Aplicaciones del laboratorio de citogentica a la clnica

E. Galn Gmez
Profesor Titular de Pediatra. Departamento de Pediatra del Hospital Materno-Infantil del Hospital Regional Universitario Infanta Cristina y Unidad de Gentica. Unidad de Prevencin de Minusvalas. Consejera de Sanidad y Consumo. Badajoz. Facultad de Medicina. UEX

Resumen

Palabras clave

El laboratorio de citogentica es fundamental para la gentica clnica. Es muy importante conocer las tcnicas actuales del laboratorio de citogentica. stas son, fundamentalmente el cariotipo, la hibridacin fluorescente in situ (FISH) y la hibridacin genmica comparativa (CGH). Mediante el cariotipo podemos conocer si el paciente presenta una anomala cromosmica numrica o estructural. Debe realizarse cariotipo de alta resolucin si el paciente a pesar de tener un cariotipo previo realizado normal, presenta retraso mental, rasgos dismrficos y otros datos sugerentes de cromosomopata. La FISH es una tcnica mixta de citogentica molecular que nos permite el diagnstico rpido de anomalas cromosmicas muy pequeas en metafase e interfase. La CGH es otra tcnica mixta, mediante la que podemos realizar un rastreo completo del genoma y nos permite identificar deleciones o duplicaciones, translocaciones no balanceadas y marcadores cromosmicos. Cariotipo; FISH (hibridacin fluorescente in situ); CGH (hibridacin genmica comparativa).

Abstract

Key words

CYTOGENETIC LABORATORY APPLICATIONS TO CLINICAL ASPECTS The cytogenetic laboratory is essential for clinical genetics. To know the current techniques of cytogenetic laboratory is very important. They are the karyotype, the fluorescent in situ hibrydization (FISH) and the comparative genomic hybridization (CGH). We can to know if a patient has a numerical o structrural chromosomal abnormality with the karyotype. If a patient has dysmorphic features, mental retardation or other features indicating a chromosomal abnormality we need to perform a high resolution karyotype even if the patient has a previous normal karyotype. The FISH is a molecular-cytogenetic technique through we can identify cryptic chromosomal abnormities in metaphase or interphase. The CGH is other molecular cytogenetic technique through we can perform a full genomics scan and identify deletions, duplications, unbalanced translocations and markers. Karyotype; FISH (fluorescent in situ hybridization); CGH (Comparative genomic hybridization).

Pediatr Integral 2002;6(9):820-830.

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INTRODUCCIN Tras la valoracin dismorfolgica, el genetista clnico necesita en muchas ocasiones de exmenes complementarios para poder completar el diagnstico. El laboratorio de citogentica juega un papel fundamental complementario de la gentica clnica. Con los avances cientficos y tecnolgicos, la gentica ha llegado a ser un aspecto fundamental de todas las reas mdicas. Es importante que el pediatra general conozca de qu medios disponemos en la ac-

tualidad en el laboratorio de citogentica, qu utilidades tiene para la clnica y qu significado tienen estos estudios. En este captulo, veremos una introduccin que nos recuerde brevemente la patologa cromosmica y, posteriormente, haremos una descripcin de las principales tcnicas con su utilidad, indicaciones para estudio y significado de las mismas. La citogentica es la parte de la gentica que se dedica al estudio del cariotipo y los cromosomas. La citogentica es una

ciencia relativamente joven. A mediados del siglo XIX el hombre comenz a observar los cromosomas al microscopio, pero hasta final de los aos 50 no fue posible individualizar los cromosomas al microscopio, contarlos y conocer su estructura. Con los avances que se han producido en la ultima dcada, no slo hemos podido identificar los cromosomas, sino que hemos llegado a identificar anomalas cromosmicas tan pequeas que estn fuera de la resolucin del microscopio ptico. Estas lti-

mas anomalas pueden ser diagnosticadas a gracias a las tcnicas de citogentica molecular (hibridacin fluorescente in situ FISH y hibridacin genmica comparativa CGH). RECUERDO-RESUMEN DE LA PATOLOGA CROMOSMICA La anomalas cromosmicas pueden ser numricas y estructurales y son la principal causa de abortos y retraso mental. Las clulas humanas somticas tienen 46 cromosomas (es decir son diploides, 2n). Las clulas sexuales humanas tienen 23 cromosomas (es decir, son haploides, n). Los cromosomas los agrupamos en pares cromosmicos atendiendo a su tamao y morfologa. Existen 23 pares cromosmicos (22 pares de autosomas y los cromosomas sexuales, XX en la mujer y XY en el hombre). Los cromosomas del mismo par se llaman cromosomas homlogos. Uno de cada par de cromosomas homlogos procede de cada progenitor de cada individuo (as, de los 2 cromosomas nmero 1, uno procedera del padre y otro de la madre, etc.). Esto se debe a que, en las clulas germinales, la dotacin cromosmica est reducida a la mitad (las clulas sexuales inmaduras tiene 46 cromosomas, pero al madurar en la primera divisin de la meiosis la llamada divisin reductora la dotacin cromosmica queda reducida a la mitad, 23 cromosomas). As, al unirse el vulo maduro (23 cromosomas) y el espermatozoide maduro (23 cromosomas), tendremos un nuevo ser con la dotacin cromosmica diploide caracterstica de la especie humana.

Cariotipo anormal Incidencia total Anomalas numricas (aneuploidias) AE balanceadas AE no balanceadas

Abortos en Fetos de madres Nacidos primer trimestre > de 35 aos vivos 1/2 96% 4% 1/50 85% 10% 5% 1/160 60% 30% 10%

TABLA I. Incidencia de anomalas cromosmicas.

AE: anomalas estructurales.

Las anomalas cromosmicas son las responsables de una proporcin significativa de enfermedades genticas, encontrndose en 1 de cada 150 recin nacidos vivos, y constituyen la principal causa de retraso mental y de abortos. Las anomalas cromosmicas se observan en el 50-60% y en el 20-30% de los abortos espontneos del primer y segundo trimestre, respectivamente. Las anomalas cromosmicas pueden ser numricas o estructurales y pueden afectar a uno o ms autosomas o a los cromosomas sexuales o a ambos simultneamente. Las anomalas cromosmicas numricas se dividen en euploidias y aneuploidias. Las euploidias se deben a una alteracin del numero haploide n (triploidia, tetraploida) y son excepcionales en los individuos vivos, siendo relativamente frecuente en los tejidos abortivos y tumorales. Las aneuploidias son las anomalas cromosmicas ms frecuentes que tiene repercusin clnica. En ellas existe un nmero anormal de cromosomas, debido a un exceso (trisomas) o prdida (monosomas) de algn cromosoma y siempre se asocian con trastornos del desarrollo fsico o mental. Las aneuploidias se producen por no disyuncin (mala separacin de los cromosomas en

la divisin celular). La especie humana tolera mejor las trisomas que las monosomas (no obstante, slo sobreviven parte de aquellos individuos que tienen trisomas de los cromosomas ms pequeos- trisomas 21, 18, 13) y tolera mejor la no disyuncin que afecta a los gonosomas que a los autosomas. En la especie humana, las monosomas de un cromosoma completo suelen ser letales (con excepcin de un 5% de las pacientes afectas de monosoma X, s. de Turner que sobreviven). Las anomalas cromosmicas estructurales son aquellas que afectan a la morfologa o estructura del cromosoma. Podemos dividirlas en balanceadas o equilibradas y no balanceadas o desequilibradas. Las anomalas balanceadas son aquellas donde no existe prdida o ganancia de material gentico y habitualmente no se acompaan de efecto fenotpico, pero pueden tener un riesgo incrementado de anomala cromosmica en la descendencia. Entre ellas, tenemos las traslocaciones y las inversiones. Las traslocaciones pueden ser traslocaciones recprocas (intercambio de fragmentos cromosmicos entre cromosomas no homlogos) y robertsonianas (donde se intercambia material cromosmico entre los cromosomas acrocn-

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TABLA II. Indicaciones para realizar un carotipo.

1. Perodo prenatal: - Edad mayor de 35 aos - Ansiedad materna - Triple screening alterado - Oligoamnios-polihidramnios - Retraso de crecimiento intrauterino (CIR) - Arteria umbilical nica - Sospecha ecogrfica de cromosomopata - Antecedentes de cromosomopata balanceada en un progenitor 2. Perodo neonatal: - Malformaciones mayores aisladas - Presencia de 3 ms defectos congnitos menores - Recin nacido con rasgos dismrficos - Recin nacido con genitales ambiguos - Parto con producto muerto de causa inexplicable - Muerte neonatal de causa inexplicada 3. Perodo de lactancia: - Nios con dificultades para el aprendizaje - Nios con rasgos dismrficos - Nios con retraso psicomotor 4. Perodos preescolar-escolar: - Trastornos del crecimiento - Retraso psicomotor - Rasgos dismrficos 5. Perodo de adolescencia: - Ginecomastia - Falta de desarrollo puberal - Amenorrea primaria o secundaria - Retraso mental - Rasgos dismrficos 6. Perodo del adulto: - Padres de nios con anomalas cromosmicas estructurales - Abortos de repeticin - Infertilidad inexplicable - Diagnstico prenatal (lquido amnitico y biopsia de corion) - Rasgos dismrficos 7. En todas las edades: - Procesos malignos (cariotipo constitucional y tumoral) - Control de trasplantes de medula sea

ciales), cromosomas en anillo, isocromosomas y cromosomas dicntricos. ESTUDIOS DEL LABORATORIO DE CITOGENTICA Los estudios que pueden realizarse en el laboratorio de citogentica son: cariotipos (resolucin standard y de alta resolucin), hibridacin fluorescente in situ (FISH) y hibridacin genmica comparativa (CGH). CARIOTIPO El cariotipo que puede realizarse por diversas tcnicas detecta anomalas cromosmicas numricas y estructurales. Hay que considerar realizar estudio de alta resolucin si existe sospecha de cromosomopata a pesar de un cariotipo previo normal. Es la distribucin ordenada de los cromosomas en metafase o prometafase, atendiendo a su tamao y a su forma. Mediante su estudio, podemos ver la dotacin cromosmica de un individuo y comprobar, por lo tanto, si un determinado paciente padece o no una anomala cromosmica. Las indicaciones para realizar un cariotipo quedan reflejadas en la Tabla II. En la especie humana los cromosomas se estudian sobre todo en linfocitos de sangre perifrica, pero pueden estudiarse en cualquier otro tejido incluyendo mdula sea, fibroblastos, o tejidos prenatales (lquido amnitico y biopsia de corion) y de la concepcin (tejidos fetales y membranas fetales de abortos). Para la realizacin del cariotipo, se necesitan 1-3 mL de sangre heparinizada. Tras ello, se realiza la siembra de la sangre

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ticos). Las inversiones se producen por una doble rotura de un cromosoma y reunin de nuevo tras un giro (inversin de 180). Pueden ser inversiones paracntricas, si las dos roturas afectan a un mismo brazo cromosmico (no cambia la morfologa del cromosoma), o pericntricas, si cada rotura afecta a un brazo cromosmico (cambia la morfologa del cromoso-

ma). Las anomalas cromosmicas no balanceadas o desequilibradas son aquellas en las que existe prdida o ganancia de material gentico, y por lo tanto suelen tener repercusiones fenotpicas, defectos congnitos asociados y/o retraso mental. Entre las anomalas cromosmicas no balanceadas, tenemos las deleciones (monosomas parciales), las duplicaciones (trisomas par-

perifrica (lo antes posible tras su extraccin, pero puede obtenerse un crecimiento aceptable hasta 2-3 das despus de la extraccin). El medio de cultivo donde se siembra la sangre es un medio que lleva suero fetal de ternera enriquecido y protegido con antibiticos y antifngicos, al que se le aade fitohemaglutinina para estimular el crecimiento y transformacin de los linfocitos T. Despus de 72 horas de cultivo, se detiene la divisin celular en metafase aadiendo colchicina (inhibe la formacin de uso acromtico y la divisin del centrmero). Posteriormente se aade una solucin hipotnica para que las clulas se hinchen y se lisen, con lo que los cromosomas se liberan y permanecen intactos los centrmeros, tras ello se fijan los cromosomas para que no se separen y luego se extienden en portaobjetos. Despus se tien con diversas tcnicas y entonces estn disponibles para el anlisis. Mediante estas tcnicas, los cromosomas muestran unas zonas claras y oscuras llamadas bandas que son especficas de cada cromosoma. Entre las tcnicas de bandeo disponibles tenemos la tincin convencional (ya en desuso), bandas G (son las habituales, de resolucin estndar 300-400 bandas) (Figuras 1 y 2), bandas Q, bandas C, bandas NOR, bandas R, bandas DAPI y bandas de alta resolucin. Las imgenes cromosmicas obtenidas al microscopio se procesan y los cromosomas se ordenan en funcin de su longitud y estructura (sobre todo por la posicin del centrmero). En la actualidad, se utiliza el anlisis informatizado de la imagen para visualizar los cromosomas.

FIGURA 1.
Diagrama de bandas GTG de los cromosomas.

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FIGURA 2. Cariotipo por tcnica de bandas GTG de una mujer cromosmicamente normal 46,XX.

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Con las tcnicas habituales de resolucin standard es fcil el diagnstico de anomalas cromosmicas numricas. Tambin pueden observarse anomalas estructurales groseras, pero no pueden observarse pequeas deleciones o duplicaciones. Es importante recordar que nuestra capacidad para identificar alteraciones cromosmicas estructurales depende del desarrollo tecnolgico. As, hace unos aos slo disponamos

del bandeo cromosmico con un nivel inferior a 500 bandas; mientras que, las tcnicas actuales permiten realizar cariotipos con ms de 800 bandas. Por todo ello, ante todo nio con defectos congnitos, debe realizarse cariotipo de alta resolucin (se realiza en cromosomas prometafsicos). Si un paciente tuviera un cariotipo previo realizado normal, pero con menos de 500 bandas, habra que repetirlo. Esto es ms im-

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FIGURA 3. Utilidades y aplicaciones de la hibridacin in situ (FISH).

Utilidades

Aplicaciones

Identificacin de marcador Identificacin de traslocaciones NO balanceadas de novo

Rapidez

Clulas en interfase y metafase

Identificacin de regiones bandeadas anormalmente Diagnstico prenatal Aneuploidas

Estudios directos, sin cultivo Poblacin original, clones Deleciones Duplicaciones

portante an si en la familia se han presentado varios hijos con defectos congnitos diversos. En algn caso, habra que realizar estudios dirigidos de citogentica molecular (ver apartados ms adelante). FISH (hibridacin in situ fluorescente) La FISH es una tcnica mixta de citogentica molecular que nos permite el diagnstico rpido de anomalas cromosmicas en metafase (muy pequeas, no visibles a la resolucin del microscopio ptico) o interfase. A veces, es difcil identificar ciertas anomalas cromosmicas, tales como marcadores cromosmicos (marker), cromosomas derivativos, traslocaciones no balanceadas de novo y algunas regiones anormalmente bandeadas, ya sea en clulas somticas o tumorales. Otro inconveniente de las tcnicas citogenticas habituales proviene del hecho de que el anlisis cromosmico se realiza en clulas

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que se estn dividiendo y los cromosomas deben detenerse en metafase. Esto significa que el proceso requiere un tiempo y trabajo para obtener clulas que estn en fase de divisin y poder realizar el estudio. Por ltimo, la seleccin que realicemos de las clulas, puede en ocasiones conducir a errores, debido a que las clulas que proliferan in vitro, pueden no representar la poblacin original. Este ltimo aspecto es muy importante cuando trabajamos con muestras tumorales (Figura 3). Muchas de las dificultades anteriormente enumeradas han podido solventarse con la introduccin de la hibridacin fluorescente in situ (FISH fluorescent in situ hybridization). Esta tecnologa, relativamente nueva, proporciona una ayuda importante a las tcnicas citogenticas clsicas, debido al hecho nico de valorar simultneamente informacin citogentica y molecular. La capacidad para detectar y caracterizar anomalas cromosmicas mediante FISH ha aumentado y mejorado en los

ltimos aos por el rpido incremento y perfeccionamiento de sondas cromosmicas especficas. En la actualidad, pueden detectarse regiones de 110 kilobases de tamao. Otro de los grandes avances que ha permitido la FISH, es la posibilidad de disponer de un test diagnstico en 24-48 horas, en contraste con la gran cantidad de tiempo requerido para algunas tcnicas citogenticas. La FISH permite la determinacin del nmero y localizacin de determinadas secuencias de DNA (cido desoxirribonucleico) en clulas humanas, tanto en interfase como en cromosomas en metafase. La metodologa del FISH se basa en la complementariedad entre las 2 cadenas de DNA de doble hlice. Actualmente, las sondas DNA son marcadas no isotpicamente por incorporacin de un nucletido modificado qumicamente que es detectado por una molcula presentadora marcada con fluorescencia. Las clulas o los cromosomas en metafase que van a ser estudiados se preparan en portaobjetos para ser evaluados al microscopio. Estas preparaciones se obtienen mediante las tcnicas habituales para los estudios citogenticos de rutina. Tambin, podemos utilizar preparaciones de clulas que estn dividindose procedentes de aspirados de mdula sea o de biopsias de piel o muestras tumorales. En el diagnstico prenatal, pueden utilizarse clulas amniticas, de vellosidades coriales o sangre fetal obtenida por fetoscopia o puncin percutnea del cordn umbilical. Sin embargo, y esto es una de los avances ms importantes, la FISH no necesita preparaciones obligatoriamente en metafase como

sucede con las tcnicas citogenticas standard. Al contrario, puede realizarse un diagnstico rpido, de gran utilidad sobre todo para el diagnstico prenatal y para muestras tumorales, estudiando clulas inmovilizadas en interfase que se obtienen directamente de las muestras o de una extensin/seccin y posterior fijacin de la muestra. Como cada cromosoma ocupa un territorio dentro del ncleo en interfase, es posible determinar el nmero de cromosomas o determinadas regiones cromosmicas contando el nmero de seales presentes. Existen sondas diferentes dependiendo de las necesidades para la deteccin de anomalas cromosmicas. La eleccin de la sonda variar con cada aplicacin particular en cuestin. En general, hay 3 tipos de sondas: 1. Sondas locus-especficas; 2. Sondas alfoides o centromricas; y 3. Sondas que dibujan cromosomas completos (pintado cromosmico) o ciertas regiones cromosmicas (painting). Adems, el DNA genmico completo puede ser utilizado como una sonda para determinar el componente humano en clulas somticas hbridos de humanos/roedores. Las sondas locus-especficas (Figura 4) tienen su aplicacin dirigida a la deteccin de aneuploidias, es decir para la deteccin de duplicaciones o deleciones de regiones cromosmicas especificas, y para la deteccin de los puntos de ruptura en traslocaciones asociadas a tumores. Estas sondas de DNA oscilan entre 15 y 500 kilobases de tamao y se utilizan para diagnosticar una anomala citogentica especfica. Las sondas centromricas o alfoides: el DNA satlite o repe-

FIGURA 4. FISH de una paciente afecta de sndrome velocardiofacial (sonda locus especfica de la regin 22q 11.2)

En la figura, se aprecian marcados los 2 cromosomas 22. El cromosoma normal tiene 2 seales: la verde (marca la regin 22q13 e identifica el cromosoma 22) y la rosa (regin especfica 22q11.2). El cromosoma 22 que le falta la seal de color rosa, tiene una microdelecin 22q11.2

titivo constituye aproximadamente del 10 al 20% de todo el DNA humano. En particular, los cromosomas llevan de 105 a 106 pares de bases de secuencias DNA centromricas o pericentromricas cortas repetidas en tandem. Las unidades monomricas que forman estas secuencias satlites alfa, beta u otras secuencias satlites de DNA varan de tal manera que muchas son cromosoma-especfico. Ya se han aislado y clonado muchas de estas sondas para estas secuencias especficas para la mayora de los cromosomas humanos y estn comercialmente disponibles. Las sondas de cromosoma completo (painting o pintado cromosmico): son sondas que utilizan una mezcla de diferentes secuencias de DNA y que son homologas a muchas zonas a lo largo de un cromosoma especfico. Esto permite que el cromosoma sea pintado o decorado tanto en metafase como en el n-

cleo en interfase. Estas sondas se han obtenido de cromosomas especficos procedentes de ciertas libreras, que han sido amplificados, o de clulas hbridos somticas monocromosmicas o mediante microdiseccin de cromosomas o regiones cromosmicas procedentes de metafase y posterior amplificacin. En los ltimos aos, se han perfeccionado las tcnicas de FISH, y han aumentado el nmero de sondas comercialmente disponibles. Ello nos permite en la actualidad utilizar diferentes sondas marcadas de manera diferente en una misma preparacin, utilizando diferentes colores para la fluorescencia de las diferentes sondas, etc. Hoy por ejemplo, disponemos del Multicolor painting (ms conocido como multicolor FISH o M-FISH) que nos permite analizar en una misma preparacin sondas que dibujaran con 6-8 colores diferentes todos los cromosomas de

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TABLA III. Ejemplos de sndromes de microdelecin que pueden ser identificados por FISH.

Sndrome S. de Williams-Beuren S. de Langer-Giedion Aniridia-T Wilms (WAGR) S. de Beckwith-Wiedemann S. de Prader Willi S. de Angelman S. de Rubinstein Taybi S. de Smith-Magenis S. de Miller-Dieker S. de Alagille S. de Di George/VCF

Locus 7q11.23 8q24 11p13 11p15 (dup) 15q11-13 (pat) 15q11-13 (mat) 16p13.3 17p11.2 17p11.3 20p11.2-12 22q11.22

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una metafase. En la actualidad, se ha introducido el rastreo del genoma humano completo mediante definicin espectral definida para cada cromosoma lo que se conoce como tcnica de cariotipo espectral o SKY. En lo que se refiere a las aplicaciones clnicas de la FISH, tenemos las siguientes: A. Estudio de las anomalas cromosmicas en metafase: 1. Aneuploidas: tiene su utilidad sobre todo en el diagnstico prenatal o en el perodo neonatal, o en ciertos tumores (sobre todo los slidos) cuando la valoracin y diagnstico temprano de algunas trisomas puede ser importante. 2.Traslocaciones e isocromosomas. 3. Marcadores cromosmicos. 4. Deleciones y duplicaciones: el anlisis de las pequeas deleciones o duplicaciones en los cromosomas humanos es mejor enfocado mediante FISH con sondas dirigidas a detectar la regin crtica que es responsable del sndrome. Actualmente, existen varios sndromes de microdelecin (engloba sndrome de microdelecin y de microdu-

plicacin) (Tabla III) que pueden ser diagnosticados con esta tcnica. B. Deteccin de anomalas cromosmicas en clulas en interfase: en los ltimos aos se estn realizando numerosos avances para detectar de forma rpida y segura diferentes anomalas cromosmicas en las clulas en interfase. Esto tiene sobre todo su aplicacin en el diagnstico prenatal, ya sea en clulas amniticas, clulas coriales o fetales parcialmente aisladas de sangre materna o de muestras endocervicales. Asimismo, estas tcnicas tambin proporcionan informacin til para el diagnstico de mosaicismos o deteccin de anomalas cromosmicas tras exposicin a radiacin, para valoracin de pacientes con leucemia que han recibido un trasplante de mdula sea y para el mapeo de genes. C. FISH y el mapeo del genoma humano: en la actualidad, para el mapeo del genoma humano se buscan mtodos directos y rpidos que permitan la visualizacin de se-

cuencias especificas de DNA a lo largo de cada cromosoma. Esto puede lograrse aplicando las diferentes tcnicas de FISH a los cromosomas en metafase o en interfase. D. Estudio de las anomalas cromosmicas mediante FISH en el cncer: la utilidad del FISH para el diagnstico de pacientes con cnceres y lesiones premalignas ha sido revisada por diversos autores. La meta principal de los estudios realizados es relacionar las anomalas cromosmicas numricas y estructurales con el diagnstico y pronstico de la enfermedad. Las tcnicas citogenticas convencionales de las clulas cancerosas en metafase, proporcionan cierta informacin que se obtiene despus del cultivo in vitro de clulas aisladas que pueden proceder del crecimiento de subpoblaciones seleccionadas. Adems, con relativa frecuencia, disponemos de metafases escasas para el anlisis. Las tcnicas de FISH han permitido solucionar, en parte, estos problemas, y han permitido que puedan estudiarse clulas aisladas o secciones de tejido. Entre las ventajas y aplicaciones, tenemos el estudio rpido que podemos hacer en pacientes con leucemia mieloide crnica, estudiando la fusin del gen BCR-ABL (corresponde a la traslocacin 9q34;22q11) en clulas en metafase o en interfase mediante FISH mediante una preparacin de las sondas con dos colores diferentes. E. Un captulo especial de la FISH es el estudio de anomalas cromosmicas su-

tiles o crpticas (anomalas subtelomricas). Los telmeros son una zona del genoma humano con alta concentracin de genes y, por tanto, pequeas alteraciones en esa zona podran afectar a genes candidatos para sndromes con retraso mental. La mayora de estas anomalas telomricas son indetectables para la citogentica convencional, de ah el nombre de crpticas o sutiles; ya que, el tamao y patrn de bandas de estas regiones cromosmicas es muy similar y no se pueden distinguir en el caso de una traslocacin, o bien el tamao de la anomala es tan pequeo que supera el lmite de resolucin de las actuales tcnicas de bandas. De acuerdo con los conocimientos actuales, y como ya comentamos anteriormente, debera valorarse la realizacin de un estudio con sondas subtelomricas en todo caso de retraso mental moderado-severo de causa desconocida, que presente anomalas dismrficas en el examen clnico o que tenga otros familiares con retraso mental (aunque el fenotipo de estos familiares sea diferente al probando, ya que la traslocacin puede segregarse de diferentes formas y dar lugar por tanto a fenotipos diferentes) y existan antecedentes de abortos de repeticin. CGH (hibridacin genmica comparativa) La CGH es una tcnica de citogentica-molecular que permite la identificacin de ganancia o prdida cromosmica por rastreo del genoma completo en una sola etapa.

Cromosomas Cell average Slide average

Conf. 95%

FIGURA 5. CGH (hibridacin genmica comparativa) de una nia que presentaba una delecin a nivel de 5q21.

Se observa en el cromosoma 5 una inclinacin hacia la izquierda del material gentico que nos indica una prdida y la sita en 5q15-22 (flecha).

Est indicado realizarla cuando hay mala calidad de la muestra o cuando se necesitan identificar marcadores cromosmicos, traslocaciones no balanceadas, monosomas o trisomas parciales. Como hemos visto previamente al hablar del cariotipo y del FISH, en muchas ocasiones, en gentica clnica y dismorfologa es necesario un diagnstico preciso en un recin nacido o en una muestra prenatal con una anomala cromosmica. El diagnstico exacto es necesario para poder conseguir un consejo gentico correcto, para el tratamiento, seguimiento y pronstico del paciente. Por el mismo motivo, la identificacin precisa del origen del material cromosmico extra o perdido es un hecho importante para la correlacin genotipo-fenotipo y puede conducir al descubrimiento de genes responsables de las anomalas clnicas que presenta un determinado paciente.

Hay algunos casos en los que no se pudo realizar un estudio cromosmico completo pues la muestra no pudo ser cultivada correctamente. En otras ocasiones el estudio cromosmico nos permiti observar que el paciente presentaba material cromosmico extra, pero no pudimos saber de donde proceda. Como hemos visto, mediante las diferentes tcnicas de FISH podemos en muchas ocasiones identificar este material cromosmico. No obstante, en muchas ocasiones el material cromosmico extra es muy difcil y laborioso de precisar y necesitamos utilizar mltiples sondas de pintado cromosmico completo (painting) de los diferentes cromosomas hasta que identificamos dicho material extra o utilizar multiFISH como hemos visto anteriormente. El multiFISH nos permite identificar el origen del material extra, pero no nos permite identificar la localizacin especfica de los puntos de ruptura en el cromosoma del cual se

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ha originado este material cromosmico extra. La CGH es una tcnica de citogentica molecular que nos permite la identificacin de ganancia o prdida cromosmica por rastreo del genoma completo en una simple etapa. Tiene la ventaja de realizar una bsqueda a lo largo de todo el genoma sin disponer de informacin previa acerca de la anomala cromosmica en cuestin. Esta tcnica se basa en la hibridacin in situ del DNA genmico total marcado de forma especifica de una muestra con un DNA humano normal (DNA de referencia) de una metafase. La hibridacin del DNA de la muestra y del de referencia puede distinguirse por los diferentes colores fluorescentes. Las cantidades relativas de DNA de la muestra y del DNA de referencia hibridados en una posicin determinada de un cromosoma pueden ser calculados de la relacin de sus diferentes colores fluorescentes (Figura 5). La CGH proporciona informacin acerca del origen de ganancias y prdidas de material cromosmico y mapea estas anomalas en el cromosoma correspondiente. La CGH no puede detectar anomalas cromosmicas balanceadas, pero sabemos que estas ltimas habitualmente no producen anomalas en los pacientes que las presentan. Las anomalas cromosmicas slo se detectan si existen en la mayora de las clulas de la muestra (valor escaso en algunos casos de mosaicismo). En un primer momento, la CGH slo se utiliz para los estudios cromosmicos en muestras tumorales, pero a medida que pasa el tiempo se va utilizando cada vez ms en citogentica convencional.

Debido a que la CGH se basa en anlisis del DNA, no son importantes el cultivo de la muestra, la disponibilidad ni la calidad de las metafases. Incluso puede utilizarse en tejidos no viables. Esto hace que esta tcnica sea muy til en el laboratorio de citogentica, sobre todo en las muestras en las que el cariotipo no puede sen completado por las tcnicas convencionales. La sensibilidad de la CGH an es desconocida. Todava no conocemos con precisin cual es el mnimo tamao de anomala cromosmica que la CGH puede detectar. Segn los diversos autores la CGH puede detectar anomalas de 2-10 Mb de DNA. Las anomalas que podemos detectar con la CGH son aneuploidias parciales en la forma de marcadores cromosmicos, deleciones parciales, traslocaciones no balanceadas y duplicaciones intracromosmicas. Muchas veces, la CGH se complementa con la FISH. Una vez que hemos podido conocer la anomala cromosmica, se comprueba la misma con pintado cromosmico. Entonces, la combinacin de la CGH y la FISH proporciona un mtodo eficiente y preciso para identificar anomalas cromosmicas de origen desconocido. BIBLIOGRAFA
Los asteriscos reflejan el inters del artculo a juicio del autor. 1.*** American Academy of Pediatrics. Committee on Genetics. Pruebas de Gentica molecular en la prctica peditrica: Revisin del tema. (ed. Esp) Pediatrics 2000, 60: 402-5. Artculo de revisin muy importante. Seala el significado e indicaciones de las pruebas de citogentica y molecular con resumen de la aplicacin a la patologa peditrica.

2.*

Connor JM, Fergusson-Smith MA. Chromosomes. In: Essential Medical Genetics. Blackwell Scientific Publications. Oxford, 4th ed. 1993. p. 38-51. Libro bsico de gentica mdica. Es un captulo de las tcnicas citogenticas y resumen de los principales trastornos cromosmicos. 3.*** Delgado A, Galn E. Monografas de Pediatra. Patologa Cromosmica. Ed. Ctedra de Pediatra. Universidad del Pas Vasco. 1998. Monografa bsica de patologa cromosmica. Revisin y puesta al da de las cromosomopatas: generalidades, anomalas cromosmicas, autosomopatas numricas y estructurales, triploidas, gonosomopatas y sndromes de microdelecin. 4.*** Galn Gmez E, Blesa Snchez E, Cardesa Garca JJ. Utilizacin de la Hibridacin in situ (FISH) en patologa peditrica. En: Estudio de Pediatra: Homenaje al Profesor Snchez Villares. Ed. Universidad de Valladolid, 1996. p.129-36. Captulo de un libro en que se realiza una puesta al da con descripcin de las tcnicas, utilidades y aplicacin a la clnica de la hibridacin fluorescente in situ (FISH). 5.** Ghaffari SR, Boyd E, Tolmie JL, Crow YJ, Trainer AH, Connor JM. A new strategy for criptic telomeric translocation screening in patients with idiopatic mental retardation. J Med Genet 1998; 35: 225-33. Aunque el nmero de casos del artculo es escaso, pone de manifiesto que entre el 7-15% de los pacientes con retraso mental idioptico presentan anomalas estructurales (deleciones, duplicaciones o traslocaciones) a nivel subtelomrico que pueden ser detectadas por la tcnica de mltiples sondas subtelomricas por hibridacin fluorescente in situ. 6.* Huang B, Ning Y, Lamb AN, Sandlin CJ, Jamehdor M, Ried T, Bartley J. Identification of an unusual marker chromosomes by spectral karyotyping. Am J Med Genet, 1998; 80: 368-2. Nos presenta la aplicacin de la tcnica de cariotipo espectral (SKY) a un caso con un marcador cromosmico poco frecuente. 7.*** Jalal SM, Law, ME. Utility of multicolour fluorescent in situ hybridisation in clinical cytogenetics. Genet Med, 1999; 1: 181-6.

Artculo de revisin. Nos presenta la utilidad en la prctica clnica de la hibridacin fluorescente in situ multicolor. Seala la utilizacin de esta tcnica para detectar y tipificar anomalas cromosmicas estructurales y marcadores (que no puede ser estudiados por las tcnica de bandeo convencional). 8.** Jorde LB, Carey JC, Bamshad MJ, White RL. Citogentica Clnica: bases cromosmicas de la enfermedad humana. En: Gentica Mdica. Ed Harcourt International, 2 edicin. Madrid, 2000. p. 108-35. Libro de gentica mdica. En este captulo resume las tcnicas de citogentica bsicas y explica la patologa cromosmica humana. Es un buen texto para mdicos de atencin primaria. 9.** Knight SJL, Regan R, Nicod A, Horsley SW, Kearney L, Homfray T et al. Subtle chromosomal rearrangement in children with unexplained mental retardation. Lancet 1999; 354: 1676-81. Pone de manifiesto la importancia del estudio cromosmico de alta resolucin y la posibilidad del estudio de hibridacin

fluorescente in situ (sondas subtelomricas) en los pacientes con retraso mental idioptico (complementa a la cita n 5). 10.***Levy B, Dunn TM, Kaffe S, Kardon N, Hirschhorn. Clinical applications of comparative genomic hybridiszation. Genetics in Medicine 1998; 1: 4-12. Artculo de revisin. Describe las tcnicas y aplicaciones de la CGH (hibridacin genmica comparativa). Aplica la tcnica a 12 casos prcticos que presentan material cromosmico de origen desconocido. 11.** Senz Hurtado J, Carbonell Prez JM, Sicilia Vzquez de Mondragn JR, Galn Gmez E, Cardesa Garca JJ. Deteccin de anomalas cromosmicas estructurales con tcnicas de alta resolucin en pacientes con cariotipo previo normal. Abstract. XV Reunin conjunta de las Sociedades de Pediatra de Andaluca Oriental, Occidental y Extremadura, Granada 23-25 noviembre de 2000. Seala la importancia de las tcnicas de bandas GTG de alta resolucin en pa-

cientes con cariotipo previo normal. Presenta 12 casos patolgicos (27% de las anomalas estructurales detectadas en 1 ao) encontrados con las tcnicas de alta resolucin. 12.** Schwartz S. Molecular Cytogenetics: show me the colors. Genetics in Medicine 1999; 1: 178-80. Editorial. Explica el avance de las nuevas tcnicas de citogentica molecular. Seala las tcnica de alta resolucin, FISH, CGH, y tcnicas mixtas. Explica las posibilidades actuales de diagnstico citogentico-molecular. 13.***Schwartz S, Depinet TW, LeanaCox J, Isada NB, Karson EM, Park VK et al. Sex Chromosome markers: characterisation using fluorescence in situ hybridisation and review of the literature. Am J Med Genet 1997; 71: 1-7. Presenta 23 casos de pacientes que tenan un marcador cromosmico de origen de los cromosomas sexuales. Se identifican los marcadores por estudio de hibridacin fluorescente in situ. Realiza una buena revisin de la literatura.

Caso clnico
Paciente de 10 aos que es enviada para valoracin dismorfolgica. Presenta rasgos dismrficos, retraso mental moderado, retraso escolar y del lenguaje. No existen antecedentes familiares de inters. Fue el producto del 2 embarazo de padres jvenes. El embarazo fue bien tolerado y sin patologa. El parto fue a las 37 semanas de edad gestacional, eutcico, ceflico. No precis reanimacin al nacer. Peso al nacer de 1.700 g. Diagnosticada en perodo perinatal de ductus arterioso que se cerr espontneamente. Conocemos

de su desarrollo psicomotor que inici la deambulacin a los 18 meses. Fue intervenida a los 2 aos de hernia umbilical. Entre las edades de 3 y 7 aos present varios episodios de parotidis supurada. Presenta retraso escolar y trastornos del comportamiento. A los 9 aos comenz con crisis convulsivas que fueron tratadas con valproato sdico. A la exploracin: buen estado general, peso 36 kg, talla 146,5 cm y permetro ceflico 50,1 cm. A nivel de la cabeza destaca una frente estrecha, hendiduras palpebrales horizontales y cortas, nariz cuadrangular, ancha desde la raz a la base, hipoplasia de la zona media de la cara. Las alas

nasales son hipoplsicas y el filtro es corto. El paladar es elevado, presenta caries dentarias. Existe micrognatia y los pabellones auriculares son de implantacin baja y poco formados. El resto de la exploracin sistemtica y por aparatos es normal. Juicio clnico: la valoracin dismorfolgica nos hizo sospechar sndrome velocardiofacial. Se solicit cariotipo de alta resolucin en sangre perifrica que fue normal, frmula cromosmica 46,XX. El estudio de la regin 22q11.2 mediante FISH (ver Figura 4) demostr que exista la microdelecin a nivel de un cromosoma 22. Diagnstico: sndrome velocardiofacial.
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ALGORITMO: ESTUDIOS EN EL LABORATORIO DE CITOGENTICA.

ESTUDIOS EN EL LABORATORIO DE CITOGENTICA

Cariotipo de resolucin standard

Normal

Patolgico

Otras tcnicas para completar estudio

Cariotipo de alta resolucin

Anomala cromosmica no identificada

Anomala cromosmica identificada

Cariotipo normal pero sigue sospecha de cromosomopata (retraso, abortos, rasgos dismrficos)

Patolgico

Normal

Sospecha de sndrome de microdelecin

FISH

CGH

FISH: hibridacin in situ fluorescente; CGH: hibridacin genmica comparativa.

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