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Mdulo 1.

Muestreo y examen microscpico de los alimentos Cuando se elaboran alimentos o cuando se tiene que controlar su calidad y/o seguridad, los anlisis microbiolgicos proporcionan informacin muy valiosa, respecto a: la calidad de las materias primas, las condiciones sanitarias en que se proces el alimento, y sobre la efectividad del proceso, especficamente de los mtodos de conservacin. Como qumicos sabemos que antes de proceder a un anlisis es indispensable: tener claro el objetivo de un anlisis, identificar los analitos adecuados y las tcnicas para determinarlos, y planear correctamente el tipo y la forma de muestreo y de manejo de las muestras.

Parte A. PLANES DE MUESTREO Y CRITERIO MICROBIOLGICO


ICMSF es la Comisin Internacional para la Especificacin Microbiolgica de los Alimentos (en ingls, International Comssion on Microbiological Specification for Food) y forma parte de la Organizacin Mundial para la Salud (OMS). Est constituida por representantes de la mayora de los pases en el mundo. ICMSF surgi por la necesidad de regular el comercio internacional de alimentos estableciendo lmites microbiolgicos, mtodos de anlisis y de muestreo. Existen diversos mtodos de muestreo, pero el de ICMSF est siendo adoptado rpidamente por la industria de alimentos relacionada con el comercio internacional. La calidad de los alimentos Segn Adams y Moss (2000), la calidad de los alimentos depende de 3 factores: Seguridad. Un alimento no debe contener ciertos niveles de microorganismos patgenos o de sus toxinas que causen enfermedades cuando ste se consuma. Aceptabilidad. Un alimento no debe contener niveles de microorganismos tales que lo conviertan en organolpticamente inaceptable en poco tiempo. Consistencia. La calidad de los alimentos debe ser consistente, es decir, no mostrar variaciones de lote a lote, tanto desde el punto de vista de seguridad como de aceptabilidad. Para determinar la calidad de un alimento se debe tomar una muestra y suponer que la calidad de esa muestra refleja la del lote del que fue tomado. La validez de esta extrapolacin depender de la representatividad de las muestras y de la exactitud y precisin del anlisis. De ah la importancia de establecer un plan de muestreo adecuado. 1

Es necesario entonces contar con un criterio microbiolgico para determinar si un alimento es de buena o de mala calidad, evaluando la seguridad del alimento, el seguimiento de buenas prcticas de manufactura, la vida de anaquel y la utilidad o adecuabilidad de un alimento o ingrediente para cierto propsito (Smoot y Pierson, 1997). Segn la Comisin Internacional para la Especificacin Microbiolgica de Alimentos (ICMSF, 2002), deben incluirse los siguientes factores en un criterio microbiolgico: Una descripcin del alimento al que aplica el criterio, ya que al diferir en origen, composicin y procesamiento, cada alimento representa diferentes problemas de descomposicin y de seguridad. Una descripcin de los microorganismos o toxinas capaces de causar problemas. Detalles de los mtodos analticos para detectar o cuantificar esos microorganismos o toxinas. El nmero y tamao de muestra que debe ser tomado de un lote de alimento. Los lmites microbiolgicos apropiados, de acuerdo con el alimento y el microorganismo a analizar.

PLANES DE MUESTREO (ICMSF, 2002) Un plan de muestreo debe incluir un procedimiento de muestreo y un criterio de decisin. Una muestra es un grupo de unidades que se sustraen para estimar el carcter de una poblacin. La unidad de muestra es cada uno de los elementos que constituyen la muestra. Un plan de muestreo est descrito por 2 valores: n, que es el nmero de unidades a analizar y c, que es el nmero mximo de unidades defectuosas aceptables. Mediante el uso de una curva de operacin caracterstica (para un par determinado de valores n y c) se puede determinar qu tan discriminante es un plan de muestreo. En esta curva se grafica la probabilidad de aceptacin de un lote contra la calidad real del lote (porcentaje de unidades defectuosas). Un plan de muestreo es ms estricto mientras mayor sea el nmero de unidades analizadas (n) y menor el nmero mximo de unidades defectuosas a aceptar (c). El riesgo del productor describe la probabilidad de que un lote aceptable sea falsamente rechazado (1 - Pa); mientras que el riesgo del consumidor describe la probabilidad de que un lote malo sea aceptado falsamente (Pa).

Un lote rechazado deber regresarse al productor, ser reprocesado, destruido o prohibido para el consumo humano. Para asegurar que la condicin de la muestra tomada sea lo ms similar a la del lote del que se sustrajo, sta deber ser representativa. Para lograr lo anterior se sugiere realizar un muestreo al azar o un muestreo estratificado, en el caso que se esperen diferencias en la calidad del lote. Se consideran los siguientes principios fundamentales: n se refiere al nmero de unidades que se sustraen de manera separada e independiente. La sustraccin de un nmero grande de unidades pequeas provee mayor proteccin que la del mismo peso total de muestra en menos unidades. La muestra real consiste de aqullas unidades que se examinan. Lo relevante no es la sustraccin de una fraccin del lote, sino el tamao de la muestra tomada al azar y los criterios de aceptacin y de rechazo. Cuando no es posible tomar una muestra al azar de todo un cargamento, sino slo de una seccin accesible, se le llama a esta seccin el marco y los resultados y conclusiones aplicarn solamente a ste. Al aumentar el riesgo debe aumentar el nmero y el tamao de las unidades, para minimizar la probabilidad de aceptar un lote que debera ser rechazado. A menor uniformidad, ser necesario sustraer un mayor nmero de muestras. Los anlisis microbiolgicos son laboriosos y lentos y los alimentos son perecederos. Por estas razones existen presiones polticas o administrativas para reducir el muestreo. Esto traer como consecuencia el aumento en la probabilidad de error. El tamao de la muestra es crtico en situaciones de anlisis de presencia o ausencia. MTODOS DE MUESTREO Existen diferentes tipos de datos: En el caso de los de atributos, las decisiones se basan en la presencia o ausencia de algn microorganismo o en el resultado positivo o negativo de una prueba. En los de medida la variable es continua, como una concentracin o un nmero. Los de medida pueden ser convertidos en los del tipo atributo estableciendo un valor lmite. Planes de 2 clases (Figura 1). Son aqullos en los que la muestra se divide en dos clases, despus de analizar las unidades: Las unidades con las que se obtengan valores entre 0 y m se consideran aceptables. Las unidades con las que se obtengan valores mayores de m se consideran defectuosas.

Se pudo haber realizado una prueba para determinar la presencia o ausencia de un microorganismo o una para determinar una cuenta microbiana o la concentracin de una toxina. m es un valor crtico arriba del cual la unidad analizada se considera defectuosa. Planes de 3 clases (Figura 2). Son aqullos en los que la muestra se divide en tres clases, despus unidades: Las unidades con las que se obtengan valores entre 0 y m aceptables. Las unidades con las que se obtengan valores entre m y M marginalmente aceptables. Las unidades con las que se obtengan valores mayores de M defectuosas. de analizar las se consideran se consideran se consideran

En ambos casos la probabilidad de aceptacin depender de los valores n y c seleccionados. Las ventajas del uso de los planes de tres clases son: De acuerdo con la experiencia prctica, an observando buenas prcticas de manufactura, algunas unidades pueden resultar en el rango marginalmente aceptable, sin causar problemas, y se pueden aceptar. Se afectan menos por cambios en la distribucin de microorganismos dentro de un lote, debidos a causas desconocidas. Permiten advertir aumentos en los riesgos, si existe una tendencia de aumento en el nmero de unidades marginalmente aceptables.

PLAN DE MUESTREO DE DOS CLASES


n = nmero de unidades a analizar c = nmero mximo de unidades defectuosas que se pueden aceptar m = Cantidad que distingue aceptables de defectuosas

Aceptables

Defectuosas

Figura 1 Planes de muestreo de dos clases.

PLANES DE 3 CLASES
Resultados cuantitativos Concentraciones

Aceptables

Marginalmente aceptables

Defectuosas

Figura 2 Planes de muestreo de 3 clases. En la Figura 3 se presenta un diagrama de flujo sugerido por el ICMSF (2002) para la seleccin del tipo de plan de muestreo.

Medicin del microorganismo por: Pruebas de presencia o ausencia concentracin Plan de dos clases Es posible aceptar la presencia de este microorganismo en el alimento? NO SI c=0 c0 Seleccionar Seleccionar n nyc Figura 3 Seleccin del tipo de plan de muestreo. Curvas de operacin Una curva de operacin (Figura 4) es la que se obtiene al graficar la probabilidad de aceptacin, con valores entre 0 y 1 y el porcentaje real de unidades defectuosas del lote (considerando que se hubieran analizado cada una de las unidades del lote). Se presenta en la Figura 4 la curva de operacin para el plan de muestreo n = 5 c = 0; o sea que para considerar que la calidad del lote es buena analizarse 5 unidades del lote y no se acepta ninguna unidad defectuosa. Entonces cuando el lote no contiene ninguna unidad defectuosa la probabilidad de aceptacin es de 95% y cuando contiene 45% de unidades defectuosas, con el plan establecido, la probabilidad de rechazo sera de 95%. El efecto de n y c en la rigurosidad del plan de muestreo En la Figura 5 se presentan las curvas de operacin para diversos valores de n y c. Se presentan 4 figuras con curvas para diferentes valores de n (5, 10,15 y 20) y en cada figura se presentan curvas de operacin para diferentes valores de c. Como se puede observar, la Pa disminuye cuando n aumenta y cuando el valor c disminuye. Pruebas Plan de tres clases Seleccionar n y c de

Es posible entonces, modificando los valores de n y c, disear planes de muestreo tan estrictos como se requiera.

Figura 4 Curva de operacin caracterstica para el plan de muestreo n=5, c=0. (ICMSF, 2002).

Figura 5 Efecto de los valores n y c en la rigurosidad del plan de muestreo (ICMSF, 2002). SELECCIN DEL PLAN DE MUESTREO Para seleccionar un plan de muestreo adecuado es necesario considerar: 1. La seriedad del tipo de riesgo segn el microorganismo a analizar. 2. Las condiciones a las que se expondr el lote del alimento. Tipo de riesgo. El plan de muestreo deber ser ms estricto mientras mayor sea el riesgo que implique el tipo de microorganismo a analizar. Los factores a considerar en el tipo de riesgo son: Mdicos y epidemiolgicos, que incluyen la severidad clnica de la enfermedad producida, su frecuencia, duracin, la infectividad del microorganismo, la posibilidad de ocurrencia del estado portador y la extensin potencial. Etiolgicos, como la asociacin inherente con riesgos severos, como ocurre en el caso de Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae, Entamoeba histolytica, Taenia solium y Taenia saginata, que sobreviven y se multiplican en el hombre, daan su salud, amenazan su vida y presentan dosis infectivas pequeas, o como Clostridium botulinum, que produce una toxina fatal. 8

Factores clnicos. Se debern tomar en cuenta las altas tasas de mortalidad ocasionadas por enfermedades como la disentera y el botulismo, las secuelas severas de la accin de Streptococcus beta-hemoltico, la convalescencia larga de enfermedades como la fiebre tifoidea, la paratifoidea, la brucelosis y la vulnerabilidad de nios, ancianos y enfermos. Factores epidemiolgicos. La propensidad de ciertos tipos de microorganismos patgenos de encontrarse distribuidos ampliamente en el reino animal, las costumbres locales, los estndares de higiene, la asociacin entre ciertos tipos de patgenos con ciertos alimentos, las costumbres dietticas y de la preparacin de los alimentos. Se clasifica entonces a los microorganismos o grupos de microorganismos de acuerdo al tipo de riesgo que representan en: Sin riesgo a la salud. Se incluye aqu a los grupos microbianos responsables de la descomposicin de alimentos, que disminuyen su aceptabilidad, su vida de anaquel, pero que como grupo de microorganismos no se considera que causen dao a la salud. Riesgo indirecto. Se considera a los microorganismos indicadores, como los microorganismos mesfilos aerobios, los coliformes totales y fecales, los enterococos y Staphylococcus aureus, que indican (de manera indirecta) la posible presencia de microorganismos patgenos. Riesgo moderado de extensin moderada. Son microorganismos ubicuos en la naturaleza y la enfermedad que producen est relacionada con nmeros grandes del patgeno. Riesgo moderado de extensin amplia. Incluye microorganismos que presentan riesgos epidemiolgicos severos. Son diseminados por alimentos especficos, pero pueden introducirse al alimento por contaminacin ambiental o cruzada. La enfermedad resulta de inculos relativamente pequeos. Riesgo severo. Los microorganismos incluidos en este grupo presentan riesgos severos a la salud. En la Tabla 1 se presenta una clasificacin de microorganismos y parsitos de acuerdo con los criterios anteriores. Se debe mencionar que sta no es una clasificacin rgida, ya que se debe tomar en cuenta que lo que para un adulto normal representa un riesgo moderado, para un adulto, un beb o un enfermo puede ser un riesgo severo. Efecto de las condiciones a las que se expondr el alimento. Dependiendo de la naturaleza del microorganismo y de la del alimento, existen condiciones que pueden provocar:

Aumento del riesgo. ste puede ocurrir por recontaminacin despus del procesamiento, uso de tal manera que permita la multiplicacin de microorganismos, cuando la coccin no ocurre inmediatamente antes del consumo. El riesgo no se modifica. Disminucin del riesgo. Por ejemplo, cuando se sabe que se aplicar al alimento un procesamiento trmico. Combinando estos dos aspectos, el ICMSF propone que se consideren 15 casos, as como un plan de muestreo para cada uno (Tabla 2). Determinacin de los valores m y M. El valor m se define como el nivel de microorganismos aceptable y obtenible con buenas prcticas de manufactura. Puede tener un valor de cero o de ausencia de cierto microorganismo, o el nivel de detectabilidad de una prueba, o un valor numrico. El valor M es un nivel de contaminacin riesgoso, provocado por malas prcticas higinicas. Microorganismos de descomposicin: sern los niveles de microorganismos que producen una descomposicin detectable (olor o sabor) o una vida de anaquel inaceptablemente corta. Indicadores de sanidad: niveles que indican una condicin de sanidad inaceptable. Microorganismos que presentan un riesgo a la salud: los niveles de microorganismos (o concentracin de toxinas) que producen enfermedades. Tabla 1 Agrupacin de microorganismos y de parsitos de acuerdo al tipo de severidad del riesgo (Smoot y Pierson, 1997). Tipo de riesgo Riesgo severo Organismo Clostridium botulinum tipos A, B, E y F Shigella dysenteriae Salmonella typhi serotipos paratyphi A y B Escherichia coli enterohemorrgica virus de la hepatitis A y E Brucella abortus, Brucella suis Vibrio cholerae 01 Vibrio vulnificus Taenia solium

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Riesgo moderado de potencialmente amplia

extensin Listeria monocytogenes Salmonella spp. Shigella spp. otras cepas enterovirulentas de E. coli Streptococcus pyogenes Rotavirus Virus del grupo Norwalk Entamoeba histolytica Diphyllobotrium latum Ascaris lumbricoides Criptosporidium parvum Riesgo moderado de extensin limitada Bacillus cereus Campylobacter jejuni Clostridium perfringens Staphylococcus aureus Vibrio cholerae no 01 Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica Giardia lamblia Taenia saginata

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Tabla 2 Planes de muestreo sugeridos por el ICMSF (2002) para las diferentes combinaciones de riesgo a la salud y condiciones de uso. Condiciones en las que se espera que el alimento sea manejado y consumido despus del muestreo Condiciones que Condiciones que Condiciones que reducen el riesgo no modifican el incrementan el riesgo riesgo Vida de anaquel Sin cambio Vida de anaquel aumenta disminuye Caso 1 Caso 2 Caso 3 3 clases 3 clases 3 clases n = 5, c = 3 n = 5, c = 2 n = 5, c = 1 Riesgo disminuye Riesgo no cambia Riesgo aumenta Caso 4 Caso 5 Caso 6 3 clases 3 clases 3 clases n = 5, c = 3 n = 5, c = 2 n = 5, c = 1 Caso 7 Caso 8 Caso 9 3 clases 3 clases 3 clases n = 5, c = 2 n = 5, c = 1 n = 10, c = 1 Caso 10 Caso 11 Caso 12 2 clases 2 clases 2 clases n = 5, c = 0 n = 10, c = 0 n = 20, c = 0 Caso 13 Caso 14 Caso 15 2 clases 2 clases 2 clases n = 15, c = 0 n = 30, c = 0 n = 60, c = 0

Grado de riesgo Sin riesgo directo, vida de anaquel, descomposicin Riesgo a la salud Bajo, indirecto (indicadores) Moderado, directo, extensin limitada Moderado, directo, extensin amplia Severo, directo

Referencias Adams M.R., Moss, M.O. (2000). Food Microbiology. The Royal Society of Chemistry, Gran Bretaa. Doyle M.P., Beuchat L.R., Montville T.J. (2001). Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. ASM Press, Washington, D.C. ICMSF (2002) Microorganisms in Foods 7. Microbiological Testing in Food Safety Kluwer Academic/Plenum Publishers. E.U.

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Smoot L.M., Pierson M.D. (1997) Indicator microorganisms and microbiological criteria. En: Doyle M.P., Beuchat L.R., Montville T.J. (Eds) Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers. ASM Press, Washington, D.C. 66-80.

Parte B.

EXAMEN MICROSCPICO DEL ALIMENTO

Cuando se tiene un alimento alterado por microorganismos en descomposicin y cuando se sospecha que un alimento est involucrado en una ETA, es importante hacer un examen microscpico directo del alimento o de una de las primeras diluciones; la microbiota que se encuentra en una tincin de Gram de dicha preparacin puede orientar al analista sobre el problema, an cuando los microorganismos pueden no estar viables. Por ejemplo la presencia de gran cantidad de cocos Grampositivos puede implicar la presencia de toxina estafilocccica, an si los cultivos resultan negativos, ya que el calentamiento puede destruir a la bacteria pero no a la toxina. Si se encuentran cantidades importantes de bacilos Grampositivos esporulados, conviene considerar el manejo que ha tenido el alimento (refrigeracin, tratamiento trmico, condiciones aerbicas o anaerbicas) y relacionarlas con los posibles contaminantes. La presencia de bacilos Gramnegativos se debe relacionar con los sntomas y periodos de incubacin, para buscar alguno de los gneros posiblemente implicados: Salmonella, Shigella, Escherichia, Yersinia, Vibrio, Campylobacter. A continuacin se describe el mtodo para el examen microscpico de alimentos en general: Equipo Microscopio ptico Material y muestras Alimento homogenizado o dilucin 10-1. Portaobjetos previamente marcados Asa microbiolgica

Reactivos Colorantes de Gram Metanol Xilol (xileno dimetil-bencenos) PRECAUCIN: Flamable, evitar exposicin en embarazo

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Procedimiento 0. En esta prctica NO SE UTILIZA MECHERO por el xilol, que es muy voltil y flamable. Aplique las muestras con pipeta Pasteur. 1. Hacer preparaciones fijas, secar al aire y fijar con metanol durante 1 a 2 minutos, escurrir, enjuagar y secar al aire. 2. Desengrasar las muestras de alimentos (que lo requieran), sumergiendo en xilol por 2 minutos; escurrir, lavar en metanol para eliminar el exceso de xilol, ya que es insoluble en agua, escurrir y secar. PRECAUCIN: El xileno es muy flamable y es txico. NO USAR MECHEROS CUANDO SE USA XILOL. EVITAR LA INHALACIN. EMPLEAR LENTES DE PROTECCIN. EVITAR LA EXPOSICIN EN EL EMBARAZO. 3. Teir las preparaciones con el mtodo de Gram 4. Examinar al microscopio, con 1000x y aceite de inmersin. Se deben examinar al menos 10 campos de cada preparacin, buscando los tipos predominantes de microorganismos, en particular costridia, cocos Grampositivos y bacilos Gramnegativos. Para el examen microscpico de huevo congelado y en polvo, as como de leche bronca, el mtodo se aplica de manera cuantitativa, aplicando una cantidad conocida de muestra en una superficie definida.

Referencias CFSAN. 2006. Bacteriological Analytical Manual (online). USFDA. Disponible a travs de Internet en: http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-2.html International Labour Organisation. (ILO). 2002. International Chemical Safety Cards (ICSC). P-xylene. International Occupational Safety and Health Information Centre. Disponible a travs de Internet en: http://www.ilo.org/public/english/protection/safework/cis/products/icsc/dtasht/_icsc00/i csc0086.htm

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