Dra. Mara Teresa Pea, Ms, PhD.

Area Parasitologa, Instituto de Patobiologa, CICVyA, INTA Castelar Repblica Argentina Los mtodos que se utilizan para el diagnstico de Trichinella spiralis comprenden: 1- deteccin directa del primer estado larval (L1) enquistada en tejido muscular estriado 2- deteccin indirecta mediante el estudio de anticuerpos especficos. 3- PCR (polymerase chain reaction) 1) Deteccin directa . La deteccin directa del primer estado larval L1 enquistada en el tejido muscular se realiza en la inspeccin post-mortem. La digestin artificial es el mtodo de control de triquinosis en mataderos requerido por los miembros de la Comunidad Econmica Europea (CEE) para el comercio de porcinos y subproductos de origen porcino entre los pases de la CEE con pases del tercer mundo. Los mtodos de deteccin directa tambin son de importancia para estudios epidemiolgicos del ciclo selvtico de la triquinosis de manera de determinar los huspedes reservorios. Los mtodos de deteccin directa del primer estado larval en tejido muscular comprenden: a) Triquinoscopa: Consiste en la inspeccin visual de pequeas muestras de tejido muscular comprimido entre 2 vidrios gruesos para la determinacin de las larvas in situ. Para ste mtodo se requiere la utilizacin del triquinoscopio que tiene una eficiencia de deteccin de 3 larvas por gramo de tejido analizado. De acuerdo al Manual de Standards para los tests diagnsticos y vacunas de la OIE se debern tomar 28 muestras de 2 x 10 mm totalizando un peso de 0,5 g de los sitios de predileccin que en cerdo son diafragma, lengua y maseteros. b) Digestin artificial: Este mtodo consiste en realizar una digestin artificial de un pool de muestras (100 g) provenientes de los sitios de predileccin previamente mencionados. La digestin artificial se basa en digerir las muestras con un lquido de digestin compuesto por pepsina y cido clorhdrico mediante calentamiento a 46-48C por 30. Mediante este proceso las larvas son liberadas del tejido muscular que luego son recuperadas por filtracin y posterior sedimentacin. Este mtodo tiene una eficiencia de deteccin de 1 larva por gramo de tejido. 2) Deteccin indirecta mediante tests serolgicos Los test serolgicos para el diagstico de triquinosis tienen la ventaja de detectar infecciones leves (<1 larva por gramo de msculo) y se pueden realizar en el animal vivo. Estos mtodos no pueden reemplazar los mtodos de deteccin directa que se realizan en los mataderos para el control de sta zoonosis, pero son adecuados para programas de control en los establecimientos as como para estudios epidemiolgicos del ciclo selvtico de la enfermedad. Como los mtodos serolgicos permiten el estudio de muestras de animales vivos as como muestras post-mortem, seran de utilidad para establecer reas libres de Trichinella y para reducir las restricciones en el comercio internacional de animales.

TECNICAS DE DIAGNOSTICO DE TRICHINELLA SPIRALIS

Los tests serolgicos incluyen: a) Test de inmunofluorescencia (IFAT): Muestras de tejido muscular congeladas son cortadas con un cristato y las secciones obtenidas son utilizadas para realizar el test de inmunoflorescencia directa o indirecta. En el test de inmunofluorescencia directa el anticuerpo conjugado es aplicado a la seccin y luego de una incubacin es lavado. La muestra es luego observada bajo microscopio de fluorescencia que revelar zonas oscuras y zonas verdes fluorescentes adonde el anticuerpo se adhiri al tejido. En el test de Inmunofluorescencia indirecta primero se incuba con suero problema la seccin de tejido en estudio y luego con anti-suero conjugado. La desventaja de stos procedimientos es que requieren de equipos costosos para su realizacin. b) Western blot:-Polipptidos de protenas denaturalizadas peden separarse de acuerdo a sus pesos moleculares y por electricidad mediante migracin a travs de un gel en un campo elctrico. La separacon de stas protenas se realiza en un gel de poliacrilamida o de agarosa-acrilamida y son desnaturalizadas con sulfato dodecil de sodio (SDS) que le confiere una carga negativa y la migracin ocurre hacia el ctodo en un rango que es proporcional a la masa molecular de la protena. En el caso de utilizarse el Western blot para el diagnstico de triquinosis, las protenas de un extracto de T. spiralis son primero separadas mediante un SDSPAGE y transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Luego las membranas son incubadas con el suero problema diludo que contiene el anticuerpo primario. Luego de la incubacin se realiza un lavado para eliminar los anticuerpos que no se adhirieron y luego se incuba con el anticuerpo secundario (conjugado). Finalmente, luego de eliminar el exceso de anticuerpos mediante lavado se incuba con el substrato para visualizar las bandas en donde el anticuerpo primario (problema) se adhiri a la protena. c) Fijacin de complemento:-Este mtodo se puede realizar en tubo o placa. Primero se forman los complejos inmunes incubando el antgeno con el suero problema. Luego se agrega el complemento que va a ser utilizado si se formaron los complejos inmunes. Finalmente se agregan las clulas indicadoras (eritrocitos) junto con el anticuerpo anti-eritrocitario en dosis subaglutinantes. Si hay complemento libre, los eritrocitos sern lisados pero si el complemento fue consumido por los complejos inmunes, entonces no se evidenciar el lisado de los eritrocitos. Los tests de fijacin de complemento estn sujetos a gran variabilidad ya que utilizan una gran cantidad de reactivos biolgicos (complemento, hemolisina y eritrocitos) que varan con el tiempo y con las diferentes fuentes de origen. d) Hemaglutinacin:-La hemaglutinacin consiste en la incubacin de diluciones seriadas del suero problema con una suspensin de eritrocitos. Si hay suficiente anticuerpos en el suero problema los eritrocitos sern aglutinados formando un pellet. Los tests de aglutinacin tienen la desventaja que no son muy sensibles ya que los reactivos son necesarios en altas concentraciones y adems la reaccin se lee a simple vista siendo de sta manera difcil de expresar.

e) ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay):-Un gran nmero de ELISA tests han sido desarrollados. El ELISA directo consiste en la deteccin del antgeno con un anticuerpo especfico conjugado con una enzima. En el ELISA indirecto el antgeno especfico reacciona con el anticuerpo no conocido y son detectados con un tercer anticuerpo especfico anti-especie que esta conjugado con una enzima. Finalmente existen los ELISA sandwich directo e indirecto. En el directo el antgeno es atrapado entre dos anticuerpos siendo uno de ellos el conjugado. En el sandwich indirecto, primero se realiza una reaccin con antigeno y anticuerpo conocidos, luego se agrega el anticuerpo problema y finalmente se agrega el anticuerpo anti-especie conjugado. El ELISA test es uno de los test serlogicos que ms se usa ya que el equipamiento as como los reactivos son fciles de conseguir. Por otro lado es un test de fcil estandarizacin y adems tiene la ventaja de que los datos pueden ser volcados a una computadora para su posterior anlisis. Los antgenos ms comnmente utilizados en el diagnstico de triquinellosis mediante el test de ELISA son los antgenos crudos y los antgenos secreto-excretores de T. spiralis. Los antgenos secretoexcretorios son obtenidos mediante el cultivo in vitro de larvas enquistadas en msculo. La ventaja de la utilizacin de los antgenos secreto-excretores es que tienen mayor especificidad detectando por lo tanto menor nmero de falsos positivos. Por el contrario, en el caso de los antgenos somticos tales como los extractos crudos dan reacciones cruzadas con otros nematodes debido a que comparten epitopes, resultando en un nmero mayor de falsos positivos. El test que se usa para el diagnstico de triquinosis es un ELISA indirecto con antgeno crudo secreto-excretorio. Gamble y colaboradores (1983) reportaron una eficiencia de deteccin de 0.01 larvas por gramo de diafragma utilizando el test de ELISA realizado con antgenos secreto-excretores. f) Dot-Elisa:-La tcnica de Dot-Elisa consiste en la captacin de antgenos contra Trichinella spiralis sobre papeles de nitrocelulosa y el posterior agregado de los sueros problemas. Posteriormente se agrega el conjugado y la reaccin se evidencia mediante el agregado del substrato. Su y Prestwood (1991) desarrollaron un dot-Elisa para el diagnstico de T. spiralis en porcinos, usando antgenos purificados mediante cromatografa de afinidad con anticuerpos monoclonales. Este test result tener una especificidad comparable con el Elisa usando antgenos secreto-excretores y tambn comparable con la especificidad del Western blot. Se detectaron mediante ste test infecciones de hasta 0,08 larvas por gramo de diafragma. Otro trabajo realizado por Hassan y col. (1994) indica que el DotElisa present una sensibilidad del 100% y una especificidad de 87.5%. 3) PCR (Polymerase chain reaction):-PCR es una tcnica que permite la deteccin de secuencias especficas de cidos nucleicos mediante la amplificacin de fragmentos de ADN in vitro con el de un termociclador. Esta tcnica se utiliza en estudios epidemiolgicos principalmente en el seguimiento de brotes humanos para determinar de esta manera el origen del brote y que especie de Trichinella es la responsable del mismo. Appleyard et al., (1999) desarrollaron un mtodo

para identificar especies y genotipos dentro del gnero Trichinella usando PCR y primers especficos. La identificacin de diferentes genotipos permitir hacer la distincin entre el ciclo de vida selvtico y sinantrpico as como la identificacin de los huspedes reservorios dando valuable informacin para la instauracin de mtodos de control. La reaccin de PCR consta de tres pasos: a) desnaturalizacin del ADN mediante el uso de calor (94 C) b) annealing del primer al ADN (37-64C) c) extensin del primer (72C) La reaccin entonces comenzar con la separacon de las 2 cadenas de ADN mientras que la enzima ADN polimerasa (Taq polymerasa) va copiando el ADN usando cada cadena como templado. Para copiar al ADN la enzima requiere de otros 2 componentes que son la fuente de bases nucletidas y el primer. Los primers son cadenas cortas de nucletidos desde donde la enzima empezar a copiar al ADN. Los tres procesos de la reaccin de PCR ocurren en el mismo tubo pero a diferente temperaturas. La primera parte del proceso separa las 2 cadenas del ADN mediante calentamiento a 90-95C. Como los primers no pueden adherirse a stas temperaturas el tubo es enfriado a una temperatura de 55C por 30 segundos, que permitir el annealing de los primers en los extremos del ADN. El paso final de la reaccin es la copia completa de los templados que se realiza a una temperatura de 75C que es la temperatura ideal para que acte la Taq polimerasa. La enzima comienza a adherir los nucletidos al primer copindose el templado y completndose de sta manera el ciclo. Al finalizar cada ciclo se obtiene una duplicacin de cada segmento de ADN. Este ciclo se repite ms de 30 veces, cada segmento de ADN que ha sido sintetizado acta como templado de modo que despus de 30 ciclos se producirn aproximadamente 1 billn de copias a partir de un segmento de ADN. Aplicacin de las diferentes tcnicas Las tcnicas convencionales de deteccin de Trichinella spp. en las carnes son simples de realizar pero tienen una baja eficiencia de deteccin. Por otro lado la triquinoscopa no puede utilizarse cuando se trata de infecciones con especies no encapsuladas tales como T. pseudospiralis y T. papuae. A pesar de tener baja eficiencia de deteccin stas tcnicas son utilizadas como rutina en inspeccin de carnes en los mataderos. Adems stas tcnicas son tambin de utilidad para identificar reservorios silvestres que cumplen un papel importante en la transmisin y epidemiologa de la enfermedad. Con respecto a los tests serolgicos, tienen la ventaja de que pueden realizarse tanto ante-mortem como post-mortem y adems tienen una eficiencia de deteccin superior a los mtodos de deteccin directa. La principal ventaja del ELISA test son los volmenes con que se

trabajan (entre 50 a 250 l) disminuyendo los costos y aumentando la precisin del diagnstico. Estos tests serolgicos tambin son de utilidad en estudios epidemiolgicos ya que permiten determinar la dinmica de transmisin a nivel de los establecimientos productores. El uso del test de ELISA depender del momento de infeccin debido a que en infecciones recientes cuando las larvas se enquistan en el msculo no pueden detectarse anticuerpos especficos. Tambin hay que tener en cuenta que el ttulo de anticuerpos especficos declina con el tiempo resultando en falsos negativos. Es por eso que el ELISA no puede reemplazar el mtodo de deteccin directa mediante digestin artificial que se utiliza en la inspeccin de carnes en mataderos y frigorficos. La tcnica de PCR es ms comunmente utilizada para determinar el origen de brotes de trichinosis en humanos. Esta tcnica permite adems determinar los diferentes genotipos de Trichinella que existen y poder asi distinguir entre ciclo de vida selvtico y domstico. La limitante de sta tcnica es el alto costo del equipamiento y los reactivos y adems necesita realizarse en condiciones limpias ya que contaminacin con ADN no especfico puede causar falsos positivos. La eleccin de la tcnica de diagnstico depender de la especie animal afectada, especie de Trichinella responsable, tiempo de infeccin, y finalidad del diagnstico. Por lo tanto los tests serolgicos y la tcnica de PCR son los ms indicados para el diagnstico de triquinellosis en humanos, mientras que las tcnicas de deteccin directa de la L1 se utilizan en cerdos as como en animales salvajes considerados reservorios. Con respecto a la especie de Trichinella responsable, hay que tener en cuenta que las especies no encapsuladas no se pueden diagnosticar con triquinoscopa. El tiempo de infeccin es determinante para los tests serolgicos ya que, como se ha indicado previamente, existe un perodo de ventana al inicio de la infeccin en la cual no se detectan anticuerpos especficos y por otro lado con el correr del tiempo el ttulo de anticuerpos en suero va decreciendo hasta convertirse en indetectable. Por ltimo la finalidad del diagnstico es tambin determinante de la tcnica a utilizarse ya que las tcnicas de deteccin directa se utilizan de rutina en frigorfico y mataderos con el fin de prevenir triquinosis en humanos as como estudios epidemiolgicos en animales salvajes, mientras que los mtodos serolgicos son utilizados pricipalmente para estudios de prevalencia as como para determinar areas libres de triquinosis.

DENSIDAD DE SIEMBRA Y DISTANCIA ENTRE LINEASLa densidad de siembra depender de la calidad de la semilla, tamao y peso de la misma, sistema de siembra, ciclo del hbrido elegido, disponibilidad de riego y tipo de suelo. En general se recomienda de 85.000 hasta ms de 150.000 plantas tiles a cosecha por hectrea, correspondiendo las menores densidades a los ciclos largos y zonas de baja disponibilidad hdrica y sistemas convencionales de siembra a 0,70 m. Las mayores densidades se pueden utilizar en caso de ciclos cortos a intermedios en siembras directas e incluso con menor espaciamiento entre hileras para lograr una rpida cobertura y menor competencia de malezas. DENSIDAD DE SIEMBRA EN SORGO SIEMBRA CONVENCIONAL A 0,70 m ENTRE HILERAS Ciclo Semillas por metro lineal (1) 13 Corto 14 15 a 16 10 a 11 Medio 12 13 8 Largo 9 10 a 11 Plantas por metro lineal 10 11 12 8 9 10 6 7 8 Plantas / Ha a cosecha 142.000 157.000 172.000 114.000 128.000 142.000 85.000 100.000 114.000

(1) Se considera una prdida de hasta el 30% de semilla, por diversas causas entre siembra y cosecha. Para el clculo de los kg de semillas por hectrea necesarios para la siembra, puede usarse la siguiente frmula: Kg / Ha = plantas / metro x 1,43 x peso de 1.000 semillas x 100 ----------------------------------------------------------------Poder germinativo x pureza x eficiencia de emergencia 10 x 1,43 x 30 x 100 kg / Ha = ------------------------------------- = 7,7 kg / Ha. 80 x 100 x 0,7

Ejemplo:

SIEMBRA DIRECTA (Distancia variable entre hileras) (1) Ciclo Semillas por metro lineal (2) 18 Corto 18 a 20 21 15 Medio 16 a 17 18 Plantas por metro lineal 12 13 14 10 11 12 Plantas / Ha a cosecha 172.000 185.000 200.000 142.000 157.000 172.000

12 Largo 13 a 14 15

8 9 10

114.000 128.000 142.000

(1) Si se acorta la distancia entre hileras, por ejemplo a 0,40 m, se debera mantener constante el nmero de plantaspor hectrea, aumentando la distancia entre plantas en el surco. (3) Se considera hasta un 50% de prdida de semilla, por diversas causas entre siembra y cosecha.