ESTANDARIZACIN DE UNA METODOLOGIA ANALITICA POR ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA PARA LA DETERMINACIN DEL HIDROXIMETILFURFURAL EN MIELES DE ABEJA STANDARDIZATION OF AN ANALYTICAL

METHODOLOGY FOR HYDROXYMETHYLFURFURAL DETERMINATION IN HONEY BY ULTRAVIOLET SPECTROMETRY Natalia HINCAPIE V.1*, Mnica J. LPEZ S.1, Catalina VICTORIA A.1 RESUMEN
En este trabajo se presentan los resultados del desarrollo y estandarizacin de una metodologa analtica para la determinacin del HMF en miel de abeja por la tcnica de espectroscopia de absorcin ultravioleta, UV. El procedimiento consiste en evidenciar la presencia de este aldehdo cclico con incrementos de temperatura, utilizando un mtodo de correccin de fondo, con medidas de absorbancia a longitudes de onda de 284 nm y 336 nm para la muestra y referencia respectivamente. Los resultados obtenidos son tratados de manera estadstica para hallar la linealidad, reproducibilidad, repetitividad, incertidumbre y sensibilidad del mtodo realizado como parmetro fundamental en un proceso de estandarizacin.

Palabras clave: Espectrofotometra ultravioleta, miel, hidroximetilfurfural, HMF, ABSTRACT

This work presents the results of development and standardization of analytical methodology for the determination of HMF in honey by means of ultraviolet absorption spectroscopy (UV). The procedure consists in evidence the presence of this cyclical aldehyde with increases in temperature, using a method of background correction, with measurements of absorbance at wavelengths of 284 and 336 nm for the sample and reference, respectively. The results are treated statistically to find the linearity, reproducibility, repititividad, uncertainty and sensitivity of the method performed as parameters in a process of standardization .

keywords: spectrophotometry ultraviolet, honey, hydroxymethylfurfural, HMF INTRODUCCION

Estudiantes, Facultad de Qumica Farmacutica, Universidad de Antioquia, Ciudad Universitaria, Calle 67 53-108. A.A. 1226, Medelln, Colombia * Autor a quien se debe dirigir la correspondencia: nathiva17@gmail.com

Desde el punto de vista composicional, la miel de abejas es bsicamente una solucin acuosa concentrada de azcar invertido, que contiene adems, una mezcla muy compleja de otros hidratos de carbono, diversas enzimas, aminocidos, cidos orgnicos, minerales, sustancias aromticas, pigmentos, ceras, granos de polen, entre otros. Los azucares son el componente mayoritario de la miel, representando, el 99-95% de la materia seca. La mayor parte de estos no se encuentran en el nctar, sino que se forman durante la maduracin y almacenamiento de la miel. Las numerosas propiedades biolgicas encontradas en la miel, la convierten en un producto complementario de la alimentacin humana y muy til en otros campos que nada tienen que ver con la alimentacin. La miel es considerada un producto natural por excelencia, sin embargo en los ltimos aos ha sufrido los efectos de la industrializacin y de la produccin agrcola. Los elementos objetivos de la calidad de la miel de abejas son extremadamente simples y se pueden reducir a tres fundamentales como son: La higiene: la miel de abejas no debe contener sustancias nocivas, su presencia se debe fundamentalmente a los tratamientos con sustancias qumicas, llevados a cabo durante su produccin. Genuinidad: la miel de abejas no debe adulterarse. Frescura: la miel debe mantener sus caractersticas naturales intrnsecas, su prdida se debe fundamentalmente a las prcticas de manejo en la colmena, los procesos de industrializacin con tratamientos trmicos excesivos y a las condiciones de temperatura y tiempo de almacenamiento. La miel comercializada, entre otras caractersticas de calidad, deber tener determinadas cualidades apreciables a simple vista por el consumidor que la distingan como son: limpieza, nitidez, fluidez, coloracin, homogeneidad y cristalizacin. El proceso de industrializacin de la miel, aunque es un proceso sencillo, presenta una serie de inconvenientes que pueden tener una gran repercusin en la calidad de la miel procesada, por tanto se hace un control exhaustivo de los tiempos y temperaturas de los

tratamientos industriales y del almacenamiento posterior, ya que no siempre estos son controlados con la rigurosidad necesaria, repercutiendo en la calidad final de las mieles comercializadas mermando en gran medida las propiedades beneficiosas de estas (1). El hidroximetilfurfural es un aldehdo cclico (HMF, vase Figura 1) que se origina espontneamente a partir de la fructuosa en medio acido (valor medio de pH 3.9) en un proceso lento. Este proceso es acelerado fundamentalmente por el calor: almacenamientos de pocos das a 50C tienen el mismo efecto sobre el aumento de HMF en miel que varios meses a 20C. Tambin los calentamientos para la licuefaccin o pasteurizacin de la miel elevan los niveles de HMF. El HMF no es una sustancia toxica, ni altera la miel a no ser que se encuentre en cantidad excesiva, lo que provocara el oscurecimiento de la misma por interacciones con compuestos aminados y azucares, sufriendo polimerizacin y reordenacin, tanto en presencia como en ausencia de oxigeno.

Figura 1. Estructura molecular del hidroximetilfurfural. Fuente: Biblioteca Digital de la Universidad de Chile. Sistemas de Informacin de Servicios y Bibliotecas. Disponibe en: http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apfisquim-farm11/c17.2.html. Entre otros parmetros la formacin de HMF esta correlacionado directamente con la humedad y contenido inicial de HMF en la miel. Tambin la acidez ejerce un efecto positivo en su formacin, comprobndose la existencia de una baja tasa de HMF en mieles calentadas debido a su ms alto pH (4.5-5.0). El aumento del contenido de HMF de la miel es un proceso paralelo a la degradacin de vitaminas, protenas y enzimas de este alimento, as como a la perdida de sabor y aroma por lo que se ha convertido en el mejor parmetro indicador de la frescura de la miel y permite

juzgar sus condiciones de procesado y almacenamiento (2). Una miel natural, recolectada en calentamiento particular, no contiene ms de 5 mg de HMF por Kilogramo, el recalentamiento, indispensable para la refundicin antes del acondicionamiento, por ejemplo, puede desarrollar algunos miligramos de HMF. Se deben tener en cuenta las condiciones de comercializacin, los tiempos y temperaturas de almacenamiento. En resumen la presencia de HMF en la miel es siempre reveladora de las degradaciones trmicas que sufri el producto y es un indicador muy importante de la calidad y de la frescura. As la norma tcnica colombiana (NTC) permite un mximo de 40 mg/Kg de HMF, valores superiores a este indican mieles viejas de baja calidad y/o excesivamente calentadas o adulteradas (3). El hidroximetilfurfural de determina por el mtodo propuesto por White basado en utilizar dos porciones alcuotas de la muestra previamente clarificada mediante la adicin de reactivos Carrez y posterior filtracin. Una de ellas, a la que se le adiciona 5 ml de agua destilada, se lee frente a la otra, a la que se aade igual volumen de solucin de bisulfito de sodio el cual hace desaparecer la absorcin debida al hidroximetilfurfural por rotura del doble enlace conjugado, con lo que otras absorbancias inespecficas son corregidas (4). DESARROLLO EXPERIMENTAL Materia prima El presente estudio se ha realizado con miel procedente de Carmen de Bolvar la cual es distribuida por productos alimenticios el Alpolen. Equipos Espectrofotmetro Agilent serie 8453 UV-VIS. Mewlett Packard. Rango de longitud de onda 190-1100nm. Balanza analtica Sartorius CP2245. Bao mara Memmert

Material volumtrico Tubos de ensayo Embudos Celdas de cuarzo Papel filtro Whatman Reactivos y soluciones Agua para anlisis Etanol Solucin de ferrocianuro de potasio (Carrez I) Solucin de acetato de zinc (Carrez II) Solucin de bisulfito de sodio Preparacin de las soluciones Solucin Carrez 1: pesar 15 g de Ferrocianuro de potasio, transferir a un baln volumtrico de 100 ml, aforar con agua destilada. Solucin Carrez II: Pesar 30 g de Acetato de zinc, transferir a baln volumtrico de 100 ml, aforar con agua destilada. Solucin de Bisulfito de sodio: Pesar 0.20 g de bisulfito de sodio, adicionar 100 ml de agua destilada. Determinacin del Hidroximetilfurfural Se pesan 5 gramos de muestra de miel, a los cuales se le agregan 25 mL de agua destilada, agitando para lograr total disolucin de la miel, transferir esta solucin a un baln volumtrico de 50.0 mL. Adicionar luego 0.5 mL de solucin Carrez I y mezclar, a continuacin agregar 0.5 mL de solucin Carrez II y mezclar. Estas soluciones se utilizan para eliminar la turbidez. Se pueden agregar gotas de etanol para suprimir la espuma si se requiere. Aforar con agua hasta completar 50 ml.

Agitar y filtrar el contenido del baln con papel de Whatman. Los primeros 10 ml del filtrado son eliminados, y el resto se colecta para su respectivo anlisis. Se toman dos tubos de ensayo: Colocar 5 ml del filtrado en cada uno de los dos tubos de ensayo, agregar al contenido de uno de los tubos de ensayo 5 ml de solucin de bisulfito de sodio y al otro tubo de ensayo agregar 5 ml de agua destilada. El bisulfito de sodio destruye el HMF, por lo que el contenido del primer tubo se usa como solucin de referencia para medir la absorbancia. El contenido del segundo tubo constituir la solucin de muestra a medir. Nota: una vez agregado el bisulfito de sodio leer inmediatamente, ya que este fuera de reducir el HMF puede reducir otras sustancias presentes en la miel. Colocar las soluciones en celdas de 1 cm y medir la absorbancia a 284 y 336 nm para muestra y estndar respectivamente, correspondientes a las longitudes de onda del espectro de luz UV. Si la absorbancia de la solucin de muestra es mayor de 0.6, diluirla con agua y diluir la solucin de referencia con solucin de bisulfito de sodio al 0.1% en la misma proporcin y corregir la absorbancia para esa disolucin. Por ltimo se determinan los miligramos de HMF presentes en la muestra. (mg/Kg). Todo el procedimiento de la metodologa se realiz por triplicado sometiendo la muestra a diferentes temperaturas y los respectivos resultados fueron analizados (4). Anotaciones al mtodo Antes de proceder con el desarrollo de la metodologa se verifica la idoneidad del sistema analtico. El material volumtrico y el instrumental empleado se calibran debidamente. Para evaluar el incremento del Hidroximetilfurfural con la temperatura, una cantidad suficiente de muestra se somete a la temperatura que se va a analizar durante un tiempo de 45 minutos con agitacin de la misma cada 10 minutos para

garantizar la transferencia de calor en toda la muestra; esta se enfra y se procede con la metodologa anteriormente descrita. A la solucin de referencia inmediatamente se le adicione la cantidad de bisulfito establecida por el mtodo realizar la lectura de la absorbancia. Antes de proceder con la lectura de absorbancia tanto de la muestra como la de la referencia se deben someter las celdas de cuarzo a un proceso de lavado con una mezcla sulfocrmica para evitar posibles interferencias y obtencin de resultados negativos. La metodologa utilizada es un mtodo de correccin de fondo, por lo cual no necesita un blanco para realizar las lecturas de absorbancia; en caso tal que el equipo necesite ste, se utilizar agua destilada para tal fin. Para lograr reproducibilidad y repetibilidad en el mtodo se debe tener cuidado con el manejo del material volumtrico, para que no se vean afectados tales parmetros.

Clculo para determinar el contenido de HMF en la muestra Calcular la cantidad de Hidroximetilfurfural (HMF) en la miel con los datos de absorbancia a 284 nm (A284) y 336 nm (A336), usando la siguiente frmula: (4)

Factor = 14.97 = (126/16,830) (1000/10) (100/5). Donde: 126 = peso molecular del HMF 16,830 = absortividad molar () del HMF a 284 nm. 1000 = mg/g 10 = centilitros/L 100 = g de miel reportados 5 = peso nominal de la muestra. Los resultados son expresados en mg/Kg, con una cifra decimal.

RESULTADOS Y DISCUSIN Con la ecuacin arriba presentada se calcularon los miligramos de HMF que aparecen en la tabla 1, que corresponden a los obtenidos por cada analista a diferentes temperaturas. Los resultados obtenidos del anlisis de HMF en miel, son tratados con Excel 2007, para hallar los parmetros de desviacin estndar, coeficiente de variacin y la ecuacin de la recta. Tambin se usa Start Grafic Plus 5.1, ste para hacer las comparaciones muestrales, en procura de obtener las tablas de ANOVA y el grfico de caja y bigotes. Todos los anlisis son aplicados con un grado de confiabilidad de 95 %. Se compararon los resultados obtenidos por los tres analistas los cuales se presentan en las figuras 1, 2 y 3, de all se sacaron: los coeficientes de correlacin (R2), las pendientes de las curvas (B) y los interceptos (A) y stos aparecen de manera resumida en la figura 4 y en la tabla 2 con sus respectivas medias, desviaciones estndar y coeficiente de variacin.

Tabla 1. Miligramos de HMF obtenidos por cada uno de los analistas a diferentes temperaturas.
Temperatura Analista 1 mg HMF 25C 31,838 31,853 31,853 35,0768 45C 36,3029 35,8394 37,9705 55C 38,5692 37,761 39,0978 65C 39,6365 39,6215 42,41 75C 42,3053 42,3202 45,0312 85C 44,4925 45,0462 Analista 2 mg HMF 31,7326 31,8673 31,7925 36,6194 36,1261 36,8436 38,2445 38,5888 38,7235 39,5048 39,1911 39,0865 42,6068 42,3225 42,3973 44,7757 45,2095 44,8205 Analista 3 mg (HMF) 31,8023 31,8772 31,6976 36,9748 36,7803 36,885 38,0385 38,0984 37,9188 39,5899 39,9786 39,9637 42,2636 42,1141 42,4729 45,1877 44,9034 45,1428

Figura 1

Figura 2

Figuras 1 y 2. Resultados obtenidos por los analistas, 1y 2 respectivamente

Grfico X-Y Mltiple

Figura 3

46 43 40 37 34 31

46 43 40 37 34 31 25

Figura 4

Variables CURVA 1 CURVA 2 CURVA 3 CURVA 4 CURVA 5 CURVA 6 CURVA 7 CURVA 8 CURVA 9 55 65 75 85

35

45

TEMPERATURA EN C Figuras 3. Resultados obtenidos por el analista, 3 . Figura 4. Resumen de todos los resultados de los tres analistas, y all se puede observar que dichos resultados no se encuentran muy dispersos entre s.
Tabla 2. Magnitudes halladas por cada analista, de los parmetros: coeficiente de correlacin (R2), el intercepto (A) y la pendiente (B). Al final (fila de total) se presenta la media (X), la desviacin estndar (S) y el coeficiente de variacin (CV) de cada parmetro.
R2
ANALIST A1 ANALIST A2 ANALIST A3 TOTAL 0.982 0.990 0.989 0.994 0.976 0.992 0.993 0.983 0.983 25.75 26.56 26.43

A
26.82 26.88 26.81 26.11 26.39 26.64 0.219 0.211 0.215

B
0.206 0.214 0.208 0.216 0.206 0.211

X= 0,987; S= 0,00613; CV=0.62%

X= 26,43; S= 0,340; CV=1.29%

X= 0.212; S= 0,0046; CV= 2,16%

Para comparar dichos estadgrafos, se aplic el test de ANOVA, planteando las siguientes hiptesis:

1. Hiptesis nula: los tres analistas trabajaron de manera igual 2. Hiptesis alternativa: los tres analistas trabajaron de manera diferente

Los resultados del test aparecen (vase tabla 3)

Tabla3. ANOVA para los tres estadgrafos: coeficientes de correlacin, pendientes e interceptos de las curvas, donde GL son los grados de libertad y CM son los cuadrados medios.
Fuente Entre grupos Intra grupos Total ANOVA para comparacin de la pendiente Entre grupos Intra grupos Total ANOVA para comparacin del intercepto Entre grupos
Intra grupos Total

Suma de cuadrados 0,0000722 0,0002287 0,0003009 0,00001756 0,00015 0,00016756 0,307222

0,789133 1,09636

GL 2 6 8 2 6 8 2
6 8

CM 0,00003611 0,00003811

Cociente F

Valor P

ANOVA para comparacin de R2

0,95

0,4398

0,00000878 0,000025 0,35 0,7175

0,153611
0,131522

1,17

0,3729

ANLISIS DE LA REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD Las ANOVAs que fueron presentadas antes, y particularmente los valores p de las pruebas, confirman la hiptesis nula de igualdad en los resultados reportados por los tres analistas. De modo que no hay diferencia estadsticamente significativa entre esos resultados, con un grado de confiabilidad del 95 %. Con esto se puede decir, que la reproducibilidad del mtodo es adecuada bajo las condiciones de trabajo realizado y que los resultados obtenidos siempre sern similares. La reproducibilidad y repetibilidad fue analizada como funcin de la dispersin entre los resultados obtenidos por cada uno de los analistas y de todos ellos a cada temperatura. Para ello, se aplic el clculo de desviacin estndar y coeficiente de variacin a cada temperatura en la que se trabaj. (Vase tabla 4.) Y de manera grfica el CV (Vase la figura 5.) En la figura 6 se presenta el grfico de caja y bigotes para los resultados reportados a 45 0C que es la temperatura a la que se dio la mayor dispersin en los datos.
Tabla 4. Magnitudes de las medias y de algunos valores de dispersin: desviacin estndar (S) y coeficiente de variacin (CV).

Temperatura en 0C
25 45 55 65 75 85

Media
31,8126 36,3831 38,2126 39,5189 42,3569 44,9566

S
0,062459816 0,62271469 0,339660175 0,33736391 0,138412147 0,233210326

CV
0,19633665 1,7115472 0,88887009 0,85367666 0,32677566 0,51874534

Figuras 5. Se grafican las magnitudes de CV a diferentes temperaturas

Grfico de Caja y Bigotes

35

35,4

35,8

36,2

36,6

37

T 45 Figura 6. Caja y bigotes para los resultados reportados a 45 0C.

En la figura 5 se observa que el valor mayor para CV es el obtenido a 45 0C, concordando con la figura 4 en la que tambin se puede observar una mayor dispersin a esa temperatura. Sin embargo el CV no llega al 2% que es el valor lmite para este estadgrafo reportado por algunos autores; incluso otros aceptan hasta un CV de 5 %. Para ampliar el

anlisis, en la figura 6 se presenta el grfico de caja y bigotes a 45 0C, en el cual se observa una ligera asimetra del lado izquierdo pero ningn dato atpico. Por esto, se puede decir que el mtodo es reproducible con un CV mximo de 1.71 % a las condiciones del laboratorio. ANLISIS DE LA LINEALIDAD Partiendo de que todos los resultados reportados por los tres analistas deben ser tenidos en cuenta ya que no hay datos atpicos y todos ellos son similares con una confianza de 95%. Con esto se calcula la relacin de linealidad entre concentracin de HMF en mg y temperatura en grados centgrados; encontrndose un R2 = 0.987 0.018 para un grado de certeza de 95%. La figura 7 presenta las magnitudes de los R2, y como se puede observar ninguno de ellos tiene un valor estadsticamente diferente a los dems.

G rfico de Caja y Bigotes

0,97

0,974

0,978

0,982

0,986

0,99

0,994

R2 todos Figura 7. Caja y bigotes para las magnitudes de R2

Ecuacin de la recta De la tabla 1, asumiendo que la pendiente, el intercepto y el coeficiente de correlacin tienen una distribucin normal, teniendo en cuenta que la ecuacin de la recta es: y = bx + a; se obtiene para anlisis de HMF en miel con la correccin de fondo y la lectura hecha a la longitud de onda y segn el procedimiento descrito, la siguiente ecuacin: mg HMF = (0,2120,0138) * T + 26,431.02mgHMF con R2 = 0.987 0.018 Donde la temperatura (T) es en 0C. CONCLUSIONES

Se encontr reproducibilidad adecuada con la que se puede asegurar resultados similares cada vez que se realiza el mtodo. De igual manera, tambin se considera que la repetibilidad es aceptable, ya que ningn resultado reportado es atpico. Hay una relacin lineal directa (R2= 0.987), entre el incremento de temperatura y la concentracin de hidroximetilfurfural presente en la muestra de miel; resultado que lleva a concluir que a mayor temperatura de conservacin de la miel, habr mayor cantidad de ese derivado de degradacin. La temperatura a la que se encontr mayor dispersin entre los datos, manifestado por mayor magnitud en el valor del CV, fue a 45 0C, cuyo valor fue de 1.71 %. Por lo que esa es la incertidumbre del mtodo aplicado bajo las condiciones propias del laboratorio; estando dentro de lo permitido. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen a Jhon Fredy Urrego, profesor de laboratorio de anlisis de alimentos y bromatologa por su ardua colaboracin, a la profesora Rosario Echeverry, tcnica y coordinadora del laboratorio de anlisis de alimentos y bromatologa por facilitar los equipos e instalaciones requeridos para el desarrollo de dicha estandarizacin. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Visquert M, Escriche I, Andrs A, Fito P. Cambios en parmetros de la calidad de la miel ocasionados por los procesos trmicos. Aliment. equipos tecnol. 2004; 23(188): 87-92. 2. Sanz Cervera S, Sanz Cervera MM. ndice de diastasas y contenido en Hidroximetilfurfural en las mieles de la Rioja. Zuba. [base de datos] 1994 [citado 2009 Abr 20]; 12: 10 pantallas. Disponible en: http://dialnet.unirioja.es/servlet/revista? tipo_busqueda=CODIGO&clave_revista=1493 3. ICONTEC. Norma Tcnica Colombiana NTC 1273 [base de datos] Bogot: ICONTEC; 1998. [acceso 24 de abril de 2009]. Disponible en: http://infomed.udea.edu.co/icontec/TecnologiaAlimentos/NTC1273.pdf 4. Clarke M.A. Ed. Sugar and sugar products. En: Cunniff P. Official methods of analysis of AOAC International. 16a ed. Garthersburg, Maryland: AOAC International; 1996. p. 44-144-43.