CINVESTAV

Alteraciones en la expresin de componentes de la va WNT en cncer cervico-uterino

Estudio de una segunda modi icacin que coopera con la infeccin por el virus del papiloma humano de alto riesgo en la carcinognesis cervical

[IDavidMC]
Octubre 2 del 2009

DEPARTAMENTO GENTICA Y BIOLOGA MOLECULAR

Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del Instituto Politcnico Nacional

Unidad Zacatenco Departamento de Gentica y Biologa Molecular

Alteraciones en la expresin de componentes de la va WNT en cncer cervico-uterino

Estudio de una segunda modi icacin alternativa a la infeccin por el virus del papiloma humano de alto riesgo para la carcinognesis cervical

Tesis que presenta: Ivan David Meza Canales

para obtener el grado de Maestro en Ciencias en la especialidad de Gentica y Biologa Molecular

Directores de la Tesis: Dr. Patricio Gariglio Vidal Dra. Adriana del Carmen Aguilar Lemarroy

Mxico DF.

Octubre 2009

Este trabajo se hizo en colaboracin con los laboratorios de la Divisin de Inmunologa del Centro de Investigacin Biomdica de Occidente del Instituto Mexicano del Seguro Social. Se agradece la hospitalidad y apoyo prestado por todo el personal durante el proyecto, en especial al Dr. Alejandro Bravo Jefe de la Divisin.

Se agradece el apoyo de beca de Maestra proporcionado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa.

Este trabajo fue realizado bajo la asesoria del Dr. Luis Felipe Jave Surez del Centro de Investigacin Biomdica de Occidente del Instituto Mexicano del Seguro Social y el Dr. Jos Efran Garrido Guerrero y la Dra. Ma. Guadalupe Ortega Pierres del Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del Instituto Politcnico Nacional.

Resumen
El cncer crvico uterino (CaCU) sigue siendo un problema de salud pblica a nivel nacional y mundial, aun a pesar de la facilidad de su deteccin por pruebas citolgicas y de su tratamiento. El CaCU presenta un fondo causal multifactorial, donde procesos celulares se ven alterados de manera paulatina y en mltiples etapas. El principal factor etiolgico de esta enfermedad es la infeccin del epitelio cervical con los virus del papiloma humano de alto riesgo (hrVPH). No obstante, la infeccin viral per se no resulta su iciente para generar una neoplasia; cambios posteriores son necesarios para la progresin de las lesiones generadas por el virus a cncer. Recientemente, se ha propuesto la activacin de -catenina como una segunda alteracin importante para la transformacin maligna de las clulas epiteliales infectadas con hrVPH. -catenina es un factor transcripcional de reconocida actividad oncognica, cuya actividad es regulada por la va WNT. Estudios preliminares de nuestro grupo de trabajo, obtenidos mediante microarreglos de cDNA, han mostrado una expresin diferencial importante de esta va en lneas derivadas de cncer cervico-uterino, lo que sugiere que la expresin aumentada o disminuida de alguno(s) de estos genes pudiera estar implicada de manera importante en la carcinognesis cervical. En este trabajo se busc identi icar modi icaciones en la expresin gnica y proteica de componentes de la va WNT en lneas celulares derivadas de cncer cervico-uterino infectadas y no infectadas con hrVPH. A partir de un anlisis de microarreglos de lneas celulares derivadas de cncer cervico-uterino se seleccionaron genes de la va WNT con modi icaciones en su expresin, con posibles implicaciones en la carcinognesis cervical. Se realiz el diseo de oligonucletidos iniciadores espec icos para la ampli icacin de dichos genes por PCR punto inal y en tiempo real. Se obtuvo RNA y protenas totales, nucleares y citoplasmticas de cultivos de las clulas HeLa, SiHa, C33, HaCaT y cultivo primario de queratinocitos. El RNA obtenido fue retrotranscrito a su DNA complementario. Se estandarizaron las condiciones por ensayos de PCR de punto inal y luego, se realizaron ensayos de PCR en tiempo real para determinar y cuanti icar la expresin gnica diferencial. Finalmente, mediante anticuerpos espec icos y ensayos de Western blot, se busc corroborar a nivel de proteina los datos de expresin gnica obtenidos que consideramos de mayor relevancia. 22 genes con modi icaciones en su expresin fueron identi icados en los ensayos de microarreglos. Mismos que fueron evaluados por ensayos de PCR punto inal y en tiempo real. En 14 de ellos encontramos cambios importantes y reproducibles de expresin por PCR en tiempo real, de los cuales seis pudimos analizar por western blot. WNT7A, WNT16, WNT4, WNT10A, FZD10, Cyc-D1, HOXA9, WISP1 y WISP3 presentaron una disminucin en sus niveles de mRNA en las clulas derivadas de cncer cervico-uterino comparativamente con los cultivos no tumorignicos. Los niveles proteicos de Wnt7a y 16 fueron analizados y su disminucin fue corroborada. Solamente WNT5A y FZD10 presentaron niveles transcripcionales altos en CaCU; no obstante, los niveles proteicos de Wnt5a no correlacionaron de manera directa con los niveles del mRNA encontrados. Por otro lado, los patrones transcripcionales de los genes WNT10B, FZD3, c-MYC, LEF1 y -Catenina fueron menos claros. Sorprendentemente, -catenina y Lef1 se encontraron completamente disminuidos a nivel de protena en las lneas derivadas de CaCU. Este trabajo, aunque descriptivo, revela que alteraciones en las vas de WNT pudieran desempear un papel importante en el desarrollo del cncer cervical. Estos hallazgos podran ser importantes para generar herramientas de pronstico/diagnstico, o incluso terapias contra el cncer cervical.

Abstract
Cervical cancer remains a public health problem nationally and globally, even though the ease of their detection by cytologic testing and treatment. The main etiological factor of this disease is the infection of cervical epithelium with high risk human papillomaviruses (hrHPV). However, viral infection is considered only a irst step, since per se it is not suf icient to generate a tumor. Recently, it has been proposed that activation of -catenin might be implicated in the malignant progression of keratinocytes immortalized with hrHPV oncogenes. catenin is a transcription factor with recognized oncogenic activity, regulated by the WNT pathway. Preliminary studies of our working group, obtained by cDNA microarrays, have shown signi icant dierential expression of this pathway in cell lines derived from cervical cancer. This suggests that increased or decreased expression of one or more of these genes might be involved signi icantly in cervical carcinogenesis. Here, we have investigated the expression of key components of the WNT pathways to determine expression pro ile changes between nontumorigenic keratinocytes and tumorigenic cervical cancer derived cell lines. Three cervical cancer cell lines with dierent HPV type infection were tested (HeLa, SiHa and C33). We irst performed microarray experiments, and recognized 22 genes involve in the WNT pathways with dierent expression between the cell lines. However, only 14 of them could be validated with reproducible changes in their expression pattern by real-time PCR assays. WNT7A, WNT16, WNT4, WNT10A, FZD10, Cyc-D1, HOXA9, WISP1 and WISP3 presented a reduction in mRNA levels in cancer cells derived from cervical cancer compared with not tumorigenic cells. Wnt7a and Wnt16 protein levels were analyzed and their expression decline was corroborated. On the other hand, WNT5A and FZD10 presented high transcriptional levels in CC; however, Wnt5a protein levels did not correlate directly with mRNA levels found. Furthermore, transcriptional patterns of genes WNT10B, FZD3, c-MYC, Lef1 and -catenin were less clear. Surprisingly, -catenin and Lef1 protein levels were completely diminished in cervical cancer derived cell lines. Our results, although descriptive, indicate that alterations in the WNT pathways play a major role in the development of cervical cancer. These indings could be important to generate further prognosis/ diagnosis tools, or even anti-cancer therapies.

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...el llegar a donde se quiere depende de donde se est. Jose Saramago

Antecedentes

1.1 [El cncer cervico-uterino; un problema de salud mundial]

A nivel mundial, el cncer es la principal causa de mortalidad, tan slo en el 2007 se le atribuyen 7.9 millones de defunciones1. Entre los ms de cien tipos de neoplasias, el cncer cervico-uterino (CaCU) sigue siendo una de las neoplasia de mayor importancia en salud pblica a nivel nacional y mundial, aun a pesar de ser uno de los tipos de cncer de ms fcil deteccin (por cribado citolgico) y altamente tratables2. Es el segundo tipo de neoplasia ms frecuente que amenaza la vida de la poblacin femenina en el mundo, con una tasa de incidencia de alrededor de medio milln de nuevos casos por ao. Es responsable de aproximadamente 250,000 muertes al ao3, ubicndose en el quinto lugar de causa de muerte relacionada a cncer en mujeres a nivel mundial despus de cncer de mama, pulmn, estmago y colon-recto1.

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Figura 1. Distribucin porcentual de las defunciones por tumores malignos en la mujer. Puede observarse al cncer cervico-uterino como la segunda neoplasia con el mayor porcentaje de mortandad en la poblacin femenina en mxico, de 13.9 en el 2006 y 12.1 en el 2007.

INEGI. Estadisticas Vitales. defunciones 2006 y 2007. Base de Datos. Modificado de referencia 4.

Aunque la enfermedad se presenta de manera cosmopolita, existe una incidencia sesgada a poblaciones socio-econmicamente desfavorecidas; afectando principalmente a pases en vas de desarrollo, donde suele tomar la primera posicin de ocurrencia. En Mxico, actualmente representa la segunda enfermedad por cncer, con una incidencia reportada para el 2006 del 13 % y mortandad de 13.9 %4

1.2 [Etiologa mltiple del cncer cervical]

El CaCU corresponde a un proceso de transformacin maligna del epitelio cervical escamocolumnar estratificado. Donde clulas epiteliales sufren modificaciones a nivel molecular sobre procesos de regulacin del ciclo celular, que las llevan a un crecimiento anormal y acelerado, dando lugar a tumores que, en cierto punto de su evolucin y desarrollo, pueden provocar la ruptura de la membrana basal del epitelio, invasin y hasta la metstasis tumoral a rganos vitales.

El CaCU es una enfermedad conocida desde la antigedad, sin embargo, su conocimiento cientfico empez a mediados del siglo XIX. En 1842, cientficos italianos reportaron una incidencia prcticamente nula de cncer cervical en monjas catlicas, comparada con el resto de poblacin femenina5. Esto llev a sugerir la asociacin de la enfermedad con comportamientos sexuales, que posteriormente fueron

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reportados por epidemilogos y que, en bsqueda de agentes transmitidos sexualmente, llev al descubrimiento del virus del papiloma humano6.

El principal factor etiolgico reconocido de esta enfermedad es la infeccin del epitelio cervical con los virus del papiloma humano de alto riesgo (hrVPH)7. El papilomavirus ingresa a la mucosa cervical donde infecta de manera selectiva a queratinocitos de la capa basal del epitelio estratificado e induce su transformacin maligna8. 95 a 98 % de los casos de CaCU se asocian a la presencia de hrVPH9. No obstante, la prevalencia de este virus en la poblacin es generalizada; se estima que alrededor de un 75 % de las mujeres sexualmente activas presentan infeccin por algn tipo de papilomavirus y que tan slo el 1% de estos casos pudieran en algn momento progresar a cncer cervical. Por ende, otros factores etiolgicos han sido sugeridos. Harald zur Hausen propuso en 1982 la infeccin concomitante por el virus herpes simple (VHS) como una segunda etiologa del cncer cervical10. Estudios epidemiolgicos sugieren una posible interaccin biolgica entre estos agentes. En un ensayo comparativo de riesgos relativos de infeccin por uno o ambos tipos virales contrastado con mujeres no infectadas se encontr un potenciado riesgo de contraer CaCU10, 11. Sumado a esto, existe evidencia de co-infecciones por estos tipos virales en un tercio a un quinto de pacientes con displasias y CaCU12.

Otra alternativa reportada, es la exposicin a carcingenos, como estrgenos sintticos, humo de cigarros y humo por uso domstico de combustibles slidos como la lea6. Existe una relacin importante entre el uso estrgenos como el dietilestilbestrol (DES) y CaCU13, 14. Por algn tiempo (1940-1970) este compuesto fue utilizado en preparados farmacuticos por mdicos para prevenir partos indeseados, lo que di lugar a una gran variedad de problemas ginecolgicos, entre ellos, una incidencia aumentada de CaCU. De igual forma aunque en menor relacin, el humo del cigarro y la quema de combustibles slidos han sido fuertemente asociados a CaCU. Mujeres que fuman presentan niveles tres veces ms altos de 4-metilnitrosamino-1-3-piridil-1-butanona, un compuesto carcingeno reconocido del cigarro15.

El cncer es una enfermedad con un fondo causal reconocido como multifactorial, que slo pudiera ser explicado con las alteraciones consecutivas sobre las clulas, que generen cambios independientes.

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1.3 [Virus del Papiloma Humano, oncogenes y cncer]

Los papilomavirus conforman una nueva familia denominada Papillomaviridae16; un grupo de virus de pequeo tamao de 50 a 55 nm de dimetro, no encapsulados, de cpside icosahdrica conformada por 72 capsmeros, cada uno formado por un pentmero de la protena L1, que interacciona con la protena L2. Presentan un genoma de DNA de alrededor de 8,000 pb unido a histonas, con 8 marcos de lectura abiertos ubicados en una sola hebra de DNA policistrnica, que a su vez es dividida funcionalmente en tres regiones: una zona no codificante altamente polimrfica denominada regin larga de control (LCR), una regin codificante para genes de expresin temprana (E1, 2, 4-7) y una regin de secuencia conservada que codifica para los genes de expresin tarda (L1, 2).

Actualmente, se han descrito alrededor de 100 diferentes tipos de VPH ordenados en 16 gneros, de los cuales un tercio se encuentran relacionados con infecciones de tipo ano-genital de diversos niveles16. Estos son clasificados de acuerdo a su capacidad de transformacin maligna de la mucosa ano-genital en bajo, mediano y de alto riesgo. Siendo ste ltimo grupo de especial importancia en cncer cervical. Dentro de los tipos virales de alto riesgo, los tipos 16 y 18 son los de mayor importancia. Se estima que la infeccin por VPH-16 y 18 tiene entre el 15 y el 20%, de probabilidades de desarrollar una neoplasia17. Datos epidemiolgicos y clnicos soportan el papel oncognico de estos virus; 50 % de los casos se atribuyen al tipo viral 16, mientras que el 12 % al VPH18, seguidos de los tipos virales 45 (8%) y 31 (5%)18.

El papilomavirus ingresa a la mucosa cervical donde infecta de manera selectiva a queratinocitos de la capa basal del epitelio estratificado escamo-columnar, habitualmente en la zona denominada de transformacin, en la unin del epitelio cervical con el del cuello uterino. Normalmente en las clulas infectadas el genoma viral permanece de manera episomal, generando una infeccin transitoria que termina con la liberacin de las partculas virales al medio. No obstante, por mecanismo aun no del todo comprendidos, el genoma viral puede incorporarse al genoma celular, originando una infeccin persistente del virus, donde los mecanismos de regulacin del ciclo viral, y en consecuencia los de la

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Modificado de Woodman,C.B., Collins,S.I., & Young,L.S. 2007

Figura 2. Infeccin del epitelio cervical con el virus del papiloma humano, displasia y cncer crvico-uterino. El hrVPH ingresa a travs de microlesiones de la mucosa epitelial y se introduce a las clulas del estrato germinativo, donde modifica los proceso de regulacin del ciclo celular. En una infeccin transitoria, el genoma del virus se mantiene de manera episomal y se lleva acabo la porduccin y liberacin de particulas virales al lumen. En una infeccin persistente, por el contrario, el genoma viral se integra al genoma celular y se pierde la regulacin de la expresin de los oncogenes E6/E7, que inmortalizan a los queratinocitos generando una displasia, que en un momento dado puede progresar a una neoplasia y cancer invasor.

clula hospedera, se ven afectados de modo importante19. En este segundo escenario el progreso a una neoplasia es latente8.

Al ingresar, el virus el genoma viral se traslada al ncleo donde los genes de la regin temprana son expresados gracias a la actividad de factores transcripcionales endgenos20. Las primeras protenas expresadas corresponden a los genes E1 y E2, factores necesarios para la replicacin viral y la expresin del resto de los genes. Luego son expresadas las protenas E5, E6 y E7. Estos, en especial los ltimos dos, son estimuladores de la proliferacin, que aceleran la transcripcin y la replicacin del genoma viral al interferir con mecanismos de control del ciclo celular y diferenciacin21.

Interferir en los procesos de proliferacin, muerte y diferenciacin hasta cierto punto es importante para llevar a cabo el ciclo de vida viral en la clula22. No obstante, el virus tambin requiere de la divisin

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de la clula, por lo que la actividad debe ser regulada. E2 funciona como regulador de la expresin de E6 y E7, disminuyendo sus niveles con la finalidad de que la clula pueda progresar por el ciclo celular. Cuando el genoma viral se incorpora al genoma celular, la insercin suele irrumpir el marco de lectura para el gen E2, perdindose la transregulacin ejercida por esta protena sobre E6 y E723.

E6 y E7 son reconocidos oncogenes, cuyo estudio ha demostrado que los productos de stos son necesarios para la transformacin celular. La actividad central de estos oncogenes, E6 y E7, reside sobre la regulacin de los genes supresores de tumores p53 y pRb, respectivamente24. E6 se une a travs de E6AP a p53, un reconocido supresor de tumores, induciendo su ubiquitinacin y degradacin por el proteosoma. Mientras que E7, por otra parte, se une a pRb, un represor del factor transcripcional de ciclo celular E2F, promoviendo su inactivacin por fosforilacin y posterior degradacin.

Adicionalmente, otros mecanismos de transformacin han sido sugeridos para ambos oncogenes25. Se conoce la capacidad de E7 de interactuar con una serie de otras protenas reguladoras, como: la histona desacetilasa (HDAC), los factores transcripcionales AP-1 y TBP, a complejos reguladores del ciclo ciclinas-cdk, a los inhibidores de cdk p21 y p27 y a la piruvato-cinasa M2 (M2-PK)26. Todos sitios importantes de regulacin del ciclo celular.

Figura 3. Regulacin del ciclo celular por los oncogenes E6 y E7. Una vez integrado el genoma viral se pierde la transregulacin, ejercida por E1, de los oncogenes virales. stos entonces intervienten con los procesos de regulacin del ciclo celular. Los mecanismos estudiados mejor descritos para ambos oncogenes se esquematizan aqui. E6 se una p53 e induce su degradacin evitando su actividad de factor transcripcional y de modulador. E7 se une a la proteina de retinoblastoma desacoplando la represin del factor transcripcional E2F, factor muy importante para el progreso del ciclo celualar.

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E6 por su parte, adems de unirse selectivamente a p53 se une a Bak, una protena antiapopttica de la va mitocondrial, a quin induce su degradacin probablemente por la misma va que a p5327, evadiendo de esta forma la muerte celular por apoptosis. Adicionalmente, E6 interacta directa e indirectamente con factores transcripcionales tales como CBP/p300, c-myc y SP128, regulando la expresin de una gran variedad de genes como el de la helicasa A de RNA, NF-kappaB, la subunidad pequea de la telomerasa humana (hTERT), el factor de crecimiento endotelial (VEGF) y el factor de crecimiento tumoral (TGF)128, 29.

1.4 [Infeccin por hrVPH, un proceso necesario pero no suficiente]

Pese a todo esto, la infeccin viral per se no basta para generar un proceso neoplsico; es ms bien considerada como una primera etapa que predispone a las clulas del tejido epitelial a cambios posteriores para dar origen a una neoplasia8, 9.

Como se haba comentado antes, la infeccin viral tiene un carcter generalizado y slo un porcentaje pequeo de stas, alrededor del 1 %, progresa a cncer cervical30. Queratinocitos transfectados con los oncogenes, por separado y en conjunto, no obstante adquieren un carcter inmortal, no presentan propiedades tumorignicas salvo se agreguen modificaciones adicionales, como la activacin del oncogn RAS31. Ms aun, ratones transgnicos que expresan selectivamente estos oncogenes en las clulas basales del epitelio, por si solos no generan un nmero de tumores espontneos significativamente

Figura 4. Historia natural del VPH y cncer cervico-uterino. La persistencia de la infeccin con el VPH en la poblacin es generalizada; no obstante, solo un porcentaje pequeo de esta poblacin genera lesiones premalignas y una proporcin menor aun llega a desarrollar cancer cervico-uterino.

Modificado de Schiffman M. Castle P.N. Engl J Med 2005; 353: 2101-2104

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mayor que los ratones controles; pero la susceptibilidad a generar neoplasias cuando se agrega otro agente carcingeno si aumenta considerablemente13.

Es evidente entonces que factores adicionales, generados probablemente por los mismos oncogenes virales (E6 y E7) como proceso de la inestabilidad genmica generada o inducidos por factores alternos medio-ambientales, tales como las etiologas mltiples antes mencionadas o el propio fondo gentico, son necesarios para la tumorignesis cervical.

Recientemente se ha propuesto como una alternativa a una segunda modificacin, que da lugar a la transformacin maligna del epitelio despus de la infeccin por el hrVPH, alteraciones en la va Wnt. Basada en que, queratinocitos transfectados con los oncogenes E6 y E7 adquieren un fenotipo maligno al inducir in vitro la activacin de la va cannica de Wnt32.

Esta va se ha visto con frecuencia alterada en una gran variedad de neoplasias, como: cncer de colon, prstata, pncreas, rin, carcinoma heptico, hepatoblastoma, adenoma de tipo pulmonar fetal, melanoma, tumores de cerebro, meduloblastomas, y recientemente en CaCU33-37.

La va de sealizacin de Wnt es de gran importancia en diversos procesos biolgicos, como la embriognesis, el desarrollo y la regeneracin de tejidos, puesto que estriba en una gran variedad de funciones celulares tales como polaridad, migracin, proliferacin y diferenciacin celular38-42; todos procesos que usualmente son afectados de manera importante en el desarrollo de cncer.

1.5 [La va Wnt; una compleja red de sealizacin]

Las protenas Wnt comprenden una gran familia de lipoglicoprotenas de secrecin transductoras de seales, que se unen a receptores transmembranales tipo serpentinas denominados frizzled (FZD) y a protenas relacionadas con receptores de lipoprotenas de baja densidad (LRP) tipo 5 643.

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El primer gen de esta familia fue descrito en 1982 por Nusse y Varmus al identificar el sitio de integracin del virus del tumor mamario de ratn; donde se encontr la expresin incrementada de un gen al que denominaron Int144, que posteriormente en 1987 fue identificado como homologo del gen wingless (Wg)45, antes descrito por Sharma en Drosophila melanogaster46. Actualmente, el acrnimo Wnt proviene de la combinacin de Wg y int35.

Hasta la fecha, en mamferos, existen reportados 19 ligandos homlogos Wnt, agrupados en funcin de su homologa de aminocidos ms que por su funcionalidad. Todos estos presentan una secuencia seal de secrecin y un patrn conservado de 22 a 23 cistenas, adems de diversos sitios de glicosilacin y, ordinariamente, un sitio de lipidacin (palmitoilacin)43. La complejidad de esta va radica en que cada ligando tiene la capacidad de unirse a diferentes receptores. Diez receptores Fzd han sido descritos, a los que se suman un par de receptores extraordinarios tirosina-cinasa (Ror y Ryk)47.

Si bien, usualmente Wnt es descrita como una va, los efectos biolgicos de este grupo de protenas se asocian principalmente a tres vas de sealizacin independientes, aunque interrelacionadas: 1) la va cannica tambin denominada -catenina, 2) la va dependiente de calcio y 3) la va de polaridad planar celular (PCP)47. Poco se sabe sobre la regulacin especfica de cada una de estas vas. El ligando Wnt parece no ser un factor determinante de una sola va, puesto que se ha observado la capacidad de un solo ligando de activar vas diferentes haciendo uso de receptores distintos48. De igual forma, el receptor tampoco parece determinar la va de sealizacin, ya que mismos receptores pueden activar vas distintas49. El contexto celular parece ser un factor de gran importancia para determinar la activacin especfica de una va; por lo que el estudio de la compleja red de sealizacin Wnt debe ser detallada en cada modelo celular. Cabe resaltar que otras vas alternativas han sido igualmente descritas, no obstante, slo en determinados contextos celulares especficos, como la va de PPARgama50. Sumado a esta complejidad, debe considerarse adems que, como molculas de expresin, los ligandos Wnt pueden actuar tanto de modo autocrino como paracrino e incluso endocrino51.

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Modificado de Frank J. T. Staal et al.,2008 Figura 5. Vas de Wnt. (a) La va cannica Wnt o Wnt/beta-catenina tiene como objetivo activar al factor transcripcional beta-catenina. El ligando se une a su receptor e induce la disgregacin del complejo de degradacin conformado por Axina, APC, GSK3beta, CK1 y otros factores. La acomulacin de beta-catenina le permite migrar a ncleo y activar una gran variedad de genes, como c-myc y ciclina-D1. En (b) la via de Wnt/polaridad de planar celular, promueve la reorganizacin del citoesqueleto de actina e induce la activacin del factor transcripcional AP1. (c) la va de Wnt/calcio que igual actua sobre el esqueleto y enciende ademas cinasas dependientes de calcio y factores transcripcionales.

1.6 [Va cannica de sealizacin; Wnt/-catenina]

Es usualmente considerada como la principal va de sealizacin, fue la primera va descrita para los ligandos Wnt. Tambin conocida como la va -catenina, debido a que tiene como objetivo estabilizar y activar a este factor transcripcional, con la finalidad de que emigre al ncleo y active la transcripcin de mltiples genes en colaboracin con cofactores transcripcionales, como: TCF/LEF, p300/CBP, Brg1, parafibromin/Hyrax y PYGO39, 42, 52, 53. La estabilizacin de -catenina se consigue inhibiendo la fosforilacin de su dominio amino terminal, a fin de evitar su reconocimiento por la ubiquitin-ligasa TrCP54.

En condiciones basales, -catenina se encuentra localizada principalmente 1) en las uniones adherentes, asociada a E-cadherina, alpha-catenina y filamentos de actina, y 2) en menor cantidad en el citoplasma unido a axina dentro de un complejo de destruccin (degradosoma) conformado adems por las protenas APC, PP2A, GSK3, casen cinasa (CK) 1alpha, entre otras. Este complejo induce la fosforilacin

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secuencial de -catenina, primero por la CK1alpha en la ser-45 y luego por GSK3 en las Ser-33, Ser37 y Thr-41, lo que permite su reconocimiento por la ubiquitin-ligasa TrCP, misma que induce la degradacin por medio del proteosoma55, 56.

Con la activacin de la va, por unin del ligando Wnt con sus receptores, la protena Dvl como homopolmero se asocia al receptor Fzd e incorpora al complejo de degradosoma; permitiendo que GSK3 y la CK1alpha acten sobre el dominio PPPSP de la porcin intracelular del co-receptor Lrp. El dominio PPPSP fosforilado incorpora a la protena de andamiaje axina, lo que disocia al complejo de degradacin y evita la degradacin induciendo la acumulacin del factor transcripcional -catenina en el citoplasma57, 58. De esta forma, -catenina puede migrar al ncleo y encender la expresin de diversos genes, como c-myc, ciclina D1, Wisp1/2/3, CTL-4, FGF4/9, survivina, y reprimir la de otros42, 59. Muchos de estos genes se encuentran implicados en proliferacin celular, diferenciacin, regulacin del ciclo celular y apoptosis e inclusive han sido descritos como oncogenes; razn por la que, cambios en la regulacin de -catenina se sugieren importantes en diferentes neoplasias. Usualmente, actuando como protooncogn, puesto que su activacin se encuentra asociada a proliferacin54; no obstante, algunos estudios recientes contraponen esta idea60, 61.

1.7 [Va de polaridad planar celular]

Dentro de las vas de sealizacin no cannicas de -catenina, se encuentra la va involucrada en el proceso de polaridad planar celular, por lo que se define como la va de Wnt/PCP (PCP, del ingls planar cell polarity), tambin designada como la va Wnt/JNK, debido a que una de sus vertientes es la de activar a esta cinasa. sta va ha sido ampliamente descrita en Drosophila melanogaster y Xenopus62. Era considerada, hasta hace poco, nicamente en la embriognesis y desarrollo; no obstante, reportes recientes sugieren que pudiera tener funciones en otros procesos celulares, como migracin celular y angiognesis63, 64.

La polaridad planar celular es un proceso en el que las clulas en un epitelio se polarizan de manera

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uniforme para establecer una zona de estructuras alineadas como la orientacin de pelo o el epitelio en el rgano de Corti65. Este mecanismo requiere de una localizacin asimtrica de las protenas que intervienen, por medio de un proceso que involucra dos etapas: la localizacin apico-lateral de las protenas de polaridad planar hacia las uniones adherentes, seguido de una distribucin asimtrica en el eje prximo-distal. El proceso requiere de la actividad de las proteinas GTPasas pequeas, RhoA y Rho-cinasa (ROCK) para la remodelacin del citoesqueleto y la activacin de otros genes blanco a nivel transcripcional regulados por c-Jun/AP1; fenmenos mediados por la va Wnt/PCP (para una completa revisin ver66).

La activacin de las GTPasas, RhoA y ROCK, se sugiere se lleva a cabo por incorporacin de RhoA a DAAM (Disheveled associated activator of morphogenesis) que a su vez se une a la protena Dvl67. En este proceso tambin se ven involucradas las protenas Inversina y Diversina, que al ser sobre-expresadas, al igual que DAAM, activan la vertiente de RhoA de la va de Wnt/PCP63. Diversina se asocia con las protenas Gsk3 y Axina del degradosoma e incorpora a la CK-Iepsilon, que induce la degradacin del factor transcripcional -catenina, de tal forma que inhibe la va de sealizacin cannica y permite la va Wnt/PCP68. Siendo un punto importante de control para determinar la va de sealizacin que se llevar a trmino. RhoA activa por fosforilacin a ROCK, que a su vez activa a la cinasa LIM que inhibe a la protena despolarizante de actina cofilina, permitiendo el rearreglo del citoesqueleto69.

Adicionalmente, la activacin de c-jun se sugiere se lleva a cabo por la va de las MAPK (JNK/MAPKK7/ MAPKKK), activadas por las GTPasas cdc42/RacI, que a su vez son activadas por la protena Galpha12/13 y PI3Kgamma64. stas ltimas incorporadas a los receptores Fzd de la va PCP. Aun no es claro cmo los receptores Fzd sealizan de manera diferencial entre las vas Wnt/-catenina y Wnt/JNK. Un modelo propone que probablemente la va de PCP no requiera de los ligandos Wnt, puesto que no existen ligandos reportados para sta va al menos en Drosophila64; sin embargo, en vertebrados existe una gama mucho mayor de ligandos, algunos de los cuales pudieran estar asociados a sta va; de hecho, se han descrito factores de la va Wnt/PCP que requiren Wnt70.

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1.8 [Va Wnt dependiente de calcio]

La participacin del calcio como regulador secundario de las seales de los ligandos Wnt fue encontrada cuando al expresar Wnt5a y Wnt11 en embriones de pez cebra, se observ un incremento en los flujos de calcio en la capa que envuelve al blastodisco71.

La va Wnt de calcio (Wnt/Ca++) asume que la interaccin especifica de algunos ligandos (Wnt5a y Wnt11) con algunos receptores definidos (Fzd2, Fzd5, Fzd7, Ror2)72, en ausencia de los co-receptores Lrp5/673, genera un flujo de calcio intracelular capaz de activar a las cinasas sensibles de calcio, como cPKC (d/ing: classical protein kinase C) y CamKII (d/ing: calcium/calmodulin dependent kinase II), que su vez activan a factores transcripcionales como NF-AT (d/ing: nuclear factor of activated T cells) y cinasas reguladoras como NLK (nemo like kinase)71. NLK regula negativamente la expresin mediada por los factores TCF/LEF64, 74. sta propiedad de antagonizar la actividad de la va Wnt/-catenina, y tomando en consideracin la cualidad oncognica de esta ltima va, permite sugerir, al menos por este mecanismo, a la va Wnt/Ca++ como supresora de tumor48.

El mecanismo exacto por el cual esta va es activada an no es del todo claro y es posible que en realidad sea ms de un mecanismo y que dependan del contexto celular. Una alternativa pudiera ser la activacin por medio de la fosfolipasa-C (PLC), activada a travs de protenas G heterotrimricas, con la subsecuente generacin de segundos mensajeros fosfoinositol 1,4,5-fosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). Los receptores fzd son molculas tipo serpentina con siete dominios transmembranales similares a los descritos receptores acoplados a protenas G (GPCRs) y cuya actividad como tal ha sido anteriormente descrita anteriormente75. IP3 puede entonces unirse a receptores sobre el retculo endoplsmico generando la liberacin de calcio intracelular, mientras que el DAG puede activar a PKC. En apoyo a esta alternativa, la sensibilidad a la toxina de pertusis ha sido descrita para la va de calcio activada por el receptor Fzd274.

Otra alternativa descrita, es la activacin directa de la protena PKC. Se ha reportado la capacidad de Dvl,

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de manera independiente a su actividad en la va de cannica, de interactuar con protenas de la familia PKC, PKCdelta y PKC atpica (aPKC)76, 77. Dvl se ha visto implicada en las tres va de sealizacin, por lo que pudiera ser una protena clave en dirigir la activacin de una u otra va. La interaccin con una protena en un determinado contexto celular pudiera ser una alternativa para esto.

Una tercera opcin por considerar, es la activacin a travs de fosfodiesterasas (PDE, d/ing: phosphodiesterases). Las protenas G, pueden actuar por medio de PDE sensibles a guanosina 3,5monofosfato cclico (GMPc) activando a la protena cinasa A (PKA). PKA tiene la capacidad de promover el ingres de calcio extracelular en algunos modelos celulares78. Inhibidores de PDE de GMPc suprimen la activacin de la va Wnt/Ca++, promovida por el receptor FZD279.

Es evidente que las diferentes vas de sealizacin de Wnt presentan una interrelacin no slo en el uso de los ligandos y receptores, sino a distintos niveles, por lo que el estudio concomitante de las tres vas es un tanto inevitable y necesario.

1.9 [Otros factores moduladores]

Adicionalmente, se han descrito otras protenas moduladoras de la va, que corresponden a receptores solubles. Estos receptores no guardan relacin alguna con los receptores Fzd o Lrp, son codificados por secuencias gnicas completamente distintas. Tienen, no obstante, un dominio rico en cistenas (CRD), con el que interactan con los ligandos Wnt. Dos grupos de estos receptores se conocen, las protenas Dickkopf (Dkk) y los receptores solubles tipo frizzled (sFrp/FzB), estos ltimos descritos por primera vez como SARPs (protena secretada relacionada a la apoptosis) por su actividad estudiada en apoptosis. Ambos moduladores ha sido descritos como antagnicos de la va cannica
80 81, 82

. Por

lo que se sugieren como factores con actividad supresora de tumor. El silenciamiento epigentico de estos genes ha sido reportado en una variedad de tipos de cncer83-85. No obstante, algunos reportes contraran la actividad supresora de algunos de estos receptores86, 87.

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Un modulador soluble positivo ha sido reportado hasta la fecha. A diferencia de los anteriores, una variante obtenida por corte y empalme alternativo del gen Fzd4, denominado FZD4S88. Sin embargo, su actividad en clulas humanas, a pesar de haber sido descrito por primera vez en clulas embrionarias de rin humano, no ha sido comprobada; los ensayos de actividad reportados fueron realizados en un modelo de Xenopus.

Los ligandos, como se menciono antes, pueden activar ms de una va, incluso al mismo tiempo; reportes sugieren la posibilidad activar inclusive las tres vas en un solo modelo. Considerando, adems, la actividad pleiotrpica no del todo definida de los ligandos, es muy probable que estos moduladores, como los co-receptores jueguen un papel muy importante en definir las vas especficas a activar en un momento dado.

1.10 [Wnt y cncer]

La relacin de Wnt con cncer tiene su origen desde el descubrimiento de la va en mamferos, donde se sugiere la actividad oncognica del ligando Wnt1 en cncer de mama44. No obstante, el estudio y avance de sta va fue en un inicio dirigida exclusivamente sobre la embriognesis y el desarrollo; hasta 1993 que Vogelstein, Kinzler y Polakis reportaron la interaccin entre el conocido oncogn APC y el componente de la va Wnt -catenina35.

APC fue descubierto como un factor asociado a una enfermedad hereditaria conocida como poliposis adenomatosa familiar (FAP)70. Pacientes con sta condicin desarrollan cientos a miles de plipos adenomatosos en el colon, que si no son removidos por ciruga, suelen evolucionar a carcinomas malignos. 85 % de los casos de cncer de colon presentan mutaciones en esta protena89. APC forma parte del complejo de degradacin de -catenina en el citoplasma. Las mutaciones en APC evitan su interaccin con las protenas de andamiaje Axina 1/2, lo que inhibe la fosforilacin NH2-terminal de catenina y por ende su reconocimiento y degradacin por el proteosoma.

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-catenina es ahora ampliamente reconocido como un importante protooncogn, que activa la expresin de muchos genes involucrados en procesos primordiales para la carcinognesis, muchos de ellos a su vez reconocidos oncogenes, como c-myc. Mutaciones en el extremo NH2-terminal de -catenina, que al igual que en APC, permiten su acumulacin citoplasmtica. Estas mutaciones se han observado en una gran variedad de tipos de cncer (melanoma, pilomatricoma, carcinoma hepatocelular, medulloblastoma, tumores gastrointestinales, tumor de Wilms, entre otros), incluyendo algunos casos de cncer de colon35.

Otro cambio de sta va, que de igual forma activa al factor transcripcional -catenina, son las mutaciones observadas para el Gen WTX (FAM123B) en tumores de Wilms90. WTX es tambin un componente del complejo de degradacin descrito recientemente, que se une a -catenina e induce su degradacin91, 92. De tal forma que mutaciones con prdida de funcin de esta protena pudieran explicar la activacin anormal de -catenina en algunos casos de tumores de Wilms (30%)90.

As tambin, los niveles de -catenina se han visto incrementados en el citoplasma y ncleo en neoplasias donde no se han observado mutaciones de este factor u de alguno otro de la va93-95, sugiriendo la activacin en por algn otro mecanismo de la va Wnt. La actividad aumentada de -catenina puede deberse a diferentes enfoques; extrnsecos como intrnsecos. Una posibilidad recae en la sobreexpresin y activacin parcrina o autcrina por ligandos Wnts y receptores de la va cannica (Wnt8, FZD4) o bien por el contrario, con la disminucin de Wnts o receptores moduladores antagnicos de la actividad de -catenina (Wnt5A, Wnt11, FZD2, FRPs, DKK).

Adems de las alteraciones sobre -catenina, numerosos cambios a nivel de expresin se han reportado para muchos de los componentes de la va; ligandos y receptores, as como de protenas de la red de sealizacin, en mltiples tipos de cncer. Una gran cantidad de trabajos recientes describen la participacin oncognica y supresora de tumor de esta va en diversas neoplasias entre ellas el CaCU.

1.11 [Wnt y cncer cervico-uterino]

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La relacin de la red de sealizacin Wnt y el CaCU ha sido, hasta la fecha, poco investigada. El estudio de sta red de vas en crvix se ha limitado, y no en extenso, sobre el desarrollo y diferenciacin de las clulas y los tejidos del rgano reproductor, donde se ha reportado la participacin y actividad de algunos ligandos, como son Wnt4, 5a, 7a y 9b14, 96.

En cncer cervical, el estudio se resume a hallazgos, pocos convincentes aun, de la expresin y la actividad del factor transcripcional -catenina, el cual se ha reportado expresado en de un 3797 a 7337 % en biopsias, y, recientemente, a la represin epigentica de moduladores solubles negativos (Dkk y sFRP) de la va83, 98-101; dejndo de lado la intervencin de las vas alternas en este proceso.

Ms aun, la expresin nuclear y activacin de -catenina no ha sido explicada por completo. Estudios indican que este factor no se encuentra mutado significativamente en cncer cervical102, como lo sta en otros tipos de cncer como el colorectal. Adicionalmente, cabe resaltar que la falta de reguladores negativos no explica la activacin de la va cannica o alguna otra de las vas necesariamente, sino slo sugiere la posibilidad de que pueda suceder. La presencia de un ligando o de cambios dentro de factores internos de la va son necesarios para explicar la actividad de la va en cncer cervical. Asimismo, hasta la fecha ningn artculo ha sido publicado, en el cual se analice la expresin gnica o proteica de los ligandos de Wnt en CaCU y su relacin con el virus del papiloma humano o con los oncogenes virales.

Una reciente observacin, por Perez-Plascencia, evidencia la importancia de esta va al observar, mediante microarreglos e hibridaciones in situ, un ligero aumento de algunos componentes de la va (FZD2, GSK3, PPARgamma y C-MYC) en muestras de carcinoma cervical comparado con epitelio normal36. As mismo, estudios preliminares nuestros de microarreglos de cDNA, comparando queratinocitos no tumorignicos con lneas celulares derivadas de cncer crvico uterino y ratones transgnicos K14E6 con ratones normales103, sugieren cambios de expresin importantes en componentes de la va Wnt. Estos cambios pudieran ser de importancia para explicar la carcinognesis cervical, as como los cambios antes reportados de esta neoplasia y cncer cervico-uterino.

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Dilucidar los genes de la va de Wnt que juegan un papel clave en la carcinognesis cervical, podra permitirnos identificar de manera especfica a aquellos genes cuyos niveles de expresin pudieran servir como una herramienta de diagnstico o pronstico en la progresin maligna.

Somebody says: Of no school I am part, never to living master lost my heart; no more can I be said to have learned anything from the dead. That statementsubject to appeal- means: Im a self-made imbecile.

Johanne Wolfgang von Goethe

Planteamiento y justificacin del problema

El cncer cervico-uterino es, a la fecha, la segunda causa de muerte por cncer en la mujer en nuestro pas. El principal factor etiolgico subyacente de esta enfermedad es la infeccin del epitelio cervical con el virus del papiloma humano de alto riesgo. No obstante, la infeccin viral per se no resulta suficiente para generar un proceso neoplsico, ya que la mayora de estas remiten espontneamente despus de un determinado tiempo. Modificaciones alternas deben originarse en las clulas epiteliales infectadas a fin de que exista una progresin tumorignica en el epitelio cervical. Recientemente, se ha propuesto la activacin de -catenina como una segunda alteracin importante para la transformacin maligna de las clulas epiteliales infectadas con el hrVPH.

Mltiples reportes sustentan la actividad incrementada de este factor transcripcional en diversos tipos de cncer. No obstante, alteraciones del factor -catenina en cncer cervico-uterino no han sido encontradas. Usando la tecnologa de microarreglos de DNA, estudios previos en nuestro grupo de trabajo, han sugerido alteraciones en la expresin de algunos genes de la va WNT. La va WNT regula la

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actividad del factor transcripcional -catenina y, de manera inversa, la actividad de -catenina modifica la expresin gnica de algunos componentes de la va WNT. Reportes cientficos dan cada vez una mayor importancia a la va de sealizacin en la carcinognesis cervical; no obstante, hasta la fecha no se han determinado la funcin y los genes de esta va que juegan un papel clave durante el proceso de la carcinognesis cervical. Algunos estudios cualitativos, incluyendo los nuestros, han evidenciado posibles genes con alguna importante implicacin en cncer cervical. No obstante, su validacin con ensayos cuantitativos son indispensables para evaluar la importancia de ellos y establecer relaciones que pudieran explicar su participacin y hacer evidente nuevos puntos de estudio.

El presente trabajo plantea evaluar de manera individual y a nivel molecular aquellos genes de la va WNT que se sugieran podran estar relacionados en la carcinognesis cervical, mediante ensayos cuantitativos de expresin gnica y proteica.

Those who stand for nothing fall for anything.

Hipotesis

Alexander Hamilton

Existen modificaciones en la expresin de componentes de la va WNT en clulas derivadas de cncer cervico-uterino, como resultado de modificaciones independientes a la infeccin con hrVPH.

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No hay viento favorable para el que no sabe donde va.

Objetivos

Seneca

4.1 [Objetivo general]

Identificar modificaciones en la expresin gnica y proteica de componentes de la va WNT en lneas celulares derivadas de cncer cervico-uterino infectadas y no infectadas con HR-VPH.

4.2 [OBJETIVOS PARTICULARES]

1. Analizar, en estudios de microarreglos en lneas derivadas de cncer cervico-uterino, genes de la va Wnt con posible actividad oncognica o supresora de tumor y seleccionar aquellos de mayor importancia para su posterior estudio.

2. Comparar mediante PCR en tiempo real, el perfil de expresin de los genes de la va WNT electos en lneas celulares derivadas de cncer cervico-uterino con el encontrado en queratinocitos no tumorignicos.

3. Corroborar algunos de los cambios de expresin gnica encontrados a nivel de protena, mediante ensayos de Western blot.

4. Correlacionar las alteraciones de las molculas de la va de sealizacin de WNT con la infeccin del HR-HPV.

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Somos lo que repetidamente hacemos. La excelencia no es, pues, un acto, sino un hbito. Aristteles

Materiales y mtodos

5.1 [Modelo de estudio]

El modelo experimental de estudio fueron lneas celulares derivadas de cncer cervico-uterino, cada una con etiologa diferente: HeLa y SiHa con infeccin por hrVPH 18 y 16, respectivamente, y C33 que no presenta infeccin viral, pero si mutaciones en los genes p53 y pRB. Las tres lneas celulares fueron obtenidas del American Type Culture Collection (ATCC). Adicionalmente, como controles de clulas epiteliales no tumorignicas, se utilizaron la lnea celular HaCaT (proporcionada por la Dra. Boukamp, DKFZ-Heidelberg, Alemania) y cultivos primarios de queratinocitos (obtenidos en el laboratorio).

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5.2 [Diseo experimental]

En breve, se realiz el cultivo de las lneas celulares a partir de los cuales se obtuvo el RNA total y las protenas totales, nucleares y citoplasmticas. El RNA total fue retrotranscrito a su DNA complementario (cDNA), haciendo uso de oligo-dT con el fin de conservar slo el RNA mensajero. Posteriormente, el cDNA fue utilizado para las reacciones de estandarizacin de los oligos y, una vez establecidas las condiciones, para los ensayos de PCR tiempo real, en base a los cuales se realiz el anlisis cuantitativo de expresin gnica relativa. Por otra parte, las protenas de aquellos genes con cambios de expresin gnica importante observada por PCR tiempo real y con probables implicaciones en carcinognesis, fueron corridas por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, realizndose la inmunodeteccin con anticuerpos especficos. Los experimentos por

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PCR en tiempo real fueron realizados a partir de 3 diferentes extracciones de RNA y los Western blots se realizaron al menos por duplicado de dos extracciones de protenas independientes.

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5.3 [Cultivo celular]

Las lneas celulares fueron propagadas como cultivo adherido en monocapa a la superficie, en frascos de cultivo de 75 cm2, con medio DMEM suplementado con suero fetal bovino inactivado (10%), penicilina (100 u/ml) y estreptomicina (100 g/ml), a una temperatura de 37 C y una atmsfera al 5 % de CO2 y 95 % de humedad relativa. Todos los reactivos fueron obtenidos de GIBCOTM Invitrogen Co.

El pasaje de las clulas se realiz cada tercer o quinto da, segn la confluencia y necesidades experimentales. Para ello, las clulas eran lavadas con solucin salina de fosfatos (PBS) 1x, e incubadas con 1 ml de tripsina (0.25 % g/v)- EDTA 4Na (0.038 % g/v) a 37C por alrededor de cinco minutos hasta el desprendimiento total de las clulas, verificado al microscopio. La tripsina era inactivada con un volumen suficiente de medio de cultivo suplementado (9 ml) y diluciones del cultivo eran realizados: dejando tan slo una alcuota de las clulas resuspendidas en el frasco de cultivo y ajustando el volumen final a 15 ml con medio fresco suplementado.

Para los ensayos de extraccin de RNA y protenas, el nmero de clulas fue evaluado por exclusin de azul de tripano (1:1) en cmara de Neubauer y, una cantidad determinada de clulas fueron sembradas en cajas de cultivo p100 o p150 respectivamente, 24 hrs antes de la extraccin. La cantidad de clulas sembradas aseguraba una confluencia entre el 70 y 80 % para el da del ensayo. Todos los procedimientos fueron realizados bajo estrictas condiciones de asepsia y manipulacin, en campana de bioseguridad nivel II, para evitar contaminaciones de cualquier tipo.

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5.4 [Obtencin de Queratinocitos]

Queratinocitos primarios fueron obtenidos a partir de prepucio de recin nacidos. En breve, el tejido fue colectado y tratado con antibiticos en medio de cultivo por 24 hrs. Luego el tejido conectivo y graso fue removido de manera cuidadosa, y el tejido epitelial fue cortado en fragmentos menores a 1 mm, que fueron tratados con 25 U/ml de colagenasa (Sigma-Aldrich, Inc.) y dispasa (GIBCOTM, Invitrogen Co.) por toda la noche a 4C, con la finalidad de facilitar la separacin de la epidermis. El tejido epidermal fue entonces digerido con 2 mL de tripsina-EDTA 0.25% por 30 minutos a 37C con agitacin constante. Terminada la incubacin, la tripsina fue neutralizada con medio DMEM suplementado con SFB. Las clulas en suspensin fueron colectadas por centrifugacin y resuspendidas en medio nuevo para queratinocitos adicionado con extracto de glndula de pituitaria, factor de crecimiento epidermal y antibiticos (GIBCO, Invitrogen Co.) en frascos de cultivo previamente tratados, toda la noche, con SFB, con la finalidad de incrementar la adhesin celular. Los queratinocitos fueron mantenidos en cultivo tal como se menciona para las lneas celulares, con la consideracin del uso de un medio especfico para estas clulas e intervalos de tiempo ms grandes entre un pasaje y otro.

5.5 [Anlisis de expresin gnica]

En breve, se realiz el anlisis de expresin de los genes involucrados en la va de WNT por medio de la reaccin en cadena de la polimerasa de punto final (PCR) y por tiempo real (Lightcycler 1.5, Roche Applied Science), amplificando secuencias nucleotdicas parciales especificas para cada gen, con base al diseo de oligos especficos, que fueron diseados utilizando el software oligo v6.

El cDNA fue obtenido a partir de los diferentes cultivos celulares por medio de la extraccin del RNA con el kit comercial PureLinkTM Micro-to-Midi Total RNA (Invitrogen Co., Cat. No. 12183-018) y su sntesis por retrotranscripcin con oligo dT mediante el sistema SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Cat. No. 18080-051). El RNA fue conservado a -80C y el cDNA obtenido a -20C hasta su uso.

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La amplificacin y deteccin de las secuencias nucleotdicas parciales se llev a cabo en primera instancia por el mtodo de PCR en punto final, haciendo uso de la enzima Taq DNA polimerasa (Roche, Cat. No. 11 146 173 001) y por electroforesis en geles de agarosa (1.5 2 %) adicionado con Bromuro de etidio y revelando los fragmentos amplificados con luz UV. Estandarizadas las condiciones y determinada la especificidad de los oligos, se contino con la amplificacin por tiempo real. La cuantificacin por PCR en tiempo real se realiz bajo la plataforma LigthCycler 1.5 (Roche, Life Science), con el sistema de LightCycler FastStart DNA Master plus SYBR Green I (Roche, Cat. No. 03 515 885 001).

El anlisis se llev a cabo con la ayuda del LightCycler Software (LCS) v4.0 proporcionado (Roche, Life Science). Utilizando como calibrador de amplificacin para la normalizacin de la expresin gnica los datos obtenidos de la lnea celular HaCaT y como genes de referencia al de gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa (GADPH) y el de -Actina (ACTB).

5.5.1 [Obtencin de RNA]

El RNA total de cada uno de los cultivos fue obtenido con el sistema de extraccin y purificacin PureLinkTM Micro-to-Midi Total RNA (Invitrogen Corporation, US). Detalladamente, las clulas fueron sembradas 24 hrs antes de cada extraccin en una cantidad suficiente (Tabla 2) y su confluencia y viabilidad fue verificada antes de cada ensayo al microscopio. Las clulas fueron lisadas con 1 ml de la solucin de lisis adicionada con 2-mercapto-etanol al 1 %. La solucin fue aplicada a la superficie del cultivo celular adherido y las clulas fueron desprendidas con ayuda de un gendarme estril y resuspendidas en la solucin. El lisado celular se colect con pipeta en tubos para centrifuga de 2 ml y, posteriormente fue homogenizado pasando la solucin de 5 a 10 veces a travs de una jeringa con aguja de 0.5 mm. Un volumen de etanol al 70% (libre de RNasas) fue adicionado a cada homogenizado y mezclado vigorosamente, hasta observar la formacin de un precipitado. En seguida, los homogenizados fueron eluidos por centrifugacin ($10,000 xg/30 seg) a travs de columnas de slica donde el RNA total fue capturado. La columna con el RNA fue, entonces, lavada dos veces por centrifugacin con dos soluciones de lavado: 700 l de la primera solucin y con 500 l de la segunda solucin. Finalmente,

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el RNA, capturado en la columna, se incub con 35 l de agua desionizada libre de DNasas/RNasas (miliQ) por un lapso de 1 a 2 minutos a temperatura ambiente (TA) y el material, conteniendo el RNA, se eluy por centrifugacin (10,000 xg /1 min) y colect en un tubo estril y libre de RNasas. El RNA fue conservado a -80 C para su uso posterior.

La cuantificacin del RNA obtenido se realiz por espectrometra UV (OD:260/280) en un espectrofotmetro de longitud mltiple y su concentracin fue determinada haciendo uso de la siguiente frmula:
Donde 260 es la densidad ptica de la solucin a una longitud de de onda de 260 nm, FRNA la constante de la absorbancia de una unidad de ssRNA (40 mg ml-1), Fc el factor de dilucin y 1000 la relacin de conversin entre ml y ml .

5.5.2 [Sntesis del cDNA]

Una alcuota de cada muestra, equivalente a 5 g de RNA, se incub con 1 l de Oligo(dT) (50 M) (Cat.No. 18418-020; Invitrogen, Invitrogen Corporation, US) y 1 l de desoxi-nucletidostrifosfatados (dNTPs) 10 mM (Cat.No. 1969064; Roche Applied Science, Roche, Alemania) en un volumen total de 10 l, ajustado con agua DEPC, por 5 min a 65 C; a fin de permitir la desnaturalizacin de las estructuras secundarias del RNA. Enseguida, la reaccin, se cambio de inmediato a hielo por alrededor de 1 min, para la alineacin de los oligo(dT) al RNA molde y se adicion a cada muestra la mezcla de sntesis de la enzima Superscript III (Cat.No.18080-05; Invitrogen, Invitrogen Corporation, US), compuesta de: 2 l de RT-buer (10x), 4 l MgCl2 (25 mM), 2 l DTT (0.1 M), 1 l RNasaOUT (40 U/l) y 1 l Superscript III RT (200 U/l). La reaccin de sntesis se llev acabo primeramente mediante una incubacin a 50 C por 50 min y posteriormente la inactivacin de esta a 85 C por 5 min. Finalmente, para eliminar los residuos de RNA, las muestras (stock) fueron tratadas con RNasa H (invitrogen) por 20 min a 37 C y conservadas a -20C, para su uso posterior.

5.5.3 [Diseo de Oligos]

Los oligos fueron diseados para amplificar secuencias nucleotdicas parciales de aquellos genes

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con cambios de expresin identificados en los microarreglos (Tabla 5 y 6), haciendo uso del software Oligo v.6 y las bases de datos disponibles en el GenBank (NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov).

En aquellos genes con ms de un exn, los pares de oligos o iniciadores se disearon reconociendo secuencias en exones diferentes, con el fin de distinguir cualquier contaminacin genmica, adicionalmente, se procur que el producto amplificado (amplicn) fuese de un tamao igual o menor a 300 pb, con la finalidad de lograr una eficiencia de amplificacin cercana a 2 en las reacciones de PCR en tiempo real.

Los oligos iniciadores fueron sintetizados por Invitrogen, Invitrogen Corporation) de acuerdo al diseo elaborado y resuspendidos con agua destilada libre de DNasas/RNasas (Cat.No.10977-015; GIBCOTM, Invitrogen Corporation, Alemania), suficiente para obtener una concentracin 100 M (solucin stock). Diluciones de 1:10 de las soluciones stock, de cada par de oligos, fueron utilizadas como soluciones de trabajo para la amplificacin de las secuencias nucleotdicas parciales.

5.5.4 [Reaccin en cadena de la polimerasa; estandarizacin de condiciones]

Previo a realizar los ensayos de PCR en tiempo real, los oligos diseados fueron probados por PCR punto final mediante gradientes de temperatura para establecer la mejor Tm para la amplificacin.

Las reacciones en cadena de la polimerasa de punto final se llevaron a cabo haciendo uso de 1 U por reaccin de la enzima Taq DNA polimerasa (Roche Applied Science) con 2.5 l de buer de reaccin (100 mM tris-HCl, 15 mM MgCl2, 500 mM KCl, pH20C 8.3), 160 M de una mezcla 2 mM de dNTPs, 0.6 M de cada uno de los iniciadores sentido y anti-sentido y 25 ng del cDNA molde, en un volumen final de 25 l por reaccin ajustado con agua DEPC, en un termociclador Thermo Electrons Px2 (Thermo-Electron Corporation) siguiendo el programa de amplificacin especificado en la Tabla 3; donde slo el tiempo de extensin vari de acuerdo al tamao del amplicn y la velocidad de incorporacin de nucletidos de la enzima Taq DNA polimerasa (25 pb/s).

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Los fragmentos amplificados (25 l, adicionados con 5 l de buer de carga 6x) fueron sometidos a electroforesis en geles de agarosa (Cat.No. A9539; Sigma-Aldrich.co, US)-1xTAE (Tris-Acetato-EDTA) al 1.5 % (g/v) adicionado con Bromuro de Etidio (0.5 g/ml) (Cat.No. E1385; Sigma-Aldrich.co, US), por hora y media en un campo elctrico de un 1 v/cm2 en direccin al ctodo. En todos los geles se carg el marcador de peso molecular DNA E-Gel 1 kb plus LadderTM (Cat.No.10787-018; Invitrogen, Invitrogen Corporation, US). Los productos fueron visualizados con luz ultravioleta de 302 nm y foto-documentados mediante el sistema de imagen DigiDoc-It (UVP Cambridge, UK) para su anlisis.

5.5.6 [Anlisis cuantitativo de expresin relativa por PCR en tiempo real]

Una vez evaluada la especificidad de los iniciadores, se contino con el estudio cuantitativo de expresin gnica relativa de las secuencias de inters por medio de PCR en tiempo real. ste se realiz bajo la plataforma de LightCycler 1.5 (Roche Applied Science, Alemania), utilizando el sistema de marcaje fluorocromtico LightCycler FastStart DNA Master plus SYBR Green I (Roche Applied Science, Alemania). Se prepar una mezcla maestra con 2 l de la Master Mix (prorcionada en el kit) y 0.5 M de iniciadores en un volumen final de 8 l ajustado con agua grado PCR, que fue adicionada a cada capilar; sobre la cual se pipetearon 2 l del cDNA de cada muestra, este ltimo previamente diluido 1:20 de la solucin stock obtenida (ver sntesis del cDNA).

Todas las reacciones fueron corridas bajo el programa mostrado en la Tabla 4, donde las nicas variaciones fueron el tiempo de elongacin (de acuerdo a la extensin de cada amplicn y la velocidad de

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la enzima Taq-25 pb/s) y la temperatura de alineacin (de acuerdo a las Tm especificas; ver Tabla 6).

Adicionalmente, se realizaron diluciones seriadas de cDNAs, con la finalidad de obtener curvas de eficiencia de la reaccin. Slo las reacciones con valores de eficiencia por arriba de 1.7 fueron consideradas para su anlisis.

Anlisis relativo de expresin gnica

El anlisis se llev a cabo con la ayuda del LightCycler Software (LCS) v4.0 proporcionado con el equipo (Roche Applied Science, Alemania), que utiliza el metodo de Cp como algoritmo para la cuantifiacin relativa.
Donde E es la eficiencia de la reaccin, Cp es el punto de cruce, p hace referencia al la linea celular problema y c a la linea celular calibradora (HaCaT), PRB al gen problema y REF al gen de referencia (GAPDH o ACTB).

La expresin obtenida para HaCaT fue utilizada como calibrador de amplificacin para la normalizacin de la expresin gnica y como referencia los genes de expresin constitutiva gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa (GADPH) y -actina (ACTB).

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Todos los experimentos incluyeron una curva de disociacin, generada por un escaneo de temperatura de los productos obtenidos al final de la reaccin. Solamente las reacciones en cuya primera derivada de la curva de disociacin se obtuvo un nico pico fueron consideradas para el estudio.

5.6 [Anlisis de expresin proteica]

Se evalu mediante ensayos de Western blot, la expresin proteica de aquellos genes de inters cuyo patrn de expresin result significativo y cuyos anticuerpos se encontraron disponibles en el mercado.

En breve, las clulas fueron recolectadas y lisadas por el ensayo de radioinmunoprecipitacin (RIPA); fueron colectadas en el buer hipotnico RIPA, agitadas vigorosamente y sonicadas, con el fin de fraccionar por completo los ncleos y romper el material gentico. Enseguida, fueron centrifugadas y la fraccin proteica transferida a un tubo nuevo.

Posteriormente, las protenas fueron cuantificadas con el kit Dc protein assay (BioRAD), basado en una modificacin del mtodo de Bradford. 50 $g de cada extracto proteico fueron resueltos por SDS-PAGE, transferidos a membranas de PVDF e inmunodetectados con anticuerpos especficos. Como control de carga se detecto a la protena -actina. Los experimentos fueron realizados al menos por duplicado. En este trabajo se muestran los resultados obtenidos con reproducibilidad.

5.6.1 [Extraccin de protenas totales]

Las clulas se cultivaron en cajas p150 en cantidad suficiente para obtener una confluencia de alrededor del 80% a las 24 hrs. Transcurrido el tiempo, las clulas se lavaron con PBS y se colectaron, raspando con gendarme la caja de cultivo, en 1 mL de PBS fro en un tubo para microcentrfuga de 2 mL. La suspensin se centrifugo 5 min a 400 xg y se elimin el sobrenadante para obtener la pastilla celular, la cual fue resuspendida en 200 300 l (de acuerdo al tamao) de buer RIPA (50 mM Tris-HCl pH 7.4,

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1% NP-40, 0.25% Na-deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF) adicionado con inhibidores de proteasas (completeMini-Roche). El material celular homogenizado fue sonicado (15 pulsos de 3 segundos a una amplitud 70%) y luego incubado en hielo por 30 minutos. Posterior a una agitacin vigorosa con vrtex, se centrifug durante 5 minutos a $18,000 xg, a fin de obtener las protenas en el sobrenadante, las cuales se alicuotaron y almacenaron a -80C para su conservacin hasta su uso posterior.

5.6.2 [Obtencin de extractos proteicos citoplasmticos y nucleares]

Debido a que para algunas protenas no slo su presencia define su actividad en la clula, sino tambin importa su localizacin (sea citoplasmtica, nuclear o su liberacin al medio), se realiz la extraccin de dichas fracciones.

Las clulas se cultivaron en cajas p150 a una confluencia de alrededor de 80%. Se lavaron una a dos veces con PBS y se colectaron por raspado en 1 mL de PBS, en un tubo para microcentrfuga de 2 mL. Se obtuvo por centrifugacin el botn celular ($400 xg, 5 min), que fue resuspendido en una solucin hipotnica, buer A (10mM Hepes pH 7.9, 10mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1mM DTT) adicionada con inhibidores de proteasas (completeMini-Roche) y puesta a incubar en hielo por 30 minutos. Pasado el tiempo, se adicion detergente NP-40 (al 10%) con el fin de resuspender las membranas citoplasmticas fragmentadas, y se centrifug a $18,000 xg por 5 min. El sobrenadante obtenido, conteniendo las protenas citoplasmticas, fue alicuotado y conservado a -80C. Por otra parte, la pastilla se lav por centrifugacin con la misma solucin hipotnica y se le adicion enseguida una solucin salina hipertnica, buer C (20 mM HEPES pH 7.9, 25 % glicerol, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA), donde fue resuspendida por pipeteo y agitacin con vrtex e incubada en hielo por 30 minutos con agitacin cada 2 minutos. Terminada la incubacin, la fraccin fue centrifugada ($18,000 xg, 5 min) para eliminar los residuos y el sobrenadante, con las protenas nucleares, fue alicuotado y almacenado (-80C).

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5.6.3 [Cuantificacin de las protenas]

La concentracin de las fracciones proteicas se realiz con el kit para cuantificar protenas Dc protein assay (BioRAD). Realizando la lectura en placa de 96 pozos, en un equipo Synergy TM HT Multimode, con el software proporcionado (Biotek Instruments Inc., Vermont, USA), a una longitud de onda de 560 nm, con agitacin previa de un minuto despus de una incubacin de 5 minutos. Una curva estndar de concentraciones (de 0.156 g a 10 g; Figura 13a) fue siempre incluida junto con las muestras, bajo las mismas condiciones, en la cual fueron interpolados los valores obtenidos de las lecturas de las muestras para conocer la concentracin.

5.6.4 [SDS-PAGE y Western Blot]

Se llev a cabo la determinacin de la expresin proteica de aquellos genes cuyos cambios en los niveles de expresin gnica mostraron diferencias significativas entre las clulas no tumorignicas y las lneas celulares con fenotipo tumorignico. Los extractos proteicos fueron sometidos a electroforesis en geles de poliacrilamida (1: 35 acrilamida:bis-acrilamida, al 10%) bajo condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) y transferidas a membranas de difluorido polivinilideno (PVDF; Millipore Co.).

Las membranas fueron bloqueadas con casena al 1% en TBS y las protenas de inters fueron identificadas por inmunodeteccin con anticuerpos especficos (-catenina (H-102), sc-7199; Wnt-5a (H-58), sc-30224; Wnt-7a (K-15), sc-26361; Wnt-16 (H-96), sc-20964; LEF-1 (N-17), sc-8591; frizzled-9 (C-14), sc-33509 obtenidos de Santa Cruz Biotechnology; Wnt5a, #2392 de Cell Signaling Technology; y Wnt7a de Millipore Co.), diluidos en TBS en concentraciones que variaron para cada caso en concreto. Las protenas fueron detectadas por quimioluminiscencia haciendo uso de anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa de rbano picante, para lo cual se utiliz el reactivo Immobilon Western HRP substrate (Millipore Co., Cat. No. WBKLS0100), exponiendo las membranas a pelculas fotogrficas, por tiempos variables.

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Somos lo que repetidamente hacemos. La excelencia no es, pues, un acto, sino un hbito. Aristteles

Resultados

Bajo la evidencia de que la infeccin por el virus del papiloma humano de alto riesgo slo representa una primera alteracin insuficiente per se para generar una neoplasia, nos dimos a la tarea de buscar alteraciones adicionales en la va de Wnt, en cncer cervico-uterino, que pudieran explicar la carcinognesis del epitelio cervical.

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6.1 [Anlisis de microarreglos; genes candidatos]

Se realiz una bsqueda de genes involucrados en la va de Wnt modificados en cncer cervicouterino en microarreglos de cDNA previamente realizados por el grupo de la Dra. Aguilar Lemarroy (datos no publicados), en donde fue comparada la expresin de 10,000 genes obtenida individualmente de cada una de las lneas celulares derivadas de cncer cervico-uterino (HeLa, SiHa y C33), con la de clulas no tumorignicas HaCaT. Estos resultados fueron adems contrastados con los obtenidos por el grupo del Dr. Gariglio, donde se analiz la expresin gnica por microarreglos obtenidos de la comparacin de epitelios de ratones transgnicos K14E6 con epitelio de ratones FVB controles93.

Los datos de los microarreglos, tanto en las lneas celulares de CaCU, como en los ratones transgnicos con E6 de VPH-16, nos permitieron identificar cambios importantes de expresin en genes involucrados en las vas de Wnt, lo cual nos llev a seleccionar a 22 de ellos, que por estar modificados fuertemente en su mayora en ambos modelos, se pens pudieran tener una implicacin en la carcinognesis cervical. Evidencia reciente, con experimentos in vitro, sugiere un papel importante de esta va en el desarrollo carcinognico de queratinocitos infectados con hrVPH. Entre los genes seleccionados, se encuentran 8 ligandos de Wnt, 4 receptores Frizzled, 4 factores transcripcionales (incluyendo a -catenina), 2 protenas intermediarias de la va (DVLs) y 4 genes blanco. Los genes seleccionados se muestran en la Tabla 5.

6.2 [Anlisis de expresin gnica]

Con la finalidad de validar los datos obtenidos de los microarreglos, ensayos cuantitativos por PCR en tiempo real fueron realizados. Primero se realiz el diseo de los oligonucletidos iniciadores, seguida de la estandarizacin de las condiciones de reaccin y al final los experimentos de PCR en tiempo real con su respectivo anlisis de expresin relativa.

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6.3 [Diseo y evaluacin de oligonucletidos y condiciones de reaccin]

De los genes electos se hizo el diseo de oligonucletidos iniciadores especficos de las reacciones de amplificacin (ver Materiales y mtodos). Veintids pares de oligos fueron diseados y enviados a sintetizar (Tabla 6), de los cuales su eficiencia y especificidad fue posteriormente evaluada mediante gradientes de temperatura por PCR punto final (Figura 6) y curvas de eficiencia y disociacin por PCR en tiempo real (ver resultados para cada gen, Figura 7-12).

Adicionalmente, se enviaron a sintetizar dos pares de oligonucletidos iniciadores para la amplificacin de genes constitutivos (GAPDH y ACTB), necesarios para el anlisis relativo de expresin (Figura 7).

6.3.1 Condiciones de reaccin; gradientes de temperatura. Con la finalidad de determinar la temperatura de alineacin ptima y evaluar la especificidad de los oligonucletidos iniciadores, se realizaron amplificaciones con diferentes temperaturas de alineamiento, utilizando como molde una mezcla de cDNAs de las lneas celulares HaCaT, SiHa, HeLa y C33.

En la Figura 6, se puede observar como para la mayora de los oligos diseados se obtuvo una amplificacin especfica del fragmento en alguna de las temperaturas analizadas; no obstante, para los genes WNT8B, WNT2B, FZD4 y TCF1, o no se observ amplificacin alguna del fragmento de inters o sta no fue especfica, por lo que no se pudieron incluir en el estudio por PCR tiempo real. El mRNA de WISP1 y WISP3, no pudo ser amplificado, ya que, como se comprob ms adelante, stos genes se expresan casi exclusivamente en cultivos primarios de queratinocitos; los cuales no se utilizaron en la estandarizacin por su difcil obtencin ( ver resultados de PCR en tiempo real, Figura 11 d y e).

Con base a estos primeros ensayos, se pudieron determinar en una primera instancia, las temperaturas ptimas de amplificacin, que fueron tiles para establecer las condiciones de reaccin en los ensayos de PCR en tiempo real para cada uno de los genes de estudio, como se muestra en la Tabla 6.

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lucin FRNA la dad de lucin l y ml .

6.3.2 Curvas de eficiencia. Como parte de la estandarizacin de las reacciones de PCR en tiempo real para cada uno de los genes a analizar, en el primer set de experimentos realizados se incluy una curva de diluciones de cDNA; tiles para evaluar la eficiencia y el grado de error de cada reaccin. Un ejemplo de esto puede observarse en la Figura 7(a y d), donde se muestra las curvas de amplificacin de la dilucin en serie (1:1, 1:2, 1:4, 1:8) de una muestra de cDNA de la lnea celular HaCaT y la recta o

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curva estndar generada al graficar los logaritmos de las cuantificaciones relativas de cada una de las diluciones contra el valor de Cp de cada curva.

Idealmente, eficiencias iguales o por arriba de 1.7, con un error menor a 0.04 son consideradas adecuadas para el estudio estadstico de expresin relativa, por lo que en nuestro estudio slo se incluyeron los datos de aquellos pares de oligonucletidos donde se obtuvieran eficiencias por arriba de este valor y errores por debajo de 0.04.

6.3.3 Curvas de disociacin. Adicionalmente, para verificar la especificidad de los oligonucletidos en las reacciones de PCR en tiempo real, todas ellas incluyeron al trmino de la amplificacin, un barrido decreciente de temperaturas donde cada 0.5C se detect la fluorescencia de la mezcla de reaccin. Como la molcula de SYBER-GREEN es un fluorocromo que se intercala entre bases de manera inespecfica, la seal de fluorescencia es directamente proporcional a las cadenas hibridadas. De tal forma que al disminuir la temperatura un grado por debajo de la temperatura de hibridacin del amplicn se genera una abrupta disminucin de la fluorescencia, indicando la Tm del fragmento, evidenciada mejor an, con la segunda derivada del cambio de la fluorescencia con respecto al cambio en la temperatura.

En la Figura 7(b y f) se puede observar un ejemplo de las curvas generadas por la derivacin de la fluorescencia obtenida en las curvas de disociacin. Como podr verse ms adelante (Figuras 8-12), para la mayora de los genes de estudio se detect un nico pico de amplificacin bajo las condiciones de reaccin utilizadas. Salvo en algunos casos, como WNT7A, 10A, 16 y WISP3 (Figura 8c, d, f y 11b), donde picos adicionales al esperado se presentaron, lo que sugiere mutacin de la secuencia o, en caso de fragmentos muy pequeos, hbridos generados por los oligonucletidos. Esto pudo corroborarse al correr los amplicones en geles de agarosa revelados con bromuro de etidio.

6.4 [Anlisis cuantitativo de expresin gnica relativa]

Segn se describe en la metodologa, los genes de expresin constitutiva GAPDH y ACTB fueron utilizados

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para relativizar la expresin gnica obtenida. Estos genes fueron ensayados previamente con la finalidad de validar su uso como genes de referencia. En la Figura 7 se puede observar el anlisis de dichos genes: las curvas de disociacin, las curvas de eficiencia (E 1.7 y e 0.01) y las curvas de amplificacin para las diferentes lneas celulares, donde se puede observar la expresin (Cp) de cada cultivo. Esto ltimo resulta adems til para evaluar cada uno de los procesos previos a los experimentos: el cultivo, la extraccin, la sntesis del cDNA, eficiencias del tiempo real, de la enzima, as como el error tcnico durante el ensayo.

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6.4.1 [Genes problemas]

Se realizaron tres experimentos independientes, comprendidos desde el cultivo de las lneas celulares, la obtencin del RNA, su cuantificacin, la sntesis del DNA complementario y las reacciones de PCR en tiempo real, ms un duplicado del primer ensayo partiendo de la sntesis del cDNA. El promedio del total de los resultados obtenidos para cada uno de los genes estudiados se muestran en las grficas de las Figuras 8-12. La expresin fue comparada y normalizada en funcin de la expresin relativa obtenida en las clulas HaCaT. Diecisiete de veintids genes candidatos, generaron datos reproducibles y confiables.

6.4.1.1 [Ligandos Wnt y Receptores]

Se encontraron cambios reproducibles y confiables para seis de nueve ligandos y tres de cuatro receptores. Cuatro de los ligandos, WNT4, WNT7A, WNT10A y WNT16 presentaron una notable disminucin de expresin en las lneas derivadas de cncer cervico-uterino con respecto a la lnea no tumorignica HaCaT y al cultivo primario de queratinocitos, lo que sugiere un posible papel supresor de tumor de estos componentes (Figuras 8a, c, d, f). Cabe resaltar que, aun a pesar de que entre las clulas HaCaT y el cultivo primario de queratinocitos existen cambios de expresin, los patrones entre clulas no tumorignicas y clulas derivadas de cncer cervico-uterino se conservaron. No obstante, los cambios entre el cultivo primario y las clulas HaCaT pudieran ponerse a consideracin para explicar la inmortalidad de la lnea celular HaCaT.

En contraste, WNT5A presenta una expresin incrementada en las clulas derivadas de cncer cervical, aludiendo a una posible actividad oncognica por parte de este factor (Figura 8b). Wnt5A se ha visto a menudo implicado en diferentes tipos de cncer como marcador de metstasis. Adicionalmente, resulta interesante resaltar la expresin exacerbada de este gen en las lneas celulares infectadas con el hrVPH, sugiriendo una probable relacin con la presencia de los oncogenes virales de alto riesgo. En microarreglos de ratones K14E6 se observa, de igual manera, una sobre expresin de este gen.

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El ligando Wnt10B presenta una relacin ms complicada. Su expresin se encuentra aumentada en todas las clulas derivadas de cncer con respecto a la obtenida en el cultivo primario de queratinocitos; pero no as con respecto a la expresin de la lnea celular HaCaT, cuyos niveles superan los de la lnea

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celular SiHa, pero son menores a los de la lnea celular C33 y, por mucho, HeLa.

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Por otra parte, los receptores tambin presentaron cambios de expresin importantes, aunque menos evidentes; siendo de especial inters el aumento de expresin de FZD9 en las clulas derivadas de cncer (Figura 9b). FZD9 ha sido reportado como receptor de Wnt7A con actividad supresora de tumor. As

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como tambin, la disminucin de los niveles de expresin de FZD10 en las clulas tumorales (Figura 9c), con cambio ms evidente en las lneas celulares SiHa y C33. Adicionalmente cabe mencionar, que a diferencia que en los ligandos Wnt, en stos genes no se encontraron cambios de expresin importantes entre los cultivos no tumorignicos.

6.4.1.2 [Factores intracelulares y genes blanco]

Adems de los genes propiamente Wnt y su receptores, cambios de expresin se encontraron en otros componentes intracelulares involucrados directamente en la va Wnt. Dos de ellos, -catenina y LEF (Figura 10), factores transcripcionales fundamentales en la va cannica, presentaron cambios reproducibles y de inters en su expresin gnica, aunque carentes de un patrn claro con respecto a la tumorignesis.

-catenina (CTNNB1), por un lado, present una expresin poco incrementada en las lneas tumorignicas infectadas con hrVPH respecto a la expresin obtenida en HaCaT; no obstante, la expresin de -catenina disminuy considerablemente comparado con el cultivo primario de queratinocitos. En contraste, C33, sin infeccin con VPH, present una consistente sobreexpresin en relacin a ambos cultivos no tumorignicos.

De igual forma, la expresin encontrada en LEF1 diverge considerablemente entre ambas lneas celulares controles no tumorignicas; observndose una expresin muy disminuida en la lnea celular HaCaT comparada con el cultivo primario de queratinocitos, aunque comparable con los niveles obtenidos para las clulas SiHa. HeLa, as como C33, presentaron una expresin muy por arriba de lo obtenido para las clulas HaCaT, pero disminuida (HeLa) o comparable (C33) con la expresin en queratinocitos primarios.

Otros de los genes cuya expresin se analiz fue la de los factores DVL1 y 2. Cambios en la expresin gnica de la protena DVL1 han sido reportados en clulas derivadas de cncer cervical. No obstante,

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como puede observarse en la Figura 11, los cambios que encontramos en las lneas celulares, no fueron significativos; siendo los nicos cambios importantes la disminucin de la expresin del gen DVL2 en las clulas HeLa y de DVL1 en SiHa con respecto a HaCaT y queratinocitos primarios, lo que pudiera en todo caso sugerir una relacin con el tipo viral especfico.

Dentro del anlisis tambin se incluyeron a los genes C-MYC y CCND1 (ciclina D1), aun a pesar de no haber sido visualizados con cambios de expresin importantes en los microarreglos, por ser genes blancos reconocidos para la va cannica de Wnt. Como sabemos, estos genes intervienen de manera importante en proliferacin y regulacin del ciclo celular; adems de estar reportada la intervencin de estas protenas en cncer cervical.

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Como se puede observar en la Figura 12, ciclina D1 (b) y HOXA9 (c) presentaron una disminucin en los niveles de expresin obtenidos en todas las lneas celulares derivadas de CaCU con respecto a ambos controles. En ciclina D1, por su parte, se encontr adems una expresin dos veces mayor en las clulas HaCaT con respecto al cultivo primario de queratinocitos. C-MYC (Figura 12a), por el contrario, present slo disminucin de su expresin con respecto a las clulas control en las lneas celulares HeLa y SiHa y un fuerte aumento en los niveles de mRNA en la lnea celular C33 no infectada por VPH.

Otros genes blanco analizados, que s fueron encontrados con cambios de expresin en los microarreglos, fueron WISP 1 y 3. Estos genes presentaron una expresin muy disminuida en todas las lneas celulares, incluyendo HaCaT (Figura 12d y e); razn por la cual, como se menciono anteriormente, no fueron

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identificados en los ensayo de gradientes de temperatura por PCR punto final. Sin embargo, al analizar estos genes por PCR en tiempo real e incluyendo el cultivo primario de queratinocitos, se logr confirmar la especificidad de los oligos y expresin de los genes. Ambos genes WISP slo son expresados en los cultivos primarios y de manera muy disminuida en alguna otra lnea celular, como HeLa (WISP1) y HaCaT (WISP3). Lo que sugiere que estos genes pudieran estar implicados en la inmortalizacin, muerte de estas clulas o en la capacidad de diferenciacin.

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6.4.2 [Anlisis de expresin proteica; Inmunodeteccin en fase slida]

Considerando que no siempre los niveles de RNAm corresponden con los niveles proteicos encontrados para un gen, como resultado de los diferentes procesos de regulacin postranscripcional y postraduccional, se decidi corroborar la expresin gnica observada por inmunodeteccin en fase solida para algunos de los componentes, cuya expresin diferencial interes por tener posibles implicaciones en la carcinognesis cervical y cuyo anlisis por western blot fue posible por la disponibilidad de anticuerpos comerciales. Se realiz la extraccin total y fraccionada de las protenas, su cuantificacin (Figura 13a) y se corrieron por PAGE en condiciones desnaturalizantes, para luego transferir a membranas PVDF e inmunodetectar las protenas -catenina, Wnt5a, Wnt7a, Wnt16, Fzd9 yLEF1.

6.4.2.1 [-catenina]

La primera proteina que decidimos evaluar fue -catenina. La actividad oncognica de este factor est bien documentada, usualmente como oncogn; no obstante, existen algunos reportes que indican una probable actividad supresora de tumor en determinadas neoplasias. Al contrario de lo esperado y observado por PCR en tiempo real, encontramos una disminucin muy evidente de los niveles proteicos de -catenina en las lneas derivadas de CaCU (Figura 13b). Lo anterior evidencia dos probables procesos: (1ero) una regulacin postranscripcional, postraduccional o ambas de este factor transcripcional, y (2do) que al menos en clulas derivadas de cncer cervico-uterino en un estadio avanzado, -catenina no colabora en la capacidad proliferativa aumentada de estas clulas; no obstante, su ausencia pudiera colaborar en evitar el proceso de diferenciacin.

-catenina es, adems de un factor transcripcional, una protena de membrana y de citoplasma, que al recibir una seal adecuada migra al ncleo, donde acta como un factor transcripcional. De tal forma que no slo su concentracin es importante, sino tambin su localizacin. Para determinar su localizacin intracelular se analizaron las protenas de las fracciones citoplasmticas y nucleares de los cultivos celulares. Como se puede observar en la Figura 13c, el cambio en la expresin entre las lneas

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celulares sigue evidencindose; pero cambios en la relacin entre las fracciones Nuclear/Citoplasmtica no son evidentes; no hay aumento proporcional en las porciones nucleares de los cultivos derivados de cncer cervical.

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6.4.2.2 [Wnt7a]

Otra de las protenas consideradas importantes fue Wnt7a. Los niveles de transcrito para WNT7A se encontraron disminuidos en todas las lneas celulares derivadas de CaCU analizadas (Figura 8c) e, interesantemente, la expresin proteica tambin (Figura 13b), sugiriendo un probable papel supresor de tumor de Wnt7a en cncer cervico-uterino (ver discusin). Esta disminucin se comprob con dos anticuerpos de diferentes casas comerciales. Extraamente, el anticuerpo de Santa Cruz detecto dos bandas con el mismo comportamiento y de modo reproducible. La razn de esto no es clara.

6.4.2.3 [Wnt5a]

Recientemente, Wnt5a ha venido teniendo mucha importancia en diversos tipos de cncer, donde segn se reporta puede actuar como un oncogn o gen supresor de tumor dependiendo del contexto. En nuestro modelo, la expresin gnica obtenida con los niveles de RNAm sugera inicialmente un papel oncognico; no obstante, los niveles proteicos encontrados sugieren lo contrario (Figura 13b). Esta disminucin detectada en la protena de Wnt5a fue detectada tambin por dos anticuerpos de diferentes casas comerciales (ver Materiales y mtodos). Congruente con esto, se ha reportado una regulacin postranscripcional de este factor. Incluso sugerida como el principal mecanismo de regulacin para esta protena. Sin embargo, es importante considerar la actividad de otros procesos, como una degradacin rpida o secrecin acelerada.

6.4.2.4 [Wnt16]

La protena Wnt16, por otro lado, ha sido poco estudiada en cncer. Aqu observamos un comportamiento conservado entre los niveles transcripcionales (Figura 8f) y los proteicos (Figura 13b). Con una disminucin de la expresin en todas las lneas celulares derivadas de CaCU. Excepto por los niveles de protena y mRNA entre los cultivos controles.

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6.4.2.5 [Fzd9]

Recientemente, Robert Winn [REF] public un artculo donde describe la actividad supresora de tumor del ligando Wnt7A en cncer de pulmn, detallando algunos de los componentes involucrados en este proceso, entre ellos, el receptor FZD9. Debido a que el comportamiento de Wnt7A, a nivel de mRNA como de protena (Figura 9c y 13b), sugiere un papel supresor y considerando el aumento de expresin del mRNA observada para el receptor FZD9 (Figura 10b), decidimos estudiar los niveles proteicos de este receptor en particular. De manera interesante, observamos un incremento en su expresin en las clulas derivadas de CaCU, de acuerdo con lo visto por PCR en tiempo real. Ms an, en las clulas no tumorignicas se detectan cuatro bandas en lugar de una, como se observada para las clulas derivadas de CaCU. Hasta la fecha, no existen isoformas reportadas para este receptor; no obstante, sufre algunas modificaciones postraduccionales, como corte de un pptido seal de 22 aminocidos que antecede a la protena, multiples fosforilaciones con la activacin de la va Wnt y, reciente, se ha publicado la posibilidad de que la protena se corte en su domino intracelular y migre al interior de la clula incluso a ncleo. Ms estudios al respecto son necesarios para confirmar la naturaleza de estas bandas detectadas.

6.4.2.6 LEF1

Finalmente, se decidi evaluar tambin al factor transcripcional LEF, que presenta grandes cambios de expresin a nivel del mRNA entre las diferentes lneas celulares (Figura 11b). LEF1 es una co-factor transcripcional con actividad represora y activadora de la expresin, dependiendo del contexto en el ncleo. Usualmente, con la presencia de -catenina en el ncleo acta como activador de la expresin, mientras que en su ausencia funciona como represor. Puesto que los niveles de protena para -catenina se encontraron disminuidos en CaCU, decidimos evaluar los niveles de LEF1. Los niveles proteicos de LEF1 se comportaron de manera similar a los encontrados para -catenina. Disminuidos en cncer cervical, solo detectados en los cultivos no tumorignicos (Figura 13b). Ms aun, se detectaron dos bandas de pesos moleculares muy cercanos. LEF1 tiene reportada en la base de datos UniProtKB/ Swiss-Prot (No. Q9UJU2) cuatro isoformas: dos, isoformas 3/LEF-1-DN y 4, con una deplecin de los

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primeros 115 aminocidos y dos con, isoforma 2/B y 4, con cambios de secuencia entre los aminocidos 283-399. Nuestro anticuerpo LEF1 (N-17) va dirigido a un pptido de la porcin amino terminal de la protena, por lo que en teora estaramos reconociendo slo las isoformas 1/A (pM= 44.2kD) y 2/B (pM=35.68kD). Aunque esto debe ser comprobado, cabe notar que la isoforma B se expresa en mayor cantidad en las clulas HaCaT. Resultara interesante analizar las isoformas restantes, con la finalidad de evaluar un patrn de expresin de esta protena en los diferentes contextos celulares.

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Never ignore, never refuse to see, what may be thought against your thought. Friedrich Nietzsche

Discusin

El cncer crvico uterino sigue siendo un problema de salud pblica a nivel nacional y mundial, aun a pesar de la facilidad de su deteccin por pruebas citolgicas y de su tratamiento.

El principal factor etiolgico de esta enfermedad, reconocido por la Organizacin Mundial de la Salud, es la infeccin del epitelio cervical por tipos virales de alto riesgo del papiloma humano, los cuales se han visto presentes en el 98 a 95 % de los casos de CaCU9. Sin embargo, la infeccin por el papilomavirus es bastante comn en la poblacin sexualmente activa y solo una pequea porcin de sta, alrededor de 1 %, llega a presentar en algn momento a cncer cervical30.

De acuerdo con el modelo multifactorial del origen del cncer, actualmente se reconoce que otras modificaciones, adems de las generadas directamente por la infeccin viral persistente, son necesarias para la gnesis del cncer cervical. Dichas modificaciones pudieran obedecer a mltiples factores

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etiolgicos (descritos anteriormente en antecedentes 1.2). No obstante, vas moleculares alternativas a la infeccin por el hrVPH no han sido del todo estudiadas.

A nivel molecular, evidencia reciente propone la activacin de la va Wnt como un proceso adicional a la infeccin viral que participa en la carcinognesis cervical104, 105. Esta va est involucrada en una gran cantidad de neoplasias de manera importante. Algunos cambios, reportados recientemente, sugieren que tambin est implicada en CaCU (ver antecedentes 1.11).

En el presente estudio se analizaron a nivel molecular, las alteraciones en la expresin gnica y proteica de componentes de la va Wnt, como un primer acercamiento a la modulacin de la va en cncer cervical. Anlisis con microarreglos nos permitieron seleccionar a 22 de 88 genes de la va Wnt con probables implicaciones en la carcinognesis cervical. La expresin de dichos genes fue evaluada mediante PCR en tiempo real para su validacin.

De los ocho ligandos de Wnt, se obtuvieron resultados reproducibles en la mayora, a excepcin de Wnt2b y Wnt11. Wnt2b presenta dos isoformas reportadas106. El diseo de los oligos generados para Wnt2b considero la amplificacin de una secuencia conservada entre ambas isoformas, por lo que se esperara un solo fragmento amplificado; no obstante, mediante el anlisis realizado por PCR punto final, se encontraron patrones de bandas que sugieren la presencia de posibles isoformas adicionales o formas mutadas del gen. Este fenmeno hizo que, mediante nuestro abordaje, fuera imposible el anlisis de este gen por la tcnica de PCR en tiempo real. De igual forma, Wnt11 present diversas bandas, a pesar de que hasta el momento ninguna isoforma ha sido reportada para este factor, lo cual igualmente impidi su anlisis por PCR tiempo real. Un escrutinio ms estricto en la bsqueda de oligos o un anlisis mediante el uso de sondas especficas podra revelar informacin importante de la participacin de este par de genes y de sus isoformas en la carcinognesis cervical.

Cuatro de seis ligandos, Wnt4, 7a, 10a y 16, presentaron una expresin gnica disminuida en todas las clulas derivadas de cncer cervical en comparacin con las clulas no tumorignicas (tanto HaCaT,

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como queratinocitos primarios), lo que sugiere un posible papel como genes supresores de tumor. Para los genes Wnt7a y 16, esta expresin fue corroborada a nivel proteico. La expresin de Wnt4 y 7a se encuentra bien documentada en tejido cervical, al menos durante la organognesis del aparato reproductor14, 107.

En particular, Wnt4 ha sido reportado como posible oncogn, puesto que se encuentra sobre expresado en gran la mayora de los tipos de cncer donde se ha estudiado110, 112-114, aun a pesar de estar clasificado entre los ligandos Wnt no transformantes108. La capacidad transformante de un ligando es determinada por ensayos de activacin del factor beta-catenina en embriones de Xenopus; no obstante, se ha visto que la regulacin de beta-catenina por un ligando puede variar entre los diferentes contextos celulares, adems de que otras vas no-cannicas de Wnt pueden tambin tener actividad transformante en determinado tipo celular. Sin embargo, recientemente, se ha comprobado la capacidad de Wnt4 de activar la va cannica en clulas de cncer de mama, explicando as a su capacidad carcinognica109-111. No obstante, niveles disminuidos de este ligando tambin han sido reportados en cncer 115, 116, como los ahora encontrados para cncer cervical en este estudio, aunque con implicaciones hasta la fecha desconocidas.

Interesantemente, Wnt4 y Wnt7a, participan de manera fundamental en la regulacin de la transicin Mesenquima-epitelio (MET)14. Normalmente, durante este proceso, los niveles de Wnt4 y Wnt7a son disminuidos por SNAI1, una protena homloga a Snail de D. melanogaster, que se sabe adems reduce tambin los niveles de E-cadherina117. La prdida de E-cadeherina es un marcador del proceso de MET, puesto que desacopla las uniones adherentes de la membrana y facilita la migracin celular117. La capacidad de migracin celular representa una ventaja para la expansin del cncer tanto en el mismo tejido, como para la metstasis a otros tejidos118. En correlacin, niveles bajos de WNT4 se asocian con un fenotipo maligno severo y metastsico de queratinocitos119.

Por otro lado, se ha reportado que Wnt7a promueve la expresin de E-cadherina por medio de la activacin de beta-catenina en clulas mamarias121. Por lo que la disminucin de Wnt7a observada en

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nuestro modelo, pudiera contribuir a los niveles disminuidos reportados para E-cadherina en clulas derivadas de cncer cervical122. Los niveles disminuidos de beta-catenina, a nivel de protena en las lneas celulares de CaCU, concuerdan con esta hiptesis. Estudios de expresin de Wnt7a y Wnt4 por inmunohistoqumica y/o inmunofluorescencia en biopsias de diferentes grados de displasia-neoplasia de crvix seran de utilidad para establecer esta correlacin, as como ensayos funcionales de ambos ligandos en estas clulas.

Niveles disminuidos de E-cadherina han sido tambin reportados en CaCU, con correlacin directa al grado de severidad de la displasia-neoplasia y sin correlacin con la infeccin de VPH
120

. La no

correlacin de los niveles de E-cadherina con la infeccin por VPH, refuerza el modelo multifactorial de la carcinognesis cervical y, ms importante an, la posible segunda contribucin de la va WNT, como un segundo factor etiolgico a nivel molecular de este proceso.

Una duda inquietante en el presente trabajo, es que la prdida de E-cadherina tambin libera a betacatenina de las uniones adherentes, permitiendo su acumulacin en el citoplasma y, si esta no es degradada, su migracin al ncleo. En nuestro estudio, encontramos niveles bajos de la protena betacatenina en general. Diferentes alternativas pueden ser planteadas, como la degradacin acelerada o la prdida de alguna regin del transcrito, que pudiera estar generando una protena truncada no reconocida por los anticuerpos utilizados. Beta-catenina se localiza en el cromosoma tres, que se ha visto regularmente afectado por inestabilidad genmica generada por los oncogenes E6 y E7, interesantemente, Wnt7a tambin se localiza en el cromosoma 3, lo que pudiera en otro sentido explicar la disminucin en su expresin. Sin embargo, estas hiptesis necesitan ser comprobadas.

Adicionalmente, se ha observado que DES, un compuesto carcingeno asociado a CaCU (ver antecedentes 1.2), suprime los niveles de expresin de Wnt7a123, 124. Ratones transgnicos K14E6 y E7 generan un mayor nmero de tumores cervicales de modo significativo con respecto a ratones normales, cuando son tratados con DES y otros derivados estrognicos125. Estas observaciones sugieren que la disminucin de la expresin de Wnt7a podra ser un paso decisivo durante la progresin del CaCU.

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Por otra parte, a Wnt7a se le ha identificado con actividad supresora de tumor en cncer de epitelio pulmonar126, a pesar de encontrarse sobreexpresada en una variedad de otras neoplasias108, 127-129. Como fue mencionado en los antecedentes, los ligandos presentan actividad pleiotrpica, seguramente definida en relacin al contexto celular.

En este contexto de supresor, Wnt7a se une al receptor Fzd9 y activa, por un lado, la va Wnt/JNK, lo que promueve el programa de diferenciacin celular130 y, por otro, a la cinasa ERK5 que activa al factor transcripcional PPARgamma inhibiendo la proliferacin de las clulas neoplsicas131. Tanto la prdida de diferenciacin como de la regulacin de la proliferacin son elementos que definen el concepto de neoplasia. Trayendo a cuenta, la participacin de Wnt7a en el desarrollo del tejido cervical14, 107, esta va, aunque reciente, pudiera ser una alternativa supresora de tumor en cncer cervical.

Niveles altos de Fzd9, tanto de transcrito como de protena, se observan en nuestro modelo estudiado. La actividad supresora de tumor de Fzd9 ha sido descrita no slo en cncer de pulmn, sino tambin en leucemia mieloide aguda, donde se asocia la metilacin de la regin promotora del gen de este receptor al mal pronstico del sndrome de mielodisplasia, patologa que tiende a evolucionar a leucemia aguda132. As mismo, en leucemia linfoctica aguda se ha observado ocasionalmente una disminucin en la expresin de este gen133, 134.

En astrocytomas se han reportado niveles altos de expresin para Fzd9135; algo semejante se observ en algunas lneas celulares de cncer gstrico128. Los niveles incrementados de este receptor en nuestro estudio pudieran indicar, ms que un papel en la oncognesis, un fenmeno de retroalimentacin positiva de la seal, donde a falta de la unin del ligando, la clula censa la disminuida seal y, con la finalidad de restablecerla, genera ms receptor. Dos eventos hacen inferir lo anterior: primero, la ausencia del ligando Wnt7a en las clulas derivadas de CaCU, que como ya se coment, se ha asociado de manera fuerte con Fzd9, y segundo, las mltiples bandas observadas para Fzd9 en los western blots (Figura 9b) nica y exclusivamente en las clulas no tumorignicas. Esta segunda banda de un tamao muy similar detectada, pudiera indicar una forma modificada de la protena como resultado de su activacin, que

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solo sucede en las clulas no tumorignicas que presentan el ligando Wnt7a.

En los ratones transgnicos K14E6, los niveles de Wnt4 se encuentran sobreexpresados 2.43 veces, mientras que en los de Wnt7a y Fzd9 no se reportan cambios. Es probable, en base a esta evidencia, que la actividad de estos genes cambie durante el progreso a cncer cervical de manera independiente a la infeccin viral. Esto pudiera significar una herramienta pronstico despus de la infeccin por el virus.

El ligando Wnt16 presenta dos variantes proteicas Wnt16A y Wnt16B, generadas por corte y empalme alternativo del primer exn. El diseo de los oligos iniciadores se realiz considerando la amplificacin de ambos transcritos (exn 3 y 4), as como tambin el anticuerpo fue dirigido contra una regin conservada para ambas isoformas (aa. 111-207). No obstante, tanto el transcrito de ambos, como las protenas, fueron encontrados disminuidos en las clulas derivadas de cncer cervical. Adicionalmente, observamos un fragmento de tamao anmalo en la lnea celular SiHa, que no corresponde a hbridos formados por los oligos iniciadores, tal como puede apreciarse en el control negativo. Lo que sugiere una probable mutacin de este gen, del cual habr que obtener el amplicn de SiHa, clonarlo y secuenciarlo. Hasta la fecha slo mutaciones puntuales han sido descritas para el gen Wnt16 en clulas de cncer gstrico136. En general, los reportes en cncer hacen referencia a Wnt16 como un solo componente, quiz por ello que su contribucin hasta ahora es un poco ambigua. Niveles disminuidos, como en este trabajo, se han encontrado en cncer de mama110, y aumentados en leucemias linfoblsticas y linfocticas crnicas de clulas B137-139. En estas ltimas clulas, se sabe que participa en la leucemognesis, manteniendo niveles activos de beta-catenina por interaccin con Fzd9140. Los datos proponen que Wnt16 no participa en la carcinognesis y no se evidencia alguna relacin supresora de tumor, una alternativa es que la disminucin de este factor, como de beta-catenina, pudiera deberse a algn proceso para inhibir la diferenciacin celular. Mucho resta por ser aclarado sobre el papel de Wnt16 tanto en el desarrollo normal del crvix como en CaCU. No obstante, no se puede descartar alguna actividad para los factores Wnt16a/b en etapas tempranas del cncer. Se ha reportado que Wnt16b activa la proliferacin de queratinocitos por una va independiente a beta-catenina141.

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Otro par de ligandos descritos como activadores cannicos de beta-catenina son Wnt10a y Wnt10b. Se encuentran expresados en genes diferentes. Wnt10a se ha observado sobreexpresado slo en algunas neoplasias y en lneas celulares, como cncer gstrico, linfoma de Mentle y Burkitts, leucemia promieloctica (Raji) y cncer colorectal137, 142, 143, pero sin implicaciones funcionales descritas hasta la fecha. En crvix, su actividad y expresin no han sido reportadas. En este estudio encontramos la expresin muy disminuida del transcrito en clulas de cncer cervical, e incluso indetectable en HeLa, bajo las condiciones utilizadas. Esto tambin se podra correlacionar con la disminucin observada de beta-catenina en este trabajo. La inactividad de Wnt10b en otras mucosas se ha asociado a displasias del epitelio, como en el caso del sndrome de displasias Odonto-Onico-Dermales144. Contrariamente a nuestros resultados, la expresin de Wnt10a en ratones transgnicos K14E6 se encuentra aumentada, lo que indica que la modificacin en las lneas celulares debe ser ulterior e independiente a la presencia del oncogn E6.

Por otro lado, la relacin de expresin, a nivel de mRNA, encontrada para Wnt10b es un poco ms intricada que en el resto de los ligandos, asi como su actividad. Un reporte reciente vislumbra una dualidad interesante de este factor145. Wnt10b esta categorizado como un fuerte oncogn, expresado en una importante cantidad de tipos de cncer (osteosarcoma, carcinoma hepatocelular, cncer de colon, neuroblastomas, cncer de mama, melanomas, carcinomas de clulas no146 escamosas)145, 147-153, donde parece activar la va Wnt/cannica. Se asocia adems con una capacidad metastsica en varias de estas neoplasias, como osteosarcoma y cncer de mama. Recientemente, se ha descrito su capacidad excepcional de degradar especficamente a p27, a travs de la expresin de CULT4A una ubiquitin ligasa146. No obstante, tambin interviene en diferenciacin celular de queratinocitos154.

El aumento de este factor en HeLa, ligeramente en C33 y no en SiHa, pudiera representar un componente importante para la proliferacin no controlada de estas clulas. Probablemente una ventaja, entre muchas otras seguramente, de crecimiento en las clulas infectadas con VPH18 sobre el VPH16. Se ha reportado una mayor capacidad de proliferacin de las clulas infectadas con VPH-18 con respecto a infecciones de otros tipos de papilomavirus, incluyendo el tipo viral 16155. La expresin de este grupo de

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protenas Wnt10 queda an por ser estudiadas a nivel proteico, para ver si existiera diferencias con su expresin transcripcional, as como ensayos funcionales.

El ltimo ligando abordado en este estudio WNT5A es quiz el ligando ms estudiado hasta la fecha en cncer. Se encuentra reportado como supresor de tumor y recientemente se la han atribuido capacidad de modulador inmunolgico (REF). La protena Wnt5a interesantemente, este factor presenta niveles transcripcionales altos en los ratones K14E6, como los encontrados en nuestro modelo de cncer; no obstante, su expresin en estas ltimas es excesiva. En los microarreglos de ratn K14E6 se encontr una sobreexpresin de este factor, con incremento superior a 2.

WNT5A se ha visto a menudo implicado en diferentes tipos de cncer como marcador de metstasis 119. Este factor est implicado en el desarrollo del crvix, en un juego de regulacin paracrina con WNT7A.

Otros cambios importantes, aunque no tan significativos como en los ligandos Wnt, fueron encontrados en los receptors frizzled. Cuatro receptores fueron estudiados, aunque slo se obtuvieron resultados consistentes para tres de ellos (Fzd3, 9 y 10). Fzd4 present muchos productos de amplificacin adicionales al fragmento esperado. Este gen ha sido reportado expresado en niveles altos en la lnea celular HeLa S156, por lo que su estudio hubiera sido comparativamente interesante. El diseo de nuevos oligos iniciadores para verificar los productos obtenidos es necesario.

Encontramos niveles de Fzd10 disminuidos en todas las lneas celulares, aludiendo a una actividad supresora de tumor por parte de este receptor. Hasta la fecha nada se ha descrito de Fzd10 como supresor de tumor, todos los reportes hacen referencia a una probable participacin en la oncognesis por va de la activacin de beta-catenina157-159, lo cual nuevamente seala una posible correlacin con la observada disminucin en beta-catenina. No obstante, los reportes de actividad para este receptor slo han visto en xenopus, y los resultados no siempre son transferibles a humanos160. Cabe destacar que este receptor tambin se ha visto que interacta con Wnt7a, activando la va Wnt/JNK en clulas de cncer endometrial; sin embargo, sus implicaciones no son claras, ya que no activa la proliferacin y

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probablemente actue sobre la diferenciacin161.

El patrn de expresin obtenido para Fzd3 es un poco ms ambiguo, adems de presentar desviaciones estndares grandes. Su expresin se encuentra ligeramente disminuida en las clulas con infeccin de hrVPH, pero sin cambios significativos, mientras que en las clulas C33 se observa un patrn de sobreexpresin, lo que pudiera significar una ventaja alterna para su crecimiento. Fzd3 ha si descrito como oncognico en leucemias linfocticas agudas y crnicas y cncer colorectal, as como en tumores de Erwing, donde su silenciamiento disminuye el crecimiento de las clulas tumorignicas137, 162-164. No obstante, la informacin de este gen en la literatura es poco clara.

Sorpresivamente, los niveles proteicos del factor transcripcional beta-catenina se encuentran disminuidos en las lneas derivadas de cncer cervical; no obstante, los niveles del mRNA de HeLa y SiHa son comparativamente equivalentes a los de la lnea celular HaCaT e incrementados en C33. Beta-catenina es en definitiva una protena oncognica, pero de una regulacin muy complicada. sta interacta con una gran cantidad de componentes, co-factores transcripcionales, protenas de membrana, etc., por lo que no solo su activacin sirve para definir si participa o no en procesos como proliferacin, diferenciacin o algun otro. Esta se asocia a factores transcripcionales como LEF/TCFs entre muchos otros, que a su vez se regulan por interaccin con otros compuestos. Los niveles transcripcionales de LEF1, tambin incluido en este estudio, no presentaron un patrn de expresin consistente a nivel del mRNA; pero si a nivel de protena, donde se observ la expresin de dos isoformas (A y B) en las clulas no tumorignicas (Figura 13, ver resultados 6.4.2.6). Los oligos diseados reconocen secuencias conservadas de las 4 isoformas reportadas, mientras que el anticuerpo solo reconoce en teora dos isoformas, por lo que los cambios entre los niveles de mRNA y protena detectados pudieran ser debido a esta razn. Otro anticuerpo que reconozca el carboxilo terminal o estudios con espectro de masas para determinar las isoformas deben ser puestos a consideracin.

LEF, como beta-catenina, estn asociados tambin a la diferenciacin, proceso que ya hemos discutido

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se encuentra abatido en cncer, la expresin de estos factores solamente en clulas no tumorignicas pudieran sealar una capacidad de diferenciacin restringida en las clulas derivadas de cncer.

La expresin de beta-catenina es importante; no obstante, beta-catenina activado migra al ncleo y acta como factor transcripcional, por lo que su localizacin en la clula resulta un mejor indicador de la actividad de este factor. Se analizaron entonces las fracciones proteicas nucleares y citoplasmtica, donde nuevamente la expresin encontrada de beta-cateina fue menor en clulas derivadas de cncer y sin ningn indicio de una proporcin aumentada de la protena en ncleo. Adicionalmente, con la finalidad de seguir analizando la actividad de este factor, tres genes blancos de la va Wnt/cannica fueron analizados; cada uno de ellos involucrado en una funcin diferente definida: HOXA9 desarrollo y diferenciacin, tambin asociado a leucemias, c-MYC proliferacin y apoptosis, e involucrado en una gran tipo de neoplasias, y ciclina D1 en regulacin del ciclo celular. Convincente con los resultados de expresin disminuida de beta-catenina, los tres genes mostraron niveles relativos bajos en las lneas celulares derivadas de CaCU, confirmando la falta de actividad del factor transcripcional. Este resultado, no esperado, contrasta con la teora inicial de la activacin de beta-catenina como marcador de cncer cervical. No obstante, el proceso de carcinognesis sucede de manera progresiva y en mltiples etapas. Es probable que la prdida de la expresin de beta-catenina sea un proceso dentro de una etapa tarda del cncer cervical, como se ha evidenciado en este estudio donde slo se usaron lneas celulares ya establecidas. De manera que en las primeras etapas del CaCU se tenga una expresin aumentada de beta-catenina como un factor importante para la proliferacin celular y que en fases posteriores, una vez establecido el cncer. la expresin del gen se reduzca con la finalidad de evitar los proceos de diferenciacin y apoptosis. De esta manera se consolida lo observado por otros grupos de investigacin, donde han observado la expresin de beta-catenina en un porcentaje de biopsias de pacientes

Otro de los datos contrastantes en nuestro estudio fueron los niveles de expresin observados en los factores DVL1 y 2. El mRNA de DVL1 se ha reportado sobreexpresado en dos tercios de clulas obtenidas de cncer cervical, donde fue asociado a la inhibicin de la degradacin de beta-catenina y activacin de ciclina D1165. En nuestro estudio, encontramos una ligera sobreexpresin slo en el caso de HeLa y C33

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con respecto a las clulas HaCaT, sin embargo, en relacin al cultivo celular primario de queratinocitos, en todas las lneas celulares se observ una expresin disminuida.

Otros dos genes blancos de la va Wnt fueron tambin analizados: Wisp1 y Wisp3. Estos pertenecen a la familia de protenas de sealizacin glicosiladas ricas en cistena sobreexpresados en nefroblastoma (CCN) 166. Los Wisp fueron identificados como molculas inducidas por Wnt1, aunque se han asociado tambin a otros ligandos167. Wisp1 se ha visto amplificado en varios tipos de cncer, como cncer de colon y heptico168-171; no obstante, en cncer cervical no existe reporte alguno. En contraste con los datos obtenidos en cncer de clon y heptico, nosotros encontramos una expresin fuertemente abatida de Wisp1 en todas las lneas celulares tumorignicas con respecto a los queratinocitos primarios no tumorignicos. Este mismo cambio ha sido tambin reportado en cncer de mama, donde se sugiere que Wisp1 posee una posible funcin de gen supresor de tumor172. Adicionalmente, Wisp1 ha sido reconocido como blanco directo de beta-catenina. Nuevamente, correlacionando su no expresin con los niveles bajos de beta-catenina en las clulas derivadas de cncer; no obstante, otra regulacin parece acontecer al menos en la lnea celular HaCaT, cuyos niveles de Wisp1 son muy bajos, a pesar de la expresin alta de beta-catenina. Alguna otra alternativa de regulacin, como la presencia de algn factor transcripcional, como CREB, que se ha reportado para Wisp1, deben participar en esta regulacin.

Al igual que Wisp1, Wisp3 se ha observado sobreexpresado en tumores de colon173, sin embargo y muy interesantemente, en el presente estudio encontramos una expresin fuertemente disminuida de Wisp3 en todas las lneas celulares tumorignicas tanto al respecto con queratinocitos primarios, como con las clulas HaCaT. Esta observacin tambin ha sido reportada para cncer de mama, donde reportan su funcin como gen supresor de tumor174. Ms aun, en el estudio de los amplicones observamos al menos dos probables isoformas de ste gen, que habr que aislar y secuenciar. Isoformas de ste gen no han sido hasta la fecha reportados.

[Conclusiones y logros]

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cancergenas.

The best way to get a good idea is to get a lot of ideas. Linus Pauling

Conclusin

Con base a lo encontrado en este estudio y la bibliografa revisada, claramente se sugiere una fuerte implicacin de estas molculas relacionadas a la va Wnt, en especial de Wnt4, 7a, 10a y 16 en la transformacin maligna de los queratinocitos infectados con el hrVPH. Una vez superadas las barreras de proliferacin, factores como Wnt 4 y 7a pudieran importar en la capacidad metastsica de las clulas

La inesperada expresin disminuida de beta-catenina, aunque contrastante, pudiera explicarse como una respuesta para evitar la diferenciacin de las clulas. Hasta la fecha no existe dato de una regulacin postranscripcional de este factor. Sin embargo, lo aqu observado corresponde a una etapa avanzada de un proceso de CaCU. Es posible que la expresin de beta-catenina sea importante slo en etapas inciales de la carcinognesis.

Ms estudios considerando las diferentes etapas de progresin y la funcin tejido-clula especfico de los ligandos, como de beta-catenina y su relacin, sern necesarios para determinar la verdadera participacin de estos factores. De igual forma estudios de actividad son necesarios para determinar la participacin precisa de estos factores en CaCU.

A la fecha algunos avances se tienen ya dentro de nuestro grupo de trabajo con relacin al gen Wnt7a.

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De comprobarse su actividad supresora de tumor, ste componente, adems de poder ser til como herramienta de diagnstico-pronstico, pudiera utilizarse como un agente teraputico especfico de la neoplasia, ya que los moduladores negativos (sFRP4) se encuentran silenciados de manera especfica en las clulas derivadas de cncer cervical.

Este trabajo fue un inicial acercamiento a la expresin transcripcional y proteica de componentes de la va WNT con probables implicaciones en carcinognesis cervical. Durante este trabajo se logr (1) identificar a 88 genes de la va Wnt analizados por microarreglos, entre los cuales se encontraron 22 con cambios de expresin y de posible importancia en la carcinognesis cervical. De estos 22 genes, (2) se pudo validar la expresin gnica diferencial entre lneas tumorignicas y no tumorignicas, mediante PCR en tiempo real. Adicionalmente, (3) se pudo corroborar a nivel de protenas la expresin de aquellos genes con cambios significativos y de los cuales existen anticuerpos comerciales mediante inmunodeteccin en fase solida (western bots). Finalmente, (4) las alteraciones en la expresin de los componentes de Wnt fueron correlacionadas entre s con resultados previos del laboratorio.

Varios genes y relaciones fueron identificados, lo que permitir en un futuro el estudio ms a detalle de la participacin de esta va en la gnesis del cncer cervical. En definitiva, este trabajo nos demuestra que cambios en la va de Wnt son importantes en la carcinognesis cervical y pudieran explicar alteraciones necesarias independientes a la infeccin por el virus del papiloma humano para la gnesis de la neoplasia. No obstante, mucho de esta va falta por investigarse y describirse en cncer cervicouterino.

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