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UNIV DIAG 2000;1(2):18-21

HOSPITAL CLNICOQUIRRGICO HERMANOS AMEIJEIRAS LABORATORIOS BETER

Determinacin de anticuerpos anti-DNA de doble cadena sobre preparacin nacional de Crithidia luciliae
Dra. Elena Kokuina,1 Lic. Igrid Garca,2 Lic. Javier Suarez,2 Dra. Aracelis Chico 4 y Dra. Nelsa Casas5

RESUMEN Se cultiv el hemoflagelado Crithidia luciliae con el objetivo de desarrollar un mtodo para la determinacin de anticuerpos antiDNA de doble cadena (dc) sricos. Se prepararon lminas portaobjetos, que fueron utilizadas para la deteccin de estos anticuerpos por el mtodo de inmunofluorescencia indirecta en 124 muestras de suero de pacientes con enfermedades autoinmunes reumticas. Se compararon los resultados de las preparaciones con los obtenidos sobre lminas comerciales. Solo 4 muestras fueron discordantes, y se obtuvo un coeficiente Kappa de 0.92. Estos resultados demostraron el valor diagnstico de estas preparaciones para la deteccin de anticuerpos anti-DNAdc.

Palabras clave: Autoanticuerpos anti-DNA de doble cadena, Inmunofluorescencia, Enfermedades autoinmunes reumticas, lupus eritematoso sistmico.

La deteccin de los anticuerpos anti-DNA doble cadena (dc) es esencial en el estudio de las enfermedades autoinmunes reumticas. Adems de su importancia diagnstica en estas condiciones clnicas, estos anticuerpos probablemente desempean un papel en la patogenia de algunas de estas enfermedades, como el lupus eritematoso sistmico. Uno de los mtodos utilizados en la actualidad para la deteccin de los anticuerpos anti-DNAdc es la inmunofluorescencia indirecta sobre el protozoo Crithidia luciliae, cuyo DNA circular y en forma de hlice est contenido dentro del mitocondrin gigante desplazado hacia uno de sus polos, llamado cinetoplasto. Como la Crithidia es un organismo procariota, de ncleo pobremente organizado y carente de membrana nuclear, es un substrato inadecuado para la deteccin de los anticuerpos antinucleares en su totalidad. Por lo tanto, los anticuerpos anti-DNAdc presentes en el suero del paciente reaccionaran nicamente con el cinetoplasto, esto se puede revelar por la tcnica de inmunofluorescencia.1 En este trabajo se prob el valor clnico de nuestras preparaciones de Crithidia luciliae para
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la determinacin de los anticuerpos anti-DNAdc mediante la comparacin de los resultados con los de un mtodo comercial.

MTODOS Preparacin de lminas portaobjetos con Crithidia luciliae: Se cultiv la Crithidia luciliae donada por el profesor L.A. Aarden (Red Blood Transfusion Service, Amsterdam) en medio de cultivo modificado respecto al original,2 bajo condiciones de vigorosa agitacin a 24 oC durante 48 h. A partir de este, se prepar un segundo cultivo hasta que la concentracin del parsito alcanz de 20-40 x 106 clulas/mL. Despus de 2 lavados con solucin salina fosfatada tamponada (PBS) con 1 mg/mL de albmina bovina, lasclulas fueron resuspendidas en una solucin de albmina bovina (1 mg/mL) en agua destilada a una densidad de 10x106 clulas/mL. Despus de 10 min la suspensin fue filtrada y aplicada en fracciones de 20 mL a los espacios sobre la lmina portaobjetos. Las lminas fueron secadas y fijadas en etanol 96 % durante 10 min. Las preparaciones fueron conservadas hasta su

Especialista de II Grado en Inmunologa. Profesor Asistente. Licenciada en Biologa. Aspirante a Investigadora. Especialista de II Grado en Reumatologa. Profesor Auxiliar. Especialista de I Grado en Reumatologa.

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utilizacin a 20 C . Parte del cultivo celular se criopreserv en medio de cultivo con DMSO 7 % en nitrgeno lquido. Pacientes: Se estudiaron las muestras de suero de 124 pacientes adultos del Servicio de Reumatologa del Hospital Clnicoquirrgico Hermanos Ameijeiras con indicacin clnica de bsqueda de anticuerpos anti-DNAdc. Los sueros se conservaron a 20 oC hasta su utilizacin. Determinacin de anticuerpos anti-DNAdc: Se realiz simultneamente sobre lminas preparadas en el laboratorio y lminas comerciales (Biosystem, Barcelona) y dividida en 8 ensayos. Se emple el mtodo de inmunofluorescencia indirecta (IF), para lo cual los sueros se aplicaron diluidos 1:10 en PBS sobre el substrato antignico fijado en las lminas portaobjetos y la presencia de los anticuerpos anti-DNAdc se demostr por la incubacin de las muestras con antisuero antiinmunoglobulinas humanas (IgA, IgG, IgM), conjugado con isotiocianato de fluoresceina (Sigma BioSciences, St. Louis). Despus de aplicar el medio de montaje las muestras fueron observadas en el microscopio de fluorescencia. La brillantez del mitocondrin de la Crithidia luciliae permiti clasificar la muestra como positiva para los anticuerpos anti-DNAdc. Los resultados de ambos mtodos se compararon mediante la prueba de chi cuadrado (X2) y se determin el coeficiente de concordancia Kappa.

las 34 muestras clasificadas como positivas para los anticuerpos anti-DNAdc por las lminas comerciales, 32 lo fueron tambin sobre las lminas nuestras (fig. 2); mientras que de las 90 muestras negativas para los anti-DNAdc por las preparaciones comerciales, 88 resultaron negativas tambin sobre nuestras preparaciones de Crithidia luciliae (fig. 3).

DISCUSIN Las tcnicas para la deteccin de los anticuerpos anti-DNAdc sricos se han hecho imprescindibles en los laboratorios clnicos. Estos anticuerpos se presentan en distintas enfermedades autoinmunes y niveles elevados de anticuerpos antiDNAdc estn fuertemente asociados con el

3,22 %

96,77 %

RESULTADOS

De las 124 muestras de suero estudiadas, 90 (72,58 %) resultaron negativas y 34 (27,42 %) resultaron positivas para los anticuerpos antiDNAdc por el mtodo de inmunofluorescencia con las lminas comerciales de Crithidia luciliae. Se obtuvieron resultados idnticos para la deteccin de los anticuerpos anti-DNAdc sobre las lminas comerciales y las nuestras en 120 de las 124 muestras de suero de pacientes con enfermedades reumticas, lo que se correspondi con un X2 de 104,7, p < 0,01, y un coeficiente de concordancia Kappa de 0,92, p < 0,01 (fig.1). De

X2 = 104,7 p < 0,01 K = 0,92 p < 0,01 Fig 1. Los resultados de la deteccin de los anticuerpos antiDNAdc por las lminas comerciales de la Crithidia luciliae (Biosystems) y las preparaciones del laboratorio fueron iguales en 120 de las 124 (96,77 %) muestras de sueros de pacientes con enfermedades reumticas.

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5,88 % 2,22 %

94,11 %

97,77 %

Fig 2. De las 34 muestras positivas para anticuerpos anti-DNAdc por las preparaciones comerciales de la Crithidia luciliae (Biosystem), 32 (94,11 %) fueron detectadas por las lminas del laboratorio.

Fig 3. De las 90 muestras negativas para anticuerpos anti-DNAdc por las lminas comerciales de Crithidia luciliae (Biosystems), 88 (97,77 %) tambin lo fueron por las preparaciones del laboratorio.

diagnstico del lupus eritematoso sistmico. Entre 60 y 83 % de pacientes con lupus eritematoso presentan en su circulacin anticuerpos anti-DNAdc en algn perodo de tiempo durante su evolucin. 3 La presencia de los anticuerpos anti-DNAdc sricos es una de las 3 alteraciones inmunolgicas necesarias para la clasificacin del lupus eritematoso sistmico segn los criterios del Colegio Americano de Reumatologa, los cuales han sido revisados en 1997.4 Los anticuerpos anti-DNAdc son los de ms probado papel patognico que causan mediante diversos mecanismos el dao renal del lupus.5 Se ha encontrado que los aumentos en los niveles sricos de anticuerpos anti-DNAdc preceden las exacerbaciones del lupus, y estn particularmente relacionados con el riesgo de glomerulonefritis lpica.6 Por lo tanto, mientras que las mediciones puntuales de los anticuerpos anti-DNAdc son tiles para establecer el diagnstico del lupus, las mediciones seriales de estos autoanticuerpos pueden ser importantes para evaluar la actividad de la enfermedad.5-7 El propsito de este trabajo ha sido introducir en la prctica clnica un mtodo til para la deteccin de los anticuerpos anti-DNAdc. En la

actualidad los mtodos ms utilizados para la deteccin de los anticuerpos anti-DNAdc en la clnica son el radioinmunoanlisis (RIA) de Farr, el ensayo inmunoenzimtico (ELISA) y la inmunofluorescencia sobre el protozoo Crithidia luciliae.7 El mtodo de inmunofluorescencia que utiliza como fuente antignica la Crithidia luciliae, resulta muy atractivo, porque aunque es menos sensible que el RIA y el ELISA, su mayor ventaja es su gran especificidad, pues casi exclusivamente detecta anticuerpos anti-DNAdc, en virtud de que este microrganismo posee un miticondrin gigante rico en DNAdc, a diferencia de los substratos antignicos de RIA y ELISA, los cuales pueden estar contaminados con DNA de cadena simple (DNAsc). Los anticuerpos anti-DNAsc carecen de valor diagnstico y pueden proporcionar resultados falsos positivos que confunden el diagnstico del paciente.8,9 Otro factor a considerar es el alto costo de los juegos diagnsticos comerciales de RIA y ELISA para la deteccin de los anticuerpos anti-DNAdc, asi como resultan tambin costosas y complejas la obtencin del DNAdc de fuentes bacterianas y de mamferos, y el desarrollo de estas tecnologas en el nivel del

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laboratorio; mientras que la preparacin de lminas con Crithidia luciliae resulta simple, rpida y econmica. 9,10 El cultivo de este parsito no patgeno para el hombre, no es complejo, y su rpida reproduccin ha permitido disponer de una alta concentracin de microorganismos en solo unos pocos das, an con un medio de cultivo modificado por sustitucin de algunos de sus componentes respecto al utilizado por Aarden L.A. 2,10 Las preparaciones funcionaron de igual forma que las lminas comerciales de Crithidia luciliae para la deteccin de los anticuerpos anti-DNAdc cuando se evaluaron muestras de 124 pacientes con enfermedades autoinmunes reumticas. La comparacin de los resultados se correspondi con un coeficiente de concordancia Kappa de 0,92, ( p < 0,01). Estos resultados permiten introducir el mtodo de inmunofluorescencia sobre Crithidia luciliae desarrollado para la deteccin de los anticuerpos anti-DNAdc en la prctica clnica, lo que ampla y consolida el diagnstico inmunolgico de las enfermedades autoinmunes y en particular del lupus eritematoso sistmico en Cuba.
SUMMARY For determining the serum Anti DNA antibodies of double chain the hemoflagellate Crithidia Luciliae was cultured and slides were prepared, and used for detecting such antibodies by the method of indirect immunofluorescence in 124 serum samples from patients suffering autoimmune rheumatic diseases. The results of the local preparations were compared with the ones obtained with commercial slides. Only 4 samples disagreed, a Kappa coefficient of 0.92 was obtained. These results showed the diagnostic values of our preparations for detecting AntiDNA antibodies.

Keywords: Anti-DNA antibodies of double chain, immunofluorescence, rheumatic autoimmune diseases, erythematous systemic lupus.

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Recibido: 10 de enero del 2001. del 2001.

Aprobado: 22 de febrero

Dra. Elena Kokuina. Laboratorios BETER. Calle 102 e/. 31 y 31B. Marianao. Ciudad de La Habana.Telf. 20-0711 al 14. E-mail: betera@infomed.sld.cu