RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

DISSENY EXPERIMENTAL

Tal i com us demana el grup de Recerca d’Oncologia Molecular de l’Hospital de la Vall d’Hebron, cal
que avalueu l’anti-tumorigènesi de la Coti-2. Amb aquesta finalitat, cal que feu el disseny experimental
de l’assaig preclínic que dureu a terme per avaluar l’efectivitat i la toxicitat d’aquest fàrmac.
Així doncs, cal que definiu l’objectiu de la vostra recerca, identifiqueu i justifiqueu) les tècniques que
dureu a terme, i anomeneu els materials (cèl·lules i altres) que necessitareu.
Abans, però, cal que llegiu els 3 articles (carpeta moodle fase 4) per tenir com a referència un disseny
experimental del tipus com us demana el grup de la Vall d’Hebron. Cal, doncs, que identifiqueu quines
tècniques o assajos s’utilitzen per tal d’avaluar l’anti-tumorigènesi d’una determinada molècula.

INDIVIDUALMENT
Llegiu els 3 articles detingudament i ompliu les taules següents:

Article 1

Therapeutic effects of the euglenoid ichthyotoxin, euglenophycin, in colon cancer

April B. Cabang, Keya De Mukhopadhyay, Sarah Meyers, Jay

Autors/es Morris, Paul V.
Zimba and Michael J. Wargovich

Any 2017

URL https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5732811/

Objectiu de la recerca

L’objectiu d’aquesta recerca és investigar els efectes d’una alga com supressor de cèl·lules
cancerígenes del càncer de còlon.

Línies cel·lulars estudiades

HCT116, HT29, SW620 CRC i CRL:Nu(NCr)Foxn1nu athymic nude mouse CRC xenograft
models.

1
 RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

Tècniques utilitzades

Nom tècnica En què consisteix aquesta tècnica? (descripció completa)

Assaig autofàgia L'autofàgia és un procés de degradació intracel·lular que està

implicat en moltes condicions fisiològiques i patològiques. Quan
s'indueix l'autofàgia, es forma una membrana d'aïllament que conté
part del citoplasma i forma una vesícula de doble membrana
(autofagosoma). La membrana exterior de l'autofagosoma es
fusiona amb un lisosoma per formar l'autolisosoma, degradant els
components de l'orgànul engolit juntament amb la membrana
interior de l'autofagosoma. El terme "flux autofàgic" es refereix a
tot el procés dinàmic de l'autofàgia.

Assaig migració cel·lular El moviment o migració de les cèl·lules es mesura sovint in vitro
per dilucidar els mecanismes de diferents activitats biològiques,
com ara la curació de ferides o la metàstasi de les cèl·lules
canceroses.

Estudi de tumors L'estudi genètic també és rellevant en el diagnòstic i té un valor

predictiu que pot arribar a ser determinant, més enllà de conèixer el
grau d'agressivitat del tumor. D'una banda, pot oferir informació
sobre la sensibilitat als diferents tractaments de quimioteràpia
disponibles, bé perquè sigui resistent a algun o, per contra, que
sigui sensible a altres.

Cultiu cel·lular Els cultius cel·lulars són essencials en la investigació científica, ja

que permeten estudiar els processos que ocorren a les cèl·lules, i en
diverses aplicacions de la biotecnologia, com ara la producció de
molècules d'interès industrial, enginyeria de teixits, etc.

Assaig MTT L'assaig MTT és un assaig colorimètric per avaluar l'activitat

metabòlica cel·lular. Els enzims oxidoreductasa cel·lulars
dependents de NAD (P) H poden, en condicions definides, reflectir
el nombre de cèl·lules viables presents. Aquests enzims són

2
 RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

capaços de reduir el colorant de tetrazoli MTT bromur de

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoli a la seva formacio
insoluble, que té un color porpra. Altres tints de tetrazoli
estretament relacionats, inclosos XTT, MTS i els WST, s'utilitzen
juntament amb l'acceptor d'electrons intermedi, metosulfat
d'1-metoxifenazina (PMS). Amb WST-1, que és impermeable a les
cèl·lules, la reducció es produeix fora de la cèl·lula a través del
transport d'electrons de la membrana plasmàtica.

Anàlisi cicle cel·lular
L'anàlisi del cicle cel·lular és una tècnica que es fa servir en la
investigació bioquímica per identificar i analitzar la fase d'una
cèl·lula biològica. Durant la seva vida, una cèl·lula passa per una
sèrie de fases cícliques que col·lectivament es coneixen com a
cicle cel·lular. La quantitat d'àcid desoxirribonucleic (ADN) a la
cèl·lula canvia segons la fase. En l'anàlisi del cicle cel·lular, l'ADN
de la cèl·lula es tenyeix amb un tint fluorescent, cosa que permet
als investigadors determinar quina quantitat d'ADN és present i on
es troba la cèl·lula al seu cicle.

Assaig clonogènic És una tècnica de biologia cel·lular per estudiar l'efectivitat

d'agents específics sobre la supervivència i la proliferació de
cèl·lules. S'utilitza amb freqüència als laboratoris de recerca del
càncer per determinar l'efecte dels medicaments o la radiació sobre
la proliferació de cèl·lules tumorals, així com per a la titulació de
partícules destructores de cèl·lules (CKP) en reserves de virus.

Anàlisi d'expressió de Anàlisi de l'expressió de proteïnes de diagnòstics utilitza per

proteïnes detectar la presència de malalties o condicions fisiològiques
anormals. En la investigació s'utilitza en la producció de proteïnes
d'enginyeria genètica per estudiar científic o en el
desenvolupament de fàrmacs.

Conclusions de l’estudi

3
 RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

Els euglenòfits pot ser un agent anticancerígen prometedor dirigit a múltiples processos de
promoció del càncer.

La toxina (49.1-114.6 μM) va demostrar efectes citotòxics, antiproliferatius, anticonclogènics i

anti-migratoris contra les cèl·lules CRT de HCT116, HT29 i SW620.

El càncer colorrectal (CRC) segueix sent un dels càncers més diagnosticats i la tercera causa de
mortalitat relacionada amb el càncer.

La inhibició tumoral es va associar amb una reducció de l’expressió d’un objectiu mecanicista de
regulació negativa de l’autofàgia de rapamicina (mTOR) i la disminució de la tendència de les
citocines proinflamatòries sèriques.

Article 2

Anti-tumorigenic activity of five culinary and medicinal herbs grown under greenhouse
conditions and their combination effects

Autors/es Weiguang Yi and Hazel Y Wetzstein

Any 2011

URL https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21452174

Objectiu de la recerca

Avaluar l'activitat antitumoral de cinc herbes seleccionades conreades en condicions d'hivernacle i

estudiar els possibles efectes sinèrgics entre diferents combinacions d'extractes d'herbes.

Línies cel·lulars estudiades

Cèl·lules tumorals de càncer de còlon SW-480.

Tècniques utilitzades

Nom tècnica En què consisteix aquesta tècnica? (descripció completa)

Extracció Es el metode en el qual s’obté ADN a partir de material biologic,

4
 RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

separant-lo i purificant-lo utilitzant tecniques fisiques i quimiques, per aixi

despres poder estudiar-lo, analitzar-lo o manipular-lo.

Medició de És el mesurament dels polifenols que són components que aporten un

polifenols totals percentatge important de capacitat antioxidant.
Hi ha un tipus de polifen que pot ser beneficiós contra diversos tipus de
càncer.

Medició de la El mesurament suposa la quantificació de totes les molècules antioxidants

capacitat antioxidant presents. Els assajos es basen en la decisió de la capacitat que tenen els
compostos antioxidants.

Assaig de Aquesta tècnica permet estudiar la proliferació de cèl·lules en

antiproliferació determinades condicions.
cel·lular

Cultius cel·lulars És el procés en el qual les cèl·lules es poden cultivar en condicions

controlades i ens permet estudiar l'activitat cel·lular. Ens permet aïllar les
cèl·lules i mantenir-les en cultiu i manipular-les per poder treballar-les.

Conclusions de l’estudi

Els extractes d'espècies d'herbes poden inhibir significativament el creixement de cèl·lules de

càncer de còlon humà.

Les barreges d'extractes d'herbes poden tenir efectes combinats en el creixement de les cèl·lules
canceroses.

L'estudi suggereix que aquestes cinc herbes poden tenir beneficis potencials per a la salut per a
suprimir el càncer de còlon.

Article 3

Efficient 0Act0ivation of Apoptotic Signaling during Mitotic Arrest with AK301

5
 RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

Avijeet Chopra, Michael J. Bond, Marina Bleiler, Michelle Yeagley,

Autors/es
Dennis Wright, Charles Giardina

Any 2016

URL https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27097159

Objectiu de la recerca

L’objectiu és comprovar l'efectivitat i la toxicitat del fàrmac Irinotecan en cèl·lules tumorals

cancerígens de còlon i cèl·lules control.

Línies cel·lulars estudiades

FHC i HCT116

Tècniques utilitzades

Nom tècnica En què consisteix aquesta tècnica? (descripció completa)

Microscopia És una tècnica d’immunomarcació que, s’aprofita de la capacitat

d’immunofluorescencia
que tenen els anticossos per a unir-se de forma específica una
determinada molècula, per tant, fa servir anticossos químics sòlids
per a demostrar la presència d’una determinada molècula.
En aquest cas es van utilitzar els següents anticossos: fosfohistona
H3 Ser 2, β-tubulina, γH2AX, γ-tubulina, Aurora B i Aurora A.
La brillantor i el contrast de la imatge es van modificar amb el
programari Adobe Photoshop.

citometria de flux A les cèl·lules es van fixar en paraformaldehído al 4%, és

permeabilizaron amb Triton X-100 al 0,1% i es van bloquejar amb
sèrum de ruc al 5%. Després, les cèl·lules es van incubar amb
l'anticòs γH2AX seguit d'incubació amb Alexa Fluor.1488 anticòs
secundari (Life Technologies). A continuació, les cèl·lules es van
recollir utilitzant tripsina-*EDTA durant 15 min a 37 °C i es van
rentar una vegada amb PBS. Es va afegir iodur de propidio (30
μg/ml) a les cèl·lules abans de la filtració a través de tubs de filtre
de cèl·lules de 35 μm. Les cèl·lules es van analitzar ràpidament per

6
 RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

citometria de flux.

ensayo de caspasa-3 La proteïna que és el centre de la via apoptòtica és la caspasa 3.

L'assaig fluorimètric de Caspasa-3 (SIGMA) es basa en una
reacció d’hidròlisi que alliberant-una substància fluorescent.
En aquest cas l’activitat de la caspasa es va determinar dividint el
canvi de fluorescència pel contingut de proteïna total de la barreja
de reacció.

Cultius cel·lulars El cultiu cel·lular tracta d’un conjunt de tècniques que permeten
mantenir les cèl·lules in vitro, mantenint les màximes propietats
fisiològiques, bioquímiques i genètiques.
En aquest cas es van realitzar cultius cel·lulars a partir de les línies
cel·lulars HT29 i HCT116 de cel·lues YAMC (Colonocits
immortals primaris de ratolí adult) i IMCE (Cèl·lules epitelials
immortals del colon).

Western blot La tècnica Western Blot s'utilitza per identificar la presència de

proteïnes específiques en mostres separades electroforéticament.
Després de separació mitjançant una tècnica coneguda com a
electroforesi en gel de poliacrilamida es realitza una transferència
occidental per moure les proteïnes d'un gel de poliacrilamida en un
tros de membrana que atrapa les proteïnes en les seves respectives
localitzacions. A continuació, les membranes són sondejades amb
els anticossos en un procés anomenat immunboblotting que fa
servir anticossos de proteïnes i d'unió d'anticossos a anticossos a
través de llocs de reconeixement específics, proporcionant l'alta
especificitat necessària per a la identificació d'una sola proteïna. La
detecció d'anticossos es duu a terme fent servir sistemes de reporter
que inclou l'ús d'enzims. Els enzims poden fixar-se al final d'un
anticòs i reaccionen amb els substrats per produir canvis de color o
llum. Aquests senyals llavors poden ser reflectides i quantificats
mitjançant un procés anomenat densitometria òssia.
Els anticossos immunoblotants van ser p53, p-p53, ATM.

7
 RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

Conclusions de l’estudi

L’associació entre la senyalització mitòtica i la resposta del dany a l’ADN va ser sostinguda per la

conclusió que la inhibició d’Aurora B va reduir el nivell de tinció de γH2AX.

Hem identificat una nova classe d’inhibidors mitòtics basats en piperazina, dels quals AK301 és la

derivada més potent identificada fins ara (EC50 <200 nM).

Les cèl·lules tractades amb AK301 van mostrar una resposta de danys a l'ADN associada a una

mitosi robusta, inclòs l'activació de l'ATM, la fosforilació de γH2AX i l'estabilització de p53.

AK301 és un potent promotor d’una transició de mitosi-apoptosi que pot apuntar a les cèl·lules

canceroses amb defectes mitòtics.

L’associació entre la senyalització mitòtica i la resposta del dany a l’ADN va ser sostinguda per la

conclusió que la inhibició d’Aurora B va reduir el nivell de tinció de γH2AX.

Hem identificat una nova classe d’inhibidors mitòtics basats en piperazina, dels quals AK301 és la

derivada més potent identificada fins ara (EC50 <200 nM).

Les cèl·lules tractades amb AK301 van mostrar una resposta de danys a l'ADN associada a una

mitosi robusta, inclòs l'activació de l'ATM, la fosforilació de γH2AX i l'estabilització de p53.

AK301 és un potent promotor d’una transició de mitosi-apoptosi que pot apuntar a les cèl·lules

canceroses amb defectes mitòtics.

L’associació entre la senyalització mitòtica i la resposta del dany a l’ADN va ser sostinguda per la

conclusió que la inhibició d’Aurora B va reduir el nivell de tinció de γH2AX.

Hem identificat una nova classe d’inhibidors mitòtics basats en piperazina, dels quals AK301 és la

derivada més potent identificada fins ara (EC50 <200 nM).

Les cèl·lules tractades amb AK301 van mostrar una resposta de danys a l'ADN associada a una

mitosi robusta, inclòs l'activació de l'ATM, la fosforilació de γH2AX i l'estabilització de p53.

AK301 és un potent promotor d’una transició de mitosi-apoptosi que pot apuntar a les cèl·lules

canceroses amb defectes mitòtics.

L’associació entre la senyalització mitòtica i la resposta del dany a l’ADN va ser sostinguda per la

8
 RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

conclusió que la inhibició d’Aurora B va reduir el nivell de tinció de γH2AX.

Hem identificat una nova classe d’inhibidors mitòtics basats en piperazina, dels quals AK301 és la

derivada més potent identificada fins ara (EC50 <200 nM).

Les cèl·lules tractades amb AK301 van mostrar una resposta de danys a l'ADN associada a una

mitosi robusta, inclòs l'activació de l'ATM, la fosforilació de γH2AX i l'estabilització de p53.

AK301 és un potent promotor d’una transició de mitosi-apoptosi que pot apuntar a les cèl·lules

canceroses amb defectes mitòtics.

EN EQUIP
Un cop fetes les lectures, esteu en disposició de crear el vostre propi DISSENY EXPERIMENTAL per
l’assaig clínic. Per això, ompliu la taula següent:

Nom del propi disseny experimental

Activació de la proteïna p53 mitjançant l’ús de la COTI-2, per tractar el càncer de colon

Autorxs Vives Pau, Dávila Dylan, Cabanillas Noel, León Judith, Tapia
Nicolás

Objectiu de la recerca

Realitzar els assajos preclínics, és a dir, dissenyar i avaluar l’efectivitat i toxicitat per la COTI-2.

Quin és la vostra hipòtesi inicial?

La COTI-2 presenta millors resultats en realitzar el tractament del càncer de còlon.

Amb quines línies cel·lulars amb les que treballareu (han de ser 2!?

1) HCT 116
2) SW620

Selecció de tècniques/mètodes que aplicareu en el disseny experimental

Nom tècnica 1) En què consisteix aquesta tècnica?

9
 RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

2) Amb quina finalitat s’utilitza en aquest estudi?

Microscopia És una tècnica d’immunomarcació que, s’aprofita de la capacitat

d’immunofluorescencia que tenen els anticossos per a unir-se de forma específica una
determinada molècula, per tant, fa servir anticossos químics sòlids
per a demostrar la presència d’una determinada molècula. En
aquest cas es van utilitzar els següents anticossos: fosfohistona H3
Ser 2, β-tubulina, γH2AX, γ-tubulina, Aurora B i Aurora A. La
brillantor i el contrast de la imatge es van modificar amb el
programari Adobe Photoshop.
Per poder detectar la proteïna P 53 i les cèl·lules tumorals

Citometria de flux Les cèl·lules es van fixar amb paraformaldehid al 4%, es van
permeabilitzar amb Triton X-100 al 0,1% i es van bloquejar amb
sèrum de ruc al 5%. Després, les cèl·lules es van incubar amb
l'anticòs γH2AX (sc-101696, Santa Cruz Biotechnology) seguit
d'incubació amb Alexa Fluor.1488 anticòs secundari (Life
Technologies). A continuació, les cèl·lules es van recollir utilitzant
tripsina-*EDTA durant 15 min a 37 °C i es van rentar una vegada
amb PBS. Es va afegir iodur de propidio (30 μg/ml) a les cèl·lules
abans de la filtració a través de tubs de filtre de cèl·lules de 35 μm.
Les cèl·lules es van analitzar ràpidament per citometria de flux.

Western blot La tècnica Western Blot s'utilitza per identificar la presència de

proteïnes específiques en mostres separades electroforéticament.
Després de separació mitjançant una tècnica coneguda com a
electroforesi en gel de poliacrilamida es realitza una transferència
occidental per moure les proteïnes d'un gel de poliacrilamida en un
tros de membrana que atrapa les proteïnes en les seves respectives
localitzacions. A continuació, les membranes són sondejades amb
els anticossos en un procés anomenat "immunoblotting" que fa
servir anticossos de proteïnes i d'unió d'anticossos a anticossos a
través de llocs de reconeixement específics, proporcionant l'alta
especificitat necessària per a la identificació d'una sola proteïna. La

10
 RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

detecció d'anticossos es duu a terme fent servir sistemes de reporter

que inclou l'ús d'enzims. Els enzims poden fixar-se al final d'un
anticòs i reaccionen amb els substrats per produir canvis de color o
llum. Aquests senyals llavors poden ser reflectides i quantificats
mitjançant un procés anomenat densitometria òssia.
Els anticossos "immunoblotants" van ser p53, p-p53, ATM.

Cultivo celular Els cultius cel·lulars són essencials en la investigació científica, ja

que permeten estudiar els processos que ocorren a les cèl·lules, i en
diverses aplicacions de la biotecnologia, com ara la producció de
molècules d'interès industrial, enginyeria de teixits, etc.
El cultiu cel·lular ens ajuden a observar i estudiar els processos
que ocorren a la cèl·lula. Ens permet estudiar el cicle cel·lular,
diagnosticar càncer i per la investigació.

Análisis ciclo celular L'anàlisi del cicle cel·lular és una tècnica que es fa servir en la
investigació bioquímica per identificar i analitzar la fase d'una
cèl·lula biològica. Durant la seva vida, una cèl·lula passa per una
sèrie de fases cícliques que col·lectivament es coneixen com a
cicle cel·lular. La quantitat d'ADN a la cèl·lula canvia segons la
fase. En l'anàlisi del cicle cel·lular, l'ADN de la cèl·lula es tenyeix
amb un tint fluorescent, cosa que permet als investigadors
determinar quina quantitat d'ADN és present i on es troba la
cèl·lula al seu cicle.
Aquesta tècnica serveix per detectar proteïnes, per tant, serveix per
detectar la proteïna p53.

Ensayo migración celular El moviment o migració de les cèl·lules es mesura sovint in vitro
per dilucidar els mecanismes de diferents activitats biològiques,
com ara la curació de ferides o la metàstasi de les cèl·lules
canceroses.

Quins materials necessitareu?

11
 RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

Material fungible: Puntes de micropipetes, cubreobjectes, portaobjectes d’immunofluorescencia,

placa de petri, tubs de filtre.

Reactius: Tint de la tinció, gel d’agarosa, paraformaldehído, Triton X-100, sèrum de ruc, l'anticòs
γH2AX, Alexa Fluor.1488, tripsina-*EDTA, PBS, fosfohistona H3 Ser 2, β-tubulina, γH2AX,
γ-tubulina, Aurora B i Aurora A, iodur de propidio, poliacrilamida, tinte fluorescente, nitrogen
liquid.

Equips: Microscopi de fluorescència, comptador de colònies, cubeta d’electroforesi,

termociclador, cámara de bioseguridad, cámara de Boyden

Quins resultats espereu obtenir?

Esperem que la COTI-2 sigui més eficient davant el cancer del colon, gràcies a la proteïna p53.

Quines conclusions espereu treure amb el vostre disseny experimental?

-El creixement tumoral disminueixi dràsticament o s’aturi definitivament.

-No es produeixi una migració cel·lular.

-Es presenta la proteïna p53 modificada.

ENTREGA FINAL
Un cop descrit el disseny experimental, elaboreu un ESQUEMA COMPLET (com si fos la vostra
llibreta de laboratori, amb dibuixos o imatges) incloent:
- Tècniques que fareu, pas a pas
- Equips que utilitzareu
- Resultats que espereu

Aquest esquema pengeu-lo també a les vostres XXSS amb els hastags i mencions:
@lablabland #R3cerca #LAB2022 #JEClot

12
 RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

Activació de la proteïna p53 mitjançant l’ús de la COTI-2, per tractar el càncer de colon
Materials:
Reactius:
Equips:
Tecniques:
Microscopia d’immunofluorescència:
- La tecnica de miscroscopia d’immunofluorescència ens permet detectar la proteïna p-53.
- Ens serveix per trobar les cèl·lules tumorals per observar el càncer de colon.
Citometria de flux:
- Fixar les cèl·lules amb paraformaldehido al 4%. Permeabilitzar-les amb Triton al 0,1% i bloquejar
amb sèrum de ruc al 5%.
- Incubar les cel·lules amb l’anticòs i incubar-ho amb l’anticos secundari.
- Recollir les cèl·lules utilitzant tripsina*EDTA durant 15 min a 37ºC i rentar amb PBS un cop.
- Afegir iodur de propidi a les cèl·lules i després filtrar-les a través de tubs de fultre cel·lulars.
Western blot:
- Preparació de les mostres: (Caldrà fer una llisi cel·lular)
1. Preparar un tampó de lisi d’eritròcits (155 mM Clorur d’Amoni, 10 mM Bicarbonat de Potassi e 1
mM EDTA.
2. Preparar un tampó de llisi de leucòcits
3. Barrejar mostra amb tampó de llisi en proporció 1:4

- El cultiu cel·lular ens ayuden a observar i estudiar els processos que ocorren en la cel·lula.
- Ens permet estudiar el cicle celular, diagnosticar cancer i per la investigació.

13
 RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

Procediment experimental Western Blot.

Procediment experimental Cultiu Cel·lular.

14
 RP3 R3CERCA_ACTIVITAT 5

Procediment experimental assaig migració cel·lular.

Procediment inmunofluorescencia i citrometria de flux

15