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FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU Curso de Ps-Graduao em Medicina Veterinria

DETECO DE CAMPYLOBACTER
Raquel de Queiroz Fagundes
Mdica Veterinria

Disciplina: Cincia e Tecnologia da Carne Prof. Roberto de Oliveira Roa


Departamento de Gesto e Tecnologia Agroindustrial Fazenda Experimental Lageado, Caixa Postal, 237 F.C.A. - UNESP - Campus de Botucatu CEP 18.603-970 - BOTUCATU - SP robertoroca@fca.unesp.br

DETECO DE CAMPYLOBACTER

1 - INTRODUO

A ocorrncia de doenas alimentares por Campylobacter vem sendo relacionada ao consumo de produtos de origem animal, incluindo principalmente os de procedncia avcola, em decorrncia da contaminao das carcaas aps a eviscerao e contaminao das superfcies de manipulao aps o manuseio inadequado das carcaas. Paralelamente, tambm tem-se verificado o aumento no nmero de distrbios gastrentricos no homem, especialmente em crianas e em indivduos com sndrome da imunodeficincia adquirida (AIDS), atribudos principalmente ao Campylobacter jejuni. A inobservncia destes procedimentos higinico-sanitrios tem permitido a veiculao para o homem pelo Campylobacter jejuni e do Campylobacter coli, microrganismos potencialmente zoonticos e atualmente responsabilizados como principais causadores de diarrias em seres humanos, particularmente em crianas. Os membros do gnero Campylobacter so definidos como bastonetes Gram negativos curvos ou espiralados, no-esporognicos, oxidase positivos e urease negativos. Apresentam arranjo tpico em forma de S ou asa de gaivota, quando duas clulas formam pequenas cadeias, e motilidade caracterstica, com movimentos tipo saca-rolha ou vaivm. So tipicamente microaerfilos, requerendo baixas concentraes de oxignio (3-6%) e altas concentraes de CO2 (3-10%) para crescimento. Apresentam metabolismo energtico oxidativo, porm no utilizam carboidratos como fonte de energia, sempre derivada da oxidao de aminocidos ou cidos intermedirios do ciclo do cido tricarboxlico. So inativos na maioria dos testes bioqumicos convencionais e crescem numa faixa de temperatura pouco comum para bactrias (25-43oC), sendo considerados termotolerantes. Entretanto, no so termorresistentes, sendo facilmente destrudos pela pasteurizao. As cepas do gnero Campylobacter encontram-se em fase de reclassificao, com vrias alteraes propostas nos ltimos 10 anos e novas mudanas esperadas para o futuro. Atualmente, o gnero composto por 17 espcies, subespcies e bitipos oficialmente reconhecidos e uma espcie (C. 1

upsaliensis), proposta mas ainda no reconhecida. De modo geral, as cepas mais freqentemente associadas com doenas humanas pertencem s espcies catalase positivas C. jejuni (agora subdividida nas subespcies C. jejuni subsp. jejuni e C. jejuni subsp. doylei), C. coli, C. lari (espcie nova), C. fetus (supsp. fetus), C.

hyointestinalis (espcie nova), C. cinaedi (espcie nova) e C. fennelliae (espcie nova), cujas caractersticas encontram-se descritas na Tabela 1. Trs espcies de Campylobacter so normalmente associadas com gastrenterites agudas veiculadas por alimentos: C. jejuni, C. coli e C. lari. C. jejuni comumente encontrado no trato intestinal de animais como ces, gatos, carneiros, aves e bovinos, sendo transmitido predominantemente por alimentos de origem animal, particularmente leite cru e carne de aves. C. coli e C. lari tambm so encontrados no trato intestinal de animais, porm so muito menos freqentes, como agentes de gastrenterites alimentares, do que C. jejuni. Essas trs espcies apresentam temperatura tima de crescimento na faixa de 42-43oC, no crescendo abaixo de 30oC. Sobrevivem melhor s temperaturas de refrigerao do que a 25oC, na qual o nmero de clulas viveis reduzido rapidamente e so extremamente sensveis ao congelamento e concentrao de oxignio do ar. A atmosfera tima para crescimento composta de 5% de O2, 10% de CO2 e 85% de N2 e so favorecidas pela presena de agentes redutores nos meios de cultura, sendo comum a adio de sulfato ferroso, metabissulfito de sdio e piruvato de sdio, na concentrao de 0,025% cada. Na deteco de Campylobacter em alimentos, deve ser levado em considerao o fato de que a populao presente nos produtos normalmente baixa, devido ao no crescimento em temperaturas abaixo de 30C e extrema sensibilidade concentrao de oxignio do ar (21%). O sucesso da deteco geralmente depende da anlise de um nmero grande de amostras, concentrao das clulas presentes e enriquecimento seletivo em condies microaerfilas, temperatura de 42C, tima para C. jejuni, C. coli e C. lari. A manuteno de condies seletivas, tanto no enriquecimento quanto no plaqueamento subseqente, garantida pela utilizao de meios nutritivos (Caldo/gar Brucella, Caldo/gar Nutriente No 2) suplementados com sangue de cavalo ou carneiro e diferentes combinaes de alguns dos seguintes antibiticos: vancomicina, polimixina, cicloeximida, trimetroprima, rifampicina, cefoperazona, anfotericina, cefalotina, colistina, cefazolina, novobiocina e bacitracina. 2

TABELA 1 - Principais caractersticas das espcies de Campylobacter (HOLT et al., 1994)

TESTE

C. jejuni subsp. jejuni

C. jejuni subsp. doylei w +

C. coli

C. lari

C. fetus subsp. fetus

C.

fetus C. hyointestin alis + + +

C. cinaedi

C. fennelliae

subsp. venerealis + -

Crescimento a 25 C Crescimento a 42 C Crescimento glicina Crescimento NaCl Crescimento TMAO Sensibilidade ao cido nalidxico (discos 30 g) Sensibilidade cefalotina (discos 30 g) Teste de catalase Utilizao da glicose Reduo do nitrato H2S (TSI) em em em

+ 1% +

+ +

+ +

+ d +

+ +

3,5% -

0,1% -

R + + -

S + -

d + + +a

R + + -

S + + -

S + + -

S + + +

R + + -

S + 3

H2S

(tiras

acetato +

chumbo) H2S (SIM) Hidrlise do hipurato + -

a = produo de H2S na gua de cinerese da rampa + = 90% ou mais cepas so positivas em 48h - = 90% ou mais cepas so negativas em 48h d = 11-89% das cepas so positivas

w = fracamente positivo TMAO = xido de N-trimetilamina TSI = gar Trplice Acar Ferro SIM = gar Sulfeto Indol Mortilidade

2 - MATERIAL REQUERIDO PARA A ANLISE

Enriquecimento e Plaqueamento Seletivo de superfcie Caldo de Enriquecimento de Doyle e Roman, Caldo de Enriquecimento de

Caldo Brucella para lavagem de superfcie ou swabs estreis para esfregao

Preston ou Caldo de Enriquecimento de Wesley Placas de gar de Blaser (Campy-BAP) e gar Campylobacter Charcoal Diferencial (CCDA) Placas de gar de Skirrow ou gar de Butzler (opcionais) Centrfuga com resfriamento a 4C Sistema de gerao de atmosfera microaerfila Estufa incubadora ou shaker incubador a 42C

Confirmao < Tubos de gar Infuso de Corao (HIA) inclinados < Tubos de Caldo Infuso de Corao (HIB) < Tubos de gar Infuso de Corao com 5% de sangue de coelho desfibrinado (HIA-RB) inclinados < Tubos de Caldo Infuso de Corao (HIB) suplementados com 0,002% de nitrato de potssio < Placas de gar Infuso de Corao com 5% de sangue de coelho desfibrinado (HIA-RB) < Tubos de Meio Teste de Fermentao da Glucose para Campylobacter < Tubos de Meio de Oxidao Fermentao da Glucose para Campylobacter < Tubos de Caldo Brucella suplementados com 0,16% de gar e 3,5% de NaCl 5

< Tubos de Caldo Brucella suplementados com 0,16% de gar e 1% de glicina < Tubos de Caldo Brucella suplementados com 0,16% de gar e 0,02% de cistena - HCI < Tubos de Meio de xido de Trimetilamina (TMAO) < Tubos de gar Trplice Acar Ferro (TSI) < Tubos de gar Sulfeto Indol Motilidade (SIM) < Tubos com 0,4 ml de soluo aquosa 1% de hipurato de sdio < Reagentes de Gram modificados por Hucker para Campylobacter < Discos de cido nalidxico (30 g) e cefalotina (30 g) < Reagente de Kovacs para teste de oxidase (soluo aquosa 1% de cloridrato de N,N,N,N-tetrametil-p-fenilenodiamina) < Perxido de hidrognio 3% < Tiras de acetado de chumbo < Soluo de ninidrina 3,5% < Reagentes de nitrato para Campylobacter (A = soluo de cido sulfanlico, B = soluo de dimetil-alfa-naftilamina, p de zinco)

3 - PROCEDIMENTO

Ateno! Amostras destinadas deteco de Campylobacter devem ser analisadas o mais rapidamente possvel, no devendo ser congeladas, em funo da alta sensibilidade desses microrganismos ao congelamento. Havendo

necessidade de estocagem mais prolongada, as condies ideais para garantir a sobrevivncia das clulas so a manuteno a 4C em atmosfera de 100% de N2 com 0,01% de bissulfito de sdio ou a transferncia para uma igual quantidade de Meio de Transporte de Cary-Blair e manuteno a 4C.

a) Enriquecimento seletivo

a1) Amostras de carcaas, cortes de aves e cortes de carne bovina ou suna. Acondicionar em um saco plstico estril, juntar 250 ml de Caldo

Brucella ou outro caldo adequado e lavar a superfcie das amostras, massageando bem para remover os microrganismos aderidos. Filtrar o caldo de lavagem em duas camadas de gaze estril e centrifugar o filtrado a 16.000 x g/4C/10 min. Descartar o sobrenadante e suspender o material slido em 2-5 ml de um dos seguintes caldos de enriquecimento seletivo: Caldo de Enriquecimento de Doyle e Roman, Caldo de Enriquecimento de Preston ou Caldo de Enriquecimento de Wesley. Acondicionar em um jarro de anaerobiose e substituir o ar por uma atmosfera microaerfila com 5% O2, 10% CO2 e 85% N2. A substituio pode ser feita pelo processo de exausto do ar e introduo da mistura microaerfila de gases (repetir a exausto e a injeo por 3-4 vezes) ou pela utilizao de sistemas de gerao de atmosfera microaerfila, disponveis comercialmente com os seguintes cdigos: Campylobacter Microaerophilic System (DIFCO 1956 ou 1958) Campylobacter Gas Generating Kit (OXOID BR 56A ou BR 60A) Anaerocult C (MERCK 16275) Incubar os jarros a 42C/48h ou, na disponibilidade de um agitador incubador com temperatura controlada, a 42C/18-24h com agitao.

a2) Amostras de meias-carcaas ou grandes peas de carne bovina e suna e superfcies de equipamentos. Com swabs estreis umedecidos no caldo de enriquecimento, amostrar pelo menos cinco reas de 10 cm2 da amostra a ser analisada, recorrendo ao auxlio de delimitadores de superfcie, para demarcar as regies de amostragem. Transferir os swabs para um tubo com tampo de algodo e 25 ml de um dos caldos de enriquecimento indicados para carcaas de aves (item 18.3.al). Transferir os tubos para um jarro de anaerobiose e substituir o ar por uma atmosfera microaerfila, seguindo o mesmo procedimento recomendado no item 18.3.al e incubar a 42C/48h sem agitao, ou 42C/18-24h com agitao. a3) Amostras de alimentos lquidos. Centrifugar 250 ml da amostra a 16.000 x g/4C/10 min, descartar o sobrenadante e suspender o material slido em 2-5 ml de um dos caldos de enriquecimento indicados para carcaas de aves (item 18.3.a1). Acondicionar em um jarro de anaerobiose e substituir o ar por uma atmosfera microaerfila, seguindo o mesmo procedimento 7

recomendado no item 18.3.al e incubar a 42C/48h sem agitao, ou 42C/18-24h com agitao.

a4) Amostras de alimentos slidos em geral. Suspender 25g da amostra em 100 ml de um dos caldos de enriquecimento indicados para carcaas de aves (item 18.3.al) e homogeneizar em liqidificador ou stomacher. Transferir a amostra homogeneizada para um Erlenmeyer com tampo de algodo, acondicionar em um jarro de anaerobiose e substituir o ar por uma atmosfera microaerfila, seguindo o mesmo procedimento recomendado no item 18.3.al. Incubar a 42C/48h sem agitao, ou 42C/18-24h com agitao.

Nota a1) PARK, SANDERS (1989) desenvolveram um mtodo de enriquecimento seletivo com uma etapa de reparao de injrias, recomendado pelos autores para a anlise de frango congelado. O mtodo consiste na preparao das amostras, seguindo o mesmo procedimento descrito no item 18.3.al, usando o Caldo de Enriquecimento de Park, Sanders, isento dos agentes seletivos cefoperazona e cicloeximida, como meio de enriquecimento inicial. As amostras concentradas e suspendidas no caldo de enriquecimento so submetidas a um perodo inicial de incubao a 31-32C/3-4h em atmosfera microaerfila, sem agitao, seguindo-se a adio da cefoperazona (32 mg/l) e da cicloeximida (100 mg/l). Recompe-se a atmosfera microaerfila, incuba-se a 3537C/2h, sem agitao e em seguida transfere-se o jarro para um agitador incubador com temperatura controlada a 42C, mantendo a incubao por 40-42h, com agitao.

b)

Plaqueamento diferencial. A partir de cada tubo ou frasco de caldo de enriquecimento, estriar uma alada em uma placa de gar de Blaser (CampyBAP) e uma alada em uma placa de gar Campylobacter Charcoal Diferencial (CCDA). Opcionalmente, ainda podem ser utilizados o gar de Skirrow e o gar de Butzler, em substituio ao CCDA ou Campy-BAP. Acondicionar as placas em um jarro com atmosfera microaerfila e incubar a 42C/48h. Ateno! Para evitar a ocorrncia de crescimento confluente, caracterstico de 8

Campylobacter, que impede o desenvolvimento de colnias isoladas, recomenda-se que as placas sejam mantidas a 30C por uma noite, para completa secagem da superfcie do meio, ou que seja colocado um pedao de papel de filtro com 4-5 gotas de glicerol no jarro de incubao.

c)

Confirmao. Selecionar uma ou mais colnias tpicas de cada placa, para os testes de confirmao. As colnias de Campylobacter nos diversos meios de plaqueamento so semelhantes, podendo apresentar-se lisas, convexas e brilhantes, com bordas perfeitas, ou planas, translcidas e lustrosas, com bordas irregulares e espalhadas. Geralmente so incolores, levemente creme ou acinzentadas, com dimenso variando de puntual a 4-5 mm. Nos meios com sangue (gar de Blaser, Skirrow ou Butzler), no apresentam hemlise. Inocular cada colnia em tubos de gar Infuso de Corao com 5% de sangue de coelho desfibrinado (HIA-RB) inclinados e incubar a 42C, em atmosfera microaerfila, at crescimento visvel (geralmente 24 h). Preparar uma montagem mida para observao da forma e motilidade das clulas e um esfregao para colorao de Gram, que deve ser feita com os reagentes de Gram modificados por HUCKER para Campylobacter. Campylobacter

apresenta clulas Gram negativas em forma de bastonetes curvos ou espiralados, com arranjo tpico em forma de asa de gaivota e motilidade caracterstica em movimentos tipo saca-rolha ou vaivm. Para a realizao das provas bioqumicas, transferir as culturas de gar HIA-RB para tubos com 5 ml de Caldo Infuso de Corao (HIB), ajustando a densidade de clulas para o ponto no 1 da escala de McFarland. Utilizar essa suspenso para inocular os diversos meios de testes bioqumicos.

c1) Teste de sensibilidade ao cido nalidxico e cefalotina. Transferir 0,1 ml da suspenso da cultura para a superfcie de uma placa de gar Infuso de Corao com 5% de sangue de coelho desfibrinado (HIA-RB) e espalhar com o auxlio de uma ala de Drigalski. Colocar um disco de cido nalidxico (30 g) e um disco de cefalotina (30 g) na superfcie do meio

inoculado, em pontos bem distanciados um do outro. Incubar a placa a 3537C/72h, em atmosfera microaerfila, at crescimento visvel (geralmente 9

24 horas). As cepas sensveis aos antibiticos testados no crescero na regio em redor dos discos, formando um halo de inibio.

c2) Teste de crescimento a 25 e 42C. Umedecer um swab estril com a suspenso da cultura e inocular na superfcie de duas placas de gar Infuso de Corao com 5% de sangue de coelho desfibrinado (HIA-RB), fazendo uma nica estria de cada cultura ( possvel inocular at 4 culturas por placa). Incubar uma placa a 25C/72h e outra a 42C/72h, em atmosfera microaerfila. C. jejuni, C. coli e C. lari no crescem a 25C e crescem a 42C, embora C. jejuni subsp. doylei apresente crescimento pobre a 42C.

c3) Teste de oxidao/fermentao da glicose. Para o teste de fermentao, inocular 0,1 ml da suspenso de cada cultura em tubos de Meio Teste de Fermentao da Glicose para Campylobacter e incubar a 35-37C/72h com as tampas afrouxadas, em atmosfera microaerfila. A fermentao da glicose indicada pela viragem cida do indicador de Andrade, alterando a cor original do meio de incolor ou amarelado para vermelho. Para o teste de oxidao, inocular uma pequena quantidade da cultura obtida na placa de HIA-RB utilizada no teste de sensibilidade cefalotina e cido nalidxico, por picada, em tubos de Meio de Oxidao Fermentao da Glucose para Campylobacter. Incubar os tubos a 35-37C/72h com as tampas afrouxadas, em atmosfera microaerfila. Incubar, tambm, nas mesmas condies, um tubo no inoculado para controle. A oxidao da glicose indicada pela viragem cida do vermelho de fenol, alterando a cor do meio de vermelho para amarelo, porm, Ateno! O meio de oxidao fermentao da glicose vai apresentar uma colorao amarela logo que for removido da incubao, devido absoro do CO2 da atmosfera. Antes da leitura dos resultados, os tubos devem ser mantidos por 1 a 2h em atmosfera normal, temperatura ambiente, para que a cor volte condio original, indicada pelo tubo-controle. Nenhuma cepa de Campylobacter

fermenta ou oxida a glicose ou qualquer outro carboidrato.

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c4) Teste de oxidase. Adicionar 0,1 ml da suspenso de cada cultura na rampa de tubos de gar Infuso de Corao (HIA), estriar com uma ala de inoculao e incubar a 35-37oC/72h com as tampas desrosqueadas, em atmosfera microaerfila. Para a realizao do teste, colocar um disco ou fita de papel de filtro no interior de uma placa de Petri e embeber o centro do papel com o reagente de Kovacs para teste de oxidase (soluo aquosa 1% de cloridrato de N,N,N,N-tetrametil-p-fenilenodiamina).

Preferencialmente, utilizar discos ou tiras impregnados com o reagente, disponveis comercialmente. Com uma ala de platina ou palitos estreis, remover uma pequena quantidade da cultura dos tubos de HIA e espalhar sobre o reagente no papel, observando se ocorre o desenvolvimento de uma cor azul intensa, em aproximadamente 10 segundos (teste positivo). O no-desenvolvimento da cor azul no intervalo de 1 minuto indica teste negativo. Todas as cepas de Campylobacter so oxidase positivas. Ateno! No devem ser utilizadas alas de nquel-cromo na transferncia do inculo para o teste de oxidase. Os traos de ferro presentes no metal podem catalisar a oxidao do reagente, resultando em falsas reaes positivas. No considerar qualquer alterao da cor do reagente aps 1 minuto de contato com a cultura. O reagente de Kovacs extremamente sensvel, produzindo resposta positiva em poucos segundos.

Desenvolvimento tardio de cor azul pode ser devido autoxidao do reagente e a leitura do resultado aps o intervalo recomendado pode resultar em falsas reaes positivas. No cultivar culturas destinadas ao teste de oxidase em meios contendo glucose. A fermentao desse carboidrato inibe a atividade de oxidase e pode resultar em falsas reaes negativas. O reagente de Kovacs instvel, devendo ser preparado no dia do uso. Havendo interesse em estocar, deve-se distribuir pores de 1-2 ml em frascos escuros e manter sob congelamento (-20oC) at o momento do uso. O descongelamento deve ser feito 3 a 4 horas antes do uso e todo o volume descongelado no utilizado deve ser descartado.

c5) Teste de crescimento em 3,5% de NaCl. Adicionar 0,1 ml da suspenso de cada cultura em tubos de Caldo Brucella suplementado com 0,16% de gar e 3,5% de NaCl. Incubar a 35-37oC/72h com as tampas 11

desrosqueadas, em atmosfera microaerfila e observar a ocorrncia ou no de crescimento. Nenhuma cepa de Campylobacter cresce na presena de 3,5% de NaCl.

c6) Teste de catalase. Adicionar 0,1 ml da suspenso de cada cultura na rampa de tubos de gar Infuso de Corao (HIA), estriar com uma ala de inoculao e incubar 35-37oC/72h com as tampas desrosqueadas, em atmosfera microaerfila. Para a realizao do teste, transferir uma alada da cultura para uma gota de perxido de hidrognio 3%, em uma lmina de microscopia e observar se ocorre borbulhamento imediato (teste positivo) ou no (teste negativo). Se necessrio, para facilitar a visualizao, utilizar uma lupa ou uma lente de aumento manual. Alternativamente, o teste pode ser realizado adicionando-se vrias gotas da gua oxigenada cultura na rampa do meio de cultura, porm, Ateno! Esse procedimento nunca deve ser realizado com culturas cultivadas em meio contendo sangue, porque os glbulos vermelhos provocam falsas reaes positivas. As cepas de C. jejuni, C. coli e C. lari so catalase positivas.

c7) Teste de reduo do nitrato. Adicionar 0,1 ml da suspenso de cada cultura na rampa de tubos de Caldo Infuso de Corao (HIB) suplementado com 0,002% de nitrato de potssio. Incubar a 35-37%C/72h com as tampas desrosqueadas, em atmosfera microaerfila. Para a realizao do teste, adicionar a cada tubo de cultura, 5 gotas de cada um dos reagentes de nitrato para Campylobacter (A = Soluo de cido sulfanlico; B = Soluo de dimetil--naftilamina) e observar o

desenvolvimento de uma cor vermelha em 1-2 minutos (teste positivo). No havendo desenvolvimento da cor, adicionar cultura uma pitada de p de zinco e observar o desenvolvimento ou no de uma cor vermelha em 5-10 minutos. A ocorrncia da cor vermelha indica a presena de nitrato no meio (no-reduo), teste negativo. O no desenvolvimento da cor indica ausncia de nitrato no meio (reduo), teste positivo. As cepas de C. jejuni subsp. jejuni, C. coli e C. lari reduzem o nitrato. As cepas de C. jejuni subsp. doylei no reduzem.

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c8) Teste de crescimento em 1% de glicina. Adicionar 0,1 ml da suspenso de cada cultura em tubos de Caldo Brucella suplementado com 0,16% de gar e 1% glicina. Incubar a 35-37C/72h com as tampas desrosqueadas, em atmosfera microaerfila e observar a ocorrncia ou no de crescimento. As cepas de C. jejuni, C. coli e C. lari crescem na presena de 1% de glicina.

c9) Teste de crescimento anaerbio na presena de 0,1% de xido de trimetilamina (TMAO). A partir da placa de HIA-RB obtida no teste de sensibilidade cefalotina e cido nalidxico, transferir uma pequena quantidade da cultura para uma agulha de inoculao e inocular, por picada, os tubos de TMAO, at uma distncia a 2/3 do fundo dos tubos. Incubar a 35-37C/7 dias, com as tampas afrouxadas, em atmosfera anaerbia e observar a ocorrncia ou no de crescimento. Para obteno da atmosfera anaerbia, seguir as orientaes do item 8.3.l.(c). As cepas de C. jejuni e C. coli no crescem em condies anaerbias na presena de 0,1% de xido de trimetilamina, enquanto C. lari cresce. c10) Teste de produo de H2S com tiras de acetato de chumbo. Adicionar 0,1 ml da suspenso de cada cultura em tubos de Caldo Brucella suplementado com 0,16% de gar de 0,02% de cloridrato de cistena. Colocar uma tira impregnada com acetato de chumbo (H2S Test Strip, DIFCO 1626) na parte superior do tubo, prendendo uma extremidade na boca do tubo, ao rosquear a tampa e mantendo a outra extremidade cerca de 10 mm da superfcie, porm, sem entrar em contato com o meio de cultura, porque o reagente txico para as culturas. Na indisponibilidade de tiras comerciais, recortar tiras de papel de filtro (5 x 70 mm), embeber em uma soluo saturada de acetato de chumbo e secar em estufa a 70C/2-3h. Incubar os tubos a 35-37C/72h com as tampas ligeiramente afrouxadas, em atmosfera microaerfila e observar se h ocorrncia de escurecimento da tira (teste positivo). C. jejuni, C. coli e C. lari apresentam reao positiva no teste com acetato de chumbo.

c11) Teste de produo de H2S em gar Trplice Acar Ferro (TSI) ou gar Sulfeto Indol Motilidade (SIM). A partir da placa de HIA-RB obtida no 13

teste de sensibilidade cefalotina e cido nalidxico, inocular uma pequena quantidade da cultura em tubos de gar TSI inclinados, por picada e estrias na rampa. Repetir esse procedimento com tubos de gar SIM, inoculando as culturas por picada. Incubar os tubos 35-37C/72h com as tampas afrouxadas, em atmosfera microaerfila. Observar se h ocorrncia de escurecimento do meio, por precipitao de sulfeto de ferro, preto (teste positivo), ou no (teste negativo). As cepas de C. jejuni e C. lari no apresentam reao positiva nesses meios, enquanto C. coli pode apresentar reao positiva em TSI com precipitao de sulfeto de ferro na gua de cinerese da base da rampa.

c12) Teste de hidrlise de hipurato. Preparar previamente tubos de 10 x 100mm com 0,4 m de soluo aquosa de hipurato de sdio 1% e estocar sob congelamento. No momento do uso, descongelar a soluo de hipurato de sdio e, a partir da cultura obtida na placa de HIA-RB utilizada no teste de sensibilidade cefalotina, transferir uma alada com inculo pesado da cultura para os tubos de hipurato de sdio, emulsionando bem. Incubar a suspenso em banho-maria a 37C/2h e, em seguida, cobrir a superfcie do lquido com 0,2 ml de uma soluo de ninidrina 3,5% (3,5g de ninidrina dissolvidos em 100 ml de solvente composto por acetona/butanol 1:1). Sem agitar os tubos, reincubar a 37C/10 min e observar se ocorre o desenvolvimento de uma cor roxa intensa (teste positivo) ou se a suspenso permanece incolor ou ligeiramente prpura (teste negativo). As cepas de C. jejuni hidrolisam o hipurato, enquanto C. coli e C. lari no hidrolisam.

5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
AUGUSTO FILHO, O. Isolamento de Campylobacter em carcaas de frangos, resfriadas, comercializadas no municpio de Botucatu SP. Botucatu, 2000. (Projeto para Dissertao de Mestrado apresentado Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, UNESP, rea de Concentrao: Vigilncia Sanitria).

HOLT, J.G. et al. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 9. ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1994.

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KRIEG, N.R., HOLT, J.G. Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, Baltimore: Williams & Wilkins, 1984, v.1. MacFADDIN, J.E. Biochemical tests for identification of medical bacteria, 2. ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980. VANDERZANT, C., SPLITTSTOESSER, D.F. Compendium of methods for the microbiological examination of foods, 3.ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 1992, 1919p.

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