белков осуществляли в убывающем градиенте 50
мМ Na-ацетатного буфера + 1,7 М (NH2)SO4 сульфата аммония от 1,7М до 0 М.
Скорость потока составляла 5 мл/мин. Xyl3 элюировала примерно на 25-30% несоленого
50 мМ Na-ацетатного буфера, что соответствует концентрации 1,2 -1,3 М сульфата
аммония (Рисунок 28В). В результате последовательных стадий хроматографического
выделения были получены все рекомбинантные формы Xyl3 в гомогенном виде.
Чистоту оценивали с помощью Ds-Na-ПААГ-электрофореза, результаты которого
представлены на Рисунке 29.
Рисунок 28 - Схема хроматографического выделения Xyl3. A - обессоливание на BioGel

P10; Б - анионообменная хроматография на Source 15Q; В - гидрофобная хроматография
на Source 15Iso.
А Б
Рисунок 29 – ПААГ-электрофореграммы гомогенных форм ксиланаз. А. 1 - Xyl3 A188D;

2 - Xyl3 Y219R; 3 - Xyl3-wt. Б. 1 – XylA-wt; 2 – XylA-ins; 3 - Xyl3-wt; 4 - Xyl3-ins.
7.4. Масс-спектрометрический анализ рекомбинантных форм ксиланаз

После проведения Ds-Na-ПААГ-электрофореза из полиакриламидного геля
вырезали кусочек белковой полосы, которая соответствовала ксиланазе. Белок
подвергали обработке трипсином, и полученную смесь пептидов анализировали
методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Соответствие белковых полос из геля
исследуемым ксиланазам было показано с помощью онлайн сервиса MASCOT
(http://www.matrixscience.com), тогда как соответствие экспериментальных и
теоретических масс пептидов, несущих аминокислотные замены, проверяли с помощью
онлайн сервиса PeptideMass (http://web.expasy.org/peptide_mass/) (Таблица 9).
Таблица 9 – Идентификация аминокислотных замен в пептидах исследуемых ксиланаз

методом масс-спектрометрии.
Форма фермента m/z теоретическая m/z экспериментальная
XylA
XylA I6V 904,0 904,1
XylA I6L 918,0 918,2
XylA L18F 1506,1 1506,0
XylA N77D 1624,9; 2422,2 1625,0; 2422,4
XylA Y125R 2122,2 2122,3
XylA H191R 3022,2 3022,1
XylA S246P 1452,4; 2166,0 1452,1; 2166,2
Форма фермента m/z теоретическая m/z экспериментальная
XylA A293P 1470,9; 2338,1 1471,0; 2338,1

XylA G83C/I124C 1733,9; 2143,1; 3173,4 1734,0, 2143,1; 3173,3
XylA del ASVS/L18F 574,8; 1506,1 575,0, 1506,1
XylA-ins 1996,1 1996,0
XylE
XylE Y134R 3910,2 3910,2
XylE T196P 1642,9 1643,0
XylE D248E 1428,6 1428,6
XylE Y134R/D248E 3910,2; 1428,6 3910,1; 1428,4
Xyl3
Xyl3 A188D 2804,4; 1296,7; 2272,1 2804,3; 1296,5; 2272,1
Xyl3 Y219R 1229,8 1230,0
Xyl3-ins 3174,3 3174,6
Масс-спектрометрический анализ всех полученных мутантных форм ксиланаз

показал наличие необходимых а.к. замен. В некоторых случаях имелось несколько
идентифицированных пептидов в связи с пропуском сайтов расщепления трипсином. В
большинстве случаев структура пептидов, указанных в Таблице 9, была также
подтверждена методом тандемной масс-спектрометрии. В качестве примеров на
Рисунках 30 и 31 приведены спектры фрагментации пептидов из XylA, содержащих
вставку GQGGA (в XylA-ins) и замену L18F (в XylA L18F) соответственно.
Рисунок 30 – Масс-спектр фрагментации пептида с m/z 1996,0 из мутантной формы
XylA-ins.
Intens. [a.u.]
x10 4
924.7
5
752.5
4
624.4
3
F
K-
T I/L T Y Q D G I/L T G Y
1196.2
461.3
2
1037.9
867.6
735.4
881.6
1506.8
1343.5
1
659.3
563.3
1139.1
360.3
247.4
770.4
300.3
677.3
1259.2
431.3
1360.5
214.4
146.5
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

m/z
Рисунок 31 – Масс-спектр фрагментации пептида с m/z 1506,0 из мутантной формы

XylA L18F.
Глава 8. Свойства рекомбинантных ксиланаз дикого типа и их мутантных форм
После выделения исходных и мутантных форм рекомбинантных ксиланаз в
гомогенном виде, проведения Ds-Na-ПААГ-электрофореза и масс-спектрометрии
проводили изучение свойств ферментов: каталитической активности по отношению к
глюкуроноксилану из березы, арабиноксилану из пшеницы, определение оптимальных
температуры и рН, исследование температурной инактивации ксиланаз при различных
температурах путем определения остаточной активности по отношению к
глюкуроноксилану от времени инкубации фермента, а также проводили измерение
температуры фазового перехода (Tm) методом дифференциальной сканирующей
микрокалориметрии (ДСК). По результатам температурной инактивации и изменению
температуры фазового перехода (Tm) относительно рекомбинантной формы дикого
типа можно сделать вывод о влиянии а.к. замены на температурную стабильность
ксиланазы.
8.1. XylA
Все осуществленные а.к. замены не привели к изменению рН-оптимума
ферментативной активности, он сохранился для всех форм XylA в диапазоне 5-6
(Рисунок 32). Температурный оптимум активности также сохранился практически
одинаковым для всех мутантных форм XylA и составил 50 °С (Рисунок 33). Некоторое
снижение каталитической активности по отношению к глюкуроноксилану наблюдалось
для всех мутантных форм ксиланазы. Наименьшее влияние на активность оказала
замена S246P (-7%), наибольшее – Y125R (-22%) и H191R (-27%) (Таблица 10).
Изменение удельной активности в случае использования в качестве субстрата
арабиноксилана из пшеницы практически не наблюдалось. Максимальное снижение
активности составило 8 % в случае а.к. замены H191R (Таблица 10). В отличие от
арабиноксилана, глюкуроноксилан из березы содержит остатки глюкуроновой кислоты
в качестве латерального заместителя ксилопиранозного остова. Большинство из них
отрицательно заряжены в условиях ферментативной реакции (рН 5,0, в то время как pK
карбоксильной группы в глюкуроновой кислоте составляет 3,5). Таким образом,
дополнительно введенные остатки аргинина могут неспецифически взаимодействовать с
карбоксильными группами глюкуроновой кислоты, вызывая небольшое кажущееся
ингибирование активности.
Отн.Акт., %
100
Xyl A
XylA I6V
80 XylA I6L
XylA L18F
60 XylA N77D
XylA Y125R
XylA S246P
40
XylA A293P
XylA G83C/I124C
20
XylA del
ASVS/L18F
XylA-ins
0
2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5
pH
Рисунок 32 - рН-зависимость активности гомогенных форм XylA.
Отн.Акт., %
100 Xyl A
XylA I6V
80 XylA I6L
XylA L18F
60 XylA N77D
XylA Y125R
40 XylA S246P
XylA A293P
XylA G83C/I124C
20
XylA del
ASVS/L18F
XylA-ins
0
20 30 40 50 60 70 80 90
T, °C
Рисунок 33 - Температурная зависимость активности гомогенных форм XylA.
Таблица 10 – Удельная активность (ед/мг) по глюкуроноксилану и арабиноксилану
гомогенных форм XylA.
Фермент Глюкуроноксилан Арабиноксилан

XylA-wt 29,8 ± 0,4 28,6 ± 0,3
XylA I6V 24,2 ± 0,5 28,4 ± 0,5
XylA I6L 24,4 ± 0,5 28,3 ± 0,5
XylA L18F 23,9 ± 0,4 28,4 ± 0,4
XylA N77D 26,1 ± 0,6 27,6 ± 0,6
XylA Y125R 23,2 ± 0,7 27,0 ± 0,7
XylA H191R 21,7 ± 0,4 26,5 ± 0,5
XylA S246P 27,8 ± 0,5 28,4 ± 0,8
XylA A293P 27,3 ± 0,6 27,5 ± 0,5
XylA G83C/I124C 26,6 ± 0,9 28,0 ± 0,9
XylA del-ASVS/L18F 24,0 ± 0,7 27,6 ± 0,6
XylA-ins 22,8 ± 0,9 27,1 ± 0,5
Данные по температурной инактивации рекомбинантной XylA дикого типа и ее

мутантных форм XylA представлены на Рисунке 35 и в Таблице 11. Только один мутант
(XylA L18F) продемонстрировал значительное увеличение термостабильности
фермента. Период его полуинактивации увеличился в 1,9, 2,5, 2,4 раза по сравнению с
рекомбинантной формой при 50, 55, 60 °С соответственно (Рисунок 35, Таблица 11).
Температура фазового перехода увеличилась на 3,9 °С – до 60,0 °С (Рисунок 36, Таблица
11). XylA содержит гидрофобное ядро в составе ферментной глобулы, которое
организуется а.к. остатками фенилаланина в положениях: 10, 41; лейцина в положениях:
18, 36, 283, 284; изолейцина в положениях: 36, 37, 265, 298; аланина в положениях: 271,
297, 301; и остатка валина в положении 270 (Рисунок 34). Гидрофобные боковые группы
а.о. отмечены розовым цветом на рисунке, L18 и F18 отмечены зеленым цветом. По
результатам исследования температурной инактивации и температуры фазового
перехода можно сделать вывод, что заполнение полости более гидрофобным и большим
а.о. фенилаланина в белковой глобуле привело к усилению гидрофобных
взаимодействий, и, как следствие, к значительному увеличению термостабильности
фермента.
Рисунок 34 - Схематическое изображение структуры гидрофобного ядра XylA P.

canescens. 1 – Исходный фермент содержит в составе L18; 2 – Мутантная форма L18F
содержит в составе F18.
А.к. замены I6V, I6L не повлияли не температурную стабильность XylA. То есть,

замена неполярного разветвленного изолейцина на линейные валин и лейцин,
находящиеся в эквивалентных позициях у термостабильных ксиланаз (Рисунок 16), не
привела к оптимизации гидрофобных взаимодействий в XylA. Кривые температурной
инактивации указанных мутантных форм и соответственно их периоды
полуинактивации практически полностью совпадали с параметрами рекомбинантной
формы XylA-wt (Рисунок 35, Таблица 11). В своей работе Сонг с коллегами [211]
отметил важность гидрофобных взаимодействий на N-конце ксиланазы AnXyn10A
Aspergillus niger. Однако для обеих форм I6V и I6L наблюдалось уменьшение
температуры фазового перехода до 52,0 и 53,9 °С соответственно (Рисунок 36, Таблица
11). А замена K9L в а.к. последовательности XylA (Рисунок 16) привела к отсутствию
экспрессии данной мутантной формы по непонятным причинам. Двойная а.к. замена
G83C/I124C, направленная на образование дисульфидного мостика, привела к
незначительному уменьшению температурной стабильности, при этом периоды
полуинактивации при 50, 55, 60 °С уменьшились на 10-15%. (Рисунок 35, Таблица 11).
Однако температура фазового перехода была существенно ниже, чем у рекомбинантной
формы – 50,0° С. Можно предположить, что слабый дестабилизирующий эффект
введения дисульфидного мостика объясняется тем, что он введен в консервативную
часть глобулы, что, согласно литературным данным [54], приводит к дестабилизации
или сохранению температурной стабильности, но не к ее увеличению. В работе [156]
также было показано, что введение дисульфидного мостика в консервативную область
фермента не приводит к существенному изменению термостабильности. Другие а.к.
замены привели к значительно большей дестабилизации XylA, как следует из кривых
инактивации и данных о температуре фазового перехода. Из пяти а.к. замен,
направленных на образование дополнительных солевых мостиков, экспрессировались
лишь три: N77D, Y125R, H191R, и все они демонcтрировали меньшую
термостабильность, чем рекомбинантная форма XylA. Натеш и соавторы [54]
предполагали, что солевой мостик, образованный остатками R124 и E233, играет
ключевую роль в термостабильности ксиланазы Xyn10A T. aurantiacus. Однако
исследование параметров мутантной формы XylA Y125R показало, что замена приводит
к потере стабильности (Рисунок 35, Таблица 11), что может быть связано с тем, что
солевой мостик с глутаминовой кислотой не был сформирован или, что введение нового
остатка аргинина нарушило баланс между основными и кислотными остатками в этой
области ферментной глобулы. Второе предположение, видимо, является верным,
поскольку в этой же области XylA присутствуют R16, R169, R232, и все они
потенциально могут взаимодействовать с E233. Наибольший дестабилизирующий
эффект оказали замены N77D, A293P и del-ASVS/L18F. Мутации, направленные на
увеличение термостабильности за счет введения пролина в начало -спиралей (Рисунок
16) и увеличения жесткости третичной структуры, вместо этого привели к
дестабилизации фермента. Удаление а.к. остатков на N-конце фермента может играть
критическую роль на его стабильность и функциональность. Мутантная форма с
делецией а.к. остатков 1-QASVS-5 вообще не экспрессировалась, а мутантная форма с
делецией а.к. остатков 2-ASVS-5 и одинарной заменой L18F экспрессировалась, но
привела к значительному уменьшению термостабильности, несмотря на положительный
эффект от одинарной замены L18F (Рисунок 35, Таблица 11). Можно предположить, что
глутамин на N-конце XylA играет важную роль в обеспечении функциональности XylA.
Рисунок 35 - Температурная инактивация гомогенных форм XylA при А - 50 °С; Б
- 55 °С; В - 60 °С.
Рисунок 36 – ДСК гомогенных форм XylA
Таблица 11 - Периоды полуинактивации гомогенных форм XylA при различных

температурах и температура их фазового перехода.
50 °C, 55 °C, 60 °C,
Фермент мин мин мин, Tm, °C  Tm, °C
XylA-wt 103 13 2,2 56,1 -
XylA I6V 110 12 2,2 52,0 -4,1
XylA I6L 111 14 2,3 53,9 -2,2
XylA L18F 201 34 5,2 60,0 3,9
XylA N77D 43 3,6 <1 50,0 -6,1
XylA Y125R 70 3,7 <1 54,8 -1,3
XylA H191R 57 4,6 1 54,7 -1,4
XylA S246P 59 4,1 1,2 54,1 -2,0
XylA A293P 41 3,1 <1 51,8 -4,3
XylA G83C/I124C 95 11 2 50,0 -6,1
XylA del ASVS/L18F 38 3 1 50,3 -5,8
XylA-ins 62 5 <1 54,1 -2,0
8.2. XylE
Мутантные формы XylE демонстрировали такие же температурный и рН-
оптимумы активности, как рекомбинантный фермент дикого типа. рН-Оптимум для всех
форм XylE являлся ярко-выраженным и составил 5,5, температурный оптимум – 70 °С
(Рисунки 37 и 38). Удельная активность мутантных форм XylE Y134R, XylE Y196P,
XylE D248E, XylE Y134R/D248E по отношению к глюкуроноксилану снизилась на 17,
16, 11, 20 % относительно рекомбинантной формы XylE-wt (Таблица 12). Удельная
активность мутантных форм по отношению к арабиноксилану снизилась в меньшей
степени, максимальное снижение составило 9% в случае мутантных форм XylE D248E и
XylE Y134R/D248E. Изучение термостабильности с помощью измерения остаточной
активности при инкубации гомогенных ферментов при различных температурах
установило, что мутантные формы XylE Y134R, XylE T196P, XylE Y134R/D248E
обладают лучшими показателями периодов полуинактивации по сравнению с
рекомбинантной формой дикого типа (Рисунок 39). Наиболее ярко данный эффект
проявился при 60 °С. Периоды полуинактивации увеличились на 25, 14, 22 % для
мутантных форм XylE Y134R, XylE T196P, XylE Y134R/D248E соответственно (Таблица
13). Увеличение периодов полуинактивации также наблюдалось при 70 °С. Периоды
полуинактивации при 50 °С не определены в виду высокой стабильности XylE при
данной температуре, однако остаточная активность в точке 1440 мин составила 70, 84,
73, 76, 66 % для рекомбинантных форм XylE-wt, XylE Y134R, XylE T196P, XylE
Y134R/D248E, XylE D248E. Исследование стабильности методом ДСК установило, что
три мутантные формы XylE Y134R, XylE Y196P, XylE Y134R/D248E обладали более
высокой температурой фазового перехода по сравнению с ферментом дикого типа: на
2,7, 0,2, 2,3 °С соответственно (Рисунок 40, Таблица 13). Мутантная форма XylE D248E
демонстрировала более низкую термостабильность, период полуинактивации формы
XylE D248E снизился на 25 мин при 60 °С, а температура фазового перехода снизилась
на 0,7 °С. Из полученных экспериментальных данных можно сделать вывод, что
введение аргинина вместо тирозина в положении 134 привело к значительному
увеличению термостабильности XylE за счет образования ионной связи с аспарагиновой
кислотой в положении 248 (Рисунок 18.1). При этом замена аспарагиновой кислоты в
данном положении на глутаминовую кислоту, которая имеет более длинную боковую
группу, приводит к небольшой дестабилизации мутантной формы XylE D248E. Что
касается формы XylE Y134R/D248E, то в данном случае также наблюдается некоторое
снижение положительного эффекта от просто одинарной замены Y134R (Рисунок 18.3 и
18.4). А.к. замена T213P привела к незначительному увеличению термостабильности,
температура фазового перехода выросла всего на 0,2 °С, и при этом период
полуинактивации при 60 °С увеличился со 180 мин до 190 мин (Рис. 39, Таблица 13).
Акт отн,%
100
XylE-wt
90
80
XylE
70 Y134R
60
XylE
50 T196P
40 XylE
30 D248E
20 XylE
10 Y134R/
D248E
0
2 3 4 5 6 7 8
pH
Рисунок 37 - рН-зависимость активности гомогенных форм XylE.
Акт отн,%
100
XylE-wt
90
80
XylE
70
Y134R
60
50 XylE
T196P
40
30 XylE
D248E
20
10 XylE
Y134R/
0 D248E
30 40 50 60 70 80 90 100
T, °C
Рисунок 38 - Температурная зависимость активности гомогенных форм XylE.
Таблица 12 - Удельная активность (ед/мг) по глюкуроноксилану и арабиноксилану
гомогенных форм XylE.

XylE-wt 41,0 ± 0,7 59,0 ± 1,1
Y134R 33,8 ± 0,8 54,4 ± 1,3
T196P 35,0 ± 0,8 55,6 ± 1,3
D248E 36,5 ± 0,9 53,9 ± 1,2
Y134R/D248E 33,3 ± 0,8 54,0 ± 1,4
Таблица 13 - Период полуинактивации гомогенных форм XylE при различных

50° C, 60° C, 70° C,
Фермент мин мин мин Tm, °C  Tm, °C
XylE-wt >1400 180 3,5 70,0 -
Y134R >1400 240 4 72,7 2,7
T196P >1400 190 3,5 70,2 0,2
D248E >1400 155 3,5 69,3 -0,7
Y134R/D248E >1400 210 3 72,3 2,3
А. Акт.отн.,%
100
XylE-wt
90
80
XylE Y134R
70
60
XylE T196P
50
40
XylE D248E
30
20
XylE
10
Y134R/D248E
0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
t, мин
Б. Акт.отн.,%
100
90 XylE-wt
80
70
XylE Y134R
60
50
XylE T196P
40
XylE D248E
30
20
XylE
10
Y134R/D248E
0
0 50 100 150 200 250
t, мин
В. Акт.отн.,%
100
XylE-wt
90
80
XylE Y134R
70
60
XylE T196P
50
40
XylE D248E
30
20
XylE
10 Y134R/D248E
0
0 5 10 15 20
t, мин
Рисунок 39 - Температурная инактивация гомогенных форм XylE при А - 50 °С; Б - 60

°С; В - 70 °С.
Рисунок 40 – ДСК гомогенных форм XylE.
8.3. Xyl3
Все проведенные а.к. замены не привели к заметному изменению рН-оптимума
активности мутантных форм Xyl3, он сохранился для всех форм в диапазоне 5,5-6,0.
(Рисунок 41). Температурный оптимум активности также сохранился для мутантных
форм Xyl3 A188D и Xyl3 Y219R и составил 60 °С. Температурный оптимум Xyl3-ins
уменьшился на 5 °С и составил 55 °С (Рисунок 42, Таблица 14). Некоторое снижение
удельной активности по отношению к глюкуроноксилану наблюдалось для всех
мутантных форм и составляло 18, 11 и 28% для форм Xyl3 A188D, Xyl3 Y219R, Xyl3-ins
соответственно. Также наблюдалось незначительное снижение удельной активности
мутантных форм Xyl3 по отношению к арабиноксилану. А.к. замены A188D и Y219R,
направленные на создание дополнительных ионных пар, не привели к повышению
температурной стабильности Xyl3 (Рисунок 43). Скорее всего, это связано с тем, что
замены не привели к образованию запланированных ионных взаимодействий.
Мутантная форма Xyl3-ins также привела к дестабилизации ксиланазы. Периоды
полуинактивации при 55 °С уменьшились на 12, 37, 64% для мутантных форм Xyl3
A188D, Xyl3 Y219R, Xyl3-ins соответственно. Температуры фазового перехода также
уменьшились на 1,3, 0,9, 1,6 °С по сравнению с рекомбинантной формой дикого типа
для мутантных форм A188D, Y219R, Xyl3-ins соответственно (Рисунок 44, Таблица 15).
Акт.Отн., %
100
90 Xyl3-wt
80
70
Xyl3
60 A188D
50
40 Xyl3
Y219R
30
20 Xyl3-ins
10
0
3 4 5 6 7 8 9
pH
Рисунок 41 - pH - зависимость активности гомогенных форм Xyl3.
Акт.Отн., %
100
90
Xyl3-wt
80
70
60 A188D
50
40 Y219R
30
20
Xyl3-ins
10
0
30 40 50 60 70 80 90
T, °C
Рисунок 42 - Температурная зависимость активности гомогенных форм Xyl3.
Таблица 14 - Удельная активность (ед/мг) по глюкуроноксилану и арабиноксилану
гомогенных форм Xyl3.

Xyl3-wt 60,1 ± 1,4 58,8 ± 1,5
Xyl3 A188D 51,0 ± 1,6 56,4 ± 1,6
Xyl3 Y219R 52,5 ± 1,7 57,2 ± 1,5
Xyl3-ins 43,9 ± 1,6 54,4 ± 1,9
Таблица 15. Периоды полуинактивации гомогенных форм Xyl3 при различных

55° C, 60° C, 70° C,

Фермент мин мин мин Tm, °C  Tm, °C
Xyl3-wt 57 17 1,5 61,4 -
Xyl3 A188D 50 14 1 60,1 -1,3
Xyl3 Y219R 36 9 <1 60,5 -0,9
Xyl3-ins 21 3 <1 59,8 -1,6
А. Акт.Отн., %
100
90 Xyl3-wt
80
70 Xyl3
60 A188D
50
40 Xyl3
Y219R
30
20 Xyl3-ins
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
t, мин
Б. Акт.Отн., %
100
90 Xyl3-wt
80
70 Xyl3
60 A188D
50
40 Xyl3
Y219R
30
20 Xyl3-ins
10
0
0 5 10 15 20 25 30 35
t, мин
В. Акт.Отн., %
100
90 Xyl3-wt
80
70
Xyl3
60 A188D
50
40 Xyl3
30
Y219R
20
Xyl3-ins
10
0
0 1 2 3 4 5 6
t, мин
Рисунок 43 - Температурная инактивация гомогенных форм Xyl3 при А - 55 °С; Б - 60

°С; В - 70 °С.
Рисунок 44 – ДСК гомогенных форм Xyl3.
8.4. Исследование ингибирования ксиланаз белковыми ингибиторами ржи

Хотя ингибирование ксиланаз ингибиторами типов XIP и TAXI интенсивно
изучалось в течение последних 20 лет, количество публикаций, основанных на генно-
инженерном подходе, довольно ограничено. Практически все эти работы сосредоточены
на сайт-направленном мутагенезе ксиланаз 11-й семьи ГГ с целью выявления факторов,
влияющих на устойчивость ферментов к ингибиторам XIP и TAXI.
Изучение устойчивости исследуемых ксиланаз к ингибиторам типа XIP
проводили с помощью разработанного ранее в нашей лаборатории метода, основанного
на измерении вязкости нативного и термоинактивированного экстрактов ржи под
действием гомогенных форм ксиланаз. Термоинактивированный экстракт, в отличие от
нативного, кипятился в течение 10 мин на водяной бане, что приводило к денатурации
белковых ингибиторов ксиланаз. Поскольку известно, что ксиланазы 10-й семьи ГГ не
ингибируются TAXI и восприимчивы только к действию XIP-подобных ингибиторов, то
речь в данном случае идет именно об ингибиторах типа XIP в экстракте ржи.
Исследование установило, что XylA-wt и Xyl3-wt подвержены ингибированию XIP, в то
время как XylE-wt демонстрировала устойчивость к ингибитору (Рисунки 46-48).
Как было указано в п. 6.3, в а.к. последовательности XylE присутствует вставка из
5 а.к. – GQGGA (Рисунок 21), которая вероятно и отвечает за резистентность фермента к
белковым ингибиторам. На Рисунке 45 изображена структура комплекса ксиланазы
Aspergillus nidulans и XIP, при этом структуры ксиланаз XylA, Xyl3, XylE наложены на
структуру ксиланазы A. nidulans, а последняя не отображена для удобства.
Как видно из Рисунка 45, одна из α-спиралей XIP пространственно пересекается с
петлей GQGGA в XylE (указано стрелкой на Рисунке 45А), которая создает стерические
затруднения для формирования комплекса данной ксиланазы с ингибитором и
связывания K234 XIP-ингибитора с каталитическим а.о. E141 (E132 и E160 в случае
XylA и Xyl3, соответственно). Более наглядно это продемонстрировано на Рисунке 45Б.
С другой стороны, более длинная вставка из 12 а.о. в петле XylE (слева от петли
GQGGA на рисунке 45) напрямую не взаимодействует с ингибитором. Таким образом,
можно было ожидать, что после введения вставки GQGGA, присутствующей в петле
XylE, в соответствующие позиции а.к. последовательности XylA и Xyl3 должны были
возникнуть подобные же стерические затруднения для связывания XIP с XylA-ins и
Xyl3-ins. Указанная вставка из 5 а.к. была введена в XylA и Xyl3, и были получены и
экспрессированы мутантные формы ксиланаз XylA-ins и Xyl3-ins, в которых таким
образом произошло удлинение соответствующей пептидной петли, формирующей
«стенку ущелья» активного центра (Рисунок 45).Мутантные формы XylA-ins и Xyl3-ins
действительно продемонстировали резистентность к белковым ингибиторам, что было
подтверждено измерением вязкости нативного и термоинактивированного экстрактов
ржи (Рисунки 46 и 47).
Рисунок 45 – А. Совмещенные кристаллические структуры XylA P. simplicissimum
(1BG4.PDB, синего цвета); Xyl3 (4XV0.PDB, зеленого цвета), XylE (4F8X.PDB, красного
цвета), комплекс ксиланазы A. nidulans и XIP (1TA3.PDB, оранжевого цвета, сама
ксиланаза не отображена для удобства). Б. Также отображены боковые группы а.о. α-
спирали XIP и петли XylE.
А. Отн. вязкость,
%
100
90 нативный
80 экстракт
70
60
50
40 Т-
30 инактивиров
20 анный
экстракт
10
0
0 5 10 t, мин 15 20 25
Б. Отн. вязкость,
%
100
нативный
80 экстракт
60
40 Т-
инактивиро
20 ванный
экстракт
0
0 5 10 t, мин 15 20 25
Рисунок 46 - Уменьшение вязкости экстрактов ржи под действием ксиланаз при 40 °С,
рН 5,0 и загрузке фермента 5 ед. ксиланазной активности на мл раствора. А – XylA-wt; Б
- XylA-ins.
А. Отн. вязкость,
%
100
нативный
80 экстракт
60
40 Т-
20 ванный
экстракт
0
0 5 10 t, мин 15 20 25
Б. Отн. вязкость,
%
100
нативный
80 экстракт
60
40 Т-
20 ванный
экстракт
0
0 5 10 t, мин 15 20 25
Рисунок 47 - Уменьшение вязкости экстрактов ржи под действием ксиланаз при 40 °С,
рН 5,0 и загрузке фермента 5 ед. ксиланазной активности на мл раствора. А - Xyl3-wt; Б
- Xyl3-ins.
Отн. вязкость,
%
100
нативный
80 экстракт
60
40 Т-
20 ванный
экстракт
0
0 5 10 15 20 25
t, мин
Рисунок 48 - Уменьшение вязкости экстрактов ржи под действием XylE-wt при 40 °С,
рН 5,0 и загрузке фермента 5 ед. ксиланазной активности на мл раствора.
Разница между снижением вязкости нативного и термоинактивированного

экстрактов говорит о влиянии белковых ингибиторов (в данном случае типа XIP) на
активность ксиланаз. В случае значительной разницы (Рисунки 46.А и 47.А) можно
сделать вывод, что вязкость термоинактивированного экстракта снижается заметно
быстрее под действием ксиланазы, значит ингибиторы, которые присутствуют в
нативном экстракте, ингибируют данный фермент, поскольку вязкость нативного
экстракта снижается значительно в меньшей степени. В случае устойчивости ксиланазы
к ингибиторам XIP вязкость нативного и термоинактивированного экстрактов
снижается в равной степени при одинаковой загрузке ксиланазной активности на мл
раствора экстракта (Рисунки 46.Б, 47.Б и 48). На Рисунках 46-48 представлены
результаты экспериментов при загрузке 5 ксиланазных единиц активности на 1 мл
экстракта ржи. Вязкость при этом снизилась на 65% и 35% через 20 мин реакции под
действием XylA-wt в случае термоинактивированного и нативного экстрактов
соответственно. А в случае воздействия XylA-ins вязкость экстрактов снизилась за то
же время реакции на 64 и 61%. Такое значительное уменьшение разницы в снижении
вязкости говорит о существенном снижении восприимчивости (приобретении
устойчивости) XylA-ins к белковым ингибиторам типа XIP. Идентичные результаты
наблюдались при исследовании уменьшения вязкости экстрактов ржи под действием
Xyl3-wt и Xyl3-ins. Вязкость снизилась на 59% и 32% после 20 мин реакции под
действием Xyl3 в случае термоинактивированного и нативного экстрактов. В случае же
воздействия на экстракты Xyl3-ins вязкость снизилась соответственно на 60% и 57%.
Для сравнения под действием XylE-wt вязкость нативного и термоинактивированного
экстрактов снизилась на 60 и 59% при тех же условиях реакции (Рисунок 48).
Стоит, однако, отметить, что в то же время введение а.к. вставки в XylA и Xyl3
привело к некоторому уменьшению удельной активности ферментов по отношению к
глюкуроноксилану – на 22% и 27% для XylA-ins и Xyl3-ins соответственно (Таблицы 10
и 14). Также наблюдалось заметное уменьшение термостабильности для XylA-ins и
Xyl3-ins по сравнению с рекомбинантными ферментами дикого типа (Рисунки 35, 36, 43,
44, Таблицы 11 и 15). Таким образом, наблюдался компромисс между активностью
ксиланаз, их термостабильностью и приобретением устойчивости к ингибиторам из
злаковых растений.
ВЫВОДЫ
1. Осуществлены клонирование и экспрессия модифицированных генов xylA, xylE и
xyl3, кодирующих ксиланазы А и Е (XylA и XylE) из Penicillium canescens, а также
ксиланазу III (Xyl3) из Trichoderma reesei с различными аминокиcлотными
заменами, делециями или вставками, в ауксотрофных штаммах-реципиентах P.
verruculosum B1-537 и P. canescens RN3-11-7. На основе новых рекомбинантных
штаммов получены ферментные препараты, содержащие мутантные формы
исследуемых ксиланаз.
2. Разработаны хроматографические схемы очистки рекомбинантных XylA, XylE и
Xyl3, с помощью которых ферменты дикого типа и их мутантные формы выделены в
гомогенном состоянии.
3. Получена мутантная форма XylA L18F, которая демонстрирует более высокую
термостабильность по сравнению с рекомбинантным ферментом дикого типа (XylA-
wt). Для XylA L18F температура плавления увеличилась на 3,9°С, а время
полуинактивации фермента при 50–60°С возросло в 1,9–2,5 раза относительно XylA-
wt. Установлено, что ряд аминокислотных замен (I6V, I6L, N77D, Y125R, H191R,
S246P, A293P, G83C/I124C, del-ASVS/L18F, GQGGA-ins) не приводят к заметным
изменениям в термостабильности XylA, либо способствуют дестабилизации
фермента.
4. Получены мутантные формы XylE Y134R, T196P и Y134/D248E, которые обладают
более высокой термостабильностью по сравнению с рекомбинантным ферментом
дикого типа (XylE-wt). Температуры плавления указанных мутантных форм
увеличились соответственно на 2,7; 0,2 и 2,3°С относительно XylE-wt.
5. Установлено, что XylE-wt обладает устойчивостью к белковым ингибиторам типа
XIP из экстракта ржи, тогда как XylA-wt и Xyl3-wt восприимчивы к действию
данных ингибиторов.
6. Получены мутантные формы XylA-ins и Xyl3-ins со вставкой пяти аминокислотных
остатков (GQGGA) в пептидную петлю в районе активного центра ферментов,
которые, в отличие от рекомбинантных ферментов дикого типа, демонстрируют
устойчивость к белковым ингибиторам типа XIP за счет создания стерических
затруднений для связывания ингибитора.
БЛАГОДАРНОСТИ
При проведении исследований использовалось оборудование Центра коллективного
пользования «Промышленные биотехнологии» Федерального учреждения
«Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии»
Российской академии наук».
Автор благодарит кандидата биологических наук, старшего научного сотрудника
лаборатории структурной биохимии белка ФИЦ Биотехнологии РАН Клейменова
Сергея Юрьевича за проведение экспериментов по термоинактивации изучаемых
ферментов методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии, а также
кандидата физико-математических наук, ведущего научного сотрудника кафедры
химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова
Упорова Игоря Владимировича за компьютерное моделирование мутантных форм
ксиланаз.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М. 1986., Т. 1. С. 71.

2 Азаров В.И., Буров А.В., Оболенская А.В.. Химия древесины и синтетических
полимеров. СПб.: Темплан. 1999. С. 214-220.
3 Klemm D., Heublein B., Fink H.-P., A. Cellulose: fascinating biopolymer and
sustainable raw material, Angew. Chem. Int. 2005. P. 3358.
4 Newman R., Davies L., Harris P. Solid-state 13-C nuclear magnetic resonance
characterization of the cell walls of Arabidopsis thaliana leaves. Plant physiology. 1996.
T. 111. P. 475-485.
5 Smith B., Harris P., Melton L., Newman R. Crystalline cellulose in hydrated primary
cell walls of three monocotyledons and one dicotyledon. Plant and Cell Physiology.
1998. T. 39. P. 711–720.
6 Himmel M. E.. Biomass recalcitrance. Deconstructing the plant cell wall for bioenergy.
Blackwell Publishing Ltg. 2008. P. 61-134.
7 Шестрем Э., Янсон Я. Гемицеллюлозы. В сб. Химия древесины. М.: Мир. 1982. С.
130.
8 Eriksson O., Lindgren B.. About the linkage between lignin and hemicelluloses in
wood. Svensk Papperstidn. 1997. P. 59-64.
9 Doherty W.O.S., Mousavion P., Fellows C.M. Value-adding to cellulosic ethanol:
Lignin polymers. Industrial Crops and Products. 2011. V. 22. P. 259-270.
10 Rahikainen J., Mikander S., Marjamaa K., Lappas A. Inhibition of enzymatic hydrolysis
by residual lignins from softwood — study of enzyme binding and inactivation on
lignin-rich surface. Biotechnology and Bioengineering. 2011. DOI 10.1002/bit.23242.
11 Williams P., Heinze T., Daus S. Renewable resources for fuctional polymers and
biomaterials. The royal Society of Chemistry. 2011. Ch. IV. P. 1-27.
12 Coughlan M.P., Hazlewood G.P. Hemicellulose and hemicellulases. Portland Press
Research Monograph. London. 1993. V.4. P. 120.
13 Schulze E. Zur Kentniss der chemischen Zusammensetzung der pflanzlichen
Zellmembranen, Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1891. P. 2277-2287.
14 Ebringerova A. Structural diversity and application potential of hemicelluloses.
15 Ebringerova A., Heinze T. Xylan and xylan derivatives – biopolymers with valuable
Macromol. Symp. 2006. P. 1-12.
properties. Naturally occurring xylans structures, isolation procedures and properties.
Macromolecular Rapid Communications. 2000. P. 542–556.
16 Viikari L., Suurnaki A. Forest products: Biotechnology in pulp and paper processing.
Encyclopedia of microbiology. 2009. P. 80-94.
17 Somerville C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and
Developmental Biology. 2006. P. 53–78.
18 Bajpai P. Xylanolytic enzymes. 2014. P. 9-18.
19 Stephen A. Other plant polysaccharides. New York. 1983. V. 2. P. 98-183.
20 Holguin-Acuna A. Non-starch polysaccharides in maize and oat: ferulated
arabinoxylans and β-glucans. 2011.
21 Mueller-Harvey I., Hartley R.D., Harris P.J. Linkage of p-kumaroyl and feruloyl groups
to cell wall polysaccharides of barley straw. Carbohydr. Res. 1986. V.148, P.71-85.
22 Holtzapple M.. Hemicelluloses. Encyclopedia of food science and nutrition. 2003.
P.3060-3071
23 Deniaud E., Quemener B.. Structural studies of mix-linked β-(1-3)/β-(1-4)-D-xylans
from cell wall of Palmaria palmate (Rhodophyta). J. Physiol. 2003. P. 75-83.
24 Deniaud E., Fleurence J., Dahlman O. Preparation and chemical characterization of cell
wall fractions enriched in structural proteins from Palmaria palmate (Rhodophyta). Bot.
Mar. 2004. P. 365-379.
25 Woodward J. Xylanases: functions, properties, and applications. Top. Enzyme Ferment.
Biotechnol. 1984. P. 8-48.
26 Beg Q. Cellulases and related enzymes in biotechnology. Amer. Chem. Soc. 1996. P.
323-330.
27 Gomes M., Isorna P., Rojo M., Estrada P. Kinetic mechanism β-xylosidase from
Trichoferma reesei QM9414. J. Molecular Catalyst. 2001. V. 16. P. 7-15.
28 Kaji A., Sato M., Tsutsui Y. An a-Larabinofuranosidase produced by the wild-type
Streptomyces sp. no. 17-1. Agric. Biol. Chem. 1981. P. 925-931.
29 Poutanen K. An a-L-arabinofuranosidase of Trichoderrna reesei. J. Biotechnol. 1988. P.
271- 282.
30 Beldman G., Schols H.Arabinans and arabinan degrading enzymes. Ad. Macromol.
Carbohydr. Res. 1996.
31 Kroon P.A., Williamson G. Release of ferulic acid from sugar-beet pulp by using
arabinase, arabinofuranosidase and an esterase from Aspergillus niger. Biotechnol.
Appl. Biochem. 1996. V. 23. P. 263-267.
32 Luonteri E., Kroon P.A., Tenkanen M., Teleman A., Williamson G. Activity of an
Aspergillus terreus a-arabinofuranosidase on phenolic-subtituted oligosaccharides. J.
Biotechnol. 1999. V. 67. P. 41-48.
33 Khandke K.M., Vithayathil P.J., Murthy S.K. Purification and characterization of an a-
D-glucuronidase from a thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus. Arch. Biochem.
Biophys. 1989. P. 511-517.
34 Puls J., Schmidt O., Granzow C. a-Glucuronidases in two microbial xylanolytic
systems. Enzyme Microb. Technol. 1997. P. 83-88.
35 Biely P., Mackenzie C.R., Pul J. Cooperativity of esterases and xylanases in the
enzymatic degradation of acetyl xylan. BioiTechnology. 1986. P. 731-733.
36 Biely P., Mackenzie C.R., Schneider H. Production of acetyl xylan esterase by
Ttichoderma reesei and Schizophyllum commune. Can. J. Microbiol. 1988. P. 767-772.
37 Lee S. F., Forsberg C. W. Isolation and some properties of a P-D-xylosidase from
Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Appl. Environ. Microbiol. 1987. P. 65 1-654.
38 Mackenzie C.R., Bilous D. Ferulic acid esterase activity from Schizophyllum commune.
Appl. Environ. Microbiol. 1988. P. 1170-1173.
39 Bomeman W. S., Ljungdahl L. G., Hartley R. D., Akin D. E. Feruloyl and p-coumaroyl
esterases from the anaerobic fungus Neocallimastix strain MC-2: properties and
functions in plant cell wall degradation. Hemicclluloses and Hemicellulases. 1993. P.
85-102.
40 Henrissat B., Bairoch A. New families in classification of glycosyl hydrolases based on
amino acid secuence similarities. J. Biochem. 1993. P. 781-788.
41 Li K., Azadi P., Collins R., Tolan J., Kim J.S., Eriksson. Relationships between
activities of xylanases and xylan structures. Enzyme Microb Technol. V. 27. 2000. P.
89–94.
42 Sunna A., Antranikian G. Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria. Crit Rev
43 Polizeli M.L.T.M., Rizzatti A.C.S., Monti R., Terenzi H.F., Jorge, J.A. Xylanases from
Biotechnol. V. 17. 1997. P. 39–67.
fungi: properties and industrial applications. Applied Microbiology and Biotechnology.
V. 67. 2005. P. 577–591.
44 Rye C.S., Withers S.G. Glycosidase mechanism. Curr. Opin. Chem. Biol. V. 4. 2000. P.
463-580.
45 McCarter J.D., Withers S.G. Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis. Curr.
Opin. Struct. Biol. V. 4. 1994. P. 885-892.
46 Charnock S.J., Spurway T.D., Xie H., Beylot M-H., Virden R., Antony R., Warren J.,
Hazlewood G.P., Gilbert H.J. The topology of the substrate binding clefts of glycosyl
hydrolase family 10 xylanases are not conserved. J. Biol. Chem. 1998. V. 273 (48). P.
32187-32199.
47 Pell G., Taylor E.J., Gloster T.M., Turkenburg J.P., Fontes C.M.G.A., Ferreira L.M.A.,
Nagy T., Clark S.J., Davies G.J., Gilbert H.J. The mechanisms by which family 10
glycoside hydrolases bind decorated substrates. J. Biol. Chem. V. 279 (10). 2004. P.
9597-9605.
48 Biely P. Diversity of microbial endo-b-1,4-xylanases. Applications of Enzymes to
Lignocellulosics. 2003. P. 361–380.
49 Biely P., Vrsanska M., Tenkanen M., Kluepfel D. Endo-beta-1,4-xylanase families:
differences in catalytic properties. J. Biotechnol. V. 57. 1997. P. 151–166.
50 Hu J., Saddler J.N. Why do GH10 xylanase have better performance than GH11
xylanase for the deconstruction of preteated biomass. Biomass and Bioenergy. 2018. P.
13-16.
51 Biely P., Vrsanska M., Kremnicky L., Tenkanen M. Stereochemistry of the hydrolysis
of glycosidic linkage by endo-1,4-b-xylanases of Trichoderma reesei. FEBS Lett. V.
356. 1994. P. 137-140.
52 Schmidt A., Schlancher A., Steiner W., Schwab H., Kratky C. Xylanase from
Penicillium simplicissimum and its complexes with xylooligomers. Protein Sci. 1998.
V. 7. P. 2081-2088.
53 Schmidt A., Gübitz G., Kratky C. Xylan binding subsite mapping in the xylanase from
Penicillium simplicissimum using xylooligosaccharides as cryo-protectant.
54 Natesh R., Bhanumoorthy P., Vithayathil P. J., Sekar K., Ramakumar S., Viswamitra
Biochemistry. 1999. V. 38. P. 2403-2412.
M. A. Crystal Structure at 1.8 AE Resolution and Proposed Amino Acid Sequence of a
Thermostable Xylanase from Thermoascus aurantiacus. J. Mol. Biol. 1999. P.999-1012.
55 Natesh R., Manikandan K., Bhanumoorthy P., Viswamitra M.A., Ramakumara S.
Thermostable xylanase from Thermoascus aurantiacus at ultrahigh resolution (0,89 Å)
at 100 K and atomic resolution (1,11 Å) at 293 K refined anisotropically to small-
molecule accuracy. Acta Cryst. 2003. V. 59. 105-117.
56 Leggio L.L., Kalogiannis S., Eckert K., Teixeir S.C.M., Bhat M.K., Andrei C.,
Pickersgill R.W., Larsen S. Substrate specificity and subsite mobility in Thermoascus
aurantiacus xylanase 10A. FEBS Lett. V. 509. 2001. P. 303-308.
57 Ntarima P., Nerinck W., Klarskov K., Devreese B., Bhat M.K., van Beeumen J.,
Claeyssens M. Epoxyalkyl glycosides of D-xylose and xylo-oligosaccharides are active-
site markers of xylanases from glycoside hydrolase family 11, not from family 10.
Biochem. J. V. 347. 2000., P. 865-873.
58 Tahir T., Berrin J-G., Flatman R., Roussel A., Roepstorff P., Williamson G., Juge N.
Specific characterization of substrate and inhibitor binding sites of a glycosyl hydrolase
family 11 xylanase from Aspergillus niger. J. Biol. Chem.. V. 277 (46). 2002. P. 44035-
44043.
59 Szendefy J, Szakacs G and Christopher L (2006) Potential of solidstate fermentation
enzymes of Aspergillus oryzae in biobleaching of paper pulp. Enzyme Microb. Technol.
39, 1354-1360.
60 Souza M., Carvalho M.C. Two β-xylanases from Aspergillus terreus: Characterization
and influence of phenolic compounds on xylanase activity. Fungal Genetics and
Biology. 2013. V. 60. P. 46-52.
61 Salles B.C., Cunha R.B., Fontes W., Sousa M., Filho E.X. Purification and
characterization of a new xylanase from Acrophialophora nainiana. Journal of
Biotechnology. 2000. V. 81(2–3). P. 199-204.
62 Gubitz G. Purification and characterization of a new low molecular weight
endoxylanase from Penicillium capsulatum. Enzyme and Microbial Technology.
63 Liao H. A new acidophilic endo-β-1,4-xylanase from Penicillium oxalicum: cloning,
2003.V. 33. P. 775–785.
purification, and insights into the influence of metal ions on xylanase activity. Journal
of Industrial Microbiology & Biotechnology. V.41(7). 2014. P. 1071–1083.
64 Basit A., Liu J., Miao T., Zheng F., Rahim K., Jiang W. Characterization of two endo-
β-1,4-xylanases from Myceliophthora thermophila and their saccharification
efficiencies, synergistic with commercial cellulase. Microbiotechnology, ecotoxicology
and bioremediation. 2018.
65 Sharma M. Puriﬁcation and characterization of two thermostable xylanases
from Malbranchea ﬂava active under alkaline conditions. Bioresource
Technology. 2010. P. 8834-8842.
66 Ziaie-Shirkolaee Y., Talebizadeh A., Soltanali S. Comparative study on application of
T. lanuginosus SSBP xylanase and commercial xylanase on biobleaching of non wood
pulps. Biores.Technol. 2088. V. 99. P. 7433–7437.
67 Bibi Z., Ansari A., Rahmat R.R., Aman A. Production of xylan degrading endo-1,4-b-
xylanase from thermophilic Geobacillus stearothermophilus KIBGE-IB29. 2008. J.
Rad. Res. App. Sci. V. 7. P. 478-485.
68 Brecca J., Sineriz F., Baigori M. Purification and characterization of a thermostable
xylanase from Bacillus amyloliquefaciens. 1998. Enzyme and Microbial Technology. V.
22. P. 42-49.
69 Mahilrajan S. Purification of xylanase from Bacillus Pumilus and its characterization.
Pure Science. 2014. P. 357-361.
70 Hurlbert J.C., Preston J.F. Functional characterization of a novel xylanase from corn
strain of Erwinia chrysanthemi. J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 2093-2100.
71 Kumar M., Joshi A., Kashyapa R. and Khanna S. Production of xylanase by
Promicromonospora sp MARS with rice straw under non sterile conditions. Process
Biochem. 2011. V. 46. 1614-1618.
72 Petegem F., Collins T., Meuwis M.A., Gerday C., Feller G., van Beeumen J.
Crystallization and preliminary X-ray analysis of a xylanase from psychrophile
Pseudoalteromonas haloplanktis. Acta Crystallogr. D: Biol. Crystallogr. 2002. V. 58.
P. 1494-1496.
73 Garcia-Olmedo F., Salcedo G., Sanchez-Monge R., Gomez L., Royo J., Carbonero P.,
Plant proteinaceous inhibitors of proteinases and α-amylases. Oxford Surveys of Plant
Molecular and Cell Biology. 1987. P. 275–334.
74 MacGregor A.W., Macri L.J., Schroeder S.W., Bazin S.L. Purification and
characterization of limit dextrinase inhibitors from barley. Journal of Cereal Sciense.
1994. P. 33-41.
75 Debyser W., Derdelinck G., Delcour J.A. Arabinoxylan solubilisation and inhibition of
the barley malt xylanolytic system by wheat during brewing with wheat whole meal
adjunct: evidence for a new class of enzyme inhibitors. J. Amer. Soc. Brew. Chem. V.
55. 1997. P. 153–156.
76 Bellincampi D., Camardella L., Delcour J.A., Desseaux V., D‘Ovidio R., Durand A.,
Elliot G., Gebruers K., Giovane A., Juge N., Frisbaek J., S?rensen J.F., Svensson B.,
Vairo D. Potential physiological role of plant glycosidase inhibitors. Biochim. Biophys.
Acta. V. 1696. 2004. P. 265– 274.
77 Debyser, W. Arabinoxylan solubilisation during the production of Belgian white beer
and a novel class of wheat proteins that inhibitendoxylanases. 1999.
PhD dissertation Katholieke Universiteit Leuven, Leuven, Belgium.
78 Gebruers K., Dornez E., Bed? Z., Rakszegi M., Courtin C., Delcour J. Variability in
xylanase and xylanase inhibition activities in different cereals in the healthgrain
diversity screen and contribution of environment and genotype to this variability in
common wheat. J. Agric. Food Chem. 2010. P. 9362-9371.
79 Gebruers K., Debyser W., Goesaert H., Proost P., van Damme J., Delcour J.A. Triticum
aestivum L. endoxylanase inhibitor (TAXI) consists of two inhibitors, TAXI I and
TAXI II, with different specificities. Biochem. J. V. 353. 2001. P. 239–244.
80 Gebruers K., Brijs K., Courtin C.M., Fierens K., Goesaert H., Rabijns A.,
Readschelders G., Robben J., Sansen S., S?rensen J.F., van Campenhout S., Delcour
J.A. Properties of TAXI-type endoxylanase inhibitors. Biochim. Biophys. Acta. V. 1696
(2). 2004. P. 213-221.
81 Goesaert H., Elliott G., Kroon P.A., Gebruers K.,Courtin C.M., Robben J., Delcour
J.A., Juge N. Occurrence of proteinaceous endoxylanase inhibitors in cereals. Biochim.
82 Sansen S., De Ranter C.J., Gebruers K., Brijs K., Courtin C.M., Delcour J.A., Rabijns
Biophys. Acta. 2004. V. 1696. P. 193–202.
A. Structural Basis for Inhibition of Aspergillus niger Xylanase by Triticum aestivum
Xylanase Inhibitor-I. J. Biol. Chem.. 2004. V. 279. P. 36022–36028.
83 Sansen S., De Ranter C.J., Gebruers K., Brijs K., Courtin C.M., Delcour J.A., Rabijns
A. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of two complexes of a TAXI-
type xylanase inhibitor with glycoside hydrolase family 11 xylanases from Aspergillus
niger and Bacillus subtilis. Acta Crystallographica. Section D: Biological
Crystallography. 2004. V. 60. P. 555–557.
84 Гусаков А.В. Белковые ингибиторы микробных ксиланаз. БИОХИМИЯ. 2010. Т.
75. С. 1331 – 1347.
85 Fierens K., Gils A., Sansen S., Brijs K., Courtin C.M., Declerck P.J., De Ranter C.J.,
Gebruers K., Rabijns A., Robben J., Van Campenhout S., Volckaert G., Delcour J.A.
His374 of wheat endoxylanase inhibitor TAXI-I stabilizes complex formation with
glycoside hydrolase family 11 endoxylanases. FEBS J. 2005. V. 272. P. 5872–5882.
86 McLauchlan W.R., Garcia-Conesa M.T., Williamson G., Roza M., Ravestein P., Maat J.
A novel class of protein from wheat which inhibits xylanases. Biochem. J. V. 338. 1999.
P. 441– 446.
87 Flatman R., Mclauchlan W.R., Juge N., Furniss C., Berrin J-G., Hughes R.K.,
Manzanares P., Ladbury J.E., O‘Brien R., Williamson G. Interactions defining the
specificity between fungal xylanases and the xylanase-inhibiting protein XIP-I from
wheat. Biochem. J. V. 365. 2003. P. 773–781.
88 Berrin J.G., Juge N. Factors affecting xylanase functionality in the degradation of
arabinoxylans.Biotechnol. Lett. 2008. V. 30. P. 1139–1150.
89 Beliеn T., Van Campenhout S., Van Acker M., Volckaert G. Cloning and
characterization of two endoxylanases from the cereal phytopathogen Fusarium
graminearum and their inhibition profile against endoxylanase inhibitors from wheat.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 327. P. 407–414.
90 Beliеn T., Van Campenhout S., Van Acker M., Robben J., Courtin C.M., Delcour J.A.,
Volckaert G. Mutational analysis of endoxylanases XylA and XylB from the
phytopathogen Fusarium graminearum reveals comprehensive insights into their
inhibitor insensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P. 4602–4608.
91 Vardakou M., Dumon C., Murray J.W., Christakopoulos P., Weiner D.P., Juge N.,
Lewis R.J., Gilbert H.J., Flint J.E. .Understanding the structural basis for substrate and
inhibitor recognition in eukaryotic GH11 xylanases. J. Mol. Biol. 2008. V. 375. P.
1293–1305.
92 Furniss C.S.M.., Williamson G., Kroon P.A. The substrate specificity and susceptibility
to wheat inhibitor proteins of Penicillium funiculosum xylanases from a commercial
enzyme preparation. J. Sci. Food Agr. 2005. V. 85. P. 574–582. DOi: 10.1002/jsfa.1984
93 Gusakov A.V., Ustinov B.B. Assaying sensitivity of fungal xylanases to proteinaceous
inhibitors from a rye extract: Two GH10 family xylanases resistant to XIP-like
inhibitors. Ind. Biotechnol. 2009. V. 5. P. 104–109.
94 Payan F., Flatman R., Porciero S., Williamson G., Juge N., Roussel A. Structural
analysis of xylanase inhibitor protein I (XIP-I), a proteinaceous xylanase inhibitor from
wheat. Biochem. J. 2003. V. 372. P. 399–405.
95 Payan F., Leone P., Porciero S., Furniss C., Tahir T., Williamson G., Durand A.,
Manzanares P., Gilbert H.J., Juge N., Roussel A. The dual nature of the wheat xylanase
protein inhibitor XIP-I. J. Biological. Chem. V. 279 (34). 2004. P. 36029-36037.
96 Kumar D., Kumar S., Kumar J., Kumar O., Mishra S.V., Kumar R., Malyan S.
Xylanases and their industrial application: a review. Biochem. Cell. Arch. V. 17. 2017.
P. 353-360.
97 Beg Q.K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G.S. Microbial xylanases and their
industrial applications: a review. Appl Microbiol Biotechnol. V. 56. 2001 P. 326–338
98 Techapun C., Poosaran N., Watanabe M., Sasaki K. Thermostable and alkaline-tolerant
microbial cellulose-free xylanases produced from agricultural wastes and the properties
required for use in pulp bleaching bioprocesses: a review. Process Biochem. V. 38.
2003. P. 1327–1340.
99 Buchert J., Tenkanen M., Kantelinen A., Viikari L. Application of xylanases in the pulp
and paper industry. Bioresourse Technol. V. 50. 1994. P. 65-72.
100 Garg A.P., McCarthy A.J., Roberts J.C. Biobleaching effect of Streptomyces
thermoviolaceus xylanase preparations on birchwood kraft pulp. Enzyme and Microbial
Technology. V. 18. 1996. P. 261-267.
101 Paice M., Gurnagul N., Page D.H., Jurasek L. Mechanism of hemicellulose-direct
prebleaching of kraft pulps. Enz. Microbiol. Technol. V. 14. 1992. P. 272-276.
102 Buchert J., Ranua M., Kantelinen A., Viikari L. The role of two Trichoderma reesei
xylanases in the bleaching of pine kraft pulp. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 37. 1992.
P. 825-829.
103 Jeffries T.W. Conserved motifs in xylanases for pulp bleaching. IBCs 3rd annual
symposium on commercial enzymes. 1998. P. 212-218.
104 Godfrey T., West S. Industrial enzymology. Second edition. Macmillan Press. 1996. P.
69-382.
105 Bedford M.R. Exogenous enzymes in monogastric nutrition – their current value and
future benefits. Animal Feed Sci. Technol. V. 86. 2000. P. 1-13.
106 Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. М. ДеЛи принт. 2002.
C. 335.
107 Bedford M.R., Morgan A.J. The use of enzymes in poultry diets. World’s Poultry
Science Journal. V. 52. 1996. P. 61–68.
108 Cупрунов Д. Обогащение комбикормов ферментным комплексом для цыплят-
бройлеров. Комбикорма. T. 1. 2000. C. 47-48.
109 Choct M. Enzymes for the feed industry: past, present and future. World’s Poultry.
Science Journal. V. 62. 2006. P. 5–16.
110 McLauchlan W.R., Flatman R.H., Sancho A.I., Kakuta, J. Xylanase inhibitors from
cereals: implications for baking, brewing and plant technology. 2nd European
Symposium on Enzymes in Grain Processing. 1999. P. 55.
111 Ganga M.A., Pinaga F., Valles S., Ramón D., Querol A. Aroma improving in
microvinification processes by the use of a recombinant wine yeast strain expressing the
Aspergillus nidulans xlnA gene. Int. J. Food Microbiol. V. 47. 1999. P. 171–178
112 Screenath H.K., Jeffries T.W. Production of ethanol from wood hydrolysate by yeasts.
Bioresour Technol. V. 72. 2000. P. 253–260.
113 Parajo J.C., Domingues H., Domingues J.M. Biotechnological production of xylitol.
Part 1, interest of xylitol and fundamentals of its biosynthesis. Bioresour Technol. V.
65. 1998. P. 191–201.
114 Aditya B., Kenneth B., Nirmal U., Venkatesh B. Novel thermostable endo-xylanase
cloned and expressed from bacterium Geobacillus sp. WSUCF1. Bioresource
115 Ribeiro et al. A novel thermostable xylanase GH10 from Malbranchea pulchella
Technology. 2014. V. 165. P. 314–318.
expressed in Aspergillus nidulans with potential applications in biotechnology.
Biotechnology for Biofuels. 2014. V. 7. P. 115.
116 Gupta S.K., Srivastava S.K., Sharma A., Nalage V.H., Salvi D., Kushwaha H.
Metabolic engineering of CHO cells for the development of a robust protein production
platform. PLoS ONE. V. 12. e0181455. 2017.
117 Chang A., Scheer M., Grote A. BRENDA, AMENDA and FRENDA the enzyme
information system: New content and tools in 2009. Nucleic Acids Research. V. 37.
2009. P. 588–592.
118 Han N., Miao H., Ding J. Improving the thermostability of a fungal GH11 xylanase via
site-directed mutagenesis guided by sequence and structural analysis. Biotechnology for
Biofuels. V. 10. 2017. P. 133. https://doi.org/10.1186/s13068-017-0824-y.
119 Qian C., Liu N., Yan X., Wang Q., Zhou Z., Wang, Q. Engineering a high-performance,
metagenomic-derived novel xylanase with improved soluble protein yield and thermo-
stability. Enyzme and Microbial Technology. V. 70. 2015. P. 35–41.
120 Wahab A., Jonet M.A.B., Illias R.M. Thermostability enhancement of xylanase
Aspergillus fumigatus RT-1. Journal of Molecular Catalysis. V. 134. 2016. P. 154–163.
121 Acevedo J.P., Reetz M.T., Asenjo J.A., Parra L.P. One-step combined focused epPCR
and saturation mutagenesis for thermostability evolution of a new cold-active xylanase.
Enzyme and Microbial Technology. V. 100. 2017. P. 60–70.
122 Souza A.R., de Araújo G.C., Zanphorlin L.M., Ruller R., Franco F.C., Torres F.A.
Engineering increased thermostability in the GH-10 endo-1,4-β-xylanase from Ther-
moascus aurantiacus CBMAI 756. International Journal of Biological
Macromolecules. 2016. V. 93A. P. 20–26.
123 Ruller R., Alponti J., Deliberto L.A., Zanphorlin L.M., Machado C.B., Ward R.G.
Concommitant adaptation of a GH11 xylanase by directed evolution to create an alkali-
tolerant thermophilic enzyme. Protein Engineering, Design & Selection. 2014. V. 27(8).
P. 255–262.
124 Xie H.F., Flint J.E., Vardakou M., Lakey J.H., Lewis R.J., Gilbert H.J., Dumon C.
Probing the structural basis for the difference in thermostability displayed by family 10
125 Zhang H., Li J., Wang J., Yang Y., Wu M. Determinants for the improved
xylanase. Journal of Molecular Biology. 2006. P. 157-167.
thermostability of a mesophilic family 11 xylanase predicted by computational
methods. Biotechnology for Biofuels. 2014. V. 7(3). P. 1-10.
126 Basheer S.M., Chellappan S. Bioresources and bioprocess in biotechnology. Enzyme
engineering. Singapore: Springer. 2017. P. 151–168.
127 Pucci F., Rooman M. Physical and molecular bases of protein thermal stability and cold
adaptation. Current Opinion in Structural Biology. 2017. V. 42. P. 117–128.
128 Sammond D.W., Kastelowitz N., Himmel M.E., Yin H., Crowley M.F., Bomble Y.J.,
Comparing residue clusters from thermophilic and mesophilic enzymes reveals adaptive
mechanisms. PLoS One. 2016. DOi 11:e0145848.
129 Goldstein R.A. Amino-acid interactions in psychrophiles, mesophiles, thermophiles,
and hyperthermophiles: insights from the quasi-chemical approximation. Protein Sci.
2007. V. 16. P. 1887-1895.
130 Chen J., Lu Z., Sakon J., Stites W.E. Increasing the thermostability of staphylococcal
nuclease: implications for the origin of protein thermostability. J. Mol. Biol. 2000. V.
303. P. 125-130.
131 Oda K., Kinoshita M. Physicochemical origin of high correlation between thermal
stability of a protein and its packing efficiency: a theoretical study for staphylococcal
nuclease mutants. Biophys Physicobiol. 2015. V. 12. P. 1-12.
132 Dorra A. et al. Improvement of Trichoderma reesei xylanase II thermal stability by
serine to threonine surface mutations. International Journal of Biological
Macromolecules. 2015. V 72. P. 163–170.
133 Wang J., Tan Z., Wu M., Li J., Wu J. Improving the thermostability of a mesophilic
family 10 xylanase, AuXyn10A, from Aspergillus usamii by in silico design. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 2014. DOi 10.1007/s10295-014-1463-y.
134 Ge M., Xia X.Y., Pan X.M. Salt bridges in the hyperthermophilic protein Ssh10b are
resilient to temperature increases. J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 31690-31696.
135 Thomas A.S., Elcock A.H. Molecular simulations suggest protein salt bridges are
uniquely suited to life at high temperatures. J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 2208-
136 Bai W., Zhou C., Xue Y., Huang C.H., Guo R.T. Three-dimensional structure of an
2214.
alkaline xylanase Xyn11A-LC from alkalophilic Bacillus sp. SN5 and improvement of
its thermal performance by introducing arginines substitutions. Biotechnol. DOI
10.1007/s10529-014-1512-7.
137 Karshikoff A., Ladenstein R. Ion pairs and the thermotolerance of proteins from
hyperthermophiles: a ‗‗traffic rule‘‘ for hot roads. Trends Biochem Sci. 2001. V. 26. P.
550-556.
138 Xiao S., Patsalo V., Shan B., Bi Y., Green D.F. Raleigh D.P. Rational modification of
protein stability by targeting surface sites leads to complicated results. Proc. Natl. Acad.
Sci. 2013. V. 10. P. 11337-11342.
139 Pezzullo M., Del Vecchio P., Mandrich L., Nucci R., Rossi M., Manco G.
Comprehensive analysis of surface charged residues involved in thermal stability in
Alicyclobacillus acidocaldarius esterase 2. Protein Eng. Des Sel. 2013. V. 26. P. 47-58.
140 Gribenko A.V., Patel M.M., Liu J., McCallum S.A., Wang C., Makhatadze G.I.
Rational stabilization of enzymes by computational redesign of surface charge-charge
interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. 2009. V. 106. P. 2601-2606.
141 Yip K.S. The structure of Pyrococcus furiosus glutamate dehydrogenase reveals a key
role for ion-pair networks in maintaining enzyme stability at extreme temperatures.
Structure. 1995. V. 3. P. 1147-1158.
142 Jonsdottir L.B. The role of salt bridges on the temperature adaptation of aqualysin I, a
thermostable subtilisin-like proteinase. Biochim. Biophys. Acta. 2014. P. 2174-2181.
143 Irfan M., Gonzalezb C.F., Razaa S., Rafiqa M., Hasana F., Khana S., Shah A.
Improvement in thermostability of xylanase from Geobacillus thermodenitrificans C5
by site directed mutagenesis. Enzyme and Microbial Technology. 2018. V. 111. P. 38–
47.
144 Lanzarotti E., Biekofsky R.R., Estrin D.A., Marti M.A., Turjanski A.G. Aromatic-
aromatic interactions in proteins: beyond the dimer. J. Chem. Inf. Model. 2011. V. 51.
P. 1623-1633.
145 Madhusudan M.K., Mahalakshmi R. Implications of aromatic–aromatic interactions:
146 Mahanta P., Bhardwaj A., Reddy V.S., Ramakumar S. Role of long-range aromatic
from protein structures to peptide models. Protein Sci.2015. V. 24. P. 1920-1933.
clique and community in protein stability. BioRvix. 2018.
147 Gromiha M.M., Thomas S., Santhosh C. Role of cation–p interactions to the stability of
thermophilic proteins. Prep. Biochem. Biotechnol. 2002. V. 32. P. 355-362.
148 Folch B., Dehouck Y., Rooman M. Thermo- and mesostabilizing protein interactions
identified by temperature-dependent statistical potentials. Biophys. J. 2010. V. 98. P.
667-677.
149 Prajapati R.S., Sirajuddin M., Durani V., Sreeramulu S., Varadarajan R. Contribution of
cation–p interactions to protein stability. Biochemistry. 2006. V. 45. P. 15000-15010.
150 Tang M.A., Motoshima H., Watanabe K. Cold adaptation: structural and functional
characterizations of psychrophilic and mesophilic acetate kinase. Protein J. 2014. V. 33.
P. 313-322.
151 Pecher P., Arnold U. The effect of additional disulfide bonds on the stability and
folding of ribonuclease A. Biophys. Chem. 2009. V. 141. P. 21-28.
152 Bagarolo M.L., Porcelli M., Martino E., Feller G., Cacciapuoti G. Multiple disulfide
bridges modulate conformational stability and flexibility in hyperthermophilic archaeal
purine nucleoside phosphorylase. Biochim. Biophys. Acta. 2015. P. 1458-1465.
153 Jo B.H., Park T.Y., Park H.J., Yeon Y.J., Yoo Y.J., Cha H.J. Engineering de novo
disulfide bond in Bagarolo bacterial a-type carbonic anhydrase for thermostable carbon
sequestration. Sci Rep. 2016. V. 6. P. 29322.
154 Niu C., Zhu L., Xu X., Li Q. Rational design of disulfide bonds increases
thermostability of a mesophilic 1,3-1,4-b-glucanase from Bacillus terquilensis. PLOS
ONE. 2016. DOi 11:e0154036.
155 Dick M., Weiergraber O.H., Classen T., Bisterfeld C., Bramski J., Gohlke H.,
Pietruszka J. Trading off stability against activity in extremophilic aldolases. Sci. Rep.
2016. Doi 6:17908.
156 Siddiqui K.S., Poljak A., Guilhaus M., Feller G., D‘Amico S., Gerday C., Cavicchioli
R. Role of disulfide bridges in the activity and stability of cold-active alpha amilase. J.
Bacteriol. 2005. V. 187. P. 6206-6212.
157 Ogawa K. Roles of a short connecting disulfide bond in the stability and function of
psychrophilic Shewanella violacea cytochrome c (5). Extremophiles. 2007. V. 11. P.
158 Feng T., Daiwen C., Bing Y., Yuheng L., Ping Z., Xiangbing M., Jie Y., Jun H.
797-807.
Improving the thermostability of Trichoderma reesei xylanase 2 by introducing
disulfide bonds. Electronic Journal of Biotechnology. 2017. V. 26. P. 52–59.
159 Turunen O., Etuaho K., Fenel F., Vehmaanperä J., Wu X., Rouvinen J., Leisola M. A
combination of weakly stabilizing mutations with a disulfide bridge in the alpha-helix
region of Trichoderma reesei endo-1,4-beta-xylanase II increases the thermal stability
through synergism. J. Biotechnol. 2001. V. 88(1). P. 37-46.
160 Die H., Jianfang L., Qin W., Jia Z., Jianqing C., Minchen W. Improved Temperature
Characteristics of an Aspergillus oryzae GHF11 Xylanase, by In Silico Design and Site-
directed Mutagenesis. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2016. V. 21. P. 704-
711. DOi 10.1007/s12257-016-0339-6.
161 Gruber K., G. Kintschar M., Hayn A., Schlacher W., C. Kratky. Thermophilic xylanase
from Thermomyces lanuginosus: High-resolution X-ray structure and modeling studies.
Biochem. 1998. V. 37. P. 13475-13485.
162 Gao S.J., Wang J.Q., Wu M.C., Zhang H.M., Yin X., Li J.F. Engineering hyper-
thermostability into a mesophilic family 11 xylanase from Aspergillus oryzae by in
silico design of N-terminus substitution. Biotechnol. Bioeng. 2013. V. 110. P. 1028–
1038.
163 Cheng Y.S., Chen C.C., Huang C.H., Ko T.P., Luo W.H., Huang J.W., Liu J.R., Guo
R.T. Structural analysis of a glycoside hydrolase family 11 xylanase from
Neocallimastix patriciarum. J. Biol. Chem. 2014. V. 289. P. 11020–11028.
164 Hu H., Chen K., Li L., Long L., Ding S. Characterization of the wild-type and truncated
forms of a neutral GH10 xylanase from Coprinus cinereus: roles of C-terminal basic
amino acid-rich extension in its SDS resistance, thermostability and activity. J.
Microbiol. Biotechnol. 2017. P.775-784. DOi 10.4014/jmb.1609.09011
165 Rafaela Z.V., Tiago A.M.cImpact of the removal of N-terminal non-structured amino
acids onactivity and stability of xylanases from Orpinomyces sp. PC-2. International
Journal of Biological Macromolecules. 2017. DOi 10.1016/j.ijbiomac.
166 Siddiqui K.S. Defying the activity-stability trade in enzymes: taking advantage of
entropy to enhance activity and thermostability. Crit. Rev. Biotechnol. 2016. V. 3. P. 1-
167 Karshiko A., Nilsson L., Ladenstein R. Rigidity versus flexibility: the dilemma of
14.
understanding protein thermal stability. FEBS J. 2015. V. 282. P. 3899-3917.
168 Chiuri R. Exploring local exibility/rigidity in psychrophilic and mesophilic carbonic
anhydrases. Biophys J. 2009. V. 96. P. 1586-1596.
169 Isaksen G.V., Aqvist J., Brandsdala B.O. Enzyme surface rigidity tunes the temperature
dependence of catalytic rates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016. V. 113. P. 7822-7827.
170 Wenhan Y., Yongzhi Y., Lingdi Z., Hang X., Xiaojing G., Xu Y., Bing D., Yunhe C.
Improved thermostability of an acidic xylanase from Aspergillus sulphureus by
combined disulphide bridge introduction and proline residue substitution. Scientific
Reports. 2017. V. 7. P. 1587. DOi:10.1038/s41598-017-01758-5.
171 Dagan S., Hagai T., Gavrilov Y., Kapon R., Levy Y., Reich Z. Stabilization of a protein
conferred by an increase in folded state entropy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V.
110. P. 10628-10633.
172 Gavrilov Y., Dagan S., Levy Y. Shortening a loop can increase protein native state
entropy. Proteins. 2015. V. 83. P. 2137-2146.
173 Boone C.D., Rasi V., Tu C., McKenna R. Structural and catalytic effects of proline
substitution and surface loop deletion in the extended active site of human carbonic
anhydrase II. FEBS J. 2015. V. 282. P. 1445-1457.
174 Feng X., Tang H., Han B., Zhang L., Lv B., Li C. Engineering the thermostability of -
glucuronidase from Penicillium purpurogenum Li-3 by loop transplant. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 2016.
175 Kovacic F., Mandrysch A., Poojari C., Strodel B., Jaeger K.E. Structural features
determining thermal adaptation of esterases. Protein Eng. Des Sel. 2016. V. 29. P. 65-
76.
176 Bellissent-Funel M.C. Water determines the structure and dynamics of proteins. Chem.
Rev. 2016. V. 116. P. 7673-7697.
177 Glass D.C., Krishnan M., Nutt D.R., Smith J.C. Temperature dependence of protein
dynamics simulated with three different water models. Journal of Chemical Theory and
computation. V. 6(4). P. 1390-1400. DOi:10.1021
178 Sterpone F., Bertonati C., Briganti G., Melchionna S. Water around thermophilic
proteins: the role of charged and apolar atoms. J. Phys. Condens. Matter. 2010. V 22. P.
284113.
179 Mou Z., Ding Y., Wang X., Cai Y. Comparison of protein-water interactions in
psychrophilic, mesophilic, and thermophilic Fe-SOD. Protein Pept. Lett. 2014. V. 21. P.
578-583.
180 Paredes D.I., Watters K., Pitman D.J. Comparative void-volume analysis of
psychrophilic and mesophilic enzymes: Structural bioinformatics of psychrophilic
enzymes reveals sources of core flexibility. BMC Struct. Biol. 2011. V. 11. P. 42.
181 Aissaoui N., Landoulsi J., Bergaoui L. Catalytic activity and thermostability of enzymes
immobilized on silanized surface: In uence of the crosslinking agent. Enyzme and
Microbial Technology. 2013. V. 52. P. 336-343.
182 Mateo C., Palomo J. M., Fernandez-Lorente G. Improvement of enzyme activity, sta
bility and selectivity via immobilization techniques. Enyzme and Microbial Technology.
2007. V. 40. P. 1451-1463.
183 Brady D., Jordaan J. Advances in enzyme immobilisation. Biotechnology Letters. 2009.
V. 31. P. 1639–1650.
184 Chiyanzu I., Cowan D.A., Burton S.G. Immobilization of Geobacillus pallidus RAPc8
nitrile hydratase (NHase) reduces substrate inhibition and enhances thermostability.
Journal of Molecular Catalysis. B, Enzymatic. 2010. V. 63. P. 109–115.
185 Tang C., Saquing C.D., Sarin P.K. Nano brous membranes for single-step
immobilization of hyperthermophilic enzymes. Journal of Membrane Science. 2014. V.
472. P. 251–260.
186 Cakmak U., Ertunga N.S. Gene cloning, expression, immobilization and
characterization of endo-xylanase from Geobacillus sp. TF16 and investigation of its
industrial applications. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2017. https://doi.
org/10.1016/j.molcatb.2017.01.016.
187 Heinen P. R., Pereira M.G., Rechia C.G.V. Immobilized endo-xylanase of Aspergillus
tamarii Kita: An interesting biological tool for production of xylooligosaccharides at
high temperatures. Process Biochemistry. 2010. V. 53. P. 145–152.
188 Jampala P., Preethi M., Ramanujam S. Immobilization of levan-xylanase nanohybrid on
an alginate bead improves xylanase stability at wide pH and temperature. International
189 Kumar S., Haq I., Prakash J. Improved enzyme properties upon glutaraldehyde cross-
Journal of Biological Macromolecules. 2017. V. 95. P. 843–849.
linking of alginate entrapped xylanase from Bacillus licheniformis. International
Journal of Biological Macromolecules. 2017. V. 98. P. 24–33.
190 Chen M., Zeng G., Xu P. How do enzymes ―Meet‖ nanoparticles and nanomaterials?
Trends in biochemical sciences. 2017. V. 42(11). P. 914–930.
191 Liu M., Dai X., Guan R.. Immobilization of Aspergillus niger xylanase A on Fe3O4-
coated chitosan magnetic nanoparticles for xylooligosaccharide preparation. Catalysis
Communications. 2014. V. 55. P. 6–10.
192 Fukura K., So Y., Young J.. Jeong C. Enhancing the activity of Bacillus circulans
xylanase by modulating the flexibility of the hinge region. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.
2014. DOi 10.1007/s10295-014-1454-z.
193 Qin L., Baoguo S., Ke X., Chao T., Youqiang X., Liangjun L.,Xiuting L. Improving
special hydrolysis characterization into Talaromycesthermophilus F1208 xylanase by
engineering of N-terminal extensionand site-directed mutagenesis in C-terminal.
International Journal of Biological Macromolecules. 2017. V. 96. P. 451–458.
194 Xiuyun W., Zhennan T., Xukai J., Qun Z., Lushan W. Enhancement in catalytic activity
of Aspergillus niger XynB by selective site-directed mutagenesis of active site amino
acids. Appl Microbiol Biotechnol. 2017. https://doi.org/10.1007/s00253-017-8607-8.
195 Tahir T.A., Durand A., Gebruers K., Roussel A.,Williamson G., Juge N. Functional
importance of Asp37 from a family 11 xylanase in the binding to two proteinaceous
xylanase inhibitors from wheat. FEMS Microbiol. Lett. 2004. V. 239. P. 9–15.
196 Bourgois T.M., Nguyen D.V., Sansen S., Rombouts S., Beliеn T., Fierens K.,
Raedschelders G., Rabijns A., Courtin C.M., Delcour J.A., Van Campenhout S.,
Volckaert G. Targeted molecular engineering of a family 11 endoxylanase to decrease
its sensitivity towards Triticum aestivum endoxylanase inhibitor types. J. Biotechnol.
2007. V. 130. P. 95–105.
197 Aslanidis C., de Jong P.J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).
Nucleic Acids Research. 1990. V. 18. P. 6069–6074.
198 Sambrook J., Russell D. Molecular cloning, a laboratory manual . Cold Spring Harbor
Laboratory. 2001.
199 Sanger F., Nicklen S., Chase A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.
Proc. Nat. Acad. of Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463–5467.
200 Aleksenko A., Makarova N., Nikolaev .I, Clutterbuck A. Integrative and replicative
transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene.
Current Genetics. 1995. V. 28. P. 474-478.
201 Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. Москва: Мир.
544 с.
202 Somogyi M. A new reagent for the determination of sugars . Journal of Biological
Chemistry. 1952. V. 195. P. 19-23.
203 Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биокнверсия лигноцеллюлозных
материалов. Учебн.пособие. Москва: Изд-во МГУ. 1995. 224с.
204 Privalov P.L., Potekhin S.A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-
induced changes in proteins. Methods Enzymol. 1986. V. 131. P. 4-5.
205 Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка. Курс лекций. Москва: Книжный
Дом Университет. 2002. C. 376.
206 Vieille C., Zeikus G.J. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular
mechanisms for thermostability. Microbiol Mol Biol Rev. 2001. V. 65(1). P. 1-43.
207 Ooi T., Oobatake M., Nemethy G. Accessible surface areas as a measure of the
thermodynamic parameters of hydration of peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987.
V. 84. P. 3086.
208 Vila J., Williams R.L., Velasquez M. Empirical solvation models can be used to
differentiate native from near-native conformations of dovine hancreatic trypsin
nhibitor. Proteins. 1991. V. 10. P. 199.
209 Wesson L., Eisenberg D. Atomic solvation parameters applied to molecular dynamics
of proteins in solution. Protein Science. 1992. V. 1. P. 227.
210 Zheng F., Huang J., Hu H. N- and C-terminal truncations of a GH10 xylanase
significantly increase activity and thermostability but decrease SDS resistance. Appl.
211 Song L., Tsang A., Sylvestre M. Engineering a thermostable fungal GH10 xylanase,
Microbiol.Biotechnol. 2016. V. 100. P. 3555-3565.
importance of N-terminal amimo acids. Biotech. & Bioengin. 2015. DOi
10.1002/bit.25533.

Disser DenisenkoYA

Загружено:

Сведения о документе

Авторское право

Доступные форматы

Поделиться этим документом

Поделиться или встроить документ

Параметры публикации

Этот документ был вам полезен?

Это неприемлемый материал?

Авторское право:

Доступные форматы

Disser DenisenkoYA

Загружено:

Авторское право:

Доступные форматы

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ

ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР «ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ

Денисенко Юрий Андреевич

БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ГРИБНЫХ КСИЛАНАЗ 10-Й СЕМЬИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................................ - 6 -

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................... - 12 -

ГЛАВА 1. СТРОЕНИЕ И СОСТАВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ РАСТЕНИЙ.................. - 12 -

1.1. КЛЕТОЧНАЯ СТЕНКА ............................................................................................... - 12 -

1.2. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ................................................ - 13 -

1.3. ПОЛИСАХАРИДЫ МАТРИКСА ............................................................................... - 15 -

ГЛАВА 2. КСИЛАНОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ И БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ

2.1. КСИЛАНОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ФЕРМЕНТОВ ............................................ - 19 -

2.3. МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА ........................................................................................... - 23 -

2.4. КСИЛАНАЗЫ 10-Й И 11-Й СЕМЬИ ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ ............................... - 24 -

2.5. БИОХИМИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КСИЛАНАЗ .... - 27 -

2.6. БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ КСИЛАНАЗ ИЗ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР ................ - 28 -

2.6.1. TAXI-ТИП БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ КСИЛАНАЗ ...................................... - 29 -

2.6.2. XIP-ПОДОБНЫЕ БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ КСИЛАНАЗ.............................. - 32 -

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КСИЛАНАЗ............ - 35 -

3.1. КСИЛАНАЗЫ В ЦЕЛЛЮЛОЗНО-БУМАЖНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ ........... - 35 -

3.2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КСИЛАНАЗ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА КОРМОВЫХ

3.3. ДРУГИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ПРИМЕНЕНИЯ КСИЛАНАЗ .. - 37 -

4.1. БИОИНЖЕНЕРИЯ ФЕРМЕНТОВ .............................................................................. - 40 -

4.2. ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И СТРУКТУРНЫЕ

4.2.1. ГИДРОФОБНЫЕ ЭФФЕКТЫ .................................................................................. - 44 -

4.2.2. СОЛЕВЫЕ МОСТИКИ И ИОННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ............................... - 45 -

4.2.3. Π–Π ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ...................................................................................... - 47 -

4.2.4. КАТИОННО–Π ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ................................................................... - 47 -

4.2.5. ДИСУЛЬФИДНЫЕ МОСТИКИ ............................................................................... - 48 -

4.2.6. ТЕРМИНАЛЬНЫЕ N- И C- УЧАСТКИ ФЕРМЕНТОВ ........................................ - 49 -

4.2.7. ЖЕСТКОСТЬ И ГИБКОСТЬ .................................................................................... - 51 -

4.2.8. ПЕТЛИ ........................................................................................................................ - 52 -

4.2.9. ГИДРАТАЦИЯ ПОВЕРХНОСТИ ............................................................................ - 53 -

4.3. ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ .......................................................................... - 53 -

4.4. НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТОВ ................ - 54 -

4.5. УЛУЧШЕНИЕ ДРУГИХ ОПЕРАЦИОННЫХ ПАРАМЕТРОВ КСИЛАНАЗ ........ - 55 -

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .......................................................................... - 58 -

ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ. ....................................... - 58 -

5.1. МАТЕРИАЛЫ. .............................................................................................................. - 58 -

5.1.1. ФЕРМЕНТЫ. .............................................................................................................. - 58 -

5.1.2. ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ (ФП) ...................................................................... - 58 -

5.1.3. МИКРООРГАНИЗМЫ .............................................................................................. - 58 -

5.1.5. РЕАКТИВЫ ................................................................................................................ - 59 -

5.2. МЕТОДЫ ....................................................................................................................... - 60 -

5.2.1. ВЫРАВНИВАНИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ...... - 60 -

5.2.2. АМПЛИФИКАЦИЯ ЦЕЛЕВЫХ ГЕНОВ XYLA, XYLE И XYL3 ............................ - 60 -

5.2.3. АМПЛИФИКАЦИЯ ГЕНОВ С ТОЧЕЧНЫМИ МУТАЦИЯМИ .......................... - 64 -

5.2.4. ТРАНСФОРМАЦИЯ ШТАММА-РЕЦИПИЕНТА P. VERRUCULOSUM B1-537- 65 -

5.2.5. ТРАНСФОРМАЦИЯ ШТАММА-РЕЦИПИЕНТА P. CANESCENS RN3-11-7 .... - 65 -

5.2.6. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ В КОЛБАХ......... - 65 -

5.2.7. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ ........................................................... - 66 -

5.2.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА ........................................................ - 66 -

5.2.9. ПРОВЕДЕНИЕ DS-NA-ПААГ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА .............................................. - 67 -

5.2.10. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ..................................................... - 67 -

5.2.11. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ................................................ - 67 -

5.2.12. ИЗУЧЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРНОЙ СТАБИЛЬНОСТИ ......................................... - 68 -

5.2.13. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРНОГО И РН-ОПТИМУМОВ АКТИВНОСТИ

5.2.14. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ ИЗ ЭКСТРАКТА РЖИ

ГЛАВА 6. ВЫБОР ПРОВОДИМЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН ........................ - 70 -

6.1. ОБЩАЯ СТРАТЕГИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ.................................... - 70 -

6.2. АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЗАМЕНЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА УВЕЛИЧЕНИЕ

6.2.2. XYLE ........................................................................................................................... - 77 -

6.2.3. XYL3 ........................................................................................................................... - 79 -

6.3. АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЗАМЕНЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА ПРИДАНИЕ