ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Proyecto: Aislamiento de
Azospirillum a partir de raíces de
gramíneas
ASIGNATURA :

Microbiología de Suelos

DOCENTE :

Dr. Nelly Ramírez de Jiménez

ALUMNOS:

Rómulo Aycachi Inga

Alex M. Chafloque Millones
Cinthya Paz Acuña

CICLO :

2007- I

Lambayeque, junio 2007.

GENERALIDADES

 Título del proyecto: “Aislamiento de Azospirillum a partir de raíces de

gramíneas”

 Personal investigador:
Autores:

Aycachi Inga Rómulo

Chafloque Millones Alex M.
Paz Acuña Cinthya

Patrocinador o Asesor:

Dra. Nelly Ramírez de Jiménez

 Carrera profesional / Especialidad:

Biología / Microbiología y Parasitología

 Tipo de investigación :

- De acuerdo al fin que se persigue: APLICATIVO

- De acuerdo a la tecnica de contrastación: EXPLICATIVA

 Régimen de investigación: Orientada al área de Microbiología del Suelo

 Localidad o Institución donde se desarrollará el proyecto:

Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo

 Duración del proyecto: 8 semanas aprox.

 Fechas probables de inicio y terminación:

- Inicio: 23 de julio del 2007

- Terminación: 10 de setiembre del 2007

 Cronograma de trabajo:

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
2007
MESES
JULIO AGOSTO SETIEMBRE
ACTIVIDADES
SEMANAS
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

FASE DE PLANEAMIENTO
Revisión Bibliografica
Elaboración del Proyecto
Presentación del Proyecto
Aprobación del Proyecto
Implementacion del Proyecto
FASE DE EJECUCION
Aislamiento de Azospirillum
Toma de muestra
Procesamiento de la muestra
Registro de datos
Analisis estadístico de datos
FASE DE COMUNICACIÓN
Analisis e intepretacion
Elaboración del informe
Presentación del informe

 Recursos disponibles

Personal:
- Técnicos del Laboratorio de Microbiologia
- Docente del area de Microbiología del Suelo

Equipos e instrumentos:
- Microscopiso electricos
- Centrifugas
- Estufa

Materiales y reactivos
- Placas de Petri
- Asa de Kolle
- Tubos de ensayo
- Agua destilada esteril
- Medio de cultivo NFb semigelificado “libre” de nitrógeno y con malato
como fuente de carbono
- Material biológico (gramineas)
- Pinzas
- Mecheros bunsen

Local:
- Laboratorio de Microbiología de Suelos – Facultad de Ciencias
Biológicas

 Presupuestos

Bienes:

- Material de escritorio:

CANTIDAD DESCRIPCION PRECIO

 100 Papel bond S/. 6.00
3 Lapiceros S/. 5.50
1 Corrector S/. 2.00
1 Marcador indeleble S/. 2.80
1 Juego de reglas S/. 2.50
1 Resaltador S/. 2.80
1 (clips) Clips S/. 2.50
3 Fólder Manila S/. 1.50
TOTAL S/. 25.60

- Material de laboratorio:

CANTIDAD DESCRIPCION PRECIO

8 Placas de Petri S/. 40.00
12 Tubos de ensayo medianos S/. 8.00
1 Gradilla S/. 5.00
1 (caja) Laminas porta objetos S/. 7.00
1 Mechero de vidrio S/. 8.00
1 L. Ron de quemar S/. 3.50
½ L. Alcochol de 96º S/. 1.50
1 Bolsa de algodon S/. 3.00
1 Asa de Kolle S/. 5.00
TOTAL S/. 81.00

- Material biológico:

Maíz …………. S/. 1.00

Arroz …………. S/. 1.50
Trigo …………. S/. 2.00
Total S/. 4.50

Material para procesamiento de datos:

S/.
Rollo fotografico 8.00
S/.
Cartuchos para tinta 25.00  C
S/. osto
Otros 8.00 total
S/. del
TOTAL 41.00
proyecto: S/. 152.10

 Financiamiento: Autofinanciamiento

PLAN DE INVESTIGACION
Realidad problemática

Aún cuando Spirillum lipoferum fue descrito en 1925 por Beijerinck, esta
bacteria estuvo olvidada por varias décadas. Son las observaciones de Peña-
Cabriales y Döbereiner en 1973 las que iniciarían la época moderna de esta
bacteria. Estudios taxonómicos de S. lipoferum conducen a su reclasificación
en un género nuevo, Azospirillum.
Actualmente son reconocidas seis especies en el género Azospirillum.
Las dos primeras en ser descritas fueron A. lipoferum y A. brasilense, siendo
éstas las mas ampliamente estudiadas. Posteriormente fueron descritas las
especies A. amazonense, A. halopraeferans, A. irakense y A. largomobile
siendo el nombre de esta especie corregido a A. largimobile. Pocos años antes
ésta especie fue considerada como un sinónimo de la especie A. lipoferum.
Recientemente, en honor de quien impulsara los estudios con este género
bacteriano y descubriera otros diazótrofos, se ha propuesto la especie
candidata A. doebereinerae.
Pocos años después del redescubrimiento de Azospirillum y hasta
alrededor de 1993, este género fue el mas estudiado entre las bacterias
asociadas a plantas. La capacidad de Azospirillum para estimular el crecimiento
de las plantas y de aumentar el rendimiento de los cereales promovió
numerosos estudios sobre la ecología, fisiología y genética de esta bacteria.
Los azospirilla muestran una muy amplia distribución geográfica
alrededor del mundo. Aún cuando son mas abundantes en las regiones
tropicales, también se les encuentra en las regiones templadas, frías y
desérticas. En las regiones templadas del sur de Brasil, los Estados Unidos y
Kenia la presencia de Azospirillum es menor al 10% en las muestras
analizadas. El pH del suelo juega un papel importante en la presencia de las
especies del género Azospirillum. Las especies de A. brasilense y A. lipoferum
se encuentran en mayor abundancia en suelos con valores de pH cercanos a la
neutralidad, aún cuando a pH abajo de 5 se les encuentra en forma esporadica
y no lográndose su aislamiento de suelos con pH menor a 4.5.
Un estudio en el que se evaluaron 23 tipos de suelos con características
diferentes mostró que algunos factores abióticos tales como porcentaje de
arcilla, contenido de materia orgánica, capacidad de retención de agua y
contenido de nitrógeno afectan positivamente la sobrevivencia de A. brasilense,
en tanto que el tamaño de las partículas de arena y especialmente la alta
concentración de carbonato de calcio afectan negativamente la sobrevivencia
de esta especie en ausencia de plantas. No obstante, la sobrevivencia de A.
brasilense en la rizosfera es independiente de la aridez del suelo.
Las bacterias del género Azospirillum han sido aisladas de la superficie
de la raíz de una muy amplia variedad de plantas y de su rizosfera, incluyendo
cereales como maíz, trigo, arroz, sorgo, avena, pastos forrajeros como
Cynodon dactylon, Poa pratensis, Festuca arundinacea, de diferentes especies
de Pennisetum y Panicum. Especies de Azospirillum fueron aisladas incluso del
henequén [Agave fourcroydes], y plantas cactáceas que incluyen diferentes
especies de Opuntia y Stenocereus. En algunos casos se logró confirmar el
aislamiento de A. brasilense y A. amazonense de semillas de pastos
esterilizadas superficialmente. Aun cuando no fueron identificados al nivel de
especie, algunas cepas de Azospirillum fueron aisladas de esporocarpos de los
hongos ectomicorrízicos Hebeloma crustuliniforme, Laccaria laccata y
Rhizopogon vinicolor.
Ante la información obtenida anteriormente por las investigaciones
realizadas, se haria de vital importancia determinar si en nuestra localidad se
encuentra tambien como un simbionte rizosférico el género Azospirillum y sobre
todo proveer información de que especies en concreto de dicho género estan
presentes en la agricultura de gramíneas de la localidad.

Justificación e importancia

La inoculación de diversas plantas con Azospirillum ha mostrado que los

principales sitios de colonización son las areas de elongación celular y las
bases de los pelos radicales. Sólo algunas células de Azospirillum llegan a
adherirse a la cofia o a los pelos radicales. Sin embargo, fue observada la
presencia de Azospirillum dentro del mucigel que se acumula en la cofia. La
inoculación de raíces de trigo con una cepa de Azospirillum que expresa
constitutivamente el gen reportero gusA mostró que en los primeros días de la
asociación las células bacterianas colonizan específicamente los sitios de
emergencia de las raíces laterales y las regiones de los pelos radicales, tanto
de la raíz primaria como de las raíces secundarias y posteriormente la
superficie de la raíz. En plantas de trigo fue observado que la inoculación de
Azospirillum induce cambios en la morfología de los pelos radicales, siendo
éstos cambios significativamente mayores que los causados por Rhizobium
leguminosarum o Azotobacter chrococcum, los cuales son mínimos. Además,
fue observado que la inoculación con 105 a 106 células de Azospirillum causa
tanto la elongación como el aumento de la superficie total de la raíz, en tanto
que la inoculación de 108 a 109 células causan la inhibición del desarrollo de
ésta.
Considerando la capacidad de Azospirillum para asociarse con plantas
de interés agrícola, así como su capacidad para fijar N2 en medios de cultivo,
se diseñaron numerosos experimentos para evaluar el efecto de la inoculación
sobre el crecimiento de las plantas. No existen reportes que indiquen efectos
patogénicos en las plantas causadas por la inoculación de Azospirillum. El
único reporte existente en esta dirección indica que ninguna de las especies de
Azospirillum causa sintomas visibles de enfermedad sobre la raíz o las hojas de
plantas de trigo, algodón o tomate. Con la inoculación de Azospirillum se
observó frecuentemente un mayor desarrollo del sistema radical el cual se
traduce en mayor superficie de absorción de nutrientes, así como en mayor
desarrollo de la parte aérea de las plantas. También fueron observados
incrementos en el contenido de nitrógeno, fósforo, potasio y otros minerales en
las plantas inoculadas. Principalmente con A. brasilense y A. lipoferum se
llevaron a cabo gran cantidad de experimentos en muchos países para evaluar
su efecto sobre el rendimiento de los cultivos.
Frecuentemente se observó que la inoculación de los cultivos
con Azospirillum permite reducir en 40-50% el nivel de los
fertilizantes sin que exista disminución en el rendimiento de la
cosecha.
Recientemente fueron observados incrementos en la biomasa
de pastizales naturales inoculados con A. brasilense aun bajo
condiciones de crecimiento subóptimas.
 Algunas compañias en diferentes países han registrado inoculantes de
Azospirillum para maíz y otros cultivos. Burdman y col. refieren que en
Sudafrica se lleva a cabo la producción de inoculantes a base de Azospirillum
para 150,000 hectáreas de maíz y 12,000 de trigo. Algunas características de la
producción de inoculantes a base de Azospirillum han sido discutidas.
Aun cuando el uso de Azospirillum como bioestimulante del crecimiento
de las plantas no se ha generalizado mundialmente, en México la aplicación de
ésta bacteria en diferentes cultivos ha revasado con mucho lo hecho en otros
países. En el ciclo agrícola primavera-verano (PV) del año 1999 la Secretaría
de Agricultura, a través de su Instituto Nacional de Investigaciones Forestales
Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) y de la Fundación Mexicana para la
Investigación Agropecuaria y Forestal, A.C., en colaboración con el Centro de
Investigación sobre Fijación de Nitrógeno-UNAM, llevó a cabo la inoculación de
alrededor de 450,000 hectáreas de maíz y 150,000 hectáreas de sorgo, cebada
y trigo, empleando cepas de Azospirillum seleccionadas por su capacidad para
promover el crecimiento de las plantas e incrementar el rendimiento de los
cultivos.
En la actualidad hacen falta muchos estudios de investigación
básica, tanto sobre la bacteria como en su interacción con la planta,
para un mejor entendimiento de la asociación Azospirillum-planta. No
obstante, la aplicación de Azospirillum como bioestimulante que
incrementa la producción de los cultivos deberia extenderse a todos
aquéllos lugares donde la aplicación de fertilizantes es nula o escasa
(caso existente en muchas zonas agrícolas pobres del país, sobre todo
en la serranía). En las regiones donde se practica una agricultura
moderna, la inoculación con Azospirillum permitiría reducir las
elevadas cantidades de fertilizantes que generalmente se aplican y
con ello disminuir tanto el costo de producción como los problemas
derivados de su uso, principalmente la contaminación, sin detrimento
de la producción.
En nuestro caso, como parte del proyecto, solo se trataría de
aislar e indentificar especies del genéro Azospirillum, que son propias
de la localidad.

Objetivos

- Aislar bacterias del genéro Azospirillum a partir de raíces de

gramíneas.
- Realizar la identificación de especie de las bacterias aisladas.
- Realizar tincion flagelar y otros tipos de tinciones que
demuestren la morfología típica de la bacteria.

Material y métodos (procedimiento)

 Materiales

- Placas de Petri
- Asa de Kolle
- Tubos de ensayo
- Agua destilada estéril
 - Macetas
- Suelo estéril
- Raíces de gramíneas diversas (arroz, maíz, trigo)
- Semillas pregerminadas de gramíneas
- Láminas porta objetos
- Reactivos para tinción
- Mecheros

 Métodos

Aislamiento de Azospirillum

- Realizar el lavado de las raices previamente cortadas a 1 cm

de longitud en agua destilada estéril tres veces.
- Depositar con el asa de Kolle las raíces en los tubos
conteniendo medio de cultivo.
- Llevar a incubar durante tres días a una temperatura de 28º
C.
- Luego de la incubación en el tubo se debe observar una zona de
interfase (microaerofilia).
- Luego proceder con el sembrado en placa para aislar y poder
observar las colonias características
- Realizar tinción de Gram y coloración de flagelos.

Experimento

- Con las cepas aisladas, coloreadas y comprobadas, preparar tres

macetas con suelo estéril y con inoculación de Azospirrillum en
semillas pregerminadas en pasto sudan y dos macetas controles (sin
inoculación).
- Regar las macetas por 30 días con agua hervida fría y verificar la
humedad (al escarbar).
- Luego aislar Azospirillum de los maceteros y observar los cambios y
diferencias producidas entre los maceteros control y los maceteros
inoculados.

Referencias

- A. CURA, Jóse y otros. (2002). Utilidad de las bacterias

promotoras del crecimiento y fijadoras de nitrógeno en el
cultivo del arroz durante las primeras etapas del desarrollo.
Depto. Biología Aplicada y Alimentos, Facultad de Agronomía.
Universidad de Buenos Aires.
- CABALLERO MELLADO, Jesús. (2001). El género Azospirillum.
Programa de Ecología Molecular y Microbiana, Centro de
Investigación sobre Fijación de Nitrógeno, UNAM. México.
- LABANDERA, C. y otros (2002) Aislamiento y caracterización
de microorganismos fijadores de nitrógeno en plantas de
avena y arroz. CONICYT-BID. INIA.

- M. da Silva Brasil y Divan Baldani, V. L. (1999). Efeitos da inoculação

de bactérias diazotróficas em gramíneas forrageiras do Pantanal.
EMBRAPA Agrobiología. Brasil.

- SOLEDAD DACCARO, Betina y otros (2002). Inoculación con

Azospirillum brasilense en el Cultivo de Maíz. Area de
Microbiología Agrícola U.N.L.