Практические навыки

1. Метод окраски по Бурри-Гинсу: назначение, техника окраски, результат.

Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают краситель, и для их выявления
чаще всего применяют данный метод негативного контрастирования.
1. На середину предметного стекла наносят каплю черной туши и смешивают ее с каплей
культуры капсульных бактерий с помощью петли.
2. Шлифованным краем предметного стекла делают мазок (по типу мазка из крови). Мазок
сушат на воздухе и фиксируют в пламени горелки.
3. Окрашивают 5 мин карболовым фуксином, разведенным водой 1:3
4. Осторожно промывают водой, высушивают.
Бактерии окрашиваются в красный цвет, а неокрашенные капсулы выделаются на
черно-розовом фоне.

2. Метод окраски по Циль-Нильсену: назначение, техника окраски, результат.

Применяют для выявления кислотоустойчивых бактерий
1. Фиксированный мазок окрашивают карболовым фуксином через полоску фильтровальной
бумаги с подогреванием до появления паров в течение 3-5 мин.
2. Снимают бумаги и после охлаждения промывают мазок водой
3. Обесцвечивают препарат 5% серной кислотой или 3% солянокислым спиртом.
4. Промывают водой
5. Окрашивают метиленовым синим 3-5 мину
6. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно красный цвет, остальная
микрофлора окрашивается в светло-синий цвет.

3. Метод окраски по Нейссеру: назначение, техника окраски, результат.

Применяют для выявления зерен волютина.
1. Фиксированный мазок окрашивают ацетатом синьки Нейссера в течении2-3 мин.
2. Наносят раствор Люголя на 10-30с.
3. Промывают водой, высушивают.
4. Окрашивают везувином или хризоидином в течении 0,5-1 мин
5. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Тело бактерии окрашивается в желтый цвет, а зерна волютина в темно-синий, почти
черный цвет.

4. Метод окраски по Граму: назначение, техника окраски, результат.

Применяют для выявления грамотрицательных и грамположительных бактерий.
1. Фиксированный мазок окрашивают генциановым фиолетовым 1-2 мин через полоску
фильтрованной бумаги, затем ее снимают и краситель сливают
2. Наносят раствор Люголя и через 1-2 мин раствор сливают.
3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения
фиолетовых струек красителя
4. Промывают водой
5. Окрашивают водным фуксином 1-2 мин промывают водой, высушивают и
микроскопируют.
Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а
грамотрицательные в красный.
Грамположительный: бактерии, в клетках которых комплекс, образуемый
генциановым фиолетовым и йодом, удерживающийся при обработке их спиртом.
 Грамотрицательные: бактерии, не обладающие свойством удерживать комплекс и
обесцвечивать при обработки спиртом.
5. Методы обнаружения жгутиков и подвижности бактерий.
Окраска по Леффлеру:
1. Приготовленный из 18-24ч культуры препарат обрабатывают 15-20 мин при комнатной
температуре протравой.
2. Тщательно промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе
3. Докрашивают фуксином Циля 3-4 мин при легком подогревании.
4. Промывают водой и высушивают.
Метод серебрения жгутиков по Морозову:
Готовят три реактива:
1) 1 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл формалина, 100 мл дистиллированной воды;
2) 5 г танина, 1 мл жидкой карболовой кислоты (фенола), 100 мл дистиллированной воды;
3) 5 г кристаллического азотнокислого серебра (AgN03) растворяют в 100 мл
дистиллированной воды.
К 80 мл раствора серебра (20 мл отливают) по каплям приливают водный раствор
аммиака (нашатырного спирта), пока не растворится образовавшийся осадок и останется
легкая опалесценция. Для окраски препарата раствор серебра разводят дистиллированной
водой в соотношении 1:100, Техника окраски следующая: на одну минуту на препарат
наливают первый реактив, сливают, промывают водой, наливают второй реактив,
подогревают на слабом пламени до появления паров (1 мин), тщательно промывают водой, 1
—2 мин при подогревании обрабатывают препарат третьим реактивом до появления темно-
коричневой окраски мазка, тщательно промывают водой, высушивают и микроскопируют с
иммерсией.
Метод «висячей» капли:
Используют стекла с лункой и покровные стекла. Края покровного секла смазывают
вазелином, а в центр наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло
лункой вниз прижимают к покровному стеклу, так, чтобы капля находилась в центре лунки.
Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно
приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или
края. Используя малых сухой объектив 8, находят края капли, устанавливают объектив на 40
и микроскопируют.
Метод «раздавленной» капли:
На поверхность чистого предметного стекла наносят каплю материала или суспензию
бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой и не выходить
за края покровного стекла. Микроскопируют с объективом 40.
Прижизненная (витальная) окраска:
Взвесь микробов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового синего или
нейтрального красного. Затем приготавливают препарат висячей или раздавленной капли и
микроскопируют.

6. Бактериологический метод исследования: цель, этапы.

Бактериологический метод исследования – это метод получения чистой культуры,
путем посева материала от больного на различные (питательные) среды и ее идентификация.
Этапы:
1) Выбор материала от больного и его посев на питательные среды. Посевы инкубируют в
термостате 18-24 ч при t=37ºС.
2) Учет первичных признаков:
 культуральные свойства - характер роста на плотных и жидких средах;
 морфологические и тинктариальные свойства;
  подвижность в препарате раздавленной капли;
 первичная сероидентификация с помощью поливалентных типовых сывороток.
3) Выделение культуры на скошенный агар. В термостат на 24ч.
4) Идентификация по следующим свойствам: морфологические и тинкатериальные свойства;
биохимические свойства; факторы патогенности и токсинообразования; сероидентификация с
помощью моновалентных типовых сывороток; фагоцитирование (типирования с помощью
фагов); чувствительной к антибиотикам.

7. Биохимическая идентификация бактерий: питательные среды, постановка, учет

результатов.
Определение сахаролитических свойств:
Обычно используют короткий пестрый ряд, к которому относятся жидкие среду Гисса с
моно- и дисахаридами: лактоза, глюкоза, мальтоза, сахароза и шестиатомный спирт – манит.
Среда Гисса состоит из гептонной воды, 1% углевода и индикатора Андреде (кислый
фукцин, обесцвеченные щелочью). В среду отпускают поплавок, который при стерилизации
заполняется средой. При сбраживании сахара бактериями, цвет среды меняется на красный, а
газ скапливается в поплавке. Результат реакции определяется при помощи добавления в
питательную среду различных индикаторов, делающих цветные реакции.
Среда Ресселя: питательный агар, 1% лактозы, 0,1% глюкозы и индикатор Андреде.
Среду готовят таким образом, чтобы внизу она была в виде столбика, а верхняя часть имела
скошенную поверхность. Исследуемую культуру засевают уколом в столбик и на поверхность
среды. При ферментации углеводов происходит покраснение среды; разрывы столбика
свидетельствует о газообразовании. При разложении углеводов происходит образование
органических кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газа (CO2 и H2). Кислоты вызывают
изменения pH среды, что приводит к изменению окраски. Газ вытесняет жидкость в верхней
части поплавка или вызывает разрыв агара.
Определения протеолитических свойств:
Определяются обнаружением конечных продуктов ферментации белков (индола,
сероводорода, аммиака) и по способности разжижать желатин (мясопептонный бульон с 10-
15% желатин).
Посев на мясопептонный бульон или пептонную воду. Разжижать желатину способны
микробы, выделяющие фермент типа коллагеназы, наблюдается рост в форме воронки,
гвоздя, елочки. При t=20-22ºС. Инкубация 2-3 суток при t=37ºС.
1. Реакция на аммиак. Полоску лакмусовой бумаги укрепляют под пробкой так, чтобы она
не соприкасалась с питательной средой. Посинение бумаги свидетельствует о наличии
аммиака.
2. Реакция на индол:
 Способ Эрлиха: в пробирку с культурой бактерий на мясопептонном бульоне прибавляют
2-3мл эфира, перемешивают и добавляют несколько капель реактива(Эрлиха); в присутствии
индола наблюдается розовое окрашивание, при осорожном наслаивание - розовое кольцо.
 Способ Мореля: полоски фильтравальной бумаги, пропитанные щавелевой кислотой,
укрепляют под пробирки вместе с лакмусовой полоской. При образовании индола нижняя
часть бумажки окрашивается в розовый цвет.
3. Реакция на сероводород. Под пробиркой укрепляют полоску фильтровальной бумаги,
пропитанную ацетатом свинца; в присутствии сероводорода нижняя часть бумаги чернеет
вследствие образования сульфита свинца.
4. Обнаружение ферментов каталазы. На предметное стекло наносят каплю 1-3% раствора
перекиси водорода и вносят в нее петлю бактериальной культуры. Каталаза разлагает
перекись на H2O и O2. Выделение пузырьков свидетельствует о наличии ферментов.
8. Питательные среды: классификация, требования, примеры.
Одним из главных условий культивирования является применение соответствующих
питательных сред.
Классификация:
1. По происхождению:
 Естественные (молоко, желатин, картофель);
 Искусственные (приготовлены из специально подобранных природных компонентов,
например: -мясопептонные среды содержат мясной перевар, пептон и определенные
концентрации солей);
 синтетические (состоят из химических солей, аминокислот, углеводов, витаминов и
т.д.).
2. По консистенции (в зависимости от процентного содержания агар-агара):
 Твердые (3-5% агар-агара);
 Полужидкие (0,3%, 0,5% и 0,7% агар-агара);
 Жидкие (0% агар-агара).
3. По составу:
 простые (мясопептонный агар – МПА, мясопептонный бульон – МПБ, пептонная вода);
 сложные (мясопептонная основа и различные добавки, например: кровяной агар,
сывороточный агар, полужидкие углеводные среды Гисса, сахарный бульон и др.).
4. По назначению:
 общего назначения – для культивирования большинства бактерий (МПА, МПБ, кровяной
агар и др.);
 специального назначения – для особых целей:
˗ элективные (желточно-солевой агар для стафилококков, щелочная пептонная вода
для холерного вибриона) - выделяется один вид;
˗ дифференциально-диагностические (дифференциально-диагностические среды для
энтеробактерий- среды Эндо, Левина, Плоскирева) - выделяются сложные группы.
Требования к питательным средам:
1) Питательность (содержание всех необходимых питательных веществ).
2) Изотоничность (обеспечивает осмотическое равновесие между клеткой и средой,
облегчает процессы осмоса и диффузии питательных веществ и продуктов метаболизма).
3) Определенная рН (обеспечивает функционирование ферментов бактерий).
4) Определенный Н-потенциал (обеспечивает окислительно-восстановительные процессы в
клетке бактерий; разный для аэробов и анаэробов).
5) Стерильность (позволяет правильно учесть результаты).
6) Прозрачность (позволяет увидеть рост бактерий).

9. Методы культивирования вирусов, индикация и идентификация.

1) Биологический - заражение лабораторных животных.
2) В развивающихся куриных эмбрионах – чаще всего материал вводят в аллантоисную и
амниотическую полости, на хорионаллантоисную оболочку и в желточный мешок. Вскрытие
через 48-72 ч. Инкубации при t=37ºС. В результате может: гибель эмбриона; дефекты
развития (бляшки); накопление вирусов в аллантоисной жидкости (обнаруживают путем
титрования).
3) Размножение в культуре ткани. Типы культура в ткани:
 перевиваемые - культуры опухолевых клеток; обладают больше митотической
активностью;
  первично трипсинизированные - подвергаемые первичной обработке трипсином; эта
обработка нарушает межклеточные связи, в результате чего выделяются отдельные клетки-
полуперевиваемые клетки человека.
Методика изучения цитопатического действия вирусов:
Для исследования монослоя клеток пробирку с тканевой культурой помещают на
предметный столик, микросопируют так, что бы монослой был сверху. Изучают с помощью
объектива 8. Отмечают полное или островковое разрушение пласта клеток.
Основные проявления:
1. Гибель клеток или морфологические изменения в них.
2. Некоторые вируса вызывают слияние клеток и образование многоядерного смещения.
3. Клетки могут расти, но не делиться; в результате образуется гигиант-клетки.
4. В клетки появляются включения (ядерные, цитоплазматические, смешанные). Включения
могут окрашиваться в розовый цвет (эозинофильные включения) или в голубой (базофильные
включения).
5. Если в культуре ткани размножаются вирусы, имеющие гемагглютинин, то в процессы
размножения клетка приобретает способность адсорбировать эритроциты (гемадсорбция).
Постановка реакции гемагглютинации (РГА):
Куриные эмбрионы вскрывают, аллантоисную жидкость разливают в пробирки
двукратные возрастающие разведения в объеме 0,5 мл (для контроля берут 0,5 мл такой же
жидкости незараженного эмбриона). Затем добавляют по 0,5 мл 1% суспензии отмытых
куриных эритроцитов и выдерживают при tº. Результаты через 40 мин. Наличие
гемагглютинации в опытных пробирках при ее отсутствии в контрольной указывают на
содержание вируса и исследуемой жидкости.

10. Методы культивирования и питательные среды для анаэробов.

1. Физические методы:
 создание вакуума в специальных аппаратах (анаэростат);
 замена воздуха индифферентным газом (анаэростат);
 затруднение доступа кислорода (культивирование в глубине столбика агара на среде
Вильсона-Блера №1- методы Витнберга или в запаленных стеклянных трубках с агаром -
метод Виняль-Витона).
2. Химические методы
 культивирование на плотных питательных средах в специальных аппаратах, в которых
кислород поглощается химическими веществами (эксикатор, аппарат Аристовского);
 культивирование жидких средах в присутствии редуцирующих веществ (аскорбиновая
кислота, тиогликолевая кислота).
3. Биологические методы:
 культивирование на плотных питательных средах в герметически закупоренных чашках
Петри, в которой кислород поглощается специально заселенным аэробом (метод Фоотнера);
 культивирование в жидких средах, содержащих адсорбенты для кислорода (кусочки
паренхиматозных органов – среда Китта-Тароцци, вату, сахарный агар и прочее).
В качестве субстрата дыхание в среды для выращивания анаэробой добавляется
глюкоза.
Среды для анаэробов:
1. Среда Вильсона-Блера (железносульфатный агар). Приготовляется из питательного
агара, к которому добавляют глюкозы, Na2SO3, FeCl2. Анаэробные клостридии (Сl.
Perfringens) образуют на этой среде колонии черного цвета за чет восстановления Na2SO3 в
Na2S, который, соединяясь с хлоридом железа, дает осадок сульфата железа черного цвета.
2. Среда Китта-Тароцци. Состоит из питательного бульона, адсорбции кислорода. Перед
посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течении 10-15 мин для удаления
воздуха. С целью изоляции от атмосферного воздуха среду заливают небольшим слоем
вазелинового масла.

11. Методы выделения чистой культуры анаэробов.

1 день:
Исследуемый материал засеивают для обогащения в пробирку со средой Китта-Тароцци.
Среду необходимо перед посевом прогреть на кипящей водяной бане 10-20 минут для удаления
растворенного в ней кислорода, а затем охладить до 30-37ºС. При выделении споровых форм
анаэробов засеянную среду вновь прогревают на водяной бане при 80ºС в течении 20 минут для
уничтожения неспоровых форм бактерий, затем инкубируют в термостате при 37ºС.
2 день:
Просматривают посевы, приготавливают мазки и окрашивают по Граму. В положительном
случае обнаруживают помутнение и пузырьки газа в среде и крупные споровые Грам+ палочки в
мазках.
Для выделения чистой культуры по методу Цейслера петлю материала из среды Китта-
Тароцци наносят на кровяной сахарный агар в первую чашку Петри и распределяют шпателем
по поверхности среды, затем этим же шпателем втирают материал в среду второй и третьей
чашек для получения изолированных колоний.
По методу Вейнберга одну или две петли материала из среды Китта-Тароцци вносят в
пробирку с бульоном для разведения материала. Затем пастеровской пипеткой с запаянным
концом переносят материал последовательно в 3-5 узких пробирок с предварительно
прокипяченным (около 20 минут) остуженным до 50ºС сахарным мясо-пептонным агаром,
погружая капилляр пипетки в расплавленный агар до самого дна пробирки. Засеянные
пробирки быстро охлаждают под струей воды, при этом агар застывает и фиксирует
разобщенное положение отдельных микробных клеток в глубине столбика агара. Инкубация
до 24 часов при 37ºС.
3 день:
Изучений свойств колоний. На месте отобранной для выделения чистой культуры
колонии делают распил пробирки, колонию отсасывают пастеровской пипеткой и переносят в
пробирку со средой Китта-Тароцци, которую помещают в термостат 24 часа, 37ºС. Затем
идентифицируют.

12. Методы выделения чистой культуры аэробов.

Метод Коха: заключается в приготовлении ряда разведений материала в стерильном
изотоническом растворе хлорида натрия и внесение одной капли каждого разведения в
пробирки с расплавленным и остуженным агаром. После тщательного перемешивания
содержимое пробирок выливают в стерильную чашку Петри.
Метод Дригальского: материал петлей или пипеткой наносится на поверхность агара в
чашку Петри и распределяется стерильным шпателем. Затем этим же шпателем растирают по
поверхности агара во 2 и 3 чашках.
1 день:
Исследуемый материал разводят в пробирке с изотоническим раствором хлорида
натрия. Одну петлю приготовленного разведения наносят на поверхность мясо-пептонного
агара в чашку Петри и тщательно втирают шпателем в среду на одной половине чашки. Этим
же шпателем оставшийся на нем материал втирают в агаровую среду на второй половине
чашки, затем шпатель погружают в дезинфицирующий раствор. После посева чашку
переворачивают дном кверху и помещают в термостат на 18-24 часа при температуре 37ºС.
2 день:
Просматривают чашки и изучают изолированные колонии. Для определения
морфологии клеток и их тинкториальных свойств из части исследуемой колонии
приготавливают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Для выделения и накопления чистой культуры одну изолированную колонию или
несколько различных изолированных колоний пересеивают в отдельные пробирки со
скошенным ПМА или какой-либо другой питательной средой.
3 день:
Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Для проверки её однородности
приготавливают мазок, окрашивают, микроскопируют.

13. Методы физической стерилизации: назначение, режимы.

1. Прокаливание – в пламени спиртовки или газовой горелки. Этим способом стерилизуют
бактериологические петли, препаровальные иглы, пинцеты и некоторые другие инструменты.
2. Стерилизация сухим жаром – в сушильном шкафу (печи Пастера) при температуре 160-
170ºС 1,5-2 часа. Стерилизуют стеклянную посуду- пробирки, чашки Петри и пипетки.
3. Стерилизация паром под давлением – в автоклаве. Стерилизуют многие питательные
среды, перевязочный материал, белье. 1 режим 111ºС 0,5 атм 30 минут; 2 режим 121ºС 1 атм
15-20 минут; 3 режим 127-133ºС 1,5-2 атм 20-25 мин.
4 Текучим паром – в автоклаве, аппарате Коха в течении 3 дней, по 30-60 минут при 100ºС.
Материал: субстраты с углеводами, желатином, мочевиной, витаминами.
5. Пастеризация – в аппарате Коха, водяной бане 65- 70ºС 15-30 минут. Материал: растворы,
лекарственные препараты, продукты питания.
6. Тиндализация –аппарат Коха, водяная баня 56-68ºС в течении часа 5-6 дней. – сыворотки,
белковые среды, витамины.
7. Кипячение – в биксах, контейнерах + сода 30-60 минут, 100ºС. Материал: инструменты,
стекло, шприцы.
8. УФ–облучение – специальные бактериальные лампы 2-3 раза в день в течении часа.
Обработка воздуха.
9. Гамма излучение с помощью гамма-излучателей. Пластиковые изделия, одноразовый
инструментарий.
10. Ультразвук с помощью ультразвуковых источников – обработка воды, лекарств.

14. Механическая стерилизация – фильтрование: виды фильтров, назначение и

применение.
С помощью мелкопористых фильтров разных типов, задерживающих только клеточные
формы микробов и их споры.
Фильтры Шамберлана изготовлены из каолина с примесью песка и кварца, имеют вид
свечей, полых внутри с различными размерами пор и условно обозначены L1, L2, L3.
Фильтры с 5 по 13 бактерий не пропускают.
Фильтры Беркефельда сделаны из инфузорной земли в виде свечи. Размеры в порядке
увеличения: W, N, V (дабл-ю, эн, ви).
Фильтр Зейтца состоит из асбестовой пластинки, которая монтируется в специальную
металлическую воронку, вставленную через резиновую пробку в колбу Бунзена.
Фильтрование проводят под вакуумом. Перед фильтрованием всю систему стерилизуют в
автоклаве.
Мембранные фильтры приготавливают из нитроклетчатки. В зависимости от
размеров пор эти фильтры имеют номера от 1 до 5.
Фильтрованием стерилизуют жидкие материалы, не выдерживающие нагревания
(сыворотку крови, антибиотики и др.) Фильтрование также используют для получения
бактериальных токсинов, фагов и разных продуктов жизнедеятельности бактерий.
15.Дезинфекция: определение, виды, классификация химических веществ.
Дезинфекция - это уничтожение или резкое подавление численности патогенных
микроорганизмов с помощью химических веществ на объектах внешней среды. Проводят с
определенной периодичностью (профилактическая дезинфекция), либо при возникновении
инфекционного заболевания или подозрении на него (очаговая дезинфекция).
Антисептики по механизму действия:
- поверхностно-активные (жирные кислоты, мыла);
- фенол, крезол и их производные – повреждают клеточную стенку и клеточные белки;
- формальдегид – вызывает денатурацию белков вегетативных форм бактерий и спор;
- окислители (перекись водорода) – активным является атомарный кислород;
-хлорсодержащие вещества (хлорамин, хлорная известь) действуют благодаря выделению
газообразного хлора;
- акридины – обладают сродством к нуклеиновым кислотам, нарушают процессы клеточного
деления;
- соли тяжелых металлов вызывают коагуляцию белков, обладает бактерицидным
действием по отношению к бактериям и вирусам.
Антисептики по химической природе:
- спирты;
- галогены и галогенсодержащие препараты (препараты йода и хлора – йодинол, йодонат,
раствор Люголя, хлорная известь, хлоргексидин, хлорамин);
- альдегиды (формальдегид);
- кислоты и щёлочи – борная кислота, бензойная, уксусная; раствор аммиака);
- металлы (ляпис, медный купорос);
- фенолы и их замещенные производные (салол, тимол);
- катионные детергенты (циригель);
- газы (окиси этилена, пропилена);
- красители (бриллиантовый зеленый, метиленовый синий);
- окислители (перекись водорода).

16. Методы контроля стерилизации и дезинфекции.

Бактериологический контроль стерилизации. Три пробирки с мясо-пептонным
бульоном засеять шелковыми нитями, смоченными смесью споровой и неспоровой культур.
1 пробирку подвергнуть автоклавированию, вторую – кипячению, а третью (контрольную) -
не подвергать никакому воздействия. Посевы выдержать при 37ºС в течении 24 часов.
Отметить результат поставленного опыта.
Определение эффективности действия дезинфицирующих веществ. Приготовить два
вида бактериальных тест-объектов: 1) шелковые нити, смоченные культурой кишечной
палочки (E.coli), 2) шелковые нити, смоченные спорообразующей культурой (с большим
содержанием спор). Нити поместить в растворы фенола (5%), лизола (5%), хлорной извести
(10%) на 5 и 60 минут, после чего отмыть от дезинфицирующих веществ, засеять в МПБ и
поместить в термостат до следующего дня. Контрольные тесты не подвергать действию
дезинфицирующих веществ.

17. Определение общего микробного числа (ОМЧ) воздуха методом Коха.

Общее микробное число - общее количество бактерий в 1 кубическом метре. Чашку
Петри с мясо-пептонным агаром оставляют открытой в течение 5-10 минут. Затем её
закрывают и инкубируют в течение 2 суток при 37ºС. Результаты учитывают путем подсчета
числа выросших колоний, исходя из того, что на площадь чашки 100 см в квадрате в течение
5 минут оседают микробы, содержащиеся в 10 л воздуха.
Определение микробного числа по формуле Омелянского:
Х = а•100•1000•5/(b•10•Т),
где Х – количество микробов в 1 кубическом метре (1000л) воздуха; а – количество выросших
колоний в чашках; b – площадь чашки; Т – время, в течение которого чашка была открыта; 5
– время по правилу Омелянского; 10 – объем воздуха в литрах.

18. Определение общего микробного числа (ОМЧ) воздуха методом Кротова.

Метод Кротова является более точным количественным методом определения ОМЧ с
помощью аппарата Кротова. Воздух в количестве 50- 100 л пропускают со скоростью 25
литров в минуту над открытой чашкой Петри с МПА. Затем закрывают и инкубируют.
Затем вычисляют по формуле:
Х = количество микробных колоний, выросших на чашке умножить на 1000 и разделить на
объем пропущенного через прибор воздуха в литрах.
1000 - это искомый объем воздуха в литрах.

19. Определение коли-титра и коли-индекса воды методом мембранных фильтров.

Коли–титр – наименьшее по объему количество воды, в котором обнаруживается
присутствие кишечной палочки. (должен быть не менее 300 мл).
Коли- индекс – количество кишечных палочек в 1 литре воды. (должен быть не более
3).
Используют воронку Зейтца с мембранным фильтром, вмонтированную с колбу
Бунзена, которая присоединяется к вакуумнасосу. Мембранные фильтры стерилизуют
кипячением в дистиллированной воде. Строго определенный объем исследуемой воды
фильтруют через мембранный фильтр, который затем помещают на поверхность среды Эндо
в чашку Петри. Посевы инкубируют при 37ºС в течение суток. Затем из 2-3 колоний
красного цвета (типичных для кишечных палочек) приготавливают мазки, окрашивают по
Граму и микроскопируют; остатки этих колоний засевают в пробирку со средой Эйкмана
(1% пептонная вода с 0,5% хлорида натрия, индикатор Андреде, 0,5% глюкозы и поплавок);
инкубируют при температуре 37ºС в течение суток. При наличии газообразования
подсчитывают количество красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс, из
значения которого потом вычисляют коли-титр. Например, если коли-индекс равен 5, то
коли титр равен 200 (1000/5= 200).

20. Определение коли-титра и коли-индекса воды методом Эйкмана.

Коли–титр – наименьшее по объему количество воды, в котором обнаруживается
присутствие кишечной палочки. (должен быть не менее 300 мл).
Коли- индекс – количество кишечных палочек в 1 литре воды. (должен быть не более
3).
Воду открытых водоёмов в объемах 100,10, 1 и 0,1 мл засевают в среду Эйкмана (1%
пептонная вода с 0,5% хлорида натрия, индикатор Андреде, 0,5% глюкозы и поплавок). Для
посевов больших количеств воды используют концентрированную среду Эйкмана,
содержащую десятикратные концентрации данных веществ, так как в очень разбавленной
среде кишечная палочка не вырастет.
Для исследования водопроводной воды сеют 4 пробы по 100 мл и 10 проб по 10 мл в
концентрированную среду Эйкмана. Посевы инкубируют в течении суток при температуре
37ºС. Определение бродильного титра производят по наличию пузырьков газа в поплавке.
При исследовании питьевых вод делают высев на среду Эндо с последующей
бактериоскопией и вторичной проверкой способности к газообразованию при 37ºС при
пересеве из колонии на среду Эйкмана. При положительных результатах определяют коли-
титр и вычисляют коли-индекс. При коли-титре воды 100, коли индекс будет равен 10
(1000/100=10).
21. Метод определения ОМЧ и степени фекального загрязнения почвы.
Максимальное число микроорганизмов содержится в почве на глубине 5-20 см.
Присутствие в почве Е. coli и Streptococcus faecalis указывает на свежее; Citrobacter и
Enterobacter – не свежее, a Clostridium perfringens – на давнее загрязнение. Более точная
оценка – с помощью определения коли-индекса (наименьшее количество почвы, в котором
обнаруживается хоть 1 E.coli), перфрингенс-титра (наименьшее количество почвы, в которой
обнаружена хоть 1 клетка газовой гангрены ).
Для определения ОМЧ:
Почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест не менее 10
проб) в стерильную банку. Из проб готовят навеску 30 г, из которой готовят водную
суспензию (+ вода 270 мл), а затем ее разведения 10 -3, 10-4, 10-5. Из 2-х последних разведений
по 0,1 мл смешивают с 4 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 45ºС МПА, выливают
двойным слоем в чашки с 2% МПА. Инкубируют в термостате (37ºС). Подсчитывают
количество выросших колоний и вычисляют микробное число.

22. Метод стандартных дисков.

Качественный метод определения чувствительности бактерий к антибиотикам.
Бумажные диски, пропитанные определенными антибиотиками, помещают на поверхность
МПА в чашки Петри, предварительно засеянного «газоном» исследуемой бактериальной
культуры. Посевы инкубируют в течение 16-24 ч, после чего учитывают результаты опыта
по образованию светлых зон задержки роста бактерий. По диаметру зон ориентировочно
судят о чувствительности бактерий к антибиотикам. Так, зоны диаметром до 15 мм – слабая,
15-25 мм - средняя, более 25 мм - сравнительно высокая чувствительность микроорганизма к
антибиотику.

23. Метод серийных разведений.

Затратный, прибегают, когда требуется антибиотик 100 ед./мл, двукратное разведение.
Готовят в пробирках, содержащих 1 мл МПБ. В 1 пробирку вносят 1 мл исходного раствора
препарата, после готовят серию (ряд) последовательных разведений препарата от 50 до 0,1
ЕД/мл в равных объёмах питательной среды. Затем в каждую вносят 0,1 мл испытуемой
бактериальной суспензии, густотой 1 млрд/мл по оптическому стандарту. Одновременно
ставят контроли – бактерий (1 мл МПБ+0,1 мл суспензии бактерий) и антибиотика (МПБ+
антибиотик). Посевы инкубируют 18-24 ч, после отмечают результаты - отсутствие
помутнения среды говорит о задержке роста бактерий в присутствии данной концентрации
препарата. Где 50, 25, 12,5, 6,25 - нет помутнения – где МБК, от 3,125 и до 0,1 – есть
помутнение - МПБ. Минимально ингибирующая концентрация = 6,25+3,125/2= 4,6 ед.

24. Факторы патогенности.

 Плазмокоагулаза - культуру засеивают в 0,5 мл стерильной цитратной плазмы кролика в
разведении 1:5, и инкубируют от 2 ч до суток. + Плазма застывает.
 Гиалуронидаза - в пробирку с экстрактом пупочного канатика + чистую культуру и
инкубируют 20 минут. + несколько капель ледяной уксусной кислоты. При + результате -
выпадения осадка в ней.
 Лецитиназа - посев культуры на желточный агар. Инкубация 24 ч - образуется матовый
венчик вокруг лецитиназо-положительных микроорганизмов.
 Гемолизин - чистую культуру вносят на 5% кровяной агар, 24 часа инкубируют. Агар
просветляется при + результате, образуя зону гемолиза.
 Фибринолизин - чистую культуру микроорганизмов вносят в сгусток крови («тромб»),
инкубируют 2 ч, наблюдается растворение.
 Каталаза - бактериальную массу снимают с поверхности агара бактериологической
петлей и суспензируют в капле 3%-го раствора перекиси водорода на предметном стекле.
Положительный результат — образование пузырьков газа.
 Общая фосфатаза - культуру вносят в питательную среду (0,1% фенолфталеина фосфата
натрия) - инкубируют 37ºС, 24 ч + 2-3 капли нашатыря - колонии красного цвета.
 Уреаза - исследуемую культуру микроорганизма засевают на среду с мочевиной и
индикатором. Инкубируют 24 ч, наблюдаем изменение цвета.
 Некротоксин - бульонную культуру микроорганизмов вносят внутрикожно кролику, при
+ реакции, наблюдаются некрозы (ожоги).
 Летальный токсин - бульонную культуру внутривенно, при + реакции гибель в течении
часа.
 Энтеротоксин - чистую культуру вносят внутрибрюшинно или с пищей, при + реакции –
отравление, диарея.

25. Биологический метод исследования: цель, задачи, назначение, этапы.

Цель: обнаружение возбудителя и его токсина в организме; выделение чистой
культуры; определение патогенности; получение иммунобиологических препаратов для
профилактики, диагностики, лечения.
Задачи: изучение патогенеза заболевания, вызвавшего данным возбудителем,
характера взаимодействия микроба и макроорганизма.
Назначение: заражение восприимчивых лабораторных животных исследуемым
материалом и последующее выделение чистой культуры возбудителя.
Этапы:
1) выбор лабораторного животного. В опыт берут здоровых и стандартизированных
по: полу, возрасту, массе, породе, линии, упитанности; культуру для заражения
стандартизируют по: плотности, возрасту, суспензирующей жидкости.
2) заражение животного: материал должен быть забран в асептических условиях, в
стерильную посуду, гомогенизирован, использован как можно быстрее. Перед заражением
удалить шерсть и обработать 70 % этанолом. При болезненных вмешательствах
обезболивание.
3) бактериологическое исследование (выделение чистой культуры возбудителя,
идентификация, посев материала на плотные питательные среды, изучение колоний,
отличают культуральные свойства колоний, делают мазки и окрашивают по Граму.
Микроскопируют определяя тинкториальные и морфологические свойства.

26. Реакция агглютинации на стекле: назначение, постановка, ингредиенты, учет.

Назначение: для идентификации видов и типов бактерий по известной
агглютинирующей сыворотке, для определения присутствия антител в сыворотке больного по
известным антигенам.
Постановка, ингредиенты: ставят с диагностическими агглютинирующими
сыворотками в разведениях 1:10, 1:20. На хорошо обезжиренное стекло наносят отдельно
каплю изотонического раствора хлорида натрия для контроля. Затем в каждой капле
размешивают небольшое количество культуры до получения гомогенной взвеси.
Учет результатов: через 2-4 минут в капле с сывороткой появляются хлопья,
контрольная капля остается равномерно мутной.

27. Реакция развернутой агглютинации: назначение, постановка, ингредиенты, учет.

Назначение: для определения титра антител. Ставится в сыворотке больных. Ее
разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. В
более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у
здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр). В качестве
антигена используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, убитых бактерий, с
которыми безопасно работать.
Постановка, ингредиенты: в агглютинационные пробирки предварительно разливают
по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую доливают 1 мл сыворотки,
разведенной 1:100, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В
полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2
капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и
помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной
температуре.
Учет результатов: производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с
контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не
должно быть. Интенсивность реакции:
++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости);
+++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости);
++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная);
+ - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо
различимы;
— - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).
За титр сыворотки последнее ее разведение, в котором интенсивность агглютинации
оценивается не менее чем два плюса (++).

28. Реакция пассивной агглютинации: назначение, постановка, ингредиенты, учет.

Назначение: для выявления специфических антител в сыворотке больного.
Постановка, ингредиенты: человеческие эритроциты 0-группы, предварительно
обработанные раствором танина в разведении 1:20000 и нагруженные антигеном, вносят в
лунки плексигласовой панели, в которых приготовлены разведения сыворотки больного.
Результаты учитывают через 2 часа инкубации при 37ºС.
Учет результатов: при положительном- эритроциты оседают на дне лунки в виде
ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в
отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.
Контроли ингредиентов реакции: сенсибилизированные эритроциты с нормальной
сывороткой, буферным раствором; несенсибилизированные с исследуемой сывороткой.

29. Реакция термокольцеприципитации: назначение, постановка, ингредиенты, учет.

Назначение: для определения природы антигена в исследуемом материале.
Постановка, ингредиенты: в узкую пробирку (диаметр 0,5см), в которые разливают
сыворотки (по 0,1 мл). Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают по стенке
(пробирку держат наклонно) антиген в таком же объеме. Затем пробирку осторожно, чтобы
не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении антигена на сыворотку
четко видна граница между двумя жидкостями. Результаты учитывают в зависимости от вида
микроорганизма через 5-10 минут, 1-2 часа, 20-24 часа.
Учет результатов: через 1-2 минуты. В случае положительной реакции на границе
между сывороткой и исследуемым материалом появляется преципитат в виде кольца белого
кольца. В остальных преципитата не образуется.

30. Реакция диффузной преципитации в агаровом геле: назначение, ингредиенты,

постановка, учёт результатов.
 Назначение: позволяет определять токсигенность (например, дифтерийной палочки);
титр преципитирующей сыворотки — максимальное разведение антигена, которое дает
преципитацию с данной сывороткой
Ингредиенты: сыворотка, содержащую антитела, различные испытуемые антигены
или один и тот же антиген в различных разведениях.
Постановка: чашки заливают просветленным агаром, в котором вырезают несколько
лунок на равном расстоянии друг от друга. В центральную лунку вносят сыворотку,
содержащую антитела, в остальные — различные испытуемые антигены или один и тот же
антиген в различных разведениях. Реагенты диффундируют в агар.
Учет результатов: в зонах оптимальных соотношений на месте встречи антигена и
антител образуются мутные полосы (дуги) преципитации.

31. Реакция связывания комплемента: назначение, ингредиенты, постановка, учёт

результатов.
Назначение: диагностика сифилиса, хронической формы гонореи, коклюша,
актиномикоза, всех риккетсиозов и вирусных инфекций.
Ингредиенты:
 антитело – иммунная инактивированная нагреванием сыворотка больного,
 антиген – из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, гаптенов, экстрактов тканевых
липидов,
 комплемент –из свежей сыворотки морских свинок,
 эритроциты барана,
 гемолитическая сыворотка.
Постановка:
 первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента
(АГ+АТ=комплекс+комплемент); при 37°С в течение 30 мин или постановка РСК «на
холоде» при 0—4°С в течение суток (специфичность и чувствительность реакции выше).
 вторая фаза – добавляют в каждую пробирку по 0,4 мл гемолитической системы
пробирки, встряхивают и выдерживают 20—30 мин при 37°С. Разрушение эритроцитов
гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к
гемолитической системе.
Учет результатов: оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех
пробирках. При окончательном учете интенсивность реакции отмечается плюсами:
++++ - резко положительная - с полной задержкой гемолиза, жидкость в пробирке
бесцветная, все эритроциты осели на дно;
+++, ++ - положительная - отличается нарастанием окраски жидкости вследствие гемолиза
и уменьшения количества эритроцитов в осадке;
+ - слабо положительная - жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное
количество эритроцитов.
Отрицательная - полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно-розовую
окраску («лаковая кровь»).

32. Реакция иммунофлюоресценции: назначение, ингредиенты, постановка, учёт

результатов.
Назначение: первичная идентификация микроорганизмов (экспресс-диагностика).
Ингредиенты: исследуемый материал (культура), флуоресцентная сыворотка.
Постановка:
1) Прямая: исследуемый материал (культура) + флуоресцентная иммунная сыворотка =
инкубируют до двух часов при 37°С. Требуется большое количество меченых антимикробных
сывороток.
2) Непрямая: исследуемый материал (культура) + антиглобулиновая флуоресцентная
сыворотка = инкубируют до 2х часов при 37°С. Обходятся одной меченой сывороткой.
Вначале антиген связывают немеченной специфической сывороткой, а затем образованный
иммунный комплекс антиген-антитело дополнительно обрабатывают меченной ФИТЦ
антисывороткой, содержащей антитела против иммуноглобулина этого комплекса.
Общее:
На обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки,
а из органов и тканей - мазки-отпечатки. Препараты подсушивают, фиксируют, наносят на
них люминеспируюшую сыворотку, взятую в рабочем разведении, и помещают во влажную
камеру при температуре 37 °С на 20 - 30 мин. Затем для удаления избытка флюоресцирующих
антител препарат промывают в забуферном изотоническом растворе натрия хлорида в
течение 10 - 15 мин с последующим ополаскиванием в дистиллированной или проточной воде
в течение 10 мин. Сушат при комнатной температуре и исследуют люминесцентным
микроскопом с использованием масляной иммерсионной системы.
Учет результатов: желто-зеленое свечение комплекса АГ-АТ. Интенсивность
специфической флюоресценции оценивают по четырехплюсовой шкале:
++++ - очень яркая;
+++ - яркая;
++ - выраженная ободочная флюоресценция;
+ - слабое свечение клеток.

33. Полимеразная цепная реакция: назначение, ингредиенты, постановка, учёт

результатов.
Назначение:
 диагностика инфекций,
 диагностика онкологических заболеваний,
 геноидентификационная экспертиза,
 оценка гистосовместимости,
 диагностика наследственных заболеваний.
Ингредиенты:
 буферная система – смесь катионов и анионов, обеспечивающая оптимальные условия ля
работы ферментов, стабильное значение рН;
 ДНК-проба – обработанный анализируемый образец, содержащий искомую ДНК,
служащую мишенью для амплификации;
 Taq-полимераза – обеспечивает достраивание второй цепи ДНК, начиная с 3`-конца
праймера по принципу комплементарности;
 набор дезоксинуклеозидтрифосфатов;
 праймеры.
Постановка: проводят в амплификаторе; выполняется 20 - 35 циклов, каждый из
которых состоит из трех стадий.
 денатурация - двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96°C на 0,5 - 2 минуты,
чтобы цепи ДНК разошлись, разрушаются водородные связи между двумя цепями.
 отжиг - когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с
одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается
на 4 - 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 - 2 минут.
 элонгация - ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве
затравки. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Обычно время
элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После
окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы
достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.
Учет результатов: проводят с помощью электрофореза в агарозном геле: отрицательно
заряженные молекулы ДНК движутся в геле под действием электрического поля от катода к
аноду. ДНК в геле окрашивают бромидом этидия, что делает ее видимой в ультрафиолетовом
свете. Если в исследуемой пробе в результате ПЦР накопились
ампликоны (фрагменты ДНК одинакового размера), то они окажутся на одном расстоянии от
старта и будут видны как полоса на гелевой дорожке. Если положение полосы на гелевой
дорожке соответствует расчётной для использованной пары праймеров - результат
исследования положительный.
34. Реакция нейтрализации вирусов: назначение, ингредиенты, постановка, учёт
результатов.
Назначение: для выявления вирусов и различных токсинов.
Ингредиенты: исследуемый материал, антитела против токсинов.
Постановка: реакции основаны на способности антител связывать различные
возбудители или их метаболиты, лишая тем самым их возможности реализовать свои
биологические свойства (т.е. антитела нейтрализуют возбудителей). Проводят на
лабораторных мышах. 1-ой вводят исследуемый материал (контрольная группа); 2-ой –
исследуемый материал + антитела против токсина А; 3-ей - исследуемый материал + антитела
против токсина В; 4-ой - исследуемый материал + антитела против токсина Е.
Учет результатов: на эффективность нейтрализации указывает выживание животного
либо отсутствие гибели клеток в культурах. Первая мышка точно погибнет, из других может
кто-то выживет.

35. Реакция торможения гемагглютинации вирусов: назначение, ингредиенты,

постановка, учёт результатов.
Назначение: в серологической диагностике вирусных болезней.
Ингредиенты: антитела, вирусосодержащие жидкости, изотонический раствор натрия
хлорида, эритроциты.
Постановка: проводится в лунках пластмассовых пластин. Сыворотки в двукратно
снижающихся концентрациях разводят в изотоническом растворе натрия хлорида и
разливают по 0,25 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют равное количество
вирусосодержащей жидкости. Контролем является взвесь вируса в 0,85 % растворе натрия
хлорида. Планшеты со смесью сывороток и вируса выдерживают в термостате 30 мин или
при комнатной температуре 2 ч, затем в каждую из них добавляют по 0,5 мл 1 % взвеси
эритроцитов.
Учет результатов: учитывают после выдерживания планшета в течение 30 мин в
термостате или в течение 45 мин при комнатной температуре. Образуется плотный осадок
эритроцитов на дне лунки в виде диска или кольца с ровными краями. Титр антител
(максимальное разведение, которое вызвало задержку агглютинации эритроцитов)
определяют по последней лунке с положительной РТГА.
Рекомендуется ставить ее с парными сыворотками, одну из которых получают в начале
заболевания, а вторую спустя 1-2 недели. Увеличение титра антител в 4 раза и более во
второй сыворотке указывает на то, что заболевание вызвано предполагаемым вирусом.

36. Радиоиммунный анализ: назначение, ингредиенты, постановка, учёт результатов.

Назначение: биохимический анализ крови, гормоны, онкомаркеры, антигены
микроорганизмов.
Ингредиенты: неизвестный антиген; антитело, меченное радиоактивной меткой
(гамма).
 Постановка: неизвестный антиген + антитело, меченное радиоактивной меткой
(гамма).
 при конкурентном методе - на поверхности полистироловых лунок сорбируются
антитела. Затем к этим иммобилизованным антителам добавляется исследуемый материал,
содержащий специфический к ним антиген. После образования иммунного комплекса
добавляют меченый 125I антиген, обладающий той же специфичностью к иммобилизованным
в лунках антителам. Внесенный меченый антиген будет реагировать лишь с той частью
активных центров иммобилизованных антител, которые остались незаблокироваванными
антигеном исследуемого материала.
 непрямой метод РИА с использованием антивидовых меченых АТ. На поверхности лунок
сорбируют АГ, а затем добавляют разведенную сыворотку больного. При наличии в ней
соответствующих АТ на поверхности лунок формируется комплекс АГ-АТ. При
последующем введении в лунку антивидовой меченой сыворотки АТ, содержащиеся в ней,
адсорбируются на образовавшемся комплексе.
Учет результатов: в радиометрическом аппарате по интенсивности радиовспышки, что
говорит о концентрации.

37. Иммунноферментный анализ: назначение, ингредиенты, постановка, учёт

результатов.
Назначение: для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в
частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов,
ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ,
содержащихся в исследуемом материале.
Ингредиенты:
1) АГ (АТ) известное – на лунке планшета;
2) АТ (АГ) исследуемое;
3) АТ с ферментом, специфичное комплексу АТ-АГ;
4) хромогенный субстрат, взаимодействующий с фермент;
5) стоп раствор.
Постановка:
1. На поверхности лунок планшета находится очищенный антиген определенного
возбудителя. В них добавляется биологический материал пациента происходит
специфическая реакция между этим антигеном и искомым антителом (иммуноглобулином).
Образуется комплекс.
2. Добавляется конъюгант – АТ с ферментом. Конъюгант специфичен к комплексу АТ- АГ
первого этапа. Фермент активизируется.
3. Добавляется субстрат и активный фермент взаимодействует с ним, изменяя бесцветный
цвет раствора.
4. Добавляется стоп раствор для прекращения взаимодействия фермент-субстрат.
Учет результатов: желтый цвет раствора в лунке - положительный результат.
Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и
антител.

38. Реакция иммунного блоттинга: назначение, ингредиенты, постановка, учёт

результатов.
Назначение: диагностика инфекций (ВИЧ).
Ингредиенты: антитела, антигены.
Постановка: электрофорез белков сыворотки крови в геле. Затем на гель накладывают
нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану и выделенные антигены электрофорезом
переносят на блот (твердая поверхность), потом добавляют антитело и меченного конъюгата.
 Учет результатов: проводят авторадиографию с использованием рентгеновской
плёнки. При наличии в исследуемой сыворотке крови антител к ВИЧ на полоске-реплике в
определённых зонах, соответствующих отдельным антигенам, появляются окрашенные
полосы:
 полоска А — положительный контроль
 полоска В — слабоположительный контроль
 полоска С — отрицательный контроль
 полоска D — положительный образец (обнаружено присутствие антител к ВИЧ).