MICROBIOLOGIA APL.

S CINCIAS AGRRIAS
PLNIO DOS ANJOS RAMALHO

JI-PARAN/RO JULHO DE 2011

Av. Eng. Manfredo Barata Almeida da Fonseca, 762, Bairro Jardim Aurlio Bernardi Caixa Postal 271 - CEP 76.907-438 - Ji-Paran - RO Fone: (69) 3416-3100 - Fax: (69) 3416-3131

PLNIO DOS ANJOS RAMALHO

MICROBIOLOGIA APL. S CINCIAS AGRRIAS

Trabalho apresentado ao Professor, Msc. Anderson Viera Santos, da disciplina de Microbiologia aplica s cincias agrrias, Curso de agronomia.

CEUJI/ULBRA Ji-paran/RO Julho de 2011

Av. Eng. Manfredo Barata Almeida da Fonseca, 762, Bairro Jardim Aurlio Bernardi Caixa Postal 271 - CEP 76.907-438 - Ji-Paran - RO Fone: (69) 3416-3100 - Fax: (69) 3416-3131

Por volta da dcada de 70, vrios organismos procariticos foram isolados a partir de uma srie de ambientes considerados extremamente inspitos, quase que incompatveis com a presena de seres vivos. Estes ambientes naturais caracterizavam-se por apresentar temperaturas bastante elevadas (prximas a 100C), extrema acidez (pH prximo a 2), altas salinidades (cerca de 10 a 15%) e, muitas vezes, ausncia completa de oxignio. Como vrias destas caractersticas correspondiam s possveis condies encontradas na Terra primitiva, os pesquisadores acreditavam que os organismos procariticos presentes nestes ambientes deveriam corresponder a clulas primitivas, talvez "fsseis vivos", representando as formas de vida ancestrais das bactrias modernas. Por esta razo, estes organismos foram denominados "arqueobactrias". No entanto, a partir dos trabalhos de Carl Woese e colaboradores (h cerca de 25 anos), realizando estudos comparativos de sequncias de DNA que codificavam rRNA (16S e 23S) de diferentes organismos, foram definidos 3 grandes domnios compreendendo todos os seres vivos. Assim, de acordo com a proposta de Woese, os seres vivos poderiam ser agrupados em trs grandes domnios: Bacteria (anteriormente denominadas eubactrias), Archaea (as arqueobactrias") e Eucarya (Eucariotos). Estes trs domnios teriam derivado de um hipottico ancestral comum de todas as clulas. A anlise da rvore filogentica apresentada abaixo, revela como a denominao "arqueobactrias" inadequada e quo obsoleta a idia de que as "arqueobactrias" seriam os ancestrais das bactrias atuais, pois estes organismos no correspondem aos ancestrais da bactrias atualmente conhecidas.

Figura 1 rvore filogentica universal, apresentando os trs domnios da vida

Esta rvore revela claramente que as "arqueobactrias" no correspondem aos ancestrais das bactrias atuais, visto que sua possvel origem ocorre quase que concomitantemente origem das bactrias mais primitivas. Outro aspecto que a rvore permite deduzir o fato das "arqueobactrias" ocuparem uma posio intermediria entre os domnios Bacteria e Eucarya, sugerindo que estas correspondem a um grupo de organismos diferentes de bactrias e de clulas eucariticas. De fato, estudos genticos e fisiolgicos posteriormente revelaram que tais organismos apresentam caractersticas de bactrias, de eucariotos, alm de caractersticas exclusivas, no encontradas em qualquer outro domnio. Por esta razo, deixaram de ser denominadas "arqueobactrias", recebendo a denominao archaea. Av. Eng. Manfredo Barata Almeida da Fonseca, 762, Bairro Jardim Aurlio Bernardi Caixa Postal 271 - CEP 76.907-438 - Ji-Paran - RO Fone: (69) 3416-3100 - Fax: (69) 3416-3131

Uma questo ainda no elucidada refere-se ao porqu de encontrar-se um grande variedade de archaea extremfilas, habitanto ambientes de altas temperaturas, salinidade, ou extremos de pH. Por outro lado, o acmulo de conhecimentos sobre este grupo vem mostrando que as archaea podem ser encontradas nos mais diversos ecossistemas, desde ambientes aquticos frios, sistema digestrio do homem e outros animais, em tecidos vegetais. Certamente no absurdo cogitar que no futuro sejam descobertas archaea patognicas ao homem ou outros seres vivos. As caractersticas apresentadas por alguns dos membros deste domnio parecem refletir as condies primitivas da Terra, quando tal domnio comeou a evoluir como um ramo filogenticio distinto. Ao que parece, vrias archaea conservaram mais do que as eubactrias estas caractersticas fisiolgicas primitivas, o que seria responsvel pela distribuio atual no planeta. Assim, as archaea compreendem um grupo heterogneo de microrganismos que podem ser caracterizados, em sua maioria, como habitantes de ambientes inspitos, geralmente crescendo em condies consideradas at ento como extremas e limtrofes para a vida. Classificao das Archaea Atualmente considera-se que este domnio apresente trs filos: Crenarchaeota, Euryarchaeota e Korarchaeota.

Figura 2 rvore filogentica do domnio Archaea

O filo Crenarchaeota, separa-se muito prximo da raiz da rvore universal, sendo composto por organismos hipertermfilos (Thermoproteus, Pyrolobus ePyrodictium), compreendendo os organismos capazes de crescer nas maiores temperaturas conhecidas. Estes hipertermfilos so, em sua maioria, quimiolitotrficos autotrficos, sendo ento classificados como produtores primrios. Neste grupo h tambm organismos isolados (mas ainda no cultivados em laboratrio) de ambientes frios, tais como guas ocenicas. Av. Eng. Manfredo Barata Almeida da Fonseca, 762, Bairro Jardim Aurlio Bernardi Caixa Postal 271 - CEP 76.907-438 - Ji-Paran - RO Fone: (69) 3416-3100 - Fax: (69) 3416-3131

O filo Euryarchaeota um grupo fisiologicamente diverso, sendo composto por dois grupos: 1) as archaea metanognicas, que so anaerbias, (Methanococcus, Methanobacterium e Methanosarcina), encontradas em ambientes de condies extremas, e 2) as haloflicas extremas, que so aerbias (Halobacterium, Halococcus). As metanognicas compreendem os organismos mais anaerbios conhecidos, ou seja, o oxignio mesmo em concentraes baixssimas exerce um efeito extremamente letal sobre estes organismos. Neste filo h ainda o gnero Thermoplasma, composto por bactrias acidfilas, termoflicas, que no apresentam parede celular. As haloflicas geralmente coram-se como Gram negativas, no apresentam esporos e, em sua maioria, so imveis, geralmente apresentando grandes plasmdeos, contendo cerca de 25 a 30% do DNA da clula. Dentre as metanognicas, encontra-se o gnero Methanopyrus, que cresce em temperaturas de at 110C. O filo Korarchaeota composto quase que somente por isolados identificados apenas a partir do sequenciamento de 16S rRNA, sendo considerado um grupo de hipertermfilos. At o momento, poucos espcimes de Korarchaeota foram cultivados em laboratrio. Pesquisas realizadas em uma fenda termal localizada no fundo do mar da Islndia, em 2002, levaram identificao de uma nova espcie de archaea apresentando caractersticas bastante distintas, quando comparada aos demais membros desse domnio. A espcie Nanoarchaeum equitans diferencia-se das demais archaea por ser aparentemente muito primitiva (ou modificada), sendo encontrada em associao com outra archaea (Igniococcus sp.). Este organismo de morfologia arredondada bastante diminuto, apresentando cerca de 400 nm de dimetro e um pequeno genoma, de 0,5 Megabases. De acordo com seus descobridores, as grandes diferenas apresentadas por Nanorachaeum em relao seqncia de RNA ribossomal, sugerem que tal organismo seja classificado em um novo filo, proposto como Nanoarchaeota. Estrutura celular das Archaea Quanto morfologia, podem ser esfricas, bacilares, espiraladas, achatadas, quadradas, discides e muitas vezes de morfologia irregular ou pleomrficas. Suas dimenses so extremamente variveis, de 0,1 a 15 m, com alguns filamentosos atingindo 200 m. As archaea apresentam vrias caractersticas especiais, que permitem seu desenvolvimento em uma vasta gama de ambientes. Estas incluem alteraes de composio de membrana, composio variada de paredes celulares, presena de protenas tipo histonas, ntrons, mecanismos de splicing, entre outros. Parede celular: Apresenta composio e estruturao extremamente variveis neste grupo de microrganismos. Esta variabilidade sugere que o ancestral comum seria desprovido de parede, sendo as diversas paredes resultantes de evoluo independente, de acordo com os diferentes ambientes e grupos de archaea. Quando coradas pelo mtodo de Gram, algumas archaea comportam-se como Gram positivas e outras como Gram negativas, embora suas paredes sejam completamente distintas daquelas de eubactrias. Como observado na figura acima, suas paredes celulares apresentam uma grande diversidade quanto composio qumica e, diferentemente das eubactrias, no apresentam peptideoglicano. Alm disso, existem tambm outras archaea que no exibem parede celular (Thermoplasma). O gnero Thermoplasma cresce bem em temperaturas de 55C e pH 2, em meios complexos. Estes organismos apresentam a membrana citoplasmtica bastante diferente, contendo compostos semelhantes a lipopolissacardeos, contendo ligaes tetrater. Um outro gnero, filogeneticamente relacionado aThermoplasma, Picrophilus, que cresce em pHs de 0,06 a 0,7. Av. Eng. Manfredo Barata Almeida da Fonseca, 762, Bairro Jardim Aurlio Bernardi Caixa Postal 271 - CEP 76.907-438 - Ji-Paran - RO Fone: (69) 3416-3100 - Fax: (69) 3416-3131

Vrias archaea exibem uma parede espessa, rgida, semelhante parede Gram positiva (Methanobacterium, Methanopyrus, Halococcus), entretanto, os polmeros que compem a estrutura podem ser: pseudopeptideoglicano ou metanocondroitina. O pseudopeptideoglicano diferencia-se do peptideoglicano pela ocorrncia de cido talosaminurnico em substituio ao murmico, pela ligao do tipo b-1,3 ao invs de b-1,4 entre os acares e pela ausncia de D-aminocidos nas pores peptdicas da molcula. Nestas bactrias, a lisozima no exibe qualquer atividade de degradao da parede, uma vez que seu stio de ao so as ligaes b-1,4. Da mesma forma, a penicilina ineficaz contra estes organismos porque o mecanismo de sntese de parede distinto nas archaea. A metanocondroitina um polmero de 4 acares (galactosamina, cido glucornico, N-acetil-galactosamina e glicose), muito semelhante ao tecido conectivo animal, composto por sulfato de condroitina. Aquelas archaea que coram-se como Gram negativas podem ter paredes compostas por protenas, polissacardeos ou glicoprotenas. As paredes proticas podem variar entre si, podendo ser do tipo monocamada de natureza cristalina, ou policamadas, de protenas tubulares. As glicoprotenas so tambm comuns, muitas vezes contendo grandes quantidades de aminocidos carregados negativamente. As halobactrias so um exemplo do modelo descrito acima, onde as cargas negativas da parede interagem com os ons Na+ do ambiente, estabilizando a parede. O gnero Halococcus apresenta a parede celular composta por um heteropolissacardeo altamente sulfatado, nunca observado em qualquer outro ser vivo, eventualmente, algumas archaea exibem uma camada protica adicional ao redor da parede celular, ou compondo a prpria parede, denominada camada S, em um estado cristalizado. Membrana Citoplasmtica: corresponde a uma estrutura nica, apresentando composio qumica e arranjo totalmente diferentes das membranas citoplasmticas de quase todas as bactrias e de todos eucariotos. As membranas de archaea geralmente apresentam um alto contedo protico e vrios lipdeos: glicolipdeos, sulfolipdeos, fosfolipdeos (raros) e lipdeos apolares do tipo isopreno. A presena de hidrocarbonetos ramificados aumenta a fluidez da membrana, uma vez que dificultam a formao de estruturas cristalinas. Dentre os principais lipdeos esto aqueles do tipo glicerol-ter-isopreno (hidrocarbonetos de 20, 25 ou 40 Carbonos). Uma caracterstica da poro lipdica da membrana o fato desta no ser composta por cidos graxos convencionais. Em seu lugar encontram-se longas cadeias de hidrocarboneto ramificadas. Os hidrocarbonetos ligam-se ao glicerol por ligaes do tipo ter (ao invs de ster) e podem apresentar-se como bicamadas (como em todas as membranas) ou como monocamadas. Quando formam bicamadas, denominam-se glicerol diter e quando originam monocamadas, diglicerol tetrater. Quando h a monocamada, esta modula sua fluidez atravs da ciclizao de alguns elementos da cadeia de hidrocarboneto, formando anis pentacclicos. As protenas de membrana podem ser tambm bastante diferentes daquelas observadas em outros tipos celulares. Cromossomo: bastante semelhante ao cromossomo das eubactrias, uma vez que nico e, na maioria dos casos, circular. Por outro lado, sua organizao semelhante aos eucariotos, uma vez que observam-se protenas (do tipo histona) associando-se ao DNA, atuando na manuteno da estrutura do DNA, afetando tambm a expresso gnica. Foi observado que em muitos hipertermfilos a associao das protenas ao DNA promove um enovelamente do tipo positivo no DNA, enquanto em eucariotos, este negativo. Foi tambm relatada a presena de introns no cromossomo de Archaea, em genes de RNA de hipertermfilos e halfilos, sendo processado atravs de endonucleases.

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Transcrio: Em relao aos promotores, aparentemente sua estrutura tem maior semelhana com promotores de eucariotos que de procariotos. A RNA polimerase mais complexa que a de bactrias, podendo ser composta por 8 polipeptdeos em metanognicas e haloflicas (enquanto em Bacteria so 4). Nas hipertermfilas, podem existir 10 polipeptdeos distintos (assemelhando-se RNA polimerase de eucariotos). Ribossomos: So do tipo 70S, semelhantes aos de bactrias, entretanto, sua composio protica bastante distinta, tornando-os resistentes aos antibiticos que afetam a sntese protica bacteriana. A traduo tambm diferentes das Bacteria, assemelhando-se mais aos Eucarya, sem a participao da formil-metionina no incio do processo. A toxina diftrica, que inibe a traduo de clulas eucariticas tambm inibe o processo em Archaea. Flagelos: Muitas archaea, inclusive aquelas sem parede celular, podem apresentar flagelos. Estes diferem totalmente dos flagelos bacterianos, uma vez que no apresentam a estruturao em corpo basal, gancho e filamento. Nas Archaea, o flagelo no apresenta os anis observados nas bactrias e, geralmente, composto por vrios tipos de flagelina, que exibe composio similar a vrias fmbrias. Ao que parece, o flagelo composto por flagelina, que se organiza a partir da membrana citoplasmtica, projetando-se para o exterior da clula. Ecologia de archaea Embora inicialmente fossem consideradas organismos restritos a ambientes extremos, muitas archaea vm sendo isoladas de ambientes favorveis aos demais organismos procariticos e eucariticos. No entanto, dentre as vrias archaea descritas at o momento, a maioria encontrada em poucos ambientes especializados terrestres e aquticos, tais como lagos extremamente salinos, ambientes estritamente anaerbios e/ou ambientes extremamente quentes. At pouco tempo, a menor temperatura onde foi possvel se fazer o cultivo in vitro de archaea era de 30C. Dados recentes indicam, por outro lado, que este grupo de microrganismos pode tambm ser isolado de ambientes frios. Atualmente sabemos que estes organismos so importantes membros da microbiota aqutica de regies frias do planeta. Ao que parece, as archaea podem corresponder a at 34% da biomassa procaritica das guas costeiras superficiais da Antrtida. De maneira geral, e pelo fato da maioria das archaea conhecidas serem isoladas de ambientes quentes, salinos e/ou anaerbios, este domnio didaticamente dividido em trs grandes grupos: termoflicos, halfilos e metanognicos. No entanto, vale ressaltar mais uma vez que dados mais recentes comprvam a ampla distribuio geogrfica e ecolgica desse grupo de organismos. Termofilia: Sabe-se que vrias archaea tm temperatura tima superior a 80C e temperatura mxima de crescimento acima de 100C (Pyrodictium brockii tem timo de 105C e Pyrolobus fumarii de 106C, embora cresa em at 113C). Ainda no se sabe at onde pode ir esta faixa de temperatura. Pyrolobus fumarii foi isolado de uma fenda no Oceano Atlntico, a uma profundidade de 3.650 metros, crescendo em uma faixa de temperatura de 90 a 113C, pH de 4 a 6.5 e concentraes de NaCl variando de 1 a 4%. Experimentos realizados em laboratrio mostram que culturas na fase exponencial de crescimento sobrevivem ao tratamento em autoclave (121C) por 1 hora. A termofilia requer adaptaes fisiolgicas especializadas, pois as protenas e cidos nuclicos no podem ser desnaturados e a membrana deve manter-se funcional nestas temperaturas. Curiosamente, a estrutura primria (seqncia de aminocidos) de vrias protenas de Archaea no exibem diferenas significativas quando comparada a outros organismos. Provavelmente, o principal fator para esta caracterstica seja o dobramento destas protenas. Uma caracterstica das protenas de termoflicos refere-se substituio de aminocidos mais flexveis por aqueles que conferem maior rigidez molcula. Alm disso, foi sugerido que as Av. Eng. Manfredo Barata Almeida da Fonseca, 762, Bairro Jardim Aurlio Bernardi Caixa Postal 271 - CEP 76.907-438 - Ji-Paran - RO Fone: (69) 3416-3100 - Fax: (69) 3416-3131

protenas poderiam ser estabilizadas pela presena de altos teores de aminocidos hidrofbicos. As archaea termfilas tambm exibem um enorme nmero de chaperonas, que garantem o dobramento correto das protenas nas temperaturas mais elevadas. Em termos de genoma, observa-se muitas vezes valores maiores de G+C nas hipertermfilas, estabilizando assim os cidos nuclicos. Entretanto, tal caracterstica no pode ser considerada como regra. Muitas termoflicas apresentam altas concentrao de 2,3-difosfoglicerato cclico, um composto que protege contra a depurinizao. Vrias outras produzem uma DNA girase reversa, que enovela o DNA no sentido positivo, que mais estvel que o negativo, o qual encontrado na maioria das outras clulas. Alm disso, muitas vezes so encontradas protenas do tipo histona ou outras, que se ligam fortemente ao DNA, protegendo-o. Quanto membrana, sua funcionalidade decorrente da presena de isopreno e da ciclizao de seus componentes, alm da alta frequncia de membranas do tipo tetrater. As termfilas podem ser encontradas em fontes geotrmicas, fontes vulcnicas (que expelem vapores e compostos sulfurados), fontes termais marinhas, onde erupes vulcnicas elevam a temperatura para mais de 100C. Nestes casos, estas bactrias requerem, adicionalmente, presses elevadas para o seu desenvolvimento. Estes organismos so muito utilizados em biodigestores de esgoto e tambm como fonte de insumos laboratoriais (Taq pol). Halofilia: Este grupo de archaea habita locais denominados hipersalinos, requerendo grandes quantidades de sal para seu desenvolvimento. Um halfilo extremo requer pelo menos 1,5M de NaCl (9%), podendo variar de 2 a 4M (12 a 23%) para outras espcies. Foram descritos organismos capazes de crescer na presena de 5,5M de NaCl, o que equivale a 32%, correspondendo ao limite de saturao para este sal. Embora ambientes salinos sejam comuns, os hipersalinos so raros, encontrando-se em reas quentes e secas do mundo (lagos salgados, salinas, mar morto). Nestes ambientes, as clulas tenderiam a perdem gua, devido elevada concentrao externa de sal. Entretanto, exibem uma adaptao fisiolgica que corresponde ao acmulo de sais ou ons em seu citoplasma, ou pela sntese de compostos orgnicos intracelulares, denominados solutos compatveis. Assim, o gnero de halfilos Halobacterium bombeia grandes quantidade de K+ para o interior da clula, superando a concentrao externa de Na+. Nestes organismos, as enzimas devem exibir maior tolerncia ao sal, tendo em vista que seu funcionamento dever ocorrer em um ambiente muito concentrado. Muitas apresentam bombas de cloro, que constantemente bombeiam este on para o interior da clula. As paredes podem conter uma grande quantidade de aminocidos carregados negativamente, ou polissacardeos sulfatados, para interagir com ons Na+ presentes no meio, sendo esta interao essencial integridade da parede. Metanognicos: Este foi o primeiro grupo de archaea descrito, sendo nico por sua capacidade de sintetizar metano. Sua distribuio geogrfica muito ampla, sendo encontrados no intestino de ruminantes, em cupins, em lagoas, lodos de esgoto, etc. Podem ser quimiolitotrficos ou quimiorganotrficos e, via de regra, so anaerbio estritos, exibindo enorme sensibilidade ao oxignio.

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Interaes microbianas Ao que parece, as archaea interagem intensamente com outros organismos, embora sejam eventos menos frequentes que aqueles observados para as eubactrias. As archaea metanognicas realizam associaes com outros microrganismos, uma vez que necessitam de substrato (principalmente H) para a produo de metano. Assim, em processos de degradao anaerbia de resduos de indstrias de papel, que ocorrem em rios e lagos e tambm no intestino de ruminantes, pode-se observar a ocorrncia de comunidades microbianas contendo metanognicas, havendo a produo de metano e gs carbnico. Um dos principais produtos da fermentao de muitos anaerbios o H2, que prontamente utilizado pelas metanognicas, que associado ao CO2, origina o metano. O cido frmico pode tambm ser utilizado como doador de eltrons para a reduo do CO2. A produo de metano, por sua vez, garante um ambiente anaerbico. J foi descrita a ocorrncia de metanognicas endossimbiontes em protozorios que habitam o rumen de vertebrados. Foi descrita a associao de archaea com animais e em alguns tecidos vegetais, embora at o momento no tenha sido comprovada a capacidade de invadir tecidos ou manifestar potencial patognico nesses organismos. Em muitos casos a presena de metanognicas no rumen pode levar a prejuzos ao gado, uma vez que competem pelo acetato produzido na fermentao da celulose. H ainda um problema ambiental associado produo de metano pelas archaea, pois este metano expelido pelas archaea contribui ao agravamento do efeito estufa. Estudos recentes indicam que a quantidade de metano expelida pelas Archaea pode ser de 400 ton3/ano (cerca de 50 litros por dia). Dados recentes revelam a deteco de archaea em amostras de placa dental subgengival, embora nada tenha sido provado em relao ao potencial patognico dos organismos isolados.

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