Mt ~4?

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Departamento de Nutricin y Bromatologa III (Higiene y Tecnologa de los Alimentos) FACULTAD DE VETERINARIA

CARACTERIZACION PARCIAL, BIOQUMICA E INMUNOLOGICA, DE UNA SUSTANCIA ANTIMICROBIANA PRODUCIDA POR Lactobacillus sake 148

Memoria que, para optar al grado de Doctor en Veterinaria, presenta el Licenciado:

ODON JULIAN SOBRINO ABUJA

PABLO ELPIDIO HERNANDEZ CRUZA, CATEDRATICO DE NUTRICION Y BROMATOLOGA DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID,

CERTIFICA:

Que la tesis doctoral titulada CARACTERIZACION PARCIAL, BIOQUIMICA E INMUNOLOGICA. DE UNA SUSTANCIA ANTIMICROBIANA PRODUCIDA POR LACTOBACILLUS SAKE 148, de la que es autor D. Odn Julin Sobrino Abuja, ha sido realizada en el Departamento de Nutricin y Bronntologa III (Higiene y Tecnologa de los Alimentos), bajo la direccin conjunta del catedrtico D. Bernab Sanz Prez, de la profesora titular Da. Mara E. Fernndez Alvarez y del que suscribe y cumple las condiciones exigidas para optar al ttulo de Doctor en Veterinaria.

Madrid, 19 de enero de 1993

cnAQNcttx~c {OwkJ)

__

.rd~E~rnab Sanz Prez Edo: Maria FiFtr~d~~ Alvarez Edo: Pablo E. Hernndez Cruza

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, quiero agradecer al Prof D. Bernab Sanz Prez la confianza depositada en mi al acogerme en el Departamento, que tan acertadamente ha dirigido durante aos y, en el que se ha desarrollado este trabajo. Deseo agradecerle tambin su paciencia y comprensin durante mis primeros pasos, torpes y vacilantes, porel laboratorio as como sus enriquecedoras orientaciones, que han contribuido sobremanera a mi completa formacion.

De manera especial quiero mostrar mi agradecimiento al Prof. D. Pablo E. Hernndez Cmza, verdadera piedra angular y soporte cientfico de este trabajo. Agradecerle, sobre tQdo. su ejemplo, modelo de trabajo, dedicacin, abnegacin y sacrificio. Su acertado asesoramiento, apoyo, comprensin y constante estmulo han conseguido, adems de hacerme permanecer cientos de horas (incluidos fines de semana y festivos) en el laboratorio, mculcanne una enorme pasin por el trabajo de investigacin desarrollado.

No puedo olvidar, por supuesto, expresar mi agradecimiento a los restantes miembros del Hogar del Lactobacilo; a Juan Miguel, socio cofundador y compaero de las situaciones ms inverosmiles que en un laboratorio presentarse puedan (Rodrguez, 1991); a Wagner Luiz, por su amistad y por compartir conmigo peripecias, desaguisados y muchas horas de trabajo, jalonadas en algunas ocasiones, de pequeos xitos; al resto de los miembros del Hogar, a Luis por su entusiasmo y, en especial a Fernanda por su peculiar sentido del humor y por la ayuda, comprensin y cario demostrados en los momentos ms dificiles de este trabajo.

Tambin quiero agradecer al resto de los componentes del Departamento de Nutricin y Bromatologa III su contribucin al clima de amistad y trabajo que han alimentado el desarrollo de esta tesis. A Almudena y Manuela por las agradables y teraputicas tertulias, a

Olga por su colaboracin en las tcnicas de HPLC, esencial en la obtencin de algunos de los resultados de este trabajo. A todos, en general, agradecerles su ilusin por mantener viva la titilante llama de la investigacin y el compaerismo.

A Industrias Cabo, S.A. por su generosa colaboracin al proporcionamos las muestras de embutidos cuando fueron requeridas.

Al personal del hospital militar Gmez Ulla por su contribucin al desarrollo de las pruebas inmunolgicas.

A la Comunidad de Madrid por la concesin de una Beca de Formacin de Personal Investigador, con la que se ha realizado parte de esta tesis. Asimismo, este trabajo ha sido parcialmente subvencionado por el BRIDGE (Biotechnology Research for Innovation, Development aud Growth in Europe) T-Provect on Lactic Acid Bacteria (Contract BIOT-0263) y por la Comisin Interministerial de Ciencia y Tecnologa (CICYT ALI91-0255).

Por ltimo, mi ms especial agradecimiento a Cristina, por haber renunciado a ms de un fin de semana y fiestas de guardar, y por la comprensin y cario demostrado durante todos los aos que ha durado la ejecucin de este trabajo.

INDICE
CAPITULO 1: EXPOSICION GENERAL DEL PROBLEMA A INVESTIGAR CAPITULO II: REVISION BIBLIOGRFICA
II. 1.- Utilizacin de agentes antimicrobianos en los alimentos; presente y futuro 1.- Temperatura 2.- Actividad del agua 3.- pH 4.5.6.7.8.9.10.II.Gases y atmsferas modificadas o controladas cidos orgnicos Sales de curado Antibiticos Radiaciones Envasado Interaccin de factores Las bacterias lcticas y su posible empleo como conservadores de los alimentos II. 2.- Bacterias lcticas; ntroduccin histrica 1.- Caractersticas generales 2.- Taxonomia II. 3.- Gnero Lactobacillus 3. 1.- Morfologa 1.- Motilidad 2.- Tincin 3. 2.- Pared celular y ultraestructura 3. 3.- Desarrollo y caractersticas de las colonias 3. 4.- Necesidades nutritivas

7 7 8 9 9 11 11 12 12 13 13 14 14 17 20 23 23 24 24 25 25 26

1.- Medios de cultivo 3. 5.- Metabolismo 3. 6.- Consideraciones taxonmicas; Clasificacin 6. 1.- Grupo 1.- Homofermentativos obligados 6. 2.- Grupo II.- Heterofermentativos facultativos 2. 1.- Estreptobacterias atpicas 1.- Lactobacillus sake 6. 3.- Grupo III.- Heterofermentativos obligados 3. 7.- Ecologa, habitats y biotecnologa II. 4.- Actividad antimicrobiana de las bacterias lcticas 4. 1.- Actividad antimicrobiana de los cidos orgnicos 4. 2.- Actividad antimicrobiana de componentes inorgnicos 1.-Dixido de carbono 2.- Perxido de hidrgeno 3.- Diacetilo 4.- Reuterina 4. 3.- Efecto antimicrobianode las bacteriocinas y sustancias afines II. 5.- Bacteriocinas; Definicin 5. 1.- Deteccin de bacterias productoras de bactenocinas 1.- Deteccin de las cepas productoras 2.- Prueba del antagonismo directo 3.- Prueba del antagonismo diferido 5. 2.- La accin de las bacteriocinas y su diferenciacin de otras posibles causas de inhibicin 5. 3.- Produccin ptima de bacteriocinas 5. 4.- Purificacin 5. 5.- Propiedades de las bacteriocinas de las bacterias lcticas 1.- Composicin qumica 2.- Propiedades fsicas 3.- Espectro de accin 4.- Mecanismo de accin 5. 6.- Regulacin gentica II

27 28 31 32 33 33 33 34 34 35 36 37 37 38 39 39 40 40 41 41 41 42 42 44 44 45 45 46 46 47 48

5. 7.1.2.3.4.5.-

Bacteriocinas de las bacterias lcticas Bacteriocinas producidas por especies del gnero Loctobacillus Bacteriocinas producidas por especies del gnero Lactococcus Bacteriocinas producidas por especies del gnero Pediococcus Bacteriocinas producidas por especies del gnero Carnobacteriwn. Bacteriocinas producidas por especies del gnero Leuconostoc

50 50 51 51 52 52

CAPITULO III: MATERIALES Y METODOS

III. 1.- Materiales 1. 1.- Material biolgico Microorganismos empleados 2.- Obtencin de los inmunosueros 1. 2.- Productos y reactivos
-

53 54 54 54 54 55 55 60 60 60 62 63 65 65 65 65 66 66

1. 3.- Material de laboratorio III. 2.- Mtodos 2. 1.- Medios de cultivo empleados en el crecimiento de los microorganismos 1.- Medios de cultivo para el crecimiento de las bacterias lcticas 2.- Medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos indicadores distintos de las bacterias lcticas 2. 2.- Aislamiento y seleccin de las bacterias lcticas de los embutidos crudos madurados 2. 3.- Actividad antimicrobiana de las bacterias lcticas seleccionadas 3. 1.- Soluciones tampn empleadas 3. 2.- Pruebas directas de antagonismo 1.- Prueba directa de antagonismo en pocillos 3. 3.- Actividad inhibidora dc los sobrenadantes concentrados libres de clulas 1.- Preparacin de los sobrenadantes 2.- Deteccin de la actividad inhibidora de los sobrenadantes

concentrados 20 veces 67 3. 4.- Efecto de la catalasaen la actividad inhibidora de las bacterias III

lcticas seleccionadas 2. 4.- Identificacin y caracterizacin bioqumica de algunas bacterias lcticas con actividad antimicrobiana 1.- Morfologa y tincin por el mtodo de Gram 2.- Prueba de la 3.- Produccin de 4.- Hidrlisis de 5.- Produccin de catalasa gas a partir de glucosa la arginina cido sulfhdrico

67 68 68 68 68 70 71 72 73 75 75 75 76 76 77 77 78 78 79 79 80 82 82 82 82 83 84 86

6.- Prueba de Voges-Proskauer 7.- Fermentacin de carbohidratos 8.- Tolerancia al cloruro sdico 9.- Tolerancia al pH de 3,9 10.- Desarrollo a diversas temperaturas 2. 5.- Espectro antlinicrobiano de las sustancias inhibidoras producidas por las cepas de L. sake nmeros 77, 90, 148 y 180 2. 6.- Efecto de la composicin del medio de cultivo en la actividad antimicrobiana de Lactobacillus .sake 148 2. 7.- Crecimiento de L. sake 148, cintica del desarrollo y produccin de sustancia antimicrobiana a diversas temperaturas 7. 1.- Crecimiento de los cultivos 7. 2.- Parmetros cinticos del desarrollo microbiano 1.- Velocidad especfica de crecimiento (g) 2.- Tiempo de duplicacin (td) 3.- Nmero de generaciones por hora (g/h) 4.- Determinacin del peso celular seco 2. 8.- Purificacin parcial de la actividad antimicrobiana exocelular de L. sake 148 8. 1.- Cromatografa de filtracin en geles 1.- Soluciones tampn empleadas 2.- Geles 3.- Condiciones de trabajo 8. 2.- Determinacin de la proteina 2. 9.- Caracterizacin parcial de la actividad antimicrobiana exocelular parcialmente purificada de L. sake 148

Iv

9. 1.- Preparacin de la solucin patrn de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada 9.2.- Efecto de diversos enzimas en la actividad inhibidora de L. sake 148 9. 3.- Efecto de diferentes pHs en la actividad inhibidora de L. sake 148 Preparacin de las soluciones tampn de distintos pHs 2.- Condiciones de trabajo 9. 4.- Cintica de tennodestruccin de la actividad inhibidora de
-

86 87 87 87 88 89 89 89 94 94 96 96 98 98 99 99 99 100 100 103 103 103 104

L. sake 148 1.- Tratamiento trmico 2.- Parmetros cinticos de termodestruccion 9. 5.- Determinacin del peso molecular de la sustancia inhibidora de L. sakc 148 por cromatografa de filtracin en Sephadex 0-50...

9. 6- Electroforesis en geles de poliacrilarnida con dodecil sulfato sdico

(SDS-PAGE) 6. 1.- Tcnica de Swank y Munkres (1971) 1.- Tampones, geles y soluciones empleadas 2.- Preparacin de las muestras 3.- Preparacin de los geles 4.- Electroforesis 5.- Tincin de los geles 6.- Determinacin del peso molecular 6. 2.- Tcnica de Laemli (1970) 1.- Tampones, geles y soluciones empleadas 2.- Preparacin de las muestras 3.- Preparacin de los geles y electroforesis 4.- Tincin de los geles 5.- Determinacin del peso molecular 9. 7.- Determinacin de la composicin aminoacdica de la sustancia antimicrobiana de L. saLe 148 porcromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) 1.-Tampones y reactivos y

104 104

2.- Digestin cida de la muestra problema 3.- Preparacin de los patrones 4.- Derivatizacin de los aminocidos 5.- Tcnica de la cromatografa en HPLC 2. 10.- Mecanismo de accin de la sustancia inhibidora deL sake 148 2. 11.- Concentracin inhibidora mnima de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada en diversos microorganismos indicadores. 2. 12.-Mtodos inmunolgcos 12. 1.- Obtencin de los inmunosueros 1.- Pauta de inmunizacin 2.- Sangra final 3.- Obtencin y conservacin del suero 12. 2.- Inmunodifusin en geles de agarosa 1.- Preparacin del gel 2.- Preparacin de las placas de inmunodifusin 3.- Llenado de los pocillos e incubacin de las placas 4.- Lavado y secado de los geles 5.- Tincin 12. 3.- Tcnicas inmunoenzimticas 1.- Tcnicas del ELISA indirecto

106 106 106 107 108 109 109 109 109 110 112 113 113 114 114 114 115 115 115

2.- Tcnica del ELISA indirecto clsico 115 3.- Tcnica del ELISA indirecto utilizando el sistema de amplificacin biotina-avidina 119 123

CAPITULO IV: RESULTADOS

IV.1.-Evolucin de las bacterias lacticas durante la maduracin de un lote de embutidos crudos curados IV. 2.- Actividad antimicrobiana de las bacterias lcticas seleccionadas 2. 1.- Actividad inhibidora directa 2. 2.- Actividad inhibidora de los sobrenadantes de los cultivos libres de clulas VI

124

124 124 152

2. 3.- Efecto de la catalasa en la actividad inhibidora de las bacterias lcticas seleccionadas

152

IV. 3.- Identificacin y caracterizacin bioqumica parcial de las

bacterias lcticas seleccionadas por su actividad

antimicrobiana
1.- Morfologa y tincin por el mtodo de Gram 2.- Prueba de la catalasa 3.- Produccin de CO2 a partir de glucosa 4.- Hidrlisis de la arginina 5.- Produccin de cido sulfhdrico 6.- Prueba de Voges-Proskaer 7.- Fermentacin de carbohidratos 8.- Tolerancia al cloruro sdico 9.- Tolerancia al pH de 3,9 10.- Crecimiento a diversas temperaturas

154 154 154 154 154 155 155 155 156 157 157

IV. 4.- Espectro antimicrobiano de la sustancia inhibidora exocelular de las cepas de L. sake 77, 90, 148 y 180 IV. 5.- Efecto de la composicin del medio de cultivo en la actividad antirnicrobiana de Lactobacillus sake 148 IV. 6.- Parmetros cinticos y actividad inhibidora de L. sake 148

162

165

a distintas temperaturas
1.- Crecimiento y actividad antimicrobiana de L. sake 148 2.- Parmetros cinticos del crecimiento microbiano

167
167 173

IV. 7.- Purificacin parcial de la actividad antimicrobiana exocelular de L. sake 148

1.- Cromatografa de filtracin en Sephadex G-150, G-75 y G-50

175
175

VII

IV. 8.- Caracterizacin parcial de la actividad antimicrobiana de Lactobacillus sake 148 Efecto de diversos enzimas en la actividad inhibidora. 2.- Efecto del pH en la actividad inhibidora

182 182 184

3.- Cintica de termodestruccin de la actividad antimicrobiana

exocelular de Lactobaciltus sake 148 184 4.- Determinacin del peso molecular por cromatografa de filtracin en Sephadex G-50 5.- Determinacin del peso molecular por electroforsis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico 1.- Electroforesis segn la tcnica de Swank y Munkxes 2.- Electroforesis en geles del 20% poliacrilarnida con SDS (Laemly, 1979) 6.- Determinacin de la composicin aminoacdica de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada 188 188 190 190 191

IV. 9.- Mecanismo de accin de la sustanca antimicrobiana exocelular de Lactobacillus sake 148 IV. 10.- Concentracin inhibidora mnima (CIM) de la sustancia antimicrobiana exocelular de L. sake 148 IV. 11.- Caracterizacin inmunolgica parcial de la sustancia antimicrohiana de L. sake 148
11. 1.- Anlisis por inmunodifusin en geles de agarosa, de los inmunosueros de conejos cuando se emplea como antgeno la sustancia

194

194

199

anfimicrobiana exocelular de L. sake 148 199 11. 2.- Deteccin de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada de L. sake 148, mediante tcnicas inmunoenzimticas (ELISA).... 200 2. 1.- Deteccin por la tcnica del ELISA indirecto clsico 200 Evaluacin de la concentracin idnea de los reactivos que intervienen en el ensayo 200 2.- Determinacin de la respuesta inmunolgica de los conejos frente al extracto antignico inoculado 201

VIII

2. 2.- Deteccin de la sustancia antimicrobiana deL. sake 148 en el medio de cultivo MM-triptosa 1.- Evaluacin de la concentracin idneade los reactivos que intervienen en el ensayo 11. 3.- Deteccin de la sustancia antimicrobiana deL. sake 148 mediante la tcnica del ELISA indirecto con el sistema de amplificacin biotina-avidina

203 203

207

CAPITULO V: DISCUSION
V. 1.- Aislamiento de bacterias lcticas de embutidos crudos curados V. 2.- Actividad antimicrobiana de las bacterias lcticas seleccionadas 2. 1.- Eleccin de las pruebas de antagonismo microbiano 1.- Pruebas directas de antagonismo microbiano 2.- Antagonismo de los sobrenadantes libres de clulas 2. 2.- Actividad inhibidora de los cultivos de las bacterias lcticas seleccionadas 2. 3.- Actividad inhibidora de los sobrenadantes libres de clulas 2. 4.- Efecto de la catalasa en la actividad inhibidora de las bacterias lcticas seleccionadas y. 3.- Identificacin y caracterizacin bioqumica parcial de las bacterias lcticas con actividad antimicrobiana V. 4.- Espectro antimicrobiano de los sobrenadantes libres de clulas de las cepas de L. sake seleccionadas, una vez neutralizados y concentrados V. 5.- Efecto de la composicin del medio de cultivo en la produccin de actividad inhibidora

209

210

211 211 211 213 215 217 218

219

225

229

Ix

V. 6.- Parmetros cinticos y produccin de la actividad inhibidora de L. sake 148 a diversas temperaturas 231 V. 7.- Caracterizacin bioqumica parcial de la actividad antimicrobiana de L. sake 148

232

V.

&-

Mecanismo de accin de la bacteriocina producida por L. sake 148

241

V. 9.- Propiedades antignicas de la bacteriocina de L. sake 148.. 248

CAPITULO VI: CONCLUSIONES CAPITULO VII: TRABAJO FUTURo.... CAPITULO VIII: BIBLIOGRAFA

251

254

257

EXP. GRAL. DEL PROBLEMA A IN VES?lOAR

CAPITULO 1 EXPOSICION GENERAL DEL PROBLEMA A INVESTIGAR

EXP. ORAL. DEL PROBLEMA A INVESTIGAR

La masificacin y complejidad de los medios de produccin y distribucin de alimentos y el empleo de la refrigeracin como principal mtodo de conservacin de los mismos, obliga a pensar en el desarrollo de nuevas tcnicas que, unidas a las ya existentes, permitan, no slo garantizar la calidad higinica, sino prolongar la vida til de los alimentos. Para alcanzar estos objetivos en los ltimos aos se han aplicado en la carne y productos crnicos otras metodologas de conservacin. Algunas podran mejorarse empleando tcnicas basadas en el antagonismo biolgico existente entre algunos gneros microbianos saprofitos y los posibles microorganismos patgenos o alterantes cuya presencia se quiere eliminar.

Si se dispusiese de mtodos que destruyeran selectivamente la flora patgena potencialmente presente en la carne o si se inhibiese el desarrollo de su flora psicotrofa alterante, la calidad higinica y la vida til de este alimento mejo-ai-an considerablemente (Molin y Ternstom, 1982; Shaw y Latty, 1982, 1984; Dainty, 1986). Si bien stos objetivos pueden cumplirse con la utilizacin de aditivos, antibiticos o radiaciones ionizantes, tales mtodos presentan muchos inconvenientes. Asimismo, es conveniente disponer de otras alternativas que aumenten la calidad higinica y la vida til de las carnes envasadas al vaco o de las que, a pesar de someterse a la accin del calor, sufren .un proceso tecnolgico previo que puede permitir un desarrollo microbiano excesivo que determina una prdida de su calidad tecnolgica cuando no un peligro sanitario para el consumidor.

Las bacterias lcticas constituyen un grupo de microorganismos que, adems de no Ser peligrosos para el consumidor, inhiben el crecimiento de los microorganismos patgenos potencialmente presentes en la carne yen sus productos. Aunque el mecanismo ntimo de la accin antimicrobiana de stas bacterias no se conoce completamente, se sabe que sintetizan metabolitos como cidos orgnicos, perxido de hidrgeno, etc. que desempean un papel importante en la inhibicin del desarrollo de otros microorganismos. Adems tambin sintetizan otras sustancias inhibidoras, que cuando son de naturaleza proteica reciben el

EXP. ORAL. DEL PROBLEMA A INVESTIGAR

nombre genrico de bacteriocinas.

La posible utilizacin de las bacterias lcticas o de las bacteriocinas que producen como conservadores o factores de seguridad en un amplio nmero de productos alimenticios, constituye una lnea de trabajo desarrollada recientemente por algunos investigadores (Barefoot y Klaenhamrner, 1984; Pucci y col, 1988; Daeschel, 1989: Bhunia y col.. 1991) que han logrado purificar y, en algunos casos, caracterizar algunas bacteriocinas.

El objetivo de ste trabajo consiste en la bsqueda. identificacin, purificacin, y caracterizacin bioqumica e inmunolgica parcial de sustancias antintcrobianas elaboradas por las bacterias lcticas procedentes de embutidos crudos madurados. Una vez purificadas y establecidas sus caractersticas bioqumicas se estudiar su posible utilizacin como factores de seguridad que incrementan la calidad higinica y la vida til de la carne y de los derivados crnicos. Presumimos que, como factores de seguridad, podran utilizarse tanto las bacterias lcticas inhibidoras, como las sustancias antimicrobianas que producen, una vez que hayan sido purificadas.

Para lograr los objetivos propuestos se necesita desarrollar el programa de trabajo que se describe a continuacin:

1v).- De los embutidos crudos madurados, que son tericamente los sustratos crnicos ms adecuados pal-a el desarrollo de bacterias lcticas productoras de sustancias inhibidoras, se seleccionar al azar un nmero de colonias microbianas cuyo potencial inhibidor del desarrollo de otros microorganismos ser convenientemente evaluado.

29.- El antagonismo bacteriano se estudiar tanto en las colonias aisladas como en el medio extracelular.

EXP. CHAL. DEL PROBLEMA A INVESTICAR

39).~

Los grupos microbianos frente a los que se evaluar el potencial inhibidor de las

bacterias lcticas escogidas sern: bacterias lcticas de diversos origenes (leche, carne, hortalizas), micrococceas, enterococos, Pseudonionas sp. psicotrofas de la carne refrigerada, microorganismos de las carnes envasadas al vaco (Brochothrix thernosphacta y enterobactericeas) y microorganismos patgenos diversos como E. coli enteropatgeno, Staphylococcus orn-cus, Lisreria tnonocyogenes, Sairnonella spp., Clostridium boutulinum y Clostridiuni peifringens.

4$.- Mediante tcnicas microbiolgicas adecuadas se identificarn el gnero y la especie de las bacterias lcticas con mayor poder antagonista.

5Q).~

Se evaluar el efecto de diversos parmetros como composicin del medio de

cultivo, pH, temperatura, tiempo de crecimiento, etc, en la sntesis de las sustancias inhibidoras.

6$.- Mediante tcnicas de separacin de filtracin en geles se intentar purificar la actividad inhibidora extracelular de la que resulte ms interesante.

79.- Se proceder a la caracterizacin bioqumica parcial de La sustancia inhibidora seleccionada, determinando su peso molecular y su sensibilidad al pH, al calor, y a los enzimas proteolticos. lipolticos y amiloltcos.

8~).- A partir de conejos se obtendrn anticuerpos policlonales frente a la bacteriocina parcialmente purificada.

9$.- Finalmente se establecer, mediante tcnicas inmunoenzimticas (ELISA). la capacidad de los anticuemos obtenidos para caractenzar inmunolgicamente dicha bacteriocina

EXP. GRAL. DEL PROBLEMA A INVESTIGAR

que se comparar con las producidas por otras bacterias lcticas. Tambin se estudiar la utilidad de los anticuerpos en la posible deteccin y cuantificacin de la bacteriocina en medios de cultivo liquidos y en sustratos crnicos.

REVISION BIALIOGRAFICA

CAPITULO JI REVISION BIBLIOGRAFICA

REVISION il/BLIOGRAPICA

II. 1.- Utilizacin de agentes antimicrobianos en los alimentos: presente y futuro

Uno de los mayores problemas con los que el hombre se ha enfrentado a lo largo de su historia ha sido la necesidad de evitar, de una forma u otra, la alteracin de los alimentos, incrementando su vida til. Para solventarlo ha utilizado los materiales y tcnicas a su alcance como miel, sal, especias, ahumado, desecacin y otros sistemas sencillos de conservacin. La mayor parte de los mismos se siguen empleando actualmente, en algunos casos sin variacin tecnolgica alguna y, en otros, con las modificaciones necesarias introducidas por los adelantos tcnicos. A medida que crecen los conocimientos sobre los alimentos y la causa de su alteracin, aumentan tambin las metodologas necesarias para evitar sta ltima. Los mtodos empleados para evitar la alteracin de los alimentos e incrementar su vida til se basan en la utilizacin de:

II. 1. 1.- Temperatura

La temperatura desempea un papel muy importante en el desarrollo bacteriano y al modificarla se retrasa e incluso se elimina el desarrollo de los microorganismos patgenos y alterantes (ICMSF, 1980). Las temperaturas de refrigeracin slamente retrasan el crecimiento de los microorganismos mesfilos o termfilos, permitiendo el desarrollo de los psicrfilos, entre los que se encuentran muchos alterantes de los alimentos y otros patgenos, por lo que la refrigeracin no se puede considerar, por s sola, como un mtodo que permita asegurar unos alimentos sanos, en periodos de tiempo que superen una o, en el mejor de los casos, dos semanas.

Si la temperatura es tan baja que tiene lugar la congelacin del agua, incluso se inhibe el desarrollo de los microorganismos psicrfilos, permitiendo la conservacin de los alimentos durante largos periodos de tiempo (Speck y Ray, 1977). Pero la utilizacin de temperaturas de

REVISION BIBLIOGRA PICA

congelacin no implica la eliminacin de los microorganismos patgenos o alterantes que pueden permanecer viables (Obafemi y Davies, 1986). Adems la congelacin provoca daos celuLares en las bacterias aunque. con el tiempo, tambin ocasiona modificaciones perjudiciales en los alimentos.

El empleo de temperaturas altas permite la destruccin de la mayor parte de los microorganismos (pasterizacin) asi como de sus formas de resistencia (esterilizacin), sin embargo no pueden aplicarse a todos los alimentos por que modifican su estructura y/o sus caractersticas organolpticas.

La temperatura ambiental puede emplearse como factor de seguridad si favorece el desarrollo de ciertos microorganismos que, adems de modificar los caracteres organolpticos de los alimentos, mejoran su calidad microbiolgica. Los procesos ms representativos de la industria alimentaria que tienen lugar a temperatura ambiente son los que se basan en la fermentacin lctica y/o alcohlica desarrollada por microorganismos distintos (Gibbs, 1987).

II. 1. 2.- Actividad del agua

El desarrollo de los microorganismos depende, invariablemente, de la presencia de agua libre (ICMSF, 1980). La actividad del agua (a~) de un alimento orienta, objetivamente, de la cantidad de agua de que disponen los microorganismos para su desarrollo. La determinacin de la a~ limitante del desarrollo de un microorganismo dado, es importante para pronosticar su viabilidad en un alimento concreto. La aw disminuye al aumentar la concentracin de solutos (azcares o sales) y al eliminar el agua disponible para el desarrollo microbiano por calentamiento o liofilizacin.

REIISION BIBLIOGRAPICA

IL 1.3.- p11

Al igual que ocurre con la temperatura, los microorganismos poseen un pH mnimo, ptimo y mximo para su crecimiento. El pH de los alimentos es uno de los factores que determinan los microorganismos que se desarrollan en ellos, originando su alteracin, una fermentacin deseable o un riesgo para la salud del consumidor.

La disminucin natural o artificial del pH se ha utilizado, durante cientos de aos, para garantizar la estabilidad microbiolgica de los alimentos. Como ejemplos de disminucin natural del pH en conservacin de alimentos citaremos las fermentaciones controladas de la leche, carne y hortalizas, que originan productos tan estables y seguros como el queso, yogur, embutidos y encurtidos. La acidificacin artificial de los alimentos se consigue aadindoles cidos orgnicos.

Los alimentos cidos (pH<4,6). aunque pueden alterarse, es muy dificil que permitan la proliferacin de los microorganismos patgenos o la germinacin de esporas, en cambio esto si ocurre en los alimentos dbilmente cidos (pH>4,6) cuyo pH no garantiza, por s mismo, su estabilidad microbiolgica (Tanaka y col., 1986).

II. 1. 4. Gases y atmsferas modificadas o controladas

-

Durante los ltimos aos se ha generalizado el empleo de ciertos gases como conservadores de los alimentos. En la accin inhibidora de estos gases influyen, adems de la naturaleza del gas, un gran nmero de factores relacionados con el alimento, el proceso tecnolgico utilizado y el tipo de microorganismo implicado. As porejemplo. cl CO2 inhibe el desarrollo de un nmero variable de microorganismos, dependiendo de la concentracin del gas, temperatura de almacenamiento del alimento y actividad de agua del medio. En general, se

REVISION BII)LJOORAFICA

considera que las mezclas gaseosas con un 10% de CO2 inhiben el desarrollo del 50% de los microorganismos (Ledward y col., 1971). Este gas se emplea para inhibir el crecimiento de microorganismos en productos envasados al vaco y en atmsferas modificadas; sin embargo, la evidencia de que el CO2 puede favorecer el crecimiento de algunos esporulados, como los del gnero Clostrdiurn, hace necesario un estudio previo de las caractersticas del alimento en el que se va a utilizar

Otros gases experimentados han sido; el monxido de carbono (CO) (Davidson y col., 1983), que se ha comprobado que inhibe el desarrollo de psicotrofos, hongos y levaduras (Clark y Takacks, 1980) pero cuya toxicidad para quienes lo manipulan desaconseja su empleo, y el N2 que inhibe el desarrollo de los mohos. El dixido de azufre (SO2) es efectivo frente a bacterias, hongos y levaduras (Dziezak, 1986), por formar sulfitos con los compuestos orgnicos de las soluciones acuosas que inhiben el desarrollo microbiano. Sin embargo, solamente es activa la forma inica que se produce a pH=4. e otro lado origina en d las personas sensibles reacciones de hipersensibilidad, por lo que no es aconsejable su uso en los alimentos. El xido de etileno tambin se ha empleado para reducir el nmero de microorganismos de los alimentos, pero su elevada toxicidad limita su utilizacin. El xido de propileno, menos estudiado que el anterior, tambin se ha empleado para inhibir el desarrollo microbiano (Skinner y Hugo, 1976). Y, por ltimo, citaremos el ozono, cuyo empleo se limita a la esterilizacin de lquidos (Torricell, 1959).

Las atmsferas modificadas o controladas se consiguen mediante la mezcla de varios gases que se introducen en el interior del envase que protege al alimento, pudindose mantener constante la mezcla gaseosa inicial (atmsferas controladas) o no (atmsferas modificadas). En los alimentos envasados al vaco lo que se hace es extraer el aire del interior del alimento empaquetado. El objetivo de los mtodos descritos es limitar el desarrollode la flora alterante

10

REVISION BIBLIOGRAPICA

de los alimentos. El problema es que con ello aumenta la posibilidad del desarroLlo de anaerobios como C. botulinum.

II. 1. 5.- Acidos or2nicos

A los cidos orgnicos se les considera los antimicrobianos naturales ms difundidos en la naturaleza. Los ms empleados en la industria alimentaria son el actico, benzoico, propinico y srbico. El cido actico y sus sales ejercen su mayor accin inhibidora a pH prximo a 4,5. El cido benzoico es ms eficaz en el control de mohos y levaduras que en el de bacterias (Chichester y Tanner, 1972). Generalmente en los alimentos se emplea la sal sdica. El cido propinico y sus sales inhiben a los mohos, pero muy poco a bacterias y levaduras. El cido srbico es activo en alimentos cuyo pl-] est prximo a 6,0. Generalmente los sorbatos son ms efectivos en las levaduras y mohos que en las bacterias (Ldck. 1976).

II. 1. 6.- Sales de curado

El curado es uno de los mtodos ms antiguos de conservacin de los alimentos; inicialmente se realizaba de forma empfrica con sal comn contaminada con nitro o salitre, ms tarde, a la sal comn se le aada nitrato sdico; las impurezas o contaminantes del cloruro sdico, es decir el salitre, eran los responsables de la aparicin de la tonalidad rosa-rojiza tpica de los alimentos curados. Los nitritos, procedentes de la reduccin de los nitratos, originan NO que reaccionando con la mioglobina dom a los alimentos curados de un color atractivo para el consumidor e impide el desarrollo bacteriano pero, a su vez, participa en la fonnacin de nitrosaminas cancergenas por lo que el empleo de nitratos y nitritos est regulado por la legislacin alimentaria.

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REVISION BIBLIOGRAPICA

II. 1. 7.- Antibiticos

Los antibiticos, producidos por microorganismos o por sntesis qumica, inhiben el desarrollo de muchos microorganismos incluso a concentraciones pequeas. Sin embargo, su presencia en los alimentos y los riesgos que ello conleva para el consumidor, limitan su empleo. La nisina, un polipptido producido por Lacrococcus facis, ha sido aceptado como aditivo para su empleo en los alimentos por la comunidad cientfica internacional desde 1956. y sus condiciones de empleo sc encuentran reguladas por la EDA (Food and Drug Administration) (CFR, 1988).

En los ltimos aos se ha descrito la sntesis por las bacterias lcticas, de sustancias antimicrobianas de naturaleza proteica. denominadas bacteriocinas, cuyas propiedades han permitido concebir grandes esperanzas sobre su potencialidad como conservadores de los alimentos.

U. 1. 8.- Radiaciones

Las radiaciones ionizantes se caracterizan por su gran poder de penetracin y su letalidad a nivel celular (ICMSF. 1980). La aplicacin prctica de las radiaciones ionizantes para destruir microorganismos en productos alimenticios se ha desarrollado en las ltimas dcadas. Durante los ltimos 30 aos, el empleo de las radiaciones ha sufrido constantes cambios. As, mientras a principios de los 60 se permita su empleo en algunos alimentos, un poco ms tarde la administracin americana las prohibi, basndose en que quiz ste mtodo de conservacin pudiera inducir la formacin de compuestos potencialmente mutagnicos, cancergenos o teratgenos. Por ltimo, los resultados de mltiples estudios han demostrado la seguridad de ste mtodo: de ah que la Comisin de expertos de la FAO/WHO haya recomendado su empleo como procedimiento de conservacin de los alimentos

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REVISION BIRLIOORA PICA

(FAO/IAEA/WHO Expert Committee. 1977).

La utilizacin de las radiaciones ionizantes presenta una serie de ventajas sobre otros mtodos higienizantes de conservacin de los alimentos ya que, a dosis pequeas (<0,5 Mrad) no se producen cambios organolpticos apreciables en los alimentos e incluso a dosis ms elevadas (>1 Mrad), los cambios qumicos son mnimos. Adems, la penetracin de la radiacin es instantnea, homognea y profunda, permitiendo un control exacto del proceso, lo que no ocurre en los tratamientos trmicOs.

II. 1. 9.- Envasado

El envase que envuelve a los alimentos durante su almacenamiento, transporte y manipulaciones posteriores, les proporciona una proteccin; qumica, impidiendo el paso de agua, oxigeno y otros gases: fsica, al proteger al alimento de la luz, polvo o suciedad, de la prdida de peso y de las alteraciones de origen mecnico y an biolgico, al prevenir la entrada de microorganismos e insectos. Los factores de los que depende el desarrollo microbiano en los alimentos envasados son, aparte de la naturaleza del alimento y del tipo de microorganismo, la permeabilidad del material del envase al 02, CO2 y vapor de agua, sobre todo cuando en el envasado se utilizan el vaco o las atmsferas modificadas (Calvet, 1968).

II. 1. 10.- Interaccin de factores

Ninguno de los mtodos descritos pueden, aisladamente, garantizar la calidad higinica de los alimentos, lo que lleva a eniplearlos conjuntamente para conseguir una actividad aditiva o sinrgica.

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REVISION BIBLIOGRA PICA

II. 1. II.- Las bacterias lcticas alimentos

su posible empleo como conservadores de los

Los mecanismos mediante los que las bacterias lcticas ejercen su accin aniinicrobiana se describirn en la seccin II. 4. Las bacterias lcticas reunen una gran parte de las actividades antimicrobianas utilizadas actualmente para la conservacin de los alimentos en la industria agroalimentaria; adems poseen otros mecanismos que, si bien aisladamente no tienen gran importancia, conjuntamente contribuyen a mejorar la efectividad antimicrobiana.

La sntesis por las bacterias lcticas de productos metablicos finales como el CO2, H2 02 y los cidos orgnicos, el descenso del pH que ello conleva y la produccin de sustancias antimicrobianas como la reuterina y las bacteriocinas, hacen que, cada vez ms, se profundice en el estudio de las bacterias lcticas que han sido seleccionadas por su actividad antimicrobiana, para su empleo como conservantes de los alimentos. (Friend y col.. 1983; Raccach. 1981; Rubin y col., 1982)

II .2.- Bacterias lcticas: introduccin histrica

Bajo el nombre genrico de bacterias lcticas se agrupan un nmero de microorganismos cuya principal caracterstica es la produccin de cido lctico a partir de hidratos de carbono fermentables. El trmino Bacterium acidi lactici se debe a WeiEmamn que lo propuso en 1899, aunque las primeras referencias a este tipo de bacterias se deban a Hueppe (1884), quien describi una parte de la flora microbiana responsable de la acidificacin de la leche y productos lcteos, a la que se denomin Milchsauerbacillus.

Las bacterias lcticas se encuentran en los ms variados habitats, entre los que se

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REILSVON BIBLICORA PICA

incluyen la leche y productos lcteos, carne y productos crnicos, pescado, productos vegetales, tracto gastrointestinal y urinario de personas y animales e, incluso, aguas residuales y estiercol. Esta diversidad ecolgica tambin origina una diversidad morfolgica y fisiolgica de las especies de este grupo, lo que entraa una gran dificultad para establecer los rasgos de semejanza que permiten reunir a todas las especies en un grupo homogneo desde el punto de vista taxonmico.

Orla-Jensen (1919) fu responsable de los primeros intentos de demarcacin de ste grupo microbiano, y son esos mismos criterios los que constituyen, todava en la actualidad, las bases de su clasificacin:

1).- Criterios morfolgicos: El grupo estada constituido por cocos y bacilos Grampositivos, no esporulados e inmviles.

2).- Criterios fisiolgicos: Microorganismos fermentativos con produccin final de cido lctico, catalasa-negativos, microaerfilos o anaerobios, mesfilos, y con complejos requerimientos nutritivos.

A pesar de que las caractersticas esenciales no se han alterado desde su establecimiento por Orla-Jensen, si se ha modificado la nomenclatura del grupo. As por ejemplo, de los seis gneros establecidos inicialmente (Bembaceiun;, Streptobacterun, Thermobaceriuni, Betacoccus, So-eptococcus y Teti-acoccus) (Orla-Jensen. 1919), slamente se mantiene el gnero Sffepwcoccus. Los otros 5 han sido sustituidos por los gneros Lac~robaciIIus (englobara a Betabacterium, Sueptobacuriuni y Thcrmobacteriu,n

),

Leuconoswc y Pediococcus. Estos cambios en la asignacin de los nombres genricos no son ms que un reflejo del dinamismo y fluidez de los criterios de clasificacin, ya que, a medida que se producen avances en las metodologas analticas y en la filosoa de su clasificacin,

15

REVISION BIBLIOORAFICA

tambin se producen cambios en la denominacin de gneros y especies, trasvase de especies de unos gneros a otros y aumento del nmero total de especies. Como mejor se aprecia esta evolucin es observando las especies que se describen en las tres ltimas ediciones del manual de Bergey (Tabla II. 1) (Breed y col., 1957; Buchanan y Gibsons, 1974; Kandler y Weiss, 1986).

Tabla II. 1.- Modificaciones en el nmero de especies de las bacterias lcticas

N~ de especies listadas en el manual de Bergev en las ediciones de Bacterias 1957 1974 1986

Bacilos Gn. Lactobacillus Cocos Gn. Streptococcus Gn. Pediococcus Gn. Leuconostoc 19 2 3 21 5 29 8 4 15 27

45

N9 total de especies

39

59

86

16

REVISION BIBLIOGRA PICA

II. 2. 1.- Caractersticas generales

Los microorganismos de este grupo se caracterizan principalmente por ser bacterias Gram-positivas, catalasa-negativas, no esporuladas, inmviles, anaerobias o microaerfilas, cido-tolerantes, no reductoras del nitrito y productoras de cido lctico como producto final de la fermentacin de los hidratos de carbono.

Sin embargo la tincin de Gram es la nica caracterstica definitoria, excluyndose del grupo todo microorganismo Gram-negativo. Las otras, ni son exclusivas de las bacterias lcticas, ni son constantes dentro del grupo. As por ejemplo, a pesar de considerarse catalasa-negativos, se conoce desde hace tiempo las reacciones catalasa-positivas de los Pediococcus (Felton y col., 1953) e incluso de otros gneros, incluido el Lactobacillus (Whittenbury, 1964).

Las bacterias lcticas son generalmente inmviles, aunque se han descrito un gran nmero de cepas mviles con flagelos peritricos, especialmente cuando proceden de medios diferentes de la leche y sus derivados; as se han descrito en la carne (Deibel y Niven, 1958), en zumos de frutas (Hays y Reister, 1952) y en diversos productos fermentados (Vankova, 1957). El carcter microaerfilo es muy variable (Whittenbury, 1963), considerndose que es la tensin de CO2. ms que la anaerobiosis. la que favorece el desarrollo de las bacterias lcticas.

La reduccin de los nitratos a nitritos no se detecta en los medios que se emplean en el desarrollo de stas bacterias (Rogosa, 1961). La concentracin de glucosa (2%) de estos medios origina una elevada produccin de cido lctico y, consecuentemente, un gran descenso de pH que inhibe la reduccin. La capacidad reductora slamente se aprecia empleando medios de cultivo con un 0,1-1% de glucosa (Rogosa. 1961). De esta manera se ha 17

REVISlON I3IBLIOGRAPICA

visto que la mayor parte de las bacterias lcticas aisladas de carnes curadas reducen los nitratos.

La produccin de cido lctico o, ms exactamente, la sntesis de este metabolito como producto final de la fermentacin de los hidratos de carbono, es uno de los principales criterios para la diferenciacin fisiolgica de los distintos componentes del grupo. Las bacterias lcticas se dividen en tres grupos fisiolgicos distintos en virtud de sus diferencias enzimticas (Buyze y col., 1957):

1$.- Heterofermentativas obligadas: poseen los enzimas glucosa- 6-fosfato deshidrogenasa y 6-fosfogluconato deshidrogenasa, pero carecen de la fructosa difosfato aldolasa, originando como productos finales de la fermentacin de las hexosas CO2 y cido lctico. Como fuente de hidratos de carbono slamente pueden utilizar las hexosas.

2v).- Homofermentativas obligadas: poseen fructosa difosfato aldolasa, pero carecen de las dos deshidrogenasas. Al igual que las anteriores son incapaces de utilizar las pentosas como fuente de hidratos de carbono.

3$.-

Homofermentativas facultativas: poseen las dos deshidrogenasas pero

metabolizan la glucosa por la va de Embden-Meyerhof (glicolisis); utilizan las pentosas y se corresponden con las Streptobacteria de Orla-Jensen.

Los esterolsmeros (D, L, DL) del cido lctico resultante de la utilizacin de los hidratos de carbono sirven como criterios de clasificacin del grupo. Las especies del gnero Leuconosoc producen el ismero D(-) exclusivamente, mientras que los lactobacilos heteiofermentativos producen la fonna racmica (DL). Esta diferenciacin bioqumica se refleja en la Tabla II. 2. 18

REVISION BIBLIOGRAPiCA

Tabla II. 2.- Diferenciacin bioqumica de las bacterias lcticas

Tipo de Gnero fermentacin

Producto final del metabolismo

Configuracin del cido lctico

Streptococcus Pediococcus Lactobacillus: Thermobacterium Streptobacteriwn

Homofermentativa Homofermentativa

cido lctico c. lctico

L(+) DL, L(+)

Homofermentativa Homofermentativa

c. lctico c. lctico

D(-), L(+), DL D(-), L(), DL

Heterofermentativa (1) ~ lctico: c. actico

(1:1)
Retabacterlni Heterofermentativa c. lctico:c. actico:C02 (1:1:1) Leuconostoc Heterofermentativa c. lctico:c. actico:C02 (1:1:1)

D(-), L(+), DL

DL

D()

(1) Utilizacin de pentosas.

Fuente: Kandler, 1983.

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REVISION BIBLIOGRAFICA

IL 2. 2.- Taxonomia

La clasificacin de las bacterias lcticas segn la ltima edicin del manual de Bergey Kandler y Weiss, 1986) se muestra en la Tabla II. 3. Los Grupos 1, 11 y 111 sustituyen a las denominaciones de Therrnobacreriurn, Streptobacreriun y Betabaceriurn establecidas por Orla-Jensen. Sin embargo, desde la publicacin de sta edicin en 1986, y gracias a la flexibilidad taxonmica y modificaciones de los criterios de clasificacin anteriormente citados, ya se han producido nuevos cambios en la taxonoma de este grapo.

Recientemente (Schillinger y Holzapfel, 1990), se ha propuesto la creacin de un nuevo gnero, denominado Carnobacteriurn, integrado por especies relacionadas con los lactobacilos pero con peculiaridades diferenciadoras, como son el no poder desaiTollarse en agar acetato, y hacerlo en medios con un pH alto (pH 8,5-8,9) y el sintetizar cido oleico en lugar de cido cis-vaccnico. Actualmente Lactobacillus divergens y L. piscicola se denominan, respectivamente, Carnobacteriun divergens y C. piscicola, mientras C. mobile y C. gauinarurn son los restantes componentes del nuevo gnero.

La sugerencia de separar a los estreptococos lcticos (tipo N de Lancefleld) del resto de los estreptococos, creando con ellos un nuevo gnero denominado Lactococcus (Schleifer y col., 1985), cristaliz en 1986 con la validacin del nuevo gnero por la International Union of Microbiological Societies. En ste caso, los criterios empleados para establecer la nueva clasificacin resultaron de tecnologas basadas en la hibridacin de cidos nucleicos, afinidad ininunolgica, composicin lipdica y caractersticas qumicas de la pared bacteriana (Sandine, 1988).

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REVSlON RIIJLIOORAPICA

Tabla II. 3.- Taxonornia de las bacterias lcticas(a)

Gnero

N9 de especies

Lactobacillus Grupo 1: Homofermentativos obligados Grupo II: Heterofermentativos facultativos Grupo III: Heterofermentativos obligados Strepococcus Estreptococos pigenos Estreptococos orales Enterococos (tipo D de Lancefield) Estreptococos lcticos (tipo N de Lanceeld) Estreptococos anaerbicos Otros Estreptococos Pediococcus Leuconostoc 5 9 4 2 4 5 8 4 16 11 18

N2 total de especies

86

(a) Fuente: Kandlery Weiss, 1986; Hardie. 1986 yGarvie, 1986a, ]986b.

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REVISION BIBLIOGRAPICA

Estas modificaciones taxonmicas se muestran en la Tabla 11-4: actualmente el grnpo de las bacterias lcticas est constituido por microorganismos pertenecientes a los gneros Lactobacillus, Lactococcus, Carnobaceriun, Pediococcus y &Uco,,ostoc

Tabla II. 4.- Modificaciones recientes en la taxonomia de las bacterias lcticas

Nueva denominacin

Antigua denominacin

Gnero Loctococcus Lactococcus Itictis subsp. It,ctis Lactococcus cicis subsp. lacas Lactococcus ladis subsp. cremoris Lactococcus lactis subsp. hordinae Lactococcus. garvae Lactococcus plantarun (1) Loctococcus raifinolacs Gnero Carnobaceriun Carnobacteri un divergens Carnobacterium piscicola Car,obacterium niobile Carnobacteriun, gaulinrn-un2 Lociobacillus divergens Lactobacillus piscicola Streptococcus lactis subsp. lactis Streptococcu.s ocfis subsp. diacetvlactis Streptococcus lacris subsp. crernoris Lactobacillus hordince Streptococcus garxae Streptococcus planau-un Streptococ-cus raifinolactis

(1) No confundir con Lactobacillus plan tarun Fuente: Sandine, 1988 y Schillinger y Holzapfel, 1990

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REVISION BIBLIOGRA PICA

II. 3.- Gnero Locrobacillus

Realizar una descripcin profunda de los componentes de las bacterias lcticas resultara larga, tediosa e incluso improcedente, dado el tema central de este trabajo. Sin embargo, si es interesante conocer algunas de las caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y bioqumicas ms relevantes del gnero Lactobacillus.

La ltima edicin del Bergevs Manual of Svstematic Bacteriologv (1986) clasifica al gnero Lactobacillus en el volumen 2. seccin 14 como bacilos Gram-positivos no esporulados. La seccin comprende 7 gneros (Lacrobacillus, ErysipelothrLr. Brochothrix, Listeria, Kurthia, Cayophanon y Renibacrerium) que poseen en comn ser bacilos Gram-positivos, no esporulados, mesfilos, y que requieren medios complejos para su crecimiento.

II. 3. 1.- Morfologa

La morfologa de los lactobacilos es variable, desde bacilos largos, rectos o ligeramente curvados, hasta cocobacilos. Su longitud y curvatura depende de la edad del cultivo, la composicin del medio y la tensin de oxgeno. Como ejemplo de variabilidad en su morfologa podra citarse a L. delbrueckii subsp. bugaricus que en medios de cultivo lquidos o en agar MRS crece en formaciones espirales debido a que las clulas permanecen unidas despus de la divisin, mientras que en la leche origina cadenas largas y filamentosas.

Segn Bottazzi (1988), los distintos lactobacilos podran distinguirse por sus diferencias morfolgicas. As por ejemplo, los lactobacilos mesfilos son bacilos cortos, gruesos, regulares y unidos, formando filamentos (Srreptobacteria ). Las especies wrmlas

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REVISION BiBLIOGRA PICA

son bacilos largos y rectos, de clulas separadas, en parejas o en empalizada. En las especies heterofernentativas obligadas, la morfologa tpica es la de bacilos cortos, rectos y separados. Algunas especies de lactobacilos productores de gas (L. ferrnentum o L. brevis) pueden presentar una morfologa mezcla de bacilos largos y cortos, en el mismo cultivo e, incluso, en una misma colonia (Kandler y Weiss. 1986).

Los cocobacilos pueden ser tan extremadamente cortos que pueden llegar a confundirse con los Leuconostoc o estreptococos. De otra parte, algunos estreptococos ligeramente alargados se han confundido durante mucho tiempo con lactobacilos (Garvie y col., 1981). La divisin celular de los lactobacilos tiene lugar en un solo plano, mientras que la tendencia a formar cadenas vara entre las distintas especies e, incluso, entre las distintas cepas, dependiendo de la fase de desarrollo y del pH (Rhee y Pack, 1980).

11. 3. 1. 1.- Motilidad

El gnero Lactobacillus comprende bacterias inmviles, aunque algunas especies se ha visto que son mviles por poseer flagelos peritricos. En cualquier caso su motilidad depende del medio y de la edad del cultivo, y slo se observa en el momento del aislamiento, perdindose al resembraras en diversos medios de cultivo.

11. 3. 1. 2.- Tincin

Quiz la caracterstica comn de ste gnero (al igual que en las bacterias lcticas en general) sea la reaccin positiva a la tincin de Gram. Slo las bacterias de cultivos viejos y las deterioradas muestran resultados variables. Si se emplea la tincin de Gram o la del Azul de Metileno pueden observarse granulaciones internas, sobre todo cuando se trata de lactobacilos homofermentativos que forman bacilos Largos. Observados con microscopia electrnica

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REVLSION BIBLIOORA PICA

En los medios de

cuhivo

lquidos las bacterias sediiientan rpidamente cuando cesa su

desarrollo. El sedimento es liso y homogneo, siendo muy rara la presencia de precipitados granulares o mucilaginosos. Los lactobacilos no forman pelculas superficiales ni originan olores especficos durante su crecimiento en los medios de cultivo ordinarios, a pesar de contribuir al desarrollo del aroma de los alimentos fermentados. Este aroma es consecuencia de la produccin de compuestos voltiles, como diacetilo y derivados. 1-125 y aminas, que se liberan al medio durante el desarrollo microbiano (Sharpe y Franklin, 1962).

II. 3. 4.- Necesidades nutritivas

El gnero Lactobacillus, al igual que el resto de las bacterias lcticas, tiene unas necesidades nutritivas muy complejos ya que necesitan como fuente de energia y de carbono, adems de hidratos de carbono. nucletidos, aminocidos y vitaminas. Todas las especies del gnero, (salvo algunas cepas) requieren cido pantotnico y nicotnico, mientras que la tiamina slo es necesaria para el desarrollo de los lactobacilos heterofermentativos. Las necesidades de vitaminas son variables dependiendo de la especie, pero la mayora necesita riboflavina y, muy pocas, biotina o vitamina B2.

A pesar de necesitar medios muy complejos para su desarrollo, la mayor parte de los componentes del gnero (sino todos) tienen en su genoma la informacin necesaria para sintetizar todos los nutrientes citados. Adems, se ha visto que los mutantes de L. casei sintetizan determinados aminocidos en medios carentes de los mismos (aunque crecen mucho ms lentamente), dicha capacidad la pierden cuando crecen en medios ms complejos, lo que acelera su velocidad de crecimiento (Morishita y col., 1974). Estos complejos requerimientos nutritivos de los Lactobacilos actuales reflejan la seleccin natural de inutantes deficientes en determinados rutas biosintticas. lo que les permite crecer ms rpidamente que las cepas

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REVISION BII3LIOCRA PICA

originarias en medios de cultivo con muchos nutrientes

II. 3. 4. 1.- Medios de cultivo

Los medios empleados para el crecimiento de los lactobacilos cubren sus necesidades nutritivas y estn constituidos por hidratos de carbono fermentables, extractos de carne y extracto de levadura. Adems, la mayor parte de las especies necesitan otros compuestos especficos que favorezcan su crecimiento; en algunos casos son esenciales para el desarrollo, tal como ocurre con el jugo de tomate, manganeso, acetato y steres del cido oleico (especialmente Tween 80). Los compuestos citados, excepto el jugo de tomate, forman parte del medio de cultivo MRS (De Man y col., 1960) que es. sin duda, el ms utilizado para el crecimiento de los lactobacilos.

Por otra parte, algunos lactobacilos adaptados a sustratos muy particulares necesitan factores de crecimiento especiales. Algunas especies aisladas del vino de arroz, necesitan cido D-mevalnico, mientras que L. sanfranciscus necesita un pptido de bajo peso molecular aislado del extracto de levadura (Berg y col., 1981).

El pH del medio tambin influye en el crecimiento que es mayor en medios ligrarnente cidos, cuyo pH inicial vara de 6,4 a 4,5. El crecimiento se detiene cuando se alcanza un pH de 4,0 a 3,6 dependiendo de la especie y cepa. La aireacin tambin es importante ya que, aunque la mayor parte de las cepas se desarrollan en condiciones normales de aerobiosis, el crecimiento ser ptimo bajo condiciones de anaerobiosis o microaerofilia. Pero, ms que la anaerobiosis, lo que influye en el crecimiento es la tensin de CO2 (ms incluso que la tensin de 02

), considerndose ptima

la presencia de un 5-10% de CO2 (Kandler y Weiss. 1986).

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RIP VISION BII3LIOGRA PICA

La temperatura de incubacin ptima, que fu uno de los criterios iniciales de clasificacin de las bacterias lcticas (Orla-Jensen, 1919), tambin vara con la especie. La mayor parte de las especies (mesfilas) tienen una temperatura ptima de crecimiento de 25-30 con un lmite superior de 40 0C. Algunas crecen a temperaturas menores de 15 0C y, muy raramente, a menos de 5 0C siendo el limite inferior los 4 0C, temperatura a la que crecen algunas estreptobacterias atpicas de indudable inters bromatolgico (Schillinger y Locke. 1987a).

11. 3. 5.- Metabolismo

Desde el punto de vista metablico se considera que los lactobacilos se encuentran en el lmite entre el metabolismo anaerbico y aerbico. No poseen quinonas isoprenoides (excepto L. vanrnnwshiensis y L casel subsp. rhwnnosus ) (Collins y iones, 1981), ni sistemas de citocromos con los que realizar la fosforilacin oxidativa tpica del metabolismo aerbico. Sin embargo, poseen oxidasas y peroxidasas que oxidan el NADH 2 utilizando al 02

como aceptor final de electrones. A pesar de no tener catalasas ni perxido~dismutasas tambin metabolizan los perxidos mediante un sistema enzimtico catalizado por el Mg++ (Gtz col., 1980).
y

los lactobacilos son de metabolismo esencialmente fenuentativo; degradan las hexosas utilizando dos vas enzimticas (fig. 2.1):

lo).- Via de Em~en-Meverhof (glucolisis), por la que convierten un niol de hexosa en dos moles de cido lctico (fermentacin homolctica).

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REVISION BIBLIOGRAPICA

Fructosa

1,6
1
m

F
cii

Glucosa o
--1
En

-6P

o
ti ji -1

62

Gluconato
H

ti)

It

ti)
*4-4

r
-

o
s.l

u
14-1

Xiluiosa

5 2

00 2

4J

ti)

It

ti)
4-) eJ

4
Triosa
-

-u o o m

41 4-1

Trasa

32 ADP P

3P

Acetl

AD 2

AT 2

Firuvato

Piruvato

lfr
Lactato Lactato
VIA EMBDEN-MEYERHOF VTA

Acetato (Etano]>

6 FOSFOGLUCOPJATO (Heterofermentat ivas>

(Otucotisis) (Homofermentativas)

Figui-a 2. 1.- Repi-esentacin esquemtica de las rutas metablicas del gnero Lacwbacillus. (Adaptado de Kandler, 1983).

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REVIS ION IIIBLIOGRA PICA

2v).- Va del 64osfogluconato, por la que producen un mol de CO2, un mol de etanol (o de cido actico) y un ml de cido lctico (fermentacin hetcrolctica).En condiciones de aeobiosis, la mayor parte de las cepas utilizan al 02 como aceptor final de electrones, mientras no reducen el Acetil-CoA (Kandler, 1983).

El cido pirvico es un metabolito intermediario dc las dos rutas metablicas fermentativas, siendo la cantidad de hexosa del medio la que regula el tipo de fermentacin, de forma que si escasea ste azucar, la fennentacin homolctica se conviene en heterolctica con, producin final de cidos actico. frmico y de etanol (Thomas y col.. 1979). El cido lctico formado, puede oxidarse originando cido actico y frmico mediante mecanismos no bien conocidos (Kandler, 1983).

La diferencia entre lactobacilos homo y heterofermentativos se encuentra en la presencia o ausencia de los enzimas difosfofructo-aldolasa y fosfocetolasa. As, mientras los lactobacilos heterofermentativos obligados sintetizan fosfocetolasa pero no Mdolasa, los homofermentativos sintetizan aldolasa pero no fosfocetolasa.

Los lactobacilos heterofermentativos hidrolizan las pentosas gracias al enzima fosfocetolasa, originando cantidades equimolares de los cidos actico y lctico. Sin embargo, algunos lactobacilos liomofermentativos (Su-epobaceriun de Oila-Jensen) poseen un aldolasa y un fosfocetolasa que se activan nicamente en presencia de pentosas, de manera que hidrolizan las hexosas siguiendo la va Embden-Meyerhoff, originando cido lctico, mientras que las pentosas por la va del 6-fosfogluconato dan lugar a cantidades equimolares de cidos lctico y actico, pero no originan CO2, convirtindose as en los denominados heterofernentarivos facultativos (Kandler. 1983).

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REVISION BIBLIOGRA PICA

El cido lctico procedente de la fermentacin de los hidratos de carbono, posee una configuracin D- o L- dependiendo de la estercoespecificidad del lactato deshidrogenasa celular. En presencia de O- y L-lactato deshidrogenasas, el cido lctico se produce en su forma racmica (DL). Lo mismo que ocurre cuando coexisten L-lactato deshidrogenasa y lactato racemasa inducible. Esta ltima circunstancia es la que se produce en L. casel, L. cuivatus y L. sa/ce (De Vries y col., 1970). La mayor parte de los enzimas no son alostricos, pero algunas especies (L. cusei, L. cur.atus, L. sa/ce y L- bavaricus), poseen L-lactato deshidrogenasas alostricos cuyos activadores son la fructosa difosfato y el Mn (Hensel y col., 1977).

Los lactobacilos tambin emplean los hidratos de carbono con otros fines adems de la obtencin de energa. La sacarosa se utiliza en la sntesis de mucopolisacridos y la fructosa puede utilizarse como aceptor de electrones dando lugar a la formacin de manitol. La mayoria de los monosacridos y oligosacridos que utilizan las clulas como fuente de energa proceden del medio extracelular, penetrando en su interior con ayuda de permeasas especficos, no obstante, en algunas espeies la lactosa y la galactosa se transportan mediante un sistema enzimtico fosfoenol piruvato fosfotransferasa (PEP-PTS) (Chassy y Thompson, 1983). Tambin se conocen otros sistemas de transpone activo de aminas y aminocidos (Law y Kolstad, 1983).

II. 3. 6.- Consideraciones taxonmicas~ Clasificacin

Para la clasificacin de las distintas especies del gnero Lactobacillus se han considerado numerosos parmetros, entre los que sc encuentran la determinacin de los tipos de peptidoglicano de la pared celular (Willians, 1975), la fermentacin de los azcares y la temperatura de crecimiento (Schillinger y Locke. 1987b), la movilidad electrofortica de diversos enzimas (London, 1976), el anlisis inmunolgico de las lactato deshidrogenasas

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REiI~SIONfi IBLIOGRA PICA

homlogas (London, 1976), el grupo antignico (Sharpe, 1970), la determinacin de los ismeros de cido lctico y, por ltimo, la de hibridacin del DNA, que es la ms emplea da en la actualidad para determinar La proximidad filogentica entre dos especies (Simonds y col., 1971).

El primer intento de clasificacin de los lactobacilos lo realiz Orla-Jensen (1919), quin los dividi en tres gneros distintos segn las temperaturas ptimas de crecimiento y los productos finales de su metabolismo fermentativo. Estos tres gneros, (Thermobacteriurn Strenobace-iurn y Betabace,-iurn ), ya no aparecen como tales en la ltima edicin del

Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (Kandler y Weiss., 1986) al considerarse que la divisin de Orla-Jensen no origina grupos homogneos desde el punto de vista filogentico.

As, y a pesar de que la mayoi-a de las especies de cada uno de los grupos actuales (denominados 1, II y III ) coincide con las caractersticas de las termobacterias, estreptobaterias y betabacterias respectivamente, algunas de las especies descubiertas recientemente no cumplen dichas caractersticas. La clasificacin en tres grupos se realiza en virtud de su metabolismo fermentativo.

II. 3. 6. 1.- Gruno 1.- Homofermentativos obligados

Este grupo se encuentra formado por dos subgrupos de especies relacionadas entre si: en el primero se encuentran L. delbrucck-ii, L. bulgaricus, L. lactis y L. leichrnanni, mientras en el segundo aparecen L. acidophilus, L. gasseri y L. crispatus. Dicho grupo comprende la mayor parte de las termobacterias de Orla-Jensen.

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REtSION BBLIOCRAFICA

II. 3. 6. 2.- Grupo II.- Heterofermentativos facultativos

El grupo lo integran tres subgrupos: Uno primero, representado mayoritariamente por L. plantaruni, un segundo con distintas subespecies de L. casei y un tercero que comprende a L. sa/ce, L. curvatus y L. bavaricus
.

Los dos primeros subgrupos de esta divisin se

corresponderan con las antiguas estreptobacterias, mientras el tercero comprendera las denominadas estreptobacterias atpicas (Thornley y Sharpe, 1959).

II. 3. 6. 2. 1.- Estreytobacterias atnicas

Las dos primeras especies de ste grupo, L. sa/ce y L. curva/as, muestran un alto porcentaje de homologa segn las tcnicas de hibridacin del DNA. Adems, las dos poseen una racernasa inducible por cido lctico, que convierte el cido L()-lctico cido lctico en racmico (Kandler y Weiss, 1986). Esta circunstancia, y otras caractersticas fenotpicas diferencian stas dos especies del tercer componente del grupo, L. bava-icus. La diferenciacin entre L. sa/ce y L. curvatus se fundamenta en su capacidad de utilizar diversos azcares (Schillinger y Liicke, 1987b). Este subgrupo tambin se considera como los lactobacilos psicrotofos verdaderos (Reuter, 1981), al ser los que se desarrollan a temperatura ms baja de todos los lactobacilos (2-4 0C). Otra caracterstica que las diferencia de las estrepto- bacterias tpicas es su aspecto cocoide cuando se siembran en medios slidos (Reuter, 1981).

II. 3. 6. 2. 1. 1.- Lactobacillus saLe

Lactobacillus saL-e recibe esta denominacin (Katagiri y col.. 1934) por haberse aislado por primera vez de este producto japons, siendo sus principales caractersticas (Champomier y col., 1987) las de poseer una morfologa cocobacilar ligeramente curvada y regular, sobre todo en la fase estacionaria, con un tamao de 0,8-1 p.m de ancho por 2-3 gm

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REVISION BIBLIOGRAPICA

de largo y por desarrollarse aislado o en cadenas co-tas Heterofermentativo facultativo, produce los ismeros D- y L- del cido lctico, sedesaiTolla a 2-4 0C y 15 0C, pero no a 45 crece a pH 3,9 y en medios con un 8% de NaC, pero no cuando tienen un 10% de NaC y utiliza los siguientes hidratos de carbono: D-ribosa, D-galactosa, D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, N-acetilglucosamina, D-melibiosa, 0-trealosa, sacarosa y gluconato, pero no estos otros: dulcitol, inulina, D-melicitosa, D-rafinosa, glucgeno, D-wgatosa, L-fucosa, D-arabitol, D-arabinosa, D-xilosa, L-sorbosa, ramnosa, D-manitol y sorbitol. L. sa/ce tambin se ha aislado de ensilados, carne, embutidos crudos madurados (Schillinger y Lcke, 1987b. 1989) y de productos crnicos envasados al vaco.

II. 2. 6. 3.- Grupo IL- l-ieterofennentativos obligados

Este grupo lo forman casi integramente las betabacterias de Orla-Jensen, a las que se han unido otras especies de reciente descubrimiento y comprende 18 especies entre las que destacan: L. bife,-mentans, L. vi-idescens, L. safranciscus L. ferrnenturn, L. reuteri, L. confusus, L. brevis, L. halotolerans, L. kefir y L. fructivoraus.. En la ltima edicin del Ber2evs Manual of Svstematic Bacteriolotzv (Kandler y Weiss,1986) tambin se incluye en este grupo a L. dive-gens, aunque actualmente se admite que esta especie pertenece al gnero Carnobacteriun;.

11. 3. T- Ecolo2a. habitats y biotecnologa

El gnero Lactobacillus, como el resto de las bacterias lcticas, se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza debido a que es capaz de desarrollarse en las condiciones ambientales mas diversas, siempre y cuando existan en el medio los complejos nutrientes que necesita (hidratos de carbono, pptidos y aminocidos, cidos nucleicos y vitaminas). El desarrollo en anaerobiosis y entre un amplio intervalo de temperaturas (2-45

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REVISIN BIBLIOCRA PICA

0C). as como su tolerancia a una tensin de 02 baja, permite detectarlos en los ms variados habitats, como en los ensilados y productos fermentados vegetales, zumos de frutas, cerveza, vino (Whitting, 1975; Sharpe, 1981: Kandler, 1984), queso (Botazzi y col., 1973), yogur (Davis, 1975) y otras leches fermentadas (Kandler y Kunath, 1983), productos crnicos refrigerados (Reuter. 1975). embutidos crudos curados y productos crnicos envasados al vaco (Holzapfel y Gerber, 1983). Tambin se han aislados de pescados (Cone, 1982) del tracto gastrointestinal y urinario de personas y animales (Sharpe y col., 1973; Sharpe, 1981; Dent y Willians, 1982), asi como del estircol y de las aguas residuales (Okada y col., 1979; Weiss y col., 1981).

El efecto beneficioso de stos microorganismos al impedir de diversas maneras el desarrollo de otros microorganismos patgenoso alterantes, as como los cambios organolpticos y nutritivos favorables que originan al multiplicarse en diversos sustratos. hacen que algunas especies del gnero Lacrobacillus se hayan utilizado desde hace tiempo en la elaboracin de alimentos fernientados (yogur, kefir, leches acidificadas, embutidos crudos curados) y ensilados. Son microorganismos tecnolgicos indispensables y seguirn sindolo en la futura tecnologa de los alimentos y, sin duda, aumentar su inters en salud humana y animal.

11. 4.- Actividad antimicrobiana de las bacterias lcticas

La actividad antimicrobiana de las bacterias lcticas se conoce desde hace tiempo, si bien de una forma empfrica. Hasta hace muy poco tiempo no se inici el estudio cientfico del mecanismo, o los mecanismos mediante los que las bacterias lcticas manifiestan su actividad antimicrobi ana.

Actualmente se piensa que el primer mecanismo antimicrobiano ejeicido por las 35

REVISaN BIBLIOGRA PICA

bacterias lcticas podia ser el de la simple competencia por los nuti-ientes, como consecuencia de las distintas velocidades de crecimiento de los microorganismos, es muy posible que una determinada especie bacteriana de crecimiento rpido agote los nutrientes cticos presentes en el sustrato, perjudicando la existencia de otros microorganismos. Este sistema no es exclusivo de las bacterias lcticas, aunque si los son los que a continuacin se detallan.

II. 4. 1.- Actividad antimicrobiana de los cidos orgnicos

Como consecuencia de su metabolismo fermentativo, las bacterias lcticas sintetizan cidos orgnicos, lo que se acompaa de una notable caida del pH del medio.

La accin antimicrobiana de los cidos orgnicos puede deberse a tres factores (Beuchat y Golden, 1989):

iQ).~

Al efecto antagonista de la caida del pH, que inhibe el desarrollo de otros

microorganismos cido-sensibles.

2Q)<

A la actividad antagonista de la forma no disociada del cido que penetra en el

interior de las clulas e inhibe algunas reacciones enzimticas metabolicamente importantes.

39.- A la accin especfica de los cidos orgnicos, ya que los de ms de 4 tomos de carbono aumentan su actividad antimicrobiana a medida que lo hace la longitud de la cadena. No obstante, la escasa liposolubilidad de los cidos de ms de 8 tomos de carbono, disminuye su actividad en las bacterias Gram-negativas (Baird Parker, 1980).

Los cidos orgnicos de cadena corta, como el lctico y actico, son lipoflicos cuando no estn disociados, por lo que pueden penetrar al interior de los microorganismos

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REVSION BBLIOGRA PICA

disminuyendo el pH intracelular, alterando sustratos enzimticos e inhibiendo funciones metablicas esenciales corno la fosforilacin oxidativa (Haird Parker. 1980). EL que el cido actico sea ms inhibidor en mohos y levaduras (Baird Parker, 1980) que el lctico podra deberse a que a pH 4,0-4,6 (el natural del entorno donde se desarrollan las bacterias lcticas) este cido est entre 2 y 4 veces menos disociado que el lctico (Lindgren y Dobrogosz, 1990). Los cidos actico y lctico pueden actuar sinrgicamente inhibiendo el crecimiento de salmonelas (Rubin, 1978) y levaduras (Moon, 1983) ya que el bajo pH que proporciona el cido lctico aumenta la concentracin del cido actico no disociado. Otros cidos producidos por las bacterias lcticas en diversos sustratos, como frmico, ctrico y mlico, tienen una actividad antimicrobiana menor que los citados.

II. 4. 2.- Actividad antimicrobiana de componentes inorgnicos

Las bacterias lcticas tambin producen otros compuestos antimicrobianos como CO2, H202 y el diacetilo.

II. 4. 2. 1.- Dixido de carbono

El CO2 producido como consecuencia del metabolismo heterofermentativo obligado ejerce su accin antibacteriana creando un ambiente anaerbico al reemplazar el 02, impidiendo as el desarrollo de los microorganismos aerbios obligados, o bien mediante una actividad inhibidora intrinseca y variable segn el microorganismo de que se trate (Clark y Takacs, 1980).

Aunque no se conoce con exactitud el mecanismo ntimo por el que el CO2 ejerce su accin antimicrobiana, quiz se deba al efecto de dicho compuesto en la inhibicin de 37

RElISION BIBLIOGRAPICA

descarboxilaciones enzimticas (King y Nagel, 1975) o por acmulo de CO2 en la bicapa lipidica de la membrana celular, alterando su permeabilidad (Eklund, 1984).

11. 4. 2. 2.- Perxido de hidr2eno

Algunas bacterias lcticas sintetizan H202 en presencia de oxgeno gracias a la actividad de determinadas flavoprotein-oxidasas o NADH-peroxidasas. Este H202 se acumula en el medio exocelular ya que las bacterias lcticas carecen, de actividad catalasa (Kandler y Weiss, 1986). La produccin de H202 por las bacterias lcticas depende de la cepa y de la cantidad de oxigeno presente (Collins y Aramaki, 1980). Dahiya y Speck (1968) y Price y Lee (1970). demostraron el efecto inhibidor del H202 producido por las bacterias lcticas, en diversas cepas de Sraphylococcus al/leus y Pseudornonas spp. El efecto bactericida del H202 se atribuye a su potente accin oxidante en la clula bacteriana (Fooster y col., 1957) y a la destruccin de estructuras moleculares bsicas de las proteinas celulares (Sykes, 1965).

Asimismo, algunas bacterias lcticas presentes en la leche, activan el sistema antibacteriano de la lactoperoxidasa (Bjrck, 1985), debido a la sntesis en aerobiosis de H202 (Carlsson y col., 1983). La actividad antimicrobiana del H202 es variable, no afectando prcticamente a las bacterias Gram-positivas entre las que se incluyen las bacterias lcticas, mientras que las Gram-negativas, como Escherichia coIi, Salmon ella spp. y Pseudomonas spp. son muy sensibles a su actividad (Bjrck, 1985). Se cree que el efecto antimicrobiano del sistema lactoperoxidasa se debe a la oxidacin de los grupos -SH de algunos enzimas metablicos vitales, como la hexoquinasa, aldolasa y gliceraldehido-3P deshidrogenasa (Bjrck, 1985).

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REVISIN I3IULIOGRAFICA

II. 4. 2. 3.- Diacetilo

Algunas especies de bacterias lcticas producen, a partir del citrato, dacetlo (2.3-butanodiona) (Jay,1982), siguiendo la va del piruvato que es el metabolito intermediario (Kandler, 1983). A pesar de que el metabolismo de las hexosas inhibe la produccin de diacetilo, ste se acumula en el medio y, adems de generar el aroma que caracteriza a ciertos productos como la mantequilla, ejerce una actividad inhibidora sobre un gran nmero de microorganismos, tanto Gram-positivos como Gram-negativos (Jay, 1982). Esta actividad se favorece cuando el pH del medio es bajo (Jay, 1982). El diacetilo inhibe el desaiTollo de los microorganismos Gram-negativos al interaccionar con el metabolismo de la arginina, impidiendo la utilizacin de ste aminocido (Jay. 1986).

II. 4. 2. 4.- Reuterina

Lactobacillus reuteril es el nico lactobacilo y quizas la nica bacteria, que produce reuterina y la libera en el medio exocelularcomo consecuencia del metabolismo anaerbico del glicerol.

La reuterina (Axelsson y col., 1989), es una sustancia antimicrobiana activa frente a bacterias Gram-positivas, Gram-negativas, levaduras, hongos y protozoos. Qumicamente es una mezcla homognea de monmeros, monmeros hidratados y dmeros cclicos del aldehido 3-hidroxipropinico (Talaricco y Dobrogosz, 1990) que proceden del glicerol mediante una reaccin catalizada por una coenzima glicerol-deshidratasa dependiente de la vitamina 812 (Talaricco y Dobrogosz, 1990; Talaricco y col., 1990). De sta formaL. reuteri es la nica bacteria conocida capaz de utilizar el glicerol como aceptor alternativo de hidrgeno durante la fermentacin de los hidratos de carbono, produciendo mayor cantidad de aldehido 3-hidroxipropinico del que es capaz de reducir, por lo que ste se libera en el medio 39

REVISION BIBLiOGRA PICA

extracelular donde manifiesta su actividad antimicrobiana. Entre los microorganismos sensibles a esta sustancia se encuentran Salmondlla sp., Shigella sp., clostridios, estafilococos, listerias, candidas y tripanosomas.

II. 4. 3.- Efecto antimicrobiano de las bacteriocinas y sustancias afines

La primera noticia sobre la produccin por las bacterias lcticas de sustancias antagonistas, distintas de los productos finales del metabolismo microbiano, se atribuye a Rogers (1928), quien describi la actividad antimicrobiana de &reptococcus lactis (actualmente Lacococcus lads) sobre L. acdophilus Desde entonces se han identificado un
.

cierto nmero de sustancias proteicas, con actividad antimicrobiana sobre otros microorganismos. Este grupo est constituido por una serie de sustancias de composicin qumica, mecanismo de accin y espectro antimicrobiano variable.

Por la importancia que tiene este grupo de sustancias, al que pertenece el agente antimicrobiano aislado y caracterizado parcialmente en este trabajo, senos permitido describir y revisar con cierto detalle sus aspectos ms sobresalientes.

II. 5.- Bacteriocinas: Definicin

Las bacteriocinas se definen como proteinas o complejos de naturaleza proteica con accin bactericida en microorganismos filogenticamente muy prximos a la bacteria productora (Tagg y col., 1976). Este grupo heterogneo de sustancias, generados tanto por microorganismos Gram-positivos como Gram-negativos, vara mucho en propiedades bioqumicas, espectro antimicrobiano y mecanismo de accin.

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REIISION BIBLIOGRAPICA

11. 5. 1.- Deteccin de bacterias nroductoras de bacteriocinas

La deteccin de bacterias con actividad antirnicrobiana, atribuible a las bacteiiocinas, se realiza en dos fases o etapas: 1).- deteccin de la cepa productora de la actividad antagonista, y 2).- diferenciacin de la actividad antimicrobiana debida a las bacteriocinas de otras posibles causas de inhibicin.

II. 5. 1. 1.- Deteccin de las ceDas uroductoras

Silo que se pretende es detectarla posible actividad antimicrobiana de un gran nmero de bacterias lcticas aisladas de diversos sustratos alimentarios, el mtodo de eleccin consiste en utilizar la denominada prueba general de antagonismo, que se realiza en un medio de cultivo slido en el que se observan fcilmente los halos resultantes de la inhibicin del desarrollo de un microorganismo indicador producida al crecer en la misma placa cada una de las bacterias lcticas aisladas. Los mtodos experimentales ms utilizados son el antagonismo directo y el antagonismo diferido (Tagg y col.,1976). En cualquier caso, se basan en la siembra de colonias aisladas de la cepa problema en un medio slido apropiado, sobre el que se deposita una capa de medio slido o semislido que lleva el microorganismo indicador.

II. 5. 1. 2.- Prueba del anta2onismo directo

La prueba ms sencilla y utilizada se basa en el mtodo desarrollado por Orada (1946). En este caso, la cepa problema y el cultivo indicador se desarrollan simultneamente y la visualizacin de la actividad antimicrobiana slo es posible si se produce durante las primeras fases de crecimiento de la cepa problema (Tagg y col., 1976). Tambin es impol-tante la densidad del cultivo indicador utilizado (Kuttner, 1966). El cultivo indicador se deposita en las placas inmediatamente despus de inoculadas con la cepa problema.

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REVISION BI/?LIOGRA PICA

Una variante de ste mtodo consiste en cortar pocillos en las placas de medio slido y rellenarlos con una gota del mismo medio conteniendo la cepa problema. Una vez solidificado el agar del pocillo se siembra sobre la placa el microorganismo indicador (Tagg y col., 1976).

Pero quizs el mtodo de eleccin sea el empleado por De Klerk (1967). En esta variante la cepa problema se siembra en profundidad, con un asa de platino o un palillo, en el medio de cultivo slido y despus se inocula su superficie con el microorganismo indicador.

II. 5. 1. 3.- Prueba del antagonismo diferido

En esta prueba la bacteria problema se siembra y desarrolla en placas de medio slido, durante un periodo de tiempo dado, inactivdola a continuacin por exposicin al calor o al cloroformo. Ms tarde, el cultivo indicador mezclado con agar semislido, se siembra en las placas inactivadas como queda dicho (Fredericq, 1948; Barefoot y Klaenhammer, 1984). Este sistema tiene la ventaja de pennitir el crecimiento de la bacteria problema y del indicador en condiciones ptimas de temperatura ya que la incubacin no es simultnea. No obstante, puede ocurrir que el cultivo indicador sea sensible a los mtodos que inactivan el cultivo problema (Tagg y col., 1976).

II. 5. 2.- La accin de las bacteriocinas inhibicin

su diferenciacin de otras posibles causas de

Los mtodos antes descritos no garantizan que la actividad antmcrobiana del microorganismo estudiado se deba a las bacteriocinas, en consecuencia debe evaluarse la actividad antimicrobiana de los microorganismos de inters utilizando ensayos experimentales complementarios. En estos ensayos se trata de eliminar la presencia en el medio de cultivo de

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RElLSION BIBLIOCRAPICA

otros microorganimos o productos metablicos con actividad antimicrobiana. Consecuentemente, la bacteria problema que interesa se siembra en un medio lquido que se cultiva en condiciones ptimas para la produccin mxima de actividad antimicrobiana Tales condiciones se determinarn experimentalmente ya que no tienen porqu coincidir con las ptimas de crecimiento (Tagg y col., 1976). a continuacin se esteriliza el medio de cultivo por filtracin para eliminar la posible presencia de bacterifagos (Tagg y col., 1976), que podran ser los responsables de los halos de inhibicin observados al cultivar las bacterias problema con el microorganismo indicador

La actividad antagonista del H202 que pudiera producir la cepa de inters se elimina incubando el microorganismo en anaerobiosis estricta (Schillinger y Liicke, 1989), o tambin aadiendo al medio de cultivo catalasa (Su, 1949) o peroxidasa (Holmberg y Hallander, 1973), antes de determinar su actividad antimicrobiana frente al microorganismo indicador.

Finalmente, la acidez del medio de cultivo se neutraliza tratndolo con una solucin bsica fuerte (Tramer, 1966>.

De esta manera, una vez eliminadas otras causas de inhibicin distintas de las bacteriocinas, se evala la actividad antimicrobiana de los medios de cultivo libres de clulas. Esto se realiza de tres formas:

1).- Depositando una gota del medio lquido problema neutralizado, en una placa de
Petri con agar semislido en la que se desarrolla el microorganismo indicador (Daeschel y Klaenhammer, 1985).

2).- Practicados unos pocillos en placas de medio slido, se recubre su superficie con agar y se deposita una gota del medio lquido problema previamente neutralizado, se deja 43

RPAISION BIBLIOCRA PICA

transcurrir un tiempo suficiente para que difunda y, finalmente, se rellenan los pocillos con agar y se deposita en ellos el microorganismo indicador (Daeschel y col., 1990; Ahn y Stiles, 1990a); tambin se puede separar el agar de la placa de Petri que lo contiene y , despus de invertido, se siembra el microorganismo indicador en la otra cara de la capa de agar (Tagg y McGiven, 1971; Schillingery Lcke, 1989).

3).- Saturando un disco de papel de filtro con una cantidad suficiente del medio lquido neutralizado. Una vez seco el disco, se coloca sobre el microorganismo indicador sembrado en agar semislido (Bhunia y col., 1987; Bhunia y col., 1988).

II. 5. 3.- Produccin ptima de bacteriocinas

Tanto la composicin de los medios de cultivo, como las condiciones de desarrollo necesarias para una produccin ptima de bacteriocinas varian de unas bacterias productoras a otras (Tagg y col., 1976). As por ejemplo, algunas bacteriocinas slo se producen cuando el microorgansimo se cultiva en medios slidos o semislidos (Geis y col., 1983), mientras que otras bacterias productoras necesitan suplementos especficos como extracto de levadura (Nielsen y col., 1990) o glucosa (Bhunia y col., 1987). Los medios semisintticos, de composicin ms sencilla, se emplean para favorecer las labores de purificacin de las bacteriocinas (Bhunia y col., 1987). La temperatura, el tiempo de incubacin el cultivo con agitacin o estacionario tambin influyen en la produccin de bacteriocinas (Biswas y col., 1991).

II. 5. 4.- Purificacin

En la caracterizacin bioqumica parcial de las bacteriocinas se necesita su purificacin previa a partir del medio de cultivo libre de clulas en el que se encuentra la sustancia

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REVISION BIBLIOGRAPICA

inhibidora. Con esta purificacin se pretende separar la sustancla activa del resto de componentes del medio de cultivo y de las clulas que en l crecieron. Debido a [a heterogeneidad de estas sustancias es muy dificil establecer un protocolo modelo de purificacin, cada tipo de bacteriocina requiere una tcnica especfica que debe determinarse empricamente, al igual que las condiciones de cultivo, (Tagg y col., 1976).

En general, el primer paso de la purificacin de las bacteriocinas consiste en concentraras en el medio de cultivo neutralizado mediante precipitacin con sales, cidos o etanol, dilisis o liofilizacin. Una vez obtenido el concentrado, se procede a la separacin de los distintos compuestos por su tamao molecular (cromatografa de filtracin, ultrafiltracin, centrifugacin, etc.) o por su distinto potencial elctrico (cromatografa de intercambio inico, electroforesis, etc.)

El nico punto en el que coinciden todos los mtodos de purificacin es en la prdida de actividad, a veces masiva, durante la purificacin de las bacteriocinas (Tagg y col., 1976). Por eso es importante determinar, en cada paso del proceso de purificacin, [a cantidad de proteina y su actividad especfica (actividad inhibidora/mg de proteina) a fin de evitar aquellos pasos que impliquen una gran prdida de actividad (Tagg y col., 1976).

II. 5. 5.- Propiedades de las bacteriocinas de las bacterias lcticas

U. 5. 5. 1.- Composicin qumica

Las bacteriocinas son, segn la definicin de Tagg y col. (1976), sustancias antagonistas de naturaleza proteica. Por tanto, la inhibicin o desaparicin de la actividad antagonista mediante la utilizacin de enzimas proteoliticos es definitiva para catalogar a una sustancia inhibidora como bacteriocina. No obstante, aunque las bacteriocinas suelen ser

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REVISION IJIBLIOGRAPICA

molculas sencillas (agregadas o no), algunas presentan en su composicin al menos durante los estadios previos a su purificacin, adems de proteina, componentes [ipdicos y/o hidrocarbonados (De Klerck y Smith, 1967; Upreti y Hinsdill, 1973).

II. 5. 5. 2.- Propiedades fsicas

El peso molecular de estas sustancias vara desde los 2.700 daltons de la pediocina AcH (Bhunia y col., 1988), hasta los 37.000 daltons de la helveticina J que puede llegar a formar agregados de hasta 300000 daltons; agregados de ste tamao slo se separan mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico (SDS-PAGE) (Joerger y Klaenhammer, 1986). El peso molecular suele determinarse por cromatografa de filtracin en geles empleando agentes disociantes para evitar la formacin de agregados (Pulusani y col., 1979; Joerger y Klaenhammer, 1986) tambin puede hacerse por electroforesis en SDS-PAGE (Bhunia y col., 1987).

Una caracterstica que prcticamente la presentan todas las bacteriocinas es su termoestabilidad (West y Warner, 1988; Daeschel y col., 1990; Schillinger y Lcke, 1989); sin embargo, esta caracterstica es dficil de cuantificar, ya que depende de su grado de purificacin, del pH, de la fuerza inica y de la presencia de molculas termoprotectoras (Tagg y col., 1976).

II. 5. 5. 3.- Espectro de accin

En cuanto a su espectro de accin, las bacteriocinas se han dividido arbitrariamente en dos tipos (Klaenhammer, 1988):

19.- Bacteriocinas con un espectro de accin muy restringido, limitado a especies

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REVISION BIBLIOGRAPICA

bacterianas muy relacionadas filogenticamente con la cepa productora. lo que concuerda con la definicin clsica de bacteriocinas (Tagg y col., 1976) y entre las que se incluyen muchas bacteriocinas caracterizadas hasta ahora, como la diplococina, lactacinas B y F y lactocina 27.

2v).- Bacteriocinas con un espectro ms amplio activas, adems de frente a las especies con ellas relacionadas, frente a otras bacterias Gram-positivas. Como ejemplo de este grupo se cita la nisina, que impide la esporulacin y crecimiento de especies bacterianas de los gneros Clostridiurn y Racillus. No obstante, todava no se han descrito bacceriocinas activas frente a bacterias Gram- negativas (Klaenhammer, 1988).

II. 5. 5. 4.- Mecanismo de accin

El mecanismo de accin suele determinarse adicionando la sustancia, ms o menos purificada, a un cultivo lquido en crecimiento inoculado con una poblacin determinada del microorganismo sensible. Durante su incubacin (microoganismo bacteriocina), se toman muestras a intervalos de tiempo regulares y se determinan las bacterias viables mediante recuentos en placa. La sustancia ser bactericida si disminuye el nmero de microorganismos viables y bacteriosttica silos recuentos se mantienen constantes.

Segn la definicin clsica de Tagg y col. (1976), las bacteriocinas son bactericidas para los microorganismos sensibles. El mecanismo mediante el que ejercen esta accin no es bien conocido ya que, aunque algunos autores (Tagg y col., 1976) describen esta actividad en dos etapas: a).- adsorcin a la pared bacteriana y b).- destruccin de la pared bacteriana seguida de lisis celular, otros (Barefoot y Klaenhammer, 1983; Harding y Shaw, 1990) han puesto de manifiesto la adsorcin de la bacteriocina incluso en las paredes de bacterias resistentes; por tanw, la actividad antimicrobiana no estara ligada a la presencia de receptores especficos en la pared celular.

47

RIEl ISIOiV BII?LIOGRAPICA

Tambin se han descrito sustancias con caractersticas idnticas a las bacteriocinas, pero cuyo mecanismo de accin es bacteriosttico. Entre ellas se encuentran la lactocina 27 (Upreti y Hinsdill, 1975) y otras todava no caracterizadas bioquimicamente (Racc-ach y col., 1989). El mecanismo por el que la lactocina 27 ejerce su accin bacteriosttica se debe a su adsorcin a la pared celular de las bacterias sensibles y a la posterior inhibicin de la sntesis proteica celular sin afectar a la del ADN, ARN ni ATP.

11. 5. 6.- Regulacin sentica

Una de las cuestiones sobre las que los investigadores han puesto mayor nfasis en los ltimos aos es la de caracterizacin gentica, a nivel molecular, de la produccin de bacteriocinas. De hecho, los ensayos destinados al estudio de los determinantes genticos que regulan su produccin y la resistencia a su accin, as como el estudio de los mecanismos de transferencia gentica de stos determinantes han contribuido significativamente al desarrollo y aplicacin de las modernas tcnicas genticas (Klaenhammer, 1988).

Se ha demostrado con ello que la produccin y la resistencia a las bacteriocinas suele encontrarse codificada en plsmidos, generalmente en un mismo plsmido (Klaenhammer, 1988). Pero la produccin de bacteriocinas no est siempre codificada en estos elementos genticos. As por ejemplo, la lactacina B producida por L. acidophilus N2 no se encuentra asociada a la presencia de plsmidos y lo mismo ocurre con la lactacina F (Barefoot y Klaenhammer, 1984). Tampoco se ha determinado la existencia de plsmidos ni de otros elementos genticos extracromosomales en la produccin de la lactostrepeina Las 5 de L. lacs subsp. cernoiis (Dobrzanski y col., 1982).

Pero como ya se ha dicho, son numerosos los investigadores que han comprobado que la produccin de bacteriocinas se encuentra ligada a la presencia de plsmidos. De esta forma.

48

REVISION BIBLIOCRA PICA

la diplococina de L. lactis subsp. crernoris 346 se halla ligada a un plsmido de 54 Megadaltons (Davey, 1984), mientras la pediococina A de P. pentosaceus FBB6I est codificada en un plsmido de 13.6 Megadaltons (Daeschel y Klaenhamrner, 1985). Asimismo la produccin de nisina por diversas cepas de L. actis se encuentra codificada en un plsmido de 28-30 Megadaltons, en el que tambin se codifica la resistencia a dicha bacteriocina y la fermentacin de la sacarosa (Gonzalez y Kunka, 1987).

Adems, no slo se han identificado los plsmidos que codifican la sntesis de bacteriocinas, sino que se ha llegado, incluso, a donar los genes responsables de su produccin y de la resistencia a la accin de dicha bacteriocina en otras bacterias receptoras (Van Belkum y col., 1989), determinndose la secuencia de nucletidos de los operones que los regulan (Van Belkum y col., 1991).

El rpido desarrollo de las tecnologas genticas en los ltimos aos puede permitir el desarrollo de bacterias lcticas de inters portando plsmidos de produccin y resistencia a las bacteriocinas, facilitando su supervivencia al crecer con otras bacterias carentes de stos plsmidos (Klaenhammer, 1988). Estas tcnicas tambin permitiran expresar en una misma bacteria los determinantes de varias bacteriocinas, pero no ya slo de las bacteriocinas de otras bacterias lcticas, sino de otras especies bacterianas distintas, con lo que el espectro antimicrobiano de las bacterias lcticas se vera notablemente aumentado. Adems se les podra proporcionar resistencia frente a todos los compuestos antimicrobianos lo que supondra una ventaja adicional al poder crecer en un medio hostil (Klaenhammer, 1988). El empleo de estas metodologas genticas en la produccin y mejora de las bacterias lcticas productoras de bacteriocinas (sobre todo en las cepas de mayor inters industrial), abre unas perspectivas prometedoras a la industria de fermentacin y conservacin de alimentos (Klaenhammer, 1988).

49

REVISIN RIBLIOGRAPICA

11. 5. 7.- Bacteriocinas de las bacterias lcticas

Prcticamente todos los gneros de las bacterias lcticas presentan especies o cepas productoras de bactenocinas:

II. 5. 7. 1.- Bacteriocinas producidas porespecies del 2nero Lactobacillus

La primera especie de este gnero en la que se identific una actividad antimicrobiana asociada a una bacteriocina fu en L. fermenti (De Klerk y Goetzze, 1961). A partir de entonces se han identificado y, en algunos casos caracterizado, sustancias de ste tipo en otras especies del gnero

a) L. helveticus

.-

Se conocen dos bacteriocinas producidas por esta especie, la

lactocina 27 (Upretti y Hinsdill, 1973), y la helveticina J (Joerger y Klaenhamer, 1986).

b) L. acidophilus

.-

A la primera sustancia con actividad bacteriocina identificada en

esta especie se le denomin acidofilina (Vicent y col., 1959), aunque ms tarde se identificaron la lactacina B (Barefoot y Klaenhammer, 1984) y la lactacina F (Muriana y Klaenhammer, 1991).

c) L. plantarurn

.-

En esta especie se han descrito tres bacteriocinas, la lactolina

(Kodama, 1952), la plantaricina SIK-83 (Andersson y col., 1988) y la plantaricina A (Daeschel y col., 1990).

d) L.sake

.-

En los ltimos aos y de forma casi simultnea se han identificado dos

bacteilocinas producidas por microorganismos de esta especie, la sakacina A (Schillinger y Lticke, 1989), y la lactocina 5 (M0rtvedt y Nes, 1990).

50

REVISION RIBLJOGRA PICA

Tambin se ha citado la produccin de bacteriocinas en L. delb,-ueckii subsp. ladis (Toba y col., 1991). L. bulgaricus (Abdel-Bar y col., 1987) y en cepas de lactobacillos aislados a partir de intestino humano (Silva y col, 1987) y de la flora vaginal saprofita (McGroary y Reid, 1988).

II. 5. 7. 2.- Bacteriocinas producidas por especies del gnero Lactococcus

La nisina producida por L. lactis subsp. lactis es, quiz, la bacteriocina mejor identificada y caracterizada de todas las producidas por las bacterias lcticas (Hurst, 19813. No obstante, adems de la nisina se han descrito otras bacteriocinas, como la diplococina producida por L. lactis subsp. cA-enioris (Davey y Richardson, 1981) y las lactostrepcinas, distintas a la nisina y producidas por diversas cepas de L. lacris subsp. lactis y L. lactis

subsp. crernoris (Kzak y col, 1978; Dobrzanski y col, 1982). Tambin se han identificado, en otras especies de este gnero, 8 tipos diferentes de bacteriocinas que son claramente distintas de la nisina y las lactostrepcinas, (Geis y col., 1983).

II. 5. 7. 3.- Bacteriocinas producidas por especies del gnero Pediococcus

Los primeros indicios de produccin de bacteriocinas por parte de este gnero datan de mediados de los aos 70, cuando se identific una actividad inhibidora distinta del H202 en una cepa de P. cerevisae (Fleming y col., 1975). Posteriormente se ha caracterizado la pediococina A de?. pentosaceus (Daeschel y Klaenhammer, 1985) y las pediococina PA-1 (Gonzalez y Kunka, 1987) y pediococina AcH (Ehunia y col., 1988) producidas por 1. acidilacrici.

51

REVISiN BIBLIOGRAPICA

II. 5. 7. 4.- Bacteriocinas producidas por especies del gnero Carnobacwrium

Aunque es un gnero de nueva creacin (Collins y col., 1987), ya se ha descrito [a produccin de bacteriocinas por C. piscicola (Ahn y Stiles, 1990) y C. dveigens (Schillinger y Holzapfe, 990).

II. 5. 7. 5.- Bacteriocinas producidas porespecies del gnero Leuconostoc

A este gnero solamente se le atribua actividad inhibidora debida a la produccin de cidos orgnicos y diacetilo, hasta que se ha caracterizado la produccin una bacteriocina por una cepa de Leu. gelidun (Harding y Shaw, 1990; Hasting y Siles, 1991).

52

MATERIALES Y METODOS

CAPITULO III MATERIALES Y METODOS

53

MATERIALES Y MEFODOS

U. 1.- MATERIALES

III. 1. 1.- Material biol2ico

Iii 1. 1. 1.- Microoreanismos empleados

Las bacterias lcticas utilizadas en la realizacin de este trabajo se han aislado de embutidos crudos madurados, elaborados sin cultivo iniciador industrial y donados generosamente por la empresa crnica Industrias Cabo S.A., de Madrid. Las cepas se aislaron siguiendo un mtodo aleatorio y la mayor pai-te de ellas se identificaron tentativamente como Lactobacillus sake siguiendo el esquema de identificacin de Schillinger y Liicke (1987b).

En la tabla 111.1 se muestran los microorganismos utilizados como indicadores para evaluar la actividad antimicrobiana de las bacterias lcticas procedentes de los embutidos crudos madurados, as como su origen. Todos los microorganismos se liofilizaron en un medio de leche desnatada al 10% para garantizar su conservacin. Los stocks de trabajo se mantuvieron en congelacin a -20 oc en caldo nutritivo con un 15% de glicerol, revitalizndolos cada dos meses mediante dos o tres pases en el mismo caldo.

II. 1. 1. 2.

Obtencin de los inmunosueros

Los inmunosueros se obtuvieron por inoculacin de la sustancia antirnicrobiana parcialmente purificada en conejos machos de raza New Zealand, de 2,5-3 Kg de peso, cedidos por el animalario del Departamento de Ciruga Experimental de Hospital Militar Central Gmez Ulla de Madrid.

54

MAIIERIALES Y MIETDDOS

III. 1. 2. Productos y reactivos

-

Los productos qumicos utilizados en las experiencias descritas en este trabajo fueron de calidad reactivo y suministrados por las siguientes firmas: Merck, Probus, Sigma, FLuka o Panreac.

Los productos utilizados en las experiencias microbiolgicas procedan de las firmas Difco y Oxoid, excepto los componentes minerales, azcares y colorantes que fueron suministrados por Merck, Panreac y BDH.

En las tcnicas cromatogrficas y electroforticas se emplearon productos suministrados por Pharmacia y Bio-Rad y los utilizados en los ensayos enzimticos, inmunolgicos e inmunoenziniticos lo fueron por Sigma, Difco, Pharmacia y Nordik.

II. 1. 3. Material de laboratorio

-

En la preparacin de los medios de cultivo y soluciones acuosas se ha empleado agua destilada, obtenida de un destilador Afora(1) y desmineralizada en un intercambiador inico Seta mod. R600.

Las pesadas ordinarias se realizaron en balanzas monoplato Sauter mod. S-1000 y las de precisin en balanzas analticas Sartorius mod. 2443 y Microwa mod. 6620. Para equilibrar las muestras a centrifugar se utiliz una balanza biplaso Cobos mod. 28

(1)
con

La

cita

de

marcas a otras

comerciales del mercado.

no

significa

que

el

autor

las

recomiende

preferencia

55

MATERIALES YMIPTODOS

Tabla III. 1. - Microorganismos indicadores empleados para evaluar la actividad antimicrobiana de las bacterias lcticas aisladas de embutidos crudos madurados

Microorganismo indicador Bacterias Gram-positivas Lactobacillus acidophilus Lactobacillus brevis Lactobacillus carnis LaCtobaCillus casel Lactobacillus curvatus Lactobacillus farcinzinis Lactobacillusfermentunz Lactobacillus n)eseItteiiCus Lactobocillus plantarwn Lactobacillus sake Lactobacillus mesentericus Carnobacteriunz divergens
Cainoba Cte/lun? piscicola Micrococcus

Cepa n~

Origena

289 Lb226 Lv6l 475 Lb726 Lb34 285 394 221 LbS?? Lb684 M R364 Lvi 3
MR37 1

CEOE IMTH FRIB CEOE IMTH IMTI-I CEOE CEOE CEOE IMTH IMTH FRIB FRIB FRIB CEOE CEOE CEOE CEOE CEOE CEOE NCIB CEOE CEOE FR 1 FRI

varians

230 481 1 84 410 49 148 10018 237 59 1 37 361

Ente-ococcusfaecalis Enterococcusfaecalis (var. liquefaciens) Enterococcusfaeciunz Bacillus stearoterrnophilus Bacillus ce,~eus Brochotrv thermosphacua Staphylococcus xylosus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus

56

MATI??IALES Y METODOS

Tabla 111. 1. (continuacin)

-

Microorganismo indicador

Cepa &

O.igena

Bacterias Gram-positivas Listeria rnonocytogenes Listeija nhonocytogenes Listeija rnonocvtogenes Listeria rnonoCytogenes Listeria nzonocyogenes Clostridinin pef,-ingeas Clostridiurn botulinurn Bacterias Gram-ne2ativas
Enterobacter cloacae Escherichia coli Esche-icia Coli enteropatgeno Salnzonella typhi Salmonella thyphim urjan; Salmonella thyphimuriunz

5105 7973 LIS sv 1/2 LI 1 sv 4 Scott A 376 551

NOEC NOEC FVM FVM CEOE CEOE CEOE

194 BW545 B4 1 409 443 T9 1 DC5 DC? NT1 9 WA E20 14405

CEOE MIT IEKC CEOE CEOE CENAN FRTE FR IB FRIE DHHS NC IPP

Pseudornonafluo-escens Pseudomonafluorescens Pseudornonafluorescens Yersinia ente~ocolirica Yersinia enterocolifica Yersinia enterocolirica

a Abreviaturas: CEOE, Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (Burjasot, Valencia); CENAN, Centro Nacional de Nutricin y Alimentacin (Majadahonda, Madrid); DHHS. Dpt. of Health and Human Services. (Washington DC. USA); FRI, Food Research Institute (Madison, USA); FRIB, Food Research Insticute (Bristol, Reino Unido); FVM, Facultad de Veterinaria (Madrid); IEKC, International Eschechia and Klebsiella Centre (Copenhage, Dinamarca); IMTH, Institute flir Mikrobiology, Toxicology und Histology (Kulmbach, RFA); IPP, Institut Pasteur (Paris, Francia); MIT, Masachussets Institute of Technology (Boston, USA); NCIB, National Collection of Industrial and Marine Bacteria (Aberdeem, Reino Unido); NOEC, National Collection ofT~pe Cultures (Londres, Reino Unido)

5-7

MATERIALES Y MIITODOS

Los ajustes y determinaciones de pH se llevaron a cabo con pH-metros Crison mod. Digit 501 y Radiometer mod. 28.

Las esterilizaciones de los medios de cultivo y de las soluciones cuya naturaleza as lo permita se realizaton en autoclaves Averly y Selecta mod. 437-G. La esterilizacin del material de vidrio se efectu por calor seco en una estufa de aire forzado I-Ieraeus mod. KFTU-K. La esterilizacin de otras soluciones tuvo lugar por filtracin con filtros Millipore de 0,22 y 0,45 gm de dimetro de poro.

Las homogenizaciones se llevaron a cabo en un homogenizador-Stomacher Colworth mod. 400.

Las centrifugaciones se efectuaron en una centrfuga refrigerada Sorval mod. RC-5B, equipada con rotores SS-34 y GSA y en una microcentrfuga Heraeus Christ, mod. Biofuge, equipada con un rotor tipo 1220.

Las siembras microbianas se realizaron en una cmara de flujo laminar Telstar mod. CE-A. Las incubaciones se efectuaron en estufas Heraeus, mods. KB-500 y B6200 y Selecta. mod. Termotronic 338, termostatadas a la temperatura deseada. Los tratamientos trmicos e incubaciones que requeran un control de la temperatura ms preciso se realizaron en baos de agua o de glicerina provistos de termostatos Selecta, mod. Tectron.

El crecimiento de los cultivos microbianos se estim porturbidometra. empleando un colormetro Klett-Summerson mod. 800-3. Los recuentos microbianos se hicieron en un contador de colonias WTW mod. BZG-24. Las observaciones microscpicas se realizaron en un microscopio ptico Nikon, ruod. L-ke, equipado con un dispositivo de contraste de fases.

58

MATERIALIS Y MEPODOS

Las determinaciones espectrofotomtricas se llevaron a cabo en espectrofotmetros Kontron, mod. Uvikon 820, e Hitachi, mod. U-2000, registrndose los resultados en una impresoi-a trmica Kontron, mod. Uvikon LS Thennoprinter 4B.

Las muestras se conservaron en arcones congeladores Kelvinator, mods. AC-550 y ACK-55 y Liebherr, mod. GT6102, as como en frigorficos Aspes. Kelvinator mod. 1 AKR y Liebherr y en un armario frigorfico termostatado a 4 0C 0C construido por una firma local.

Las liofilizaciones se efectuaron en una aparato Terruzzi Melvisa, mod. TP-3.

Las cromatografias de filtracin en geles se realizaron utilizando columnas de diferentes dimensiones de las marcas Phai-macia y Wright. Las fracciones cromatogrficas se recogieron en colectores de fracciones LKB-Bromma mod. 7000 Ultrarac y 2212 Helirac.

Las electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico se practicaron en una cubeta de electroforesis Bio-Rad. mod. Protean II, empleando como fuente de alimentacin un aparato Shandon, mod. SAE 2761.

En los ensayos inmunoenzimticos (ELISA), se emplearon placas de ELISA marca Costar mod. 3590 de 96 pocillos y la lectura de las mismas se efectu en un lector de placas ELISA Titerek Multiskan mod. Plus.

En la determinacin de la composicin aminoacdica de la susancia antimicrobiana parcialmente purificada mediante tnicas de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). se emple un cromatgrafo Beckman mod. 332. dotado de una columna (25 cm x 4,6 mm) de fase reversa Spherisorb ODS-2 (Supelco) y un detector UV. Beckman mod. 160. El

59

MATER/ALES Y MTODOS

cromatograma se obtuvo en un integrador Hewlett Packard mod. HP-3394A.

Como material general de laboratorio se han utilizado pipetas, micropipetas automticas Gilson, mods. P-20, P-200. P-l000, agitadores, mecheros de gas, termmetros, etc. El material de vidrio empleado fu siempre del tipo Pirex
-

III. 2. METODOS
-

III. 2. 1. Medios de cultivo empleados en el crecimiento de los mlcroor2antsmos

-

111. 2. 1. 1. Medios de cultivo para el crecimiento de las bacterias lcticas

-

1. Medio de Man. Rogosa y Sharpe <MRS. de Oxoid

-

Contiene: Peptona Extracto de carne Extracto de levadura Dextrosa Acetato sdico Fosfato dipotsico Citrato triamnico 5 ulfato magnsico Sulfato de manganeso Tween 80 pH 6,2 10,0 8,0 4,0 20,0 5,0 2,0 2,0 0,2
0,05

ml

60

MATERIALES Y MTODOS

Preparacin

Se suspenden 52 g del medio de MRS en 11500 ml de agua destilada calentando la solucin hasta su disolucin y esterilizndola en un autoclave a 121 0C durante 15 minutos. Cuando el medio se depositaba en placas de Peni, a los componentes citados se les aada 10,0 g/l de agar bacteriolgico (DIFCO) y 7,5 gil cuando se elaboraba el agar de MRS semislido para los experimentos de inhibicin.

2.

Medio base Contiene: Dextrosa Extracto de levadura Cloruro sdico Citrato amnico Fosfato potsico dihidrogenado Fosfato dipotsico Sulfato magnsico Sulfato de manganeso Sulfato feaoso Tween 80 pH final llevado a 6,2 con HCI iN g/l 10,0 5,0 2,0 2,0 1,0 1,0 0,20 0,05 0,01 1 ml

Pieparacin.

Para estudiar la influenciade la fuente de nitrgeno en la produccin de las sustancias antibacterianas, este medio base se suplement con 15 g/l de uno de los siguientes extractos: triptona, triptosa. proteosa-peptona, casitona, peptona (suministrados por Difeo) o extracto de

61

MA TER/ALES Y MTODOS

carne (Oxoid>. Los componentes citados se disolvieron en 1.000 ml de agua destilada. La preparacin ulterior de cada uno de los medios semisintticos as obten idos es idntica a la sealada para el medio de MRS (seccin III. 2. 1. 1) El medio base suplementado con 15 gil con triptosa (MM-Triptosa) se emple para la purificacin de las sustancias antimicrobianas producidas por las bacterias lcticas.

III. 2. 1. 2.- Medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos indicadores distintos de las bacterias lcticas

1. Caldo infusin de cerebro y corazn (BHI, Oxoid Contiene: Extracto de cejebro Extracto de corazn Proteosa-peptona Cloruro sdico Dextrosa Fosfato disdico pH 7,4 g/l 12,5 5,0 5,0 5.0 2,0 2,5

Preparacin

Se suspenden 37 g del producto deshidratado en polvo en un litro de agua destilada. La preparacin ulterior del medio as obtenido es idntica a la sealada para el medio de MRS (seccin III. 2. 1. 1)

62

MATERIALES Y MI7FODOS

2. Caldo con Tween para todos los uropsitos (APT. Difco~ Contiene: Triptona Dextrosa Extracto de levadura Citrato sdico Cloruro sdico Fosfato dipotsico Sulfato magnsico Cloruro de manganeso Sulfato ferroso Clorhidrato de tiamina Tween 80 pH 6,7 g/l 12,5 10,1 7,5 5,0 5,0 5,0 0,8 0,14 0,04 0,001 0,2

Preparacin

Se suspenden 46,2 g del polvo deshidratado en un litro de agua destilada. La preparacin ulterior del medio as obtenido es idntica a la sealada para el medio de MRS (seccin III. 2. 1. 1).

III. 2. 2.

Aislamiento y seleccin de las bacterias lcticas de los embutidos crudos madurados

Las bacterias lcticas (cepas LAB) utilizadas en este trabajo se aislaron durante la maduracin de un lote de embutidos comerciales a los que no se les haba aadido ningn

63

MATERIALES Y MEXODOS

cultivo iniciador. Las muestras se tomaron de la masa crnica durante los siguientes dias de maduracin: 0, 2, 6, 10, 21 y 35. Para el aislamiento de las bacterias lcticas se recogieron aspticamente 20 g de la porcin central de los embutidos que se homogeneizaron durante 10 minutos en 180 mIde un medio que contena peptona (1 gIl) y cloruro sdico (8,5 gIl) en agua destilada.

El recuento total de microorganismos presentes en el homogeneizado se realiz en placas de PCA suplementado con cloruro sdico (1%). El agar de recuentos en placa (PCA, Oxoid) contiene (por litro); 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 1,0 g de dextrosa y 9,0 g de agar. Su pH final es de 7,0 y se prepara suspendiendo 17,5 g de polvo del medio deshidratado en un litro de agua destilada. El resto de las operaciones de preparacin del medio son idnticas a las indicadas para el medio de MRS (seccin III. 2. 1. 1. 1). El recuento de bacterias lcticas se efectu en agar de MRS. Las placas de PCA y de MRS se incubaron a 32 0C durante 3 das.

De las colonias crecidas en agar de MRS se seleccionaron 180, en grupos de 30, durante los dias 0, 2, 6, 10, 21 y 35 de maduracin siguiendo el mtodo aleatorio descrito por Ordez (1979). Las colonias seleccionadas se recogieron con una asa de platino y se sembraron en tubos que contenan caldo de MRS, manteniendo los tubos durante 16 h a 32 0C. A los cultivos obtenidos se les adicion un 15% de glicerol estril y se almacenaron en congelacin a -20 0C hasta su posterior utilizacin. Alcuotas de cada una de las cepas se almacenaron en liofilizacin con leche desnatada al 10
%.

64

MATERIALES Y MEFODOS

III. 2. 3. Actividad antimicrobianade las bacterias lcticas seleccionadas

-

111. 2. 3. 1. Soluciones tampn empleadas

-

1.)

Tampn de fosfato 4 mM, pH 7,0.

a. Solucin de Na2HPO4, 4miN4. Contiene 0,76 g de Na2HPO4 en 1 litro de agua destilada.

b. Solucin de NaH2PO4, 4 mM. Contiene 0,55 g de NaH2PO4 en 1 litro de agua destilada.

Preparacin

Se aade la solucin (b) a la (a) hasta que su pH alcanza el valor de 7,0.

III. 2. 3. 2. Pruebas directas de antagonismo

-

111.2.3.2. 1.- Prueba directa de antaEonismo en pocillos

Para detectar la actividad inhibidora de las bacterias lcticas (LAB), aisladas de los embutidos crudos madurados, frente a los microorganismos indicadores, se ide un sistema consistente en utilizar placas de Petri con medio MPS slido en las que, con un sacabocados de? mm de dimetro, se hicieron pocillos, cuyo fondo se tapiz con 10 ~fldel mismo medio. A continuacin se depositaron en cada pocillo 20 pl de los cultivos de las cepas LAB escogidas y cultivadas en caldo MRS, despus de laxadas y resuspendidas en el mismo medio.

65

MATERIALES Y MEIVDOS

Las placas se prepararon por duplicado y cada pocillo se rellen con agar MRS. Posteriormente, los microorganismos indicadores a una concent-acin ap-oxiinada de 1 x o~ ufc/ml, se sembraron en una de las placas del par, que contena agar MRS, cuando se trataba de bacterias lcticas y agar BHI en el resto de los casos. Tanto las placas a las que se les haba aadido el indicador como sus compaeras del par carentes del mismo, se incubaron a 32 0C durante 24 horas. Transcurrido ste tiempo se aadi indicador a las placas del par que carecan del mismo y cuyas cepas LAB haban obtenido una ventaja de crecimiento de 24 horas, siguiendo la pauta citada (prueba de actividad inhibidora diferida). Estas placas se incubaron durante a 32 0C durante otras 24 horas.

Con esta tcnica la inhibicin ejercida por las bacterias lcticas en el microorganismo indicador se manifiesta por la aparicin de halos en la superficie de las placas. Dicha inhibicin se cuantifica determinando el rea de la corona circular del halo de inhibicin (mm2) por unidad de densidad ptica de los cultivos en unidades Klett y por 0,020 ml de medio de cultivo.

III. 2. 3. 3. Actividad inhibidora de los sobrenadantes concentrados libres de clulas

-

U. 2. 3. 3. 1

Preparacin de los sobrenadantes

Las 24 bacterias lcticas seleccionadas (20 con gran actividad inhibidora directa y 4 con una actividad manifiestamente menor), se cultivaron en caldo MRS durante 16-18 h a 32 y los sobrenadantes libres de clulas se obtuvieron centrifugando los cultivos a 12.000 g durante 10 minutos. El pH de los sobrenadantes se ajust a 6,2 con NaOH IN y, a continuacin, se filtraron por un filtro de 0,22 gm de dimetro de poro. Los filtrados se liofilizaron y antes de su utilizacin se concentraron 20 veces, resuspendindolos en tampn de fosfato 4 mM, de pl] 7,0.

66

MATERIALES Y MTODOS

III. 2. 3. 3. 2.

Deteccin de la actividad inhibidora de los sobrenadantes concentrados 20 veces

Para detectar y cuantificar la actividad inhibidora de dichos sobrenadantes se utilizaron discos de papel de filtro Whatman n9 3. de 7 mm de dimetro, que contenan 0,030 ml de los sobrenadantes concentrados 20 veces. Estos discos se colocaron en placas de Petri que tenan su fondo tapizado con una fina capa de agar base y en las que se depositaron aproximadamente 3 x io~ clulas de los microorganismos indicadores de inters sealados en la tabla III 1, resuspendidos en 6 ml de agar semislido MRS o BHI (0,75 % de agar en todos los casos). Las placas se incubaron a 32 0C durante 24 h y la actividad inhibidora de los sobrenadantes se determin midiendo los halos de inhibicin formados alrededor de los discos de papel de filtro. Para ello se utiliz la expresin: Dimetro del halo de inhibicin inhibicin x 2) + dimetro del papel de filtro (7 mm). (Radio de la zona de

III. 2. 3. 4.

Efecto de la catalasa en la actividad inhibidora de las bacterias lcticas seleccionadas

La influencia del H

202 en la actividad inhibidora de las bacterias lcticas se evalu

adicionando catalasa (130 UI/m) a los cultivos libres de clulas neutralizados y filtrados. La actividad inhibidora se determin empleando el sistema de discos en placas descrito en la seccin III. 2. 3. 3. 2. La actividad inhibidora debida al H202 se determin cuantificando la diferencia de dimetro entre los halos de inhibicin de las muestras problema y las de los controles a las que no se les haba adicionado catalasa.

67

MATERIALES Y MI7iODOS

IIL 2. 4.

Identificacin

caracerizacin bi~umica de al2unas bacterias lcticas con

actividad antimicrobiana

III. 2. 4. 1. Morfolo2a y tincin por el mtodo de Gram

-

Los cultivos de las 6 bacterias lcticas seleccionadas por la mayor actividad inhibidora de sus cultivos libres de clulas, se tieron por el mtodo Gram y se observaron al microscopio para determinar su morfologa y sus afinidades tintoriales.

TU. 2. 4. 2. Prueba de la catalasa

-

La produccin de catalasa se realiz aadiendo una gota de perxido de hidrgeno (110 vol) a una alcuota del cultivo a analizar. Como control positivo se emple un cultivo de S. aureus. La prueba se basa en la descomposicin del perxido de hidrgeno por la catalasa dando agua y oxgeno, manifestndose este ltimo por la presencia de burbujas.

111. 2. 4. 3. Produccin de gas a partir de glucosa

-

La produccin de CO2 a partir de La glucosa se determin de dos mane;-as diferentes:

1.)

Introduciendo campanas de Durham en tubos con caldo MRS de cuya

composicin se suprime el citrato. Si las cepas producen gas durante la incubacin de los cultivos, ste se manifiesta por la presencia de burbujas en el interior de la campana.

2.) Colocando en los tubos de medio CS-T modificado tapones de agar (2 % p/v) y
-

observando si durante la incubacin de aquellos se produce un desplazamiento de los tapones debido a la presencia de gas. 68

MAERIALES Y METODOS

El medio CS-T modificado contiene: g/l Casaminocidos~1> Extracto de levadura Fosfato monopotsico Fosfato dipotsico Sulfato magnsico (7 H 20) 5,0 5,0 0,6 0,6 0,2 0,05 0,01 0,01 0,08 2,5 1,0 ml

Sulfato de manganeso (1 H20) Sulfato ferroso Clomro sdico Bromotimol azul Agar Tween 80 pH 6,2

Preparacin

0C durante 15 minutos, se le aade A un litro de medio de cultivo esterilizado a 121 una solucin de glucosa al 10 % en una proporcin del 10% (y/y). La solucin de glucosa se esteriliza por filtracin con filtros Millipore de 0,22 ~.tm tamao de poro. Una vez enfriado de el medio, se le adicionan 150 jil del cultivo a investigar realizndose a continuacin picaduras en el medio semislido. Se le aaden 2,5 ml del agar al 2
%.

La formacin de gas se detecta

por el desplazamiento del tapn hacia arriba despus de 3 das de incubados los tubos a 32 0C.
Una mezcla comercial de

aminocidos

obtenidos

por

hidrlisis

de

casena

69

MATERIALES Y MCIODOS

III. 2. 4. 4. Hidrlisis de la ar2inina

-

L)

Caldo Arginina Contiene: Peptona Extracto de levadura Fosfato dipotsico Acetato sdico Citrato sdico Sulfato magnsico Sulfato de manganeso L-Arginina Tween 80 g/1 10,0 4,0 2,0 5,0 2.0 0,2 0,02 3,0 1,0

Preparacin.

Una vez disueltos los componentes del medio, se distribuye en tubos que se esterilizan en autoclave a 121 0Cdurante 15 minutos.

2.) Reactivo de Nessler

a.) Solucin 1. Contiene: Yoduro potsico Yoduro mercrico Agua destilada 7 lO 40 g g mi

70

MATERIALES Y M171ODOS

b.) Solucin 2. Contiene 10 g de NaOH en 50 ml de agua destilada.

Preparacin.

Una vez preparadas las dos soluciones (y dejada enfriar la solucin 2), se mezclan en un matraz aforado de 100 ml y se aade agua destilada hasta enrasar. Se deja que sedimente el precipitado, se decanta el lquido sobrenadante claro, que se guarda, y se desecha el precipitado.

Sembradas las bacterias lcticas de inters en caldo de Arginina, se incuban a 32 0C durante 2 das; a 1 mIde stos cultivos se le aade 1 ml del reactivo de Nessler. La hidrlisis de la arginina, con formacin de amonaco, produce una alcalinidad que se manifiesta por el desarrollo de un color entre anaranjado y marrn.

U. 2. 4. 5. Produccin de cido sulfhdrico

-

III. 2.4. 5. 1. Tcnica de Shav

-

E~an (l981~

1. Agar base de acetato de plomo (Difco). Contiene: Peptona Pioteosa Dextrosa Acetato de plomo Tiosulfato sdico Agar g/l 15,0 5,0 1,0 0,2 0,08 15,0

71

MAERIALES Y MTODOS

pH 6,6

Prepw-ocn.

Se suspenden 36 g del medio deshidratado, 1 ml de Tween 80 y 0,05 g de sulfato de manganeso en 1 litro de agua destilada La suspension se calienta hasta ebullicin y se esteriliza en autoclave a 121 0C durante 15 minutos. El medio esterilizado se deja enfriar hasta 45 0C para distribuirlo finalmente en placas.

Si las colonias desarrolladas en las placas incubadas a 32 0C durante 3 das producen cido sulfhdrico, se observa un ennegrecimiento del medio.

III. 2. 4. 5. 2. Asar hierro de Klieser

-

Los cultivos seleccionados se inocularon en tubos inclinados de agar hierro de Klieger, tanto en picadura como en estra. Los tubos se incubaron durante 7 das a 32 0C, manifestndose la produccin de cido sulfhdrico por un ennegrecimiento del medio.

Hl. 2. 4. 6. Prueba de Voses-Proskauer

-

a.) Caldo MR-VP. Contiene: Peptona Fosfato dipotsico Dexuosa pl] 7,5 g/l 7.0 5.0 5,0

72

MATERIALES Y MElaDOS

a.) Solucin de a-naftol en etanol Contiene: a-naftol Etanol 6 100 g ml

c.) Solucin de hidrxido potsico. Contiene:

KOI-I
Agua destilada

40 100

g ml

Prepn -acin.

Una vez disuelto el medio a.) se distribuye en tubos que se esterilizan en autoclave a 121 0C durante 15 minutos Sembrado el inculo de la cepa problema e incubados los tubos a 32 0C, a 5 ml de los cultivos se aaden 0,5 ml de la solucin b.) y 0,5 ml de la cj y se observa el cambio de coloracin del medio. El desarrollo de un color rojo intenso se debe a la produccin de acetil metil carbinol a partir de la dextrosa que, en presencia de ICOR, reacciona con el a-naftol.

III. 2. 4. 7. Fermentacin de carbohidratos

-

1.)

Medio API C-IL (BioMrieux) Contiene: Peptona Extracto de levadura Tween 80 73 gil 10,0 5,0 1,0

MATERIALES Y MTODOS

Fosfato dipotsico Acetato sdico Citrato diamnico Sulfato magnsico Sulfato de manganeso Bromocresol prpura pH 6,9-7,0

2,0 5,0 2,0 0,20 0.05 0,17

2.) Tiras API 50 CH (BioMrieux).

Cada tira contiene los siguientes carbohidratos: 0. control; 1. glicerol; 2. eritritol; 3. D-arabinosa; 4. L-arabinosa; 5. ribosa; 6. D-xilosa; 7. L-xilosa; 8. adonitol; 9. ~3-metil D-xilsido; 10. galactosa; 11. glucosa; 12. fructosa; 13. manosa; 14. sorbosa; 15. ramnosa; 16. dulcitol; 17. inositol; 18. manitol; 19. sorbitol; 20. a-metil D-mansido; 21. a-metil D-glucsido; 22. N-acetil glucosamina; 23. amigdalina; 24. arbutina; 25. esculina; 26. salicina; 27. celobiosa; 28. maltosa; 29. lactosa; 30. melibiosa; 31. sacarosa; 32. trealosa; 33. inulina; 34. melicitosa; 35. rafinosa; 36. almidn; 37. glucgeno; 38. xilitol; 39. gentibiosa; 40. D-turanosa; 41. D-lixosa; 42. D-tagatosa; 43. D-fucosa; 44. L-fucosa; 45. D-arabitol 46. L-arabitol; 47. gluconato; 48. 2-cetogluconato y 49. 5-cetogluconato.

Procedimiento.

Los cultivos seleccionados, desarrollados previamente en caldo MRS, se centrifugaron a 12.000 g durante 10 minutos y el sedimento (las clulas) obtenido se resuspendi en el medio API CHL. El sedimento resuspendido se deposit en microtubos en los que se encuentran los carbohidratos La zona aerbica de los microtubos (superficie) se cubri con aceite de parafina para crear las condiciones de anaerobiosis requeridas. Las tiras con los

74

MATERIALES Y MTODOS

distintos microtubos se incubaron a 32 0C, realizando dos lecturas de las mismas a las 24 y 48 h, respectivamente. La fermentacin de los carbohidratos se manifiesta por un cambio de color del microtubo, debido a la produccin anaerbica de cido, que es detectado por el indicador de pH incluido en el medio API CHL.

III. 2. 4. 8. Tolerancia al cloruro sdico

-

La tolerancia de las bacterias seleccionadas a la sal se determin en caldo MRS suplementado con un? y un 10 % de NaC, respectivamente. El medio, una vez inoculado, se incub durante 6 das a 32 0C.

III. 2. 4. 9. Tolerancia al pH de 3.9

-

El crecimiento de los cultivos a pH 3,9 se evalu en caldo MRS cuyo pH se haba ajustado a 3,9 con HCI IN. El medio se incub durante 5 das a 32 0C.

III. 2. 4. 10. Desarrollo a diversas temperaturas

-

El desarrollo de los cultivos a diversas temperaturas se analiz depositando alcuotas de cada uno de ellos en tubos de ensayo que contenan caldo MRS. Una vez inoculados los tubos, se procedi a su incubacin a las diversas temperaturas durante periodos variables de tiempo. El desarrollo de los cultivos se determin a intervalos de tiempo regulares midiendo su absorbancia en Unidades Klett.

75

MATERALES Y MEraDOS

III. 2. 5.- Esnectro antimicrobiano de las sustancias inhibidoras producidas por las cepas deL. sate nmeros 77. 90. 148
y

180

El espectro antimicrobiano de las 4 cepas de U sake que mostraron una mayor actividad antagonista, se detennin viendo la actividad inhibidora frente a los microorganismos indicadores citados en la tabla III. 1 del sobrenadante concentrado libre de clulas, elaborado segn se describe en la seccin Hl. 2. 3. 3. La actividad inhibidora se determin midiendo los halos de inhibicin alrededor de los circulos de papel de filtro y se expres como: Dimetro de inhibicin

(Radio de la zona de inhibicin x 2) + dimetro del papel de filtro (7 mm).

III. 2. 6.

Efecto de la composicin del medio de cultivo en la actividad antimicrobiana de Locwbacillus sake 148

Para estudiar el efecto del medio de cultivo en la actividad antimicrobiana deL. saLe 148, este se sembr en diversos medios de cultivo que se incubaron durante 16 h a 32 C. Los medios empleados fueron los siguientes: 1.) Medio de APT 2.) Medio de APT suplementado: a) con 10 g de triptosa/l (APT-Triptosa) b) con 10 g de proteosa-peptona/l (APT-Proteosa) c) con 10 g de peptonail (APT-Peptona) d) con 10 g de extracto de came/l (APT-Extracto de carne) 3.) Medio EHI 4.) Medio BHI con las supletnentaciones descritas: a) BHI-Triptosa b) BHI-Proteosa c) Rl-II-Peptona

76

MATERIALES Y METOI)OS

d) EHI-Extiacto de carne
5.)

Medio base suplementado: a) con 15 g de triptosall (MM-Triptosa) b) con 15 g de proteosa/l (MM-Proteosa) c) con 15 g de peptona/l (MM-Peptona) d) con 15 g de extracto de carne/l (MM-Extracto de carne) e) con 15 g de caseina/1 (MM-Caseina)

fl con 15 g de triptonall (MM-Triptona)

Terminada la incubacin se prepararon los sobrenadantes concentrados libres de clulas y se determin su actividad antimicrobiana de la manera descrita en la seccin III. 2. 3. 3., utilizando a L.fermcntunz CEGI285 como el microorganismo indicador

III. 2. 7.

Crecimiento de L. saLe 148. cintica del desarrollo sustancia antimicrobiana a diversas temperaturas

produccin de

III. 2.7. 1. Crecimiento de los cultivos

-

Alcuotas de 100 ~.d un cultivo de L. sake 148 se inocularon en tubos con caldo de MRS y MM-Triptosa y se incubaron a 4, 8,15,20 y 32 0C durante? das, 5 das, 30 h, 16 h y 12 h, respectivamente. El desarrollo de los cultivos se estim por turbidometra a determinados intervalos de tiempo; con los datos obtenidos se calcularon los parmetros cinticos del desarrollo microbiano que se describen en la seccin III. 2. 6. 2. En los mismos intervalos se determin el valor del pH del cultivo.

La actividad antimicrobiana de los sobrenadantes obtenidos en cada intervalo, se determin como se indica en la seccin III. 2. 3. 3., empleando a Lferrnentum CECT285

77

MATERIALES Y MITODOS

como el microoraanismo indicador.

111. 2. 7. 2. Parmetros cinticos del desarrollo microbiano

-

111.2.7.2. 1.- Velocidad especfica de crecimiento (u

Se define como el aumento de la masa celular de los cultivos respecto del tiempo de incubacin y se calcula a partir de la ecuacin de la recta de regresin de una grfica que representa la masa celular de los cultivos en funcin del tiempo de incubacin (figura 3.1)

x
c

1-

Figura 3. 1.- Representacin grfica terica del incremento de la masa celular de los cultivos en funcin del tiempo de incubacion.

78

MATERIALES Y MTODOS

De la figura 31 se deduce que: dx

ux

dt siendo x la densidad ptica de los cultivos en unidades Klett, t el tiempo de incubacin en horas y 1 la velocidad especfica de crecimiento. Asimismo,
X2 dx

5
X2

5o
In

gdt;

X2

In

=jit; por tanto,

III. 2. 7. 2. 2. Tiempo de dunlicacin (t1

-

Se define como el tiempo que tardan los cultivos en duplicar su masa celular a una temperatura de incubacin determinada. Su valor se calcula de la expresin:

x2
In ____ xl
r

2X1
it;

0,693
=jlt<j:

cuando X2 = 2X1;

In xl

ln

2=Jitd;

td

III. 2. 7. 2 3. Nmero de generaciones por hora (st/h

-

Este trmino indica el nmero de generaciones microbianas de los cultivos en una hora a una temperatura detenninada y su valor se corresponde con el inverso del tiempo de 79

MATERIALES Y MTODOS

duplicacin a).

III. 2. 7. 2. 4. Determinacin del peso celular seco

-

El peso celular seco se determin por interpolacin en una grfica (figura 3. 2) en la que se representa el peso celular seco con respecto a la absorbancia en Unidades Klett

III. 2. 7. 2. 4. 1. Elaboracin de la recta patrn para la determinacin del yeso celular

-

seco

Para determinar la recta patrn se prepararon una serie de tubos con medios de cultivo estriles de MRS y MM-triptosa, que se inocularon con Ji. saLe 148 y se incubaron a 32 0C.

La absorbancia de los cultivos se determin cada ciertos intervalos de tiempo al progresar el tiempo de incubacin; para ello se tomaban alcuotas de 5 ml de los medios de cultivo a intervalos regulares en los que se determinaron las Unidades Klett hasta que stas se estacionaron (ya no aumentaban ms).

Las alcuotas se filtraron por filtros Millipore, de 0,45 ~m de dimetro de poro, previamente tarados. Los filtros, en los que haban quedado retenidas las clulas, se introdujeron en placas de Petri de vidrio y se desecaron durante 10 h a 80 0C. El peso celular seco (n Jml), correspondiente a cada absorbancia se estableci determinando la diferencia en peso del filtro con y sin microorganismos dividida por 5. La absorbancia en Unidades Klett se relacion con el peso celular seco mediante una recta de regresin (fig 3. 2).

80

MATER/A LES Y MTODOS

300
E

250
u

200
y,

u u

150

100

2-a

o n

y,

50

o 0,0

0,5

1,0

1,5

2.0

Peso celular seco (mg/m)

Figura 3. 2.- Recta patrn para la determinacin del peso celular seco en virtud de la absorbancia del medio de cultivo.

81

MATERIALES Y MTODOS

III. 2. 8. Purificacin parcial de la actividad antimicrobiana exocelular deL. saLe 148 III. 2. 8. 1. Cromatografa de filtracin en celes
-

Esta tcnica cromatogrfica se basa en la separacin de las molculas por su tamao molecular. III. 2. 8. 1. 1. - Soluciones tampn emoleadas 1.) Tampn de cido ctrico-fosfato, de pH 5,6. (a.) Solucin de cido ctrico, 0,1 M. Contiene 21,01 gde cido ctrico (1 H20) por litro de agua destilada. (b.) Solucin de Na,HPO4, 0,2 M. Contiene 28,4 g de Na2HPO4 por litro de agua destilada.
Preparacin.

Se mezclan 42 ml de cido ctrico, 0,1 M con 58 ml de Na9HPO4. 0,2 M. 2.) Tampn de cido ctrico-fosfato, de pH 5,6, con urea 0,1 M, y 1 M

A la solucin tampn base (seccin III. 2. 8. 1. 1. 1), se le aaden, respectivamente,

g 60 g de urea por litro de solucton.

III. 2. 8. 1. 2.

Geles

El Sephadex es un polmero resultante de la formacin de enlaces ciuzados entre las molculas de dextrano y de epiclorhidrina. Debido al gran nmero dc grupos hidroxilo de su molcula este polmero es muy hidroflico y se hincha fcilmente en el agua y en soluciones

82

MATiRRiALES Y MTODOS

electrolticas. Los tipos de Sephadex difieren en su grado de entrecruzamiento, por lo que se utilizan par-a alcanzar fraccionamientos con diversos intervalos de tamao moleculary que en el caso de los Sephadex 0-150 fino, G-75 y 0-50 son, respectivamente, de 5.000 a 300.000 daltons, de 3.000 a 80.000 daltons y de 1.500 a 30.000 daltons.

Los geles se prepararon y activaron segn las normas de la casa suministradora (Pharmacia Fine Chemicals). Los geles hidratados se conservaron en refrigeracin hasta su utilizacin.

III. 2. 8. 1. 3. Condiciones de trabaio

-

La cromatografa se realiz en una cmara termostatada a 41 0C y el eluato cromatografiado se recogi en un colector de fracciones.

El sobrenadante, libre de clulas y liofilizado, de cultivos de Ji. saLe

148

desarrollados en MM-triptosa durante 16 h a 32 0C, se resuspendi en el tampn de cido ctrico-fosfato, de pH 5,6 y urea 1 M, hasta una concentracin 20 veces mayor que la inicial. A continuacin 20 ml de esta solucin se depositaron en una columna (3,2 x 443 cm) de Sephadex G-150, previamente equilibrada con el tampn de cido ctrico-fosfato, de pH 5,6 y urea 0,1 M. El eluato, en fracciones de 5 m, se someti a una lectura espectrofotomtrica a 280 nm para determinar su contenido proteico, mientras que su actividad inhibidora se estableci de la manera descrita en la seccin III. 2. 3. 3. 2. utilizando L. fermentum CECT285 como el microorganismo indicador. Las fracciones cromatogrficas con actividad antimicrobiana se juntaron, liofilizaron y resuspendieron en el tampn de elucin para depositarias de nuevo en una columna (2,5 x 90 cm) de Sephadex 0-75, previamente equilibrada con cl tampn de clucin. Las fracciones eluidas dotadas de actividad antimicrobiana se manipularon corno se ha descrito antes y se depositaron de nuevo en una tercera columna (1,6 x 90 cm) de Sephadex

83

MATERIALES Y MTODOS

G-50. Las fracciones cromatogrficas con actividad antimicrobiana se juntaron, liofilizaron y se mantuvieron en un desecador a 4 0C hasta su utilizacin posterior.

III. 2. 8. 2. Determinacin de la protena

-

Se realiz por la tcnica de Lowry, segn la modificacin de Markwell y col. (1978). La tcnica se basa en el desarrollode color al poner en contacto las protenas con los reactivos que posteriormente se detallan. El desarrollo del color se debe a una combinacin de reacciones:

a.) Formacin de un complejo entre los enlaces peptdicos de las protenas con el cobre en tin medio alcalino (reaccin tipo Biuret).

b.) Reduccin del reactivo fosfomolbdico-fosfotngstico por la tirosina y el triptfano.

Esta tcnica pone de manifiesto los grupos fenoles presentes en las protenas; por ello es necesario extrapolar los resultados a una curva patrn construida con anterioridad. Como protena estndar para construir la curva patrn se emple la fraccin V de la seroalbmina bovina (figura 3. 3).

Reactivos:

Solucin A: Na,C0

3 al 2

%,

NaOH al 0.4 % y tartrato sdico

potsico (NaKC4H4O6) (4 H90) al 0,16 % en agua destilada.

84

MATERIALES Y MTODOS

0,4
u

0,3

o so o
0,2
u

o di
.0
01

0,0 o 20 40 60 80 100 120

Proteina (~ag/mI)

Figura 3.3.- Recta patrn para la determinacin de protena por el mtodo de Lowry modificado.

85

MATERIALES Y M5IODOS

Solucin B: CuSO4 (5 H-,O) al 4 % en agua destilada. Solucin C: Se obtiene mezclando 100 volmenes de la solucin A con

1 volumen de la solucin R
-

Solucin D: Reactivo de Folin-Ciocalteau diluido en agua destilada en la

proporcin 1:1

(y/y).

P,ocedimie,ito.

A 1 ml de una muestra que contenga entre 10 y 100 ig de protena se le aaden 3 ml de la solucin C; la mezcla se deja en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos. A
continuacin se adicionan 0,3 ml de la solucin D, agitndola inmediatamente y dejndola

reaccionar durante 45 minutos, al trmino de los cuales se mide el aumento de la absorbancia a 660 nm con referencia a un blanco preparado de la misma manera peo con agua destilada.

III. 2. 9.

Caracterizacin parcial de la actividad antimicrobiana exocelular parcialmente purificada de Ji.

saLe

148

III. 2. 9. 1.

Preparacin de la solucin patrn de la sustancia antimicrobiana

parcialmente purificada

Para realizar las pruebas de estabilidad enzimtica y trmica, se resuspendieron 200 mg de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada, obtenida de la columna de Sephadex G-50 (seccin III. 2. 8. 2), en 1 ml de una solucin tampn dc citrato-fosfato 4mM, de pH?. Esta solucin se preparaba justo antes de su empleo.

86

MATERIALES Y MTODOS

III. 2. 9. 2. Efecto de diversos enzimas en la actividad inhibidoi-a de Ji saLe 148

Para determinar la sensibilidad de la actividad inhibidora a los enzimas proteolticos (tripsina, pepsina, papana, proteasa II y proteasa XIV), lipolticos (lipasa 1 y lipasa VII) y amilolticos (a-amilasa), se prepar una solucin de la sustancia inhibidora parcialmente purificada (seccin III. 2. 9. 1). A los pocillos de placas de ELISA en los que se haban depositado 60 g de las dos soluciones (2 y 10 mg/m) de los distintos enzimas en tampn de citrato-fosfato, se aadieron 60 il de la solucin conteniendo la sustancia inhibidora, de tal manera que la concentracin final del enzima fu de 1 y 5 mg/ml respectivamente en cada dos pocillos. Como control positivo en un pocillo se coloc la sustancia antimicrobiana diluida al 50% con el tampn citado. Para determinar la posible accin inhibidora o estimulante del crecimiento del microorganismo indicador, ejercida por los enzimas empleados, se determin
la posible actividad antimicrobiana a las concentraciones descritas. La actividad antimicrobiana residual de los pocillos se determin tras 2. 6, y 12 horas de incubacin de las mezclas a 32

0C, segn el mtodo descrito en la seccin [It. 2.3. 3. 2; como microorganismo indicador se
utiliz L. ferrnentwn CECT285.

III. 2. 9. 3. Efecto de diferentes vHs en la actividad inhibidora de Ji. saLe 148

-

111. 2. 9. 3. 1. - Preparacin de las soluciones tampn de distintos vHs

E) Tampn universal (Dawson y col., 1969). a) Solucin A.

Contiene:
Acido ctrico

gp
6,008

Fosfato monopotsico

3,893

87

MATERIALES Y MErODOS

Acido brico Acido dietilbarbitjico Agua destilada hasta

1,769 5,266 1000 ml

b) Solucin B. Contiene 0,8 g de NaOH en 1.000 ml de agua destilada.

Procedimiento:

A 100 ml de la solucin A se le aaden los ml de la solucin B necesarios para obtener el valor de pH deseado. Se realizaron soluciones con valores de pH de 2,6, 3,6, 4,6,
7,6, 8,6, 9,6, 10,6, 11,6 y12,0.
5,6,

6,6..

III. 2. 9. 3. 2. - Condiciones de trabaio

Para establecer la estabilidad de la actividad antimicrobiana parcialmente purificada (seccin III. 2. 8. 2.) a los diferentes pHs, se distribuyeron en tubos alcuotas de 1 ml de la solucin tampn. Despus de incubar los tubos 24 h a 24 0C, se determin su actividad antimicrobiana por el sistema de los discos (seccin III. 2. 3. 3. 2), utilizando a L.fermentunz CECT285 como microorganismo indicador. Para comprobar que los tampones de diferente pH no ejercan accin inhibidora en el microorganismo indicador, se realiz la misma prueba de inhibicin con soluciones de la sustancia con actividad antimicrobiana.

88

MATERIALES Y AtETaDOS

III. 2. 9. 4. - Cintica de tennodestruccin de la actividad inhibidora deL, saLe 148

III. 2.9.4. 1.-Tratamiento trmico

En viales de vidrio (10 x 30 mm) hermticamente cenados se colocaron 0,1 ml de la solucin de sustancia antimicrobiana parcialmente purificada de Ji. saLe 148 que se calentaron a 80, 100, 121, 135 y 150 0C en un bao de glicerina termostatado, durante intervalos de tiempo variables en funcin de la temperatura de calentamiento. Finalizado el tratamiento tnnico Las muestras se enfriaron rpidamente en un bao de hielo picado y se determin su actividad antimicrobiana residual de la manera descrita en la seccin III. 2. 3. 3. 2. empleando como indicador a L.fermentunz CECT285.

III. 2. 9. 4. 2. - Parmetros cinticos de termodestruccin

A) Valor D o tiempo de reduccin decimal

Se define como el tiempo necesario para disminuir en un 90 % a una temperatura determinada, la actividad inhibidora inicial de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada de Ji. saLe 148, y se corresponde con el tiempo en el que la curva de supervivencia atraviesa un ciclo logartmico. Se calcula a partir de la ecuacin de la recta de regresin de una grfica de termodestruccin, que representa el logaritmo del porcentaje de la actividad inhibidora inicial en funcin del tiempo de calentamiento (figura 3. 4).

De la figura 3. 4, se deduce que:

log x

-kt

89

MATERIALES Y MTODOS

k
o

7
t
Figura 3. 4.- Representacin grfica terica de la actividad inhibidora en funcin del tiempo de caientamiento.

siendo X el % dc actividad inhibidora residual; 1 la constante de inactivacin en mm

t

el tiempo de calentamiento de las muestras Asimismo: (log x~ log x)

-

-k (t2-

t1>

log x~ log xi
-

1 D

logx,-logx~

ti t2
-

tI

log X2 log x1
-

90

MATERIALES Y METODOS

B) Tiempo medio It l/2~

Se define como el tiempo en el que la actividad inhibidora inicial se reduce en un 50 % a una temperatura determinada. El trmino puede calcularse grficamente (figura 3. 5), representando la variacin de la actividad inhibidora inicial en funcin del tiempo de calentamiento, o bien matemticamente, asumiendo que el cambio de la actividad

inhibidora con respecto al tiempo es funcin de la actividad inhibidora inicial (ecuaciones 1 y 2), dX
-

kX(l)

dt dX

kdt (2);

x
donde x representa la actividad inhibidora,
t

el tiempo de calentamiento a una determinada

temperatura y k la constante de inactivacin de la actividad inhibidora en min1.

Integrando la expresin (2) entre dos valores de x diferentes (x x0 la actividad inhibidora inicial en el tiempo t0, resulta:

0 y x) a (t0 y t) y siendo

-s
Si x

dxx

5 dr In _x0
to x

k(t-t0) 2,3 logxo=k(t~t0)

x

100
=

2,3 log 2 =ktp;

t12=

50, 2,3 log

____

50

ti!2 ZQSAi23 k

91

MATERIALES 1 MTODOS

~100

y,

4>
i-

50

--a

t 1/2

Figura 3. 5.

Representacin gi-fica terica de la actividad inhibidora en funcin del tiempo de calentamiento.

C) Valor 7

Se define como la temperatura necesaria para disminuir el valor D en un 90

%,

y se

calcula a partir de la ecuacin de la recta de regresin, obtenida al representar grficamente el logaritmo de los valores D en funcin de la temperatura a la que fueron obtenidos (figura 3. 6). l)e la figura 3. 6 se deduce que: log D aT
+

donde D es el tiempo de reduccin decimal a una determinada temperatura y Y es la

92

MATERIALES Y MTODOS

temperatura del tratamiento trmico en

0C.

o
o>
o

T
Figura 3. 6. Representacin grfica terica de los valores D en funcin de la temperatura.

Sipordefinicin, a=-

l logD=z (T
= ____

TC

z
1

log D2

log D1

(T2 z

log D2

log D1

T2)

log D2

log D

93

MATERIALES Y MEFODOS

III. 2. 9. 5.

Determinacin del peso molecular de la sustancia inhibidora deL. sake 148 por cromatoiirafa de filtracin en Sephadex 0-50

La cromatografa de filtracin en geles de Sephadex 0-50 para determinar el peso molecular de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada, se realiz de la manera descrita en la seccin III. 2. 8. 1. 3. Para ello 20 mg de la sustancia parcialmente purificada, disuelta en 3 ml de tampn de cido ctrico-fosfato, de pH 5,6 y urea 1 M se depositaron en la columna (1,6 x 90 cm) que contena el Sephadex 0-50, determinndose posteriormente la absorbancia a 280 nm y la actividad antimicrobiana de las fracciones eluidas resultantes.

A continuacin, en la misma columna se depositaron 3 ml de una solucin de 5 mg de dextrano azul, 6 mg de a-quimotripsingeno A (25.000 daltons), 8 mg de RNasa pancretica bovina (13.700 daltons) y 1 mg de vitamina B12 (1.300 daltons), disueltos en el mismo tampn en el que se disolvi la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada de L. sake 148. La absorbancia de tas fracciones etuidas se determin a 280 nrn, mientras el peso molecular de la sustancia problema se determin por interpolacin en una grfica (figura 3. 7), en la que se representaba el logaritmo de los pesos moleculares de las protenas estndar en funcin de la fraccin cromatogrfica en la que se encontraban.

III. 2. 9. 6.

Electroforesis en 2eles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico (SOS-PACE

Esta tcnica permite separar mezclas complejas de polipptidos en funcin de su tamao molecular. La electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico (SDS-PAGE). se realiz segn las tcnicas de Swank y Munkres (1971) yde Laemli (1970). El dodecil sulfato sdico es un detergente que con otros agentes, como el mercaptoetanol y el calor, nte-vicne en la desnaturalizacin de las protenas a subunidades y. adems, proporciona 94

MATERALLS Y MEPODOS

5 A B
1~

u
o

E o o

o,

0-~ biJ

c
3

2 0

II

-1

-1

10

20

30

40 Fraccin n9

50

60

Figura 3. 7.

Recta patrn para la determinacin de pesos moleculares por cromatografa de filtracin en Sephadex 6-50. (A) a-quimotripsingeno, (B) RNAsa pancretica bovina. (C) vitamina Ej 2.

95

AlATIERIALES Y MUFODOS

a las cadenas polipeptdicas una densidad de carga similar. De esta forma cuando el complejo SDS-protena se somete a electroforesis en un gel que contiene SDS, su velocidad de migracin viene deterirtinada principalmente por la masa de la partcula SDS-polipptido segn el pricipio de exclusin molecular. El campo elctrico, en este caso, slo suministra la fuerza impulsora.

III. 2. 9. 6. 1. Tcnica de Swank

-

Munkres (1971

III. 2. 9. 6. 1. 1. Tampones. geles

-

soluciones emuleadas

1.) Tampn para solubilizar las muestras. Se compone de: Urea 3-mercaptoetanol SDS Acido ortofosfrico 0,01 M hasta 4,8 0,5 0.25 10,0 g inI g ml

2.) Tampn de cido fosfrico 1 M-SDS, pH 6.8. Condene: Acido ortofosfrico (85 %) SDS Agua destilada, hasta El pH se ajuna a 6,8 con Tris. 33,7 5,0 500,0 ml g ml

3.) Solucin de acrilamida-bisacrilamida. Est formado por: Acrilamida 18,75 g

96

MATERIALES Y MIETODOS

N,N-metiln-bisacrilamida Agua destilada hasta

1,87 50,0

g ml

4.) Gel de separacin. Consta de: Solucin de acrilamida-bisacrilarnida Tampn de cido fosfrico 1 M-SDS Urea Agua destilada TEMED (N,N,N.N, tetrametiln-etilen-diamina) Persulfato amnico (6 %) 9,99 3,0 14,4 29,0 9,0 0,3 ml ml g ml g ml

5.) Gel de concentracin. Le forman: Solucin de acrilamida-bisacrilamida Tampn de cido fosfrico 1 M-SDS Urea Agua destilada TEMED Persulfato amnico (6%) 1,65 0,5 2,45 10,0 1,5 0,1 ml ml g ml g ml

6.) Tampn de electroforesis. Contiene: Tampn de cido fosfrico 1 M-SDS Agua destilada 0,225 ml 2,225 ml

97

MATERiALES YMETODOS

7.) Solucin de fijacin. Consta de isopropanol: cido actico: agua destilada (2,5:10:6,5 y/y).

8.) Solucin de tincin. Consiste en una solucin de azul brillante de Coomassie al 2 % en cido actico al 7
%.

9.) Solucin de lavado. Es una solucin al 7 % de cido actico en agua destilada.

III. 2. 9. 6. 1. 2.

Preparacin de las muestras

Las muestras solubilizadas en tampn de solubilizacin, con 50, 100 y 200 gg de la sustancia antimicrobiana, parcialmente purificada, se mantuvieron durante 5 minutos en bao de agua hirviendo antes de depositar 30 g de cada solucin en el gel de concentracion.

III. 2. 9. 5. 1. 3. Preparacin de los Leles

-

Los geles se prepararon de la manera descrita por Swank y Munkres (1971). El gel consta de dos porciones: fase inferior (gel de separacin) y fase superior (gel de concentracin). Los geles se prepararon como se describe en las secciones III. 2. 9. 6. 1. 4 y III. 2. 9. 6. 1. 5. Para evitar la presencia de burbujas de aire en los geles, la mezcla se desgasific a temperatura ambiente por sonicacin en un bao, durante 5 minutos, antes de aadirle el TEMED y el persulfato amnico. Los receptculos de formacin de los geles se llenaron primero con la solucin del gel de separacin hasta unos 3 cm de su extremo superior, mientras en la superficie de la mezcla, y para que no se formaran meniscos, se deposit un pequeo volumen de una solucin saturada de butanol. La mezcla se mantuvo durante 1 h a 37

98

MATERIALES YMFTODOS

0C y, una vez polimerizada, se retir el butanol y se lav su superficie con agua destilada. A continuacin se deposit el gel de concentracin y se introdujo el peine que forma los pocillos donde se depositarn Las muestras. El gel se polimeriza durante 30 minutos a 37 0C. quedando listo para realizar la electroforesis.

III. 2. 9. 6. 1. 4.

Electroforesis

La electroforesis tuvo lugar pasando por el gel una corriente de 18-20 mA

evitando

las temperaturas inferiores a 16 0C, para minimizar el riesgo de precipitacin de la urea Finalizada la electroforesis, el gel se extrajo de los vidrios del soporte.

III. 2. 9. 6. 1. 5. Tincin de los geles

-

Terminada la electroforesis, los geles se sumergieron en la solucin de fijacin y se mantuvieron fijndose durante, aproximadamente 8 h, cambiando la solucin de fijacin 2 3 veces. A continuacin, se introdujeron en la solucin de tincin donde se mantuvieron durante 2 h a temperatura ambiente. La eliminacin del colorante no fijado se realiz con la solucin de lavado.

III. 2. 9. 6. 1. 6-- Determinacin del peso molecular

El peso molecular se determin por interpolacin en una grfica en la que se representa el logaritmo del peso molecular de las protenas estndar frente a su distancia de migracin en el gel (figura 3. 8). Las protenas utilizadas en la confeccin de la recta patrn procedan de un kit comercial que contena las siguientes protenas estndar de bajo peso molecular: mioglobina 111 (2,5 KDa), mioglobina 11(6,2 KDa). mioglobina 1(8,1 KDa). mioglobina 1 11(14 KDa) y mioglobina (16,9 KDa).
y

99

MATERIALES Y MTODOS

111.2.9.6.2.

Tcnicade Laemli (1970

III. 2. 9.6. 2. 1. Tampones. Eeles

-

soluciones empleadas

1.) Tampn para solubilizar las muestras. Se compone de: Tris HCI 0,5 M, pH 6,8 Glicerol SDS (10%) j3-rnercaptoetanol Azul de bromofenol (0,05 %) Agua destilada 1,0 0,8 1,6 0,4 0.2 4,0 ml ml ml ml ml ml

2.) Solucin de acrilamida-bisacrilamida. Est formada por: Acrilamida N,N-metiln-bisacrilamida Agua destilada hasta 14,6 0,4 50,0 g g ml

3.) Gel de separacin. Contiene: Solucin de acrilarnida-bisacrilamida Tris HCI 1,5 M, pH 8,8 Agua destilada SDS (10%) Persulfato amnico (10 %) TEMED 20,0 7,5 1,9 0,3 0,15 15,0 ml ml ml ml ml 1.11

100

MATERIALES Y MEFODOS

4.) Gel de concentracin. Contiene: Solucin de acrilamida-bisacrilamida Tris HCI 0,5 M. pH 6,8 Agua destilada SDS (10%) Persulfato amnico (10 %) TEMED 1,3 ml 2,5 ml 6,1 ml 0,1 ml 50,0 g 10,0 g

5.) Tampn de electroforess. Consta de: Tris base Glicina SDS Agua destilada 6,6 28,8 2,0 2,2 g g g 1

6.) Solucin de tincin. Est formado por: cido actico Alcohol metflico Agua destilada Azul de coomasie 10,0 40,0 50,0 0,25 ml ml ml g

7.) Solucin desteidora Se componede: Acido actico Alcohol metlico 10.0 40,0 ml ml

101

MATERIALES Y MEFODOS

4,5

A
B

~
4) 4)

4,0

C
D

o
E

o, 4)

b)

3~5
u

3,0

20

40

60

80

oo

Distancia migrada (mm)

Figura 3. 8.- Recta patrn para la determinacin del peso molecular por la tcnica de Swank y Munkres. Patrones de bajo peso molecular; (A) Mioglobina, (E) Mioglobina 1 y TI, (C) Mioglobina 1, (D) Mioglobina II y (E) Mioglobina 111.

102

MATERIALES Y MTODOS

Agua destilada

50,0

ml

.)

Solucin de fijacin: Etanol:cido actico:agua destilada (10:5:85 y/y).

Hl. 2. 9. 6. 2. 2. - Preparacin de las muestras

Cinco, 10 y 15 gg de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada se disolvieron y se mantuvieron durante 5 minutos en un bao de agua hirviendo, antes de depositar lO jil de cada solucin en el gel de concentracin.

III. 2. 9. 6. 2. 3. Preparacin de los eeles y electroforesis

-

Tanto la preparacin de los geles como la electroforesis correspondiente se realiz de [a manera descrita en las secciones III. 2. 9. 6. 1. 3. y III. 2. 9.6. 1.4.

III. 2. 9. 6. 2. 4. - Tincin de los 2eles

III. 2. 9. 6. 2.4. 1. Tcnica del nitrato de plata

-

Los geles se tieron con el reactivo de nitrato de plata distribuido comercialmente por la casa Bio-Rad. Este reactivo, elaborado segn el mtodo de Merril y col. (1981), es unas

10-50 veces ms sensible que el azul brillante de Coomassie para visualizar las protenas en
los geles de poliacrilamida con SDS. La tincin se realiz siguiendo estrictamente las instrucciones recomendadas por la casa suministradora.

103

MATERIALES Y MTODOS

III. 2. 9. 6. 2. 5. Determinacin del peso molecular

-

El peso molecular se deterruin interpolando en una grfica los pesos moleculares de las protenas estndar frente a la distancia recorrida en su migracin en el gel. Las protenas estndar utilizadas en la confeccin de la recta patrn procedan de un kit comercial que contena las protenas de bajo peso molecular descritas en la seccin 111.2.9.6. 1.6.

III. 2. 9. ~7. Determinacin de la composicin aminoacdica de la sustancia

-

antimicrobiana de L. sake 148 por cromatografa lquida de alta

-

resolucin (HPLC

La determinacin de la composicin aminoacdica se realiz segn la tcnica descrita por Beaver y col (1986).

III. 2. 9. 7. 1. Tampones y reactivos

-

1.) Solucin A: tampn acetato-rietilan,ina. de pH 6.8

a) Solucin de acetato sdico 0,03M.

Disolver 2,46 g de acetato sdico en 1 litro de agua destilada.

b) Solucin de trietilamina al 0,05%

y/y.

Diluir 0,5 mIde trietilamina en 1 litro de agua destilada.

104

MATERIALES Y MTODOS

Procedimiento:

Mezclar ambas soluciones hasta obtener un pH de 6,8.

2.) Solucin 13: acetonitrilo al 90%

A 900 ml de acetonitrilo de calidad HPLC, aadirle agua Milli-Q hasta 1 litro. 3.) Solucin de acetonitrilo en tampn fosfato 0.5M. de pH 7.4

a) Solucin de fosfato sdico dibsico. 0.5M

Disolver 7 g de fosfato sdico dibsico en 100 mIde agua destilada.

b) Solucin de fosfato sdico monobsico, 0.5M

Disolver 6,8 g de fosfato sdico monobsico en 100 ml de agua destilada.

Procedimiento

Aadir solucin b) a la a) hasta obtener un pH de 7,4. La solucin as obtenida se filtra por un filtro de 0,45 linde dimetro de poro y se aade acetonitrilo calidad HPLC hasta una proporcin del 5%
(y/y).

4.) Solucin de fenilisotiocianato Contiene: Alcohol etlico Trietilarnina 105 tI 500 350

MATERIALES Y MTODOS

Fenilisotiocianato Agua destilada

100
50

III. 2. 9. 7. 2 DiLestin cida de la muestra problema

-

En viales de vidrio (10 x 30 mm) que se cerraron hermticamente al vaco, se colocaron previamente 10 mg de proteina de la sustancia antimicrobiana (seccin 111.2. 8. 1.), disuelta en 1 ml de HCI 6 N; a continuacin se calentaron a 120 oc durante 24 horas para realizar la hidrlisis cida de la muestra. Una vez hidrolizada se liofiliza y el liofilizado obtenido despus se resuspende en 750 tI de HCI 0,2N y se le aaden 100 fi de una solucin acuosa de norleucina al 1% (plv) en agua Milli-Q. Este aminocido, que no se encuentra normalmente en las muestras, acta como patrn interno.

III. 2. 9. 7. 3. Preparacin de los patrones

-

De cada uno de los aminocidos patrn y de la norleucina se pesaron 10 mg, que se disolvieron en 10 ml de una solucin de 0,2N HCI. Les aminocidos patrn empleados fueron los contenidos en un kit comercial de la casa Sigmt

III. 2. 9. 7. 4. Derivatizacin de los aminocidos

-

Tanto la solucin de aminocidos procedente de la hidrlisis de la sustancia antimicrobiana como la de los aminocidos patrn, se derivatizaron hacindolas reaccionar durante lO minutos en el doble de volumen de la solucin de derivatizacin de Etanol:Trietilamina: Fenilisotiocinato (7:2:1). Una vez terminada la reaccin, el medio lquido se evapor en corriente de N9. El material desecado resultante se resuspendi en una solucin de acetonitrlo en tampn fosfato 0,5M, de pH 7,4. 106

MATERIALES Y MTODOS

III. 2. 9. 7. 5. Tcnica de la cromatoLrafa en HPLC

-

En un cromatgrafo HPLC dotado de una columna de fase reversa (Supelco lSc) termostatada a 35 0C se inyectaron alcuotas de 20 tI de la solucin problema y de los aminocidos patrn derivatizados. La fase mvil estaba constituida por un gradiente de la Solucin B en la A (tabla III. 2) y la deteccin de los aminocidos derivatizados se realiz determinando su absorbancia a 254 nm. La composicin aminoacdica, cualitativa y cuantitativa, de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada se determin comparando el cromatograma obtenido con el de los aminocidos patrn.

Tabla III. 2.- Condiciones de trabajo para la determinacin, mediante cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), de la composicin aminoacdica de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada de Ii sake 148

Tiempo (mm)

Flujo (ml/niin) % de E en A

Duracin (mm)

0 0,5 5,5 15 22 32

1 1 1 1 1 1,5

4 6 15,5 35 38,5 99

0 5 9,5 7 10 5

107

MATERIALES Y MTODOS

111. 2. 10. Mecanismo de accin de la sustancia inhibidora deL. sake 148

-

Su determinacin se realiz esencialmente de la forma descrita por Schillinger y Lucke (1989). Se procedi como sigue: El sobrenadante de un cultivo de L. saLe 148, crecido en medio MRS, se concentr unas 20 veces.

De este concentrado se tom una alcuota de 0,5 ml que se verti en 5 ml de medio MRS o 1381 (dependiendo del microorganismo indicador utilizado) recin inoculado con un microorganismo indicador; la concentracin del inculo fu en todos los casos de unas 5 x u fc/ml.

Como microorganismos indicadores se emplearon los siguientes: L. fernentunz CECT285, L. curvarus CECT726, Car. diuergens LVI3, Leu. mesenteroides CECT394, L. monocytogenes NCTC5 105, L. monocwogenes LIS sv 1/2, L. nzonocyw genes Scott A, S.
typhinuriun

T91, Y.

enterocolihca

E20. S. aureus FRII3Y, S. aureus FR1361 y C.

botulinun CECT5S. C. pezfrin4elzs CECT3J6. Los cultivos se incubaron, a 32 0C o37 oc y en aerobiosis o anaerobiosis segn el microorganismo indicador, durante 5 h y, a continuacin, se hicieron los correspondientes recuentos microbianos depositando alcuotas de 100 tI de dicho cultivo en placas de MRS o EHI. Como control se realiz una experiencia similar en la que al microoraanismo indicador se le aadieron 0,5 ml del sobrenadante concentrado de un cultivo deL. saLe 23. microorganismo cuyo sobrenadante concentrado no mostraba ninguna actividad inhibidora detectable.

El mecanismo de accin de la suslancia antimicrobiana de L.sake 148 sera bactericida

SI SC

observase una disminucin de la viabilidad del microorganismo indicador y

bacteriosttica, si las ufc/ml del microor2anismo indicador permanecieran constantes respecto de su valor inicial.

108

MATERIALES Y MTODOS

Hl. 2. 11.- Concentracin inhibidora mfnima de la sustanca antimicrobiana en diversos microorganismos indicadores

Para determinar la concentracin inhibidora mnima (CIM), se prepar una solucin de la protena purificada en tampn de fosfato 4 mM, de pH 7,0 a una concentracin de 8 mg/mi; a continuacin se diluy 2, 4, 8 y 16 veces. De cada dilucin (1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16) se tomaron alcuotas de 30 tI cuya actividad antimicrobiana se evalu segn la tcnica descrita en a secin III. 2. 3. 3. 2. Los microorganismos indicadores empleados fueron L. ferrnentum CECT285, C. divergens LV 13, L. nbonocywgenes 7973, LIS sv 1/2 y Scott A, S. aureus FRI 137, FRI 349 y FRI 362, C. botulinuin 551 y C.pe;fringcns 376.

La concentracin inhibidora mnima (dM), se define como la concentracin mnima de protena que produce un halo de inhibicin en el medio slido de crecimiento del microorganismo indicador empleado. En este ensayo, nicamente se consideraron como halos dc inhibicin aqullos cuya corona circular tena un radio mayor de 1 mm.

III. 2. 12.

Mtodos inmunolgicos

III. 2. 12. 1. Obtencin de los inmunosueros

-

La ststancia responsable de la actividad inhibidora de L. saLe 148 (seccin hL 2. 8. 1), se emple para la inmunizacin de conejos con el fin de obtener los correspondientes inmunosueros portadores de anticuemos.

III. 2. 12. 1 1
.

Pauta (le i nfluni zaciil

(Domo animales de experinenlacin se empIcaron 2 conejos machos dc la raza New

109

MAIERIALES Y MTODOS

Zealand de 2,5-3 Kg de peso a los que se nocul la sustancia inhibidora parcialmente purificada. Depilada y desinfectada (con alcohol) la zona de inoculacin se inyectaron subcutneamente a los conejos, en ambos lados de la espina dorsal, comenzando por la zona ms proxima a la regin cervical. Como inculo se emplearon 1-4 mg del antgeno (sustancia inhibidora parcialmente purificada), emulsionados en una mezcla de 0,5 ml del Adyuvante Completo o Incompleto de Freund (Difco) y 1 ml de agua destilada estril; las inyecciones se llevaron a cabo durante un periodo de 91 das a intervalos de? das (tabla III. 3).

Antes de la primera inoculacin se realiz una sangra parcial inicial (S0), para comprobar la ausencia de reactividad de los animales frente a los antgenos utilizados. Asimismo a los 21, 42, 63, 84 y a los 91 das del proceso de inmunizacin y, con el fin de verificar la efectividad de dicho proceso, se realizaron sangras parciales (S, 52, 53 y 54).

En las sangrias parciales la sangre se obtuvo de la vena marginal de la oreja, segn el siguiente procedimiento: El animal se introduca en una caja, de la que sobresala la cabeza, para inmovilizarlo; la zona elegida de la oreja se frotaba con algodn empapado en xilol para producir una vasodilatacin que favoreciera la sangra y, a continuacin, se efectuaba una puncin con aguja o bien se seccionaba el vaso cuidadosamente con bistur, recogindose por goteo dc 5 a 10 ml desangre.

lii. 2. 2. 1. 2. SanEra final

-

Despus de anestesiado el animal por va intramuscu[ar con Keto!ar (clorhidrato de ketamina) a una dosis de 10 mg/kg de peso, se colocaba en una mesa en posicin de decbito supino y se inmovilizaba por las 4 extremidades.

Ho

MATERIALES Y MTODOS

Tabla III. 3.

Patita de inmunizacin de los conejos por inoculacin subcutnea de la sustancia con actividad antimicrobiana deL. sake 148

Adyuvante completo Das Exuacto antignico (mg) de Freund (m)

Adyuvante incompleto de Freund (m) Sangra

1 1 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Sf

sangra inicial

53

sangra parcial da 63 sangra parcial da 84

S~= sangra parcial da 21

=

sangra parcial da 42

Sf = sangra final da 91

111

MATERIALES YMETODOS

Una vez depilada y desinfectada perfectamente la zona cervical inferior, con el material quirrgico apropiado se practicaban las incisiones cutneas siguientes: a) longitudinal a lo largo de la lnea media ventral b) transversal a nivel de la segunda vertebra cervical c) transversal a nivel de la sexta vertebra cervical

A continuacin se disecan los msculos ventrales del cuello visibles en este rea: Ms. cleidomastoideus (parte del Ms. cleidocephalicus y ste a su vez del Ms. brac/iiocephalicus), Ms. sternornastoideus (parte del Ms. sternocephalicus), Ms. sternohyoideus y Ms.
sernothyroideus.

Por el borde lateral del Ms. sernothyoideus se diseca en profundidad hasta llegar al paquete vsculo-nervioso situado a uno y otro lado de la trquea (A. carotis cornunis, V. jugularis y Troncus vagosimpathicus). Se diseca la A. carotis comunis y con una pinza de tipo mosquito se fija el N. vagus, que contina unido al tronco vascular. De este modo al efectuar la seccin de la arteria se puede dirigir el flujo sanguneo a un tubo o recipiente donde se recoge la sangre.

Cuando disminuye el flujo de sangre, se recomienda aplicar un masaje cardiaco con el fin de conseguir el mayor volumen de sangre posible.De cada animal se recogieron de 120 a 150 ml de sangre cuando la sangra final se realizaba segn las normas sealadas.

III. 2. 12. 1. 3. Obtencin y conservacin del suero

-

La sangre obtenida se trasvasa lentamente a un tubo de centrfuga, a fin de evitar su hemlisis, y se centrifuga a 2.000 g durante 10 minutos. A continuacin, el coagulo formado se desprende de las paredes laterales con una esptula o aguja y el sobrenadante se recoge con

112

MATERIALES Y MEFODOS

una jeringa. En caso de requerirlo, el sobrenadante se centrifuga de nuevo. Una vez obtenido el suero se distribuye en fracciones dc 2 ml en viales, aadindoles una o dos gotas de una solucin de azida de sodio al 0,01 % que acta como agente conservador. El suero se mantiene en congelacin a -20 0C hasta su utilizacin posterior.

Iii. 2. 12. 2. Inmunodifusin en Leles de agarosa

-

Esta tcnica, que permite visualizar la interaccin entre antgenos y anticuerpos, se basa en su difusin por un medio semislido (agarosa). Si ambos se corresponden, se forma una lnea de precipitacin cuya posicin depender del coeficiente de difusin de los antgenos y anticuerpos, de sus respectivas concentraciones y del tiempo de reaccin.

En este trabajo se ha empleado la tcnica de inmunodifusin doble descrita por Ouchterlony (1949), que permite verificar el proceso de inmunizacin de los animales de experimentacin y la correspondencia inmunolgica entre los inmunosueros obtenidos y los extractos antignicos de inters.

Los extractos antignicos utilizados fueron el sobrenadante neutralizado y concentrado deL. sake 148 (seccin III. 2. 3. 3. 1.) y la sustancia responsable de su actividad inhibidora obtenida tal y como se describe en la seccin III. 2. 8.

III. 2. 12. 2. 1. Preparacin del gel

-

El gel se preparaba inmediatamente antes de usarlo, constaba de agarosa al 1% en solucin de cloruro sdico al 0,85% (Suero fisiolgico salino): se le adicionaba como agente conservador un 0,0 1% de azida de sodio. Para prepararlo, la solucin de agarosa en el suero salino se calentaba con agitacin hasta ebullicin, aadiendo a continuacin la solucin de

113

MATERIALES Y MTODOS

azida de sodio.

III. 2. 12. 2. 2. Preparacin de la ulacas de inmunodifusin

-

Se utilizaron portaobjetos de vidrio de 7.5 x 5 cm que se situaban sobre una mesa niveladora depositando sobre cada uno de ellos 6 ml de la solucin de agarosa caliente. Una vez solidificada la agarosa, con la ayuda de moldes metlicos de seccin circular, se realizaron excavaciones: una central, de 12 mm de dimetro y 6 perifricas, dispuestas en forma de roseta de 6 mm de dimetro que deistaban de la central 7 mm. Seguidamente, y con ayuda de una aguja, se retiraron cuidadosamente los discos de agarosa aadiendo a continuacin un par de gotas de agarosa fundida en el fondo de los pocillos formados y evitar as posibles anomalas en la difusin de los anticuemos.

III. 2. 12. 2. 3. Llenado de los pocillos e incubacin de las placas

-

Preparadas las placas de inmunodifusin se depositaron 150 tI del inmunosuero en el pocillo central y 50 tI de los extractos antignicos en los pocillos perifricos. A continuacin se colocaron en unas bandejas que se introdujeron en una cubeta que contena de 5 a 10 ml de una solucin de azida de sodio al 1%: de esta forma, adems de inhibir el crecimiento microbiano, se mantena la humedad de la cubeta que, por ltimo, se tapaba y se mantena durante 18-24 horas a 37 0C.

III. 2. 12. 2. 4.

Lavado y secado de los Leles

Una vez incubadas, las placas se lavaron en solucin salina al 0,85% durante 48 horas a temperatura ambiente; la solucin de lavado se cambi tres veces cada da y el ltimo lavado se realiz con agua destilada; la superficie de las placas se sec con una tira de papel de filtro

114

MATERIALES Y MTODOS

Whatman n9 1 procurando eliminar las burbujas de aire que se sitan entre el gel y el papel. Una vez seco el gel, el papel se desprende con facilidad de la superficie de la placa.

III. 2. 12. 2. 5. Tincin

-

Tuvo lugar sumergiendo los portaobjetos durante 2 horas en una solucin formada por 90 partes de metanol, 10 de cido actico y un gramo de negro amida 1013 (Merck). Posteriormente se lavan 30 minutos con una solucin de cido actico al 5%, tras lo cual el ltimo se arratra con lavados repetidos de agua destilada.

III. 2. 12. 3. Tcnicas inmunoenzimticas

-

III. 2. 12. 3. 1. Tcnica del ELISA indirecto

-

En este trabajo se han utilizado dos procedimientos diferentes del ELISA indirecto. El primero fu un ELISA indirecto clsico empleando un conjugado comercial de anticuerpos anti-IgG de conejo conjugados al enzima peroxidasa de rbano. En el segundo se utiliz un sistema de amplificacin biotina-avidina.

III. 2. 12. 3. 2. Tcnica del ELISA indirecto clsico

-

En esta tcnica los antgenos se inmovilizan por adsorcin pasiva en una superficie inerte; los anticuerpos especficos reconocen a sus correspondientes antgenos y el complejo formado lo detecta un segundo anticuerpo marcado con un enzima, que reconoce como antgenos a los anticuerpos anteriores. La reaccin es visible porque al actuar cl enzima sobre el sustrato se ibera un compuesto coloreado.

115

MATERIALES YMETODOS

a) Antgenos

Como antgenos se emplearon la actividad antimicrobianadeL. sake 148 parcialmente purificada (obtenida tal y como se describe en la seccin III. 2. 8. 1.) as como los sobrenadantes libres de clulas de L. sake 148 y de una cepa (L. sake 23), que no manifiesta ninguna actividad antimicrobiana detectable; en ambos su desarrollo se llev a cabo en MM-Triptosa y en MRS.

b) Anticuerpos

Se utiliz el inmunosuero total obtenido al inmunizar los conejos con la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada.

c) Coniugado

El conjugado utilizado fu uno comercial de anti-inmunoglobulinas de conejo, obtenidas en macho cabrio, y marcadas con el enzima peroxidasa de rbano (Nordic).

d) Tamuones y reactivos

1. Tampn PES. de oH 7.2

NaC KH-,P04
Na2HPO4 (12 H,O)

8,0 0.2 2,9

0,2

g g g g

KO

116

.LfATERIALES Y MTODOS

Agua destilada hasta

1000

ml

2. Tamnn PBST

Se prepara como el PES y se le aade un 5% de Tween 20.

3. Tampn de cido ctrico-fosfato de pH 3.9

a) Preparar una solucin de cido ctrico monohidratado 0dM disolviendo 21,01 g en 1.000 ml de agua destilada.

b) Preparar una solucin de Na9HPO4. O,2M, disolviendo 28.4 gen 1.000 mIde agua destilada.

c) Mezclar las dos soluciones hasta obtener un pH de 3,9.

4. Sustrato

Preparar una solucin de cido 2-2-azino-bis-3-etil benzotiazolina sulfnico (ABTS) (Sigma) en agua destilada a una concentracin de 15 mg/ml y despus preparar una mezcla de la siguiente composicin:
-

Solucin de AETS (15 mg/m) Tampn ctrico-fosfato, pH 3,9 H202 (30% en peso)

0.4 10.0 20.0

ml ml i-~

117

MATERIALES Y MEFODOS

5. Solucin de frenado

Fluoruro sdico (NaF) al 2% en agua destilada.

6. Solucin de tapizado

Gelatina al 1% en tampn PES

e) Metodolo2a del ELISA indirecto

Los pocillos dc las placas de ELISA (Costar 3590) se llenaron con 100 tI de una solucin de la sustancia inhibidora en tampn PBS, de pH 7,2 o con 100 tI de los sobrenadantes de los cultivos de inters. Las placas se incubaron durante una hora a 37 0C, tras lo cual se lavaron 5 veces con PEST para eliminarel exceso de antgeno no adsorbido en los pocillos.

Unavez secas las placas y. para tapizar las zonas del pocillo en las que no se hubiese adsorbido el antgeno, se aadieron a cada pocillo 200 tI de gelatina al 1% en PES, incubndose las placas durante una hora a 37 0C. Despus de lavadas otras cinco veces con PBST, se aadieron a los pocillos 100 tI de suero de conejo diluido en PBST; las placas se incubaron en un agitador de placas de ELISA durante una hora a temperatura ambiente.

Terminada la incubacin, se lavaron de nuevo cinco veces con PBST para eliminar los complejos antgeno-anticuerpo formados en la neutralizacin y los restos de anticuerpo que no hubieran reaccionado. Seguidamente se adicionaron a los pocillos 100 tI del conjugado anti-conejo diluido en PBST y, de nuevo, se incubaron las placas durante una hora a temperatura ambiente en el agitador.

lIS

MATERIALES Y MTODOS

Tras lavar las placas cinco veces con agua destilada para eliminar los restos de conjugado libre, se aadieron a cada pocillo 150 fl del sustrato y las placas se incubaron en el agitador durante 45 minutos a temperatura ambiente; inmediatamente se para la reaccin adicionando a cada pocillo 50 tI de NaF al 2%. El color verde de los pocillos se cuantific midiendo su absorbancia a 405 nm en un lector espectrofotomtrico de placas de ELISA.

Adems, en la prueba descrita se realizaban siempre los siguientes controles:

Control del anticuerpo: Antgeno + Gelatina + Conjugado + Sustrato.

Control del antgeno: Gelatina + Anticuerpo + Conjugado + Sustrato.

Control del conjugado: Conjugado + Sustrato.

Si en alguno de los controles se alcanzaba una A~5 mayor de 0,150, el experimento se consideraba nulo.

III. 2. 12. 3. 3.

Tcnica del ELISA indirecto utilizando el sistema de amplificacin biotina-avidina

Se diferencia de la tcnica anterior en que los anticuerpos procedentes de la inmunizacin de los conejos se conjugan con la biotina, y en que la deteccin del complejo antgeno-anticuerpo/biotina se realiza con un conjugado de avidina o de estreptavidina marcada con peroxidasa de rbano.

En los ltimos aos, se ha visto que el complejo avidina-biotina es un mediador muy til y verstil en una gran variedad de aplicaciones analticas, incluidas las tcnicas 119

MATERIALES YMEFODOS

inmunoenzimticas. El hecho de que en poco tiempo se haya generalizado su uso en campos muy diversos, se debe a la elevadsima afinidad (1015 M-1) de la avidina por la biotina y a la gran estabilidad de esta interaccin no covalente.

Utilizando las propiedades del complejo biotina-avidina, se pueden amplificar las reacciones inmunoenzimticas (ELISA). En este caso, los anticuerpos especficos de la reaccin se conjugan con la biotina (biotinizacin) y se detectan por un conjugado de avidina-enzima, en lugar de por las ant-inmunoglobulinas de la especie de la que procede el anticuerpo unido al enzima.

III. 2. 12. 3. 3. 1. - Biotinizacin de los anticuemos

Los inmunosueros procedentes de la inmunizacin de los conejos, deben sufrir un tratamiento previo antes de conjugarse a la biotina.

a.) Obtencin de los anticuerpos a partir del inmunosuero

1) Tampones y reactivos

a) Solucin saturada de Sulfato amnico

Se obtiene disolviendo 76,1 g de (NH

4)2504 en 100 ml de agua destilada, hasta que la

solucin precipUa. Momentos antes de su empleo, esta solucin se filtra a travs de un papel de 91 y su pH se ajusta a 7,4 con NaOH IN. filtro Whatman n

120

MATERIALES Y MTODOS

b) Tampn de PES. de nH 7.4

Obtenido tal y como se describe en la seccin 111.2. 12. 3. 2. d.) 1.)

Procedimiento

25 ml del suero procedente de los conejos inmunizados se centrifugaron a 3.000 g durante 30 minutos. Al sobrenadante obtenido se le aadi un volumen igual de solucin saturada de sulfato amnico y se dej reposar a 4 0C durante 12 h. Pasado este tiempo, se realiz una segunda centrifugacin a 3.000 g durante 30 minutos y el precipitado obtenido tras la eliminacin del sobrenadante se diluy en 12,5 ml de tampn PBS. Los anticuerpos asi obtenidos se dializaron frente a PES y se liofilizaron antes de su conjugacin con la biotina.

b.) Conjugacin de los anticuerpos purificados con la biotina

Los anticuerpos precipitados se conjugaron con el ster biotin amidocaproatoN-hidroxi-succinimida (Sigma), siguiendo la tcnica de Bonnard y col. (1984), pero con ligeras modificaciones. Se procedi como sigue:

1. Preparar una solucin del reactivo de biotina (1 mg/ml de dimetilsulfxido).

2. En el tampn PES de pH 7,2, preparar una solucin del anticuerpo precipitado (con una concentracin de, al menos, 1-3 mg/m).

3. Aadir la solucin de biotina a la del anticuerpo, en una relacin molar biotina/anticuerpo de 50/1.

121

MATERIALES YMETODOS

4. Incubar la mezcla durante 2 horas a temperatura ambiente.

5. Eliminar la biotina no reaccionante mediante dilisis de la mezcla frente al tampn

PBS (16ha40C).
6. Los anticuerpos conjugados se conservan en fracciones de 0,1 ml a -20 0C hasta el momento de su utilizacin.

III. 2. 12. 3. 3. 2

MetodoloEa del ELISA indirecto utilizando el sistema de amplificacin biotina-avidina

La tcnica sigue los mismos pasos y tiempos de incubacin que los descritos en el ELISA indirecto clsico (seccin III. 2. 12. 3. 2.), salvo que el conjugado empleado es uno comercial de Estreptavidina-peroxidasa de rbano (Sigma).

122

RESULTADOS

CAPITULO IV

RESULTADOS

123

RESULTADOS

IV. 1.

Evolucin de las bacterias lcticas durante la maduracin de un lote de embutidos crudos curados

Cuando se analiza la relacin entre carga microbiana total y carga de bacterias lcticas, durante la maduracin de un lote de embutidos se observa (Fig. 4.1) un rpido aumento del nmero de bacterias lcticas que alcanza su punto lgido hacia el sexto da de maduracin igualndose con el recuento microbiano total, lo que sugiere que casi la totalidad de los microorganismos de los embutidos crudos madurados pertenecen a este grupo. Los altos recuentos de bacterias lcticas se mantienen, prcticamente sin sufrir modificaciones, a lo largo de la maduracin de los embutidos.

IV. 2. -Actividad antimicrobiana de las bacterias lcticas seleccionadas

IV.2.1.- Actividad inhibidora directa

Como ya se ha descrito en la seccin 111.2.3.1 de este trabajo, durante la maduracin de un lote de embutidos crudos se aislaron 30 bacterias lcticas en los das 0, 2.6. 10, 21 y 35 de maduracin, de forma que al final del periodo madurativo se reunieron 180 bacterias cuya actividad antimicrobiana directa se estudi frente a diversos microorganismos indicadores. Les resultados de la prueba directa de antagonismo se reflejan en las figuras 4. 2 a 4. 5. De las mismas se deduce que la actividad inhibidora es distinta en cada cepa analizada, siendo significativamente mayor cuando las bacterias se incubaron en las placas 24 h antes de la incorporacin de los microorganismos indicadores.

124

RESULTADOS

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Das de maduracin

Figura 4. 1.- Evolucin de la flora microbiana total (O), y lctica (U) durante la maduracin de los embutidos crudos curados.

125

RESULTADOS

La actividad antimicrobiana de las 180 bacterias lcticas seleccionadas se determin empleando como microorganismos indicadores a Lactobacillusfern;entunz CECT285 (fig. 4. 2), L. planrarum CECT22l (fig. 4. 3), Staphylococcus aureus CECTS9 (fig. 4. 4) y Salmonella yphimuriunz CECT443 (fig. 4. 5). Los resultados obtenidos indican una mayor actividad inhibidora cuando las cepas seleccionadas se enfrentaron a otras bacterias lcticas, tanto cuando crecan simultneamente como cuando lo hacan 24 h antes de incorporales el indicador. Frente a las bacterias patgenas como 5. aureus y S. typhimuriunz no se aprecia una actividad inhibidora definida cuando se desarrollan simultneamente con ellas, lo que contrasta con lo que ocurre cuando las bacterias lcticas seleccionadas se desarrollan en las placas 24 h antes de la incorporacin del indicador.

Es de destacar la presencia de halos de inhibicin de bordes nitidos y definidos en algunas de las cepas evaluadas frente a L. fermenturn y L. plantarum. Estas cepas, que parecan poseer un mecanismo de inhibicin diferenciado de las dems, representan un 25 % de las analizadas y en las figuras se sealan con un asterisco.

De las 180 cepas estudiadas, se seleccionaron 20 que estaban dotadas de una manifiesta actividad antimicrobiana (halo de bordes ntidos) y 4 cuya actividad era menor. En las figuras 4. 6 a 4. 29 se muestra la actividad antimicrobiana de las 24 cepas frente a L. brevis LB826, L. carnis, L. curvalus LE726, L. diiergens MR375, L.farciminis LB34, L. sake LE684, Leu. mesenteroides MR364, M. iarians CECT23O, B. thermosphacta NCIB 10018, S.faecium CECT4lO, E. cok LE841, B. stearothermophylus CECf49, E. cloacae CECT149, 8. cereus CECTI48, Js.fluorescens DC7. Y. enerocolitica NC E20, S.flexnerii CECT58S, 5. faecalis CECT48I, L. monocytogenes Lllsv4, L.fermenum, L. plantarun>
typ/zimurium
CECT22I. 5.

CECT443 y 5. ~weus CECT59. Las actividades inhibidoras observadas son

similares a las reseadas antes y notablemente superiores cuando se emplean como indicadores otras bacterias lcticas.

126

RESULTADOS

La mayor parte de las 24 cepas analizadas poseen una actividad antimicrobiana directa claramente cuantificable frente a Y. enterocollca E20 y 5. yphiinuriunz CECT443 y. sobre todo, frente a 5. aureus CECT59 y L. monocyogenes LI lsv4, originando en los dos

ltimos indicadores halos de inhibicin definidos y de un dimetro apreciable, similares a los observados frente a las bacterias lcticas. No obstante, frente a otros indicadores, como 8.
cereus

CECTl48 y S.flexnerii CECT585, son pocas las cepas que ejercen accin inhibidora

definida.

127

RESULTADOS

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128

RESULTADOS

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RESULTADOS

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130

RESULTADOS

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131

RESULTADOS

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133

RESULTADOS

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134

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136

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137

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138

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Figura 4. 5(y VI).- Actividad inhibidora de las 180 bacterias lcticas seleccionadas frente a 5. ryphimuriunz CECT443. Las columnas poseen el mismo significado que en la figura 4. 2(1). 139

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Figura 4. 6.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lcticas seleccionadas frente a L. brevis L8826. Las columnas poseen el mismo significado que en la figura 4. 2(I).
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Figura 4. 7.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lcticas seleccionadas frente a L. carnis MR3Y 1. Las columnas poseen el mismo significado que en a figura 4 2(1).

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Actividad inhibidora de 24 bacterias lcticas seleccionadas frente a L. farcirninis L1334. Las columnas poseen el mismo significado que en la figura 4. 2(I).

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Figura 4. II.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lcticas seleccionadas frente aL. sake L8684. Las columnas poseen el mismo significado que en la figura 4. 2(1).

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Figura 4. 12.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lcticas seleccionadas frente a Leu. rnesenteroides MR364. Las columnas poseen el mismo significado que en la figura 4. 2(1).
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Figura 4. 13.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lcticas seleccionadas frente a M. varians CECT23O. Las columnas poseen el mismo significado que en la figura 4. 2(1).

143

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Figura 4. 14.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lcticas seleccionadas frente a B. tern2osp harto NCIB 10018. Las columnas poseen el mismo significado que en la figura 4. 2(I).
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Figura 4. 15< Actividad inhibidora de 24 bacterias Jcticas seleccionadas frente a S. xdosus CECT237. Las columnas poseen el mismo significado que en la figura 4. 2(1).

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Figura 4. 16.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lcticas seleccionadas frente a S. faecium CECT4IO. Las columnas poseen el mismo siEnificado que en la figura 4. 2(I).
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Figura 4. 17.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lcticas seleccionadas frente a E. ccli LB841. Las columnas poseen el mismo significado que en la figura 4.
2(1).

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Figura 4. 29.- Actividad inhibidora de 24 bacterias lcticas seleccionadas frente a S. aureus CECT59. Las columnas poseen el mismo significado que en la figura 4. 2(1).

151

RESULTADOS

IV. 2. 2.

Actividad inhibidora de los sobrenadantes de cultivos libres de clulas

En la tabla IV. 1 se muestra la actividad antimicrobiana de los sobrenadantes de cultivos libres de clulas de las 24 cepas previamente descritas despus de filtrados, neutralizados y concentrados siguiendo el procedimiento descrito en la seccin 111. 2. 3. 3. Como se observa, algunos presentan una actividad notable frente a ciertos microorganismos indicadores, sobre todo frente a otras bacterias lcticas. Es digno de mencin que los sobrenadantes de las cepas 148 y 180 presenten una notable actividad frente a L. nzonocytogenes. No obstante, frente a otros indicadores carecen de actividad inhibidora detectable, lo que significa que, o bien stos son insensibles a dicha actividad, o bien que la concentracin de la sustancia inhibidora es demasiado pequea para detectarse con esta tcnica.

IV. 2. 3.

Efecto de la catalasa en la actividad inhibidora de las bacterias lcticas seleccionadas

Ya se ha descrito que el perxido de hidrgeno (H,O,), producido por algunas bacterias lcticas, inhibe el crecimiento de otras bacterias. Sin embargo, el tratamiento con 130 UY/ml de catalasa de los sobrenadantes de los cultivos libres de clulas con actividad inhibidora no disminuye dicha actividad (no se muestran los resultados). As pues, una vez comprobado que, ni la acidez, ni la sntesis de H,02, ni la presencia de bacterifagos estaban involucrados en la actividad antimicrobiana de las cepas estudiadas, se pens que stas quizs sinteticen otros compuestos activos de bajo peso molecular y/o bacteriocinas. Por ello sc procedi a la identificacin y caracterizacin bioqumica parcial de aquellas cepas cuyos sobrenadarnes libres de clulas, una vez concennados, manifestaban la mxima actividad antimicrobiana

152

RESULTADOS

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1.53

RESULTADOS

IV. 3.

Identificacin y caracterizacin bioqumica parcial de las bacterias lcticas seleccionadas nor su actividad antimicrobiana

Las seis bacterias lcticas cuyos sobrenadantes concentrados libres de clulas manifestaron la mxima actividad antimicrobiana, se sometieron a la mayora de las pruebas recomendadas por Schillinger y Lcke (1987b), reseadas en la seccin III. 2. 4., para la identificacin rpida de las bacterias lcticas procedentes de la carne y productos crnicos. Las cepas seleccionadas fueron las correspondientes a los nmeros 31, 77, 90, 148. 177 y 180.

IV.

3.

1. Morfologa
-

tincin por el mtodo de Gram

La obseivacin microscpica de las cepas seleccionadas, teidas con el mtodo de Gram, evidencia una moifologa de bacilos cortos Grarn positivos (tabla IV. 2).

IV.

3.

2. Prueba de la catalasa
-

Todas las cepas analizadas fueron catalasa negativas (tabla IV. 2>

IV. 3.

3.

Produccin de CO, a partir de glucosa

La capacidad de las cepas analizadas de producir CO,, se investig como se describe en La seccin 111. 2. 4. 3. Ninguna de las cepas seleccionadas produjo dicho gas (tabla IV. 2).

IV.

3.

4.

Hidrlisis de la arginina

Los resultados de la prueba de hidrlisis de la arginina se muestran en la tabla IV. 2,

154

RESULTADOS

no observndose una respuesta uniforme en las diferentes cepas seleccionadas. Dicha respuesta vara desde la reaccin negativa de las cepas 31,77,90 ylSO, hasta la positiva de las cepas 148 y 177.

IV. 3. 5. - Produccin de cido sulfhdrico

La realizacin de las tcnicas descritas en la seccin III. 2 4. 5.. no evidenci, en nign caso, la produccin de cido sulfhdrico por ninguna de las cepas analizadas (tabla IV. 2).

IV. 3. 6

Prueba de Voges-ProskaUer

La produccin de acetona por las cepas seleccionadas se evalu mediante la prueba de Voges-Proskaer (seccin III. 2. 4. 6.). Los resultados obtenidos se muestran en la tabla IV. 2; de ellos se deduce que todas las cepas producen acetoina en cantidades mayores (cepas 77 y 90) o menores (cepas 31, 177 y 180). Sin embargo, la cepa 148 fu negativa en esta prueba.

IV. 3. 7. Fermentacin de carbohidratos

-

La capacidad fermentativa de carbohidratos de las cepas seleccionadas se evalu siguiendo el procedimiento descrito en la seccin III. 2. 4. 7. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla IV. 3. De ellos se deduce que:

1.) Todas la cepas analizadas fermentan la ribosa, galactosa. D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, N-acetil glucosamina. escualina, melibiosa, sacarosa, trealosa y gluconato.

2.) La fermentacin de los azcares Larabinosa, a-metil D-Qlucsido, Dturanosa,

155

RESULTADOS

salicilina, maltosa, lactosa, D-rafinosa, celobiosa y 2 ceto-gluconato es variable dependiendo de las cepas analizadas. As, mientras la cepa 177 es la nica que fermenta la L-arabinosa, a-metil D-glucsido y D-turanosa, todas, con excepcin de la 77, utilizan la salicilina. La maltosa es fermentada por las cepas 31, 77 y 177 y la lactosa por las cepas 90, 148. 177 y 180. Las cepas 31, 77 y 177 utilizan la D-rafrnosa, mientras que la 148 y 177 fermentan el 2-cetogluconato. La celobiosa slo es dbilmente fermentada por la cepa 180.

3.) Ninguna de las cepas analizadas fermenta el glicerol, eritritol, D-arabinosa, D-xilosa, L-xilosa, adonitol, 3-metil xilsido, L-sorbosa, ramnosa, dulcitol, inositol, manitol, sorbitol, a-met mansido, amigdalina. arbutina, inulina, melizitosa, almidn, glucgeno. xilitol, 3-gentibiosa, D-lixosa, D-tagatosa, D-fucosa, L-fucosa, D-arabitol, L-arabitol y 5 ceto-gluconato.

La fermentacin de los azcares manitol, ribosa, melibiosa, manosa, sacarosa y trehalosa, es de gran importancia en la clasificacin de los lactobacillos de origen crnico. Con los resultados obtenidos y siguiendo el esquema de identificacin propuesto por Sehillinger y Lcke (1987b), todas las bacterias lcticas analizadas se clasificaron tentativamente como Lactobacillus sake.

IV.

3. 8. Tolerancia al clomro sdico

-

En la tabla IV.2 se muestra el desarrollo de las bacterias lcticas seleccionadas en medio MRS suplementado con un 7 o un 10% de NaC, incubado a 32 0C durante un tiempo mximo de 6 dias. Todas las cepas seleccionadas, salvo la 77, crecen a una concentracin de NaC del 7%. sin embargo, ninguna manifiesta desarrollo mensurable cuando la concentracin de NaC se eleva al 10%.

156

RESULTADOS

IV. 3. 9. Tolerancia al pH de 3.9

-

Ninguna cepa se desarrolla en el medio MRS a pH de 3,9 (ajustado con HCI, IN) (tabla IV. 2)

IV. 3. 10. Crecimiento a diversas temperaturas

-

Las temperaturas a las que las bacterias lcticas se desarrollan son tambin importantes en el esquema de identificacin de Schillinger y Liicke (1987b). En la seccin III. 2. 4. 10 se describe la metodologa seguida para estudiar el crecimiento bacteriano a las temperaturas de 4, 15 y 45 0C, cuyos resultados se recogen en la tabla IV. 2. Todas las cepas seleccionadas se desarrollan a 4 y 15 0C, pero a 45 C nicamente lo hacen las cepas 148 y 177.

157

RESULTADOS

Tabla IV. 2.- Caractersticas morfolgicas y bioqumicas de las bacterias lcticas seleccionadas

Cepa N~ Caracterstica 31
77

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148

177

180

Morfologa Tincin Gram Catalasa Produccin de CO, Hidrlisis de la arginina Produccin SR2 Voges-ProskaUer Crecimiento en

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158

RESULTADOS

Tabla IV. 3.

Utilizacin de los carbohidratos por las bacterias lcticas seleccionadas

Cepa N9 Carbohidrato 31 77 90 148 177 180

Glicerol Eritritol Darabinosa L-arabinosa Ribosa D-xilosa L-xilosa Adonitol 3-metil-xilosido Galactosa D-Glucosa D-Fructosa DManosa L-Sorbosa Ramnosa Dulcitol Inositol
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159

RESULTADOS

Tabla IV. 3. (continuacin)

-

Cepa N9 Carbohidrato 31 77 90 148 177 180

Manitol Sorbitol a-metil Dmanosido a-metil D-glucosido N-acetil glucosarnina Amigdalina Arbutina Escualina Salicilina Celobiosa Maltosa Lactosa Melibiosa Sacarosa Trealosa Inulina D-rafinosa Almidn

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160

RESULTADOS

Tabla IV. 3.

(continuacin ..y 2)

Cepa N2 Carbohidrato 31
77 90 148 177

180

Glucgeno Xilitol 3-gentobiosa D-turanosa D-lixosa D-tagatosa D-fucosa L-fucosa 0-arabitol L-arabitol Gluconaro
2 ceto-gluconato

-.

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-

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+
-

5 ceto-gluconato

161

RESULTADOS

IV. 4.- Esoectro antimicrobiano de la sustancia inhibidora exocelular de las ceoas de L. saLe 77. 90. 148
y

180

Una vez caracterizadas bioquimicamene las seis bacterias lcticas de inters, en cuatro de ellas se evalu de nuevo la actividad inhibidora de sus sobrenadantes concentrados libres de clulas frente a un numero mayor y ms diverso de bacterias alterantes y patgenas. Con la metodologa sealada en la seccin 111. 2. 5 (tabla IV. 4) se observ que los sobrenadantes concentrados de las 4 cepas de L. saLe analizadas eran activos frente a cepas de L. brevis, L. curvatus, Carnobacteriurn di~ergens, Leu. nesenreroides, S. auieus, C botulinun,, C. pe,f,ingens y L. rnonocvtogenes.

La actividad inhibidora de las cepas estudiadas variaba no solo desde el punto de vista cuantitativo sino tambin cualitativo. As por ejemplo, el sobrenadante deL. saLe 148 fu el nico que se mostr activo frente a todas las cepas de L. monocytogenes estudiadas, adems fu tambin el nico que inhiba el desarrollo de las cepas CECT5 105 y Scott-A.

La magnitud de la actividad inhibidora, cuando sta exista, tambin fu distinta en cada cepa ensayada siendo, en general, el sobrenadante de L. saLe 148 el ms potente, si se excepta aL. saLe 180 cuya capacidad de inhibir a S. aureus FR1137 o L. nzonocytogenes LIS sv 1/2 era mayor. Sin embargo, no se inhibi ninguna de las bacterias Grarn-negativas ensayadas, entre las que se incluan microorganismos potencialmente productores de toxiinfecciones alimentarias como Salmonella yphirnurwn y Ye,sinia enterocoltica.

162

RESULTADOS

Tabla IV. 4.- Espectro antimicrobiano de las cepas de Lactobadillus saLe seleccionadas

Inhibicin por el sobrenadante concentrado de la cepa de L. sa/ce & Microoganismo Origena 77 90 148 180

Bacterias Gram-positivas Lactobacillus acdophilus

Loctobacillusbreiis Loctobacillus ccn-ns

289 Lb289 Lv6l

CEC IMTH FRIB CEC IMTH ERIE CECT CEC CEC IMTH CEC CEC CEC CEC CEC CECT CEC CEC
NCI B

O 16,8 O O 4,2 17 19,4 O O O O O O O O 0 O O 0 O 0

O 15 O O 15,6 17 17,4 O O O O O O O O 0 O O 0 8.4 8.8

0 20,4 O O
17,2

0 12 O O
13,8

Lactobacillus casei 475 Lactobaci/lus curvatus Lb726 Ca,-nobacteriun; divergeus Lv 13 Lactobacillusfernientuni 285 Lactobacillus mesentericus 394 Lactobacilius plantauni 221 Loctobacillus saLe Lb68 Leuconostoc mescnw,odes 394
Micrococcus iarians
Staphy/ococcus riJosas

21,6 23,8 O O O O O O O O 0 O O
(1

13 14 O O O O O O O 1) 0 O O
0

230

237
481 184

Sireptococcusfaecalis Strepbococcusfaecalis

(var. Iicuejhcens)
Streptococcusfaciuni

410 Bacillus steaoemophilus 49

BacH/as cen~us

Bochoh,Lv the-nmosplacu- Swp/oIwoccus ameus Staphylococcus am-cus

148 1001 8 1 37 361

FR 1 FRI

9 9,2

10 8

163

RESULTADOS

Tabla IV. 4.- (continuacin)

Inhibicin por el sobrenadante concentrado de la cepa deL. sake n9 Microoganismo Origena 77 90 148 180

Listeria nzonocyrogenes Listeria rnonocytogenes Listeria rnonocytogenes Listeiia rnonocytogenes Listeiia nhonocytogenes Clostridium botulinum Clostridium pe,fringens

5105 7973 LIS sv 1/2 LI sv4 Scott A

551

NCC NCC FVM FVM FVM CEC CEC

o
9
17,2

o
9,6 9,6

14,2
17

o
lo 19,4 9 0 10,2 10,6

9 0 0 11,4

o o 9,4
10

17 17
15,2 9,8 15

376

Bacterias Gram-negativas

Ente,obacter cloacac 194 Escherichia cok BW545 Escherichia coli enteropatogenica B4 1 Salmonella yphi 409 Salmon ella iyphinwrium T91 Pseudornonasfluorescens DC5 Pseudonzonas fluorescens DC? Pseudomonas fluorescens NTI9 Ye,sinia enterocolitica Yersinia enterocolitica
E20

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O

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o o o o

o o

a Abreviaturas como en tabla III. 1 b Actividad inhibidora expresada corno dimetro de halo de inhibicin en mm.

164

RESULTADOS

De los resultados obtenidos se desprende que:

1). Las sustancias inhibidoras producidas por las cepas deL .sake seleccionadas son distintas, ya que varan tanto en su espectro antimicrobiano como en la magnitud de su inhibicin.

2). La sensibilidad de los distintos microorganismos indicadores frente a las sustancias inhibidoras vara de acuerdo con la especie y cepa utilizada, de donde se desprende que la cepa productora no slo origina una sustancia inhibidora especfica, sino que la sensibilidad frente a dicha actividad del microorganismo indicador empleado depende adems de la especie tambin de la cepa.

3). La actividad inhibidora de L. sa/ce 148 fu superior a la del resto de las cepas estudiadas, por lo que se seleccion dicho microorganismo para la realizacin de estudios posteriores.

IV. 5.

Efecto de la comnosicin del medio de cultivo en la actividad antimicrobiana de Loctobacillus sa/ce

148

El medio MRS, que se emplea generalernente para el desarzollo de las bacterias lcticas es muy rico en sustancias proteicas por lo que dificultara la purificacin de las sustancias proteicas antimicrobianas. Consecuentemente, la actividad inhibidora de L. saLe 148 se deteimin en otros medios de cultivo, unos complejos y otros ms definidos, de acuerdo con la metodologa descrita en la seccin III. 2. 6. La actividad inhibidora de los sobrenadantes concentrados de los cultivos libres de clulas se compar con la correspondiente de L saLe 1 4S crecido en medio MRS (tabla IV. 5).

165

RESULTADOS

Tabla IV. 5.

Actividad antimicrobiana de L. saLe 148 desarrollado a 32 0C en diversos medios de cultivo

Medio de cultivo

Actividad inhibidora a

MRS
ART

++

ART + Triptosa APT + Proteosa peptona API + Extracto de carne

++
++ ++

API + Peptona
BHI BHI + Triptosa

++

BHI + Proteosa peptona

BHI + Extracto de carne

BHI + Peptona

MM MM MM MM MM MM

+ + + +

Triptosa Proteosa peptona Extracto de carne

++ + ++ +

Peptona + Trptona + Casitona

++,

a Smbolos para el ensayo de difusin en agar: mm);

+,

Dimetro de inhibicin grande (15-21

Dimetro de inhibicin pequeo (<15 mm); -.Sin inhibicin.

166

RESULTADOS

Los resultados de la tabla IV. 5. indican que los medios de cultivo APT y EHI (suplementado o no) no son adecuados para que se exprese la actividad antinicrobiana de L. saLe 148. Lo mismo ocurre con el medio base (MM), suplementado con triptona o casitona, (hidrolizados proteicos derivados de la caseina). Sin embargo, la actividad inhibidora es cuantificable cuando el microorganismo se cultiva en medio complejo de APT o en medio base MM, suplementados con tripbosa, proteosa-peptona, peptona o extracto de carne (todos ellos son hidrolizados proteicos de origen crnico>. La actividad inhibidora de en el medio base suplementado con triptosa (MM-triptosa), es similar a la obtenida en el medio MRS. Dado que la triptosa es, como se ha dicho, un hidrolizado proteico crnico que contiene, fundamentalmente, aminocidos y pptidos pequeos lo que facilita la purificacin de la sustancia antimicrobiana deL, saLe 148.

IV. 6.- Parmetros cinticos y actividad inhibidora de L saLe 148 a distintas temperaturas

IV. 6. 1.- Crecimiento actividad antimicrobianadeL. saLe 148

y

En las figuras 4,30 a 4,34 se muestra la relacin entre crecimiento y actividad antimicrobiana de L. saLe 148, al desarrollarse en los medios MRS y MM-triptosa a diversas temperaturas. De los resultados obtenidos se deduce que:

1.) L. saLe 148 manifiesta un crecimiento cuantificable a 4, 8, 16, 25 y 32 0C. si bien el desanollo es mayor a 25 y 32 oc.

167

RESULTADOS

300
-5-. .4--a

600 500
Cd

250

o
1~ CC

o Cd o

200

400

150
Cd
u

300

<fi

Cd o

loo
50

200

.0
LI

Cd

~z u

.0

CC

loo
O

lo

15

20
Tiempo (das)

25

30

300

600 500
Cd
1.,

250

o
CC

e Cd o

4>

200

400

150
Cd u

300

<fi

Cd o

E E

Cd .0
1~

loo
50

200

~Z

O CC .0

loo
.2.

0 20
Tiempo (das)

lo

15

25

30

Figura 4. 30.- Crecimiento ~o) y actividad antimicrobiana (u) de Lacmobacillus saLe 148 cultivado en los medios MRS (A) y MM-triptosa (B) a 4 oc.

168

RESULTADOS

300 250

600 500
Cd 1O

4>

CC

e Cd o

4>

200

400

150
Cd e Cd .0 1~ o u, .0
u

300

-o
Cd o

E
fi-fi

E
e

loo
50

200

~z u

loo o

8
Tiempo (das)

10

12

300
-5-1 ~1

B
-

600 500
Cd
1-

e>

250

O
CC

o Cd o e
Cd

4>

200

400

o 150

e e

300 -o
200

e-fi

Cd o
;1.

e Cd .0 .0
CC

loo
50
-

z u

1-

~1

loo o

o. o

.1.

8
Tiempo (das)

lo

12

Figura 4. 31.- Crecimiento ~o) y actividad antimicrobiana (M~ de

Locwbacillus

saLe

148 cultivado en los medios MRS (A) y MM-triptosa (8) a

8 0C.

169

RESULTADOS

300
4--a

60<) 500
Cd

-4-a

4>

250

CC

o Cd o e
Cd

e>

200

o o 400 ~
e e

1-.

150
u e Cd .0

300 -o
Cd
200

4+1

loo
50

z u

CC

.0

loo
50 60 70 80o

o0

10

20

30

40

Tiempo (horas)

300
-44-a

B
E

600 500
Cd

e>

250

u,

o
200 -

o Cd o e
Cd

a)

400
e e

150
ca

300 ~
Cd

4+.

e
.0
fi-

E E

Cd

loo
50
-

200 z u

o
ti

.0

loo o

o
O lO 20 30

40

50

60

70

80

Tiempo (horas)

Figura 4. 32.- Crecimiento (O) y actividad antimicrobiana (U) de L saLe 148 cultivado en los fifledios MRS (A) y MM-triptosa (II) a 16 0C.

170

RESULTADOS

300

600 500
Cd
1-.

e>

250

CC e>

o
200

400
e e

Cd

150

3041) o
Cd o
200

e-fi

Cd ca e Cd .0
1~

E E

loo
50

~-z ca

.0

CC

loo
6 12 18 24 30 36

oo

Tiempo (horas)

300

600 500
Cd O
1-.

-5-1

4>

~50

0 Cd e

CC e>

200

400

e e
150 300 ~
4+-fi

Cd ca e Cd .0
1-

Cd

E E

loo 50 oo
6 12 18 24 30 36

200 10<)

1= U

.0

CC

Tiempo (horas)

Figura 4. 33.- Crecimiento (o) y actividad antimicrobiana (u) de Lacrobacillus saLe 148 cultivado en los medios MRS (A) y MMtriptosa
0C. 25

(II)

171

RESULTADOS

300
.5--a

600 500
Cd
1-

a)

250
200

CC

o Cd o e
Cd

e>

400 ~
e e

150
ca e Cd .0 o u, .0

300 c
Cd o

Cx.

loo
50

200 -z ca

loo
6 12

o0

18

24

30

36

42

48 o

Tiempo (horas)

300
250

600 500
Cd o
1-

4>

u,

o Cd
o

a)

200 150

400
.0

e Cd ca e Cd .0
1-

300 ~
Cd o
200

rl

loo
50

E E

ca

.0

o u,

loo
6 12 18 24 30 36 42 48

o0

Tiempo (horas)

Ligura 4. 34.- Crecimiento (o) y actividad antimicrobiana (u> de

sa/ce 148 cultivado en los medios MRS (A) y MM-triptosa (B) a 32 0C.
Lactobacillus

172

RESULTADOS

2.) Dentro de una misma temperatura, el desarrollo ptimo se alcanza en el medio

M RS.

3.) A las temperaturas de incubacin empleadas, la actividad antiinicrobiana se detect poco despus de iniciarse la fase logartmica de crecimiento. Por tanto, la actividad antimicrobiana de esta cepa es una propiedad ligada al desarrollo celular, siendo detectable y cuantificable durante su crecimiento en un medio base o mnimo, suplementado con triptosa.

4.) Tanto en el medio MRS como en el MM-triptosa, la actividad antimicrobiana fu mxima cuando L. saLe 148 se cultivaba a 32 0C, no obstante, la actividad fu siempre mayor en el niedio complelo MRS. La actividad mxima a esta temperatura se detecta a las 16 horas de crecimiento; posteriormente se observaba un ligero descenso hasta el final de la incubacin.

IV. 6. 2. Parmetros cinticos del crecimiento microbiano

-

Los parmetros cinticos estudiados en L. saLe 148 cultivado en los medios MRS y MM-triptosa a 4, 8, 16, 25 y 32 0C, fueron los siguientes; velocidad especfica de crecimiento
(gt),

tiempo de duplicacin celular (td), nmero de generaciones por llora (g/h) y peso celular

seco final (mg/m).

Los parmetros citados, as como el pH y la actividad antimicrobiana final se muestran en la tabla IV. 6. De ella se deduce que:

1.) La velocidad especfica de crecimiento y el nmero de generaciones/tora fu mayor y, consiguientemente, el tiempo de duplicacin menor, cuando L.sake 48 se desarrollaba a 25 y 32 0C. El crecimiento fu ligeramente inferior cuando el medio empleado era el MM-triptosa.

173

RESULTADOS

Tabla IV. 6.

Parmetros cinticos de crecimiento, pH final y actividad inhibidora de Loctobacillus saLe 148, cultivado en los medios MRS y MM-triptosa a diferentes temperaturas

Parmetro (a)

Medio

Temperatura de incubacin (0C)

4
M RS MM-triptosa td MRS MM-triptosa MRS MM-triptosa pcs MRS MM-triptosa M RS MM-rriptosa MRS MM-triptosa
MRS

16

25

32

0,001 0,001.

0,006 0,005

0,035 0,035 19,2

19,8

0,075 0,073 9,2 9,9 0.108 0,100

1,25

0,093 0,087 7,4 7,9 0,130 0,120 1,34

1,28

563 700

108

137 0,009 0,007

0,89 0,87

0.002 0,00 1
0,82

0,050 0,050 1,14

1,15

0,83 5,4 5,2 137 101 0,8 0,8

1,20 4,5 4.3

541)3 502

pH

5,2 4,8 160 101 0.9 0,6

4,9
4,4

4,5

4,3 513 485 1,9

2,2

Al

170 108

AlE

0,7 0,5

1,9
2.2

MM-tri ptosa

(a) ~, velocidad especfica de crecimiento (h~ 1); td, tiempo de duplicacin (h), g/h, generaciones/hora; pcs, peso celular seco (ng/m): pH, pH final: Al y AlE, actividad inhibidora del sobrenadante (inn2/ml) y actividad inhibidora especfica del mismo (min2/rnl/Unidad Klemt)

174

RESULTADOS

2.) El peso celular seco final fu mayor a 32 0C. Con el medio de MM-triptosa se

obtena un peso celular ligramente inferior.

3.) El pH final fu ms bajo a las temperaturas ptimas de crecimiento, siendo menor que el obtenido cuando el medio de cultivo empleado era el de MM-triptosa.

4.) La actividad inhibidora mxima se alcanz a los 32 0C en el medio MRS, sin embargo. la actividad inhibidora especfica, es decir, el cociente de dividir la actividad inhibidora mxima por la absorbancia del cultivo (Unidades Klett), fu igual a 25 y 32 0C y ligeramente stiperior en el medio de MM-triptosa.

IV. 7. - Purificacin parcial de la actividad antimicrobiana exocelular deL. sa/ce 148

Conocidas las condiciones ptimas de produccin de la sustancia antimicrobiana exocelular de L.

scA-e

148 en medio semisinttico de MM-triptosa, se procedi a su

purificacin por cromatografa de filtracin en geles.

IV. 7. 1. Cromatoizrafia de filtracin en Sephadex G- 150. 0-75 y G-50

-

El sobrenadante concentrado libre de clulas de Lsake 148, obtenido como se describe en la seccin 111.2. 3. 3. 1. se purific parcialmente en columnas de Sephadex 0-150 fino, 0-75 y G-50 de la manera descrita en la seccin 111.2. 8. de este trabajo. El resultado de sta purificacin se refleja en las figuras 4.35, 4. 36 y 4. 37, en las que se muestra la actividad antirnicrobiana y la absorbancia de las fracciones eluidas. Al pasar el sobrenadante concentrado por la columna de Sephadex 0-150 fino (figura 4. 35), la actividad antiuicrobiana eluye tardiarnente aunque antes de que aparezca el ~ mayor de la absorbancia. Dado que este pico coincide con el volumen de eiucin de Ja columna

175

RESULTADOS

se supone que el peso molecular de la sustancia antimicrobiana se encuentra muy prximo al lmite inferior de exclusin del Sephadex G-150 fino, que es de unos 5.000 daltons. Para obtener una mejor separacin, las fracciones con mayor actividad antimicrobiana se juntaron y liofilizaron, volvindolas a pasar por una columna de Sephadex G-75.

El resultado de la segunda filtracin se observa en la figura 4. 36, aprecindose 2 picos de absorbancia mxima no bien definidos. El primero de ellos, ms pequeo, coincide con el de la actividad inhibidora, mientras que el segundo coincide con el volumen de elucin de la columna. La actividad inhibidora queda, por tanto, retenida en la columna. Sin embargo. Ja capacidad de separacin de sta columna es muy amplia (3.000 - 80.000 Da) por lo que, para obtener la mayor separacin posible por cromatografa de filtracin, se recurri a una tercera columna con un intervalo de separacin entre 1.500 y 30.000 Da. De nuevo, las fracciones con mayor actividad inhibidora procedentes de la segunda columna se juntaron y liofilizaron, pasndolas a continuacin por una columna de Sephadex G-50.

Los resultados obtenidos con la columna de Sephadex G-50 se reflejan en la figura 4. 37, en la que se observa que el pico de actividad se corresponde con el de absorbancia mxima.

176

RESULTADOS

(1~w ~unu) eiopqqu~ PCP1I13V

o o o
O

o o o
o o
fifl

o
en

o o o

o o o e]

o o o CD el
-e
.0
4,

s o

Cd

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O

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00
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1-

e e o ca ca Cd

4,

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O

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Cd

o o
oc

o
SO

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4
wu

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E EI3UCtJJOSq~

177

RESULTADOS

<-

fUI ZWW)

t?aOpiqiqu~ PEP!AQ3V

o O o
o

CD
~-

o
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0. ~5 Cd o te

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Cd

0~.-

O SO
Lfl

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O O en O el O

en

4
2)
WLi

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Ei3uEqJosq~

u-

178

RESULTADOS

~.

w~ww)

esopqqu~ PP!A!PV

O O O

O
O Sr O O

O O
en

O O
O Sr

O O
O oc~ -t
ce O) en
O,
O)

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O O O

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O SO
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LI,

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Cd

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Cd

el
Cd e->

O,

O Cd .0 o
i.fl

~
Cd

o-,
UO

en

el

en

-f
-It

ttiu

Ii

2) u-.

179

RESULTADOS

La purificacin de la actividad antimicrobiana exocelular de L. saLe 148 se muestra en la tabla IV. 7, en la que se detalla el grado de purificacin y porcentaje de recuperacin para cada una de las etapas. La purificacin final fu de 6,7, con una recuperacin de la actividad antimicrobiana del 8
%.

180

RESULTADOS

Tabla IV.?. - Purificacin pai-cial de la actividad antimicrobiana de Lactobaciflus sa/ce 148

Volumen (m)

Actividad Actividad Actividad Inhibidora Protena Inhibidora Actividad Grado de Inhibidora Total Total Especfica Recuperad-a Purificacin 2/nil) (cm2) (mg/mi) (cin2/ml) (%) (veces) (cm

Sobrenadante del cultivo libre de clulas 500 Sephadex G-150 Sephadex 413-75 Sephadex G-50

6,5

3.267

10

0,6

100

17

148,5

2.525

50

2,9

77

4,5

111,6

670

25,9

2,2

21

3,2

88,3

265

30

4,4

6,7

La purificacin se calcula corno la Actividad inhibidora especfica de la fraccin X/Actividad inhibidora especfica fraccin 1. La recuperacin se calcula como la Actividad inhibidora de la fraccin X/Actividad inhibidora de la fraccin 1 multiplicado por 100.

181

RESULTADOS

IV. 8.

Caracterizacin parcial de la actividad antimicrobiana de Lactobacillus saLe 148

IV. 8. 1.

Efecto de diversos enzimas en la actividad inhibidora

Para determinar la sensibilidad de la actividad antimicrobiana parcialmente purificada a los enzimas proteolticos, lipolticos y amiloliticos, se realiz el ensayo descrito en la seccin III. 2. 9. 2. Los resultados obtenidos se observan en la Tabla IV. 8, de la que se deduce que:

1.)

La actividad antimicrobiana de L. saLe 148 es destruida por los enzimas

proteolfticos inespecficos papaina, proteasa XIV y proteasa II. Otros enzimas proteoliticos, como la tripsina y pepsina, reducen la actividad antimicrobiana en un 92 % tras 12 horas de incubacin a 32 0C.

2.)

Los enzimas lipolticos lipasa 1 y lipasa VII, no modifican

la actividad

antimicrobiana de Lactobacillus saL-e 148 y lo mismo ocurre cuando se emplean enzimas amilolticos.

Los resultados obtenidos indican que la actividad antimicrobiana de L. saL-e 148 es de naturaleza proteica, sin que existan en su estructura componentes lipdicos ni hidrocarbonados que intervengan en dicha actividad.

182

RESULTADOS

Tabla IV. 8.

Efecto

de diversos

enzimas en la actividad antimicrobiana

parcialmente

purificada de Lactobacil/us saLe 148

Actividad residual (%) Enzima Concentracin Final (mg/m) 2 Tiempo de incubacin (h) 6 12

Tripsina

1 5

46 31 24 31

25 8

8 8 8 8

Pepsina 5 Papaina Proteasa XIV Proteasa II 1 5 1

5

8
8 55 16 26 16
100

67
21 .7?
37

o
O 16

o
100
100

Lipasa 1

loo 10<)

100 100 100 100 10<)

Lipasa VII 5 a-ami lasa 5

loo
loo 1<1<) loo

100

100 100 loo

183

RESULTADOS

IV. 8. 2. - Efecto del oH en la actividad inhibidora

El ensayo se realiz como se describe en la seccin 111. 2. 9. 3., variando el pH del

tampn utilizado en la disolucin de la actividad antimicrobiana entre 2,6 y 12 y utilizando aL. fernzentunz CECT285 como microorganismo indicador.

Los resultados obtenidos se muestran en la figura 4. 38, de la que se deduce que la sustancia antimicrobiana es activa en el intervalo de pH analizado, aunque la mayor actividad se observa a valores de pH entre 5.6 y 6,6. La actividad inhibidora es ligeramente inferior cuando los valores de pH son extremos, tanto cidos como bsicos.

IV. 8. 3.

Cintica de termodestmccin de la actividad antimicrobiana exocelular de

Lactobacillus saLe

148

La cintica de termodestruccin de la actividad antimicrobiana de L sake 148, se determin depositando en viales de vidrio 20 mg de la sustancia parcialmente purificada en 100 g de tampn citrato-fosfato 4 mM de pH 7, a continuacin se cierran hermticamente, y se calientan durante intervalos de tiempo variables, dependiendo de la temperatura de calentamiento (seccin III. 2. 9. 4).

La figura 4. 39 muestra la inactivacin trmica de la sustancia antimicrobiana de L. saLe 148 a80, 100,121, 135 y 150 0C; deella se deduce:

La actividad antimicrobiana deL. saLe 148 es resistente a temperaturas de 80 y 100 0C. perdiendo nicamente un 40 % de su actividad inhibidora inicial cuando se calienta a 100 0Cdurante 30 mm.

184

RESULTADOS

100

80

Cd

O o .0

1~

60

.0 o Cd o ca

40

20

o
2 4

10 pH

12

Figura 4. 38.

Efecto del pH en la actividad de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada deL. saLe 148.

185

RESULTADOS

Esta termorresistencia tambin se manifiest cuando las temperaturas de calentamiento fueron de 121, 135 y iso 0C.

2.- A las temperaturas empleadas, la inactivacin de la sustancia antimicrobiana se ajust, con ligerasvariaciones, a ecuaciones cinticas de primer orden, mientras los parmetros de termodestruccin D,
t 14

y Z se calcularon, como se describe en la seccin 111. 2. 9.

5. 3. 2. , a partir de los resultados de termodestruccin (figura 4. 39)0C, calculados asumiendo una cintica de Los valores D a 80, 100, 121. 135 y 150 nactivacin de primer orden, fueron de 285,7, 119, 23,8, 17,4 y 15,2 minutos respectivamente. Los valores t
1~, calculados par a las mismas temperaturas, fueron de 198,

82,5, 16,5, 12,05 y 10,6 minutos respectivamente. Finalmente, de la ecuacin de la recta de regresin obtenida al representar grficamente el logaritmo de los valores D en funcin de la temperatura a la que fueron obtenidos, se calcul el valor 7; dicho valor, procedente de la recta comprendida entre 121 y 150 =C,fu de 153,4
0C.

186

RESULTADOS

100

80

Cd

o o .0 .0

1~

60

o Cd

40

-a

20

oo

10

20

30

40
Tiempo (mm)

50

60

Figura 4. 39.- Resistencia trmica de la actividad antimicrobiana parcialmente purificada de Lactobacillus saL-e 148 tras su calentamiento a 80 0C (mIl, 100 0C (o>, 121 0C(), 135 0C(A)y 1500C().

187

RESULTADOS

IV. 8. 4.

Determinacin del ceso molecular por cromato2rafa de filtracin en Seohadex G-50

El peso molecular aparente de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada deL. saL-e 148, se determin sometindolo a una nueva cromatografa de filtracin en un gel de Sephadex G-50. Como se describe en la seccin III. 2. 9. 5, la representacin grfica de los eluatos cromatogrficos de marcadores de peso molecular estndar, en funcin del logartmo de sus pesos moleculares, permite determinar el peso molecular de una protena problema por interpolacin en la grfica de la fraccin cromatogrfica que la contiene.

La cromatografa se realiz en las condiciones descritas en la seccin III. 2. 9. 5, y su resultado se refleja en la tabla IV. 9. En dicha tabla se muestran el peso molecular en daltons, su logaritmo y las fracciones de elucin de los compuestos estndar y de la actividad antimicrobiana de L. saL-e 148. El peso molecular de la sustancia inhibidora, obtenido por interpolacin grfica de los resultados obtenidos (fig. 3. 7), fu de 4.640 daltons.

IV. 8. 5.

Determinacin del Deso molecular por electroforesis en aeles de poliactilamida con dodecil sulfato sdico

Para confirmar el peso molecular de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada de L. saL-e 148. determinado por cromatografa de filtracin, se utilizaron las tcnicas de electroforesis en geles de poliacril- amida con dodecil sulfato sdico y urea segn la tcnica de Swank y Munkres (1971)
y

en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico

(SDS-PAGE) segn la tcnica de Laemli (1970).

188

RESULTADOS

Tabla IV. 9. - Determinacin del peso molecular de la actividad antimicrobiana parcialmente purificada de Lactobacillus saLe 148, por cromatografa de filtracin en Sephadex G-50

Compuesto

Fraccin de elucin n2

Logaritmo del peso molecular

Peso molecular (Daltons)

a-quimotripsingeno RNAsa pancretico Actividad antimicrobiana Vitamina

27 32

4.40 4,14

25.000 13.700

43 55

3,67 =13

4.640 1.355

189

RESULTADOS

IV. 8. 5. 1. Electroforesis se2n la tcnica de Swank Munkres (1971

-

Esta tcnica permite separar cadenas peptdicas de pequeo tamao molecular gracias a la incorporacin de urea a los geles de poliacrilamida. Con tal fin separador, 50, 100 y 200 gg de la actividad inhibidora parcialmente purificada deL, saL-e 148 se sometieron a un anlisis electrofortico en geles de SDS-poliacrilamida-urea, segn la tcnica descrita en la seccin III. 2. 9. 6. 1.

No obstante, una vez teidos los geles no se apreci ninguna banda proteica en los lugares en los que se haban depositado las soluciones que contenan la sustancra antimicrobiana parcialmente purificada. Considerando que la falta de bandas proteicas ntidas en los geles poda ser consecuencia de una falta de poder separador del gel con urea o de un fallo del mtodo de tincin de los geles, se recurri a la electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS segn la tcnica de Laemli (1970).

IV. 8. 5. 2. Electroforesis en geles de 20% poliacrilamida con SDS (Laemli. 1970

-

Aunque esta tcnica electrofortica tiene un menor poder de resolucin en los pptidos de bajo peso molecular que la de Swank y Munkres, al utilizar el mtodo de tincin de Merril y col. (198]), a base de nitrato de plata, facilita la tincin de las proteinas. Esta tincin aplicada a las protenas de los geles de poliacrilamida con SDS, es 10-50 veces ms sensible que la del azul brillante de Coonassie.

Siguiendo la tcnica descrita en la seccin III. 2. 9. 6. 2. se aplicaron en electroforesis 5, 10 y 15 ~ig la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada de LsaL-c 148. En la de figura 4.40 se indican los resultados obtenidos. Como puede observarse, no se detectan bandas proteicas definidas en los lugares de los geles en los que se deposit la sustancia

190

RESULTADOS

antinicrobiana parcialmente purificada. Slo en el frente electrofortico se puede distinguir una banda de tincin difusa. La densidad de esta banda aumenta a medida que crece la concentracin de sustancia antinicrobiana parcialmente purificada depositada en el correspondiente pocillo.

IV. 8. 6.-

Determinacin de la composicin aminoacdica de la sustancia antimicrobiana narcialmente nurificada

La utilizacin de la tcnica de deteccin de aminocidos por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). descrita en la seccin III. 2. 9. 7. as como el estudio comparativo de los cromatogi-amas del hidrolizado cido de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada y de los aminocidos patrn, di lugar a los resultados que se reflejan en la tabla 1W 10. De ella se deduce que:

1.) La sustancia antimicrobiana posee 14 aminocidos distintos, de los que 13 se corresponden a los siguientes: cido asprtico. cido glutmico, glicina, histidina, treonina, alanina, prolina, valina, tirosina, metionina, leucina, fenilalanina y lisina; el decimotercero, que elufa entre el cido glutmico y la glutamina, no pudo identificarse al no corresponder a ninguno de los aminocidos empleados corno patrn.

191

RESULTADOS

234

16,9 Kd
14,4

Kd 8,1 Kd 6,2 Kd-

2,5

Frente -h el ectrofo rtico

Figura 4. 40.- Electroforesis por SDS-PAGE de la actividad antimicrobiana parcialmente purificada de L. saL--e 148. Lineas: 1, marcadores de peso molecular standard (de arriba a abajo, 16.949, 14.404, 8.159, 6.214 y 2.512 daltons); 2, 3 y 4 corresponden, respectivamente a 15, 0 y 5 gg de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada.

192

RESULTADOS

Tabla IV. 10.- Composicin aminoacdica de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada de L. saL-e 148

Aminocido

Contenido (nmol)

Residuos por molcula (probable)

Acido asprtico Acido glutimico No Identificado~ Glicina Histidina Treonina Alanina Prolina Tirosina Vaina Metionina Leucina Fenilalanina Lisina

7,7 10,9 7,1 8,6 1,9 4,3 8,4 11,6 21,9 5,9 2,1 4,5 1,5 4,8

4 6 3(4) 4 (5) 2 4 6 1 3 1 2 1 2 (3)

Peso molecular asignado igual a la media del de los aminocidos empleados como patrn.

93

RESULTADOS

2.) La sustancia antimicrobiana es muy rica en aminocidos de carcter hidrofbico; (alanina, leucina, valina, fenil alanina, metionina y prolina) que constituyen el 50% de la molcula. Los ms frecuentes son prolina (6 residuos/molcuLa), cido glutmico (6) y glicina (4-5), y los menos histidina (1), treonina (2), metionina (1). leucina (2) y fenil-alanina (1). El aminocido que no pudo identificarse eluye en una posicin muy prxima de la glicina, y en cada molcula hay unos 3-4 residuos (asumiendo un peso molecular medio de 130).

3.) La sustancia antimicrobiana de L.sake 148 posee unos 40 a 43 aminocidos por molcula, lo que da idea de su pequeo tamao molecular (5047); ello se corresponde bastante bien con el peso molecular obtenido por cromatografa de filtracin en Sephadex 0-50 (4640). pero no con su comportamiento en la electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico (2500).

IV. 9

.-

Mecanismo de accin de la sustancia antimicrobiana exocelular de Lactobaclihs sa/ce 148

Cuando a los medios MRS, APT y BHI incubados con unas 5 x 0~ ufc/ml de diversos microorganismos indicadores (seccin III. 2. 10) se les adicionan 0,5 ml de sobrenadantes de L. saLe 148 libres de clulas, debidamente concentrados, se detiene el Crecimiento de las bacterias sensibles (tabla IV. 11), pero no disminuye el nmero de ufc/ml. Sin embargo, la adicin de 0,5 ml de un cultivo de L saL-e 23, carente de actividad inhibidora, no afecta al desarrollo de estos microorganismos indicadores. Los resultados obtenidos indican que la actividad antimicrobiana deL. saL-e 148 posee un mecanismo de accin bacteriosttico.

194

RESULTADOS

IV. 10.

Concentracin inhibidora mnima <ClM~ de la sustancia antimicrobiana de L su/cc 148

La concentracin inhibidora mnima (CIM) de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada deL. saL-e 148 frente a diversos microorganismos indicadores, se determin de la manera descrita en la seccin 111. 2. 11. Los resultados se muestran en la tabla IV. 12. Como se ve, la CIM vara entre 1 y 18 mglml, dependiendo de los microorganismos indicadores utilizados.

195

RESULTADOS

Tabla IV. 11.- Efecto de los sobrenadantes concentrados de Lactobacdlus sake 148 y 23, antagonista (1) y no antagonista (C) respectivamente, en el desarrollo a 32 oc de algunos microorganismos indicadores.

Microorganismoa Oh

log ufc/m] 4h 8h 16h

Loctobacillusfernzentuni Lactobacillus cwvatus Carnobacterium diveigens Leuconostoc mesenteroides Listei-ic niozocytogenes Listeria rnonocytogenes Listeria rnonocytogenes Listeria nonocytogenes
Salinonella tvphniuvnn Yersinia enterocolitica

285 726 LV13 395 5105 7973 LIS sv 1/2 Scott A T9 1 E20 137

T C T

5,3 5,5 5,6 5.6 5,7 5,6 5,7 5.7 5,8 5,7 5,3 5,3 5,8 5,8 5,8 5,8 5,5 5,4 5,7 5.8 5,3 5.2

5,3 6,8 5,6 6,9 5,7 6.9 5,8 6,9 5,8 6,9 5,2 6,8 5,7 6,9 5,7 6,9 6,9 6.8 6,1 6,3 5,1 6.9

5,4 8.7 5,7 8,5 5,3 8,7 5,9 8,9 5,7 8,9 5,7 8,7 5,9 8.9 5,9 8,8 8,8 8,7 6,9 7,1 5,6 8,9

5,5 9,8 6,1 9,8 5,4 9,5 6,4 9,5 5,7 9,3 5,7 9,1 6,2 9,5 6,1 9,5 9,5 9,4 8.2 8.9 6,3 9,2

T C T C T C T C 1

C
T

T C 1 C
1 C

5/cpb viococcus am-cus

196

RESULTADOS

Tabla IV. 11. (continuacin) Microorganismoa Oh log ufc/ml 4h 8h 16h

Staphylococcus aureus
Clostridiun; botulinun; Clostridiun pe4ringens

371
551

C C C C C C

5,2 5,3 4,9 4,9 5,1 5,1

5,3 6,7 4.8 5,0 5,2 5,3

5.3 8,7 4.9 5,7 5,3 7.7

6,5 9,8 4,9 6.3 6,4 9,3

376

a Para conocer la procedencia de los microorganismos ver tabla III. 1

197

RESULTADOS

Tabla IV. 1%- Concentracin Inhibidora Mnima (CIM) de la susancia antimicrobiana exocelular de L.sake 148, en diversos microorganismos indicadores.

Concentracin Microorganismo indicador Inhibidora Mnima (ng/mi)

Loctobacillusferinentun; CECT28S Carnobacteruin dite.-gens LV 13 Listeria nzonocytogenes NCTC5 105 Listeria nhonocytogenes LIS sv 1/2 Listeria rnonocytogenes Scott A Staphvlococcus aureus FR1137 Staphvlococcus am-cus FR1349 Staphylococcus aureus FR136 1 C/osuldiurn botulinu.rn 551 Clostridiun; pefringens 376 2 9 9 9 9 18 18 4 4

198

RESULTADOS

IV. 11.- Caracterizacin inmunolgica parcial de la susrancia antimicrobiana deL, sa/ce 148

IV. 11. 1.- Anlisis por inmunodifusin en Leles de aaarosa. de los inmunosueros de conejos cuando se emolea como antzeno la sustancia antimicrobiana exocelulardeL. sa/ce 148

La sustancia antimicrobiana exocelular parcialmente purificada de L. sa/ce 148, se obtuvo como se describe en la seccin III. 2. 12 de este trabajo. Antes de inoculara a los conejos se comprob por inmunodifusin en geles de agarosa que los sueros de los conejos no originaban lneas de precipitacin visibles al enfrentarse con la sustancia.

Durante la inmunizacin de los animales se realizaron 4 sangras parciales para comprobar la producin de anticuerpos frente al extracto antignico, as como para determinar la presencia o ausencia de reacciones cruzadas con otros componentes procedentes del medio MM-triptosa (concentrado 20 veces por liofilizacin); lo mismo se comprob con el sobrenadante libre de clulas de un cultivo de L saL-e 148 en medio MM-triptosa y con el mismo sobrenadante concentrado 20 veces por liofilizacin. No obstante, en ningn caso se detectaron 1 incas de precipitacin.

199

RESULTADOS

IV. 11. 2.- Deteccin de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada deL, sa/ce 148 por tcnicas inmuno-enzimticas (ELISA

IV. 11. 2. 1.- Deteccin por la tcnica del ELISA indirecto clsico

Antes de la inoculacin de los conejos con el extracto antignico de inters, se comprob que ninguno de ellos presentaba reactividad inmunolgica al someter una muestrade su suero al ELISA indirecto que se describe a continuacin.

IV. 11. 2. 1. 1.- Evaluacin de la concentracin idnea de los reactivos que intervienen en el ensayo

Para garantizar que la sustancia antimicrobiana exocelular deL. sake 148 saturaba el fondo de los pocillos de las placas de ELISA, se diluyeron 100 ~xgdel extracto antignico citado en 1 ml de tampn PBS. Con idnticos fines, y como extracto antignico control, se emple el medio MM-triptosa liofilizado a la concentracin dc 1 mg de proteina por ml de tampn PBS.

Como conjugado se utiliz uno comercial, anti-IgG de conejo, obtenido de cabras y marcado con peroxidasa de rbano (Nordic). Para establecer la dilucin de trabajo de este conjugado, se siguieron las indicaciones del fabricante y el criterio aplicado pal-a la eleccin del antgeno, es decir, garantizar la presencia de conjugado en exceso. La dilucin elegida fu la 1/1000.

200

RESULTADOS

IV. 11. 2. 1. 2.- Determinacin de la respuesta inrnunol~ica de los conejos frente al extracto antignico inoculado

Durante la inmunizacin de los conejos se realizaron varias sangras parciales para comprobar que producan anticuerpos frente al extracto antignico inoculado, y que no se originaban reacciones cruzadas frente al extracto antignico control. En la figura 4. 41 se muestran los resultados procedentes de esta determinacin. De la figura se desprende que:

1.) En las sangras parciales efectuadas a los 21 y 42 das de la primera inoculacin antignica no aumenta significativamente la respuesta inmunolgica de los conejos frente a los antgenos de inters.

2.) En las sangras realizadas a los 63 y 84 das de la primera inoculacin la respuesta inmunolgica de los conejos aument significativamente, hacindolo tambin pero ligeramente en la sangra final que tuvo lugar a los 91 das de la inoculacin iniciaL

201

RESULTADOS

3,0

2,5

2,0 E
U)

o u
1-

1,5

o
.0

1,0

TJ~

0,5

0,0 1,0

1-

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Log. dilucin del anticuerpo

Figura 4. 41.- Deteccin inmunolgica por un ELISA indirecto, de la sustancla antirnicrobiana parcialmente purificada de L.saLe 148 a los O (A), 21 (A). 42 (0), 56 (), 84 (o) y 91 (U) das de inoculacin en conejo Concentracin del andgeno 10<) gtg/ml. Dilucin del conjugado 1/1000.

202

RESULTADOS

LV. 11. 2. 2.- Deteccin de la sustancia antimicrobiana deL. sa/ce 148 en el medio de cultivo MM-triptosa

La misma tcnica del ELISA indirecto empleada para determinar la respuesta inmunolgica de los conejos inmunizados con la sustancia antimicrobiana deL, sa/ce 148, se utiliz para evaluar la presencia de dicha sustancia en el medio de cultivo MM-triptosa.

IV. 11.2. 2. 1.- Determinacin de la concentracin idnea de los reactivos que intervienen en el ensayo

Las indicaciones del fabricante, junto con los resultados de experiencias preliminares, permitieron establecer como dilucin de trabajo del conjugado la de 1/1000.

Una vez ajustada la concentracin de trabajo del conjugado, se procedi a establecer la ms idnea para el inmunosuero (cuya concentracin inicial de protena era de 20 mg/mI). Para ello, en un ensayo previo, se determin la dilucin del inmunosuero ms apta para diferenciar la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada disuelta en tampn PBS, de la disuelta en medio MM-triptosa (figura 4 42). De Los resultados obtenidos se desprende que los componentes del medio de cultivo interfieren en la deteccin de la sustancia antimicrobiana de L. sa/ce 148, si bien el inmunosuero disuelto 16 veces en tampn PBSTes el que nejordetecta dicha sustancia en el medio de cultivo de MM-triptosa.

203

RESULTADOS

3,0

2,5

E 2,0
U) xl.

u
.0 .0
1-

1,5

o 1,0

0,5

0,0 1,0 1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Log. dilucin del anticuerpo

Figura 4. 42

.-

ELISA indirecto dc la sustancia antimicmbiana exocelular de LsaLc 148 en tampn P135 (m~ y en medio de MM-riposa (ny El resto de los parmetros como en la figura 4. 41.

204

RESULTADOS

Posteriormente, se realiz un ensayo para detectar la sustancia antimicrobiana exocelular de L. sa/ce 148 cultivado en medio de MM-triptosa. Los resultados del ELISA indirecto de la sustancia antimicrobiana de L. saLe 148 en tampn PBS, en medio de MM-triptosa y en el sobrenadante libre dc clulas de un cultivo de este microorganismo realizado en medio de MM-triptosa se muestran en la figura 4.43. De los resultados obtenidos se deduce que:

1.- Cuando la bacteriocina parcialmente purificada de L. saLe 148 se disuelve en tampn PBS se puede detectar la presencia de hasta 6 ~tgde proteina por cada pocillo de la placa de ELISA.

2.- Sin embargo cuando se emplea el ELISA indirecto para detectar la sustancia antimicrobiana de L. sa/ce 148 crecido en medio de cultivo MM-triptosa, los inmunosueros empleados no detectan dicha sustancia.

Dada la imposibilidad de detectar la sustancia antimicrobiana en medio de MM-trptosa y con la finalidad de aumentar la sensibilidad del ELISA indirecto, se opt por mejorar la sensibilidad del ensayo mediante la utilizacin de anticuemos conjugados a la biotina.

205

RESULTADOS

tu

2,5

E ~ U) o t
.0
1~

2,0

1,5

o CC <1,0
.0

0,5

0,0 0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2.5

3,0

3,5

Log. dilucin del antgeno

Figura 4. 43.- ELISA indirecto de la sustancia antimicrobiana exocelular de L. saL-e 148 en tampn PES (u), en medio de MM-triptosa (c) y en el sobrenadante de un cultivo de t saL-e 148 en MM-triptosa (). Dilucin del anticuerpo 1/160. Dilucin del conjugado l/10(XY

206

RESULTADOS

IV. 11. 3.- Deteccin de la sustancia antimicrobana de L. sa/ce 148 mediante un

ELISA indirecto con el sistema de amDlificacin biotina-avidina

El empleo de esta tcnica con los mismos extractos antignicos y en las mismas
condiciones no mejor los resultados ya que, paralelamente a la mejora observada en la deteccin de la sustanca antimicrobiana parcialmente purificada, se aprecia tambin una mayor interaccin de los anticuerpos biotinizados con los extractos antignicos empleados como control (figura 4. 44). Se concluy por lo tanto, que en el medio de MM-triptosa. a pesar de tener una composicin muy sencilla, existen compuestos que, de una forma u otra, interfieren con la deteccin inmunolgica de la actividad antimicrobiana.

207

RESULTADOS

3,0

2,5

E
U)

2,0

o
c~

1,5

u
.0 .0

~ CC

1,0

0,5

0,0 0,0

0,5

1,0

1,5

2.0

2,5

3.0

3,5

Log. dilucin del antgeno

Figura 4. 44.- ELISA indirecto de la sustancia antimicrobiana exocelular de L. soke 148 en tampn PBS (u), en medio de MM-triptosa (o) y en el sobrenadante libre de clulas de un cultivo deL saL-e 148 desarrollado en el medio de MM-triptosa (4). Dilucin del anticuerpo biotinizado 1/160. DiLucin del conjugado 1/3000.

208

DISCUSION

CAPITULO V DISCUSION

209

DISCUSION

y. i. Aislamiento de bacterias lcticas de embutidos crudos curados

-

Para la realizacin de este trabajo, que pretende el aislamiento y caracterizacin parcial de bacterias lcticas utilizables para mejorar la calidad higinica de la carne y sus productos, primero se procedi al aislamiento de estas bacterias de embutidos cnidos curados. La eleccin de estos productos como fuente de bacterias lcticas se debe a que las que contienen estn mejor adaptadas a la ecologa bacteriana de la carne y los productos crnicos que las aisladas de otras fuentes, como leche, productos lcteos y hortalizas (Schillinger y LOcke, 1989).

Adems las bacterias lcticas son, invariablemente, el grupo microbiano predominante en la mayora de los productos crnicos yen las carnes envasados a vacio, constituyendo entre el 75 y el 95 % de su poblacin bacteriana total (Mol y col., 1971: Kitchell y Shaw, 1975; Reuter, 1975; l-litchener y col., 1982; Shaw y Harding, 1984; Korkeala y Mtehl, 1989).

De otra parte, los recuentos de bacterias lcticas respecto del microbiano total obtenidos por otros investigadores (LOcke, 1986; Holley y col., 1988> durante la maduracin de los embutidos crudos madurados, coinciden con los nuestros (Tabla 1W 1); en ambos casos se ha visto que la mayor parte de la microflora crnica est constituida por bacterias lcticas.

El nmero de bacterias lcticas al final de la maduracin de las muestras estudiadas (aproximadamente 8-9 x 108 ufc/g de embutido) concuerda con los resultados sealados por otros investigadores para el bacon (Cavett, 1963), los embutidos crudos madurados (Egan, 1983) y las carnes envasadas al vacio (Hitchener y col.. 1982; Egan. 1983). En muchos productos crnicos, estas bacterias constituyen el principal componente de su microflora debido a la supresin del desarrollo de otros grupos microbianos por mecanismos de antagonismo microbiano no bien evaluados (Reuter, 1981).

210

EJISCUSION

V. 2. Actividad antimicrobiana de las bacterias lcticas seleccionadas

-

y. 2. 1. Eleccin de las pruebas de anta2onismo microbiano

-

V. 2. 1. 1. Pruebas directas de antaLonismo microbiano

-

El antagonismo microbiano puede evidenciarse de diversas maneras. En los estudios preliminares, las pruebas de antagonismo se realizaron utilizando generalmente medios de cultivo slidos e implicaron la deteccin de la inhibicin del crecimiento que ejerca el microorganismo analizado (activo) en el microorganismo indicador (pasivo) (Tagg y col., 1976).

Las dos pruebas enpleadas con este propsito son la directa o simultnea y la indirecta o diferida. La concentracin del microorganismo indicador es importante en la sensibilidad del mtodo (Kuttner, 1966).

En la prueba directa, el microorganismo a evaluar y la cepa indicadora se desarrollan al mismo tiempo. Una de las pruebas directas ms sencillas es la prueba de la gota, utilizada originalmente por Gratia (1946), y cuyo empleo est ampliamente difundido (Geis y col., 1983; Daeschel y Klaenhammer, 1985; Gonzalez y Kunka, 1987; Raccach y col.. 1989; Spelhaug y Harlander, 1989; Daeschel y col., 1990; Ahn y Stiles, 1990a). En ella, una gota del cutivo del microorganismo a evaluar se deposita en un medio de cultivo slido, previamente inoculado con el microorganismo indicador. Entre las variantes de este procedimiento se incluye el empleo de pocillos excavados en el medio slido que se rellenan con una cantidad conocida del cultivo del microorganismo a evaluar (Sabine. 1963; Tagg y McGiven. 1971; Tagg y col., 1976; Silva y col.. 1987; Harris y col.. 1989; Rodriguez y col.. 1989).

211

DISCUSION

Otra modificacin de gran utilidad es la siembra por picadura de los microorganismos a estudiar en placas cuya superficie se ha sembrado con el microorganismo indicador (DeKlerk, 1967; Gagliano y Hinsdill, 1970; Davey y Richardson, 1981; Barefoot y Klaenhammer, 1983).

Fredericq (1948) fu el primero en utilizar las pruebas diferidas de antagonismo. En este caso, el microorganismo a evaluar se siembra e incuba en un medio slido durante un cierto tiempo, transcurrido el cual se cubre con otra capa de medio que contiene el
-

microorganismo indicador. Las pruebas diferidas son a menudo ms sensibles que las directas (Taggycol., 1976).

Como en la prueba directa, una de las variantes de las pruebas diferidas ms empleada es la de la gota (Andersson y col, 1988; Harris y col., 1989; Schillinger y LOcke, 1989; Spelhaug y Harlander, 1989; Ahn y Stiles, 1990a). Con esta prueba y para resaltar ms la accin .de las sustancias inhibidoras difusibles de los cutivos, se inactivan las clulas del microorganismo productor con calor (Geis y col, 1983; Ahn y Stiles, 1990a) o, mejor an, con vapores de cloroformo (Kekssy y Piguet. 1970; Davey y Richardson, 1981; Geis y col., 1983; Ahn y Stiles, 1990a). No obstante, esto conleva algunos inconvenientes como el que algunos agentes inhibidores se inactivan al exponerse a los vapores de cloroformo. Brock y Davie (1963) demostraron la sensibilidad al cloroformo de una sustancia inhibidora producida por Enrerococcusfaecalis subsp. zvrnogenes. Los vapores de cloroformo tambin impiden el empleo de placas de Petri de plstico; adems el cloroformo residual de los medios de cultivo puede originar resultados errneos (Kekssy y Piguet, 1970).

Otra alternativa, cuando se sospecha la existencia de sustancias antagonistas difusibles, consiste en sembrar el cultivo indicador en una cara del medio de cultivo slido y el cultivo a evaluar en la opuesta, ya sea empleando el sistema de gotas (Kekssy y Piguet. 1970) o el de

212

DISCUSION

pocillos (Tagg y McGiven, 1971; Barefoot y Klaenhammer, 1983; Spelhaug y Harlander, 1983). Una ventaja de este mtodo es que as se excluye la actividad inhibidora debida a bacterifagos (Tagg y col., 1976).

Tanto en las pruebas de antagonismo directo, como diferido, es recomendable colocar los cultivos de los microorganismos a analizar en pocillos abiertos en los medios slidos, lo que permite que si se deposita siempre el mismo nmero de microorganismos, pueden establecerse comparaciones entre los dimetros de las zonas de inhibicin obtenidas. Otra ventaja de este mtodo es el aumento de la sensibilidad, puesto que entre el microorganismo estudiado y las cepas indicadoras nicamente se interpone una capa fina de agar; esto, adems, excluye la inhibicin debida a bacterifagos, que son microorganismos no difusibles (Tagg y McGiven, 1971). Por todo ello, se eligi este mtodo para la realizacin de las pruebas de antagonismo, tanto directo como diferido, de las 180 bacterias lcticas aisladas y seleccionadas de los embutidos crudos curados (seccin IV. 1).

V. 2. 1. 2. Antagonismo de los sobrenadantes libres de clulas

-

Cuando en las pruebas de antagonismo microbiano se emplean cultivos no es fcil identificar la causa del mismo (Tagg y col., 1976). En la identificacin de bacterias lcticas productoras de sustancias antagonistas difusibles es importante excluir de los ensayos no slo a los microorganismos productores de tales sustancias, sino tambin a otros metabolitos con actividad inhibidora.

Las sustancias que en las pruebas de antagonismo bacteriano poseen una actividad inhibidora similar a las bacteriocinas. pueden neutralizarse o eliminarse utilizando sobrenadantes libres de clulas neutralizados o dializados. Los sobrenadantes se obtienen por centrifugacin de los cultivos y por filtracin por filtros de 0.22 o 0.45 um de dimetro de

213

DISCUSlON

poro.

La neutralizacin de la actividad antagonista de los cidos orgnicos puede realizarse ajustando el pH de los sobrenadantes a un valor prximo a la neutralidad (pH 6,9-7,0) (Geis y col., 1983: Barefoot y Klaenhammer, 1984; Rodriguez y col., 1989; Nielsen y col., 1990; M0rtvedt y Nes, 1990), o dializando los sobrenadntes por membranas que permiten la difusin de sustancias de un tamao molecular menor de 6000 daltons. La dilisis puede ir precedida de una precipitacin de los sobrenadantes con sulfato amnico (Bhunia y col, 1987; Gonzlez y Kunka. 1987; Ray y col., 1989). El precipitado, constituido fundamentalmente por protenas, se reconstituye y dializa. No obstante, la mayora de los autores prescinden de esta precipitacin (Andersson, 1986; Andersson y col., 1988; Harris y col., 1989; Schillinger y LOcke, 1989; Daeschel y col., 1990; Ahn y Stiles, 1990b).

El efecto del perxido de hidrgeno de los sobrenadantes puede evitarse incubando los cutivos en anaerobiosis (Schillinger y LOcke, 1989), o tratando con catalasa los sobrenadantes libres de clulas (Barefoot y Klaenhammer, 1983; Muriana y Klaenbammer, 1987; Ferreira y Gilliland, 1988; Schillinger y LOcke, 1989; Rodriguez y col., 1989; ~arminati y col., 1989; Ahn y Stiles, 1990a). Geis y col. (1983), aaden la catalasa directamente al medio de cultivo del microorganismo indicador.

Los sobrenadantes libres de clulas tambin pueden concentrarse con el fin de aumentar su actividad inhibidora. Entre los sistemas de concentracin ms empleados destacan la evaporacin a vaco en rotavapores (Geis y col., 1983; Silva y col., 1987) y la liofilizacin (Rodriguez y col., 1989).

La actividad inhibidora de los sobrenadantes puede detectarse con cualquiera de las variantes de antagonismo directo e indirecto citadas, estando muy difundidos los mtodos de

214

DISCUSION

la gota (Geis y col., 1983; Ray y col.. 1989; Carminati y col., 1989: Ahn y Stiles, 1990a) y la disposicin de los sobrenadantes en pocillos abiertos en las placas (Joerger y Kiaenhammer, 1986; Ahn y Stiles, 1990a). Otro mtodo muy empleado cuando se investigan bacteijas lcticas bacteriocinognicas, consiste en colocar los sobrenadantes en papeles de filtro estriles. Los discos de papel de filtro, impregnados con el sobrenadante, se depositan en placas de agar sembradas con el microorganismo indicador (Shahani y col, 1976; Ferreira y Gilliland. 1988) o bien se deposita en los filtros una cantidad determinada de sobrenadante (Abdel-Bar y col., 1987; Bhunia y col., 1987; Bhunia y col., 1988; Rodriguez y col., 1989). La segunda opcin ha sido la utilizada en este trabajo, lo que permite comparar la actividad inhibidora de los diversos sobrenadantes analizados.

V. 2. 2. Actividad inhibidora de los cultivos de las bacterias lcticas seleccionadas

-

Tanto las 180 bacterias lcticas examinadas en primera instancia, como las 24 seleccionadas con posterioridad de entre las primeras, manifestaron actividad inhibidora frente a alguno de los microorganismos indicadores empleados (figuras 4 6 a 4. 29). La actividad inhibidora generalmente es mayor cuando los microorganismos a evaluar se siembran 24 horas antes que los microorganismos indicadores, algo en lo que nuestros resultados coinciden con los de Ahn y Stiles (1990a).

La sensibilidad de los microorganismos indicadores a la actividad inhibidora de las bacterias lcticas analizadases variable, lo que demuestra que dicha actividad es caracterstica de cada cepa y no de la especie bacteriana (Schillinger y LOcke, 1989: Daeschely col., 1990).

Los resultados obtenidos por otros investigadores que han evaluado la actividad antimicrobiana de las bacterias lcticas varan bastante. Al igual que nosotros, Kozak y col. (1978) observaron que las 47 cepas deL. lacis subsp. lacs que estudiaron, eran activas

215

DISCUSION

frente a otras dos cepas de L. lacs subsp. ladis y frente a una de L. lacris subsp. Cremoris. El mismo resultado obtuvieron Ahn y Stiles (1990a) al examinar la actividad inhibidora de 10 cepas de diversos gneros de bacterias lcticas frente a 10 indicadores que tambin eran bacterias lcticas.

El 63 % de las 52 cepas de L acidophilus analizadas por Barefoot y Klaenhammer (1983), inhibieron el desarrollo de diversas cepas de L. eichn,anni, L. bulgaricus, L. heIvetCLis y L. lacds, porcentaje idntico al obtenido por Raccach y coL (1989) con 11 cepas de Lactobacillus y de Sireptococcus sp., empleando como indicadores diversas cepas de 6 especies distintas de bacterias lcticas y 4 cepas de L.
monocytogenes.

De otra parte,

nicamente el 15 % de las 79 cepas de Lacwbacillus sp. examinadas por Rammelsberg y Rader (1990) inhibieron una, al menos, de las 9 cepas indicadoras deL. brevis, P. daninosus y Leuc. oenus ensayadas. El porcentaje de cepas inhibidoras registrado por Davey y Richardson (1981) fue an menor, ya que slo el 7 % de las 150 cepas deL.
crenzork lactis ladis

susbsp.

analizadas, inhibieron el desarrollo de varias cepas de L. lactis subsp. crernoris y L.

subsp. lactis.

Schillinger y LOcke (1989), al evaluar 142 cepas deL, saL-e, 4 deL. plantarwn y 75 de L.
curvatus,

observaron que el 13, el 75 y el 1 %, respectivamente, eran activas frente, al

menos, uno de los 31 microorganismos indicadores empleados; estos resultados contrastan con los de Ahn y Stiles (1990a) y con los nuestros, ya que en nuestro caso prcticamente todas las cepas aisladas manifiestan actividad inhibidora sobre varios indicadores, contraste que llama poderosamente la atencin si se tiene en cuenta que en los tres trabajos las bacterias lcticas proceden de una fuente comn, los embutidos crudos madurados.

Lo expuesto anteriormente ofrece una idea de la dificultad que presenta el establecer la actividad inhibidora de las bacterias lcticas, lo que se agrava por la escasa uniformidad en las

216

DISCUSION

condiciones de trabajo y por la diversidad de microorganismos indicadores empleados. No obstante, las bacterias lcticas analizadas en los trabajos citados son especialmente activas frente a otras bacterias lcticas y nunca, o de forma excepcional. frente a las bacterias Gram-negativas.

V. 2. 3. -Actividad inhibidora de los sobrenadantes libres de clulas

La actividad inhibidora de los sobrenadantes libres de clulas se estableci slamente en los aislados ms activos. Los sobrenadantes libres de clulas de los cultivos de nuestras 24 bacterias lcticas seleccionadas, una vez concentrados, mostraron una actividad antimicrobiana variable dependiendo de la cepay del indicador empleado (tabla IV. 1); fueron especialmente sensibles las bacterias lcticas empleadas como indicadores.

Quiz sea conveniente recordar que las bacterias lcticas activas seleccionadas, se aislaron durante la maduracin de un lote de embutidos; en cada muestreo se seleccionaron 30 colonias. Esto significa, por ejemplo, que las cepas 24 y 29 procedan de la masa crnica original, la 31 y 46 del embutido en segundo da de maduracin y, as sucesivamente, hasta la cepa 180 que se alsi el ltimo da (35) de maduracin. De la observacin de la tabla IV. 1, se concluye que es posible aislar bacterias lcticas productoras de sustancias antimicrobianas, distintas de los cidos orgnicos o del agua oxigenada, en cualquier momento de la maduracin e, incluso, a partir de la masa crnica inicial. Algunas de las cepas evaluadas mostraron actividad frente a varias cepas de L. nionocytogenes y S. aureus, microorganismos productores de toxiinfecciones alimentadas.

La actividad inhibidora de las bacterias lcticas frente a otras de su mismo grupo y a menudo estrechamente relacionadas entre si, es un hecho ampliamente documentado (Geis y col., 1983; Barefoot y Klaenhammer, 1984; Joerger y Klaenhanmer, 1986; Andersson, 1986;

217

DISCUSION

Gonzalez y Kunka, 1987; Bhunia y col., 1987; Schillinger y LOcke, 1989; Harris y col., 1989; M0rtvedt y Nes, 1990; Ahn y Stiles, 1990a; Ahn y Stiles, 1990b). Sin embargo, son mucho ms escasos los estudios que demuestran que las bacterias lcticas inhiben el desarrollo de cienos microorganismos patgenos Gram-positivos, como 5. aureus (Andersson, 1986; Andersson y col., 1988; Bhunia y col., 1988) y L. inonocytogenes (Ehunia y col., 1988; Carminati y col., 1989; Schillinger y LOcke, 1989; Harris y col., 1989; Spelhaug y Harlander, 1989; Ahn y Stiles, 1990b). La mayor parte de los autores citados coinciden en sealar que las bacterias Gram-negativas son insensibles a las sustancias antibacterianas producidas por las bacterias lcticas estudiadas. Quiz la excepcin mejor conocida a este respecto la constituyan las cepas de L. laCt productoras de nisina (Hurst, 1981). En general, la actividad antimicrobiana es muy heterognea y depende de cada cepa en particular (Harris y col., 1989).

V. 2. 4.

Efecto de la catalasa en la actividad inhibidora de las bacterias lcticas seleccionadas

Los resultados obtenidos indican que la actividad antimicrobiana de los sobrenadantes concentrados no puede ser, en ningn caso, atribuible al perxido de hidrgeno. La capacidad de algunas bacterias lcticas de producir perxido de hidrgeno es una propiedad indeseable, especialmente si en las emulsiones crnicas existe un alto contenido de oxgeno, si se emplea mucha grasa en la formulacin del embutido o si la actividad de los enzimas que degradan el perxido de hidrgeno es pequea (Schillinger y LOcke, 1987a). En estos casos, la presencia en la carne y productos crnicos de microorganismos productores de perxido de hidrgeno produce alteraciones del color o un enranciamiento precoz.

Las bacterias lcticas difieren en su capacidad de producir y degradar el perxido de hidrgeno. L-lastings y Hlzaptel (1987) observaron que el 50 % de las cepas de L. saL-e de origen crnico producan perxido de hidrgeno y, de ellas, la mayora lo haca muy

218

DISCUSION

dbilmente. La falta de una buena seleccin de las bacterias lcticas autctonas explica, en parte, el que t. plantaruni, P. acidilactic y P. pentosaceus sean los microorganismos ms empleados como cultivos iniciadores en la elaboracin de productos crnicos y no L. sa/ce o L. curvatus, que son especies mucho ms competitivas (LOcke y Hechelmann, 1987).

y. 3.

Identificacin

caracterizacin bioqumica parcial de las bacterias lcticas con

actividad antimicrobiana

Cuando se aislan bacterias lcticas y en panicular lactobacilos, de la carne y productos crnicos, no es posible clasificarlos adecuadamente siguiendo los sistemas de identificacin empleados clsicamente, ya que stos se basan en las propiedades de microorganismos procedentes de otras fuentes (OrIa Jensen, 1919; Rogosa, 1970; Sharpe, 1979). Hasta muy recientemente, las cepas difciles de identificar se englobaron bajo la denominacin de estreptobacterias o lactobacilos atpicos (Thornley y Sharpe, 1959; Reuter, 1975; Sharpe, 1979). No obstante, como sugiri Ingram (1975), el trmino de estreptobacterias atpicas es poco afortunado ya que las bacterias lcticas de origen crnico no son menos tpicas que las dems, en todo caso lo sern los criterios de identificacin y clasificacin, debido a la ignorancia de las propiedades de las especies de origen crnico.

Con el transcurso del tiempo se han realizado diversos intentos de identificar y clasificar las estreptobacterias de origen crnico (Reuter. 1975; Kitchell y Shaw, 1975; Hitchener y col., 1982). Todos ellos se basan en reacciones bioqumicas variables que, al no emplear mtodos numricos en el establecimiento de los grupos, han llevado a la creacin de grupos innecesariamente complicados y arbitrarios (Shaw y Harding. 1984). No obstante, en 1987, Schillinger y LOcke elaboraron un esquema de identificacin rpida de lactobacillos de origen crnico, basado en sus caractersticas fisiolgicas, la mayor parte de las cuales son fcilmente determinables. Este esquema, que se muestra en la figura 5. 1, incluye especies

219

DISCUSJOJkI

recientemente caracterizadas, como L. sa/ce, L. cunatus, C. piscicola y C. divergens, por le que la hemos utilizado en la identificacin y clasificacin de nuestros aislados.

En las tablas IV. 2 y IV. 3 se muestran las caractersticas morfolgicas y bioqumicas: ms significativas de nuestros aislados. De ellas se deduce que se trata de bacilos homofermentativos, que crecen a 15 oc, no fennentan el manitol, pero si la ribosa, sacarosa y trealosa por lo que, siguiendo el esquema de la figura 5. 1, los clasificamos tentativamente como L. sa/ce; las caractersticas descritas coinciden con las sealadas por Kandler y Weiss (1986) y por Champomier y col., (1987) para esta misma especie.

En nuestro caso, ninguna de las cepas aisladas crece en medio MRS de pH 3,9. Schillinger y LOcke (1987b) han sealado que aproximadamente el 11% de las cepas de E. sa/ce no crecen a dicho pR. A este respecto conviene destacar que los lactobacilos incluidos en las estreptobacterias atpicas son menos acidificantes y acidotolerantes que los dems (Reuter, 1975; Reuter, 1981).

Todas las cepas analizadas crecieron a una concentracin de cloruro sdico del 7%, a excepcin de la nmero 77. lo que coincide con los resultados de Champomier y col. (1987), Schillinger y LOcke (1987b), M0rtvedt y Nes (1990) y Rodrguez (1991). Sin embargo, ninguna de las cepas estudiadas se desarroll cuando la concentracin de cloruro sdico fu del 10%. Existen discrepancias en cuanto a la capacidad de E. sa/ce de desarrollarse a esta concentracin de cloruro sdico, ya que mientras Schillinger y LOcke (1987b) indican que el 93 % de 131 cepas de E. sa/ce crecen a esta concentracin, Champomier y col. (1987) mantienen que se trata de una caracterstica excepcional.

220

DISCUSION

Leuconosroc Lacrobacill heremfermentativos Lactococcus homofermentativos

L.

subsp. casei

subsp. pseudo pto ntoruni

-

Figura 5. 1.

Esquema de identificacin rpida de bacterias de origen crnico. Fuente: Schillinger y Licke (1987b).

221

DISCUSION

Las cepas de L. sa/ce analizadas muestran una capacidad variable de hidrolizar la arginina, pues mientras las cepas 90 y 148 producen amoniaco a partir de dicho aminocido, las cepas 31, 77, 177 y 180 no lo producen (tabla IV. 2). Schillinger y LOcke (1987b), observaron que la mayora de las cepas de L. sa/ce posean esta capacidad, lo que concuerda con los resultados de Champomier y col. (1987). Sin embargo, resulta curioso que Kandler y Weiss (1986) describan aL. sa/ce como incapaz de hidrolizar la arginina, ya que la cepa que consideraron tipo, la L. sa/ce ATCC15521. carece de esta capacidad. Reuter (1981) y Rodrguez (1991), concuerdan con nuestros resultados en que la capacidad de hidrolizar la arginina vara de unas cepas de L. sa/ce y de L. curvatus a otras.

La capacidad de algunos lactobacilos de producir cido sulfhdrico es una caracterstica tecnolgica perjudicial, ya que su proliferacin en los alimentos acarrea su deterioro (Egan. 1983). Ninguna de las cepas que hemos ensayado produca cido sulfhdrico en ninguno de los medios estudiados (tabla IV. 2). No obstante, Schillinger y Locke (1987b), observaron en el 50 % de las cepas de L. sa/ce analizadas la produccin de cido sulfhdrico.

Las cepas de L. sa/ce comparten caractersticas bsicas que las diferencian de otras especies de lactobacilos. Sin embargo, poseen otras propiedades en las que la variabilidad entre cepas es la nota predominanante. Las discrepancias entre la cepa tipo y las propiedades de las de origen crnico explican las dificultades de muchos investigadores para identificar sus aislamientos (Reuter, 1981). En este sentido, la fermentacin de la arabinosa, amigdalina. esculina, arbutina, salicina, celobiosa, maltosa y lactosa, que en la descripcin deL. sa/ce en el Berizevs Manual of Svstematic Bacterioloav (Kandler y Weiss, 1986) se admiten como pruebas de identificacin, variaron en las 13cepas de esta especie que analizaron Champomier y col. (1987>. Quizs esto justifique la variabilidad de nuestras cepas en lo que concierne a fermentacin de azcares.

222

DISCUSlON

Que todos nuestros aislados se hayan identificado como L. sa/ce no es sorprendente. ya que algunos investigadores han observado que esta especie puede convertirse en la predominante a las temperaturas de maduracin normalmente empleadas en Europa en la elaboracin de los embutidos crudos (LOcke. 1986; Schillinger y LOcke, 1987a). LOcke y Hechelmann (1987) apoyan esta observacin al confirmar el predominio natural deL. sa/ce y L. curvatus en embutidos europeos madurados tradicionalmente.

Holy y Holzapfel (1988) tambin han observado que entre las bacterias lcticas aisladas de carne de vacuno, envasada a vaco y almacenada a temperaturas de refrigeracin, hay un fuerte predominio de L. sa/ce, constituyendo L. sa/ce, L. curvatus y E. bavaricus casi el 80 % del total de bacterias lcticas identificadas. Conviene recordar que L. bavaricus se diferencia deL. sa/ce en que carece de racemasa (Kandler y Weiss, 1986a). Asimismo, Monte! y col. (1989) consideran a L saL--e como la bacteria lctica ms abundante en la carne de vacuno. Korkeala y Mkel (1989), utilizando el esquema de clasificacin de Sehillinger y LOcke (1987b), han establecido que L sa/ce es la bacteria lctica mayoritaria de los productos crnicos envasados a vaco. Hastings y col. (1986) tambin han observado que E. sa/ce es la especie predominante en la carne picada de vacuno irradiada (5 KGy), adjudicando a esta especie 100 de las 113 cepas aisladas.

Globalmente consideradas, y de acuerdo con numerosos estudios anteriores, las estreptobacterias atpicas tambin han constituido el grupo bacteriano ms numeroso del bacon (Cavett, 1963), de una gran variedad de productos crnicos (Reuter, 1975) y de las carnes envasadas a vaco (Mol y col., 1971; Reuter. 1975; Kitchell y Shaw, 1975; Hitchener y col., 1982; Holzapfel y Gerber, 1986). Su presencia se ha considerado deseable, ya que contribuyen al aumento de la vida til de los productos citados (Egan. 1983). Recientemente, y como contribucin a una mejor comprensin de la clasificacin de las bacterias lcticas de origen crnico, Champomier y col. (1987) han comprobado que los 6 grupos de lactobacilos

223

LIVSCUSION

aislados de productos crnicos por Laban y col. (1978) y la mayora de los integrantes del grupo 11 de Shaw y Harding (1984). encajan perfectamente en la descripcin tipo de U saL-e.

Actualmente L. saL-e y L. curvanis se consideran microorganismos psicrotrofos, siendo de entre las bacterias lcticas los que crecen a las temperaturas ms bajas (Reuter, 1981; Kandler y Weiss, 1986

9.

Esta caracterstica se refleja en todas las cepas analizadas, ya que

todas ellas se desarrollan a 4 oc (tabla IV. 2). Estos resultados coinciden con los obtenidos por Schillinger y LOcke (1987b) y Champomier y col. (1987), dado que el 99 % de las cepas deL. sa/ce estudiadas por los primeros, y todas las ensayadas por los segundos, crecieron a 4 0C. Por el contrario, slo el 50 % de las cepas de L. planrarwn se desarrollan, y dbilmente, a esta temperatura (Reuter, 1981; Schillinger y LOcke, 1987b). Hasting y Holzapfel (1987) han observado que ninguna de la 100 cepas de L. sa/ce aisladas de carne radurizada se desarrollaban ni a 4 oc ni a 8 0C. Quizs esta anomala se deba a alteraciones de la fisiologa celular de los lactobacilos provocadas por la irradacin.

De nuestras cepas de U sa/ce nicamente las 148 y 177 se desarrollan a 45 0C. La mayora de los estudios realizados hasta la fecha, coinciden en sealar que la mayor parte de las cepas de L. sa/ce no se desarrollan a 45 oc (Reuter. 1975; Champomier y col., 1987; Hasting y Holzapfel, 1987; Korkeala y Mkel, 1989) o lo hacen muy dbilmente (Reuter, 1981). Sin embargo, Schillinger y LOcke (1987b) han observado que el 87 % de las cepas de L. sa/ce y el 77 % de las de L. curatus, crecen a dicha temperatura. La mayora de las cepas deL. plantarun sise desarrollan a 45 0C (Reuter, 1981: Schillinger y LOcke, 1 987b).

La temperatura ptima de crecimiento de las bacterias lcticas constituye un parmetro de gran importancia tecnolgica en la eleccin de cultivos iniciadores crnicos. As, mientras 1>.
acdlactic

se desarrolla bien a temperaturas superiores a 40 0C, las temperaturas ptimas de

crecimiento de It pentosaceus y L. planta-un se sitan entre 30 y 35 0C. siendo las deL.

224

DISCUSION

sa/ce y L. Curvatus algo menores (Locke y Hechelmann, 1987). En un estudio comparativo de

las bacterias lcticas normalmente incluidas en los cultivos iniciadores crnicos (L. sa/ce, L curvatus, L. planrarurn, P. acidflactici y 1. penzosaceus ), Schillinger y Locke (1989) comprobaron que L. saL-e era la especie que se desarrolla ms rpidamente y con mayores recuentos en una mezcla crnica mantenida a 20 0C; su mayor rapidez de desarrollo fu especialmente significativa respecto de los lactobacilos nativos de un lote control a] que no se le haba adicionado ningn cultivo iniciador.

V. 4.- Esoectro antimicrobiano de los sobrenadantes libres de clulas de las cepas de L. sa/ce seleccionadas, una vez neutralizados y concentrados

El conocimiento exacto del espectro antimicrobiano de las bacteriocinas producidas por las bacterias lcticas es muy importante, ya que su empleo podra inhibir el desarrollo de las bacterias lcticas que se utilizan como cultivos iniciadores en la elaboracin de productos crnicos. En este sentido. Hammes y col. (1990) observaron que cepas de E. curvatus y E. sa/ce, productoras de sustancias inhibidoras no inhibian nicamente a las bacterias contaminantes, como S. aureus, sino que tambin afectaban a microorganismos que se emplean corrientemente como cultivos iniciadores como E. plantarunz o Micrococcus varians. Por tanto, el conocimiento de las propiedades antimicrobianas de las bacterias lcticas, facilitar la seleccin de las cepas que formen parte de un cultivo iniciador, de forma que se minimicen los riesgos sanitarios provenientes los productos crnicos.

Los sobrenadantes libres de clulas, neutralizados y concentrados, de 4 cepas de E. saL-e (77, 90, 148 y 180), ejercieron una actividad antagonista diversa en distintos microorganismos indicadores (tabla IV. 1). El espectro antimicrobiano de cada una de las cepas es significativamente distinto, lo que induce a suponerque las sustancias antimicrobianas son distintas entre s. Este aspecto ya haba sido observado por Bhunia y col. (1988), quienes

225

DISCUSION

comprobaron que algunas cepas de pediococos eran ms activas que otras frente a diversos microorganismos patgenos y alterantes de los alimentos.

La actividad antimicrobiana de las cepas de L. sa/ce estudiadas no se limita a especies bacterianas filogenticamente prximas, como parece ser la situacin predominantante en las sustancias inhibidoras producidas por el gnero Lactobacillus (Andersson y col., 1988; Schillinger y Holzapfel, 1990; Toba y col., 1991), sino que tambin afecta a microorganismos Gram-positivos, patgenos y alterantes de los alimentos de gran inters en la industria crnica como los pertenecientes a los gneros Lisreria, Swphylococcus y Closrridiunz. Tambin es importante destacar que las cepas ensayadas no inhiben el desarrollo de 5. carnosus ni de M. varians, microorganismos cuya presencia en los alimentos no slo es beneficiosa sino deseable, ya que son los responsables de reacciones qumicas que influyen beneficiosamente en la calidad higinicay en las caractersticas organolpticas de los alimentos.

Algunos investigadores han observado la reduccin de los nitritos y el enrojecimiento de los embutidos se suprimen cuando se utiliza como iniciador un cultivo compuesto de cepas de L. sa/ce antagonistas de M. varians (Hammes y col., 1990). La resistencia de 5. carnosus y M. varians, microorganismos utilizados como cultivos iniciadores comerciales, frente a la accin antimicrobiana de las cepas de L. sa/ce que hemos aislado en este trabajo es muy importante, ya que permite su empleo en los cultivos iniciadores al garantizar la calidad higinica de los alimentos sin inhibir reacciones bacterianas deseables.

Por otro lado, la posibilidad de inhibir el desarrollo de L. monocvtogenes es muy interesante, sobre todo si se tiene en cuenta que este microorganismo crece en un intervalo de temperaturas muy amplio (1-45 0C) y en presencia de un lO % de NaC (Seelinger y iones. 1986); adems permanece viable durante el procesado y almnacenamniento de algunos alimentos fermentados (Juntilla y col., 1989), proliferando en sustratos cuyo pH es ligramente menor

226

DISCUSION

de 5,6 (Conner y col., 1986); no obstante, es relativamente sensible a los medios ms cidos (Rodrguez, 1991).

Los alimentos pueden contaminarse durante su elaboracin y manipulacin con 5. aureus que, posteriormente, puede desarrollarse y, si son cepas enterotoxignicas, producir toxinas (Smith y Palumbo, 1981), que pueden originar brotes de intoxicaciones alimentarias. La actividad antimicrobiana de las cepas de L. sa/ce analizadas frente a 5. aureus enterotoxignico permite suponer que su empleo, junto a otros factores de seguridad (Hammes y.col.. 1990), podra aumentar mucho la calidad higinica de los alimentos y disminuir la incidencia de estas toxiinfecciones alimentarias.

El crecimiento y produccin de toxinas por C. boulinurn se previene mediante la adicin a los alimentos de nitratos y nitritos; sin embargo, su incorporacin a los alimentos est limitado por su posible conversin en nitrosaminas, compuestos que son cancergenos. Smith y Palumnbo (1981) comprobaron que las bacterias lcticas previenen el crecimiento y produccin de toxinas de C. borulinun;, nicamente cuando el sustrato contiene glucosa y nitritos. Recientemente (CFR, 1988), la Food and Drues Administration ha permitido la utilizacin de la nisina como antagonista de C. botulinum en algunos alimentos. Por ello, la capacidad de nuestras cepas de L. sa/ce de inhibir el desarrollo de C. botulinunz, resulta esperanzadora en cuanto a su posible utilizacin como inhibidor del desarrollo de este patgeno en los alimentos. Asimismo, la utilizacin de las cepas aisladas en este trabajo o las sustancias inhibidoras elaboradas por ellas, permitiran disminuir los niveles de nitritos habitualmente empleados en algunos derivados carnmcos.

Se sabe poco sobre el efecto de las bacterias lcticas en C. pe,fringens. Baran y Stevenson (1975) demnostraron que este microorganismno superviva en los embutidos crudos madurados de pavo, elaborados con P. cerevisiae comno cultivo iniciador. Aunque no se

227

DISCUSION

conoce bien la persistencia o destruccin de C. perfringens durante el procesado, almacenamiento y distribucin de muchos productos crnicos, es posible hipotetizar que las sustancias antimicrobianas producidas por las cepas aisladas en nuestro trabajo dificultaran el desarrollo de este patgeno.

La sensibilidad de las listerias a sustancias antagonistas de especies del gnero Lactobacillus no es sorprendente, ya que estos dos gneros estn estrechamente relacionados (Wilkinson y Jones, 1977; Seelinger y Jones, 1986; Rhuland y Fieder, 1987). Adems, se han publicado numerosos trabajos que confirman la actividad antimicrobiana de diversos lactobacilos sobre L. rnonocyrogenes (Harris y col., 1989; Schillinger y Holzapfel, 1990; Harding y Shaw, 1990). Sin embargo, en los trabajos publicados, la actividad antagonista se limita a otros lactobacilos y listerias. siendo muy rara su actividad frente a otros patgenos Gram-positivos como 5. aureus (Andersson. 1986; Talarico y col., 1988). Hasta ahora, no tenemos constancia de que existan cepas de L. sa/ce cuyo espectro antimicrobiano sea tan amplio corno el de las cepas que se han aislado en este trabajo.

El espectro antimicrobiano de estas cepas es similar al mostrado por cepas del gnero Pediococcus. Sin embargo, la sntesis de sustancias antimicrobianas por especies de origen crnico pertenecientes a este gnero se limita nicamente a P.
acdilactici

H con actividad

antimicrobiana frente a microorganismos Gram-positivos como C. perfringens, Listeria

nzonocyto genes

y Staphylococcus aureus y dos especies Gram-negativas, Acromonas

hydrophila y Pseudornonas pulida (Bhunia y col.. ~988).

Por lo que respecta a los lactococos la nisina producida por Lactococcus lactis inhibe el desarrollo de L. monocvtogenes (Ehunia y col, 1988) y especies del gnero Clostridiurn dificultando, adems, la germinacin de las esporas de C. botulinum (Daeschel. 1989). Sin embargo, es inactiva frente a microorganismos Gram-negativos. hongos o levaduras.

228

DiSCUSION

El amplio espectro de accin de las cepas de L. saL-e estudiadas en este trabajo y, de la cepa 148 en particular, permite concebir esperanzas sobre el futuro empleo de estos microorganismos como agentes conservadores de ciertas carnes y productos crnicos, ya que es precisamente la especificidad mostrada por las bacterias lcticas la que ha limitado el empleo de estos microorganismos como cultivos iniciadores o protectores (Hastings y Stiles, 1991). No obstante, antes de estimular su utilizacin en la industria crnica. se necesita conocer silos resultados de inhibicin obtenidos in vitro son reproducibles en un sistema crnico experimental.

y. 5.- Efecto de la composicin del medio de cultivo en la produccin de actividad inhibidora

Una vez seleccionado el microorganismo con mayor actividad antimcrobiana y con unas caractersticas de crecimiento ms favorables, se necesita establecer las condiciones ptimas de produccin de su actividad para acometer su purificacin con las mejores garantias de xito. Para ello se seleccion la cepa L. sa/ce 148, cuyo intervalo de temperaturas de crecimiento es muy amplio (4-45 oc) y cuyo sobrenadante cultural presenta una actividad antimicrobiana comparable, sino superior, al de las otras cepas de L. sa/ce aisladas.

Tagg y col. (1976) ya sealaron que ciertos componentes del medio de cultivo podran ser crticos en la produccin de ciertas bacteriocinas. Sin embargo. existen pocos trabajos sobre el efecto de los distintos nutrientes en la produccin de compuestos antagonistas por las bacterias lcticas (Reddy y Ranganathan. 1983; Batish y col.. 1990; Biswas y col., 1991); en la mayor parte de los casos no se ha llegado, a resultados concluyentes. Algunas cepas productoras de sustancias antimicrobianas pierden esta capacidad cuando crecen en medios lquidos y la recuperan cuando lo hacen en medios slidos o semislidos, tal es el caso de la lactacina B (Barefoot y Klaenhammer. 1983) y de la propionicina PLG-l (Lyon y Glatz,

229

DISCUSION

1991). Contrariamente a los resultados obtenidos por stos investigadores, L. sa/ce 148 mostraba actividad inhibidora tanto en medios slidos como lquidos.

De los resultados obtenidos en este trabajo (tabla IV. 5). debe destacarse la ausencia de actividad antagonista cuando L. sa/ce 148 se desarrollaba en medios de cultivo semidefinidos suplementados con hidrolizados de proteinas lcteas (caseinas). No sucede as cuando el suplemento es un hidrolizado de proteinas crnicas (peptona o extracto de carne), a pesar de que la actividad antagonista es fcilmente mensurable y cuantificable. La produccin ptima acaece en el medio complejo MRS. Esta ltimo observacin concuerda con la de McGroarty y Reid (1988) acerca de la produccin de bacteriocinas por L. casei sp. rharnnosus y L. acidophilus 76. Los resultados obtenidos refuerzan la teora de Schillinger y LOcke (1989) segn la cual las bacterias lcticas aisladas de productos crnicos, seran ms adecuadas para asegurar la calidad higinica de la carne y productos crnicos que las procedentes de otros productos.

Tampoco se detect la actividad antimicrobiana en L. sa/ce 148 cuando ste se desarrollaba en caldo de APT sin suplementar. Sin embargo, cepas Carnobacterun; pisccola (Ahn y Stiles, 1990a) y Leuconosoc gelidunz (Hastings y Stiles, 1991), aisladas de productos crnicos envasados al vaco, sintetizan bacteriocinas en caldo de APT. Lo mismo ocurri en el medio BRI, que es un caldo de cultivo compejo de cuya composicin forman parte hidrolizados de cerebro y corazn bovino. En este caso resulta muy dificil explicar la ausencia de actividad antagonista, tanto en el medio sin modificar como en el suplementado con diversos extractos crnicos, dada la extraordinaria riqueza nutritiva de este medio.

Las diferencias observadas en la produccin de actividad antimicrobiana dependiendo de la fuente proteica, se justificarian por la variacin en algn componente especfico (posiblemente aminoacdico) o por la existencia de mecanismos reguladores de origen

230

DISCUSION

gentico. estimnulados o reprimidos por componentes del extracto proteico. Esto ltimo explicara la falta de actividad inhibidora de L. saL-e 148 al crecer en el caldo BHI, tanto suplementado como sin suplemento. Morishita y col. (1974), demostraron que algunos mutantes de L. cosed sintetizaban detenninados aminocidos en medios carentes de los mismos; dicha capacidad la perdan cuando crecan en medios complejos. De los resultados obtenidos se deduce que sera conveniente estudiar ms profundamente estos posibles mecanismos reguladores, con el fin de predecir la posible inhibicin o represin de la actividad antagonista de L. sa/ce 148, cuando ste se desarrolle en la carne o en sus productos.

V. 6.- Parmetros cinticos

produccin de la actividad inhibidora de

L. sa/ce 148 a diversas temperaturas

L. sa/ce 148 se desarroll a 4, 8. 16, 25 y 32 0C, tanto en medio complejo MRS como en medio mnimo MM con triptosa (tabla IV. 6), obtenindose unos parmetros de crecimiento similares a los encontrados por otros investigadores con cepas de L. sa/ce y otras bacterias lcticas de origen crnico (Rodrguez. 1991).

Segn Daeschel y col. (1990) la produccin de bacteriocinas por las bacterias lcticas puede iniciarse en cua[quier etapa del crecimiento, tanto en su comienzo (fase logartmica) como al final (fase estacionaria). La actividad antagonista de L. sa/ce 148 es detectable y cuantificable al poco tiempo de iniciarse su crecimiento en todas las temperaturas ensayadas (fig. 4. 30 a 4. 34). Estos resultados coinciden con los de la mayor parte de los trabajos publicados (Glvez y col., 1986; Ahn y Stiles, 1990b; Hastings y Stiles. 1991) en los que la producin de sustancias inhibidoras parece ser una propiedad asociada al crecimiento.

Corno ya sealaron Ahn y Stiles (199Gb). la produccin de bacrnriocinas en la fase mnicial del crecimniento bacteriano podra favorecer el predominio de la cepa productora en una

231

DISCUSlON

poblacin bacteriana mixta con bacterias sensibles. Asimismo, la deteccin de la actividad antagonista al comienzo del crecimiento indica que no corresponde a un metabolito secundario. La disminucin de la actividad durante la fase estacionaria (fmg. 4. 34), podra deberse a la accin de enzimas proteoliticos endo o exocelulares, a que la sustancia responsable de la actividad se convierte en otros metabolitos o a su inestabilidad ante el aumento de la acidez del medio de crecimiento.

El incremento de la actividad antibacteriana al hacerlo la temperatura se debe, al parecer, al mayor desarrollo celular, ya que la actividad aumenta a medida que la temperatura se aproxima a la ptima de crecimiento deL. sa/ce 148. Hasting y Stiles (1991) comprobaron que la produccin de bacteriocinas porLeuconosoc gelidun; es directamente proporcional a la masa celular del cultivo microbiano. Es de destacar que L. sa/ce 148 produca actividad antimicrobiana a todas las temperaturas ensayadas.

La produccin de la actividad antagonista a temperaturas de refrigeracin, contribuida a dificultar el desarrollo de los microorganismos alterantes y patgenos en los alimentos refrigerados.

V. 7.- Caracterizacin biocuimica narcial de la actividad antimicrobiana deL, sa/ce 148

Una vez establecidas las condiciones ptimas de crecimiento

de produccin de la

actividad antimicrobiana deL. sa/ce 148, el siguiente paso consisti en intentar su purificacin, con el fin de separar la entidad activa de otros productos o restos celulares y de las protenas del medio de cultivo. Hay que reconocer que el medio complejo MRS no es el ms indicado para iniciar la purificacin de la actividad antagonista de L. sa/ce 148, ya que los

sobrenadantes procedentes de este medio contienen una concentracin elevada de protenas y pptidos (Barefoot y Klaenhamnmer, 1984), lo que no sucede con el medio mnimno con triptosa

232

DISCUSION

que, siendo un medio semidefmnido sencillo, permite la sntesis de la actividad antimicrobiana deL. saL--e 148 (tabla IV. 6).

Debido a la heterogeneidad de las bacteriocinas, sus protocolos de purificacin se han diseado empricamente para cada una de ellas.

Barefoot y Klaenhammer (1984), tras emplear sin xito la cromatografa de intercambio inico, purificaron la lactacina E creando condiciones disociantes (urea 8M) antes de someterla a ultracentrifugacin y a cromatografa de filtracin en geles. Los resultados obtenidos indicaron que el peso molecular de la bacteriocina parcialmente purificada era de 6.500 daltons. Sin embargo, cuando la lactacina B parcialmente purificada se someti a electroforesis en poliacrilamida con dodecil sulfato sdico (SDS-PAGE) no se apreciaron bandas en los geles, a pesar de teirlos con reactivos de plata, que es un proceder de gran sensibilidad para la deteccin de las bandas de proteinas en los geles. Dos aos ms tarde, Joerger y Klaenhammer (1986) tambin purificaron la helveticina .1 por cromatografa de filtracin en geles que llevaban dodecil sulfato sdico (SOS) como agente disociante. El peso molecular de la bacteriocina purificada fu de unos 37.000 daltons.

De otra parte, Rammelsberg y Rader (1990) han encontrado dificultades al intentar purificar la brevicina 37 y la caseicina 80, utilizando los procedimientos de purificacin proteica tradicionalmente empleados. Dichos investigadores han observado, asimismo. que la concentracin de los sobrenadantes por liofilizacin origina una prdida importante de la actividad antimicrobiana.

En contraste con la utilizacin de las tcnicas cromatogrficas de filtracin en geles, empleadas en la purificacin de bacteriocinas producidas por lactobacilos, la purificacin de la pediocina PA-l (Gonzalez y Kunka, 1987) y de la pediocina AcH (Bhunia y col.. 1988),

233

DISCUSION

producidas por pediococos, se ha realizado por cromatografa de intercambio inico. El peso molecular de la pediocina PA-I parcialmente purificada (16.500 daltons) se determin por cromatografa de filtracin en geles, mientras que el de la pediocina Acl-i (2.700 daltons) se estim por SDS-PAGE.

En nuestro trabajo, la purificacin de la actividad antimicrobiana exocelular deL. sa/ce 148, se realiz concentrando los sobrenadantes por liofilizacin y separando las protenas por cromatografa de filtracin en geles. Utilizamos la urea (a una concentracin 1 M) como agente disociante de los posibles agregados proteicos, formados por la sustancia antimicrobiana consigo misma o con otros componentes del medio del cultivo (figuras 4. 35 a 4. 37). El proceso de purificacin se tradujo en un aumento poco apreciable de la actividad inhibidora especfica (7 veces) y en una baja recuperacin de la actividad inhibidora original (8 %) (tabla IV. 7). Los resultados obtenidos confirman que, segn se ha observado en otras ocasiones, las bacteriocinas son, a veces, bastante resistentes a su purificacin por las tcnicas standar de separacin de proteinas (Ranimelsberg y Rader, 1990). La concentracin de las muestras por liofilizacin antes de someterlas a cromatografa de filtracin, posiblemente afecta negativamente a la actividad antimicrobiana.

La prdida de actividad, que a menudo es grande, producida durante la purificacin constituye un problemna corriente en las bacteriocinas originadas por las bacterias lcticas (Tagg y col., 1976).

Barefoot y Klaenharnrner (1984) y Joerger y Klaenhammer (1986), nicamente lograron recuperar el 0,4 % de la actividad inhibidora inicial de la lactacina E y el 4 % de la helveticina J. Sin emnbargo, mientras la purificacin final de la lactacina B fu de 3.222 veces y 1-a de la helveticina 3 de 837 veces, la purificacin final de la sustancia antimicrobiana de L. sa/ce 148 es mucho menor. De ello se deduce que el mtodo de purificacin empleado es poco

234

DISCUSION

eficaz, por lo que conviene desarrollar otros ms potentes.

La sustancia antimicrobiana de L. sa/ce 148 parece que se sintetiza en forma de poliptido de pequeo tamao molecular como lo demuestra que, en los experimentos de filtracin en geles de Sephadex G-150 fino, G-75 y G-50 (figuras 4. 35 a 4. 37), se eluye lejos del volumen de vacio, volumen en el que se encuentran las molculas de un tamao molecular mayor que el dimetro de poro del gel. En este aspecto, la sustancia antimicrobiana de L. sa/ce 148 difiere de la lactocina 25 (Upreti y Hinsdill, 1973), lactacina B (Barefoot y Klaenhammer, 1984), helveticina J (Joerger y Klaenhammer, 1986), lactacina F (Muriana y Klaenhammer, 1991), propionicina PLG-1 (Lyon y Glatz, 1991) y la bacteriocina deL. sa/ce 449 (Rodrguez, 1991), que se aislaron primero, bien como agregados proteico-polisacridos complejos (partculas globulares parecidas a las micelas) o bien como grandes agregados proticos, que se separaron ms tarde utilizando diversas tcnicas analticas.

Una vez realizada la purificacin parcial de la actividad antimicrobiana conviene realizar su caracterizacin fsico-qumica. Uno de los criterios bsicos para que una sustancia antimicrobiana se considere una bacteriocina es que sea un componente proteico biolgicamente activo (Tagg y col.. 1976), lo que se determina por su sensibilidad a diversos enzimas proteoliticos. En la tabla IV. 8 se mrmuestra el efecto de diversos enzimas proteolticos, lipolticos y amilolticos, en la actividad antimicrobiana exocelular parcialmente purificada de L. saL--e 148. En ella se observa que los enzimas inespecficos, corno la papana, proteasa II y proteasa XIV, anulan la actividad inhibidora, mientras que otros enzimas ms especficos la disminuyen mucho; de ah se deduce que la sustancia antimicrobiana deL. sa/ce 148 posee una estructura proteica biolgicamente activa.

Adems, su resistencia a la accin de los enzimas lipoliticos y amiloliticos indica que en su composicin no entran a formar parte elementos lipdicos ni hidrocarbonados y, silo

235

DISCUSION

hacen, no influyen en su actividad antimicrobiana.

La sustancia antimicrobiana parcialmente purificada deL. sa/ce 148 es muy estable en un amplio intervalo de valores de pH (fig. 4. 38), mostrando su mayor actividad a valores de pH comprendidos entre 5,6 y 6,6; cuando el pH se situaba entre valores extremos (2,6-4,6; 10-12) la actividad disminua ligeramente (sin superar nunca el 20%).

Gonzalez y Kunka (1987), comprobaron que la pediocina PA-1 producida por 1. acidilactic era estable entre valores de pH de 4 y 7, si bien mostraban ligeras prdidas de actividad a pH de 2.3 y 10. Bhunia y col. (1988) establecieron el intervalo de pH al que la pediocina AcH era activa entre pH 2,5 y 10 y observaron una prdida total de la actividad cuando el pH era mayor de 10.

La nisina, producida por L. lactis es inactiva cuando el pH es superior a 7 (Hurst, 1981; Liu y Hansen, 1990). La propionicina PLG-1 permanece estable a valores de pH entre 3 y 9, con ligeras prdidas de actividad a pH de 3-4 (Lyon y Glatz, 1991).

La gran estabilidad frente al pH mostrada por la bacteriocina de L sa/ce 148 es muy imnportante de cara a su posible utilizacin como agente antimicrobiano, tanto en los alimentos fermentados como en otros productos alimenticios.

La resistencia al tratamiento trmico es una caracterstica muy extendida entre las bacteriocinas, no obstante, el criterio seguido para determinar la estabilidad de estas sustancias vara bastante, ya que esta propiedad depende del grado de purificacin de las bacteriocinas y de otros factores como pH, fuerza inica y presencia de molculas termoprotectoras (Tagg y col., 1976). La existencia de bacteriocinas termosensibles es menos corriente, aunque entre stas se encuentran la helveticina J (Joerger y Klaenhammer, 1986), la caseicina 80

236

DISCUSION

(Rammelsberg y Rader, 1990), la bacteriocina sintetizada porL. delbruec/cii sp lactis (Toba y col., 1991) y la propionicina PLG- (Lyon y Glatz, 1991). La bacteriocina producida porL. sa/ce 148 es muy termoestable (fig. 4. 39), parecindose en esto a las bacteriocinas de L. acidophilus, (Barefoot y Klaenhammer, 1983; Muriana y Klaenhammer, 1987), L. helvericus (Upreti y Hinsdill, 1973; Joerger y Klaenhammer, 1986), L. plantarurn (West y Warmer, 1988; Daeschel y col., 1990), L. sa/ce (Schillinger y LOcke, 1989; M0rvedt y Ness, 1990) y L. brevis (Rammnelsberg y Raedler, 1990).

La gran termoestabilidad de la bacteriocina de L. saL-e 148 le confiere ventajas en cuanto a su posible utilizacin en alimentos higienizados por el calor, ya que permanece biolgicamente activa tras los tratamientos de pasterizacin y esterilizacin a los que se somenten stos productos.

La determinacin del peso molecular aparente de la bacteriocina de L. sa/ce 148 mediante filtracin en geles de Sephadex G-50, di un peso molecular de 4640 daltons (tabla

IV. 9). La elucin de esta bacteriocina en un solo pico de bajo peso molecular no es corriente,
dada la baja concentracin del agente disociante empleado (urea 1M en el tampn de disolucin y urea 0,1M en el de elucin). Lo corriente es que las bacteriocinas producidas por las bacterias lcticas formen agregados de alto peso molecular (Muriana y Klaenhammer, 1991; Rodrguez, 1991).

El peso molecular de las bacteriocinas de las bacterias lcticas es muy variable, con molculas grandes, como la helveticina J cuyo peso molecular es de 37.000 daltons (Joerger y Klaenhammer, 1986), la caseicina 80 de un peso molecular entre 40.000 y 42.000 daltons (Rammnelsberg y Raeder, 1990) y la bacteriocina de L. saL-e 449 de unos 30.000 daltons (Rodrguez, 1991). No obstante, tal y como ocurre con la bacteriocina de L. sa/ce 148, la mayor parte presentan un peso molecularrelativamente pequeo, menor de 10.000 daltons. En

237

DISCUSION

este grupo se incluyen: nisina (Hurst. 1981), diplococina (Davey y Richardson, 1981), lactacina B (Barefoot y Klaenhammer, 1984). pediocina AcH (Bhunia y col., 988). actacina

F (Muriana y Klaenhammer, 1991), lactocina 5 (M0rtvedt y col., 1991) y carnocina U149

(Stoffels y col., 1992). Cuando las bacteriocinas forman agregados moleculares es difcil determinar su peso molecular mediante tcnicas de filtracin en geles, por lo que se recurre a la electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico (SDS), con o sin urea.

Sin embargo, la utilizacin de la electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS, con o sin urea, para determinar el peso molecular de Ja bacteriocina deL. sa/ce 148 di resultados negativos cuando la tincin se realiz con Azul Brillante de Coomasie (Laemmli, 1970). Esto no es extrao, ya que Muriana y Klaenhammer (1991) obtuvieron el mismo resultado al determinar el peso molecular de la lactacina F con este colorante. Por otra parte, Davey y Richardson (1981) y Stoffels y col. (1992), observaron la existencia de una banda difusa asociada al frente electrofortico al determinar el peso molecular de la diplococina y la carnocina U149 respectivamente. Cuando Barefoot y Klaenhammer (1984) utilizaron nitrato de plata como agente tintorial para determinar el peso de la lactocina B obtuvieron, igual que nosotros (fig. 4. 40), una banda de tincin difusa asociada al frente electrofortico.

La dificultad de determinar el peso molecular de las bacteriocinas por tcnicas electroforticas se atribuye a que las condiciones creadas durante la electiroforesis originan la hidrlisis espontnea de las molculas proteicas (Muriana y Klaenhammer, 1991); de otra parte, la cantidad de protena depositada en los geles es lo suficientemente grande para poder detectarse con el nitrato de plata, cuyo lmite de deteccin es menor de 1 nanogramo de protena (Merril y col., 1981). Adems, la falta de bandas proteicas en los geles indica que la muestra se encuentra libre de otras proteinas contaminantes, lo que facilita la determinacin de la composicin aminoacdica de las bacteriocinas parcialmente purificadas.

238

DISCUSION

Al comparar la composicin aminoacdica de la bacteriocina de Ib. sa/ce 148, obtenida por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) con la de otras bacteriocinas de peso mnolecular semejante, se obtiene la tabla V.1. De esta tabla se desprende que, al igual que la lactocina 5 de Ib. sa/ce L45 (M0rtvedt y col., 1991), la bacteriocina de Ib. sa/ce 148 tiene en su composicin un 50% de aminocidos apolares, presentando ambas, adems, una cierta similitud en su composicin cualitativa pero no cuantitativa, de aminocidos. De la observacin de la tabla tambin se desprende que la bacteriocina de L. sa/ce 148 difiere de otras como la nisina. subtilina y diplococina (Davey y Richardson, 1981), lactacina E (Muriana y Klaenhammer, 1991) ola carnocina U149 (Stoffels y col., 1992)

La mejor conocida de las bacteriocinas producidas por las bacterias lcticas es la nisina, de la que no slo se conoce su composicin de aminacidos sino, adems, la disposicin de los mismos en la cadena peptdica. Una caracterstica fundamental que diferencia a la nisina, subtilina, epidermina (Ailgaier y col., 1986), galliderinina (Kellner y col., 1988), PepS (Kellner y col., 1989), actocina 5 (M0rtvedt y col., 1991) y carnocina

U149 (Stoffels y col., 1992) de otras bacteriocinas como la diplococina y la lactacina E es la

presencia, en las tres primeras, de aminocidos modificados postransacionalmente como la dehidroalanina, dehidrobutimna, lantionina y beta-metil lantionina. Esto determina que se haya propuesto el nombre de lantibioticos para aquellas bacteriocinas que, como la nisina, posean tales aminocidos (Muriana y Klaenhammer, 1991).

En el cromatograma obtenido al anlizar por HPLC el hidrolizado de la bacteriocina de Ib. sa/ce 148 (resultados no mostrados), tambin se observa la presencia de un pico cromatogrfico que no se corresponde con ninguno de los patrones empleados.

239

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240

DiSCUSION

En nuestro caso fu imposible determinar con exactitud la identidad de este aminocido, sin embargo, su elucin en la columna cromatogrfica, en una posicin muy prxima a la glicina, coincide con los resultados obtenidos al analizar, por el mismo sistema de

HPLC, la lactocina 5 (M0rtvedt y col.. 1991) y la carnocina U149 (Stoffels y col., 1992).
Estos autores demostraron que la lantionina eluye precisamente en esta posicin, por lo que no es descabellado plantear la hiptesis de que el aminocido no identificado de la bacteriocina de L. sa/ce 148 fuera la lantionina, lo que la convetira, por definicin, en un lantibitico.

Si bien conviene conocer los aminocidos que conforman la sustancia inhibidora, tambin tiene un gran inters saber la localizacin o secuencia de dichos aminocidos en la estructura proteica. El conocimiento de la secuencia facilitara la elucidacin de los determinantes antignicos de esta bacteriocina, as como su donacin, mediante tcnicas de amplificacin por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en vectores genticos de inters. Tanto la secuenciacin como el estudio de los determinantes, forman parte del esquema de trabajo futuro a desarrollar como continuacin del actualmente en curso. La caracterizacin completa de la bacteriocina de L. sa/ce 148 y el estudio gentico de los mecanismos responsables de su sntesis, permitirn conocer la relacin existente entre su estructura y su mecanismo de accin, sus relaciones estructurales con las bacteriocinas producidas por otras bacterias lcticas y, por ltimo, la biologa molecular de la produccin de bacteriocinas en el gnero Lactobacillus.

V. 8.

Mecanismo de accin de la bactem-iocina producida por Ib. sa/ce 148

La sustancia inhibidora elaborada por Ib. sa/ce 148 se aparta ligeramnente de la definicin que Tagg y col. (1976) dieron de las bacteriocinas, al considera-las como proteinas o complejos proteicos con accin bactericida en especies bacterianas filogenticamente relacionadas con la cepa productora; esto no se cumple en la bacteriocina de Ib. sa/ce 148 que,

241

DiSCUSION

como hemos visto, posee accin bacteriosttica en lodos los microorganismos indicadores estudiados (Tabla IV. 11).

La primera caracterstica, su naturaleza proteica, se cumple en todas las bacteriocinas de las bacterias lcticas descritas hasta la fecha. La segunda, su limitado espectro de accin, ya fu cuestionado por Klaenhammer (1988), quin propuso la divisin de las bacteriocinas de las bacterias lcticas en dos tipos: el primero constituido por sustancias con un espectro de accin limitado a otras bacterias lcticas relacionadas con la cepa productora; a este grupo, que es muy numeroso, pertenecen entre otras, la lactacina E (Barefoot y Klaenhammer, 1983) y F (Muriana y Klaenhammer, 1991), la lactocina 27 (Upreti y Hinsdill, 1975), la helveticina J (Joerger y Klaenhammer, 1985), la sakacina A (Sehillinger y LOcke, 1989), y la lactocina 5 (M0rtved y Ness, 1990). El segundo grupo estara formado por sustancias con un espectro de accin ms amplio en el que. adems de las bacterias lcticas, se incluiran otros microorganismos Gram-positivos como 5. aureus, L. monocytogenes, C. botulinunz y C. pe,f-ingens. Pertenecen a este grupo la nisina, la pediocina AcH y la sustancia antimicrobiana objeto de este trabajo, producida por Ib. sa/ce 148.

En la tercera caracterstica citada por Tagg y col. (1976), el mecanismo de accin bactericida, es donde mayor es la discrepancia con los resultados de este trabajo. Efectivamente, tai y como se aprecia en los recuentos microbianos realizados despus de tratar varios cultivos de diversos microorganismos sensibles con un sobrenadante neutralizado y concentrado deL. sa/ce 148 (tabla IV. 11). el mecanismo de accin de esta bacteriocina es bacteriosttico.

La accin bactericida descrita para las bacteriocinas se produce en dos etapas (Tagg y col.. 1976). En la primera, la bacteriocina se une a receptores especficos situados en la superficie de los microorganismos sensibles. Esta unin altera la permneabilidad de su

242

DISCUSION

membrana; en la segunda etapa de su mecanismo de accin se provoca la ruptura de la membrana y la muerte celular. Esta accin bifsica se ha comprobado mediante examen microscpico, al apreciarse cambios morfolgicos y posterior lisis celular en las bacterias sensibles a la nisina (l-Iurst, 1981), plantaricina SIK-83 (Andersson y coL,1988) y lactacina F (Muriana y Klaenhammer, 1991).

La accin de la nisina se atribuye a su elevada hidrofobicidad, lo que le permite interaccionar con la membrana bacteriana y originar poros en la misma aumentando su permeabilidad y provocando la muerte celular por estallido (Hurst, 1981). Esta accin, similar al efecto surfactante de ciertas molculas hidrofbicas, es tambin la causante de la accin bactericida de la lactacina E (Muriana y Klaenhammer, 1991).

En ocasiones se puede apreciar un efecto bactericida sin que se produzca la lisis celular, lo que ocurre en el caso de la pediocina AcH, cuyo mecanismo de accin ha sido estudiado en profundidad por Bhunia y col. (1991). Esta sustancia ejerce su actividad en varias etapas: (1) inicialmente se une a receptores inespecificos de la pared celular, posiblemente cido lipoteicoico; (2) cuando se saturan estos receptores se une a receptores especficos, originando alteraciones funcionales en la membrana que (3), provocan la prdida de iones potasio y la entrada en la clula de molculas de pequeo tamao; adems, la bacteria pierde su capacidad de multiplicarse. (4) Solo en algunas cepas especialmente sensibles la pared celular pierde su integridad estructural y el microorganismo se lisa. (5) La resistencia mostrada por otras bacterias Gram-positivas se debera a a falta o inaccesibilidad de los receptores especficos y (6) la resistencia de las bacterias Gram-negativas estara motivada por la carencia tanto de receptores especficos, como inespecficos. La lactacina B, que tiene accin bactericida, tampoco origina alteraciones en la permeabilidad de la membrana ni lisis celular (Earefoot y Klaenhammer. 1984).

243

DISCUSION

Las lactostrepcinas (Dobrzanski y col., 1982), lactacina E (Barefoot y Klaenhammer, 1983>, helveticina J (Joergery Klaenhammer, 1985), sakacina A (Schiljingery LOcke, 1989), bacteriocina de Leuconostoc gelicluni (Harding y Shaw, 1990), plantaricina A (Daeschel y col., 1991) y carnocina U149 (Stoffels y col., 1992), junto con las citadas nisina, lactacina F, plantaricina SIK-83 y pediocina AcH son algunas de las bacteriocinas que, como la mayor parte de las producidas por las bacterias lcticas, poseen un mecanismo de accin bactericida independientemente del mecanismo intimo que conduce a la muerte bacteriana.

E] efecto bacteriosttico de la bacteriocina de Ib. sa/ce 148 contrasta con el bactericida de la sakacina A, producida por otra cepa de Ib. saL--e (Sehillinger y LOcke, 1989). Este resultado refuerza la hiptesis, apuntada al analizar el espectro de accin, de que las bacteriocinas producidas por distintas cepas de una misma especie no son idnticas entre s.

Sin embargo esta accin bacteriosttica no es nica dentro de las bacterias lcticas, ya que este carcter se ha descrito en la lactocina 27 de Ib. acidophilus (Upreti y Hinsdill, 1975), aunque en algunos casos se ha observado un efecto bactericida sobre cepas de Ib. nonocytogenes (Raccach y col., 1989); el efecto bacteriosttico tambin se ha descrito en lactobacilos de origen crnico identificados como Ib. sa/ce (Ahn y Stiles, 1990a) y en Leuconostoc gelidurn (Hastings y Stiles, 1991).

Incluso el efecto bactericida atribuido a la pediocina AcH podra no ser tan evidente a tenor de la observacin de los resultados de Ehunia y col. (1988). Segn dichos mnvestigadores, la adicin de pediocina AcH a un cultivo de Ib. plantarurn WSO-30 en crecimiento (con una poblacin inicial de 3 x io7 ufc/ml) origin una disminucin de, nicamnente, 0.8 unidades logartmicas en el recuento de microorganismos viables efectuado una hora despus de dicha adicin. En los recuentos realizados a las 3. 5, 7 y 11 horas posteriores, se observa una recuperacin, mientras posteriormente se mantienen los valores

244

DISCUSION

obtenidos al inicio del experimento (3 x io~ ufc/ml). Mientras tanto, el cultivo control contina su crecimiento normal hasta alcanzar valores de 2 x o~ ufc/ml. Hasting y Stiles (1991) obtuvieron resultados similares a los anteriormente sealados y. a pesar de todo, adjudicaron un mecanismo de accin bacteriosttico a la bacteriocina producida por Leuconostoc gelidunz UALl87.

Los resultados de Bhunia y col. (1988) contrastan con los claramente bactericidas de Schillinger y LOcke (1989) quienes, empleando un procedimiento idntico al nuestro y. muy similar al de Bhunia y col. (1988), comprobaron que los recuentos del microorganismo indicador (cuya poblacin inicial era deS x i05 ufc/ml), disminua 3,5 unidades logartmicas dos horas despus de aadir el sobrenadante libre de clulas, neutralizado y concentrado de Ib sa/ce Lb706; en recuentos posteriores fu imposible detectarlo. Por otra parte, Ehunia y col. (1991) sealan, que la bacteria indicadora es incapaz de multiplicarse; la ruptura de la pared celular y la muerte bacteriana sera un destino reservado nicamente a cepas de microorganismos especialmente sensibles.

Realmente, es difcil aceptar que ninguna de las cepas que emplemos como microorganismos indicadores fuera sensible y que la bacteriocina de Ib. sa/ce 148 ejerciera una accin bactericida en otras cepas sensibles; por ello y, a diferencia de Bhunia y col. (1988), consideramos que la sustancia inhibidora ejerce una accin bacteriosttica ya que detiene el crecimiento de los microorganismos sensibles, disminuyendo su vitalidad y no su viabilidad, algo que no ocurre en las experiencias de Schillinger y LOcke con L. sa/ce LB706.

La nica bacteriocina de las bacterias lcticas de la que se conoce con exactitud la formna en que ejerce su accin bacteriosttica es La lactocina 27, que detiene la sntesis proteica sin afectar la del ADN o ARN, y sin modificar los niveles de APT (Upreti y Hinsdill, 1975). Este mecanismo de accin, diferente del atribuido a otras bacteriocinas. es uno de los motivos

245

DISCUSION

que hace que cada vez se emplee ms el trmino de sustancias similares a bacteriocinas para referirse a las sustancias antimicrobianas que, como la lactocina 27 o la producida por Ib. sa/ce-

148, difieren en alguna de las propiedades atribuidas a las bacteriocinas clsicas

(Klaenhammer, 1988). En la tabla y. se sealan algunas propiedades de las bacteriocinas mejor conocidas, lo que permite comparar las coincidencias y diferencias de nuestra bacteriocina parcialmente caracterizada y las de aquellas caracterizadas por otros investigadores.

Nuestros resultados, junto a otros que ponen de manifiesto el efecto bacteriosttico de algunas bacterias lcticas (Upreti y Hinsdill, 1975; Raccach y col., 1989; Ahn y Stiles, 1990a; Hastings y Stiles, 1991), explicaran porqu persiste pero no se desarrolla Ibisteria monocytogenes en carne fresca de bovinos y en la carne y productos crnicos de polo en presencia de una flora lctica competitiva Buchanan y col., (1989), Johnson y coL, (1988); tambin explicara el que Shelef (1989) haya observado que Ib. monocytogenes no se desarroua durante la maduracin de embutidos elaborados con carne de bovinos.

La concentracin inhibidora mnima de la sustancia antagonista parcialmente purificada de Ib. sa/ce 148 en los diversos microorganismos ensayados (tabla IV. 12), oscila entre 1 y 18 i~gml, siendo las cepas de S. aureus FR1349 y FR1361 las ms resistentes a su accin inhibidora. Los resultados obtenidos sugieren, una vez ms, la posible utilidad de las bacterias lcticas y de sus bacteriocinas como factores de seguridad de la carne y de los productos crnicos.

246

DISCUSION
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247

DiSCUSION

V. 9.- Propiedades antignicas de las bacteriocina de Ib. sa/ce 148

El conococimiento de las propiedades inmunolgicas de las bacteriocinas es interesante por varios motivos. Primero, para determinar su seguridad para el consumidor, esto es, que no le provoque reacciones alrgicas o indeseables. De otra parte, la obtencin de anticuerpos frente a las bacteriocinas permitira su deteccin y cuantificacin en las carnes y productos crnicos. Asimismo, los anticuerpos especficos facilitaran la purificacin a homogeneidad de la sustancia antimicrobiana por tcnicas de cromatografa de afinidad, lo que permitira su purificacin en un solo paso, evitando la utilizacin de otros procedimientos de separacin proteica menos eficaces.

El primer aspecto, la salud del consumidor, parece garantizado ya que el carcter proteico de la sustancia estudiada, su pequeo tamao y su sensibilidad a los enzimas proteoliticos hacen pensar que su uso per os, con los alimentos, carecer de peligros para la salud humana. Posiblemente esta caracterstica es comn a todas las bacteriocinas de las bacterias lcticas, prueba de ello es que una de stas sustancias cuyas propiedades antignicas no son del todo conocidas, la nisina, es la nica bacteriocina autorizada en muchos paises para su uso en alimentos d consumo humano, ya que se ha demostrado que no origina reacciones txicas en el consumidor (Hurst. 1981). Igualmente la bacteriocina deL. sa/ce 148 carece de propiedades alergnicas, ya que su inoculacin a los animales de experimentacin no les produce reacciones alrgicas ni txicas.

En cuanto al segundo aspecto ennumerado, las caractersticas antignicas de las bacteriocinas, no est suficientemente estudiado ni siquiera en las sustancias mas ensayadas; no obstante, se sabe que ciertas bacteriocinas de algunas bacterias Gram-negativas poseen propiedades antignicas (Gagliano y Hinsdill, 1970; Tubylewicz, 1970; Tagg y col., 1976).

248

DISCUSION

Unicamente Ehunia y col. (1990), han evaluado la antigenicidad de la pediocina AcH de P. acidilacfici, llegando a la conclusin de que la inoculacin de esta sustancia a ratones y conejos no genera la sntesis de anticuerpos neutralizantes. La explicacin de este fracaso inmungeno habra que buscarla, segn dichos autores, en el pequeo tamao molecular de sta sustancia (2700 Da) que la hara comportarse como un hapteno; en que las tcnicas de mnmunizacin o los adyuvantes empleados no fueron los adecuados o en que el nmero de animales de experimentacin utilizados fu pequeo.

Adems, la calidad del antgeno no era la mas indicada para estas experiencias, ya que emplearon una bacteriocina parcialmente purificada cuya fraccin activa (de 2700 daltons) iba acompaada de, al menos, 2 proteinas de alto peso molecular visibles por electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico (SDS-PAGE).

Coincidiendo con nuestros resultados, Bhunia y col. (1990), mediante un sistema inmunoenzimtico (ELISA) indirecto, observaron una respuesta inmunolgica frente a la pediocina AcH parcialmente purificada; tal respuesta la atribuyeron a las proteinas de alto peso molecular, pero sin actividad inhibidora, presentes en la muestra inoculada. En nuestro caso, la respuesta inmunolgica no puede atribuirse a compuestos proteicos de elevado peso molecular, ya que la electroforesis en geles de poliacrilamida (fig. 4. 40) demuestra claramente que la preparacin estaba libre de sustancias de este tipo.

De los resultados obtenidos, parece deducirse que la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada de Ib. sa/ce 148 presenta cierta accin inmungena, ya que el ttulo de anticuerpos obtenido en cada una de la sangras parciales es superior a la anterior (fig. 4. 41). Adems, dicha sustancia puede identificarse y diferenciarse del antgeno empleado corno control, cuando ambos se disuelven en tampn de PBS (g 4 42 ) Sin embargo, fu imposible la deteccin de dicha sustancia cuando se aadi al medio de cultivo MM-triptosa

249

DISCUSION

debido, posiblemente, a la interferencia provocada por alguno de sus componentes. De los resultados obtenidos puede concluirse, al igual que hicieron Ehunia y col. (1990), que la bacteriocina deL. sa/ce 148 no es detectable mediante el ELISA indirecto cuando se encuentra disuelta en un medio de cultivo, por lo que quizs sera necesario desarrollar una tcnica ms sensible que evitara las interferencias citadas.

En cualquier caso, la respuesta inmunolgica de los animales de experimentacin fu muy pequea lo que pudo ser debido, aparte del tamao de la partcula, a otros condicionantes ya citados por Bhunia y col. (1990), como: a) que el nmero de animales inmunizados no fuera suficiente para permitir la generalizacin de las conclusiones; b) que los adyuvantes, vas y protocolos de inmunizacin no fueran los ms adecuados o c) que el tamao de la sustancia, sea incapaz de generar una respuesta en el organismo receptor. En este caso sera necesario incrementar la potencia inmungena conjugndola con sustancias que le otorguen esta capacidad como, por ejemplo, con la seroalbmina bovina (BSA).

Las interferencias con otros componentes del medio podran evitarse empleando otras variantes del mtodo ELISA. Pero quiz fuera ms efectiva la obtencin de anticuerpos monoclonales que, al ser ms especficos que los policlonales empleados en este trabajo, evitaran reacciones indeseables con otros compuestos.

250

CONCLUSiONES

CAPITULO VI

CONCLUSIONES

251

CONCLUSIONES

1).- Las 180 bacterias lcticas seleccionadas durante la maduracin de un lote de embutidos crudos presentaron actividad inhibidora directa, variable y cuantificable, frente a diversos microorganismos indicadores. De ellas, 20 manifestaron actividad antimicrobana exocelular; dichas cepas se aislaron en todas las etapas del proceso de maduracin, desde la masa crnica inicial hasta el producto final listo para su consumo.

2).- Las 6 cepas con mayor actividad inhibidora se identificaron como Lacrobacillus sake. Todas se desarrollaron a 4 y 15 oc, pero slo las cepas 148 y IT7 lo hicieron a 45 <C. El espectro antimicrobiano de las 4 cepas con mayor actividad inhibidora sugiere que las sustancias inhibidoras son diferentes, ya que la sensibilidad de los distintos microorganismos indicadores es variable dependiendo de la cepa de L. sake productora.

3).- L. sakc 148 es capaz de desarrollarse y producir actividad antimicrobiana cuantificable a 4, 8, 16, 25 y 32 C. La producin de esta sustancia depende de la composicin del medio de cultivo, se detecta al poco tiempo de iniciarse el crecimiento microbiano y alcanza sus niveles ptimos a las 16 horas de incubacin a 32 0C.

4).- Cuando la sustancia antimicrobiana exocelular de L. sake 148, se purifica por liofilizacin y cromatografa de filtracin en geles, aumenta muy poco su actividad inhibidora especfica (7 veces), siendo muy pequea la recuperacin de la actividad inhibidora original (8%).

5Y- La sustancia antimicrobiana parcialmente purificada de L saLe 148 tiene

naturaleza proteica, es estable a valores de pH comprendidos entre 2,6 y 12, resistente al calor y bacteriosttica frente a los microorganismos sensibles, caractersticas que comparte con otras bacteriocinas de las bacterias lcticas. La fraccin activa de la sustancia antimicrobiana parcialmente purificada por cromatografa de filtracin en geles, revel que tiene un peso 252

CONCLUSIONES

molecular de 4.640 daltons. La sustancia parcialmente purificada se compone de 13 aminocidos; adems, y por cromatografa HPLC, se aprecia un pico que pertenece a un aminocido distinto de los utilizados corno patrones. Esta compuesto desconocido eluye junto a la glicina, lo mismo que el aminocido lanuonina.

6).- Consideramos que la sustancia antimicrobiana de L. sake 148 es bacteriosttica, ya que detiene el crecimiento de los microorganismos sensibles, pero no su viabilidad. Su concentracin inhibidora mnima vara entre 1 y 18 mg/mI, dependiendo de los microorganismos ensayados.

7).- La inoculacin de la sustancia antimicrobiana a los animales de experimentacin (conejos) origin una respuesta inmungena dbil. El desarrollo y puesta a punto de un ELISA indirecto no permiti la deteccin de la bacteriocina parcialmente purificada en un medio de cultivo semidefinido (medio de MM-triptosa).

8).- Las caractersticas fisico-quimicas de la bacteriocina producida por Li. saLe 148 y su accin antimicrobiana frente a bacterias patgenas Gram-positivas de gran inters en la industria alimentaria, hacen concebir esperanzas sobre la posible utilidad de las bacterias lcticas o de sus bacteriocinas, como factores de seguridad tanto en la carne y productos crnicos como en otros sustratos alimentarios diversos.

253

TRAUIiIO FUTURO

CAPITULO VII TRABAJO FUTURO

254

TRABAJO FUTURO

Las cepas de L. saLe con actividad antimicrobiana exocelular aisladas y caracterizadas parcialmente, pueden ser de gran utilidad en la inhibicin del desarrollo de microorganismos alterantes y patgenos de la carne y productos crnicos, as como de otros alimentos. Sin embargo, las condiciones de un sustrato alimentario slido como la carne, son distintos de las que se dan en los medios de cultivo lquidos. Por ello, la sntesis y la actividad de las sustancias antimicrobianas de las bacterias lcticas descritas, deben examinarse en sistemas alimentarios reales, mxime teniendo en cuenta la incapacidad de L. saLe 148 de producir la actividad antimicrobiana cuando se desarrolla en diversos medios de cultivo. En consecuencia, parece conveniente acometer estudios tendentes a aclarar los mecanismos responsables de la estimulacin o represin de la sntesis o actividad de estas sustancias antimicrobianas.

El empleo de cepas bacteriocinognicas de L. sake, como cultivos iniciadores en la elaboracin de productos crnicos, presupone tanto la prevencin del desarrollo de microorganismos indeseables, como una mayor homogenidad del proceso fermentativo. Por ello, el desarrollo y puesta a punto de sistemas novedosos de transformacin gentica de las bacterias lcticas, como la electroporacin, permitira introducirles genes que codifiquen propiedades de importancia tecnolgica. Gracias a la tecnologa del ADN recombinante, los determinantes genticos de la produccin de bacteriocinas y de la resistencia a las mismas podran utilizarse como marcadores genticos o como genes de inters para la produccin de bacteriocinas como aditivos alimentarios. De aqu que constituya un objetivo prioritario de nuestro trabajo futuro el estudiai-, con la mxima amplitud posible, las caractersticas genticas de los determinantes que codifican la producin de bacteriocinas en las cepas de Li. sake de interes.

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TRABAJO FUTURO

mecanismo de accin, favorecera el estudio de los determinantes genticos responsables de su sntesis y regulacin y, por ltimo, permitira comparar las relaciones existentes entre estructura-actividad en las distintas bacteriocinas producidas por las bacterias lcticas.

De otra parte, el bajo poder inmungeno mostrado por la bacteriocina de Li. sake 148 dificulta su deteccin en los alimentos por mtodos inmunoenzimticos (ELISA), este aspecto es fundamental, ya que uno de los requisitos que es ms importante cumplir para que se autorize la adicin de esta bacteriocina a los alimentos es, precisamente, que se pueda detectar y cuantificar despus de incorporarse a los mismos. Por este motivo, se pretende mejorar la capacidad antignica de esta sustancia empleando mtodos de inmunizacin alternativos, entre los que se incluira su conjugacin a otras molculas e, incluso, la obtencin de anticuerpos monoclonales especficos. Es necesario desarrollar y poner a punto otras variantes de las tcnicas inmunoenzimticas (ELISA) empleadas en el presente trabajo para permitir la deteccin y cuantificacin de la sustancia antimicrobiana de inters en diversos sustratos alimentarios. Asimismo, los anticuerpos especficos podran permitir la purificacin a homogeneidad de la sustancia antimicrobiana, por cromatografa de afinidad, lo que permitida su purificacin en un solo paso y evitada la utilizacin de otros procedimientos de separacin proteica menos eficaces.

256

BIBLIOCRA E/A

CAPITULO VIII BIBLIOGRAFA

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