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LA RESISTENCIA DE NEISSERIA GONORRHOEAE A LOS NEUTRFILOS

M. Brittany Johnson and Alison K. Criss * M. Johnson Bretaa y Alison K. Criss * Department of Microbiology, University of Virginia, Charlottesville, VA, USA Departamento de Microbiologa de la Universidad de Virginia, Charlottesville, VA, EE.UU. La infeccin en el ser humano-especficas de patgenos bacterianos como Neisseria gonorrhoeae desencadena una respuesta potente, inflamatoria local impulsada por los leucocitos polimorfonucleares (neutrfilos o PMNs). Los PMNs son clulas diferenciadas terminales y fagociticas que son un componente vital de la respuesta inmune del husped innato y son los primeros en responder a las infecciones bacterianas y fngicas. Los PMN poseen un arsenal diverso de los componentes de los microorganismos de combate, incluyendo la produccin de especies reactivas del oxgeno y la liberacin de enzimas de degradacin y pptidos antimicrobianos. A pesar de numerosos PMN en el sitio de infeccin gonoccica, N. gonorrhoeae pueden ser cultivadas a partir de los exudados ricos en PMN de las personas con gonorrea aguda, lo que indica que algunas bacterias resisten a la muerte por los neutrfilos. La contribucin de los PMN a la patognesis de gonorrea se ha modelado en vivo por el ser humano masculino resto de la uretra y los genitales femeninos murino inoculacin e in vitro con aislados PMN PMN primarios o lneas celulares derivadas. Estos sistemas revelan que algunos gonococos sobrevivir y replicarse dentro de los PMN y sugieren que los gonococos defenderse de los PMN de dos maneras: que expresan factores de virulencia que defenderse de los componentes de los PMN 'antimicrobianos oxidativo y no oxidativo, y modulan la capacidad de los PMN de fagocitar gonococos y para liberar los compuestos antimicrobianos. En esta revisin, se har hincapi en los enfoques variados y complementarios utilizados por N. gonorrhoeae para resistir la aprobacin por los PMN humanos, con nfasis en los productos de los genes que modulan bacteriana gonoccica-PMN interacciones. La comprensin de cmo algunos gonococos sobrevivir a la exposicin a los PMN ayudar a guiar las futuras iniciativas de lucha contra la enfermedad gonocccica. Gonorrheal Disease Enfermedad de gonorrea La gonorrea es un importante problema de salud mundial, con ms de 62 millones de casos estima que se producen en todo el mundo por ao (Annimo, 2001 ). El nmero de casos reportados en los Estados Unidos se ha mantenido en aproximadamente 330.000 por ao, pero se estima que el nmero real es de al menos dos veces ms alta, y las tasas de gonorrea estn aumentando rpidamente entre los hombres que tienen sexo con hombres y los adultos jvenes ( y Workowski Berman, 2010 ). La causa de la gonorrea es la Gram-negativas diplococo Neisseria gonorrhoeae (el gonococo o GC). Gc es un patgeno humano-especfico que se transmite a travs de un estrecho contacto sexual con una persona infectada. La gonorrea se presenta como una uretritis aguda en los hombres y cervicitis en mujeres, pero la faringe y el recto tambin pueden ser infectados (Wiesner y Thompson, 1980 ). Debido a la naturaleza asintomtica de la infeccin con frecuencia las mujeres, la gonorrea es una causa importante de enfermedad inflamatoria plvica, que se caracteriza por dolor abdominal y cicatrizacin de las trompas que resulta en un embarazo

ectpico e infertilidad, las infecciones no tratadas en los hombres tambin conducir a la esterilidad. Infecciones diseminadas Gc puede causar el sndrome de artritis-dermatitis, endocarditis y meningitis. GC tambin puede ser de transmisin vertical durante el parto y sigue siendo una causa principal de ceguera infecciosa neonatal en el mundo en desarrollo ( Wiesner y Thompson, 1980 ). Gc sigue siendo un problema importante de salud pblica debido a la rpida adquisicin de resistencia a mltiples antibiticos ( Tapsall, 2009 ) y su capacidad de variar antignicamente fase y sus estructuras de superficie, evitando que las personas infectadas de desarrollar una respuesta inmune protectora y que obstaculizan el desarrollo de una vacuna de proteccin ( Virji, 2009 ). Independientemente de la localizacin anatmica que est infectado, Gc promueve una respuesta inflamatoria que se caracteriza por el reclutamiento de los PMN (Figura 1 ). En los hombres, los PMN aparecen en las muestras de la uretra y la orina das despus de la infeccin, e inmediatamente antes de la aparicin de los sntomas ( Cohen y Cannon, 1999 ). El exudado purulento producido por los hombres infectados, que se describe en la Biblia y de Galeno, es el aspecto ms conocido de la enfermedad de gonorrea y se refleja en la traduccin de "gonorrea", del griego como "flujo de semilla" ( Edwards y Apicella, 2004 ) . Las secreciones del cuello uterino de las mujeres con gonorrea tambin contienen los PMN ( Evans, 1977 ). Las bacterias en las secreciones de gonorrea se adjuntan en el plazo de los PMN ( Ovcinnikov y Delektorskij, 1971 ; Farzadegan y Roth, 1975 ; Evans, 1977 ; King et al, 1978. ; . Apicella et al, 1996 ). PMNs son los principales que responden inmune innata a infecciones bacterianas y fngicas y son capaces de fagocitosis y matar a una variedad de microorganismos ( Borregaard, 2010 ). Sin embargo, a pesar de los numerosos PMN en el sitio de la infeccin por gonorrea, Gc viables pueden ser cultivadas a partir de los exudados de las personas infectadas ( Wiesner y Thompson, 1980 ), y un subconjunto de Gc siendo viables cuando Gc estn expuestos a los PMN in vitro. Interpretamos estos resultados demuestran que los PMN-impulsado respuesta inmune innata a Gc es eficaz en la limpieza de una infeccin por gonorrea. La persistencia de la GC en la presencia de PMN facilita a largo plazo Gc es la colonizacin de sus huspedes humanos obliga, creando mejores oportunidades para la difusin y la transmisin de la gonorrea. En esta revisin se har hincapi en los conocimientos actuales acerca de la resistencia Gc al despacho de PMN, un aspecto crtico de la virulencia de Gc. FIGURE 1 FIGURA 1

Figura 1. Exudados gonorrea contienen numerosos PMN con asociados Gc. Tincin de Gram del exudado uretral de un hombre con gonorrea no complicada. Algunos PMN asociado con un solo diplococos (flecha fina), mientras que otros tienen varios adherentes e internalizado Gc (flecha gruesa). Tenga en cuenta que la mayora de los PMN en el exudado no estn infectados. PMN Antimicrobial Activities PMN antimicrobianos Actividades PMN son las clulas blancas de la ms abundante en la sangre perifrica de los seres humanos. Ellos son los fagocitos profesionales y la primera lnea de defensa del sistema inmune innato ( Borregaard, 2010 ). En respuesta a la infeccin perifrica o dao, PMN seguir las seales quimiotcticas de extravasacin de la sangre y migran a travs de los tejidos para llegar al lugar de destino. Clulas epiteliales de la mucosa y residente quimiocinas liberacin inmune de los PMN, como la interleucina-8, IL-6, factor de necrosis tumoral y la interleucina-1 ( Borregaard, 2010 ). Estas quimiocinas se liberan durante la infeccin humana por Gc ( Ramsey et al, 1995. ; . Coberturas et al, 1998 ). PMN poseen receptores que se unen y se complementan y fagocitan las partculas de anticuerpos opsonizadas [por ejemplo, receptor del complemento 3 (CR3), FcRs]. Tambin puede engullir partculas unopsonized a travs de interacciones de tipo lectina o el uso de receptores que son especficos para los ligandos en la superficie de la partcula ( Groves et al., 2008 ). La interaccin entre los PMN y se produce una partcula objetivo de la movilizacin de los diferentes subconjuntos de grnulos citoplasmticos en el plasma o la membrana phagosomal (Figura 2 ). La fusin de grnulos permite la degradacin y la muerte de los microorganismos, tanto intracelular y extracelular ( Borregaard et al., 2007 ). PMN mecanismos de muerte microbiana incluyen la produccin de especies reactivas del oxgeno (ROS) a travs de la enzima NADPH oxidasa (la "explosin oxidativa"), as como las actividades independientes de oxgeno de las enzimas de degradacin y los pptidos antimicrobianos (Tabla 1 ). PMN humanos grnulos se clasifican en forma de grnulos azurfilos o primarios, los cuales contienen mieloperoxidasa, pptidos defensinas, y catepsina G, entre otros componentes antimicrobianos; grnulos especficos o secundarios que contienen la flavocytochrome b 558 subunidad de la NADPH oxidasa, LL-37 catelicidina, lactoferrina, y CR3, y gelatinasa o grnulos terciarios que contienen gelatinasa ( Borregaard et al, 2007. ). Inicialmente, el contenido de grnulos gelatinasa degradar la matriz extracelular, lo que permite a los PMN migran a travs de los tejidos subyacentes del sitio de la infeccin. A continuacin, la liberacin de grnulos especficos en el punto de destino posibles aumentos fagocitosis debido a la presentacin de CR3 en la superficie del PMN. Por ltimo, la liberacin de los grnulos especficos y azurfilos crea un ambiente que es generalmente hostil para la supervivencia microbiana ( Lacy y Eitzen, 2008 ). PMN tambin la liberacin de neutrfilos trampas extracelulares (TNE), compuesto de ADN, histonas y componentes seleccionados de grnulos, que atrapan y matan a los microbios sin necesidad de fagocitosis ( Papayannopoulos y Zychlinsky, 2009 ). As, los PMN se combinan el oxgeno-dependientes e independientes de los mecanismos para combatir microorganismos intracelulares y extracelulares.

FIGURE 2 FIGURA 2

Figura 2.. Los mecanismos celulares de la supervivencia despus de la exposicin a Gc PMNs. Gc (azul diplococo) adhiere a la superficie de los PMN y se hunde en un fagosoma (valo blanco). PMN poseen tres tipos de grnulos (1 , 2 y 3 ), cada uno de los cuales contiene un subconjunto nico de los compuestos antimicrobianos. Grnulos se fusionan con el fagosoma nacientes o membrana plasmtica para entregar su contenido a los microorganismos invasores. Se proponen dos mecanismos que permitan Gc para sobrevivir despus de la exposicin a los PMN. (A modo de ejemplo, slo la supervivencia intracelular Gc se muestra.) En primer lugar, los grnulos de PMN liberan su contenido en la membrana plasmtica o en fagosomas que contienen Gc (A). Sin embargo, los factores de virulencia Gc confieren resistencia a los compuestos de grnulos "a los antimicrobianos. En segundo lugar, Gc evita grnulos de PMN de la liberacin de su contenido en la membrana plasmtica o en fagosomas, permitiendo que la bacteria para evitar encontrarse con compuestos antimicrobianos PMN (B). Cualquiera de estos mecanismos permitir una fraccin de Ge de sobrevivir y replicarse en presencia de PMN (C). TABLA 1

Componentes de la Tabla 1. Antimicrobianos encuentra en los grnulos de PMN. El hecho de que los exudados gonorrea contienen viable Gc indica que los PMN son ineficaces para eliminar la infeccin completamente Gc. Hay dos mecanismos que podran explicar cmo sobrevive Gc PMN desafo: Gc evita que los PMN de realizar sus funciones normales de antimicrobianos (fagocitosis, la liberacin de grnulos de contenido), o Gc expresa defensas contra componentes oxidativo y no oxidativo producido por los PMN (Figura 2 ). Como veremos, ahora hay evidencia sustancial para los dos mecanismos, que en ltima instancia permitir Gc para sobrevivir en un husped y ser transmitido a nuevos individuos.

Sistemas modelo para el examen de los PMN durante la patognesis Gc Cuatro enfoques experimentales se han utilizado para investigar la participacin de los PMN en la enfermedad de gonorrea. Cada uno ha contribuido a nuestra comprensin de cmo los PMN son reclutados durante la gonorrea aguda y cmo Gc puede resistir esta embestida. El modelo masculino Desafo uretral Infeccin humana experimental se limita a la inoculacin la uretra masculina, debido a la posibilidad de complicaciones graves como la enfermedad inflamatoria plvica en las mujeres con gonorrea ( Cohen y Cannon, 1999 ). Infeccin uretral de los resultados de voluntarios de sexo masculino en la liberacin de citocinas proinflamatorias y la apariencia de los PMN en el tracto urogenital 2-3 das despus de la infeccin, similar a lo que se ve en casos naturales de la uretritis gonoccica ( Cohen y Cannon, 1999 ). Al igual que en las infecciones naturales, los exudados de los hombres con infeccin experimental Gc contienen PMNs asociados con Gc y ocasionales clulas epiteliales exfoliadas. Anlisis con microscopio electrnico de estos exudados revel que un subconjunto de GC dentro de los PMN aparecen intactos, proporcionando la evidencia inicial de que Gc puede sobrevivir dentro de fagosomas PMN ( Ovcinnikov y Delektorskij, 1971 ; Farzadegan y Roth, 1975 ; . Apicella et al, 1996 ). La Mujer modelo murino del Tracto Genital La Dra. Ann Jerse (Universidad de Servicios Uniformados de Ciencias de la Salud) ha desarrollado un modelo de ratn hembra de la infeccin del tracto genital Gc, lo que permite la infeccin por gonorrea al ser examinado en un husped genticamente tratable. En este modelo, los ratones tratados con estradiol se inoculan por va vaginal con GC, que permite a ms del 80% de los ratones a ser colonizada por bacterias durante ms de una semana. Ratones infectados producen citoquinas inflamatorias, dando lugar a la rpida aparicin de los PMN en el tracto genital ( Jerse, 1999 ). La infeccin experimental de ratones hembra ha proporcionado informacin sobre la ventaja selectiva de la opacidad asociada (OPA) sobre la supervivencia de expresin de la protena Gc y el papel de los factores de virulencia Gc confiere resistencia in vitro a ROS y pptidos antimicrobianos en la infeccin in vivo ( Jerse, 1999 ; Jerse et al, 2003. ; Wu y Jerse, 2006 , Wu et al, 2009. ; . Cole et al, 2010 ). Porque los ratones carecen de los receptores especficos de los humanos y otros componentes que pueden ser importantes para la enfermedad de gonorrea, los estudios futuros podran emplear ratones transgnicos para las protenas humanas de inters. Puros ratones que son transgnicos para humanos relacionados con el antgeno carcinoembrionario, molculas de adhesin celular (CEACAMs) y CD46, receptores que estn implicados en la patognesis de gonorrea ( Merz y So, 2000 ), ya se han desarrollado ( Johansson et al, 2003. , Gu et al ., 2010 ), con cepas de ratn ms probable que se produzca en los prximos aos.

Inmortalizado PMN-Al igual que las lneas celulares El uso de las lneas inmortalizadas promieloctica clulas humanas para estudiar los mecanismos moleculares de la patogenia de Gc proporciona un sistema que es clonal, fcil de mantener, y es susceptible a la expresin de transgenes. Como ejemplo, la leucemia HL-60 lnea de clulas pueden diferenciarse en un fenotipo PMN-como con el cido retinoico ( Collins et al, 1977. ; . Newburger et al, 1979 ). Diferenciadas clulas HL-60 puede fagocitar y generar ROS en respuesta a la Opa que expresan Gc similar a primaria PMN humanos ( Bauer et al, 1999. ; Pantelic et al, 2004. ). Sin embargo, clulas HL-60 no cuentan con la fuerte actividad antimicrobiana asociada con las clulas primarias, debido en parte a la ausencia de grnulos especficos y otros compartimentos intracelulares ( Le Cabec et al., 1997 ). PMN primaria La investigacin sobre los mecanismos moleculares que subyacen a las infecciones de Gc PMN ha dependido principalmente en clulas humanas primarias, purificada de la sangre humana recin aisladas. La abundancia de los PMN en la sangre humana y la facilidad de purificacin que los PMN susceptibles a la infeccin con Gc in vitro. Las limitaciones de trabajar con los PMN principales incluyen su corta vida media, su limitada capacidad para la manipulacin gentica y la variabilidad de persona a persona intrnseco a las clulas humanas primarias. Sin embargo, la principal PMN humanos se han utilizado para medir la fagocitosis y la unin de GC, cuantificar la supervivencia despus de la exposicin Gc PMN, y evaluar el papel de los factores de virulencia Gc en defensa bacteriana contra los PMN. Gc infeccin de los PMN murino tambin se ha llevado a cabo ( Wu y Jerse, 2006 ; Soler-Garca y Jerse, 2007 ). Los estudios futuros con PMN primaria, junto con cultivos de clulas epiteliales de los sitios anatmicos relevantes puede proporcionar un medio para examinar las complejas interacciones entre las clulas husped que se producen durante la infeccin por gonorrea. Interaccin con los PMN Gc est influenciada por el estado fisiolgico de los PMN que se utiliza. La experimentacin inicial con primaria PMN humanos clulas empleadas y Gc suspendidas en soluciones salinas tamponadas ( Densen y Mandell, 1978 ; . Rest et al, 1982 ), pero esto es poco probable que refleje la transmigrado, estado preparado de PMN en el tracto genitourinario durante la infeccin aguda. La investigacin del laboratorio del Dr. Richard Rest (Drexel University) demostr que cuando se permiti a los PMN se adhieren a los tejidos tratados con la culturaplatos, lanzaron componentes granulares y mucho ms ligado a Gc PMN en suspensin ( Farrell y Resto, 1990 ). El laboratorio del Dr. Michael Apicella (Universidad de Iowa), posteriormente desarrollado un ensayo con adherentes de colgeno-PMN, lo que gener un sistema para estudiar el papel de determinados factores de virulencia Gc en la supervivencia bacteriana despus de PMN desafo (Seib et al, 2005. ; Simons et al ., 2005 ). Se adapt el protocolo para incluir el tratamiento Apicella PMN con las quimioquinas IL-8, lo que facilita la activacin de PMN (Borregaard, 2010 ). Hemos utilizado este sistema para demostrar la supervivencia dentro de Gc PMN y para identificar las protenas que defienden Gc las bacterias de la matanza de los PMN ( Stohl et al, 2005. , . et al Criss, 2009 ).

Supervivencia y replicacin en presencia de PMN Aunque la supervivencia de Gc en asociacin con los PMN que una vez fue objeto de acalorados debates, ahora hay pruebas sustanciales de que los gonococos sobrevivir y multiplicarse dentro de los fagocitos humanos. Examen de exudado uretral por microscopa ptica y electrnica se ha demostrado en repetidas ocasiones la presencia de abundantes PMNs con asociados e internalizado Gc ( Ovcinnikov y Delektorskij, 1971 ; Farzadegan y Roth, 1975 ; King et al, 1978. ; . Apicella et al, 1996 ). El hecho de que los gonococos viables pueden ser cultivadas a partir de exudados uretrales o hisopos de cuello uterino es altamente sugestiva de supervivencia Gc en presencia de PMN ( Wiesner y Thompson, 1980 ). Los estudios in vitro en el laboratorio utilizando Apicella adherente PMN humanos demostraron que ms del 50% Gc internalizado por los PMN se mantuvieron viables durante un mximo de 6 horas, segn lo determinado por la carga bacteriana viable y microscopa electrnica ( Simons et al., 2005 ). Nuestro grupo corroborado estos hallazgos y detectarse directamente Gc viable extracelulares e intracelulares despus de la infeccin PMN, el uso de tintes que revelan la integridad de las membranas bacterianas ( al Criss et al., 2009 ). Llegamos a la conclusin de estos estudios que una fraccin de Gc puede sobrevivir tanto extracelular como intracelularmente en presencia de PMNs. Hay evidencia de que GC no slo persisten en los PMN, pero tambin utiliza el PMN como un sitio para la replicacin. Estudios pioneros en la dcada de 1970 mostr que en el interior Gc exudado derivado de los PMN son sensibles a la penicilina, que slo mata a las bacterias de replicar. En presencia de los agentes antimicrobianos, tales como la espectinomicina o pyocin que no puede penetrar en las membranas eucariotas, el nmero de PMN-asociados Gc aumentado con el tiempo, lo que indica la replicacin bacteriana en el interior exudatous e in vitro infectadas por PMN ( Veale et al, 1976. , 1979 ; Casey et al., 1979 , 1980 , 1.986 ). Mediante microscopa electrnica y el recuento de colonias, el laboratorio Apicella se observ un aumento en la GC dentro de colgeno adherentes PMN humanos sobre una infeccin de 6 h, los resultados tambin sugieren la replicacin intracelular ( Simons et al., 2005 ). Del mismo modo, se utilizaron colorantes bacteriana viabilidad de observar un aumento en el nmero de Gc viable dentro de los PMN en el tiempo ( al Criss et al., 2009 ). Mientras que la ventaja de replicar dentro de las clulas terminales diferenciadas de una vida til limitada Gc es cuestionable, el grupo Apicella mostr que los PMN infectados con Gc retrasar su apoptosis espontnea ( Simons et al., 2006 ). Anticipamos que los avances en imagen celular a proporcionar apoyo adicional para la replicacin en el interior Gc PMN y se dan una idea de la oportunidad y alcance de este evento. Vinculante y la fagocitosis de los PMN por Gc Puesto que las secreciones gonorrea contienen PMNs asociados con bacterias viables intracelular y extracelular, Gc deben poseer los factores que promueven el apego y la fagocitosis de los PMN. Interacciones de opsonizacin y no opsonizacin son los dos medios bsicos de la fagocitosis, los cuales pueden ser utilizados por Gc ( Groves et al, 2008. ; Figura 3 ).

FIGURA 3

(A) Los anticuerpos que reconocen las estructuras Gc opsonizan superficie de la bacteria y permiten la fagocitosis a travs de receptores Fc. La eficacia de la fagocitosis mediada por la inmunoglobulina es cuestionable dada la fase extensiva y la variacin antignica de las estructuras de la superficie de Gc. (B) Gc se une el factor H y protena de unin C4, dando lugar a la opsonizacin de GC con C3 y otros componentes del complemento. Gc es fagocitado luego a travs del receptor CR3. Gc pili y porina cooperativa puede interactuar con CR3, que pueden mediar la fagocitosis no opsonizacin de GC por los PMN. (C) Seleccin de las protenas Opa unen a los receptores de la familia CEACAM expresa en los PMN, lo que no opsonizacin fagocitosis de Opa + Gc. La captacin de opsonizacin Los dos principales opsoninas en la fagocitosis PMN son inmunoglobulinas y complemento, que se unen a los receptores Fc y receptores del complemento, como CR3, respectivamente. Los pacientes con gonorrea produce opsonizacin IgG e IgA contra Gc superficie expuesta componentes, incluyendo porinas, protenas Opa, pilin, hierro regulado protenas de membrana externa, y lipooligosacrido (LOS) ( Brooks et al, 1976. ; McMillan et al, 1979. ; Tramont y otros, 1980. ; Rice y Kasper, 1982 ; Siegel et al, 1982. ; Lammel et al, 1985. ; Schwalbe et al, 1985. ). Curiosamente, el suero de individuos sin antecedentes de gonorrea contiene opsonizacin IgG contra Gc porina e IgM contra Gc isotipos LOS contiene hexosamina; los antgenos no-Gc reconocidas por estos anticuerpos no se conocen ( Sarafian et al, 1983. ; Griffiss et al. , 1991 ). Muchas de las estructuras de la superficie Gc que promueven la respuesta inmune humoral son antignicamente fase y variable, evitando as mediada por anticuerpos vigilancia inmune ( Virji, 2009 ). Adems, Gc secreta una proteasa IgA que rompe la IgA polimrica en las secreciones mucosas ( Blake y Swanson, 1978 ). De este modo se complementan en lugar de anticuerpos es probable que haga la fagocitosis opsonizacin de GC por los PMN. El sistema del complemento es un componente clave del sistema inmune innato compuesto por ms de 30 protenas.

Non-opsonic Uptake In the absence of antibodies or complement, efficient binding and engulfment of Gc by PMNs is achieved via expression of colony Opa proteins ( King and Swanson, 1978 ; Virji and Heckels, 1986 ; Fischer and Rest, 1988 ). Opa proteins, formerly known as protein II, are a family of closely related, 2030 kD outer membrane proteins that facilitate Gc binding and internalization by human cells, including PMNs ( Sadarangani et al., 2011 ). Gc strains possess approximately 11 opa genes encoding 78 antigenically distinct Opa proteins ( Connell et al., 1990 ; Dempsey et al., 1991 ). Each opa gene is phase-variable due to slipped-strand mispairing in a pentameric nucleotide repeat that places the gene in our out of frame ( Murphy et al., 1989 ), such that individual Gc can express zero, one, or any possible combination of Opa proteins. Differential expression of Opa proteins can influence bacterial tropism for host cell types and provides a mechanism of immune evasion ( Sadarangani et al., 2011 ). Opacity-associated proteins bind heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) and/or CEACAMs. Only those Opa proteins that bind CEACAMs are reported to influence Gc interactions with PMNs ( Sadarangani et al., 2011 ). The Opa-binding CEACAMs on PMNs are CEACAM1, CEACAM3, and CEACAM6, with CEACAM3 expression exclusively restricted to PMNs. CEACAM1 and CEACAM3 are transmembrane proteins, while CEACAM6 possesses a glycosylphosphatidylinositol anchor ( GrayOwen and Blumberg, 2006 ). Binding of Opa proteins to any of the three CEACAMs results in Gc internalization, but via different signaling events ( McCaw et al., 2004 ). Opacity-associated protein expression is selected for in the male urethra, the female cervix during the follicular phase of the menstrual cycle, and in the murine cervix ( James and Swanson, 1978 ; Swanson et al., 1988 ; Jerse et al., 1994 ; Jerse, 1999 ). However, Opa Gc survives better after exposure to PMNs in vitro than isogenic Opa + Gc ( Rest et al., 1982 ; Virji and Heckels, 1986 ; Criss et al., 2009 ). Opa protein expression increases Gc phagocytosis by PMNs and stimulates PMN ROS production, and both factors may influence bacterial survival after exposure to PMNs ( Rest et al., 1982 ; Fischer and Rest, 1988 ). Gc surface structures other than Opa proteins may contribute to adherence and phagocytosis by PMNs. Pili and porin cooperatively interact with CR3 on cervical epithelial cells ( Edwards et al., 2002 ). It is not known if this interaction occurs on PMNs, but if it were to occur, it would drive non-opsonic uptake of Gc by PMNs. In vitro studies suggested that type 1, virulent, piliated Gc were resistant to phagocytosis and killing by PMNs compared to type 4, avirulent, non-piliated bacteria that arise after extensive laboratory passage ( Ofek et al., 1974 ; Dilworth et al., 1975 ). We now know that type 1 and type 4 Gc vary in Opa expression as well as piliation, both of which could have contributed to these observations. Purified porins also decrease PMN actin polymerization, which may reduce the phagocytosis of Gc by PMNs ( Bjerknes et al., 1995 ). Serogroup C strains of N. meningitidis with lacto-N-neotetraose (LNnT) on LOS are phagocytosed by neutrophils in an opsonin-independent manner ( Estabrook et al., 1998 ); it has not been examined whether this LOS epitope on Gc affects phagocytosis by PMNs. Together, the

combinatorial expression of Opa proteins, pili, porin, and LOS modulate Gc binding and internalization by PMNs. Gc Defenses Against PMN Antimicrobial Activities Whether they remain extracellular or are phagocytosed by PMNs, Gc must contend with the variety of oxidative and non-oxidative antimicrobial components produced by PMNs (Figure 2 ). Gc isolated directly from human material or guinea pig subcutaneous chamber fluid display increased survival in the presence of phagocytes compared to Gc grown in vitro ( Witt et al., 1976 ; Veale et al., 1977 ), suggesting that Gc possesses factors necessary for defending against phagocyte killing that are lost or altered with extended in vitro culture. These Gc factors aid Gc in resisting the toxic activities of PMNs in two ways. First, Gc prevents PMNs from producing or releasing antimicrobial components. Second, Gc expresses virulence factors that defend against these components. As we will describe, many Gc gene products have been identified that protect Gc from purified ROS, proteases, or antimicrobial peptides, but in most cases their roles in defense against PMNs have not yet been investigated. Defenses Against Oxidative Damage The major species of ROS include superoxide anion, hydrogen peroxide, and hydroxyl radical. These ROS have different reactivities and half-lives, but together they induce DNA, protein, and cell membrane damage that can lead to cell death ( Fang, 2004 ). There are at least four potential sources of oxidative stress for Gc in vivo . (1) PMN NADPH oxidase transports electrons across the phagosomal or plasma membrane to generate superoxide, which spontaneously dismutates to hydrogen peroxide. In PMNs, the azurophilic enzyme myeloperoxidase uses hydrogen peroxide as a substrate to generate hypochlorous acid (bleach; Roos et al., 2003 ). Phagocytes can also produce reactive nitrogen species (RNS) such as nitric oxide and peroxynitrite, but RNS appear to be of limited importance in human PMN antimicrobial activity ( Fang, 2004 ). (2) Enzymes related to phagocyte NADPH oxidase are expressed in epithelial cells, and the survival defect of Gc antioxidant mutants inside primary cervical cells implies that epithelial cells may also be an important source of oxidative stress for Gc ( Wu et al., 2005 , 2006 ; Achard et al., 2009 ; Potter et al., 2009 ). (3) Lactobacillus species that generate hydrogen peroxide are normally found in the vaginal flora of women ( Eschenbach et al., 1989 ). Women with inhibitory lactobacilli are less likely to be infected with Gc ( Saigh et al., 1978 ), and lactobacilli inhibit Gc growth in vitro ( Saigh et al., 1978 ; Zheng et al., 1994 ; St Amant et al., 2002 ). However, it appears that effects of lactobacilli on Gc may be independent of hydrogen peroxide production, since mucosal secretions can effectively quench lactobacilli-derived ROS ( O'Hanlon et al., 2010 ). (4) Gc generate ROS during aerobic respiration, although this may be less of an issue in vivo , where the oxygen tension in the genitourinary tract is low ( Archibald and Duong, 1986 ). Gc defenses against oxidative stress involve manipulation of the PMN oxidative burst, detoxifying or repair of oxidative damage, and transcriptional upregulation of antioxidant gene products (Figure 4 A).

FIGURE 4 FIGURA 4

Figure 4. Figura 4. Mechanisms of Gc survival after exposure to antimicrobial compounds produced by PMNs . (A) Resistance to oxidative damage. PMN NADPH oxidase generates superoxide ( ) and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) from O 2 , which are converted to hypochlorous acid (HOCl) by myeloperoxidase (MPO). Gc prevents PMNs from generating ROS by lactate-mediated increase in Gc O 2 consumption and suppression of NADPH oxidase activity by porin or as-yet unidentified factors. Gc scavenges ROS through the activities of MntABC, superoxide dismutase (SodB), catalase (KatA), and cytochrome c peroxidase (Ccp). Gc can also repair damage due to ROS through DNA repair enzymes (RecN), protein reductases (MsrA/B), and other proteins (Ngo1686). (B) Resistance to PMN non-oxidative damage. Gc pili and/or porins prevent PMN granules from releasing non-oxidative antimicrobial components. LOS protects Gc outer membrane proteins such as Opa and porin from proteolysis by cathepsin G. Sialylation of LOS by Lst and PEA modification of LOS by LptA increases bacterial resistance to cathepsin G and other antimicrobials. The MisR/MisS two-component regulator increases expression of LptA and other gene products that confer resistance to PMN non-oxidative damage. Ngo1686 and RecN also protect Gc from PMN non-oxidative damage. The MtrCDE and FarAB efflux pumps export cationic antimicrobial peptides (CAMPs) and long-chain fatty acids (FA) from the Gc cytoplasm, respectively. In most cases, the contribution of these virulence factors to Gc survival after exposure to PMNs remains to be determined. Gc manipulation of the PMN oxidative burst In the absence of Opa protein expression, Gc fails to induce the PMN oxidative burst ( Rest et al., 1982 ; Virji and Heckels, 1986 ; Fischer and Rest, 1988 ; Criss and Seifert, 2008 ). Even in the presence of Opa + Gc that induce ROS production in PMNs, the magnitude of ROS production is small relative to stimuli such as phorbol esters or other bacteria ( Simons et al., 2005 ). Gc utilizes three mechanisms to reduce the amount of ROS produced by PMNs. First, exposure to lactate that is released from PMNs undergoing glycolysis stimulates the rate of Gc oxygen consumption, reducing the amount available to PMNs as a substrate for NADPH oxidase ( Britigan et al., 1988 ). Second, purified Gc porin inhibits PMN ROS production in response to Gc, yeast particles, and latex beads ( Lorenzen et al., 2000 ), but not formylated peptides ( Haines et al., 1988 ; Bjerknes et al., 1995 ). Whether porin has this effect in the context of whole Gc bacteria remains to be examined. Third, we reported that Opa Gc suppresses the PMN oxidative burst induced by serum opsonized staphylococci and formylated peptides by a process requiring bacterial protein synthesis and bacteria-PMN contact; the bacterial products mediating this effect are not known at this time ( Criss and Seifert, 2008 ).

Detoxification and repair of oxidative damage Bacteria respond to oxidative stress by catalysis of superoxide to hydrogen peroxide by superoxide dismutase (SOD), which is then converted to water and molecular oxygen by catalases and peroxidases ( Seib et al., 2006 ). Gc possesses a single cytoplasmic superoxide dismutase (SodB), one cytoplasmic catalase (KatA), and several genes annotated as peroxidases. SodB activity is low in Gc and does not play a significant role in protection against oxidative stress ( Tseng et al., 2001 ). In comparison, KatA is crucial to Gc defense against ROS. Gc has approximately 100-fold higher levels of catalase than E. coli ( Hassett et al., 1990 ). Disruption of katA significantly reduces Gc survival to hydrogen peroxide and superoxide in vitro ( Johnson et al., 1993 ; Soler-Garcia and Jerse, 2004 ; Stohl et al., 2005 ) and reduces the survival of some strains of Gc in the female murine genital tract ( Wu et al., 2009 ). Gc also has high peroxidase Gc activity due to the periplasmic cytochrome c peroxidase encoded by ccp ( Archibald and Duong, 1986 ). ccp mutant Gc show slight sensitivity to hydrogen peroxide, which is markedly enhanced when katA is also inactivated ( Turner et al., 2003 ). Gc also imports Mn(II) into its cytoplasm via the MntABC transporter, where it scavenges superoxide and hydrogen peroxide by a mechanism independent of SodB and catalase ( Tseng et al., 2001 ). This system is similar to the manganese transport system in Lactobacillus plantarum ( Archibald and Duong, 1984 ). GC tambin se puede reparar el dao oxidativo a las protenas y el ADN. Gc expresa dos formas de metionina sulfxido reductasa, que revierte la oxidacin de los residuos de metionina en las protenas. La protena MsrA se localiza en el citoplasma, mientras que MsrB se secreta a la membrana externa. Un mutante msrAB es ms sensible al perxido de hidrgeno y superxido in vitro de sus padres de tipo salvaje ( Skaar et al., 2002 ). Muchos productos de los genes implicados en la reparacin Gc recombinacin de ADN, reparacin por escisin de base, y la reparacin por escisin de nucletidos participar en Gc defensa contra ROS, tales como la recombinasa Reca y el RECN protena de unin al ADN ( Davidsen et al, 2005. ; . Stohl et al, 2005 , Stohl y Seifert, 2006 ; Lecuyer et al, 2010. ). La metaloproteasa Ngo1686 supuesta ayuda a proteger Gc de perxido de hidrgeno y el hidroperxido de cumeno oxidante de lpidos, pero las dianas celulares con los que interacta Ngo1686 se desconoce en la actualidad ( Stohl et al., 2005 ). Ambos ngo1686 y mutantes RECN tener defectos significativos de supervivencia despus de la exposicin a la educacin primaria PMN humanos, sino un mutante Reca no ( Stohl et al, 2005. ; Criss et al, 2009). La induccin de la transcripcin de genes antioxidantes de los productos Gc pre-expuestas a perxido de hidrgeno sobrevive desafo PMN significativamente mejor que los no expuestos Gc ( Criss et al., 2009 ). Este hallazgo implica que Gc posee el complejo circuito de transcripcin que es importante para la defensa contra ROS y / o PMN. El transcriptoma de Gc expuestos a concentraciones subletales de perxido de hidrgeno se defini y puso de manifiesto la regulacin al alza de la codificacin de las transcripciones RECN, Ngo1686, y otros antioxidantes despus del desafo oxidativo ( Stohl et al., 2005 ). Expresin de genes antioxidantes est regulado por una seleccin de represores transcripcionales. La protena oxyR reprime la expresin kata,

que se alivia el estrs oxidativo siguientes con el fin de aumentar la produccin de catalasa ( Tseng et al., 2003 ). Perr responde a Mn (II) los niveles y reprime la expresin de MntC, parte del Mn (II) transportista ( Wu et al., 2006 ). Por ltimo, Ngo1427, un homlogo LexA, reprime la expresin de RECN, que se alivia cuando un residuo de cistena se oxida ( Schook et al., 2011 ). PMN fundamentalmente de no-oxidativa componentes antimicrobianos contra Gc Aunque Gc tiene complejos mecanismos para detectar el dao oxidativo y responder a ella, la importancia de estos procesos en la supervivencia de los PMN Gc parece ser limitado. Mutantes en el kata, sodB, CCP, o mntABC, solos o en combinacin, no afectan el porcentaje de GC que pueden sobrevivir desafo PMN ( Seib et al, 2005. ; al Criss et, 2009. ). Por otra parte, la supervivencia Gc es similar entre los PMN PMN normales y con deficiencia de ROS obtenidos de pacientes con enfermedad granulomatosa crnica (EGC; Rest et al, 1982. , Criss y Seifert, 2008 ), y los PMN mantiene en condiciones de anoxia, ya que es probable que se se encuentran en el tracto reproductivo superior de las mujeres, no se vean afectadas por la actividad antigonococcal ( Casey et al, 1986. ; Frangipane y Resto, 1992 ). Nuestro grupo mostr que la supervivencia Gc no se vio afectada despus de la exposicin a PMNs tratados con diphenyleneiodonium (DPI), un inhibidor de la NADPH oxidasa. Tratamiento DPI o PMN CGD no aument el porcentaje de supervivencia de ngo1686 o Gc RECN, ni aumentar la supervivencia de Opa + Gc que inducen ROS de los PMN ( Criss et al., 2009 ). A partir de estos resultados, podemos concluir que los PMN fundamentalmente de no-oxidativa actividad antimicrobiana contra la GC. La redundancia funcional en las defensas antioxidantes Gc puede ser suficiente para contrarrestar PMN-ROS derivados, como alternativa, los PMN no pueden generar suficiente ROS durante la infeccin afectar la supervivencia de Gc. Defensas contra los no-dao oxidativo Investigacin seminal del resto y los laboratorios de Shafer indic que los componentes se encuentra dentro de los grnulos de PMN pantalla de oxgeno independiente actividad antigonococcal ( Rest, 1979 ; Casey et al, 1985. ; Rock and Rest, 1988 ). Estos componentes incluyen el bactericida / permeabilidad cada vez mayor de protenas ("hCAP57"), la catepsina G de la proteasa, y LL-37 antimicrobiana del pptido ( Casey et al, 1985. ; Shafer et al, 1986. , 1998 ). A diferencia de muchas bacterias Gram-negativas, Gc son altamente resistentes (> 0,2 mg / ml) a otra clase de pptidos antimicrobianos, las defensinas ( Qu et al., 1996 ), a pesar de la resistencia observada vara dependiendo de las condiciones experimentales utilizadas ( Porter et al ., 2005 ). De los componentes de PMN grnulos no oxidativo, la catepsina G y la LL-37 ha sido el ms estudiado activamente por sus efectos sobre Gc. Catepsina G es una serina proteasa altamente catinico, que reside en PMN grnulos azurfilos. Se rompe enzimticamente protenas de membrana externa Gc incluyendo porinas y protenas Opa ( Descanso y Pretzer de 1981 , Shafer y Morse, 1987 ). Sin embargo, los inhibidores de la proteasa del calor y no impedir la capacidad de la catepsina G de matar a Gc in vitro, lo que indica su actividad antigonococcal es independiente de su actividad proteoltica ( Shafer et al., 1986 ). Catepsina G puede insertar en las membranas Gc, pero matar no parece ser debido a cambios en

la permeabilidad de la membrana, en cambio, la catepsina G puede impedir la biosntesis del peptidoglicano ( Shafer et al, 1990. ). LL-37 es la forma activa de una protena precursora de 18 kD ("hCAP18") que se encuentra en los grnulos especficos. hCAP-18 es procesado proteolticamente a LL-37 por la protena de grnulos azurfilos proteinasa-3 ( Sorensen et al., 2001 ). hCAP-18/LL-37 tambin es sintetizada por clulas epiteliales mucosas, y es fcilmente detectado en las secreciones cervicovaginales (media LL-37 concentracin de 10 ug / ml) y plasma seminal (media hCAP-18 la concentracin de 86 ug / ml; Malm et al, 2000. ; Tjabringa et al, 2005. ). Gc infeccin aumenta los niveles de hCAP18/LL-37 por dos a cuatro veces cuando se lava el cuello uterino y la uretra ( Porter et al, 2005. ; . Tjabringa et al, 2005 ). Estas concentraciones de LL-37 sera suficiente para ejercer la actividad antibacteriana de GC, ya que la concentracin media inhibitoria de la LL-37 para Gc es de 6 mg / ml ( Shafer et al., 1998 ). El mecanismo de accin de antigonococcal LL-37 sigue siendo enigmtica y puede estar relacionada con su capacidad de formar poros que alteran la integridad de las membranas bacterianas ( Brogden, 2005 ). Aunque Gc son susceptibles a la catepsina G y la LL-37 in vitro, la capacidad de un porcentaje de GC para sobrevivir a la exposicin PMN sugiere que las bacterias han desarrollado mecanismos para contrarrestar estos componentes antimicrobianos. Estos mecanismos implican la modulacin directa de la liberacin de grnulos de PMN, los cambios en la superficie para resistir Gc no oxidativo componentes antimicrobianos, y la exportacin activa de estos componentes (Figura 4 B). La modulacin de la liberacin de grnulos de PMN Ambos pili y porina se han reportado para reducir la fusin de grnulos de PMN con la membrana plasmtica o fagosomas. Cuando se aade a los PMN primaria, porinas purificada inhibe la exocitosis de grnulos azurfilos y especficos ( Bjerknes et al, 1995. ; . Lorenzen et al, 2000 ). "Tipo 1", piliated Gc se inform tambin de inhibir la exocitosis de grnulos azurfilos relativa a "tipo 4", no piliated Gc, pero otras estructuras de superficie, expresada en un tipo de bacterias pueden haber mediado este resultado ( Densen y Mandell, 1978 ). Estudios ms detallados con cepas isognicas Gc son necesarios para determinar si y cmo las estructuras de la superficie de influencia de la movilizacin Gc grnulo. Modificaciones a la superficie Gc LOS Gc se cree que la mscara de protenas que son degradadas por la catepsina G, ya que el truncamiento o prdida de los resultados en un aumento de LOS vinculante de la catepsina G y una mayor susceptibilidad a la catepsina G-mediada por el asesinato ( Shafer, 1988 ). Dos modificaciones de las interacciones entre impactos LOS bacterianas con las clulas husped y las defensas del husped: fosfoetanolamina (PEA) en sustitucin de lpido A o el oligosacrido, y sialilacin de la terminal Gal1-4GlcNAc eptopos del oligosacrido ( Mandrell et al, 1990. ; al Plested et. , 1999 ). Adems de la PEA en el grupo heptosa en la cadena beta del ncleo oligosacrido Gc mejora la resistencia de suero, pero no afecta la susceptibilidad a los pptidos

antimicrobianos ( Lewis et al., 2009 ). Por el contrario, adems de la PEA de lpido A de la enzima LPTA aumenta la resistencia a los antimicrobianos humanos normales pptidos de suero y catinicos que indica que los cambios estructurales en LOS contribuir a la capacidad de los gonococos para resistir la accin bactericida de estos componentes inmune innata ( Lewis et al. , 2009 ). La expresin de LPTA es regulada positivamente por la Misr / Miss dos componentes del sistema regulatorio ( Newcombe et al, 2005. ; Tzeng et al, 2008. ). Gc exportacin de componentes antimicrobianos La resistencia a mltiples transferibles (MTR) locus es un factor determinante de la resistencia a los agentes antimicrobianos Gc ( Shafer et al., 1998 ). Un miembro de la divisin de resistencia nodulacin de las clulas (RND) de la familia de bombas de expulsin, est codificada por un gen mtrCDE tres opern designado. MTRC atraviesa el periplasma de vincular la protena de la membrana interna MtrD, la transportadora de salida a mltiples frmacos, con MtrE externa de protenas de membrana, el canal para la exportacin de los antimicrobianos en el medio ambiente extracelular ( Hagman et al., 1995 ). MtrCDE utiliza la fuerza motriz de protones para exportar una gran variedad de compuestos del citoplasma Gc, incluidos los antibiticos, detergentes, y los pptidos antimicrobianos ( Hagman et al, 1995. ; . Veal et al, 2002 ). mtrCDE est regulada negativamente por el represor transcripcional MTRR ( Hagman y Shafer, 1995 ) y positivamente regulada por el activador transcripcional Mtra ( Rouquette et al., 1999 ). Las mutaciones en MTRR y Mtra que modulan la expresin de MtrCDE afectan la resistencia a los pptidos antimicrobianos Gc ( Hagman et al, 1995. , Hagman y Shafer, 1995 ). Expresin MtrCDE promueve la supervivencia Gc en el tracto genital femenino murino ( Jer et al., 2003 ) y aumenta la resistencia a los pptidos antimicrobianos murino ( Warner et al., 2008 ), pero su papel en la defensa de GC en contra de los PMN no est claro. Gc tambin utiliza el sistema de bomba de eflujo Farab para conferir resistencia a largas cadenas de cidos grasos, independiente de la actividad Mtr ( Lee y Shafer, 1999 ). El sistema est compuesto por Lejos de la Fara que atraviesa la membrana enlazador, el transportista Farb membrana citoplasmtica, y MtrE. Lejos de expresin se cree que es importante para la supervivencia de los aislados en la superficie de la mucosa rectal, que es rico en derivados de la dieta de cidos grasos, y no contribuye a la supervivencia de Gc en el tracto genital murino ( Jer et al., 2003 ). Cmo funciona el sistema Lejos contribuye a la defensa de GC contra PMN, que puede liberar los cidos grasos ( Huang et al., 2010 ), que queda por explorar.

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