Captulo XIII - Carnes e Produtos Crneos

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CARNES E PRODUTOS CRNEOS

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Carnes

enominam-se carnes as partes musculares comestveis das diferentes espcies de animais de aougue, manipuladas em condies higinicas e provenientes de animais que ao abate se apresentam em boas condies de sade, certificados por mdico veterinrio responsvel pelo servio de inspeo. As carnes frescas ou in natura devero ser entregues ao consumo conservadas sob refrigerao, sendo avaliadas quanto sua segurana higinico-sanitria, classificao, presena de conservadores, caractersticas fsico-qumicas, microscpicas, microbiolgicas e sensoriais. A composio da carne depende da espcie animal, raa, sexo, maturidade, regime alimentar e localizao anatmica do msculo, entre outras caractersticas. Em geral, a carne contm aproximadamente 75% de seu peso em gua (com variao de 65 a 80%). As protenas representam 19% (com variao de 16 a 22%) e so um dos componentes mais importantes no aspecto nutricional. As substncias nitrogenadas no proticas (ATP, ADP, IMP, NAD, NADP, creatina, aminocidos livres etc.) totalizam 1,5%. O contedo lipdico da carne muito varivel, entre 1,5 e 13%. O teor de carboidratos baixo, variando de 0,5 a 1,3% do peso. Alm disso, as carnes contm numerosos compostos inorgnicos que, somados, totalizam 1%. As determinaes de umidade (012/IV), protenas (036/IV ou 037/IV), carboidratos (041/IV), cinzas (018/IV), gorduras (032/IV), gorduras saturadas (053/ IV), sdio (cap. XXIII) e colesterol so procedentes em estudos nutricionais, composio para formulaes e rotulagem. Eventualmente, pode tornar-se pertinente determinar o valor de pH (017/IV), a presena de aditivos como: fosfatos (031/IV), corantes artificiais (051/IV) e nitritos, bem como a presena de resduos de pesticidas (cap. XX), hormnios e antibiticos, a pesquisa de substncias anti-oxidantes,
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como sulfitos, utilizados para mascarar processos de alterao que a carne sofre durante a estocagem (deteriorao) e de contaminantes inorgnicos como arsnio, estanho e chumbo (cap. XXIII). As carnes e seus derivados esto sujeitos a alteraes por reaes qumicas, fsicas e microbiolgicas. As alteraes fsicas e qumicas decorrem principalmente da modificao e/ou degradao de protenas e lipdios, que provocada tanto pela ao de agentes naturais, por exemplo, o oxignio, como por enzimas hidrolticas endgenas naturalmente presentes na carne e ainda por outras substncias (enzimas, peptdios, aminas etc.) produzidas por microrganismos. A decomposio dos aminocidos sulfurados da carne, com desprendimento de compostos de enxofre, poder ser avaliada qualitativamente pela reao de ber para gs sulfdrico (004/IV). A reao de ber para amnia (005/IV) poder ser utilizada para evidenciar o incio das alteraes deteriorativas das carnes. Alm da ao enzimtica, a deteriorao tambm pode resultar de reaes oxidativas, como, por exemplo, a oxidao lipdica, que uma alterao dependente da disponibilidade de oxignio, da temperatura de armazenamento e da composio do msculo, evidenciada qualitativamente pela reao de Kreis (279/IV). As condies higinico-sanitrias dos estabelecimentos processadores, manipuladores, distribuidores e comerciais tambm so fatores de destaque na determinao da aceitabilidade das carnes, pois estas oferecem condies favorveis para o crescimento de bactrias, sendo importantes tanto as deteriorativas como as patognicas, que podem chegar ao produto pela inadequada manipulao. Portanto, todos esses aspectos podero comprometer as caractersticas sensoriais, assim como a qualidade nutricional e microbiolgica das carnes. Preparo da Amostra Retire pores de vrias regies da pea, sem grandes vasos, ossos, peles, tecidos adiposos e aponevroses, tendo, entretanto, o cuidado de no descaracterizar a amostragem. Homogeneze passando o material trs vezes em moedor de carne, utilizando disco de 3 mm de dimetro. Misture bem aps cada moagem. Alternativamente, utilize um processador de alimentos para o preparo da amostra. Particular ateno deve ser dada a certos tipos e/ou cortes de carne, para assegurar distribuio uniforme de gordura e tecido conjuntivo na moagem, sempre objetivando que a amostragem represente realmente a pea inicial ou amostra recebida. A cada intervalo, reincorpore com auxlio de esptula a gordura aderida superfcie do equipamento e o tecido conjuntivo preso nas facas. Utilize amostra representativa com peso de 200 g. Coloque a amostra em frasco hermeticamente fechado. De preferncia, comece imediatamente todas as determinaes. Se houver alguma interrupo, mantenha a amostra sob refrigerao para inibir a decomposio. Guarde a 5C por at 24 h ou congele a amostra a -18C. No momento da pesagem, ho506 - IAL

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mogeneze reincorporando a possvel separao de lquido, gelatina ou gordura. Caractersticas Sensoriais O exame sensorial da aparncia, textura, odor e sabor de grande importncia, pois so essas caractersticas as que mais se alteram no incio da deteriorao das carnes. Aparncia Prpria de cada espcie, uniforme, sem acmulo sangneo, sem corpos estranhos e sem presena de limo na superfcie. A gordura deve ser de uma tonalidade que varia de branca a amarela e no deve apresentar pontos hemorrgicos. A cor das carnes deve ser uniforme, sem manchas escuras ou claras, variando nas espcies bovina e bubalina, do vermelho-escuro ou pardacento ao vermelho-cereja ou claro; na espcie suna, a superfcie de corte dever apresentar-se com uma aparncia marmrea (em diferentes nveis ou intensidades), sem flacidez e no exsudativa, apresentando matizes de vermelhorosado-escuro (carne suna escura, firme e seca Tipo DFD) ou vermelho-rseo (carne suna fresca) a rseo-plido ou esbranquiado (carne suna plida, mole e exsudativa Tipo PSE). Nos eqinos e muares, seu tom vermelho-escuro, enquanto nas aves varia de amarelo-avermelhado ao amarelo-esbranquiado. Essas coloraes podem tambm ser relacionadas ao frescor e ao tempo de exposio do corte ao ambiente, pois medida que o corte envelhece h escurecimento da superfcie, que se torna progressivamente escura ou acinzentada, podendo apresentar iridicncia ou coloraes esverdeada e azulada, pela ao de microrganismos. Textura A textura da carne normalmente firme, compacta, elstica e ligeiramente mida. A gordura deve mostrar-se firme ao tato. No incio da putrefao, a superfcie torna-se viscosa ou limosa e a carne perde a firmeza. Odor As carnes frescas devem apresentar um odor suave, agradvel e caracterstico de cada espcie, tornando-se amoniacal, sulfdrico e depois ptrido, quando em estado de deteriorao. A gordura tambm deve ter odor suave e caracterstico, sendo indicativos de alterao os odores modificados ou o odor a rano. O odor da carne suna tende a ser mais intenso em animais inteiros (odor espermtico), sendo mais perceptvel quando a carne aquecida (276/IV), o que facilita o desprendimento e, portanto, a percepo dos odores imprprios ou alterados. Sabor Suave e caracterstico, prprio de cada espcie. O sabor varia consideravelmente segundo a espcie, raa, idade e regime alimentar do animal. Um complexo conjunto de substncias qumicas responsvel pelo sabor da carne.

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276/IV Prova de coco A prova de coco auxilia na determinao das alteraes das caractersticas sensoriais de aparncia, odor, textura e sabor, sendo utilizada para carne fresca, carne cozida e produtos crneos. O aquecimento da amostra facilita o desprendimento de vapores e, portanto, a percepo de odores imprprios ou alterados. Fundamenta-se na observao das modificaes de textura, odor e sabor ocorridas nos alimentos em incio de decomposio, ressaltadas quando a amostra submetida ao aquecimento. Material Bico de Bnsen, chapa aquecedora ou banho-maria, balana semi-analtica, bquer de 250 mL e vidro de relgio. Procedimento Utilize amostra moda devidamente homogeneizada. Em um bquer de 250 mL, coloque aproximadamente 20 g de amostra, cubra com gua e tampe com vidro de relgio. Aquea at o incio dos primeiros vapores, destampe e perceba o odor dos vapores produzidos. O odor amoniacal ou sulfdrico facilmente identificado. Ferva por mais 5 minutos e observe as caractersticas da carne e do caldo. O sabor deve ser prprio e a textura firme. Referncia bibliogrfica BRASIL. Ministrio da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuria. Laboratrio Nacional de Referncia Animal. Mtodos analticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes. II Mtodos fsicos e qumicos. Braslia (DF), 1981. cap. I, p. 2. 277/IV Prova para sulfito com verde de malaquita Baseia-se na mudana de cor do corante orgnico verde de malaquita na presena de anidrido sulfuroso e de sulfitos. Material Balana semi-analtica, esptula, cpsula de porcelana e pipeta graduada de 1 mL. Reagente Soluo de verde malaquita a 0,02% m/v
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Procedimento Pese 3,5 g da amostra em cpsula de porcelana. Acrescente 0,5 mL da soluo de verde malaquita. Misture com o auxlio de esptula por 1 a 2 minutos. A presena de sulfito na amostra descora a soluo de verde malaquita. Na ausncia de sulfito, a amostra adquire uma colorao verde azulada. Nota: esta reao tambm positiva para outros agentes redutores. No caso de positividade realize teste confirmatrio (049/IV) ou (050/IV). Referncia bibliogrfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 268-269. 278/IV Prova para nitritos Nitritos de sdio ou de potssio so conservadores usados em produtos crneos. Esto relacionados com a obteno de cor e sabor e com as atividades antioxidante e antimicrobiana, contudo, proibidos em carnes frescas e congeladas. Demonstrou-se que os nitritos reagem com certas aminas formando as nitrosaminas, substncias potencialmente cancergenas. No organismo infantil, os nitritos interagem com a hemoglobina afetando o transporte de oxignio, resultando em condio patolgica denominada metemoglobinemia. A determinao qualitativa da presena dos nitritos em carnes frescas ou congeladas feita pela reao de Griess-Ilosvay. Baseia-se na reao de diazotao dos nitritos com cido sulfanlico e copulao com cloridrato de alfa-naftilamina em meio cido, formando o cido alfa-naftilamino-pazobenzeno-p-sulfnico, de colorao rsea. Material Tubos de ensaio de 25 mL, papel de filtro qualitativo e pipetas graduadas de 1 e 10 mL. Reagentes Soluo de cido sulfanlico Pese 0,5 g de cido sulfanlico e dissolva em 150 mL de soluo aquosa de cido actico (1+4). Soluo de cloridrato de alfa-naftilamina Dissolva 0,4 g de cloridrato de alfa-naftilamina em 150 mL de cido actico (1+4). Se no dissolver bem, aquea, deixe em repouso e decante ou filtre em algodo.

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Procedimento Faa um macerado da amostra com gua e filtre. Em um tubo de ensaio, pipete 10 mL do filtrado, adicione 1 mL da soluo de cido sulfanlico e agite. Adicione 1 mL de cloridrato de alfa-naftilamina e agite fortemente. Em presena de nitritos, haver formao de colorao rsea mais ou menos intensa, dependendo da quantidade de nitrito que foi adicionada. Nota: amostras que possuem nitrito em excesso produzem com o reativo de Griess-IIosvay uma colorao vermelha fugaz, que passa a amarela-parda como se fosse prova negativa. Referncias bibliogrficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985. p.100-101. BRASIL. Ministrio da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuria. Laboratrio Nacional de Referncia Animal. Mtodos analticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes. II Mtodos fsicos e qumicos. Braslia (DF),1981. cap. I, p. 5-6. Produtos crneos Os produtos crneos so preparados com carnes de animais de aougue, sadios e abatidos sob inspeo sanitria, ou outros tecidos animais comestveis, submetidos a processos tecnolgicos adequados, crus ou cozidos. Os produtos so classificados segundo a forma, o tamanho, o sistema de acondicionamento, o processo ou a tcnica de fabricao e condimentao. As caractersticas sensoriais de aparncia devem ser prprias e a superfcie deve apresentar-se com caractersticas tpicas para cada produto. Modificaes como superfcie mida, limosa, sebosa, pegajosa ou viscosa indicam alterao. O invlucro no deve estar danificado. O produto deve traduzir a utilizao de tecnologia adequada para a sua elaborao. A colorao deve ser uniforme e caracterstica, rsea no produto curado cozido e avermelhada no curado cru, sem manchas ou alteraes (esverdeada ou pardacenta) da cor caracterstica. A consistncia deve ser prpria, com maior ou menor firmeza conforme o tipo de produto. O odor e o sabor devem ser caractersticos e a parte gordurosa no deve apresentar-se com odor ou sabor a rano. As determinaes usuais so, entre outras, pH (017/IV), umidade (012/ IV), protenas (036/IV ou 037/IV), carboidratos (041/IV), cinzas (018/IV), gorduras (032/ IV), gorduras saturadas (053/IV), colesterol, sdio (cap. XXIII), cloretos em cloreto de sdio (028/IV ou 029/IV), corantes artificiais (051/IV), reao de ber para amnia (005/ IV), prova de rancidez nas partes gordurosas, amido, hidroxiprolina, prova para formaldedo, conservadores nitritos e nitratos e protenas de soja. 279/IV Reao de Kreis
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A prova para rano na gordura pela reao de Kreis vlida para produtos crneos e partes gordurosas de carnes. Rancidez o nome que se d s alteraes no odor e no sabor dos leos e gorduras. A floroglucina reage em meio cido com os produtos de oxidao dos triglicerdios, resultando em composto de condensao de colorao rsea ou vermelha, cuja intensidade proporcional oxidao. Material Rotavapor, balana semi-analtica, papel de filtro, frasco Erlenmeyer de 500 mL com boca esmerilhada e tampa, balo de fundo chato de 300 mL com boca esmerilhada, proveta de 150 mL, proveta de 50 mL com boca esmerilhada e tampa, pipeta de 5 mL, funil e papel de filtro qualitativo. Reagentes ter cido clordrico Soluo de floroglucina em ter a 0,1% m/v Procedimento Separe cerca de 30 g das partes gordurosas da carne ou 100 g do produto crneo previamente triturado. Transfira para um frasco Erlenmeyer de 500 mL. Adicione de 100 a 150 mL de ter e deixe em contato, ao abrigo da luz e calor, por uma noite. Filtre a mistura atravs de papel de filtro para um balo de fundo chato de 300 mL. Evapore o filtrado em rotavapor sob vcuo temperatura mxima de 40oC. Transfira, com auxlio de uma pipeta, 5 mL da gordura fundida (resduo do balo) para uma proveta de 50 mL. Adicione 5 mL de cido clordrico, tampe e agite por 30 segundos. Adicione 5 mL de soluo de floroglucina, tampe e agite novamente por 30 segundos. Deixe em repouso por 10 minutos. Na presena de rano, a camada inferior apresentar uma colorao rsea ou vermelha. Nota: se a intensidade da colorao for fraca, compare a camada inferior com uma soluo de permanganato de potssio a 0,0012% (3,8 mL de uma soluo 0,002 M diluda para 100 mL). Se a intensidade for a mesma, ou inferior, pode-se deixar de levar em considerao o resultado, contanto que as caractersticas sensoriais do produto sejam satisfatrias.

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Referncia bibliogrfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP 1985. p. 260. , 280/IV Prova para formaldedo O formaldedo considerado uma substncia conservante de material biolgico. Sua adio proibida em alimentos. A floroglucina reage com o formaldedo em meio alcalino produzindo o derivado hidroximetilado, de colorao salmo fugaz. Material Balana semi-analtica, aquecedor eltrico, condensador de Liebig, balo de Kjeldahl de 600 mL, proveta de 100 mL, frasco Erlenmeyer de 200 mL, tubos de ensaio, pipetas graduadas de 1, 2 e 5 mL. Reagentes Soluo de cido fosfrico a 20% v/v Soluo de floroglucina (C6H6O3) a 1% m/v Soluo de hidrxido de sdio a 10% m/v Procedimento Pese cerca de 10 g da amostra, previamente triturada e homogeneizada em bquer. Transfira para balo de Kjeldahl com auxlio de 80 mL de soluo de cido fosfrico a 20%. Ligue o balo ao conjunto de destilao de Liebig. Aquea at ebulio e destile cerca de 40 mL em frasco Erlenmeyer de 200 mL. Coloque em tubo de ensaio 5 mL do destilado, adicione 1 mL da soluo de floroglucina a 1% e 2 mL da soluo de hidrxido de sdio a 10%. Na presena de formaldedo, aparecer a colorao salmo fugaz e na sua ausncia, a cor violeta. Observe a cor imediatamente aps a adio dos reagentes. Nota: esta metodologia no se aplica a produtos com caractersticas de rano e produtos defumados. Referncia bibliogrfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP 1985. p. 271, 272.
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281/IV Determinao espectrofotomtrica de amido A adio de amido permitida em algumas classes de salsichas, mortadelas e outros produtos crneos, respeitados os limites estabelecidos pela legislao vigente, especficos para cada classe de produto. Alm do amido, que um extensor utilizado para reduzir custos do produto final e auxiliar na reteno de gua, outros ingredientes so empregados na elaborao, tais como: carne, sangue, vsceras comestveis, gordura, protenas de soja, aditivos e condimentos. Alguns deles esto presentes em grandes quantidades, podendo acarretar interferncia na extrao e dosagem do amido; outros contm teores considerveis de acares simples e de amido em sua composio, superestimando o valor real. O mtodo baseia-se na determinao espectrofotomtrica a 500 nm do composto colorido formado pela reao entre os reativos de Somogyi-Nelson e a glicose proveniente da hidrlise do amido. Com o objetivo de minimizar interferncias (gorduras, protenas e acares simples) e aumentar a eficincia das determinaes, procede-se a uma extrao prvia da amostra com ter de petrleo e lcool, para posterior hidrlise cida e clarificao com reagentes Carrez. Esse mtodo, assim como o de Fehling, baseia-se na reduo do ction Cu++ a Cu+, e na oxidao do acar a cido orgnico. O Cu+ complexado com arsenomolibdato (reativo de Nelson), que possui um agente cromforo, originando um complexo estvel de colorao azul. A intensidade dessa colorao proporcional quantidade de acares redutores. Material Espectrofotmetro UV/VIS, centrfuga, balana analtica, estufa, chapa de aquecimento com aparelho de refluxo acoplado, papel indicador de pH, banho-maria, dessecador, papel de filtro, termmetro, bqueres de 500 e 1000 mL, bales volumtricos de 100, 250 e 1000 mL, tubos de centrfuga de 15 mL, pipetas graduadas de 5 e 10 mL, pipeta volumtrica de 1 mL, frasco Erlenmeyer de 500 mL com boca esmerilhada, tubos de Folin-Wu de 25 mL (Figura 1), cubeta de vidro com caminho ptico de 10 mm, bureta de 10 mL e proveta de 25 mL.

Figura 1 Tubo de Folin-Wu de 25 mL.

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Reagentes lcool ter de petrleo cido clordrico Soluo de hidrxido de sdio 40% m/v cido sulfrico (D = 1,84 g/mL) Reativo A Dissolva 25 g de carbonato de sdio, 25 g de tartarato duplo de sdio e potssio, 20 g de bicarbonato de sdio e 200 g de sulfato de sdio anidro em 800 mL de gua. Transfira para balo volumtrico de 1000 mL e complete o volume com gua. Reativo B Dissolva, em gua, 15 g de sulfato de cobre penta-hidratado. Transfira para um balo volumtrico de 100 mL. Adicione duas gotas de cido sulfrico (D = 1,84 g/mL) e complete o volume com gua. Reativo de Somogyi ou reativo cprico Adicione 1 mL do reativo B a 25 mL do reativo A em proveta no momento da anlise. Reativo de Nelson Dissolva 25 g de molibdato de amnio em 450 mL de gua. Adicione 21 mL de cido sulfrico e agite. Adicione 2 g de arseniato de sdio hepta-hidratado, dissolvido em 25 mL de gua. Deixe em banho a 37oC, por um perodo de 24 a 48 h. Soluo de acetato de zinco di-hidratado a 12% m/v Pese 120 g de Zn(CH3COO)2.2H2O, dissolva em 30 mL de cido actico glacial e 600 mL de gua. Transfira para um balo volumtrico de 1000 mL e complete o volume com gua. Soluo de ferrocianeto de potssio tri-hidratado a 6% m/v Pese 60 g de K4Fe(CN)6.3H2O e dissolva em 800 mL de gua. Transfira para balo volumtrico de 1000 mL e complete o volume com gua. Soluo-padro de glicose a 250 g/mL Seque uma quantidade arbitrria de glicose anidra em estufa a 80C, por 2h. Deixe esfriar em dessecador. Pese 250 mg, transfira quantitativamente para balo de 1000 mL com gua, complete o volume e homogeneze. A concentrao dessa soluo-estoque 250 mg/L ou 250 g/mL. Procedimento Pese 1 g da amostra homogeneizada, em tubo de centrfuga. Adicione 10 mL de soluo lcool-ter de petrleo (1:3), agite com a ajuda de uma fina haste de ferro e centrifugue a 2500 rpm, por 5 minutos. Despreze o sobrenadante e repita o
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procedimento anterior. Adicione 10 mL de lcool a 80% v/v a 80oC ao resduo, agite com fina haste de ferro e centrifugue a 2500 rpm por 5 minutos. Despreze o sobrenadante e repita a extrao alcolica. Seque o resduo em estufa a 70oC, por 20 minutos. Transfira o resduo obtido no tubo de centrfuga, com auxlio de 100 mL de gua, para um frasco Erlenmeyer de 500 mL com boca esmerilhada. Adicione 5 mL de cido clordrico. Hidrolise em refluxo por 90 minutos. Esfrie e neutralize o hidrolisado com soluo de hidrxido de sdio a 40% at pH 7 (volume gasto aproximado 6 mL), verificando com papel indicador de pH. Transfira para um balo volumtrico de 250 mL e clarifique adicionando 5 mL de soluo de acetato de zinco e 5 mL de soluo de ferrocianeto de potssio (reagentes Carrez). Complete o volume, tampe e agite com vigor. Deixe em repouso por 15 minutos, agitando vigorosamente varias vezes nesse perodo. Filtre para um frasco Erlenmeyer e reprecipite com hidrxido de sdio a 40% at pH 11 (gasto aproximado 0, 5 mL). Filtre, transfira 1 mL do filtrado para tubo de Folin-Wu e adicione 1 mL de reativo de Somogyi ou reativo cprico, deixe imerso em banho-maria fervente por 20 minutos. (Verifique se aps 20 minutos de fervura a tonalidade azulada permanece nos tubos; caso contrrio, dilua a amostra e proceda novamente reao com reativo cprico.) Esfrie, adicione 1 mL de reativo de Nelson e complete o volume com gua at a primeira marca do tubo de Folin-Wu (12,5 mL) e homogeneze. Proceda s leituras de absorbncia das solues contra o branco de reagentes, no comprimento de onda 500 nm. Nota: caso as solues estejam concentradas, isto , a absorbncia obtida ultrapasse o maior valor da curva-padro, dilua a amostra e repita a reao colorimtrica com os reativos de Somogyi-Nelson, ou repita a reao completando o volume para a segunda marca do tubo de Folin-Wu (25 mL). Neste caso, o resultado final (% de amido) dever ser duplicado. Curva-padro Transfira alquotas de 0 (branco); 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1 mL da soluopadro estoque de glicose para tubos de Folin-Wu. Adicione 1 mL de reativo de Somogyi ou reativo cprico, deixe imerso em banho-maria fervente por 20 minutos. Esfrie, adicione 1 mL de reativo de Nelson, complete o volume com gua at a primeira marca do tubo de Folin-Wu (12,5 mL) e homogeneze. Proceda s leituras de absorbncia das solues contra o branco, no comprimento de onda 500 nm. Proceda regresso linear dos valores de absorbncia obtidos (eixo y) e das concentraes de glicose de 4, 8, 12, 16 e 20 g/mL (eixo x). Utilize nos clculos os valores dos coeficientes linear e angular da reta (absortividade, considerando o caminho ptico da cubeta de 1 cm). Clculos

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Glicose (%) x 0,9 = amido por cento m/m A = absorbncia da amostra b = coeficiente linear da curva-padro de glicose a = absortividade (coeficiente angular da curva-padro de glicose) p = massa (g) da amostra 0,3125 = fator de diluio 0,9 = fator de converso de glicose para amido Referncia bibliogrfica AUED, S.; CARVALHO; J. B. de; T AVARES, M.; ZANELATTO, A. M.; BACETTI, L. B. Determinao de amido em salsichas: comparao entre os mtodos de Fehling e de Somogyi-Nelson e avaliao de metodologia para extrao do amido. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 50, n. 1/2, p. 251-256, 1990. 282/IV Determinao espectrofotomtrica de hidroxiprolina Mtodo de referncia para determinao do aminocido hidroxiprolina em carnes e produtos crneos, expresso em % m/m. A hidroxiprolina quantitativamente determinada como medida das protenas colgenas de carnes e produtos crneos. O tecido conjuntivo colagenoso contm 12,5% de hidroxiprolina quando o fator 6,25 (converso nitrognio para protena) utilizado, ou 14% quando o fator 5,55. A amostra hidrolisada com soluo de cido clordrico em constante ebulio sob refluxo, a soluo filtrada e diluda. A hidroxiprolina oxidada com cloramina T. A cor vermelha prpura que se desenvolve aps a adio de 4-dimetilaminobenzaldedo medida espectrofotometricamente a 558 nm. Material Processador de alimentos, chapa eltrica equipada com condensador resfriado com gua para refluxo, balana analtica, banho-maria com temperatura termostaticamente controlada a (60 0,5)oC, espectrofotmetro UV/VIS, cubeta de vidro de caminho ptico de 10 mm, papel de filtro qualitativo de dimetro 12,5 cm, pHmetro, frascos Erlenmeyer com boca esmerilhada de 100, 250 e 500 mL, tubos de ensaio com tampa de 10 mL, bales volumtricos de 50, 100, 500 e 1000 mL e pipetas volumtricas de 1, 2, 5, 10 e 20 mL.

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Reagentes cido clordrico 6 M Misture volumes iguais de HCl e gua. Soluo-padro estoque de hidroxiprolina a 600 g/mL Dissolva 60 mg de hidroxiprolina em gua. Transfira para um balo volumtrico de 100 mL e complete o volume com gua. A soluo estvel cerca de 2 meses a 4oC. Opo: dissolva 120 mg em balo de 200 mL e complete o volume com gua. Soluo-padro intermediria de hidroxiprolina a 6 g/mL Pipete 5 mL da soluoestoque em balo volumtrico de 500 mL. Complete o volume com gua. Prepare a soluo no dia de seu uso. Soluo-padro de trabalho de hidroxiprolina Pipete 5, 10, 20 e 30 mL da soluo intermediria em balo volumtrico de 50 mL. Complete o volume com gua. Essas soluespadro de trabalho revelam concentraes de hidroxiprolina de 0,6; 1,2; 2,4 e 3,6 g/mL, respectivamente. Prepare as solues no dia de seu uso. Soluo-tampo (pH 6) Dissolva 30 g de cido ctrico mono-hidratado (C6H8O7.H2O), 15 g de hidrxido de sdio e 90 g de acetato de sdio tri-hidratado (CH3COONa3H2O) em cerca de 500 mL de gua. Transfira a soluo para balo volumtrico de 1000 mL. Adicione 290 mL de 1-propanol. Determine o pH e ajuste, se necessrio, com cido ou base. Complete o volume. A soluo estvel por cerca de 2 meses a 4oC e em frasco escuro. Soluo oxidante Dissolva 1,41 g do reagente cloramina T em 100 mL da soluo tampo pH 6. A soluo estvel 1 semana a 4oC, em frasco escuro. Reagente de cor Dissolva 10 g de 4-dimetilaminobenzaldedo em 35 mL de cido perclrico a 60% m/m. Adicione vagarosamente, com agitao, 65 mL de 2-propanol. Prepare a soluo no dia de seu uso. Procedimento Pese, com preciso, cerca de 4 g da amostra em duplicata em frascos Erlenmeyer de 250 ou 500 mL. A amostra no deve aderir s paredes laterais. Adicione 30 mL de HCl 6 M e algumas prolas de vidro (ou cacos de porcelana) a cada frasco. Aquea fervura branda por 8 horas sob refluxo. Transfira quantitativamente o hidrolisado para balo volumtrico de 500 mL com gua. Complete o volume e agite. Filtre a soluo atravs de papel de filtro, em frasco Erlenmeyer de 500 mL. O filtrado estvel ao menos por 2 semanas a 4oC. Dilua o filtrado com gua em balo volumtrico, de modo
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que a concentrao de hidroxiprolina da diluio final esteja na faixa de 0,6 a 3,6 g/mL. A diluio de 5 mL do filtrado para 50 mL usualmente satisfatria. Pipete 2 mL da diluio final de cada amostra em tubos de ensaio. A cada tubo, adicione 1 mL da soluo oxidante. Agite os tubos e deixe por (20 2) minutos temperatura ambiente. Adicione 1 mL do reagente de cor e misture vigorosamente. Feche cada tubo com tampa ou papel alumnio. Imediatamente, coloque os tubos em banho de gua a (60 0,5)oC por exatamente 15 minutos. Resfrie os tubos em gua corrente por 3 minutos. Mea a absorbncia das solues contra o branco de reagentes a (558 2) nm. Curva-padro Prepare a curva-padro para cada srie de medies. Transfira 2 mL de gua (branco) e 2 mL de cada soluo-padro de trabalho aos tubos de ensaio e proceda adio da soluo oxidante e do reagente de cor conforme procedimento da amostra. Construa a curva com absorbncia no eixo y e concentraes de hidroxiprolina 0,3; 0,6; 1,2 e 1,8 g/mL no eixo x. Calcule os coeficientes linear e angular da reta (absortividade, considerando o caminho ptico da cubeta de 1 cm). Clculos

A = absorbncia do filtrado da amostra diluda 10 vezes (5 mL em 50 mL) b = coeficiente linear da reta obtida na curva-padro a = absortividade, coeficiente angular da reta obtida na curva-padro p = peso da amostra (g) H x 8 = tecido colagenoso (B) em g/100 g Nota: tecido conjuntivo colagenoso contm 12,5% de hidroxiprolina se o fator de converso de nitrognio para protena for de 6,25.

% protena total = teor de nitrognio da amostra em g/100 g x 6,25 Notas O clculo diferente em alguns pases, com base nos diferentes fatores de converso de nitrognio e de hidroxiprolina. O limite de quantificao do mtodo de 0,030 g/mL de hidroxiprolina na alquota de anlise (com desvio-padro relativo de 6,5%) e de 0,0075 g/100 g de hidroxiprolina na amostra (Della Torre et al. 2004).
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Referncias bibliogrficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, (method 990.26). Arlington: A.O.A.C.,1995. chapter 39. p.13-5. DELLA TORRE, LICHTIG. J.; BERAQUET, N.J. Validao do mtodo espectrofomtrico para quantificao do aminocido hidroxiprolina em conservas de carne. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 63(1), 2004 (no prelo). 283/IV Determinao espectrofotomtrica de nitritos Baseia-se nas reaes de diazotao de nitritos com cido sulfanlico e copulao com cloridrato de alfa-naftilamina em meio cido, formando o cido alfa-naftilamino-pazobenzeno-p-sulfnico de colorao rsea. O produto resultante determinado espectrofotometricamente a 540 nm. Material Balana analtica, espectrofotmetro UV/VIS, banho-maria, balo volumtrico mbar de 50 mL, bales volumtricos de 100, 200, 250 e 1000 mL, provetas de 25 e 50 mL, bqueres de 100 e 200 mL, frasco Erlenmeyer de 250 ou de 500 mL, funil, papel de filtro qualitativo, pipeta graduada de 5 mL, pipetas volumtricas de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10 e 20 mL. Reagentes Utilize preferencialmente gua deionizada isenta de nitritos e/ou nitratos no preparo dos reagentes e na realizao da anlise. Soluo de tetraborato de sdio deca-hidratado a 5% m/v Dissolva 50 g de Na2B4O7.10H2O em gua e complete o volume at 1000 mL. Soluo de ferrocianeto de potssio tri-hidratado a 15% m/v Dissolva 150 g de K4Fe(CN)6.3H2O em gua e complete o volume at 1000 mL. Soluo de acetato de zinco diidratado a 30% m/v ou sulfato de zinco hepta-hidratado a 30% m/v Dissolva 300 g de Zn(CH3COO)2.2H2O em 30 mL de cido actico glacial e 500 mL de gua (aquea brandamente, se necessrio) e complete o volume at 1000 mL. Alternativamente, dissolva 300 g de ZnSO4.7H2O em gua e complete o volume at 1000 mL.
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Reagente sulfanilamida a 0,5% m/v Dissolva 1,25 g de C6H8N2O2 em 250 mL de soluo de cido clordrico (1+1). Aquea brandamente, se necessrio. A soluo estvel por 1 a 2 meses. Reagente NED a 0,5% m/v Dissolva 0,5 g de cloreto de alfa-naftiletilenodiamina (C12H16Cl2N2) em 100 mL de gua. Aquea brandamente, se necessrio. Estoque em frasco mbar sob refrigerao. A soluo estvel por uma semana e dever ser desprezada quando apresentar alterao da colorao. Soluo-padro de nitrito de sdio (NaNO2) a 0,2 g/L Pese 200 mg de nitrito de sdio, previamente seco por 1 hora a 105C, dissolva em gua e dilua para 1000 mL. Essa soluo-padro estoque estvel por 2 semanas, se mantida a 4C. Soluo-padro de trabalho a 8 g/mL Pipete 10 mL da soluo-padro estoque de nitrito de sdio em um balo volumtrico de 250 mL e complete o volume com gua. Procedimento Pese 10 g de amostra triturada e homogeneizada em um bquer de 200 mL. Adicione 5 mL de soluo de tetraborato de sdio, misture com basto de vidro e acrescente cerca de 50 mL de gua quente (80oC). Deixe em banho-maria por 15 minutos, agitando freqentemente com a baqueta. Proceda da mesma forma com um branco de reagentes sem a adio da amostra. Com auxlio do basto de vidro e de um funil, transfira o contedo quantitativamente para balo volumtrico de 200 mL. Lave bem o bquer com aproximadamente 50 mL de gua. Deixe esfriar e adicione 5 mL de soluo de ferrocianeto de potssio e 5 mL de soluo de acetato de zinco (ou como alternativa, sulfato de zinco). Agite por rotao aps a adio de cada reagente e complete o volume com gua. Agite com vigor. Deixe em repouso por 15 minutos, agitando vigorosamente vrias vezes nesse perodo. Filtre em papel de filtro qualitativo para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Pipete 10 mL do branco de reagentes e das amostras, respectivamente, para bales volumtricos mbar de 50 mL. Adicione 5 mL de reagente sulfanilamida, deixe reagir por 5 minutos e adicione 3 mL de reagente NED, agitando aps cada adio. Complete o volume com gua e homogeneze. Deixe em repouso por 15 minutos e faa a leitura da absorbncia a 540 nm contra o branco de reagentes. Curva-padro Pipete alquotas de 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 mL da soluo-padro de trabalho de nitrito de sdio (8 g/mL) para bales volumtricos de 50 mL. Adicione, a cada um, 5 mL de reagente sulfanilamida, misture por rotao e aps 5 minutos, adicione 3 mL de reagente NED. Complete o volume e homogeneze. Deixe a cor desenvolver por 15 minutos e determine a absorbncia a 540 nm contra branco de reagentes. Construa a curva com os valores de absorbncia no eixo y e de concentrao de nitrito de sdio 0,16; 0,32; 0,48; 0,64; 0,80; 0,96 e 1,12 g/mL no eixo x. Calcule os coeficientes linear e angular da reta (absortividade, considerando o caminho ptico da cubeta de 1 cm).

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Clculo

A = absorbncia da amostra b = coeficiente linear da reta obtida na curva-padro a = absortividade (coeficiente angular da reta obtida na curva-padro) p = massa da amostra em gramas 1000 = fator de diluio Nota: o limite de quantificao do mtodo de 0,032 g/mL de NaNO2 (ou 0,021 g/ mL de NO2-) na alquota de anlise, com desvio padro relativo de 3,7% (TAKEMOTO et al., 1999). Referncias bibliogrficas BRASIL. Instruo Normativa n. 20, de 21 jul. 1999. Secretaria de Defesa Agropecuria, do Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Oficializa os Mtodos Analticos Fsicoqumicos para Controle de Produtos Crneos e seus Ingredientes Sal e Salmoura. Dirio Oficial, Braslia (DF), n.173, 9 set. 1999. Seo 1, p.30-31. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP 1985. p. 97-98. , TAKEMOTO, E.; DELLA TORRE, J. C. de M.; LICHTIG, J. Nitrato em espinafre: validaes de mtodos colorimtricos. In: III SIMPSIO LATINO AMERICANO DE CINCIA DE ALIMENTOS (SLACA), 1999. Resumos... Campinas: FEA-UNICAMP, 1999. p. 5. 284/IV Determinao espectrofotomtrica de nitratos O nitrato reduzido a nitrito em coluna de cdmio metlico em meio alcalino. A reao baseia-se na diazotao dos nitritos com cido sulfanlico e copulao com cloridrato de alfa-naftilamina em meio cido, formando o cido alfa-naftilamino-p-azobenzeno-p-sulfnico de colorao rsea. O produto resultante determinado espectrofotometricamente a 540 nm. Material Balana analtica, espectrofotmetro UV/VIS, banho-maria, coluna de cdmio, bales volumtricos mbar de 50 mL, bales volumtricos de 100, 200, 250 e 1000 mL, provetas
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de 25 e 50 mL, bqueres de 100 e 200 mL, frasco Erlenmeyer de 250 ou de 500 mL, funil, papel de filtro qualitativo, pipeta graduada de 5 mL e pipetas volumtricas de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10 e 20 mL. Reagentes Utilize preferencialmente gua deionizada isenta de nitritos e/ou nitratos no preparo dos reagentes e na realizao da anlise. Soluo de tetraborato de sdio deca-hidratado a 5% m/v Dissolva 50 g de Na2B4O7.10H2O em gua e complete o volume at 1000 mL. Soluo de ferrocianeto de potssio tri-hidratado a 15% m/v Dissolva 150 g de K4Fe(CN)6.3H2O em gua e complete o volume at 1000 mL. Soluo de acetato de zinco di-hidratado a 30% m/v ou sulfato de zinco hepta-hidratado a 30% m/v Dissolva 300 g de Zn(CH3COO)2.2H2O em 30 mL de cido actico glacial e 500 mL de gua (aquea brandamente se necessrio), complete o volume at 1000 mL. Alternativamente, dissolva 300 g de ZnSO4.7H2O em gua e complete o volume at 1000 mL. Soluo de EDTA a 5% m/v Pese 5 g de C10H14N2Na2O8.2H2O, dissolva com gua e complete o volume de 100 mL. Guarde em frasco de polietileno. Reagente sulfanilamida a 0,5% m/v Dissolva 1,25 g de C6H8N2O2 em 250 mL de soluo de cido clordrico (1+1). Aquea brandamente se necessrio. A soluo estvel por 1 a 2 meses. Reagente NED a 0,5% m/v Dissolva 0,5 g de cloreto de alfa-naftiletilenodiamina (C12H16Cl2N2) em 100 mL de gua. Aquea brandamente, se necessrio. Estoque em frasco mbar sob refrigerao. A soluo deve ser desprezada quando apresentar alterao da colorao (estvel por uma semana). Soluo-tampo pH (9,6-9,7) Dilua 20 mL de cido clordrico em 700 mL de gua. Adicione 50 mL de hidrxido de amnio. Verifique o pH e ajuste para (9,6-9,7) com HCl ou NH4OH, se necessrio. Complete o volume at 1000 mL e misture. Soluo-tampo pH (9,6-9,7) diluda (1+9) Dilua 100 mL da soluo-tampo pH (9,6-9,7) em balo de 1000 mL e complete o volume com gua. Soluo-padro de nitrito de sdio (NaNO2) a 200 mg/L Pese 200 mg de nitrito de
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sdio, previamente seco por 1 hora a 105C, dissolva em gua e dilua para 1000 mL. Essa soluo-padro estoque estvel ao menos por 2 semanas, se mantida a 4C. Soluo-padro de trabalho a 8 g/mL Transfira 10 mL da soluo-padro estoque para um balo volumtrico de 250 mL e complete o volume com gua. Soluo-padro de nitrato de sdio (NaNO3) Desseque o nitrato de sdio por 1 hora a 105C. Pese, com preciso, 0,1 g e dissolva em gua. Adicione 50 mL da soluo-tampo pH (9,6-9,7) e complete para balo de 100 mL com gua. Essa soluo-padro estvel ao menos por duas semanas, se mantida a 4C. Soluo-padro de trabalho de nitrato de sdio a 10 g/mL Dilua 1 mL em balo de 100 mL com gua. A soluo-padro de nitrato de sdio de trabalho deve ser preparada no momento da anlise. Preparao da coluna de cdmio (Figura 2) Estire um tubo de vidro de 1,5 cm de dimetro e 15 cm de altura (coluna). Compacte um pequeno chumao de l de vidro na extremidade afilada da coluna, acrescente uma camada de 1 cm de areia tratada. Preparao do cdmio esponjoso: prepare 500 mL de soluo de sulfato de cdmio a 20%. Adicione 5 barras de zinco metlico, deixando-as totalmente imersas na soluo. medida que o cdmio esponjoso for se depositando nas barras, retire utilizando basto de vidro ou material plstico e transfira para um bquer contendo gua em quantidade suficiente para cobrir todo o cdmio. Transfira aproximadamente 200 mL de gua e o cdmio para um copo de liquidificador (de material plstico ou vidro), homogeneze e em seguida passe em peneira mesh 20 ou 40, recolhendo em outro bquer, mantendo o cdmio sempre coberto com gua. O cdmio triturado e peneirado posto a decantar completamente. Remova a gua sobrenadante e inicie o tratamento do resduo (cdmio esponjoso) da seguinte maneira: cubra todo o cdmio com cido clordrico 2 M; deixe em contato (repouso) por 2 minutos, remova o cido clordrico sobrenadante; lave o cdmio com gua at pH neutro; adicione cido clordrico 0,1 M at cobrir todo o cdmio, deixe em repouso por 15 minutos e remova o cido clordrico sobrenadante; lave o cdmio com gua at pH neutro; decante e remova a gua sobrenadante, adicione soluo-tampo pH (9,6-9,7) (1+9) deixando em contato por, no mnimo, 15 minutos. Decorrido esse tempo, o cdmio est pronto para ser compactado na coluna de vidro previamente preparada com l de vidro e areia na extremidade. Transfira o cdmio em pequenas pores com o auxlio de gua, evitando sua exposio ao ar, at atingir uma altura de 10 cm. Adapte ao topo da coluna um funil de separao de 100 mL, com haste de 10 mm de dimetro e 25 cm de comprimento com uma rolha de silicone, prevenindo a entrada de ar na coluna. Dessa forma, permite-se o controle do fluxo. Mantenha a coluna sempre com gua.

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Figura 2. Funil de separao acoplado coluna de cdmio. Regenerao ou ativao da coluna A atividade da coluna de cdmio decresce depois de 24 horas, quando este mantido em gua. Regenere a coluna no comeo de cada dia de utilizao e aps duas (uma duplicata) redues (passagens) de amostras. Passe as solues na coluna com fluxo de 10 mL/min respeitando a seguinte ordem: 25 mL de cido clordrico 0,1 M, 50 mL de gua e 25 mL de soluo-tampo diluda (1+9). Procedimento Pese 10 g de amostra triturada e homogeneizada em bquer de 200 mL. Adicione 5 mL de soluo de tetraborato de sdio, misture com baqueta de vidro e acrescente cerca de 50 mL de gua quente (80oC). Deixe em banho-maria por 15 minutos, agitando freqentemente com a baqueta. Proceda da mesma forma para o branco de reagentes sem a adio da amostra. Com auxlio da baqueta e de um funil, transfira o contedo quantitativamente para balo volumtrico de 200 mL. Lave bem o bquer com aproximadamente 50 mL de gua. Deixe esfriar e adicione 5 mL de soluo de ferrocianeto de potssio e 5 mL de soluo de acetato de zinco (ou como alternativa, sulfato de zinco). Agite por rotao aps a adio de cada reagente e complete o volume com gua. Agite com vigor. Deixe em repouso por 15 minutos, agitando vigorosamente vrias vezes nesse perodo. Filtre em papel de filtro qualitativo para frasco Erlenmeyer de 250 mL. Transfira uma alquota de 20 mL do filtrado (primeiramente do branco de reagentes e na seqncia, as amostras) para bquer de 100 mL. Adicione 5 mL da soluo-tampo pH (9,6-9,7). Se turvar, adicione 2 mL de soluo de EDTA 5%. Passe pela coluna de cdmio a um fluxo que no exceda 6 mL/minuto, recolhendo diretamente em balo volumtrico de 100 mL. Lave as paredes do bquer no mnimo trs vezes consecutivas com aproximadamente 15 mL de gua, passando seqencialmente pela coluna de cdmio. Continue a passagem de gua pela coluna at completar o volume de 100 mL no balo volumtrico. Pipete 10 mL (do branco de reagentes e das amostras), respectivamente, para bales volumtricos de 50 mL. Adicione 5 mL de reagente sulfanilamida, agite por rotao, aps 5 minutos adicione 3 mL de reagente NED, complete o volume com gua, misture e deixe desenvolver a cor por 15 minutos.
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Determine a absorbncia a 540 nm contra o branco de reagentes (passado pela coluna). O resultado refere-se ao teor de nitrito de sdio total. Desconte o valor de nitrito de sdio presente na amostra (reao colorimtrica do filtrado antes de pass-lo pela coluna de cdmio). Eficincia ou controle da capacidade redutora da coluna A eficincia da coluna pode ser testada passando soluo-padro de nitrato de sdio e determinando a quantidade de nitrito formado. Misture, em um bquer de 100 mL, uma alquota de 20 mL da soluopadro de trabalho de nitrato de sdio (10 g/mL) e 5 mL da soluo-tampo pH (9,69,7). Passe pela coluna de cdmio a um fluxo que no exceda 6 mL/minuto, recolhendo diretamente em balo volumtrico de 100 mL. Lave as paredes do bquer no mnimo trs vezes consecutivas com aproximadamente 15 mL de gua, passando seqencialmente pela coluna de cdmio. Continue a passagem de gua pela coluna at completar o volume de 100 mL no balo volumtrico. Pipete 10 mL para um balo volumtrico de 50 mL. Adicione 5 mL de reagente sulfamilamida, agite por rotao; aps 5 minutos, adicione 3 mL de reagente NED e complete o volume com gua. Aps 15 minutos faa a leitura a 540 nm contra o branco de reagentes (passado pela coluna). Se a recuperao for inferior a 90%, isto , a concentrao de nitrato calculado menor que 90% do valor terico esperado, regenere a coluna de cdmio. Curva-padro de nitrito de sdio Pipete alquotas de 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 mL da soluopadro de trabalho de nitrito de sdio (8 g/mL) para bales volumtricos de 50 mL. Adicione, a cada um, 5 mL de reagente sulfanilamida, misture por rotao e, aps 5 minutos, adicione 3 mL de reagente NED. Complete o volume e homogeneze. Deixe desenvolver a cor por 15 minutos e determine a absorbncia a 540 nm contra o branco de reagentes. Construa a curva com os valores de absorbncia no eixo y e de concentrao de nitrito de sdio 0,16; 0,32; 0,48; 0,64; 0,80; 0,96 e 1,12 g/mL no eixo x. Calcule os coeficientes linear e angular da reta (absortividade, considerando o caminho ptico da cubeta de 1 cm). Clculos

Nitrato de sdio (em NaNO2) = nitrito de sdio total - nitrito de sdio Nitrato de sdio (em NaNO3) = (nitrito de sdio total - nitrito de sdio) x 1,231 A = absorbncia da amostra b = coeficiente linear da curva padro de nitrito de sdio
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a = absortividade, coeficiente angular da curva-padro de nitrito de sdio p = massa da amostra em g 5000 = fator de diluio da amostra para clculo do nitrito de sdio total 1,231 = fator de converso de nitritos em nitratos 1000 = fator de diluio da amostra para clculo do nitrito de sdio

A = absorbncia do padro nitrato de sdio b = coeficiente linear da curva-padro de nitrito de sdio a = absortividade, coeficiente angular da curva-padro de nitrito de sdio p = massa nitrato de sdio padro em g 30,8 = fator (diluio e converso NaNO3 / NaNO2) Nota: o limite de quantificao do mtodo de 0,032 g/mL de NaNO2 (ou 0,021 g/ mL de NO2-) na alquota de anlise, com desvio padro relativo de 3,7% (TAKEMOTO et al., 1999). Referncias bibliogrficas BRASIL. Instruo Normativa n. 20, de 21 jul. 1999. Secretaria de Defesa Agropecuria, do Ministrio da Agricultura e do Abastecimento. Oficializa os Mtodos Analticos FsicoQumicos para Controle de Produtos Crneos e seus Ingredientes Sal e Salmoura. Dirio Oficial, Braslia (DF), n.173, 9 set. 1999. Seo 1, p.30. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3.ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 98100. TAKEMOTO, E.; DELLA TORRE, J. C. de M.; LICHTIG, J. Nitrato em espinafre: validaes de mtodos colorimtricos. In: III SIMPSIO LATINO AMERICANO DE CINCIA DE ALIMENTOS (SLACA), 1999. Resumos... Campinas: FEA-Unicamp, 1999. p.5. 285IV Determinao de protenas de soja pelo mtodo ELISA As protenas de soja so ingredientes utilizados na elaborao de alimentos como fonte protica e como extensor em produtos crneos. As amostras de produtos crneos
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crus ou processados termicamente so maceradas e extradas com solventes orgnicos. O resduo desta extrao, denominado p de acetona, solubilizado a quente em soluo aquosa de uria. Aps diluio, as protenas de soja renaturadas so analisadas pelo mtodo ELISA, utilizando anticorpos comercialmente disponveis. Na quantificao de protenas de soja, o mtodo ELISA um imuno-ensaio competitivo indireto em que o analito protena de soja (antgeno) reage com volume fixo de anticorpo anti-protena de soja (antissoro produzido em coelho) em excesso. O anticorpo no reagente determinado pela ligao em placa de imunoensaio previamente sensibilizada com o antgeno. O anticorpo capturado determinado pela adio de um segundo anticorpo (produzido em cabra para globulinas de soro de coelho) ligado covalentemente a uma enzima (conjugado). A reao evidenciada pelo desenvolvimento de cor com a adio de substrato. Etapas de lavagem so incorporadas aps cada estgio de interao, para remover material no reagente (Figura 3). A amostra geralmente analisada em diluies seriadas na razo 3. A resposta comparada a uma curva-padro de protena de soja. O ELISA semi-quantitativo na determinao de protenas de soja em produtos crneos crus e processados termicamente, podendo ser quantitativo quando o teor de protdios da protena de soja adicionado conhecido e, especialmente, se a protena de soja (texturizada, concentrada ou isolada) est disponvel para calibrao. Material Lavadora e leitora de placas de ELISA; pipeta digital de 8 ou 12 canais, pipetas monocanais de (5-50) L, (50 -200) L e (100 -1000) L com ponteiras, reservatrios de reagentes para cada soluo; triturador de amostras, homogeneizador Ultra-Turrax ou Diax 900 (Heidolph) ou equivalente; papel de filtro Whatman n 541; tubos de vidro pirex graduados de 10 mL com tampas de plstico; banho-maria; placas de imunoensaio de poliestireno fundo chato de 96 cavidades (equivalente Nunc Maxisorp 442404); microtubos plsticos de 1 mL com tiras de tampas e suporte (8 x 12 fileiras) para diluio serial e pr-incubao; caixas plsticas com tampa para colocar placas de ELISA; bales volumtricos de 10, 25 e 50 mL; funil de vidro de 7 cm; almofariz; balana analtica; pHmetro; estufa; cronmetro e papel grfico semi-log (linear/4 ciclos log). Reagentes Acetona Uria 2-Mercaptoetanol Azida sdica (NaN3)

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Advertncia: a azida sdica material txico. Evite contato com a pele e os olhos e impea a aspirao do p. Clorofrmio-metanol 2:1 (v/v). lcool-gua (acidificado) 80+20 (v/v), acidificado com 2 gotas de HCl/L. Tampo Tris-HCl a 0,25 M Pese 30,3 g de tris (hidroximetil) amino metano em um litro de gua e ajuste ao pH 8,6 com HCl. Proteina de soja padro Utilize como padro, o concentrado de protena de soja (Loders CroKlaan B.V., Holanda) ou p de acetona de soja (equivalente Sigma S7756) ou isolado protico de soja Supro 500E (Protein Technologies International, USA) na preparao da soluo de sensibilizao. Soluo de sensibilizao (50 vezes concentrada) Misture, em balo volumtrico de 50 mL, 4,5 mL de Na2CO3 0,2 M, 8 mL de NaHCO3 0,2 M, 625 L da soluopadro de protena de soja preparada no item procedimento (b) e gua at completar o volume. Mantenha esta soluo-padro a (2-8)C por 16 horas. Nota: o valor 625 L da soluo-padro foi calculado para corresponder a 2,5 mg de protena de soja no p de acetona, uma vez que a soluo-padro descrita no item (b) do procedimento contm 100 mg/25 mL. Soluo de sensibilizao de trabalho Misture, em um balo volumtrico de 50 mL, 4,5 mL Na2CO3 0,2 M, 8 mL NaHCO3 0,2 M e gua para completar o volume. Homogeneze e retire 1 mL desta soluo, repondo o volume da soluo com 1 mL da soluo de sensibilizao 50 vezes concentrada. Soluo-tampo salina de fosfato TFS pH 7,1 Misture, em um balo volumtrico de 1000 mL, 85 g de NaCl, 10,7 g de Na2HPO4, 3,9 g de NaH2PO4.2H2O, 5 g de NaN3 e gua at completar o volume para 1000 mL. Soluo-tampo de trabalho TFST Misture 100 mL da soluo-tampo TFS, 1,5 mL de Tween 20 e 900 mL de gua. Solues imunorreagentes Soluo anticorpo-positivo Dilua, em um balo volumtrico de 50 mL, B L de antissoro de coelho para protena de soja (equivalente Sigma-Aldrich S-2519), conservado a -20C, e complete o volume com soluo-tampo TFST.

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Soluo anticorpo-negativo Em um balo volumtrico de 50 mL, pipete B L de soro normal de coelho e complete o volume com soluo-tampo TFST. Soluo conjugado Em um balo volumtrico de 25 mL, pipete C L de IgG anticoelho produzido em cabra conjugado fosfatase alcalina (equivalente Sigma-Aldrich A-7539), conservado a (2 8)C e complete o volume com soluo-tampo TFST. Nota: as quantidades de anticorpo e conjugado que devem ser adicionadas, dependem das propriedades dos imunorreagentes recebidos. Calcule B e C como descrito no item padronizao. Soluo-substrato de fosfatase em meio tampo Misture, em um balo volumtrico de 25 mL, 2,25 mL de Na2CO3 0,2 M, 4 mL de NaHCO3 0,2 M, 25 L MgCl2.6H2O 0,5 M, 25 mg p-nitrofenil fosfato (5 tabletes de 5 mg cada, equivalente Sigma 104-105, guarde no escuro a temperatura menor que 0oC) e complete o volume com gua. Padronizao (A) Anticorpo-positivo e anticorpo-negativo Teste novos lotes nas placas ELISA sensibilizadas e lavadas (itens (c) e (d) do procedimento). Prepare sries de diluies (no intervalo 100 - 100000) de anticorpo positivo (fileiras A-D) e anticorpo negativo (fileiras E-H) em TFST, pr-incube sem protena de soja, e ento proceda como descrito nos itens (h) e (k) do procedimento. Use a curva de diluio do antissoro para obter o ttulo do anticorpo positivo. Calcule o valor B, isto , se o ttulo for 1 em 3000, ento B = 2 x (1/3000) x 50000 L = cerca de 30 L. Teste tambm o anticorpo em produto crneo padro contendo concentrao conhecida de protena de soja e tambm contra materiais com potencial para reaes cruzadas. (B) Conjugado Teste novos lotes de conjugado sobre uma placa ELISA (sensibilizada e lavada, itens (c) e (d) do procedimento). Prepare anticorpo positivo como para BP (item (f ) do procedimento) e pr-incube essa soluo com TFST separadamente (item (g) do procedimento). Incube na placa (item (h) do procedimento) nas fileiras A-D (anticorpo positivo) e fileiras E-H (TFST). Use conjugado a vrias diluies (ou seja, no intervalo 500-5000) no item (i) do procedimento e ento siga (j) e (k). Calcule o valor de C (ou seja, C=15) de tal forma que o conjugado positivo seja > 1,000 e conjugado negativo < 0,050. (C) Placa ELISA Teste lotes de placas para avaliar a variabilidade entre placas. A placa padro em protocolo utiliza, nas determinaes, somente as cavidades (B G) (2-11) em razo de uma possvel variao das cavidades externas.
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Procedimentos (a) Preparao do p de acetona Pese, separadamente, 20 g da protena de soja padro e 20g da amostra previamente triturada e macere (no Ultra-Turrax ou Diax 900) com solventes orgnicos, filtrando o resduo a cada estgio para re-extrao, na seguinte seqncia: 200 mL clorofrmio-metanol (3 vezes), 200 mL lcool acidificado (3 vezes) e 200 mL acetona (3 vezes). Seque o resduo ao ar, de um dia para o outro, e homogeneze em almofariz; o produto final denomina-se p de acetona. Proceda a anlise da protena total pelo mtodo Kjeldahl (N x 6,25), utilizando o resultado para calcular a massa da amostra de p de acetona do item (b) do procedimento. (b) Solubilizao de amostras e padro Pese, separadamente, em tubos pirex graduados de 10 mL, o p de acetona da protena de soja padro (97-103 mg de protena) e o p de acetona de cada amostra de produto crneo (95-105 mg de protena). Adicione a cada um dos tubos na ordem: 2 mL de tampo Tris-HCl, 6 g de uria, 2 mL de gua, 200 L de 2-mercaptoetanol e gua para 10 mL. Tampe, misture e aquea imergindo at o nvel de 10 mL em banho de gua fervente por (60 1) min. Resfrie por (3 - 5) minutos e transfira quantitativamente para um balo volumtrico de 25 mL com gua, assegurando a ressolubilizao da uria cristalizada. Mantenha as solues de amostras e padro por 16 h a (2 - 8)oC. A soluo-padro de protena de soja est pronta para ser utilizada no item reagentes (soluo de sensibilizao) e no item procedimento (e). As solues de amostras sero utilizadas no item (e) do procedimento. (c) Sensibilizao das placas ELISA Utilizando pipeta multicanal, transfira 200 L de soluo de sensibilizao de trabalho (item reagente) a cada cavidade na placa de ELISA. Coloque a placa tampada em caixa plstica, feche e incube a 37oC por (16 1) hora. (d) Lavagem e estocagem das placas ELISA Lave as placas de ELISA utilizando um procedimento padronizado. Com um sistema automtico de lavagem estabelea um ciclo de 5 vezes, em que cada fileira de cavidades sucessivamente esvaziada e enchida com TFST por 5 vezes e finalmente as cavidades so esvaziadas. Segundo o procedimento de lavagem manual, a primeira fileira esvaziada e enchida com TFST por 5 vezes antes de finalmente ser esvaziada; a seqncia repetida para as fileiras sucessivas. Um ciclo de lavagem de 10 vezes inclui primeiramente uma lavagem de 5 vezes, seguida por um segundo ciclo de mais 5 lavagens. Se a placa ELISA sensibilizada no for utilizada imediatamente, remova a placa da estufa no final das 16 horas e lave 5 vezes. Uma lavagem eficiente parte essencial do mtodo. A placa lavada pode ser enxugada e estocada. Use tecido absorvente para secar os lados da placa, inverta a placa para remover algum lquido remanescente nas cavidades, e ento seque a parte de cima da placa. Idealmente, a superfcie interna das cavidades incluindo a base deve permanecer intocada durante o processo de lavagem e secagem. Coloque a placa tampada com a parte de cima voltada para baixo em caixa plstica, feche e estoque em freezer (-20oC).
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(e) Diluio serial das solues de amostras e padro Assegure a ambientao da temperatura das solues de amostras e padro solubilizadas (procedimento b), retirando da refrigerao com (45 - 60) minutos de antecedncia. Transfira alquotas de 750 L de cada uma dessas solues a bales volumtricos de 10 mL, dilua ao volume com TFST e misture por repetidas inverses. Encha com microtubos o suporte (8x12) e pipete 600 L das solues de amostras e padres diludos, cada um dentro do seu tubo correspondente, como definido na Tabela 1 (padro S1 em triplicata e amostras T1-Z1 em duplicata). A Tabela 1 ilustra o modelo padro de tubos que corresponde s cavidades na placa de ELISA. Todos os outros tubos devem receber 400 L de TFST; faa essa transferncia utilizando pipeta multicanal (duas pores de 200 L). Conduza a diluio serial de cada amostra, em duplicata, pelo uso de pipeta multicanal para misturar alquotas de 600 L (recolha 200 L e reponha 3 vezes) e, ento, transfira 200 L ao tubo adjacente que j contm 400 L de TFST. Misture como descrito e repita a diluio, descartando a alquota de 200 L do ltimo tubo. Desta mistura resulta uma diluio serial 1:3; normalmente use solues de amostra no diluda, 3 vezes diludas e 9 vezes diludas para o ensaio quando o teor de protena de soja na amostra desconhecido ou baixo (0 - 11 g de protena/100 g de protena total). Escolha maiores diluies se os teores so altos (3, 9, 27 vezes se 11- 33 g/100 g; 9, 27, 81 vezes para 33 -100 g/100 g), ou quando o ELISA j tenha demonstrado que as solues de amostras so muitas concentradas. Dilua as solues-padro similarmente, preparando para o ensaio 7 diluies seriais (de soluo no diluda a diluio de 729 vezes, cada uma em triplicata). Tabela 1 Modelo padro recomendado para os microtubos (pr-incubao) e cavidades correspondentes na placa de ELISA, no ensaio com 7 amostras*.
Linhas 1 A B C D E F G H BS BS BS BC BC BC BP BP 2 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 BP 3 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 BN 4 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 BN 5 00 T1 T2 T3 T1 T2 T3 BN 6 00 U1 U2 U3 U1 U2 U3 00 Colunas 7 00 V1 V2 V3 V1 V2 V3 00 8 00 W1 W2 W3 W1 W2 W3 00 9 00 X1 X2 X3 X1 X2 X3 00 10 00 Y1 Y2 Y3 Y1 Y2 Y3 00 11 00 Z1 Z2 Z3 Z1 Z2 Z3 00 12 00 00 00 00 00 00 00 00

* As 96 posies esto arranjadas em 12 colunas (1-12) e 8 linhas (A-H). Cada amostra analisada a 3 diluies (em duplicata); padro a 7 diluies (em triplicata), e 4 brancos em triplicata. BS, branco substrato; BC, branco conjugado; BP, branco anticorpo positivo; BN, branco anticorpo negativo; 00, no usado; S1-S7, padro (1-7 indica 7 diluies seriais); T-Z, 7 amostras (1-3 indica 3 diluies seriais).

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(f ) Brancos Quatro tipos de brancos so usados, cada um em triplicata: substrato (BS), conjugado (BC), anticorpo positivo (BP) e anticorpo negativo (BN). Adicione 400 L de TFST a todos eles. Aos tubos BS e BC, acrescente 2 pores de 200 L de TFST; aos tubos BP, soluo de anticorpo positivo (2 x 200 L); e, aos tubos BN, a soluo de anticorpo negativo (2 x 200 L). Idealmente, as leituras finais de absorbncia (k) correspondentes a esses brancos devem apresentar os seguintes valores: BS < 0,010; BC < 0,050; BP > 1,000; BN > 0,200. (g) Pr-incubao com soro anti-protena de soja Utilizando pipeta multicanal, adicione soluo de anticorpo positivo (2 x 200 L) aos tubos de amostras e padres. Coloque TFST (2 x 200 L) nos tubos externos restantes (00 na Tabela 1). Feche cuidadosamente com as tiras plsticas que vedam os microtubos. Inverta o suporte de microtubos trs ou mais vezes para misturar e coloque na estufa a 37oC por (30 1) minutos. (h) Etapa anticorpo Nos ltimos 10 min da etapa de pr-incubao (g), lave a placa de ELISA j temperatura ambiente, cerca de (45 - 60) minutos, utilizando um ciclo de 5 vezes. Remova o suporte de microtubos da estufa no tempo estipulado e inverta 3 vezes para misturar. Retire cuidadosamente as tiras plsticas vedadoras. Utilizando pipeta multicanal, transfira alquotas de 200 L de cada soluo para as cavidades na placa de ELISA na posio correspondente (Tabela 1). Coloque a placa tampada na caixa plstica, feche e incube a (120 2) min a 37oC. (i) Etapa conjugado Remova a placa ELISA da estufa, lave 10 vezes e enxugue como em (d). Adicione 200 L de TFST na cavidade do branco substrato (BS). Com auxlio da multicanal adicione soluo de conjugado a todas as outras cavidades (exceto BS) na mesma ordem de adio utilizada na etapa do anticorpo (h). Coloque a placa tampada na caixa plstica, feche e incube a (120 2) minutos a 37oC. (j) Etapa substrato Remova a placa da estufa, lave 10 vezes e enxugue. Utilizando multicanal, adicione 200 L da soluo de substrato a cada cavidade da placa na mesma ordem da etapa (h). Ento, coloque a placa tampada na caixa plstica, feche e incube por (30 0,25) minutos a 37oC. (k) Reao enzimtica e medio da cor Remova a placa ELISA da estufa e com ajuda da multicanal adicione alquotas de 50 L de soluo de 0,2 M de NaOH a todas as cavidades da placa, na mesma ordem da etapa do anticorpo. Proceda leitura da absorbncia a (405 410) nm da soluo de cada cavidade, usando leitora de ELISA ou equivalente; essa leitura deve ser realizada entre 5 e 60 minutos aps a adio da soluo de NaOH.
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Clculos Para cada placa, construa uma curva-padro (Figura 4) do log da concentrao de protena de soja padro como p de acetona (N x 6,25) nas 7 diluies seriais versus a correspondente absorbncia (mdia de 3 leituras). Calcule a concentrao de protena total (N x 6,25) em cada diluio de cada soluo de amostra. De cada mdia de absorbncia, leia na curva a concentrao de protena de soja correspondente em cada diluio da amostra. Calcule a massa de protena de soja por 100 g de protena total para as 3 diluies correspondentes a cada amostra de p de acetona. Se todos os 3 valores corresponderem poro central da curva de calibrao (isto , S2 a S6), utilize a mdia como resultado final. As absorbncias muito baixas implicam que as solues utilizadas estavam muito concentradas e um maior nmero de diluies seriais deve ser utilizado para um segundo procedimento de ELISA. Os resultados tambm podem ser calculados em termos de massa de protena de soja por 100 g de amostra como recebida ou em termos de peso do ingrediente de soja (protenas isoladas contm 88% de protena, concentradas 68% e texturizadas 50%, base seca, teores mnimos estabelecidos pela legislao vigente) por 100 g de amostra como recebida. Note que as trs maneiras de definir os teores de soja na amostra so diferentes e devem ser consideradas com cuidado.

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Figura 3 Procedimento esquemtico ilustrando as etapas individuais do mtodo ELISA para determinao de protena de soja.

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Figura 4 Curva-padro evidenciando a relao entre absorbncia e concentrao de protena de soja da soluo padro pelo mtodo ELISA.

O limite de quantificao do mtodo de 0,41 g/mL de protena de soja na alquota de anlise (com desvio-padro relativo de 2,4%) e de 0,14 g/100 g de protena de soja na amostra. A curvapadro abrange de 0,41 g/mL a 300 g/mL de protena de soja, limite superior com desvio padro relativo de 5,8% (DELLA TORRE et al., 2003). Referncias bibliogrficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 988.10). Arlington: A.O.A.C., 1995. chapter 39. p. 16-19. DELLA TORRE; J. C. M.; BARBOSA, S.F.C.; FERRACIOLI, V. R.; ZENEBON, O.; LICHTIG, J.; BERAQUET, N. J. Quantitative determination of comercial soy proteins in emulsion -type meat products by official ELISA procedure. In: 49th INTERNATIONAL CONGRESS OF MEAT SCIENCE AND TECHNOLOGY ICoMST, 2003. Proceedings Campinas: CTC-ITAL, 2003. p. 405-406.

Colaboradores Jussara Carvalho de Moura Della Torre, Regina S. Minazzi Rodrigues, Emy Takemoto, Snia Frana Correia Barbosa e Jaim Lichtig
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