Модификация структуры и свойств

лактоферрина хлорноватистой
кислотой
Терехова М.С.1, Григорьева Д.В.1, Горудко И.В.1, Кохан А.Ю.1, Соколов А.В.2,3, Панасенко О.М.3, Семак И.В.1, Малюшкова Е.В.1, Черенкевич C.Н.1
государственный университет, Минск, Беларусь, aurtumn_frost@mail.ru; 1Белорусский
2 ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия; 3ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА, Москва, Россия

Научный руководитель – Горудко Ирина Владимировна, к.б.н., доцент, irinagorudko@gmail.com, каб. 107.
Пространственная
структура Лф, цветом

Введение
обозначена градация
полярности аминокислотных
остатков. Синий цвет –
полярные области, красный –
неполярные

Лактоферрин (Лф) представляет собой негемовый железосвязывающий гликопротеин, относящийся к

семейству трансферринов. Он обладает рядом полезных для организма свойств (антибактериальное,
противовирусное, фунгицидное и др.). Лф содержится в секрете экзокринных желез, молоке человека и
некоторых животных, во вторичных гранулах нейтрофилов. Концентрация Лф увеличивается в очагах
воспаления за счет секреторной дегрануляции нейтрофилов. Там Лф подвергается окислительной и OCl-
протеолитической деградации в результате действия активных форм кислорода и галогенов (АФК и АФГ), а Лф: HOCl – 1:100
также различных ферментов, что может повлиять на структуру и свойства молекулы.
До 2,6 мкМ

Нейтрофил
Выявить изменения структуры и Лф

Цель биологических свойств Лф при действии

одной из АФГ – хлорноватистой кислоты
(HOCl). Миелопероксидаза

Результаты Триптофан

• Изменение аминокислотного состава Флуорескамин Флуорофор

АФК
Лф HOCl
Интенсивность триптофановой флуоресценции Лф, отн. ед.

40 80

А Б
Интенсивность триптофановой

328 нм нативный Лф HOCl

1-анилино-8-нафталин сульфонат (АНС)
рЛф:HOCl - 1:50 70
флуоресценции, отн. ед.

1:10
35 рЛф:HOCl - 1:100 60
HOCl
50
1:20 При обработке Лф HOCl происходит Повреждение
30
40 уменьшение интенсивности флуоресценции В основном HOCl АФГ мишени
HOCl C= 25-50 мМ Патогены
25 30 1:50 триптофанилов на 91,4 ± 2,5 %, сдвига
20
20
спектра при этом не происходит. Это
10 1:100
0
свидетельствует о том, что триптофанилы
15
0 2 4 6 8 10 12 находятся на границе белковой глобулы и нативный Лф
Время, мин
10 разрушаются при действии HOCl. 1,0 Лф:HOCl
Рис. 1.
Интенсивность флуоресценции

(А) Спектры собственной триптофановой

5 флуоресценции Лф в нативном состоянии и
флуорескамина, отн. ед.

после модификации HOCl в различных молярных 0,8

соотношениях Обработка Лф HOCl приводит к
0 (Б) Типичная кинетика изменения Рис. 2.
300 320 340
Длина волны, нм
360 380 400
интенсивности триптофановой флуоресценции снижению интенсивности флуоресценции Типичная кинетика
Лф под действием HOCl 0,6 изменения
флуорескамина при связывании с Лф на интенсивности
флуоресценции
50,6 ± 5,4 %, что обусловлено флуорескамин

• Изменение конформации
флуорескамина в
0,4 присутствии
уменьшением числа первичных аминов нативного Лф и
модифицированного
(Lys, Arg) в составе белковой молекулы HOCl

45 *Альбумин за счет образования хлораминов. 0,2

40
*
Интенсивность флуоресценции

5 35
Интенсивность флуоресценции

Интенсивность 0,0
зонда АНС, отн. ед.

30

4
* 25
*
флуоресценции зонда
* 1:0
0 1 2 3 4 5
зонда АНС, отн. ед.

20 1:10

15
*
АНС, связанного с Лф, Время, мин
1:25
3 10
1:50 * модифицированным
*
1:0 1:10
5
[A. Del Giudice [et al]//
Молярное соотношение ЧСА: HOCl The J. of Phys. Chem. –
1:100
HOCl, уменьшается на
• Изменение железосвязывающей
2 2016. – Vol. 120 (48). –
1:20 * P. 12261-12271] 66,8 ± 2,1 %. Сопоставляя
1:25
полученные результаты
способности
1 1:50 *Лизоцим
1:100 с данными о лизоциме и
Лиз:HOCl - 1:10
Интенсивность флуоресценции

нативный Лиз
0
1,2

1,0
альбумине, видно, что
зонда АНС, отн. ед.

Молярное соотношение Лф:HOCl 0,8 действие HOCl вызывает 1,0

R2=0,99858
0,6
разворачивание глобулы 0,18
D465/ D465max, отн. ед.

0,8
0,4
Рис. 3. Изменение интенсивности флуоресценции зонда АНС при Лф. 0,16 0,6
Оптическая плотность D465 , отн. ед.

0,2
связывании с нативным Лф и модифицированным HOCl в 0,4
0,0
различном молярном соотношении белок:HOCl [С. L. Hawkins, M. Рис. 4
0,14 0,2
Кривая доза-эффект,
* – достоверно отличается от интенсивности флуоресценции 0 2 4 6 8 10 J. Davies // Chem.
АНС в растворе нативного Лф (p<0,05) Время, мин Res. Toxicol. – 0,0
-5,4 -5,2 -5,0 -4,8 -4,6 -4,4 -4,2 -4,0 -3,8
отражающая
2005. – V. 18. – P. 0,12 Log [Fe3+] изменение
1600-1610]
Связывание Лф с оптической
плотности раствора
0,10
ионами железа Лф от концентрации
связанных ионов

Выводы
0,08
кооперативно. железа в случае
нативного и
При действии HOCl 0,06 модифицированного
HOCl белка.
железосвязывающая 0,04
На вставке показана
Показано, что при действии HOCl молекула Лф в результате аппроксимация
способность Лф 0,02
нативный рЛф функцией «dose-

модификации аминокислотных остатков (уменьшение числа уменьшается

рЛф: HOCl - 1:100
response fit»

триптофанилов, модификация Lys, Arg) претерпевает (уменьшается число

0,00

0 20 40 60 80 100 120 140 160

значительные конформационные перестройки (разворачивание связанных Fe3+). Концентрация Fe , мкМ
3+

глобулы), что сопровождается уменьшением

железосвязывающей активности белка.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (17-04-00530 и 18-515-00004) и БРФФИ (Б18Р-058).