PCR en tiempo real

PCR y Alimentos

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Tcnicas de deteccin rpida y la empresa
Los mtodos tradicionales de control de calidad en las empresas alimentarias se basan en dos nicos procesos, la inspeccin visual y elanlisis microbiolgico del producto final, lo que lleva anexo una serie de desventajas:

No detectar en qu fase de la cadena de recepcin y/o produccin se produce la contaminacin microbiolgica o fsico-qumica del alimento. Se requiere un muestreo estadsticamente significativo, lo que supone la recogida de un importante nmero de muestras con las limitaciones econmicas y temporales que ello supone. En el caso de detectarse una anomala, debe desecharse todo el lote, con la consiguiente prdida financiera.

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Tcnicas de deteccin rpida y la empresa
El empresario asume una serie de responsabilidades que en ocasiones no le corresponden ya que algunos fallos pueden tener su origen en la mala calidad de las materias primas ofertadas por los proveedores. En muchos casos la industria tiene conocimiento de los problemas cuando el producto ya se halla en el mercado, lo que supone una mala imagen para la empresa y el peligro potencial de que el consumidor desconfe de esa casa comercial en el futuro.

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Tcnicas de deteccin rpida y la empresa
Las tcnicas de deteccin rpidas de microorganismos se Deben caracterizar por su:

su especificidad su alta sensibilidad su corto tiempo de anlisis, su capacidad de inclusin en sistemas integrados su facilidad de automatizacin, Su capacidad de trabajar en tiempo real. Su sencillez Integracin en un sistema HACCP

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Estas tcnicas pueden aplicarse adems de a la deteccin de microorganismos alterantes y patgenos (bacterias, hongos, levaduras, virus y parsitos). A:

trazabilidad alimentaria, anlisis de la composicin de los alimentos, permitiendo mejorara las caractersticas organolpticas de los mismos. estimacin de su vida til y grado de frescura, deteccin de fraudes alimentarios (ej., sustitucin de una especie animal por otra de menor valor econmico, presencia de harinas crnicas y de pescado en piensos, etc.) deteccin y cuantificacin de compuestos xenobiticos (ej., aditivos, frmacos, plaguicidas, fertilizantes, dioxinas, PCBs, metales pesados, etc.), deteccin componentes de los alimentos (ej., antinutrientes, alrgenos, grasas, etc.), deteccin de biotoxinas (ej., toxinas bacterianas, toxinas fngicas o micotoxinas y toxinas marinas)

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La deteccin rpida y especfica de
productos fuera de especificacin en la lnea de proceso, permite actuar de modo que los productos rechazados al final de la lnea de produccin sean menores, las prdidas son menores y por tanto se reducen los costes (al evitar errores y prdidas de tiempo, mejorar los procesos aumentando la productividad, etc.)

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El uso de stas tcnicas crea valor aadido al

producto al aumentar la diferenciacin (al mejorar la satisfaccin del cliente, la imagen de marca, etc.) , ya que incrementan la calidad y la confianza del consumidor en cuanto a Seguridad Alimentaria, aumentando as la competitividad de la empresa

La venta de lotes de productos contaminados se

reduce como as tambin los problemas con consumidores, problemas legales y mala publicidad. .

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1) Patgenos alimentarios
2) Alergias alimentarias

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Patgenos alimentarios
CALOR REFRIGERACIN DESECACIN CONGELACIN ADITIVOS QUMICOS CONSERVANTES

ALIMENTOS

PROTEINAS CARBOHIDRATOS GRASAS ACEITES FLORA INDIGENA

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ALIMENTO

Preparacin y homogeneizacin menos laboriosa

Homogeneizado Pre-enriquecimiento Enriquecimiento Selectivo Siembra Selectiva Diferencial Identificacin Presuntiva Identificacin Bioqumica Identificacin Serolgica

Aislamiento Rpido

Deteccin Rpida Identificacin Rpida

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Mtodos rpidos

MTODOS RPIDOS: Sistemas que reducen el tiempo y/o trabajo necesarios para:

La deteccin El aislamiento y/o la identificacin

De microorganismos

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Metodos rpidos

Desarrollo de inters en Mtodos Rpidos

Fung. 2000 Institute of Food Technologists

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Mtodos Rpidos: Preparacin de la muestra

Dilucin

Homogeneizacin

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Mtodos Rpidos: Siembra en Espiral

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Mtodos Rpidos: Contadores de Colonia

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Mtodos Rpidos: Medios Cromognicos

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Mtodos Rpidos: Miniaturizacin de Pruebas Bioqumicas

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Mtodos Rpidos: Pruebas Inmunolgicas

Inmunofluorescencia

Aglutinacin de Ltex

E.L.I.S.A

Separacin Inmunomagntica

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Mtodos Rpidos: Tcnicas Genticas

Hibridacin de cidos Nucleicos

PCR

Biosensores

PCR en tiempo real

Sistemas PCR cerrados

PCR en tiempo real Sistemas PCR cerrados

MUESTRA

DETECCIN

Salmonella E. Coli E. sakazakii 24 horas

Listeria sp y Listeria monocytogenes

48 horas

PCR en tiempo real Campylobacter

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Campylobacter jejuni is the most common cause of acute bacterial gastroenteritis in the United Kingdom and the rest ofthe developed world Conventional methods for the isolation and identification of campylobacters from food products require enrichment culture for up to 48 h and subculture to selective agar followed by phenotypic identification; this method takes up to 5 days in total to obtain a result

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Incidence of bacterial food-borne pathogens in poultry carcasses. Extracted from Federal Register (1996) Pathogen reduction; Hazard analysis and critical control point (HACCP) systems; final rule. 9 CFR pt. 304.USDA-FSIS. Fed. Regist. 61:38805-38989.

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The aim of this study was to develop a real-time PCR assay with the 5 nuclease system to target the open reading frame (ORF) C sequence specific for C. jejuni. The specificity and sensitivity for the detection and quantification of C. jejuni in naturally contaminated foods after 48 h of enrichment culture were investigated, and the results were compared with those of subculture to a selective agar medium.

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In June 2001, an outbreak of acute gastroenteritis among 109 attendees of a church picnic in Kerr County, Texas, was reported. A 5-nuclease PCR assay was used to screen for Salmonella in nine food items from the buffet line. Barbeque chicken B tested positive for Salmonella, and no amplification was detected in the remaining food items. These PCR findings were consistent with culture results and were confirmed by direct nucleotide sequencing. Salmonella enterica serotype Panama was cultured from both food and patient stool samples

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Nucleic acids were extracted directly from food samples For each of the nine food items tested, two samples, designated A and B, were obtained from different areas of the food container and used directly for PCR

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The specificity of this PCR assay was evaluated against 111 culturegrown Salmonella serotypes and cross-tested against a reference panel of 37 related bacterial strains and human genomic DNA.

The assay was shown to detect all 111 Salmonella strains, and no nonspecific amplification was observed in a cross-reaction panel. Sensitivity was determined by real-time PCR amplification of serial 10-fold dilutions of genomic Salmonella DNA. Amplification of target sequences was consistently detected in samples containing less than 100 fg of genomic Salmonella DNA

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Although the TDH isolated Salmonella from corn on the cob by culture, the sample submitted to Brooks AFB was negative by both culture and realtime PCR. According to epidemiological analysis, the OR for the corn on the cob was not statistically significant (OR = 1.26). These epidemiological data, along with culture and real-time PCR results from Brooks AFB, suggest the possibility of low-level cross contamination of this food item during preparation, or at the buffet during sample collection Because raw chicken is often contaminated with Salmonella, it is most likely that uncooked or partially cooked chicken was the original Salmonella source and that the beans and corn on the cob became contaminated by unsanitary cooking practices.

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1) Patgenos alimentarios

2) Alergias alimentarias

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Alergias alimentarias

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Alergias alimentarias

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Alergias alimentarias

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Alergias alimentarias

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Alergias alimentarias

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Alergias alimentarias

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Alergias alimentarias

Directiva EU 2003/89/EC Anexo III bis

Cereales que contienen gluten y productos derivados* Crustceos y productos de crustceos Huevos y productos a base de huevos Pescado y productos pesqueros Cacahuetes y productos a base de cacahuetes Soja y productos a base de soja Leche y productos lcteos (incluida la lactosa) Frutos de cscara y productos derivados** Apio y productos derivados Mostaza y productos derivados Granos de ssamo y productos derivados [Anhdrido sulfuroso y sulfitos] > 10 mg/kg 1o mg/L

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Alergias alimentarias
Intolerancia permanente al gluten ( enfermedad celiaca )
Enfermedad crnica intestinal que produce una atrofia de las vellosidades del intestino que conllevan a una mala absorcin de nutrientes

los

La enfermedad crnica intestinal ms frecuente en Espaa (1/380) Enfermedad infradiagnosticada Formas no tpicas de la enfermedad (1/150) Origen Reaccin de hipersensibilidad? Defecto hereditario de la mucosa?

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Gluten est formado por protenas de reserva:

Glutenas Prolaminas

Son las prolaminas de determinados cereales las que provocan intolerancia al gluten:
Gliadinas (Trigo) Secalinas (Centeno) Hordenas (Cebada) Aveninas (Avena)

Prolaminas no txicas
Orzenina (Arroz) Zeina (Maz)

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El soporte de la alergenicidad parece deberse a: al pocentaje de prolamina txica presente en el gluten:

Cereal Trigo Centeno Cebada Avena Borona Maz Arroz Sorgo Tipo de Prolamina Gliadina Secalina Hordeina Avenina Panicina Ziena Orzenina Kafirina Contenido en % 69% 30-50% 46-52% 16% 40% 55% 5% 52%

a un pptido que se encuentra repetido en las prolaminas

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Alergias alimentarias

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PCR
Mediante un nico ensayo se detectan todos los cereales que contienen gluten Sensibilidad: 0,001%=1 ppm

ELISA
ELISA (Trigo, centeno, cebada) ELISA (Avena) Sensibilidad: 3 - 5 ppm

Utilizacin de controles No requiere de pruebas confirmatorias

Falsos positivos Requiere de pruebas confirmatorias

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Secalina Gliadina Hordeina Avenina

Centeno Trigo Cebada Avena

PCR

ELECTOFORESIS

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