Cdigo MANUAL DE PROCEDIMIENTOS

LABORATORIOS CIENCIAS ESCUELA PROFESIONAL DE OBSTETRICIA

: 01

Revisin : 02 Impresin: 02 Fecha Pgina : 08.02.11 : 01 de 72

PROCEDIMIENTO

ELABORACIN DE MANUALES DE LAS ASIGNATURAS PRCTICAS DEL LABORATORIO DE CIENCIAS

ASIGNATURA: BIOQUMICA

ELABORADO POR: Prof. Lic. Luis Villafana Losza

REVISADO POR

Dra. Teresa del C. Montenegro Salazar Jefe Laboratorio de Ciencias FOE-USMP

APROBADO POR : Mg. Obst. Teresa Mimbela Cubillas Jefe Departamento Acadmico FOE-USMP

NDICE
Pgina Introduccin Directiva para La prctica en el laboratorio de ciencias Prctica N1: Espectrofotometra Prctica N2: Aminocidos Prctica N3: ELECTROFORESIS: Separacin de protenas
en geles de poliacrilamida

03 04 10 16

20 27 31 35

Prctica N4: Factores que afectan la actividad de las enzimas Prctica N5: Carbohidratos Prctica N6: Rutas metablicas Prctica N7: Determinacin de Glucgeno en los tejidos animales: Parte I Prctica N8: Determinacin de Glucgeno en los tejidos animales: Parte II Prctica N9: Lpidos Prctica N10: Determinacin del colesterol Prctica N11: Extraccin de DNA Prctica N12: Transaminacin Prctica N13: Determinacin de la creatinina Prctica N14: Determinacin de una prueba de embarazo en orina

42

45 47 50 55 58 63 68

INTRODUCCIN
Siendo la bioqumica, una rama de la ciencia que se encarga de descifrar la estructura y los mecanismos esenciales de los seres vivos, tiene, como el resto de las ramas de la ciencia, una parte terica y una parte prctica. La primera se imparte a travs de los textos de la materia y el trabajo coordinado en el aula de clases. La segunda, que constituye el tema de este manual, se aprende en el laboratorio, donde el estudiante podr recrear experiencias realizadas por los estudiosos y cientficos, porque adems se establece un contacto ntimo con los fenmenos bioqumicos tericos que el estudiante ha acumulado en sus clases tericas El trabajo en el laboratorio implica un proceso, una cascada de pasos, todos de importancia, en los que sern necesarias su cuantificacin a travs de mediciones exactas, clculos y observaciones cualitativas y cuantitativas de los fenmenos biolgicos tan complejos y fascinantes como el metabolismo, la construccin y degradacin de molculas, el funcionamiento de las enzimas y la forma en que se replica y se traduce el material gentico. Indudablemente los avances de la Bioqumica se basan en el uso del mtodo cientfico, herramienta que permite comprender y analizar los fenmenos que ocurren dentro del organismo, en su interaccin con su medio ambiente para de mantener su homeostasis. De all, que el mtodo cientfico como instrumento es una actividad ordenada que consiste en la observacin planteamiento de un problema formulacin de una hiptesis, la experimentacin para la comprobacin de la hiptesis y una explicacin de los resultados de la experimentacin. La mayora de las tcnicas experimentales y conocimientos que se han adquirido en otros cursos son muy valiosas en el laboratorio de Bioqumica. En este laboratorio raramente se aslan productos en gran escala, mas bien, se trabaja con miligramos o con microgramos. Los conocimientos metodolgicos para estudiar las biomolculas avanza a grandes pasos y en la mayora de las ocasiones se requieren reactivos y equipos costosos, por lo que es mas que imposible abarcar la extensa gama de conocimientos relacionados con protocolo bioqumicos. El manual de Bioqumica se han preparado con algunas prcticas sencillas, y representativas, que intentan explicar algunas de las propiedades de la biomolculas y tcnicas para estudiarlas. Se espera que el estudiante adquiera los conocimientos necesarios para entender cursos posteriores que pudiera tomar durante la licenciatura o bien en algn postgrado dentro del rea biolgica. Este manual prctico tiene como destinatarios los estudiantes de Obstetricia, y se inicia con las recomendaciones en el quehacer habitual del laboratorio, en cada prctica debern leer cuidadosamente las recomendaciones, que son importantes, seguida de las competencias a travs de las cuales queremos optimizar el proceso de la enseanza aprendizaje, de un fundamento terico, de los materiales que se usaran durante el procedimiento de la parte experimental, de un cuestionario y finaliza con la bibliografa pertinente, a fin de que puedan realizar sus consultas.

FACULTAD DE OBSTETRICIA Y ENFERMERA

Directiva para las Prcticas en el Laboratorio de Ciencias

Dpto. Acadmico

DIRECTIVA PARA LOS ALUMNOS DE PRCTICA DEL LABORATORIO DE CIENCIAS (APROBADO POR CONSEJO DE FACULTAD)

Artculo I

: Los laboratorios de docencia de la Facultad de Obstetricia y Enfermera de la Universidad de San Martn de Porres son unidades de servicio acadmico dnde se desarrollan las prcticas de las asignaturas de qumica, bioqumica, histologa, microbiologa.

Artculo II : Es objetivo del presente reglamento dar las pautas que permitan evitar accidentes durante la realizacin de ellas.

DE LA PRESENTACIN DE LOS ESTUDIANTES:

Artculo III

El alumno debe presentarse obligatoriamente con: Mandil de algodn drill que cubra desde el trax hasta las rodillas y las mangas que cubran todo el brazo con presencia de puo. El mandil no debe ser de material sinttico (ej. Nylon) Gafas de seguridad de polipropileno Mascarilla que cubra la boca y la nariz Guantes quirrgicos cuando se trabaja con material biolgico con material solvente de fcil absorcin Pantalones y zapatos que cubra todo el pie y no deje zonas descubiertas. No debe presentarse con sandalias Cabellos recogidos El alumno no puede ingresar al laboratorio con: Portando pulseras, anillos, collares o cualquier otra prenda metlica. Maletines, mochilas, sacos, abrigos, entre otros, los que deben ser guardados en los casilleros indicados. Bebidas, gomas de mascar o cualquier tipo de alimento. Los telfonos celulares deben quedar sin sonido en los casilleros.

Artculo IV:

Solamente deben ingresar a la mesa de trabajo el material que va a ser utilizado en la prctica. Como gua de prctica, lpices, entre otros.

Artculo V:

Est prohibido fumar en la prctica.

DEL TRABAJO EN EL LABORATORIO:

Artculo VI:

Los estudiantes no podrn comenzar las prcticas y experimentos sin la presencia, orientacin y autorizacin del profesor.

Artculo VII:

El alumno debe iniciar la prctica: Habiendo ledo la gua de prctica de tal manera que conozca las advertencias, materiales, reactivos y procedimientos que se van a realizar. Portando gafas, guantes, mascarilla y mandil

Artculo VIII:

En la prctica debe: Realizar solo los experimentos programados Realizar la prctica sin prosa No bromear ni jugar en la prctica No utilizar ni tocar instrumentos o dispositivos que no estn sealados en la prctica

Artculo IX:

Debe mantenerse el orden y la limpieza Mantener los cajones y puertas de los muebles cerrados No colocar sillas, bancas o cualquier otro mueble que impida el libre desplazamiento por los pasadizos del laboratorio Evitar humedecer el piso para evitar resbalones

Artculo X:

Todo movimiento debe hacerse con cautela para evitar choques que puedan producir roturas del material del laboratorio

Artculo XI:

No debe succionar la pipeta con la boca, debe utilizarse bombillas pipeteadoras

Artculo XII:

Cuando se trabaja con tubos de ensayo se recomienda. Siempre deben ser colocados en la gradilla y no en otra localizacin (mesa, bolsillos, etc) No llenarlos con ms del 25% de su capacidad total Sujetarlos con pinzas cuando son calentados La posicin del tubo al momento de calentarlo debe presentar una inclinacin que impida que la salida de los vapores o lquidos entren en contacto con la cara del operador o de los compaeros Nunca calentar tubos tapados o cerrados No agregar ningn reactivo a um tubo que se est calentando No utilizar recipientes no indicados para el calentamiento (ej. Matraz, probetas, frascos, etc) No dirigir la vista hacia la boca del tubo cuando se est produciendo una reaccin o se est calentando

Artculo XIII:

Los productos qumicos: No deben ser olidos colocando directamente la nariz sobre la boca del recipiente No deben ser tocados Cada reactivo debe ser manipulado con un instrumento exclusivo para cada uno de ellos No deben ser probados

Artculo XIV:

Los trabajos de la prctica deben realizarse sobre la mesa del laboratorio sin excepcin alguna

Artculo XV:

Cuando tenga que mezclar un cido con agua, vierta el cido sobre el agua y no al contrario, puede generar calor excesivo, salpicaduras u otras reacciones inesperadas

Artculo XVI:

Al terminar la prctica: La mesa debe quedar ordenada y limpia

 Los tubos deben quedar limpios sobre las gradillas y los desechos en los recipientes correspondientes. Todo ello bajo la supervisin del profesor En los lavatorios no se puede verter slidos o papeles que puedan obstruir el desage Deben cerciorarse que las llaves de gas estn cerradas Lavarse las manos prolijamente Artculo XVII: AVISAR AL PROFESOR EN CASO DE: Fuego Quemaduras Salpicaduras Ingestin, inhalacin, derrame sobre la piel de productos qumicos

PRCTICA N 01: ESPECTROFOTOMETRA COMPETENCIA El alumno comprende los fundamentos de la espectrofotometra, adquiere habilidades y destrezas en el manejo del espectrofotmetro, instrumento auxiliar y de apoyo en la determinacin de los anlisis bioqumicos, valora la importancia de esta metodologa en la prevencin y mantenimiento de una salud ptima.

PRECAUCIONES 1.- Al iniciar tu experiencia siempre carga la pipeta con la bombilla de pipetear, no lo hagas con la boca. 2.- En la preparacin de las bateras de tubos, no debes utilizar las pipetas indistintamente, debe ser para cada solucin, es decir, la pipeta que estas utilizando en el agua destilada ser de uso exclusivo para ello, sino corres el riesgo de alterar las concentraciones de las soluciones que estas preparando. 3.- Para la lectura en el espectrofotmetro los tubos debern estar secos.

FUNDAMENTO Una de las propiedades de las molculas es que pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma de energa interna. Esto s puede apreciar con se inicio de ciclos vitales de muchos organismos, como es evidente el de la fotosntesis en plantas y bacterias. La Mecnica Cuntica nos explica que la luz est compuesta de fotones cada uno de los cules tiene una energa: Efotn = h. = h.c/ , Donde c es la velocidad de la luz, es su frecuencia, su longitud de onda y h= 6.6 10- 34 Js es la constante de Planck. As si decimos que una sustancia qumica absorbe luz de longitud de onda , significa que las molculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de onda. En esta prctica estudiaremos la absorcin de luz en el ultravioleta cercano (325-420 nm) y en el visible (420-700 nm). Cuando una molcula absorbe un fotn en este intervalo espectral, se excita pasando un electrn de un orbital del estado fundamental a un orbital excitado de energa superior. De est manera la molcula almacena la energa del fotn, y lo hace en sus enlaces: A + h. A* E(A*) = E(A) + Efotn

10

Como la energa se conserva, la diferencia de energa entre el estado fundamental de la molcula (A) y su estado excitado (A*) debe ser exactamente igual a la energa del fotn. Es decir, una molcula slo puede absorber fotones cuya energa h. sea igual a la energa de un estado molecular excitado. Cada molcula tiene una serie de estados excitados discretos (o bandas) que dependen de su estructura electrnica y que la distinguen del resto de molculas. Como consecuencia, el espectro de absorcin, es decir, la luz absorbida en funcin de la longitud de onda, constituye una verdadera sea de identidad de cada sustancia o molcula. Por ejemplo si intentaremos detectar las dos variedades de la clorofila A y B midiendo su espectro de ultravioleta/visible, como estn mezcladas en una misma muestra sus espectros de absorcin aparecen superpuestos tal como se representa en la siguiente figura:

En este sentido la Espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales ms utilizadas para la deteccin especfica de molculas. Se caracteriza por su precisin, sensibilidad y su aplicabilidad a molculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomolculas, etc.) y estado de agregacin (slido, lquido, gas). Los fundamentos fsico-qumicos de la espectrofotometra son relativamente sencillos. Se denomina fotocolormetra al mtodo ptico de absorcin que nos permite cuantificar sustancias y esta basada en la medicin de la intensidad de la luz monocromtica (seleccionada segn la longitud de luz deseada), trasmitida a travs de una solucin coloreada, ya sea que se trate de sustancia naturalmente coloreadas o que se han hecho de tal clida mediante reacciones qumicas adecuada. La mayora de los cuerpos en solucin tiene una capacidad de absorcin selectiva sobre determinadas radiaciones luminosas, cuando sta absorcin se realiza en la zona espectral visible, las soluciones las ve el observador de un color que es producido por las radiaciones que no han sido absorbidas. Cuando un haz de luz (Luz Incidente, I0) atraviesa una solucin, una parte de la radiacin queda absorbida por las molculas del soluto coloreado, sufriendo una reduccin de su intensidad (Luz Transmitida, I t), proporcional a la capacidad de absorcin de dichas molculas, otra parte de la radiacin se pierde por fenmenos fsicos como reflexin, refraccin y difraccin de la luz.

I0

It
11

Luz Incidente

Luz Transmitida

La longitud de onda en la que las molculas de dichas sustancias absorbe con mayor intensidad la luz, se denomina longitud de Mxima Absorcin o Lambda Mximo. Si consideramos que cada molcula absorbe una determinada de luz, la intensidad de la luz transmitida por una solucin disminuir en relacin con el nmero de molcula que se interpongan entre la fuente luminosa y el observador. Este nmero vara de acuerdo con la concentracin del soluto y el espesor del recipiente que contiene la solucin, estos factores estn considerados en la Ley de Lambert y Beer, que rigen los principios de la Colorimetra y cuyas formas de expresin son:
Log (lo / lt) = l c = A = D.O. Donde: Io = Intensidad de la Luz Incidente lt = Intensidad de la Luz transmitida. = Coeficiente de Extincin Molar. Valor constante dependiendo de la naturaleza de la sustancia y de la longitud de onda. l = Espesor del recipiente en cm. C = Concentracin de la solucin. A = D.O. = Absorbancia = Densidad ptica = Extincin. La Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la tramitancia (T) y la relacin entre ambas es logartmica.

CALCULO DE LA CONCENTARCIN DE UNA SOLUCIN PROBLEMA Para calcular la concentracin de una solucin problema con el empleo de un fotocolormetro, existen dos formas: - Mtodo de la curva Standard o curva de calibracin. - Factor de calibracin. CURVA STANDARD: Este mtodo consiste en utilizar varios Standares de concentraciones conocidas y progresivas para luego construir un grafico en un sistema de coordenadas en el que se colocan las lecturas en las ordenadas (Eje Y) y la concentraciones en las abscisas (Eje X). en la recta obtenida (Funcin Lineal), se puede extrapolar Absorbancia o Densidad ptica de la muestra problema, hallando la concentracin de la misma en el eje de las abscisas. FACTOR DE CALIBRACIN (Fc): El factor de calibracin es un trmino que relaciona la cantidad o peso de una sustancia o la concentracin de la misma con su absorbancia, es decir la intensidad de luz que absorbe una sustancia de concentracin conocida Estndar o patrn. Matemticamente es la inversa de la pendiente de la curva de calibracin.

12

Puede expresarse en peso (Fcw) o en la concentracin (Fc{}), siendo para el primer caso el peso que existe de la sustancia que da color en el tubo que se esta midiendo la absorbancia. As: Fcw = W / A o Fc{} = [Standard] / A Donde: W = peso del Standard en el tubo de reaccin. A = Absorbancia del tubo Standard [Standard] = Concentracin del Standard. Con el factor de calibracin se puede fcilmente determinar la concentracin de una muestra desconocida problema (MP), conociendo su absorbancia. Si la muestra problema y el Standard son procesados de la misma manera (diluciones) se podr usar directamente la siguiente formula. [MP] = AMPFc[ ] Si la muestra problema sufre diluciones previas se encontrara el factor de dilucin (Fd) que es matemticamente la inversa dilucin 8dil.) y esta asu vez es: Dilucin. = Vol MP / Vol T Donde: Vol MP = Volumen de la muestra problema tomada para hacer la dilucin. Vol T = Volumen Total Para este segundo caso cuando se quiera saber la concentracin de una muestra problema se proceder usando la siguiente formula: [MP] = AMPFc[ ]Fd Donde: AMP = Absorbancia de la muestra problema. Fc = Factor de Calibracin Fd = Factor de Dilucin [MP] = Concentracin de la muestra problema Cuando la muestra problema y el Standard tienen diferentes procesamientos o son medios en diferentes proporciones en los tubos de reaccin, se recomienda usar la siguiente formula: [MP] = AMPFcw (100/ VR) Donde: VR = Volumen real de la muestra en el tubo de reaccin. La concentracin de la muestra problema [MP] queda expresada en mg/dL dependiendo de la unidades W. Longitud de luces visibles ms frecuentes Violeta 300 a 340 nm Azul 400 a 440 nm

13

Verde 500 a 540 Rojo 600 a 650 MATERIALES Y REACTIVOS Solucin de Azul de Bromo fenol Solucin madre 4 tubos de ensayo Gradillas Pipetas de 5 ml Espectrofotmetro Cubetas de lectura La lectura se realizar utilizando: 340 nm, 540 nm, 600 nm, 650 nm, longitudes de onda PROCEDIMIENTO Determinacin de la curva de absorbancia Preparar la siguiente batera de tubos: Solucin stock: Azul de bromo fenol (solucin madre):

TUBOS TUBO N 1 . TUBO N 2 TUBO N 3g TUBO N 4

SOLUCIN 3 ml de solucin madre 1 ml sol. madre + 9 ml de agua destilada 1ml (tubo 2) + 9 ml de agua destilada 1m (tubo 3) + 9 ml de agua destilada

CONCENTRACIN 100 % 1/10 1/100 1/1000

Leer las Absorbancia de los 4 tubos a las siguientes longitudes de onda (): 340 nm, 540 nm, y 650 nm. en el espectrofotmetro o con filtro azul, verde y rojo en el fotocolormetro.
N de TUBOS Longitud de onda 340 nm Longitud de onda 540 nm. Longitud de onda 600 nm Longitud de onda 650 nm. 1 D .O (Abs) 2 D .O (Abs) 3 D .O (Abs) 4 D .O (Abs)

1.- Con los datos obtenidos: Construir en un papel milimetrado las Grficas de Absorbancia versus concentracin del azul de bromo fenol a las tres longitudes de onda o filtros para cada solucin. 2.- Con estas graficas elegir la longitud de onda ptima o filtro adecuado.

14

3.- Una vez obtenida la Curva de Calibracin, medir la Absorbancia a la longitud de onda ptima o filtro adecuado, 4.- Obtener el factor de calibracin (Fc) Promedio con las Soluciones Standard Utilizadas para construir la curvas de calibracin ajustadas. 5.- Calcular la concentracin de la muestra Problema:

CUESTIONARIO 1.- En que consiste la espectrofotometra? 2.- Por qu es necesario que las muestras estn coloreadas? 3.- Cul es el significado de la luz en esta metodologa? 4.- Que factores alteran la ley de Lambert- Beer? 5.- Se podrn leer la Absorbancia de soluciones incoloras, como protenas o cidos nucleicos, en el rango de la longitud de onda de la luz ultravioleta? 6.- Tiene alguna utilidad la espectrofotometra?.

FUENTE BIBLIOGRAFICA - HARRIS D. Anlisis Qumico Cuantitativo. Revert; 2001 2a ed. New York: New York:

- Centro de Investigacin y Desarrollo Tecnolgico del agua de la Universidad de Salamanca. Centro de Investigacin y Desarrollo Tecnolgico del agua de la Universidad de Salamanca. Espectrofotometra. (sede Web). Salamanca: CIDTA; (Acceso 12 Dic 2009). Disponible en: http://cidta.usal.es/cidta/Espectrofotometro.htm

15

PRCTICA N 02: AMINOCIDOS COMPETENCIA El alumno define y reconoce un aminocido, interpreta y demuestra la existencia de aminocidos azufrados en algunas protenas, identifica, analiza y experimenta utilizando la casena experiencias para comprobar los aminocidos, promueven acciones que incidirn favorablemente en la futura actividad profesional.

PRECAUCIONES 1.- Siempre carga la pipeta con la bombilla de pipetear, no lo hagas con la boca. 2.- Pipetee con las bombillas de pipetear los volmenes precisos en cada uno de los tubos. 3.- Debes tener mucho cuidado cuando utilices el HCL QP. , el HNO3, o el H2SO4 concentrado, si los tocaste lvate inmediatamente. El profesor har las mediciones respectivas 4.- Al finalizar la experiencia lava los tubos. Y elimina los deshechos de la clara de huevo al tacho de basura.

FUNDAMENTO Los aminocidos constituyen, hoy por hoy uno de los captulos ms importantes de la bioqumica general. Se trata de molculas verstiles, precursoras famosas de las macromolculas de la vida y cuyas propiedades irremplazables las han convertido en la piedra angular de acontecimientos biolgicos tan espectaculares como participar en la expresin el mensaje gentico, como es la sntesis de protenas y que tendrn que ser especficos en la actividad enzimtica participando tambin en la catlisis del metabolismo. De al que resulte imperativo el aprendizaje de las tcnicas elementales para que el estudiante se halle en posibilidad de reconocer y aislar los aminocidos esenciales para el sostenimiento de la vida, as como los procedimientos para caracterizarlos, separarlos por cromatografa y teirlos mediante el empleo de nihidrinas Segn sus caractersticas muchos aminocidos tienen diferentes comportamientos, algunos son bastantes solubles en agua, debido principalmente a sus propiedades como sal, a causa de su estructura dipolar.

16

Los grupos R- de algunos aminocidos son aromticos (como en la tirosina, la fenilalanina). Estos aminocidos estn presentes en muchas protenas. Cuando se trata una protena con cido ntrico concentrado, estos grupos R- aromticos puede ser nitrados, dando nitro-compuestos amarillos y aumentando el color en medio lcali.

MATERIALES Y REACTIVOS

Casena Albmina de huevo Hidrxido de sodio al 20% cido ntrico concentrado cido clorhdrico concentrado cido sulfrico concentrado cido actico glacial Nihidrina (hidrato de tricetohirindeno) Acetato de plomo al 10% 5 tubos de ensayo Gradillas 2 pipetas de 5 ml

PROCEDIMIENTO.Experimento 1: Solubilidad. A 0.1 g. de casena (protena de la leche) en un tubo de ensayo, agregue 5 ml. De agua destilada. A 2ml. De esta solucin agregue NaOH al 10%, luego tape con un corcho y agite. A otros 2 ml. De la solucin de casena agregue HCL concentrado gota a gota, agite y anote lo que sucede. Experimento 2: Test Xanto Proteico. Coloque 2 ml de 0.1 g. de casena en un tubo de ensayo, agregue 2 ml. De cido ntrico concentrado, caliente suavemente. Observe el color que se forme. Enfri la solucin, neutralice con cuidado agregando poco apoco solucin de hidrxido de sodio al 10%, aada un exceso de lcali y anote sus resultados. Experimento 3: Reaccin de Triptfano En un tubo de ensayo se mezclan 2 ml. De cido actico con 2 ml. De una solucin de protena, se inclina el tubo y por las paredes de este se vierte mediante una pipeta 1 ml. De cido sulfrico concentrado. Se deja en reposo durante 10 mm. Un anillo coloreado indicara la presencia de triptfano en la 17

protena. El color se dice que es debido ala reaccin entre el cido glioxlico que hay como impureza en el cido actico y el grupo indlico del triptfano. Experimento 4.-Reaccin de la NIHIDRINA

FUNDAMENTO: Nihidrina (hidrato de tricetohirindeno) un agente oxidante poderoso es reducida por la aminocidos a un pH entre 4 y 8 En una segunda etapa la Nihidrina reducida se condensa con el amoniaco liberado en el medio y con otra molcula intacta de Nihidrina, formando un complejo de color violeta o violeta azulado. PROCEDIMIENTO: Colocar en un tubo de ensayo cada una de las muestras indicadas, adicionar 0,5 ml. de solucin de nihidrina, someter al calor en bao mara a ebullicin por 2 minutos enfriar. Observar el color desarrollado. Experimento 5.- Reconocimiento de AMINOCIDOS AZUFRADOS. FUNDAMENTO: El azufre contenido en algunos aminocidos, reaccionan con acetato de plomo en medio alcalino formando un precipitado marrn o gris oscuro de sulfuro de plomo. El azufre de libera en medio alcalino formando la sal de plomo respectiva. Se basa est reaccin en la separacin mediante un lcali, del azufre de los aminocidos, el cual al reaccionar con una solucin de acetato de plomo forma el sulfuro de plomo. Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro de plomo, utilizndose el azufre de los aminocidos, el que sirve para identificar protenas que tienen en su composicin aminocidos con azufre. PROCEDIMIENTO: Colocar en un tubo de prueba 2ml. de solucin de albmina de huevo Agregar 3ml. de NaOH al 20% Hervir por unos minutos y aadir gotas de Acetato de Plomo al 10%. Observar el cambio de color. Dejamos caer 1ml. de HCl concentrado y apreciamos el olor caracterstico. Graficar su experiencia

CUESTIONARIO 1.- Qu es un aminocido? 2.- Qu son los aminocidos esenciales? 3.- En que consiste la reaccin xantoproteca? Fundamente su respuesta 18

4.- Por qu a un grupo de protenas se les llama azufrados?

FUENTE BIBLIOGRFICA - Nelson D L, Y Cox M. M. LEHNINGER. Principios de Bioqumica. 4 Ed. Espaa: Ediciones Omega S.A.; 2006 - Mathews Y Van Holde. Bioqumica. 3 Ed. Espaa: McGraw-Hill. Interamericana; 2002.

19

PRCTICA N 03: ELECTROFORESIS: SEPARACIN DE PROTENAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA COMPETENCIA El alumno reconoce la tcnica de la electroforesis en gel analiza y experimenta el proceso de purificacin de las protenas, y la composicin proteica de las distintas fracciones, comprueba y verifica el proceso de la electroforesis y valora la importancia de este mtodo en el estudio de las macromolculas.

PRECAUCIN 1. SDS puede causar irritacin de la piel, ojos y tracto respiratorio. 2. Evitar dispersin del APS y mantener higiene estricta. 3. Evitar inhalacin o ingestin de TEMED 4. La acrilamida es cancergena, evitar inhalacin y contacto con la piel. 5. La bisacrilamida es txica e irritante. 6. El isopropanol y metanol son fcilmente inflamables. Puede irritar los ojos, evitar su inhalacin. 7. El cido actico puede provocar quemaduras e irritacin. Evitar el contacto directo con este cido.

FUNDAMENTO La electroforesis es la migracin de iones en un campo elctrico. Es una de las tcnicas analticas ms importantes dentro de la Bioqumica. Las molculas biolgicas (ADN, protenas, vitaminas, etc.) poseen cargas elctricas, y por tanto poseen esta propiedad de movilidad en un campo elctrico. La movilidad depender de la carga que presentan al pH que trabajemos. La electroforesis en gel es el mtodo ms conveniente para realizar separaciones de macromolculas (ADN y Protenas). El soporte de la electroforesis (el gel) es un entramado tridimensional que impide o reduce la difusin. Este gel ha de ser compatible con los tampones usados y debe permitir la entrada del lquido en los poros (reticulados hidratables). Los soportes pueden ser ms o menos restrictivos segn que el tamao de poros limite o impida el paso de las molculas. Los ms restrictivos, como los geles de acrilamida-bisacrilamida, oponen impedimento al paso de las molculas, participando as en el proceso de separacin. El gel en la electroforesis retarda, en mayor o menor medida, a las molculas mayores respecto a las de menor tamao. Las separaciones moleculares estn pues

20

basadas en el tamizado molecular junto a la movilidad electrofortica de las molculas que van a ser separadas. Para llevar a cabo la electroforesis se necesita: A) una fuente de Tensin que proporciona el campo elctrico, mediante dos electrodos, positivo (nodo) y negativo (ctodo), entre los que se establece la diferencia de potencial. B) una cubeta o recipiente, en cuyos extremos se sitan los electrodos. C) un soporte electrofortico. D) el tampn de electroforesis: durante la electroforesis se produce electrolisis del agua, generndose protones en la proximidad del nodo e iones hidroxilos en la proximidad del ctodo; el tampn evitar que el entorno andico se acidifique y el catdico se haga ms bsico a lo largo de la electroforesis.

El polmero utilizado para la formacin del gel es la acrilamida y la bisacrilamida, los cuales se polimerizan mediante la adicin de catalizadores (persulfato amnico, TEMED). En nuestro caso, la separacin de las protenas se ver condicionada slo por su tamao y no por su carga ya que previamente las protenas sern desnaturalizadas utilizando un detergente (SDS), el cual despliega a las protenas y se queda pegado a su superficie confirindole una gran carga negativa. Esa gran carga negativa enmascara la carga intrnseca de la protena, y las protenas una vez tratadas con SDS presentan todas las mismas cargas, y la separacin ser debida solamente a la masa molecular de la protena.

21

Los pasos a seguir en una electroforesis se pueden resumir en: 1. Separacin electrofortica mediante un campo elctrico 2. Fijacin de las protenas sobre el soporte 3. Revelado de las protenas para identificar su presencia y separacin. Se realiza mediante colorantes cidos, negro amido, rojo Ponceau que se fijan sobre las funciones bsicas de las protenas. El exceso de colorante se arrastra con mezclas actico-agua, o metanol-actico, segn el colorante utilizado con tal de que se decolore el soporte sin elucin del colorante fijado a las protenas. 4. Cuantificacin de las fracciones electroforticas mediante fotmetros especiales (densitmetros) que permiten cuantificar el colorante fijado a diferentes distancias del punto de aplicacin, y con ello la representacin grfica de la separacin (proteinograma: grfica que representa las fracciones proteicas del suero sanguneo).

MATERIALES Y REACTIVOS Cmara de electroforesis vertical y accesorios Micropipetas de 20, 200 y 1000ul Vaso de precipitado de 500 ml de capacidad Flotadores para microtbulos de 1,5 ml Lmina extensible de parafina Gradillas de plstico Pipetas y puntas descartables de polipropileno con capacidad para 20, 200, y 1000 ul Solucin de poliacrilamida al 30% (Anexo A) Buffer Tris-HCl 1.5 M pH= 8.8 (Anexo A)

22

Buffer Tris-HCl 0.5M pH = 6.8 (Anexo A) Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10% (AnexoA) Persulfato de amonio (APS) al 10% recien preparado (Anexo) tetrametiletilendiamina (TEMED) solucin stock Agua destilada Buffer de resolucin Tris-Glicina (Anexo) Butanol- (Anexo) cido actico glacial Isopropanol Azul de Coomassie Albmina srica bovina (66kd) Ovoalbmina (40kD) Lisozima (16 kD) Equipo para electroforesis de poliacrilamida (vertical):

Pipeteadoras automticas.

23

Pipetas: P2 de 1L

220 de 10L P20 de 10L P200 de 100L P1000 de 1000L

PROCEDIMIENTO 1 La separacin electrofortica se lleva a cabo segn el mtodo descrito por Laemmli en geles de poliacrilamida

Gel de separacin: poliacrilamida 16% - Acrilamida (30%) - Bis-acrilamida (1%) - Tampn de separacin 4X - H20 - TEMED - Persulfato amnico 50% 5.33 ml 1.32 ml 2.54 ml 0.81 ml 20 l 20 l

1.- Verter, cuidadosamente, la acrilamida entre los cristales. 2.- Cubrir, cuidadosamente con agua (utilizar una pipeta Pasteur) para delimitar el frente. 3.- Esperar a que el gel polimerice. (Puede prepararse la noche anterior y por el auxiliar de laboratorio). Gel concentrador: poliacrilamida 3% - Acrilamida (30%) - Bis-acrilamida (1%) - Tampn de empaque 2X - H20 - TEMED - Persulfato amnico 50%

1 ml 1 ml 5 ml 3 ml 10 l 20 l

1.- Retirar el agua. Verter, cuidadosamente, la acrilamida entre los cristales. 2.- Colocar los peines y esperar a que polimerice. (Prepara el auxiliar de laboratorio). 3.- Retirar los peines. (A partir de este paso ejecuta el alumno). El volumen final de los geles es aproximadamente 10 ml, para la preparacin de 2 cristales. El tampn de separacin se prepara 4X porque se diluye 4 veces en el volumen final de 10 ml. El tampn de empaque est preparado 2X, se diluye dos veces en el volumen final

24

PROCEDIMIENTO 2 1.- A 20 l de la Fraccin 3 se le aaden, en un eppendorf, 20 l de tampn de carga (MIXER): (Tris-HCI 0,125 M, pH 6,8; SDS 4%; glicerol 20%; 2mercaptoetanol 10%; Azul de bromofenol 0,008%). 2.- Calentar las muestras a 95C durante 3 min. Calentar tambin el estndar de protenas que incluye las siguientes protenas: Albmina srica bovina (66kd), Ovoalbmina (40kD) y Lisozima (16 kD). 3.- Cargar en pocillos 20 l de F3 y 10 l del estndar de protenas 4.- Correr la electroforesis en tampn Tris-HCl 0,025 M, pH 8,8, glicina 0,192 M y SDS 0,1%, a una intensidad de corriente constante de 30 mA hasta que el azul de bromofenol est aproximadamente, a 1 mm del extremo inferior del gel. 5.- Desmontar el gel y teirlo con metanol/actico/H20 (5/1/5) con azul de Coomassie (1 g/l). 6.- Desteir el gel en metanol/actico/H20 (10/10/80).

Colorantes La tincin con azul brillante de Coomasie permite detectar hasta 0.2 a 0.6 g de protena, y es cuantitativo (lineal) hasta 15 a 20 g. Se emplea habitualmente en soluciones de isopropanol-actico y se destie por difusin en soluciones de isopropanol-actico. Para la tincin de geles 2D se recomienda eliminar los amfolitos mediante inclusin de tricoloroactico (TCA) en el colorante y la destincin en cido actico. La receta para teir con Coomasie es: solucin de Azul de Coomasie : 0.2 g de azul Coomasie en 90 ml de metanol: agua 1:1 v:v y 10 ml de cido actico glacial. tincin : sumergir el gel en 5 vol. de colorante al menos 1 h con agitacin suave (el mximo se consigue en 3 h). destincin : habitualmente mediante cambios repetidos de 10% actico en 20% metanol:agua. Se puede conseguir muy rpidamente mediante electroforesis.

25

CUESTIONARIO 1.-Mencione el fundamento de la electroforesis 2.- Cul es la importancia y la trascendencia de la electroforesis? 3.- Calcule en las tiras de nitrocelulosa de acuerdo a su motilidad y las bandas los pesos moleculares de algunas protenas 4.- Por qu las proteinas y/o polipptidos tienen capacidad de migracin? 5.- Qu condiciones deben tener las proteinas para ser sometidos a la electroforesis? 6.- Cul es la funcin del detergente (SDS) 7.- Cul es el papel del pH? 1.- Cmo se calcula el peso molecular de las protenas? 2.- Tiene alguna importancia este anlisis? 3.- Todas las protenas tienen el mismo peso molecular? 4.- Es el nico mtodo de calcular el peso molecular?

FUENTE BIBLIOGRFICA - Sambrook J. Fritsch EF. Maniatis T. Gel eletrophoresis DNA and Molecular clonig. In: Molecular clonig a laboratory manual. 2a ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989. - Westermeier R. Electrophoresis in practice. 4a ed. New York: Westermeier R VHC Publishers inc; 2005.

26

PRCTICA N 04: FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIADAD DE LAS ENZIMAS COMPETENCIA El alumno reconoce el trabajo y la accin de las enzimas, experimenta y comprueba a travs de experiencias la velocidad de la reaccin enzimtica cuando se modifica factores del entorno, participa y asume con responsabilidad para optimizar el trabajo en equipo.

PRECAUCIONES 1.- Siempre carga la pipeta con la bombilla de pipetear, no lo hagas con la boca. 2.- Pipetee con las bombillas de pipetear los volmenes precisos en cada uno de los tubos. 3.- Al finalizar la experiencia lava los tubos.

FUNDAMENTO

Consideremos G, la llamada "energa libre de Helmholtz". En un proceso reversible, el trabajo bajo temperatura y volumen constante es igual al cambio de energa libre de Helmholtz, G. Y su frmula es:

Donde H es la energa interna del sistema, T es la temperatura absoluta y S es la entropa Es decir, la energa libre es igual a la energa interna del sistema menos la energa degradada. Es importante destacar que la variacin G puede ser mayor o menor segn el nivel que alcance la degradacin de la energa. Si esta ltima es considerable como ocurre, por ejemplo, cuando se aumenta la temperatura del sistema-, la energa libre disponible es relativamente menor. Y por qu es importante sto? Porque la energa libre puede ser utilizada de manera ms eficiente como veremos en un momento. Para que una transformacin de estado pueda ocurrir espontneamente, ya sea rpida o lentamente, la energa libre de Helmholtz del estado final debe ser menor que la del estado inicial; esto es, cuando la diferencia G entre el estado final y el estado inicial sea negativa. sta es una condicin que cumplen todas las reacciones que pueden ser catalizadas por enzimas. Sin embargo, esta es una condicin necesaria ms no suficiente para que determinada reaccin ocurra realmente al menos en un tiempo razonable-.

27

Se requiere, entonces, de una nueva condicin que, sumada a la variacin negativa de la energa libre G, determine que el equilibrio se alcance ms rpidamente. Pues acelerar una reaccin qumica equivale a hacerla alcanzar su equilibrio de una forma ms rpida. Esta nueva condicin es, en verdad, muy importante ya que sin enzimas la mayora de las reacciones que ocurren en el organismo vivo tienen una velocidad espontnea muy reducida. Por eso es que sin enzimas la vida sera imposible. Esta nueva condicin es aportada por la enzima de la manera siguiente: la accin enzimtica implica colocar al sistema al cual se incorpora en una condicin momentnea de alta neguentropa. Esto es. Que intensifica an ms el estado de desequilibrio, tornndolo por tanto mucho ms inestable. Bien sabemos, que existen factores responsables del poder cataltico de las enzimas y deviene en la formacin del complejo no covalente: ES Se basa en la interaccin no covalente (puentes de hidrgeno, fuerzas electrostticas, interacciones hidrofbicas, etc. presentes en esta unin.) entre tomos del sustrato(s) y aminocidos del centro activo, con el fin de bajar el nivel energtico del complejo ES. Eso se empieza a entrever en un ejemplo muy sencillo expuesto en las hojas,. En l se supone la formacin de un puente de hidrgeno entre la enzima y el sustrato, el cual, en el estado libre forman respectivos puentes con molculas de agua. El proceso est controlado por la ecuacin: Ms exactamente por el trmino

Esto es as porque la entropa del medio aumenta notablemente debido a la reduccin de la organizacin que debe presentar la caja de solvatacin, lo que determina irremediablemente un descenso en G, con lo que el proceso es espontaneo. Se observa como no hay una ganancia en el nmero de puentes de hidrgeno, lo que no quiere decir que la energa asociada a los dos primeros sea la misma que en los dos segundos, pero aunque haya una diferencia a favor de los primeros, (antes de la formacin del complejo), esta es sin duda mucho menor que la energa proveniente de la ganancia en entropa del medio. Para que se optimicen las reacciones biolgicas, y se facilite la velocidad de reaccin hasta alcanzar su punto de equilibrio, existe la especificidad de las enzimas que catalizan y que actan sobre los compuestos denominados sustratos Por ejemplo, en el sistema digestivo la digestin del almidn es catalizada por la enzima amilasa, la cual se encuentra en la saliva, como todas las enzimas, la amilasa presenta su mxima actividad dentro de cierta escala de pH y temperatura.

28

La amilasa que se utilice en estos experimentos la donaran los experimentadores, existiendo variaciones muy grandes en la actividad de la amilasa, en la saliva de varias personas. El efecto de la amilasa y el estudio de diferentes condiciones sobre la digestin del almidn se determinaran empleando la reaccin del yodo. El almidn no hidrolizado da un color azul, oscuro con el reactivo del yodo, pero a medida que se efecta la digestin, el color azul cada vez se toma ms plido, hasta que por ultimo el color que se obtiene es el del reactivo de yodo diluido en agua. MATERIAL Y REACTIVOS Solucin de almidn al 1 % Tintura de yodo o lugol Soluciones amortiguadoras: pH 9, pH 7, pH 5 Termostato Abundante saliva Bao mara Hielo 6 tubos de ensayo Gradillas Pinzas

PROCEDIMIENTO Experimento 1: Efecto De La Temperatura Sobre La Digestin Salival Del Almidn. 4.5 ml. De almidn al 1% (preparado en un medio amortiguador con pH de 6,.9 a 7.0) divdalos en tres tubos de ensayo limpios. Coloque un tubo en el bao a 70C, otro en el de 37C y el tercero en un bao con hielo. Deje los tubos en sus respectivos baos, agitando ocasionalmente su contenido con una varilla de vidrio o agitando los tubos hasta que tengan la misma temperatura que sus baos. Transfiera 0.5 ml. De saliva a un tubo que contenga 5 ml. De agua destilada. Mezcle bien y transfiera porciones de 1.5 ml. A tubos de ensayo limpios. Coloque un tubo en el bao a 70C, otro en el 37C y el tercero en el bao con hielo y djelos el tiempo necesario para que alcancen la temperatura del bao. Cuando esto ocurra vierta la solucin de saliva en la solucin de almidn a la misma temperatura, mezcle rpidamente el contenido y tome tres gotas para hacer la prueba de almidn con yodo. A intervalos aproximados de tres minutos tome muestras de tres gotas y haga la prueba del yodo. Despus se pueden alargar estos intervalos a 5min. Y continu el experimento hasta que dos soluciones de almidn ya no den azul con el reactivo de yodo..

29

Experimento 2: Efecto del pH en la Digestin salival del Almidn. Prepare muestras de saliva diluida como en el caso anterior. Obtenga separadamente en tres tubos porciones de 5 ml. De soluciones amortiguadoras, una de pH 5, otra de pH 7 y la tercera de pH 9. a cada solucin amortiguadora agregue 1ml. De saliva diluida, mezcle la solucin y coloque los tubos en un bao a 37C. Divida 15 ml. De almidn al 1% en tres tubos de ensayo limpios y enjuagados y colquelos en el bao a 37C cuando el contenido de todos los tubos este a 37C vierta separadamente los tubos conteniendo la saliva en cada uno de los tubos que contienen la solucin de almidn. Mezcle el contenido de cada tubo y comience a realizar la prueba del yodo para almidn como en el caso anterior hasta que una de las mezclas ya no de reaccin positiva. Anote sus resultados. CUESTIONARIO 1.- Que efectos produce las altas temperaturas sobre las enzimas? 2.-.Como podras interpretar el efecto de la temperatura en nuestro organismo? 3.- Qu otros factores suelen alterar la actividad enzimtica? 4.- De qu manera el cambio de pH modifica la eficiencia cataltica de los enzimas?

FUENTE BIBLIOGRFICA - Bender, Myron L, Brubacher J L, Catlisis y accin enzimtico. 1a ed. Editorial Revert SA; 1977. - Bermeyer H.V, Methods. Enzimatic Anlisis. New York: Editor Academic Press. Vol 1 section A General Intoduction; 1974. - Traut T. Allosteric regulatory enzymes. USA: Ed. Springer; 2008.

30

PRCTICA N 05: CARBOHIDRATOS COMPETENCIA El alumno identifica los carbohidratos, determina, explica e interpreta a travs de mtodos experimentales las propiedades los fundamentos en la comprobacin de carbohidratos, valora la importancia de estas sustancias orgnicas, que forman parte de nuestras estructuras, que nos proporciona la energa para nuestra subsistencia PRECAUCIONES 1.- Siempre carga la pipeta con la bombilla de pipetear, no lo hagas con la boca. 2.- Pipetee con las bombillas de pipetear los volmenes precisos en cada uno de los tubos. 3.- Debes tener mucho cuidado cuando utilices el HCL QP , o el Na(OH), si los tocaste lvate inmediatamente. El profesor har las mediciones respectivas 4.- Lava los tubos al finalizar la experiencia. Y elimina los deshechos de la clara de huevo al tacho de basura.

FUNDAMENTO Los hidratos de carbono, compuestos por carbono, hidrgeno y oxgeno, representan la principal fuente de energa celular y son tambin constituyentes estructurales importantes de las paredes celulares y de sustancias intercelulares. Los compuestos de carbono se clasifican de acuerdo con el nmero de monmeros que contienen En estos compuestos el carbono, hidrogeno y oxigeno se encuentran en proporcin de 2 a 1, los carbohidratos comprenden desde azucares simples con peso molecular bajo, como la glucosa y la fructosa, hasta molculas grandes de peso molecular alto, como el almidn y la celulosa. Una prueba general para el reconocimiento de carbohidratos es la de Molish, en ella el cido sulfrico con las pentosas y las hexosas en caliente dan furfural o 55-hidroximetil furfural. Estos furfurales con el naftol se condensan formando cromgenos, que con el cido sulfrico dan compuestos quinoides. Otras pruebas como la de Benedict da una estimulacin semicuantitativa de la cantidad del azcar reductor existente y la prueba de lugol indicara la presencia de almidn, glucgeno o de un monosacrido o disacrido.

31

MATERIALES Y REACTIVOS Solucin de glucosa al 1 % Solucin de almidn al 1 % Jugo de naranja Reactivo de Molish Reactivo de Benedict Seliwanoff cido clorhdrico concentrado Hidrxido de sodio al 10% Lugol 5 tubos de ensayo Gradillas Pinzas de madera PROCEDIMIENTO.Experimento 1: Reaccin de Molish En un tubo de ensayo se toman 2 ml. De la sustancia problema, se agrega 2 gotas del reactivo de Molish recin preparado y se mezcla bien. Se inclina el tubo y se aade cuidadosamente por las paredes aproximadamente 2 ml de cido sulfrico concentrado. La formacin de un anillo violeta en la interfase indicara resultado positivo. Experimento 2: Con la Solucin de Benedit En un tubo de ensayo se toman 0.5 ml. De la solucin de Benedict, luego se aade 1 ml de la solucin problema y e calienta a ebullicin durante dos min. Luego se deja enfriar. La formacin de un precipitado verde amarillo o rojo ladrillo indicara la presencia de un azcar reductor, segn se encuentre en mayor o menor cantidad. Experimento 3: Prueba de Reconociendo del Almidn. En un tubo limpio y seco se coloca 3 ml. De una solucin de almidn al 1%, se aade 5 gotas de cido clorhdrico concentrado. Se mezcla cuidadosamente y se lleva al calor hasta que hierva durante dos minutos anotar los resultados. Luego se toma una alcuota (3 gotas) y se mezcla con una gota de solucin de lugol. Anotar el resultado. Se vierte en un tubo 3 gotas de la muestra problema, se aade 4 ml. De agual destilada y dos gotas de solucin de lugol. Observar la coloracin azul violeta. Anotar.

32

El tubo de la muestra problema con cido clorhdrico se contina con la ebullicin durante dos minutos o ms repetir la prueba con la solucin de lugol. Observa una coloracin rojo parado. Anotar. Continuar la ebullicin por 2 o 3 minutos y repetir la prueba con solucin de lugol por 2 a 3 veces ms. Anotar. Al final la reaccin negativa (color del reactivo) debido a que el producto final de la hidrlisis del almidn es la glucosa. El hidrolizado se neutraliza con solucin de NaOH al 10% y se realiza la prueba de Benedict. Experimento 4: Reaccin de SELIWANOFF. Fundamento.-El HCl caliente del reactivo deshidrata a las ceto hexosas para forma hidroimetilfurfural ms rpido que las aldohexosas correspondientes Por reaccin del cido clorhdrico del reactivo y el calor se obtiene furfurales a partir de las cetosas, las cuales reaccionan con el resorcinol dando un compuesto coloreado.

Procedimiento En un tubo de prueba colocar 5ml de reactivo de Seliwanoff, agregar 1ml de muestra problema y llevar a ebullicin en bao.mara. La aparicin de un color anaranjado rojiza o salmn indicar la reaccin positiva (presencia de pentosas), las aldohexosas forman compuestos de color ligeramente rozados Graficar su experiencia.

CUESTIONARIO 1.- Cual es el producto final de la digestin del almidn por la amilasa salival? 2.- Como se demuestra que el almidn sufri la accin de la amilasa salival en la experiencia realizada 3.- Cual es el fundamento del reconocimiento de los azcares monosacridos en la reaccin con el benedict? 4.- Cul es el fundamento de la reaccin de los almidones con el lugol? 5.- Qu papel cumplen los amortiguadores en este proceso?

33

FUENTE BIBLIOGRFICA - Nelson D. L, Y Cox M M. Lehninger Principios de Bioqumica. 4a ed. NY: W. H. Freeman and Company; 2005. - ELITECH. Diagnostics. Instrucciones de uso del reactivo Glucosa PAP, versin 12/ 2002

34

PRACTICA N 06: RUTAS METABLICAS COMPETENCIA El alumno reconoce y explica la degradacin de la glucosa, experimenta, comprueba e interpreta, las reacciones que se llevan a cabo experimentalmente en este proceso, comprende y valora la importancia de este proceso en la obtencin de la energa para mantener la homeostasis del ser vivo.

PRECAUCIONES 1.- Siempre carga la pipeta con la bombilla de pipetear, no lo hagas con la boca. 2.- Pipetee con las bombillas de pipetear los volmenes precisos en cada uno de los tubos. 3.- Debes tener mucho cuidado cuando utilices el NaF, o la glucosa 4.- Lava los tubos al finalizar la experiencia. Y elimina los deshechos de la clara de huevo al tacho de basura.

FUNDAMENTO La degradacin de la glucosa es realizada por el proceso de la gluclisis en el citoplasma por la accin del ADP obteniendo cido pirvico. De acuerdo a las circunstancias puede realizarse dos procesos: 1.- Sin oxgeno obtenemos el proceso de fermentacin con la obtencin de etanol o cido lctico 2.- Con oxgeno pasando al ciclo de Krebs obteniendo diferentes sustancias, la cual se realiza en las mitocondrias

35

La Gluclisis Comienza con una molcula de glucosa. En este proceso, primero se invierte energa por transferencia de un grupo fosfato desde una molcula de ATP, una por cada paso, a la molcula de azcar. La molcula de seis carbonos luego se escinde y, de all en adelante, la secuencia produce energa. En cierto momento se reduce una molcula de NAD+ a NADH e H+ almacenndose parte de la energa producida por la oxidacin del gliceraldehdo fosfato. En los pasos finales las molculas de ADP toman energa del sistema, fosforilndose a ATP
Glucosa + 2ATP + 4ADP + 2Pi + 2NAD 2 cido pirvico+ 2ADP +4ATP+ 2NADH + 2H + 2H2O

De esta forma, una molcula de glucosa se convierte en dos molculas de cido pirvico. La ganancia neta, la energa recuperada, es dos molculas de ATP y dos molculas de NADH por molculas de glucosa. Las dos molculas de cido pirvico contienen todava una gran parte de la energa que se encontraba almacenada en las molculas de glucosa original. La serie de reacciones que constituyen la guclisis se lleva a cabo virtualmente en todas ls clulas vivas, desde las clulas procariticas hasta las clulas eucariticas de nuestros propios cuerpos. Las Vas Aerbicas Respiracin En el curso de la respiracin, las molculas de tres carbonos de cido pirvico producido por la gluclisis son degradadas a grupos acetilo de dos carbonos, que luego e3ntran al ciclo de Krebs. En una serie de reacciones en el ciclo de FKrebs, el grupo actico de dos carbonos es oxidado completamente a dixido de carbono. En el curso de la oxidacin de cada grupo acetilo se reduce cuatro aceptores de electrones (tres NAD+ y un FAD) y se forma otra molcula de ATP. El Ciclo de Krebs En el ciclo de Krebs. Los carbonos donados por el grupo acetilo se oxidan a dixido de carbono y los electrones pasan a los transportadores de electrones. Lo mismo que en la gluclisis, en cada paso interviene una enzima especfica. La coenzima A es el nexo entre la oxidacin del cido pirvico y el ciclo de krebs. En el ciclo de Krebs se producen molculas de ATP, tres molculas de NADH y una molcula de FADH2 que representan la produccin de energa de este ciclo. Se necesitan dos vueltas del ciclo para completar la oxidacin de una molcula de glucosa. As, el rendimiento energtico total del ciclo de Krebs para una molcula de glucosa es dos molculas de ATP, seis molculas de

36

NADH y dos molculas de FADH. La etapa final de la respiracin es el transporte terminal de electrones, que involucra a una cadena de transportadores de electrones y enzimas embutidas en la membrana interna de la mitocondria. A lo largo de esta serie de transportadores de electrones, los electrones de alta energa transportados por el NADH de la gluclisis y por el NADH y el FADH2 del ciclo de Krebs van cuesta abajo hasta el oxgeno. En tres puntos de su pasaje a lo largo de toda la cadena de transporte de electrones, se desprenden grandes cantidades de energa libre que impulsan el bombeo de protones (ion H+) hacia el exterior de la matriz mitocondrial. Esto crea un gradiente electroqumico a travs de la membrana interna de la mitocondria. Cuando los protones pasan a travs del complejo de ATP sintetasa, a medida que vuelven a fluir a favor del gradiente electroqumico al interior de la matriz, la energa liberada se utiliza para formar molculas de ATP a partir de ADP y fosfato inorgnico. Este mecanismo, en virtud del cual se lleva a cabo la fosforilacin oxidativa, se conoce como acoplamiento quimiosmtico. En esta representacin de la cadena respiratoria, las molculas que se indican: flavina mononucletido (FMN), coenzima Q (CoQ) y los citocromos b, c, a y a3, son los principales transportadores de electrones de la cadena. Al menos otras nueve molculas transportadores funcionan como intermediaditas adems de las que se muestran aqu. Los electrones transportados por la NADH entran en la cadena cuando son transferidos a la FMN, que entonces se reduce (azul). Casi instantneamente, el FMN cede los electrones al CoQ. El FMN vuelve as a su forma oxidada, listo para recibir otro par de electrones y la CoQ se reduce. CoQ entonces pasa los electrones al siguiente aceptor, y vuelve a su forma oxidada..El proceso se repite en forma descendente. Los electrones, al pasar por la cadena respiratoria, van saltando a niveles energticos sucesivamente interiores. Los electrones que son transportados por el FADH2 se encuentran en un nivel energtico ligeramente inferior que los del NADH. En consecuencia, entran en la cadena de transportes ms bajo, a la altura de la CoQ. Los electrones finalmente son aceptados por el oxgeno, que se combina con protones (iones hidrgeno) en solucin y forman agua. Sin este reciclado, la gluclisis no puede seguir adelante. La acumulacin de cido lctico da como resultado dolor y fatiga muscular Otras vas Catablicas y Anablicas Las vas anaerobias: En ausencia de oxgeno, el cido pirvico puede seguir una de varias vas llamadas anaerbicas. Veremos brevemente dos de las vas anaerbicas ms interesantes. El cido pirvico puede convertirse en etanol (alcohol etlico) o en uno de los varios cidos orgnicos diferentes, de los cuales el cido lctico es el ms comn

37

En el primer paso de la gluclisis se desprende dixido de carbono. En el segundo, se oxida el NADH y se reduce el acetaldehdo. La mayor parte de la energa qumica de la glucosa permanece en el alcohol, que es el producto final + de la secuencia. Sin embargo, regenerando NAD , estos pasos permiten que la gluclisis contine, con su pequeo, pero en algunos casos virtualmente necesarios, rendimiento de ATP.

Pasos por los cuales el cido pirvico, formado en la gluclisis, se convierte anaerbicamente en etanol El cido lctico se forma a partir del cido pirvico, por accin de una variedad de microorganismos y tambin por algunas clulas animales cuando el O2 es escaso o esta ausente

Reaccin enzimtica que produce cido lctico anaerbicamente a partir del cido pirvico en las clulas musculares En el curso de esta reaccin, el NADH se oxida y el cido pirvico se reduce, + Las molculas de NAD producidas en esta reaccin se reciclan en la secuencia glucoltica La mayora de los organismos se alimentan directamente de la glucosa, otros alimentos son degradados y convertidos a molculas que pueden entrar en esta va central. Dado que muchas de estas sustancias, como las protenas y los lpidos pueden degradarse y entrar en la va central, se puede suponer que es posible el proceso inverso, o sea, que los distintos intermediarios de la gluclisis y del ciclo de Krebs pueden servir como precursores para la biosntesis. Y as es. Sin embargo, las vias biosintticas, aunque son semejantes a las catablicas, se diferencian de ellas. Hay enzimas diferentes

38

que controlan los pasos y hay varios pasos crticos del anabolismo que difieren de los procesos catablicos. Para que ocurran las reacciones de las vas catablica y anablica debe haber un suministro constante de molculas orgnicas que puedan ser degradadas para producir energa y deben estar presentes molculas que sern los ladrillos de construccin. Sin el suministro de estas molculas, las vas metablicas dejan de funcionar y la vida del organismo finaliza. Las clulas hetertrofas Incluyendo a las clulas hetertrofas de los vegetales, tales como las clulas de las races) dependen de fuentes externas, especficamente de clulas auttrofas, para obtener las molculas orgnicas que son esenciales para la vida. Las clulas auttrofas, por el contrario son capaces de sintetizar monosacridos a partir de molculas inorgnicas simples y de una fuente externa de energa. Luego estos monosacridos se utilizan son slo para suministrar energa, sino tambin como sillares de construccin para la variedad de molculas orgnicas que se sintetizan en las vas anablicas. Las clulas auttrofas ms importantes, sin lugar a dudas, son las clulas fotosintticas de las algas y las plantas que capturan la energa de la luz solar y la utilizan para sintetizar las molculas de monosacridos de las cuales depende la vida en este planeta. MATERIALES Y REACTIVOS
Muestra - Azcar o uvas borgoa / italia - Hgado de res - Fresas - Vela - Aceite comn - Matraz

- Tapn de jebe vi horadado - Vasos de precipitado de 150 250 ml - pH metro - Bureta - Varilla - Matraz aforado de 50 ml - Pipeta graduada de 5,0 ml - Pipeta graduada de 1,0 ml - Tubos de ensayo - Gradilla - Termmetro - Agua destilada - Hidrxido de sodio - Levadura - Azul de metileno - Buffer Fosfato - Enzima

39

PROCEDIMIENTO Experimento 1.1.- Realizar un macerado de hgado con la ayuda del mortero, con una adecuada cantidad de agua destilada 2.- Separar el extracto 3.- Sobre el extracto se coloca 10 ml. De buffer de fosfato y 5 ml. de cloruro de sodio al 10 % 4.- Se coloca 6 ml. de extracto en tubos de ensayo 5.- Se aada 2 ml. de una solucin de azul de metileno. Mantenga un tubo a 37 C y otro a temperatura ambiente. 6.- Luego observe el cambio de color del indicador y vuelva a incubar. Repetir dos veces. Repetir el experimento dando condiciones de anaerobiosis parcial con el aceite y anaerobiosis total con la vela

Experimento 2.1.- Armar los instrumentos como el diseo

2.- Aplicar en cada envase un caldo de cultivo conformado por:

- Azcar 200 gr. - Agua 500 ml - Levadura 50 gr. 3.- Controlar los parmetros de pH, temperatura, Acidez 4.- por espacio de 6 das

40

Da/fecha

Hora de Monitoreo Hora: 24 24 12 12 12 12 12 12 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8

pH

cidez

T C

% Azcar

Apariencia del caldo

Observaciones

Inicial:

CUESTIONARIO 1.- Describir lo encontrado en la experiencia realizada 2.- Por qu el cido pirvico se convierte en cido lctico slo para volver a convertirse en cido pirvico? 3.- Cmo extraer energa de las grasas o de las protenas? 4.- Escriba la reaccin de la fermentacin del cido lctico. Y diga dos ejemplos de clulas que la realizan 5.- Escriba la reaccin de la fermentacin alcohlica y diga dos ejemplos de clulas que la realizan 6.- En qu lugar u organela de las clulas procariticas y eucariticas se da la fermentacin (Oxidacin anaerbica del NADH) y la respiracin celular (Oxidacin aerobia) y bajo que condiciones se da una. FUENTE BIBLIOGRAFA - Bernal DE Ramrez, L. Anlisis de alimentos, Santaf de Bogota D.C. Academia colombiana de ciencias exactas. Fsica y Naturales: Coleccin Julio Carrizosa Valenzuela N 2. 1993. - Chan Raymond. Qumica. 4a ed Mxico: Mc Graw Hill/Interamerina; 2007.

41

PRCTICAS N 07: DETERMINACIN DE GLUCOGENO EN LOS TEJIDOS ANIMALES:PARTE I COMPETENCIA El alumno reconoce las transformaciones de materia y energa que tienen lugar en los animales cuya molcula ya estructurada es la glucosa, y que se acumula en el hgado y msculos bajo la forma de glucgeno, comprueba experimentalmente su presencia en el ratn ejecutando maniobras experimentales para este fin. Valora y evala razonadamente teoras y hechos como parte de la asignatura, entiende que el fenmeno de la vida se explica desde un punto vista molecular PRECAUCIONES 1.- Debes tener mucho cuidado al momento de realizar la diseccin y extraer los rganos del ratn. 2.- Al momento de pipetear los reactivos hazlo con precaucin. 3.- Para centrifugar escogers los tubos en parejas y que tengan el mismo volumen de lquido, podrs aadir agua destilada para buscar nivelar los lquidos, luego introduce en la centrfuga en posicin diametralmente opuesta y procede a encender la centrfuga por un tiempo prudencial.

FUNDAMENTO En un animal bien alimentado los carbohidratos se oxidan para suministrar energa y el exceso se almacena como glucgeno en el msculo y en el hgado. El glucgeno heptico es totalmente consumido en 24-48 horas y durante ayuno prolongado se sintetiza glucosa 6-fosfato a partir de compuestos diferentes a los hidratos de carbono mediante el proceso que se conoce como gluconeognesis. El ayuno, produce cambios importantes en el estado metablico del animal. En el siguiente experimento se determinara el glucgeno en tejidos en dos grupos de ratas del mismo sexo, edad y peso, un grupo que ha recibido alimento y el otro sin alimento durante tres das. El glucgeno es liberado de os tejidos al calentarlos en lcali fuerte y se precipita luego aadiendo etanol. Se agrega adems sulfato de sodio como un

42

coprecipitante para obtener una recuperacin cuantitativa de glucgeno. El polisacrido es hidrolizado luego en cido y se calcula la glucosa liberada.

MATERIAL Un ratn albino Instrumentales de diseccin Una tabla de diseccin (teknoport 10 cm por 10cm) 1 balanza Bao de agua Hielo KOH (300 g/l) Solucin de sulfato de sodio al 15% Alcohol absoluto al 96% Cloroformo Matraz de 10ml 6 Tubos de ensayo Gradilla Vasos de precipitado de litro y de 500ml

PROCEDIMIENTO Es importante que los experimentos se realicen rpidamente despus de la muerte del animal y se sugiere que uno o dos miembros del grupo preparen los tejidos, mientras que los otros alistan los tubos de ensayo para las determinaciones. Experimento 1: Aislamiento de glucgeno. En una cmara con cloroformo duerma al ratn y proceda a extraer rpidamente el hgado, el msculo y el corazn. Pselos y colquelos en tubos de centrifuga que contengan dos ml. de KOH (300 g/l), caliente en un bao de agua hirviendo durante 20 minutos. Agitando de vez en cuando. Enfri los tubos en hielo, agregue 0.2 ml. de sulfato de sodio al 15% y mezcle fuertemente. Precipit el glicgeno aadiendo 5 ml. de etanol (95% v/v), deje en hielo durante 5 minutos y remueva el precipitado por centrifugacin. Descarte el sobrenadante y disuelva el glicgeno precipitado en aproximadamente 5 ml. De agua calentando suavemente, diluya luego hasta completar la marca de 10 ml. Con agua destilada y mezcle vigorosamente. En el caso de animales alimentados, transfiera la muestra de hgado cuantitativamente a un matraz volumtrico de 10 ml. Y complete hasta la marca con agua.

43

CUESTIONARIO 1.- Qu es el glucgeno y donde se acumula en el organismo? 2.- Qu diferencia existen entre el glucgeno y el almidn que son polisacridos? 3.- Que relacin existe entre hiperglicemia y la diabetes? 4.- El glucgeno se almacena en todas las clulas de nuestro organismo? Fundamenta tu respuesta

FUENTE BIBLIOGRFICA - Nelson D L, Y Cox M M. Lehninger Principles of Biochemistry. 4a ed. NY: W. H. Freeman and Company; 2005. - Senior B, Loridan L. Functional differentiation of glycogenoses of the liver with respect to the use of glycerol. New Eng. J. Med; 1968. - Folk C, Rarback S. Dietary management of glycogen storage disease type I. Top Clin Nutr; 1988.

44

PRCTICAS N 08:
DETERMINACIN DE GLUCOGENO EN LOS TEJIDOS ANIMALES:PARTE II

COMPETENCIA El alumno reconoce las transformaciones de materia y energa que tienen lugar en los animales cuya molcula ya estructurada es la glucosa, y que se acumula en el hgado y msculos bajo la forma de glucgeno, comprueba experimentalmente su presencia en el ratn ejecutando maniobras experimentales para este fin. Valora y evala razonadamente teoras y hechos como parte de la asignatura, entiende que el fenmeno de la vida se explica desde un punto vista molecular

PRECAUCIONES 1.- Al momento de pipetear los reactivos hazlo con precaucin. 2.- Al momento de retirar los tubos del bao mara, hazlo con las pinzas porque comprenders que los tubos estn muy calientes.

FUNDAMENTO En un animal bien alimentado los carbohidratos se oxidan para suministrar energa y el exceso se almacena como glucgeno en el msculo y en el hgado. El glucgeno heptico es totalmente consumido en 24-48 horas y durante ayuno prolongado se sintetiza glucosa 6-fosfato a partir de compuestos diferentes a los hidratos de carbono mediante el proceso que se conoce como gluconeognesis. El ayuno, produce cambios importantes en el estado metablico del animal. En el siguiente experimento se determinara el glucgeno en tejidos en dos grupos de ratas del mismo sexo, edad y peso, un grupo que ha recibido alimento y el otro sin alimento durante tres das. El glucgeno es liberado de os tejidos al calentarlos en lcali fuerte y se precipita luego aadiendo etanol. Se agrega adems sulfato de sodio como un coprecipitante para obtener una recuperacin cuantitativa de glucgeno. El polisacrido es hidrolizado luego en cido y se calcula la glucosa liberada. MATERIAL 1 balanza 45

cido clorhdrico 1.2 molar Rojo fenol NaOH (0.5 mol/l) Matraz de 10ml 6 Tubos de ensayo Gradilla Vasos de precipitado de litro y de 500ml

PROCEDIMIENTO Experimento 2: Hidrlisis y determinacin de glucgeno. En tubos de ensayo pipetee por duplicado 1 ml. de las muestras que contienen la solucin de glucgeno. Agregue 1 ml. de HCl (1.2 mol/l), tape los tubos y caliente en un bao de agua hirviendo durante 2 horas agregue luego una gota de indicador rojo fenol y neutralice cuidadosamente con NaOH (0.5 mol/l) hasta que cambie el indicador de rosa a anaranjado y luego amarillo. Diluya hasta 5 ml. con agua destilada y determine el contenido de glucosa. Calcule los gramos de glicgeno presentes por 100 g. de tejido y recuerde que la glucosa existe en forma de glucsido (C6H12O5) en glicgeno y que su peso molecular es 162 y no 180.

CUESTIONARIO 1.- Qu rgano del ratn acumul ms glucgeno? 2.- Existe diferencia entre la cantidad de glucgeno de los rganos del ratn que comi del que estuvo a dieta? Fundamente sus respuestas.

FUENTE BIBLIOGRFICA - Nelson D.L Y Cox M M. Lehninger Principles of Biochemistry.. 4a ed. NY: W. H. Freeman and Company; 2005. - Senior B, Loridan L. Functional differentiation of glycogenoses of the liver with respect to the use of glycerol. New Eng. J. Med; 1968. - Folk C, Rarback S. Dietary management of glycogen storage disease type I. Top Clin Nut; 1988.

46

PRCTICA N 09: LIPIDOS COMPETENCIA El alumno identifica y reconoce segn sus caractersticas los lpidos, que se encuentra en todos los seres vivos, ejecuta experiencias y comprueba segn sus caractersticas utilizando lpidos y reactivos destinados para este propsito, evala y valora la importancia de estas biomolculas que forman parte de nuestras estructuras. PRECAUCIN 1.- Siempre carga la pipeta con la bombilla de pipetear, no lo hagas con la boca. 2.- Pipetee con las bombillas de pipetear los volmenes precisos en cada uno de los tubos. 3.- Debes tener mucho cuidado cuando utilices cloroformo, la bencina, o el ter procura que no estn cerca al fuego. 4.- Lava los tubos al finalizar la experiencia con detergente. Y elimina los deshechos de la mantequilla, las grasa o aceites.

FUNDAMENTO Los lpidos ms abundantes son los que posen cidos grasos, es decir, los lpidos saponificables. De ellos los triglicridos (grasas y aceites) son los ms caractersticos. En los triglicridos una molcula de glicerina se encuentra esterificada por tres molculas de cidos grasos. La reaccin de formacin ser la siguiente Los lpidos agrupan a un gran nuecero de compuestos biolgicos qumicamente muy heterogneos caracterizados por la presencia en su estructura de compuestos parafnicos, insolubles en agua. La preponderancia de estos compuestos o de sus grupos polares en los lpidos hace que tengan caractersticas de solubilidad diferentes y esa propiedad se usa en su extraccin y purificacin a partir de materiales biolgicos. La mayora de los lpidos son solubles en etanol al 95% V/V, pero forman una emulsin de gotas pequeas cuando se les agrega agua. Esto da a la suspensin una apariencia lechosa caractersticas y constituye u a prueba muy sensible para grasas. Las grasas almacenadas pueden enranciarse debido a al oxidacin de los dobles enlaces para formar perxidos y a su hidrlisis por microorganismos

47

con liberacin de cidos grasos. La cantidad de cidos grasos da, por lo tanto, un ndice de la frescura y la calidad de la grasa.

MATERIALES Aceites de varias marcas, Mantequilla Manteca de cerdo cido grasos: butrico, esterico, oleico Un huevo de gallina Solventes orgnicos: Acetona, Cloroformo, ter, bencina, alcohol etc. cido sulfrico concentrado Sudn III Fenoltalena Tintura de yodo Solucin de hidrxido de potasio 0.1 molar 5 tubos de ensayo 3 matraces de Erlenmeyers Gradillas, Pinzas de madera 2 Pipetas de 5ml

PROCEDIMEINTO Experimento 1: Solubilidad de lpidos. Examine la solubilidad de los lpidos (mantequilla, aceite de oliva, manteca de cerdo, etc) y cidos grasos (butirico, esterico y oleico) en agua y en solventes orgnicos (acetona, cloroformo, etanol), 0.5 ml. De la muestra problema colocarla en un tubo limpio y seco, aadir 1 ml. De solvente orgnico, agitar y observar. Experimento 2: Prueba de Salkowski. En un tubo de ensayo se introducen 2 mg. De muestra en 1 ml. De cloroformo, luego se aade 1 ml. De cido sulfrico concentrado. Una coloracin rojo azulada al prpura indicara la presencia de esteroides, el colesterol dar un color rojo. Experimento 3: Instauracin de lpidos Coloca 20 ml. de dos tres tipos de aceite en matraces Erlenmeyers pequeos y etiqueta los matraces. Agrega cinco gotas de tintura de yodo a cada aceite y agita para que se mezcle bien. Observa el color de cada solucin. Calienta los

48

matraces en una parrilla de calentamiento, a baja temperatura. Observa cul aceite recupera primero su color original. Este aceite es ms insaturado que el otro. Ahora lee la etiqueta de cada uno de los frascos de aceite y determina si los resultados de tu prueba estn de acuerdo con el contenido de grasas insaturadas que se indica en la etiqueta de cada aceite. Experimento 4: Determinacin del valor de Acidez de una Grasa. Pese cuidadosamente 10gr. De las sustancia problema y suspenda la grasa despus de derretirla en 50 ml. De un solvente de grasa. Agregue 1 ml. De solucin de fenoltalena, mezcle cuidadosamente y titule con hidrxido de potasio 0.1 mol/l hasta que el color rosado plido permanezca por mas de 20 30 seg. Anote el nmero de milmetros de lcali que se necesita y calcule el valor de acidez de grasa. Nota: 0.1 mol/l KOH contiene 5.6 gr/l o 5.6 mg/ml. El valor de acidez es el nmero de miligramos de KOH requerido para neutralizar los cidos grasos libres presentes en 1 gr. De grasa. Experimento 5: Aislamiento de lecitina a partir de yema de huevo. En un vaso de precipitacin de 100 ml. colocar un cuarto de yema y aadir 5 ml de etanol, calentar y mezclar con una varilla de vidrio. Enfriar y filtrar en un tubo de ensayo seco. Anotar los resultados.

CUESTIONARIO 1.- De qu maneras se reconocen a los lpidos? 2.- Tiene alguna relevancia la presencia de los lpidos en nuestro organismo? 3.- En que parte de nuestro organismo esta la reserva de lpidos? 4- Para qu se utiliza el Sudn III? Fundamente su respuesta 5.- A qu tipo de lpidos se les denomina insaturados? 6.- A qu se les denomina cidos grasos esenciales?

FUENTE BIBLIOGRFICA - Lehninger, Albert L. Bioqumica: las bases moleculares de la estructura y funcin celular. 4a ed Barcelona: Ed. Omega; 2005. - Nelson D.L Y Cox M M. Lehninger Principies of Bioqumica. 4a ed. NY: W. H. Freeman and Company; 2005.

49

PRACTICA N 10: DETERMINACIN DEL COLESTEROL COMPETENCIA El alumno reconoce la estructura del colesterol, determina experimentalmente en suero los valores de colesterol total, HDL-Colesterol y triglicridos, para lo que se utilizarn kits comerciales, valora la importancia del conocimiento de la determinacin del colesterol PRECAUCIONES 1.- Ten mucho cuidado al momento de lavar el material biolgico, retira bien los restos que se encuentran adheridos al material 2.- Adiciona las soluciones con mucho cuidado, tal y como dice su gua de prcticas as como las indicaciones del profesor, de esto depende el xito de la prctica 3.- Realiza tus observaciones desde el momento que vas adicionando los reactivos as observar el proceso de separacin del material.

FUNDAMENTO La cuantificacin de colesterol en suero es un procedimiento analtico bsico en el diagnstico y seguimiento de enfermedades metablicas, primarias o secundarias. Altos niveles de colesterol se asocian a riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares. En esta prctica se realizar la determinacin en suero de colesterol total, y colesterol-HDL. Abreviaturas: 4-AP: 4-amino fenazona, CHE: colesterol estearasa, CHOD: colesterol oxidasa, GK: Glicerol Kinasa, GPOD: Glicerolfosfato oxidasa, HDL: lipoprotenas de alta densidad, LDL: lipoprotenas de baja densidad, POD: peroxidasa, VLDL: liproprotenas de muy baja densidad El perfil lipdico lo constituye la cuantificacin analtica de una serie de lpidos que son transportados en la sangre por los diferentes tipos de lipoprotenas plasmticas. La determinacin de estos parmetros es un procedimiento analtico bsico para el diagnstico y seguimiento de enfermedades metablicas, primarias o secundarias. Entre estos parmetros analticos que se pueden determinar estn: el colesterol total, el colesterol transportado por las LDL, el colesterol transportado por las HDL, los triglicridos totales, ciertas apoprotenas particulares etc.

50

Altos niveles de colesterol se asocian a riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares, en especial aquel unido a las LDL (colesterol malo). El colesterol de las HDL (colesterol bueno), puesto que representa aquella fraccin de colesterol que se transporta al hgado para su metabolizacin y excrecin por va biliar, no se asocia con riesgo de enfermedad. 1.1. Determinacin de colesterol total Para la determinacin de colesterol total se utilizan reactivos comerciales que incluyen las enzimas y sustratos necesarios para la cuantificacin de todas las formas de colesterol presentes en el suero (Kit comercial de LinearChemicals). Las reacciones que tienen lugar son: CHE Esteres de colesterol + H2O CHOD Colesterol + O2 + H2O POD H2O2 + Fenol + 4-AP Quinona + H2O 1. Una colesterol estearasa (CHE) hidroliza los steres de colesterol a colesterol mas cidos grasos libre. 2. A continuacin una colesterol oxidasa (CHOD) oxida todo el colesterol a colestenona y perxido de hidrgeno. 3. El perxido de hidrgeno es sustrato de una peroxidasa (POD) que junto con 4-amino fenazona (4-AP) da lugar a la formacin de una quinona roja. La quinona formada es proporcional a la concentracin de colesterol en la muestra. 1.2. Determinacin de HDL-colesterol Para la determinacin del colesterol presente en las principales lipoprotenas que lo contienen como HDL (lipoprotenas de alta densidad) y LDL (lipoprotenas de baja densidad), es necesario: Primero, la separacin selectiva de la lipoprotena correspondiente con agentes precipitantes. Segundo, la cuantificacin del colesterol presente en dicha lipoprotena como se indic anteriormente. Entre estos reactivos precipitantes estn el cido fosfotungstico y magnesio que precipitan a las LDL y VLDL (lipoprotenas de muy baja densidad) mientras que las HDL permanecen en solucin. MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de ensayo Pipetas automticas Espectrofotmetro Suero Estndar de colesterol (200 mg/dl) 51 Colestenona + H2O2 Colesterol + Ac. Grasos

Reactivo de trabajo para el colesterol Reactivo precipitante ANEXO: SOLUCIONES: Estndar de colesterol: 200 mg/dl Reactivo de trabajo de colesterol que se prepara segn las indicaciones del fabricante y que contiene: 300 U/l de colesterol estearasa, 300 U/l de colesterol oxidasa, 1250 U/l de peroxidasa, 0,4 mmol/l de 4-AP, 26 mmol/l de fenol en tampn pipes 90 mM, pH 6,9 Reactivo precipitante: 14 mmol/l ac. fosfotungstico y 2 mmol/l MgCl Estndar de triglicridos: 200 mg/dl Reactivo de trabajo de triglicridos que se prepara segn las indicaciones del fabricante y que contiene: 150000 U/l de lipasa, 500 U/l de GK, 2500 U/l de GPO, 440 U/l de peroxidasa, 0,1 mmol/l de 4-AP, 0,126 mmol/l de fenol en t mmol/l de ATP, 2 mmol/l de p-clorofenol en tampn 50 mM pH 7,5. MATERIAL BIOLGICO Suero, estable 6 das a 2-8C.
2

PROCEDIMIENTO 1.1. Determinacin de colesterol total Disponer de tubos de ensayo rotulados como blanco, estandar y muestra. La muestra se refiere al suero a valorar y se colocan tantos tubos muestras como sueros se quieran valorar. Pipetear los componentes indicados en la Tabla I, aadiendo en ltimo lugar el reactivo de trabajo de colesterol. Tabla I. Protocolo para la cuantificacin de colesterol total Blanco de Estandar 10 l Muestra

Estndar colesterol Suero 10 l React. de trabajo 2 ml 1 ml 1 ml Mezclar e Incubar 5 min a 37C ( 10 min a temperatura ambiente). Leer la absorbancia a 505 nm. Calcula la concentracin de colesterol total de cada una de las muestras de suero del siguiente modo: 52

Amuestra mg/dl =

Ablanco x Conc. estandard (200)

Aestandard - Ablanco 1.2. Determinacin de HDL-colesterol 1. Mezclar 1 ml del suero con 0,1 ml del reactivo precipitante. Incubar 10 min a temperatura ambiente y centrifugar durante 20 min a 4000 rpm ( 2 min a 12000 rpm). 2. La determinacin de HDL-colesterol se realiza con 40 l del sobrenadante como se indica en la Tabla II y utilizando el reactivo indicado en la determinacin de colesterol total 3. Pipetear los componentes indicados en la Tabla II, aadiendo en ltimo lugar el reactivo de trabajo de colesterol. Tabla II. para la cuantificacin de colesterol de las HDL Blanco 40 l 2 ml Estandar 20 l 20 l 2 ml Muestra 40 l 2 ml

Estndar Sobrenadante H2O React. de trabajo

Mezclar e Incubar 5 min a 37C ( 10 min a temperatura ambiente). Leer la absorbancia a 505 nm. CALCULA LA CONCENTRACIN DE COLESTEROL DE LAS HDL DEL SIGUIENTE MODO: Abs. Muestra x 320 = mg/dl HDL-colesterol (505 nm) 1.1. Colesterol total Hasta 30 aos: 120-215 mg/dl 30- 39 aos: 135-240 mg/dl 40-49 aos: 140-280 mg/dl 50- 59 aos: 145-295 mg/dl 1.2. Colesterol-HDL Hombre > 55 mg/dl Mujer > 65 mg/dl

-Adems de la cuantificacin de estos tres parmetros en la prctica el alumno deber presentar un esquema de:

53

1. Las principales lipoprotenas. 2. Principales dislipidemias (tipos, causas, parmetros bioqumicas y riesgos). 3. Qu otras determinaciones analticas se pueden realizar para valoracin de las dislipidemias.

CUESTIONARIO 1.- Qu es el colesterol y cules son sus funciones? 2.- Cul es la importancia clnica de la determinacin de colesterol? 3.- A qu se refiere cuando se habla del colesterol bueno y el colesterol malo? Explica. 4.- Por que es recomendable consumir mejor grasas de origen vegetal a la animal? Explica: 5.- Qu es la arteriosclerosis? Quin tiene riesgos de padecerla? Por qu? 6.- Qu otros estudios deben realizarse adems del colesterol para determinar el riesgo de enfermedades cerebro-vasculares y cmo calculamos el ndice aterognico? FUENTE BIBLIOGRAFICA - Docon Navaza C, Garca-Saavedra M J, Vicente Garca J C. Fundamentos y Tcnicas de Anlisis Bioqumico: Anlisis de Muestras Biolgicas. Madrid: Editorial Paraninfo; 1999. - Gonzlez DE Buitrago J M, Arilla Ferreiro E, Rodrguez-Sedade M, Snchez Pozo A. Bioqumica Clnica. Madrid: Editorial McGraw-Hill.-Interamericana; 1998.

54

PRACTICA N 11: EXTRACCION DE DNA COMPETENCIA. El alumno reconoce la estructura del ADN, realiza y ejecuta las maniobras experimentales para su extraccin de clulas vegetales, valora la importancia de estas molculas, que guardar la informacin gentica. PRECAUCIONES: 1.- Ten mucho cuidado al momento de lavar el material biolgico, retira bien los restos que se encuentran adheridos al material 2.- Adiciona las soluciones con mucho cuidado, tal y como dice su gua de prcticas as como las indicaciones del profesor, de esto depende el xito de la prctica 3.- Realiza tus observaciones desde el momento que vas adicionando los reactivos as observar el proceso de separacin del material.

FUNDAMENTO La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolucin y posterior extraccin de la clula. Se empieza por lisar (romper) las clulas mediante un detergente, vacindose su contenido molecular en una disolucin tampn en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampn contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, protenas y otras sustancias en menor proporcin. Las protenas asociadas al ADN de gran longitud, se habrn fraccionado en cadenas ms pequeas y separadas de l por accin del detergente. Solo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampn y detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamlico, probablemente el nico reactivo de esta prctica que no suele haber en una cocina
MATERIALES Y REACTIVOS Muestras

Hielo triturado - Cebolla - Ajos - Tomate - Fresas

55

- Leche
Materiales de vidrio - Tubos de ensayo

- Gradilla - Varillas de vidrio - Batidor - Nevera - Colador o ctrfuga -Vasos de precipitado de 150 250 ml. (12 unidades) - Pipetas - Rallador Reactivos - Agua (destilada o mineral) - Sal de mesa - Bicarbonato sdico - Detergente lquido o champ

PROCEDIMIENTO 1.- Preparar el tampn con los siguiente ingredientes y mantener en la nevera o en un bao de hielo triturado: 120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral. No usar agua del grifo. 1.5 gr de sal de mesa, preferiblemente pura. 5 gr. De bicarbonato sdico. 5 ml de detergente lquido o champ 2.- Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre los vegetales que pueda haber (cebolla, fresa, tomates, etc.) y cortarla en cuadritos. 3.- Triturar la muestra con un poco de agua en la batidora accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos. As se rompen muchas clulas y otras quedarn expuestas a la accin del detergente 4.- Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml. Del tampn fro y agitar vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar despus los restos vegetales ms grandes del caldo molecular hacindolo pasar por un colador lo ms fino posible. Lo ideal es centrifugar a baja velocidad 5 minutos y despus pipetear el sobrenadante. 5.- Retirar 5 ml de caldo molecular a un tubo de ensayo y aadir con pipeta 10 ml. De alcohol isoamlico enfriado a 0 C. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo este inclinado. El alcohol quedar flotando sobre el tampn 6.- Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separacin entre el alcohol y el tampn. Remover la varilla hacia delante y hacia atrs y poco a poco se irn enrollando los fragmentos de mayor tamao de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedar adherido a su extremo con el aspecto de un copo de algodn mojado.

CUESTIONARIO

56

1.- Qu es el DNA y cual es su importancia? 2.- Por qu al ADN se le considera como una molcula que guarda la informacin gentica? 3.- Cmo es la estructura del ADN? 4.- Todos los seres vivos tienen el mismo tipo de ADN? 5.- A qu se debe la variabilidad gentica de las especies? 6.- D qu otras clulas se puede extraer DNA?. Explique brevemente cmo se extrae.

FUENTE BIBLIOGRFICA - Gerald Karp. Biologa celular y molecular. 4 ed. Espaa: McGraw-Hill Interamericana; 2006. - Robert A. Wallace, Jack L. King, Gerald P. Sanders. Biologa Molecular y Herencia. 1a ed. Mxico: Editorial Trillas: 1991.

57

PRACTICA N 12: TRANSAMINACION COMPETENCIA El alumno reconoce las reacciones de transaminacin de los aminocidos, demuestra estas reacciones y valora la importancia de ellas en el organismo. PRECAUCIONES 1.- Ten mucho cuidado al momento de lavar el material biolgico, retira bien los restos que se encuentran adheridos al material 2.- Adiciona las soluciones con mucho cuidado, tal y como dice su gua de prcticas as como las indicaciones del profesor, de esto depende el xito de la prctica 3.- Realiza tus observaciones desde el momento que vas adicionando los reactivos as observar el proceso de separacin del material.

FUNDAMENTO La reaccin de transaminacin es probablemente una de las ms difundidas en el metabolismo de los aminocidos, su descubrimiento se debe a los cientficos Braunstein y Kritzmann en el ao 1938. Consiste en el transporte de un grupo amino de un aminocido a un cetocido, transformando al primero en cetocido y al segundo en aminocido. La ecuacin general de esta reaccin es:

R=CH-COOH + R-C-COOG NH2 O

R-C-COOH+R-CH-COOH O NH2

Se conocen un gran nmero de transaminasas. La transaminasa que estudiaremos es la transaminasa glutmico pirvica que transforma el alfa cetoglutrico (cetocido) en glutmico (aminocido) y a la alanina (animocido) en pirvico (cetocido). Esa enzima que es particularmente rica en el tejido heptico es un excelente herramienta de estudio clnico de ese rgano, en problemas como la hepatitis o la cirrosis heptica. El procedimiento de anlisis se llevar a cabo mediante la cromatografa en capa fina.

58

La cromatografa es un procedimiento de anlisis por el cual una mezcla de molculas es separada en sus componentes mediante el uso de una fase estacionaria y una mvil. La fase estacionaria o soporte da nombre al tipo de cromatografa: papel, columna, capa fina y la fase mvil es lquida o gaseosa. La separacin de componentes se produce por el fenmeno de particin por solventes, esto es ante una mezcla de lquidos no miscible entre s, algunos componentes tendrn mayor posibilidad de localizarse en uno u otro componente, aquellos que se localicen en el componente ms lejano del soporte migraran ms y aquellos cercanos sern adsorbidos por el soporte. Existen una forma identificatoria de medir la migracin de las molculas analizadas y es el Rf. Este valor corresponde a la relacin entre los cm migrados por la molcula y aquellos migrados por el medio mvil.

MATERIALES Y REACTIVOS - Cromatoplaca - Cubeta de cromatografa ( frasco de vidrio) -Centrfuga -Hielo - Capilares -Papel cromatogrfico - Estufa -Bao Mara -Cetoglutarato -Alanina

59

-Piruvato -Glutamato -Arsenito -Extracto de hgado de pollo -Buffer fosfato pH=7.4 -Alcohol etlico -Ninhidrina -Isopropanol -Amoniaco -Butanol -Alcohol etlico -Agua destilada

PROCEDIMIENTO 1. OBTENCIN DE LOS EXTRACTOS DE ENZIMAS: - Prepare un extracto de hgado en la proporcin 1:5 en masa volumen con buffer fosfato pH 7,4. Utilice bao de hielo para realizar la operacin. - Centrifugue a 2500 rpm durante tres minutos o filtre a travs de una gasa doble o algodn. - Guarde el sobrenadante en un tubo sumergido en bao de hielo y rotrelo como extracto de hgado. - Tome la mitad del extracto y pselo a un tubo y colquelo en un bao de agua hirviendo durante 5 minutos. Rotrelo como extracto de hgado calentado 2. Preparar 4 tubos de acuerdo la esquema:

60

TUBO N ml cetoglutarato 0,2 M ml alanina 0,2M ml piruvato 0,2M ml glutamato 0,2M ml arsenito 0,1M ml Enzima activa

1 0,3 0,3 0 0 0,4 0

2 0,3 0,3 0 0 0,4 1

3 0 0 0,3 0.,3 0,4 0

4 0 0 0,3 0,3 0,4 1

ml Enzima inactiva 1 0 1 0

a
RF =-----------------

a a

3. Incubar todos los tubos por 45 minutos a 37C. 4. Retirar los tubos del bao de Mara y agregar 6ml de alcohol etlico a cada tubo. Agitar y esperar por dos minutos. 5. Centrifugar y usar los sobrenadantes para la cromatografa.

61

6. Cromatografa: -Marcar a 3 cm del borde una lnea suave con un lpiz, tratando de no daar el papel cromatogrfico. Marcar en esa lnea seis puntos separados por 2 cm cada uno. -Colocar en cada punto cinco gotas del respectivo sobrenadante y en las dos ltimas 5 gotas de alanina y cinco de glutamato respectivamente. -Dejar secar. Colocar la cromatoplaca en una cmara de cromatografa con una mezcla de isopropanol: agua: amoniaco en la proporcin de 18:4:2 -Dejar correr hasta que el nivel lquido le falte 1 cm para llegar al extremo superior de la placa. Marcar el nivel al que alcanz el lquido con un lpiz y dejar secar. -Aplicar con un spray una solucin de ninhidrina al 0,1% e butanol. -Colocar a la estufa por 10 minutos. Marcar las manchas obtenidas. -Obtener el Rf de cada mancha mediante la frmula:

Distancia de origen al punto medio de la mancha Rf: Distancia de origen al nivel mximo del solvente

-Analice comparativamente los resultados.

CUESTIONARIO 1. Qu entiende por transaminacin? 2. Qu reacciones de transaminacin conoce en el organismo? 3. Cmo diseara otro experimento que demuestre la transaminacin de los aminocidos?

FUENTE BIBLIOGRFICA Universidad de San Martn de Porres. Facultad de Medicina Humana. Filial Norte. Gua de Prcticas de Bioqumica (sede web). Per: Scribd.com (Fecha de acceso: 10.01.10). Disponible en: http://www.scribd.com/doc/7351044/Guia-Practica-BioquImica-2007II

62

PRACTICA N 13: VALORACIN DEL ESTADO NUTRICIONAL MEDIANTE TALLA, PESO Y CREATININA COMPETENCIA El alumno detecta posibles problemas de malnutricin, evala el estado nutricional de un individuo a partir de la observacin de los parmetros antropomtricos como talla, peso as como con los valores de la creatinina. PRECAUCIONES 1.- Ten mucho cuidado al momento de lavar el material biolgico, retira bien los restos que se encuentran adheridos al material. 2.- Adiciona las soluciones con mucho cuidado tal y como dice su gua de prcticas as como las indicaciones del profesor de esto depende el xito de la prctica 3.- Realiza tus observaciones desde el momento que vas adicionando los reactivos as observar el proceso de separacin del material.

FUNDAMENTO La talla es un parmetro antropomtrico de fcil obtencin e interpretacin, que nos indica el estado de nutricin y que vara segn la edad y otros factores. El peso corporal es uno de los parmetros antropomtricos que ms se utiliza. Es un indicador global del estado nutricional. Muestra el estado nutricional actual, es de fcil uso pero de difcil interpretacin. La creatinina procede de la degradacin de la creatina, una molcula energtica de sntesis heptica situada en los msculos. La creatinina formada es excretada ntegramente por la orina y est relacionada con la masa muscular.

MATERIALES Y REACTIVOS - Peso de precisin - Tallmetro - Cinta mtrica inelstica 63

- Calculadora - Tabla de peso ideal, excrecin ideal de creatinina. - Reactivo (Picrato alcalino: cido pcrico en NaOH) (comercial) Procedimiento: - Talla: medida en el tallmetro dispuesto al efecto. La medida se efecta con el sujeto descalzo, en posicin firme, con los brazos relajados y cuidando que el ojo y meato auditivo estn en el mismo plano horizontal. - Peso: en ropa ligera y descalzo - Circunferencia de la mueca: del brazo no dominante, con una cinta mtrica distal a la apfisis estiloides en el pliegue de la mueca. - Determinacin de creatinina: La creatinina reacciona con el cido pcrico, a saturacin, en medio alcalino, formando un complejo marrn, cuya absorbancia a 510 nm es proporcional a la concentracin de creatinina. Para el clculo de la creatinina utilizar la siguiente recta de calibrado: Y = 29,74x + 0,0019 (r2=0,9998) Donde Y es la Abs a 510 de la muestra y X los mg/ml de creatinina. Se diluye la orina: 1:50 con agua destilada Se preparan los siguientes tubos: Agua destilada Muestra diluida Reactivo Abs 510 (alumno 1) Abs 510 (alumno 2) Calculo de creatinan (mg/ml): Conociendo la cantidad de orina eliminada (600-1800 ml) por el paciente en 24 h, se calcula la excrecin total de creatinina por da (en mg/dl). Sabiendo que los valores normales son 23 mg/Kg/d para el hombre y 17 mg/Kg/d para la mujer, se calcula el ndice de excrecin de creatinina y se interpreta el resultado. El dato tambin puede compararse con las tablas suministradas. Control 0.1 0 1 M1 M2 0.04 0.02 0.06 0.08 1 1 1 min a 35-37 C M3 0 0.1 1

64

pH (orina):

al (4,6 - 8)

Cuerpos cetnicos: Pequea: < 20 mg/dL (normal) ; Moderada: 30-40 mg/dL; Grande: > 80 mg/dL Glucosa en orina: debe ser negativo INTERPRETACIN PESO: Es interesante conocer el peso actual (P); el peso ideal (PI) Para el PI existen diversas frmulas: Brocca: PI = A-100 donde (A=altura en cm) Lorenz: PI = A 100 [(A-150)/4] + [(E-20)/k]; donde A=altura en cm; E= edad en aos; k= 4(Hombres) 2,5 (Mujeres) Metropolitan Life Insurance Company PI = 50 + 0,75(A-150) donde A= altura en cm COMPLEXION CORPORAL Se clasifica en pequea, mediana y grande. Se mide como la razn (r) entre la talla y la circunferencia de la mueca del brazo no dominante. r = Altura (cm) / Circunferencia de la mueca (cm) Complexin Pequea Mediana Grande INDICES: Porcentaje de peso habitual %PH = P/PI x 100 (valores superiores a 120% se considera obesidad) ndice de masa corporal, se obtiene mediante la siguiente frmula IMC = Peso (kg)/ Talla2 (m2) - IMC < 20 Desnutricin - 20 < IMC < 24,9 Normalidad - 25 < IMC < 29,9 Sobrepeso - 30 < IMC < 40 Obesidad - > 40 Obesidad mrbida En un estado nutricional normal y con una funcin renal correcta, la excrecin de creatinina diaria sera: Hombres: 23 mg/kg de peso ideal Hombres r>10,4 9,6 < r < 10,4 r<9,6 Mujeres r>11 10,1 < r < 11 r<10,1

65

Mujeres: 18 mg/Kg de peso ideal El ndice de excrecin de creatinina (IEC) (ver tablas adjuntas) IEC = excrecin renal de creatinina en 24h / excrecin ideal de creatinina en 24h x 100 La excrecin ideal de creatinina se obtiene de las tablas adjuntas. Segn el IEC se estima: Nutricin normal: 80-100 % Malnutricin leve: 60-80% Malnutricin moderada: 40-50% Malnutricin severa: < 40% Presentacin de resultados Alumno (1): Peso Talla Dimetro mueca Peso ideal %PI Complexin IMS IEC pH Cuerpos Cetnicos Glucosa(orina) Glucosa Sangre EVALUACIN NUTRICIONAL Cuestionario 1.- Qu es la creatinina? 2.- Cul es el significado de la alteracin de los valores de creatinina? 3.- Indica varios casos en que se eleva y se disminuye la creatinina sangunea. 4.- Cules son las condiciones en que debe presentarse el paciente para la prueba? Por qu? 5.- En qu consiste la depuracin de creatinina en orina de 24 horas y qu ventajas o desventajas presenta con respecto a la determinacin de creatinina sangunea? Explica. Alumno(2):

66

FUENTE BIBLIOGRAFIA - Hernndez, Rodrguez M, y Snchez Gonzlez, E. Alimentacin infantil. Madrid: Editorial Daz Santos; 1991. - Tern Daz. Eugenio. Alimentacin oral y nutricin humana. Espaa: Ed autor Santander;1994. - Gonzlez Carlos. Mi nio no me come. Madrid: Editorial Temas de Hoy; 1999.

67

PRCTICA N 14: DETERMINACIN DE UNA PRUEBA DE EMBARAZO EN ORINA COMPETENCIA El alumno realiza la deteccin de la hormona gonadotropina corinica como un mecanismo para determinar el estado de embarazo, comprueba experimentalmente a travs una muestra de orina de la paciente que se sospecha que est embarazada y valora la importancia de estas pruebas en el diagnstico del embarazo. PRECAUCIONES 1.- Ten mucho cuidado al momento de lavar el material biolgico, retira bien los restos que se encuentran adheridos al material 2.- Adiciona las soluciones con mucho cuidado, tal y como dice su gua de prcticas as como las indicaciones del profesor, de esto depende el xito de la prctica 3.- Realiza tus observaciones desde el momento que vas adicionando los reactivos as observar el proceso de separacin del material.

FUNDAMENTO

Los aos de funcin reproductiva de la mujer se caracterizan por cambios rtmicos en las tazas de secrecin de las Hormonas Femeninas y cambios correspondientes en los rganos sexuales. Las funciones sexuales y reproductivas en la mujer pueden dividirse en dos fases principales; primera: la Preparacin del Cuerpo para la Concepcin y la Segunda: el Periodo de Gestacin o Embarazo. La gonadotropina corinica humana (hCG) es una hormona glicoproteica que se produce en condiciones normales en la placenta y aparece en el plasma y en la orina durante el embarazo. La hCG, junto a la hormona folculo estimulante (FSH), la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante del tiroides (TSH), est constituida por una cadena alfa, estructuralmente similar entre ellas, y una cadena beta especfica que determina su actividad biolgica. 2 Esta hormona estimula la produccin de hormonas esteroides por el cuerpo lteo, lo que propicia el ambiente uterino adecuado para el desarrollo del embrin. El principal uso de la determinacin de la hCG es el diagnstico precoz del embarazo; sin embargo, es posible observar niveles elevados en pacientes con carcinomas urogenitales, embarazos ectpicos y ovricos. Una funcin principal de la Gonadotropina Corinica Humana (GCH) es administrar los factores nutricionales y estimular cantidades necesarias de otras hormonas para mantener en ptimas condiciones el endometrio y la 68

cavidad uterina, lo que en caso contrario de no haber concepcin o cantidad insuficiente de esta hormona se perdera en forma de lquido menstrual. La deteccin precoz del embarazo por las pruebas bioqumicas se fundamenta en la determinacin de la gonadotropina corinica humana (HCG) en suero o en orina. Una vez producida la fecundacin y la implantacin del blastocisto en la decidua endometrial, las clulas trofoblsticas empiezan a sintetizar HCG.2 Las cifras de HCG se incrementan rpidamente en las primeras semanas del embarazo y a los 35 das de amenorrea alcanzan cifras de 1800 UI/L. La HCG est compuesta de 2 subunidades alfa y beta, diferentes entre s; mientras la subunidad alfa es compartida por las restantes glicoprotenas hipofisarias, la subunidad beta le confiere sus caractersticas biolgicas e inmunolgicas distintivas.2 La combinacin del empleo de los anticuerpos monoclonales contra la subunidad beta de la HCG (beta HCG) y los inmunoensayos enzimticos, ha posibilitado el auge de mtodos semicuantitativos y cualitativos rpidos, sensibles y especficos con valores de sensibilidad de 50 UI/L que pueden ejecutarse en las propias consultas mdicas y donde el resultado se ofrece en menos de una hora.

CURVA DE hCG Semana desde Cantidad de hCG el ltimo ciclo 3 4 5 6 7-8 9-12 13-16 17-24 25-40 en mUI/mL 5-50 25-400 200-7000 1000-50000 7000-200000 25000-250000 15000-250000 5000-150000 4000-100000

EMBARAZO El primer signo de embarazo es la ausencia de una menstruacin esperada. Si los ciclos son regulares, el retraso de la regla durante 1 semana o 69

ms es la base de presuncin de embarazo. El mdico diagnosticar embarazo por medio de procedimientos exploratorios y utilizando diversos sistemas diagnsticos (doppler, test de embarazo, etc.) La hCG (Hormona del embarazo) estimula el cuerpo lteo del ovario para mantener las secreciones de estrgenos y progestgenos a fin de garantizar la integridad del embarazo. Como regla general, los niveles de hCG se duplican al doble cada dos o tres das. Una mujer embarazada tendr de 10 a 50 mUI/mL de concentracin de hCG en suero la primera semana siguiente a la concepcin (al final de la tercera semana del ciclo), alcanzando la mxima concentracin entre el segundo y tercer mes, seguido de un descenso a partir de la 12 semana. Mtodos de determinacin de la Gonadotropina Corinica humana (hCG, -hCG, hormona del embarazo) La hCG se sintetiza en la placenta y aparece en el suero y en la orina relativamente pronto despus de la concepcin.La hCG es una glucoprotena compuesta por dos subunidades polipeptdicas: alfa y beta. La subunidad alfa es esencialmente idntica a la cadena alfa de otras hormonas hipofisiarias (TSH, LH y FSH). Es la variacin de las subunidades beta donde reside la especificidad de la actividad biolgica de estas hormonas. Con los mtodos cuantitativos de laboratorio pueden detectarse cantidades muy pequeas de -hCG (sensibilidad entre 0,05 y 0,1 mUI/mL). Dichos mtodos son: radioinmunoanlisis (RIA), enzimoinmunoensayo (EIA, ELISA), inmunoanlisis de fluorescencia (FIA). Casi todos ellos usan dos tcnicas: Inhibicin competitiva (RIA, FIA), y tcnicas sndwich de doble anticuerpo (EIA, FIA). Todos estos ensayos cuantitativos requieren instrumentacin especial y largos tiempos de anlisis (de 30 minutos a 3 horas).
Suero: Determinacin cuantitativa de la HGC Marcador Tumoral Mola hiadiforme, coriocarcinoma, teratomas ovricos y testiculares, HCG ectpica. Neoplasia Embarazo mltiple, amenaza de aborto:. eritroblastosis fetal grave Hipogonadismo secundario no est indicada con niveles altos de FSH o LH Cualitativo en suero u orina. En orina se prefiere la primera de la maana, recin evacuada. Restringir ingesta de lquidos a partir de la media noche. Semicuantitativa: Orina de 24 Refrigerar durante la recoleccin horas.

Suero: determinacin cuantitativa de la HCG Suero u orina cualitativa o semicuantitativa

Prueba de estmulo en adultos y nios varones Embarazo

70

Tradicionalmente se han utilizado pruebas cualitativas urgentes en orina, de aglutinacin en portaobjetos, como indicadores para visualizar una reaccin positiva. Estas tcnicas han cado en desuso tras la aparicin de los tests rpidos en dispositivos inmunocromatogrficos, proporcionando sensibilidades de 25 mUI/mL en tiempos de ensayo por debajo de los 3 minutos.

La aparicin de una nueva generacin de mtodos inmunoabsorbentes con partculas de oro coloidal recubiertos de anticuerpos anti -hCG (DONNATEST Embarazo) permite mejorar la sensibilidad de deteccin de esta hormona en orina por debajo de 20 mUI/mL en menos de dos minutos. Estas pruebas se utilizan como mtodo cualitativo, tanto en laboratorio, en formato de tira reactiva para suero y orina, o en formato de dispositivo como prueba rpida de uso personal, y con la sensibilidad suficiente para detectar la hormona desde el primer da de la falta. MATERIALES Y REACTIVOS Gradilla, tubos de 13X100 Centrifuga, Gasas Tiras reactivas para deteccin de la fraccin beta de la hormona Muestra reciente de orina PROCEDIMIENTO 1. Procedimiento opcional: recoger la orina en un vaso limpio. Sumergir la zona absorbente del dispositivo durante 10 segundos. Esperar que aparezca el resultado a partir de un minuto. NOTA: La muestra debe ser recolectada en un frasco limpio, de preferencia de vidrio con tapa de rosca que cierre bien. De preferencia debe ser la primera orina de la maana pues es la ms concentrada, pero si no es posible cualquiera del da, puede ser utilizada en el examen.

71

RESULTADOS

Si aparecen dos lneas rosadas o rojas, el resultado es positivo. Si solo aparece la lnea rosada o roja, el resultado es negativo.

CUESTIONARIO: 1.- Adems del embarazo, qu importancia clnica determina el detectar los niveles sanguneos de la hormona gonadotropina corinica? 2.- Qu es un embarazo ectpico? Explica detalladamente. 3.-En casos de amenaza de aborto, para que solicita el Gineclogo la cuantificacin de la hormona gonadotropina corinica en la paciente? Cmo se realiza el estudio? 4.-Por qu se recomienda que el estudio se realice de preferencia en la primera orina de la maana? 5.- Por que el mdico solicita la fraccin beta de la HGC? 6.-Que diferencia existe el realizar la determinacin de la HGC en sangre en vez de orina?

FUENTE BILIOGRFICA - Scott, James R. Danforth. Tratado de Obstetricia y Ginecologa. 9 ed. Mxico DF: Editorial Mc Graw-Hill Interamericana; 2000. - Colectivo De Autores. Gua Buenas Prcticas Obsttricas. Hospital Provincial Universitario Docente GAL. Cienfuegos; 2001. - Botella Llusia, Clavero Nuez, J.A. Tratado de Ginecologa.14 ed. Madrid: Ed. Daz de Santos; 1993.

72

73