Bases moleculares del iRNA y aspectos aplicados

Introduccin
La investigacin bsica en biologa molecular comenz con el DNA, una molcula que porta toda la informacin necesaria para generar nuevos organismos de su propio tipo. Esto fue seguido por la era de estudios sobre protenas, las molculas que confieren funcionalidad a la clula. Sin embargo, el RNA ha permanecido ignorado como un mero intermediario de las molculas que llevan la informacin y desempean las funciones, y solo recientemente se ha comenzado a comprender el inmenso peso en la tarea de regulacin de la informacin que estas molculas poseen. Adems de los diferentes clases de RNA aceptados, el descubrimiento reciente de los pequeos RNAs (~19-30 nts), los cuales se pensaba que eran nicamente productos de degradacin de molculas de mayor tamao, condujo al establecimiento de una clase de RNA independiente. Esta clase de RNA se piensa actualmente que gobierna los diversos procesos celulares a lo largo del reino eucariota. Mientras que la tecnologa de antisentido fue el primer mtodo que empleaba cidos nucleicos sintticos para alterar la expresin gnica, otras metodologas han surgido desde entonces que emplean oligonucletidos como instrumentos para regular los niveles de expresin a travs de muy diferentes mecanismos de accin. Esos mtodos incluyen ribozimas, aptameros, y los ms recientemente, los RNA interferentes (Los largos dsRNAs son procesados en especies de menor tamao que son las molculas efectoras reales que desencadenan la respuesta de iRNA. Esas especies pequeas, denominadas RNAs pequeos interferentes (siRNAs), son funcionales en clulas de mamferos y siRNAs sintticos pueden ser usados con relativa seguridad para activar experimentalmente la va del iRNA. iRNA). La iRNA es una va anciana que est presente en plantas, mamferos e incluso en algunos hongos. En los sistemas primitivos, iRNA puede ser efectivamente desencadenado por la presencia de especies de dsRNA largas, mientras que en los organismos superiores, las largos dsRNA tambin desencadenan respuestas inmunes innatas y su uso puede ser txico como analizaremos posteriormente (activando por ejemplo la respuesta mediada por interfern). El RNA interferente (iRNA) fue descubierto como convergencia de tres lneas de investigacin no relacionadas; el trabajo ms familiar es el del laboratorio de Andrew Fire y Craig Mello, cuyo trabajo fue publicado en la revista Nature en 1998 .En su artculo en Nature, Fire y Mello comprobaron los efectos fenotpicos de inyectar RNA dentro del gusano C.elegans, estableciendo que el RNA de doble cadena, pero no el DNA sentido ni antisentido por separado, provocaba cambios fenotpicos. Adems solo la inyeccin de RNA bicatenario (dsRNA) conduca a la perdida eficiente del RNA objetivo. Fire y Mello pudieron presentar una serie de conclusiones extradas de sus estudios, las cuales pueden resumirse de la siguiente forma: Primero, el silenciamiento gnico era desencadenado eficientemente por inyeccin de dsRNA, pero solo ligeramente o ausente por RNA monocatenario sentido o antisentido. Segundo, el silenciamiento era especfico para un mRNA homologo al dsRNA; otros mRNAs no se vea afectados. Tercero, los dsRNA deban corresponderse con la secuencia del RNAm maduro, ni intrones ni secuencias promotoras desencadenaban una respuesta, lo cual indica que un postranscripcional, presumiblemente citoplasmtico mecanismo. Cuarto, la desaparicin del RNAm objetivo sugiere que este es degradado. Quinto, solo unas pocas molculas de dsRNA por clula eran suficientes para con completo silenciamiento, lo cual indica que el dsRNA debe ser amplificado y/o actuar catalticamente en lugar de estequiomtricamente.

Sexto, el efecto del dsRNA podra difundir entre tejidos e incluso a la progenie, sugiriendo una transmisin de los efectos entre clulas.

Adems, Fire y Mello apuntaron que el RNAi podra proporcionar una explicacin para un fenmeno estudiado en plantas desde hace muchos aos, el silenciamiento gnico postranscripcional (PTGS).Y por ltimo, ellos finalizaron su artculo especulando acerca de la posibilidad de que el dsRNA podra ser usado por los organismos para el silenciamiento gnico fisiolgico. Los trabajos de estos autores le valieron el premio Novel en el ao 2006. As, el descubrimiento del elaborado y verstil sistema de silenciamiento en eucariotas es uno de los avances ms importantes en el campo de la biologa en la ltima dcada. Hay dos principales, formas distintas de RNA pequeo interferente implicadas en el silenciamiento gnico de eucariotas, los small interfering RNAs (siRNAs), y los microRNAs (miRNAs). IMAGEN 1 Los siRNAs son generados a partir de RNAs bicatenarios de virus o elementos transponibles, los cuales son procesados por la nucleasa Dicer, uno de los componentes esenciales de los complejos de silenciamiento inducidos por RNA (RICs). Dicer rompe las largas molculas de dsRNA en pequeos, 2122 dplex de nucletidos que son subsecuentemente separados por RISC para rendir siRNAs maduros. La maquinaria puede ser tambin desencadenada experimentalmente por la introduccin de dsRNA sintticos, proporcionando un instrumento importante para el silenciamiento de genes in vivo. Por su parte, a diferencia de los siRNAs, los miRNAs son fragmentos de 21-25 nts codificados por el genoma eucaritico y son o perfectamente (en plantas), o imperfectamente (en animales) complementarios a las secuencias en 3 UTR de especficos mRNAs endgenos. El apareamiento de bases de los miRNAs con los mRNAs diana, que esta mediada por una forma distintiva de RISC, resulta o bien en el clivaje o bien en la regulacin a la baja de la traduccin de los mensajeros (en funcin de si la complementariedad es total o solo parcial). Evidencias se estn acumulando rpidamente acerca de que numerosos, probablemente miles de miRNAs en animales y plantas estn implicados de forma importante en la regulacin del desarrollo y en el remodelado de la cromatina. Los miRNAs son pequeos RNAs no codificantes que contienen regiones de repeticiones invertidas de complementariedad. Esas repeticiones conducen a la formacin de hairpins bicatenarios que desencadenas la maquinaria de iRNA. En plantas, los miRNAs funcionan principalmente clivando los mRNA homlogos, En animales, sin embargo, parecen regular la expresin gnica unindose de forma parcialmente complementaria a las dianas en las regiones 3UTR., que resulta en la represin de la traduccin. A pesar de ser diferentes, tanto los miRNA como los siRNAs comparten los requerimientos de dsDNA como precursor, as como la asociacin con las protenas Dicer y Ago. Con el progreso en este campo, se fueron descubriendo diferentes tipos de siRNAs, como por ejemplo, los trans-acting small interfering RNAs (tasiRNAs), los repeat-associated small interfering RNAs (rasiRNAs) y los scanRNAs (scnRNAs), los cuales describiremos con posterioridad. Un tercer tipo de silenciamiento gnico en respuesta al dsRNA implica la modificacin del DNA celular y las histonas y su empaquetamiento en condensada y transcripcionalmente silenciada heterocromatina. El desencadenamiento de este tipo de respuesta parece estar asociada a los siRNAs, generados por la hibridacin de transcritos a partir de secuencias repetidas como transposones. As, este tipo de iRNA puede tambin representar un mecanismo de defensa celular para proteger contra los potenciales efectos deletreos de elementos genticos extraos como transposones. Los procariotas tienen aparentemente funcionalidad equivalente al sistema de los miRNA, es decir, regulacin de los genes bacterianos por pequeos RNAs antisentido. El mejor caracterizado de esas vas emplea a la protena de unin a RNA Hfq para la presentacin del small RNA y la RNAsa E para la degradacin de la diana.

E. coli tiene 60 genes miRNA, y un comparable nmero de expresados, pequeos RNA antisentido han sido detectados en la arquea Archaeoglobus fulgidus y Sulfolobus solfataricus, sugiriendo un importante rol de este mecanismo regulador en la fisiologa de los procariotas. Como las plantas y los invertebrados carecen de clulas implicadas en la inmunidad adaptativa, la habilidad del silenciamiento gnico en una manera especfica de secuencia constituye una sofisticada una forma de inmunidad cuya diana son DNAs exgenos. Aunque su papel del iRNA en la inmunidad innata en humanos no es bien conocido aun, este proceso es considerado como el principal mecanismo antiviral en plantas, donde muchos virus usan dsRNA durante su replicacin. En el caso de las plantas la defensa de iRNA es muy especfica, porque solo acta sobre cidos nucleicos que son idnticos en secuencia al dsRNA desencadenante.

Tipos de RNA pequeos (sRNA)

A continuacin vamos a presentar a los 4 principales tipos de sRNAs descritos hasta la fecha: los RNAs pequeos interferentes (siRNAs), los microRNAs (miRNAs), los RNAs de interaccin con piwi (piRNAS) y los 21U-RNAs.

MicroRNAs (miRNAs)
Los genes de miRNA constituyen en torno al 1% del total de genes codificados, y forman la mayor clase de molculas reguladoras. Evidencias sugieren que la expresin de los miRNA esta regulada a nivel transcripcional. Muchos promotores de miRNA han sido estudiados. El cluster policistronico de miR-17-18-19- 20-19b-92 esta regulado positivamente por el factor de transcripcin oncognico c-myc, y el msculo especfico miR-1 esta regulado positivamente por factores de respuesta sricos (SRF), MyoD y Mef2. La regulacin de la expresin de los miRNA a nivel de procesamiento de Drosha o Dicer no ha sido mostrado.

Biosntesis

La biosntesis del miRNA se piensa ahora que puede ser llevada a cabo por mas de una via, como describiremos a continuacin: Via cannica de miRNA: los microRNA son cadenas sencillas de RNA de 19-23 nt de longitud generados a partir de transcritos de cadena simple que poseen una estructura local de hairpin (figura 3, paso a). Esos transcritos son generados por la pol II, mostrando una caperuza en 5 y una cola poli A en 3. A diferencia de la maduracin de los RNA grandes, que ocurre en el ncleo, la maduracin del miRNA comienza en el ncleo y termina en el citoplasma. En animales, el procesamiento nuclear se inicia con la actividad endonucleotidica de Drosha, una enzima RNAsa tipo III, que en asociacin con Pasha, reconoce y genera la estructura de tallo y lazo (pre-miR) a partir del pri-miR (figura 3 paso b). Mediado por Exp-5 y Ran-GTPasa, los pre-miR son transportados fuera al citoplasma donde esos son sustrato de Dicer (figura 3, paso c). Excepto por las diferentes protenas que participan en la via de miRNA, las plantas siguen una biosntesis similar . Sin embargo, una importante diferencia existe entre la ruta de biosntesis en plantas y en animales, y se basa en en el hecho de que en las plantas la DCL1 actua sobre los pre-miRs en el ncleo . En arabidopsis y Drosophila, los dplex de RNAs pequeos son sustrato de metiltransferasas que aaden grupos metilo a los residuos 2-hidroxilo del azcar ribosa terminal, de forma que esta modificacin protege a esas especies de RNA de cualquier tipo de de degradacin o uridilacin. Los dplex de miRNAs son entonces separados por Argonauta1, un miembro destrajando de la formacin miRNA-RISC

(miRNP), generando miRNAs maduros (figura 3 paso d). El mi-RISC/ miRNP as formado, bajo la influencia del miRNA y las protenas asociadas , cumple su funcin, o sigue diferentes destinos. IMAGEN

Mirtrons, un concepto emergente de la biognesis de miRNA: adems de la via cannica de sntesis de miRNA, los animales han mostrado seguir otro modo de biognesis de miRNA donde la secuencia intrnica puede producir miRNAs. As, los miRNAs originados apartir de intrones fueron denominados mirtrones. 14 mirtrones de Drosophila y 4 mirtrones de C. elegans han sido identificados hasta la fecha; dado que tanto los genes que codifican protenas como los que no codifican poseen intrones, se piensa que mas del 80% de los miRNAs procedes de estos sitios. La generacin de mirtrones se diferencia de la via canonica de biognesis de miRNA principalmente en el no requerimiento de las protenas DROSHA/DGCR8 que eliminan la secuencia que flankea la regin tallo del pri-miRNA Interesantemente, aunque los mirtrons no han sido aun identificados en plantas y otros organismos, la presencia de intrones de longitud de pre-miRNA conduce a la posibilidad de que vas similares estn operativas.. Dado que los intrones no estn sujetos a presin selectiva es lgico asumir que ellos con poca probabilidad preservan sus secuencias, con lo que el concepto de los mirtrones podra explicar la rpida evolucinde la especificidad a lo largo de las especies que es observada en los miRNAs.

Funcin de los miRNAs

Los microRNAs muestran una alta especificidad de tejido y expresin temporal y se piensa que han evolucionado para cudar de forma intensiva las vas de desarrollo lo cual puede ser conseguido atravs de la supresin de la traduccin (teniendo lugar principalemente en animales) o por el clivaje de dianas (que ocurre principalmente en plantas). Sin embargo, hay excepciones a las funciones generales asignadas a los miRNAs de animales y plantas. Por ejemplo, en animales, el miRNA-196 dirige el clivaje de del transcrito HOXB (gen que actua sobre el eje rostro-caudal para determinar la identidad de las vrtebras y las somitas individuales), y en plantas, por ejempolo Apetala, un factor de transcripcin, es reprimido traduccionalmente por miRNA-172. Recientemente microRNAs han sido mostrados a jugar un rol crtico en conferir inmunidad tanto a animales como a plantas. El reconocimiento de la diana de miRNA, como en el caso del siRNA, es iniciado por la secuencida de la seed regin. En animales sin embargo, la diana transcripcional puede poseer mas de un sitio de reconocimiento de miRNA, permitiendo a algunos miRNAs unirse a dianas en localizaciones mltiples en la proximidad. Esto probablemente mejora el efecto del silenciamiento de forma acumulativa y tambin puede conferir redundancia al fenmeno, hacindolo ms riguroso. Por otro lado, los miRNA de plantas poseen sitios de unin nicos atravs de los que consigen el objetivo destino. Sin embargo, la compleja relacin existente entre las los miRNA de plantas y sus dianas en la mayora de los transcritos diana cae dentro de la categora de factores de transcripcin y puede as regular muchos procesos corriente a bajo. Interesantemente, los miRNAs son encontrados a regular negativamente los niveles de expresin de las principales enzimas de RNAi, como dicer o Argonauta, lo que aade otro peldao de dificultad a la red reguladora alcandazo por estas molculas. En animales, los estudios sugieren que la unin de miRNAs promueve o la desadenilizacin o la decapitacin de las dianas que es probablemente conseguida por la interaccin del complejo RISC con protenas asociadas a cap o a la cola de poli-A. Sin embargo, preguntas como cmo la unin de los miRNA actua atravs de diferentes mecanismos (supresin de la traduccin o la activacin) es pobremente entendido. Recientes estudios han modostrado que los miRNAs puden conducir a la activacin traduccional y una probable mecanismo ha sido propuesto. Estudios previos llevados a cabo

por Pillai y colaboradores haba insinuado al posible interferencia existente entre los RNAi y la activacin de la maquinaria de traduccin. Esos autores mostraron que la unin de AGO2, que esta guiada por miRNAs (let7 en este caso), puede disminuir la detencin traduccional de los correspondientes mensajeros. Mostrando un fuerte apoyo a esos descubrimientos, dos publicaciones posteriores de los mismos laboratorios han dado luz a nuestro entendimiento de los miRNAs y las protenas asociadas que participan en la regulacin al alza de la traduccin. La observacin de que TNF-a, una protena clnicamente importante, varia significativamente en condiciones de hambre y suficiencia de nutrientes permiti a esos autores hipotetizar en la implicacin de los elementos ARE sobre el mRNA en su estabilizacin o directamente activando la traduccin a partir de los RNAm. Interesantemente los autores encontraron que esos AREs portaban secuencias complementarias a los miRNAs. Invetigaciones posteriores mostraron que dos protenas, AGO2 y FXR1 asociadas, estn bajo la direccin del reconocimiento del miRNA en esos sitios y exclusivamente bajo condiciones de hambre (baja glucosa). Importantemente, los autores observaron fenmenos similares con otros miRNAs tan bien, lo que les condujo a hipotetizar que los miRNAs generalmente actual como represores durante el crecimiento celular activo, mientres queellos tienden a comportarse como activacin de la traduccin cuando las condiciones son limitantes para el crecimiento. Esos estudios demostraron la asociacin de los miRNAs en la activacin de la traduccin de mRNAs diana ha proporcionado una completa nueva dimensin de los atributos funcionales del miRNAs. Adems, en contra de la localizacin normal, los microRNAs han sido demostrados estar canalizados de vuelta al ncleo de una manera dependiente de secuencia (figura 3, paso e), Este fenmeno permite a los miRNAs extender su capacidad reguladora da otros territorios, concretamente el ncleo, proporcionando as una oportunidad para sea para elegir como blanco muchos transcritos sin procesar o bien para llevar a cabo silenciamiento gnico. Interesantemente esto fue expeculado por Bao y colaboradores,que estudiando los mutantes de Arabidopsis PHB y PHV que gobiernan la polaridad y son regulados por miR165 atravs de la via de degradacin, observaron que los mutantes resitentes a la degradacin tenan signficativamente reducida medida de metilacin cuando se comparaban con las plantas silvestres y que no haba un impacto de otras protenas de la maquinaria de RNAi como consecuencia. Estudiso de Hwang y colaboradoeres y Bao y colaboradores , aunque con diferentes sistemas, claramente apoyan la nocion de que los miRNAs juegan un papel esencial en el silenciamiento gnico mediado por RNAi. En las plantas, los patrones de expresin de los microRNAs se piensa que estn dirigidos por multiples interacciones de feedback que implican varias fitohormonas, en particular a las auxinas y las giberelinas. Las fitohormonas regulan la trascripcin de varios genes por unin a los elementos cis y esos transcritos poseen sitios para ciertos miRNAs. En contraste, la transcripcin de algunos miRNAs esta directamente regulada por fitohormonas. As, la intrincada relacin entre los miRNAs y las finohormonas es central par a muchos procesos biolgicos.

Modulacin de las dianas del miRNA

Los miRNA de animales, como regla general, se unen a la regin 3de la diana, mientras que en el caso de las plantas, la unin ocurre en la regin codificante. Normalmente , un mxido de desapareamientos es aceptado en la regin semilla que , por otra parte, modulara el rango de silenciamiento. Enzimas de edicin localizadas en el nucleo adenosina desaminasa que actua sobre RNA (ADARs), edita adenosina a inosina en posiciones especficas a lo largo de dsRNAs (figura 3). La sobreexpresin de ADAR humana muestra que dos isoformas (ADAR1 y ADAR2) estn implicadas en la edicin de miRNAs in vivo. Aunque la eficiencia de la edicin de ADAR1 fue encontrada ser mayor que en ADAR2, la ultima, a diferencia de ADAR1, muestra una edicin en una sola posicin del precursor. Esto cambia la secuencia seed regin y finalmente modula el rango de dianas en los precursones. As, la edicin de los miRNA (tanto pri- como pre-miRNA) puede explicar poruqe algunos miRNAs provocan especificidad en tejidos.

Ademas de la edicin, la unin del miRNA a su diana puede estar impedida por la presencia de secuencias flanquedoras que tanbien estn sorprendentemente conservadas y pueden servir como sitio de ataque para ciertas protenas. Las bien conocidas Hur protenas y las recientemente descubiertas Dnd1, una protena de unin , pertenecen ambos a esa clase de proteinas.

Tanto Hur como Dnd1se unen a elementos ricos en AU- (ARE) en el 3UTR y modulan la funcin de miRNAs. Dnd1 ha sido demostrado disminuir la represin de miRNA122 de p27 en lneas celulares humanas, y similares efectos se han visto con el miR430 del pez zebra. Esos resultados muestran claramente la posibilidad de otros mecanismos post-transcripcionales sean operativos durante la modulacin de la funcionalidad de los miRNA. Los transcritos reprimidos por miRNA en animales son introducidos en el interior de vesculas dinamias denomiandas cuerpos P. (GW1 o cuerpos citoplasmticos, que llevan a cabo la degradacin activa de los mRNA y el silenciamiento gnico.

RNASs pequeos interferentes (siRNAs)

Los siRNAs son molculas reguladoras de longitud comprendida entre 20-24 nucletidos que, adems de proteger a la clula de la intrusin de cualquier cido nucleico exgeno (como los virus), estn implicadas en el mantenimiento de la integridad del genoma por el silenciamiento transcripcional de locus indeseables (como retrotransposones o secuencias repetidas). Biosntesis

El principal requerimiento para la generacin de siRNA es una larga molecula de RNA bicatenario, los cuales son formados a partir de cualquier evento de transcripcin que genere mensajeros con complementariedad de secuencia o por alguna actividad enzimtica capaz de convertir RNA monocatenario en bicatenario (figura 1, pasos a y b). La molcula principal en la generacin de siRNA es Dicer, una RNAsa III tipo endonucleasa. Los animales normalmente codifican un nico tipo Dicer para generar varios tipos de RNAs pequeos (aunque hay excepciones como Drosophila o C. elegans, los cuales codifican dos dicers). Las plantas, sin embargo, requieren de mltiples Dicer. Dicer, en general, posee 6 dominios, DExH helicasa, DUF283, PAZ, RNasa IIIa, RNAsa IIIb y un dominio de unin a RNA (RBD). As, por ejemplo, Arabidopsis y el arroz poseen cuatro y seis poteinas similares a Dicer (DCLs) respectivamente. En Arabidopsis, DCL 2,3,4 estan implicadas en la generacin de diferentes especies de siRNA mientras que DCL1 es responsable nicamente de la biosntesis de miRNA, de forma que la actividad de cada Dicer genera siRNAs de diferente longitud, como por ejempo DCL2 ,DCL3 y DCL4 que generan fragmentos de 22, 24 y 21 nucletidos respectivamente. Estudios llevados a cabo en mutandes de Dicer tanto en plantas como en hongos , han permitido concluir que esas protenas son funcionalmente redundantes. Otra interesante conclusin extraida de esos estudios con mutantes fue la observacin de la existencia de una jerarqua funcional a lo entre las diferente dicers. Otra importante protena implicada en la biosntesis de siRNA en plantas, hongos y C.elegans (pero no en humanso) es una RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRP). La principal funcin de esta protena es generar siRNAs secundarios,en una etapa denominada amplificacin de la seal en la via del siRNA. RdRP puede reconocer molculas aberrantes de RNA para producir dsRNAs o bien de forma dependiente de primer, o bein de manera independiente. Las molculas de dsDNA as formadas son posteriormente clivadas por la actividad agua debajo de dicer. Los dplex del siRNA son entonces separados por la actividad helicasa de Argonauta, una protena reclutda por Dicer. Esta protena tiene 3 dominios bien caracterizados llamados PAZ, MID y PIWI. Tanto

en animales como en plantas codifican mltiples argonautas que participan en diferentes de iRNA. Aunque no todas las protenas argonauta estn caracterizadas, la funcin de unos pocos miembros ha sido elucidado, as por ejemplo, AGO2 y AGO1 son miembros destacados de siRISC y miRISC respectivamente, en plantas y animales. De forma similar a Dicer, evidencias sugieren una redundancia funcional en estas protenas. IMAGEN 2 Junto con otras protenas accesorias, argonauta sienta la estabilidad trmica de los extremos del dplex del siRNA e inicia la separacin de las hebras a partir del extremo con una relativamente menor estabilidad trmica. De las dos cadenas, la que es retenida por el complejo proteico siRISC es denomianda cadena gua , mientras que la otra (denomianda cadena pasajera) esta destinada a ser degradada por exonucleasas. En arabidopsis, la cadena madura simple de siRNA son metiladas por HEN1 , proporcionndole estabilidad. La cadena simple de siRNA cargada en el complejo proteico puede ser considerada anloga a las enzimas de restriccin procarioticas que actan contra cualquier cido nucleico foraneao. Sin embargo, a diferencia de los mecanismos de defensa procarioticos mediados por las enzimas de restriccin, los RNA pequeos eurocariotas pueden regular incluso cuando el DNA extrao ha sido transcrito a RNA. Si un RNA hibrida con la cadena gua del si-RISC, se activa argonauta, la actividad RNAsa que actuar especficamente sobre la secuencia diana en la posicin complementaria a una distancia de 10 a 11 nucleotidos apartir del 5 del siRNA IMAGEN 3 Clases de siRNA

Dependiendo de la naturaleza del loci y la biognesis del precursor de dsRNA diferentes tipos de siRNAs han sido indentificados. RNA pequeos interferentes transactivador (ta-siRNA): son pequeos RNA de 21 nt de longitud que regieren transcritos endgenos como molde, que son convertidos a dsRNA por una polimerasa dependiente de RNA (RdRP) y subsecuentemente requiere la actividad aguas abajo de DCL4 y AGO7 para generar tasiRNA funcionales. Animales como los humanos o las moscas, que carecen de RdRP, no poseen este tipo de siRNA. Los tasiRNA se parecen a los miRNAs tanto en tamao como en funcin y estn implicados en dianas de mRNAs no idnticos. Ha sido demostrado que los miRNAs transcritos reclutan RdRP que consecuentemente genera tasiRNAs, estableciendo as un ejemplo de regulacin de RNAs pequeos mediada por otros RNAs pequeos. En una via alternativa, RdRP puede tambin actuar sobre transcritos aberrantes (normalmente trascritos virales) convirtindolos en dsRNA y este mecanismo es probable ser responsable de prevenir a la clula de cualquier evento de transcripcin errnea queu pueda afectar a la integridad celular. RNAs pequeos interferentes asociados a repeticiones (rasiRNAs): son fragmentos de 24-26 nts generados por la actividad de DCL3 sobre dsRNAs generados durante eventos de transcripcin, normalmente locis de retrotransposones. Esos locis estn generalmente metilados lo que previene de su transcripcin. Al igual que los tasiRNAS, estos requieren tambin de RdRP para la amplificacin del pool de RNAs pequeos. Los RasiRNAs juegan un importante rol durante la gametognesis en las moscas, gusanos y mamferos atravs de la modulacin del estado de la cromatina, y el silenciamiento de transcritos virales atravs del reclutamiento de protenas modificadores de histonas. Scan RNA (scn RNA): otro tipo de relativamente largo siRNA ( 29 nts) ha sido encontrado en el protozoo Tetrahymena thermophyla. Este organismo muestra un dimorfismo nuclear que difiere aproximadamente en el 15% de la secuencia. Durante la conjugacin, los scn RNAs derivados apartir del micronucleo son generados (nucleo reproductivo) y eliminan locis correspondientes a su propio genoma

mientras que los generan en el macronucleo. Este fenmeno requiere una protena similar a argonauta denominada Twi1, y parece ser una forma de RNA interferente atravs de la cual los organismos pueden eficientemente modificar versiones del genoma a partir de otros existentes.

siRNA largos (lsiRNAs): constituyen la clase de siRNA mas recientemente introducida , constituida por fragmentos de 30-40 nts de longitud y estn inducidos en respuesta a infecciones bacterianas o condiciones de crecimiento. Descubierto en Arabidopsis, la generacin de lsiRNAs requiere de las proteinas DCL1, DCL4 y AGO7 y depende de otros miembros de las vas de tanto el miRNA como el siRNA, como RDR6, HYL1 o HEN1. Uno de los lsiRNAs tiene como diana una protena que confiere resitencia contra infecciones bacterianas.

Naturaleza sistmica del silenciamiento

Los siRNAs se creen que participan en una forma primitiva de respuesta inmune generada contra cidos nucleicos extraos. Por lo tanto, ellso deben surgir a partir de sitios de produccin para conferir una rpida defensa celular. Esta hiptesis est apoyada por estudios genticos llevados a cabo en animales, donde la importancia de los siRNAs dentro de las clulas ha sido demostrado a travs de una protena de membrana llamada Systemic RNA Interference Defective (SID-1), encontrando que la asimilacin de dsRNAs por la SID-1 era dependiente de longitud, con mayores molculas (500 pbs), siendo importada a una mayor velocidad que las molculas pequeas (30 pbs). Adems, observaron que la importacin de siRNA no estaba afectado ni por el tratamiento de las clulas con frio ni por el agotamiento de ATP, lo que sugiere un mecanismo de asimilacin pasiva. El cmo la protena SID-1 discrimina entre los siRNA y los miRNAs continua siendo un fenmeno desconocido. La funcionalidad de los siRNAs es consecuencia de su unin a las secuencias objetivo y es gobernado por una regi crtica dentro de la secuencia del siRNA denomianda regon semilla (seed regin) , que son crticas para conferir a los siRNAs su especificidad. Es atravs de la seed regin se une, lo reconoce y consecuentemente lleva a la secuencia objetivo a su clivaje o represin. Desde que los siRNAs se unen a les secuencias de las cuales ellos derivan, ellos no estn bajo ningn tipo de presin de seleccin. Cabe sealar que aunque la seed regin es importante en el reconocimiento de la diana, la complementariedad en otras regiones del siRNA es crtica durante el evento de clivaje. El floema es el tejido vascular de las plantas terrestres implicado en la distribucin de azucares, nutrientes y otras biomolculas atravs de la planta, y recientemente, Yoo y colaboradores han proporcionado evidencias de que este tejido es capaz de movilizar otra clase de molculas, los RNA pequeos (figura 1, paso g). Estudios con savia de floema de diferentes especies como cucurbitaces o yuca revelan la presencia de siRNAs y miRNAs . Adems, el descrubimiento de una nueva protena, la protena-1 pequea del floema de unin al RNA (PSRP1), que es funcionalmente similar a SID1 en los animales y se une a las especies de RNA pequeo; esto fue confirmado por estudios de silenciamiento de la cubierta proteica de virus y lneas no silenciadas, donde los autores pudieron encontrar acumulacin de siRNAs de cubierta proteica en las lneas silenciadas, pero no en las silenciadas; sin embargo el significado del transporte de miRNA atravs del floema continua sin ser dilucidado. Sin embargo la protena PSRP1 no esta conservada a lo largo de las plantas. As, aunque la naturaleza sistmica del silenciamiento es un fenmeno bien aceptado, los mecanismos que subyacen estn todava mal definidos y requieren esfuerzos para solventar las diferencias entre las protenas descubiertas en plantas y animales.

Interferencia de RNA estable

La introduccin de siRNAs de 21bp ha permitido la aplicacin exitosa de la tecnologa de iRNA en clulas de mamferos. Sin embargo, ensayos usando este mtodo son transilentes en la naturaleza y el fenotipo supresivo puede ser perdido en tiempos duplicativos varios, debido seguramente a la dilucin del siRNA. Mientras esta aproximacin es de confianza para estudios a corto tiempo de expresin de genes, no puede reemplezar a los modelos de Knocuk en ratones o permitir screenigs genticos precisos de perdida de funcin. Pero esto no es lo que ocurre en organismos coo C elegans o N crassa porque en ellos se produce una sntesis directa de siRNA a travs de la accin de una polimerasa de RNA dependiente de RNA. En estos sistemas, el fenotipo suprimido no es solo mantenido, sino que adems pasa a generaciones futuras, auque el efecto disminuye gradualmente. Para superar los inconvenientes del uso de siRNA en mamferos, un sistema para la expresin estable de siRNA ha sido desarrollado, tomando como modelo la estructura de los miRNA endgenos, vectores de expresin en mamferos han sido diseados para dirigir la sntesis intracelular de siRNA. En la mayora de los casos, en inserto de dianda especfico esta constituido por una secuencia de 19 nucletidos copmplementarios a la secuenca diana, seguida por un corto espacio y la secuencia complementaria inversa a la misma diana. Una vez transcrito, una estructura en tallo-lazo de 19 bp, denominada RNA hairpin pequeo (shRNA) , es procesado por Dicer en un siRNA que puede dirigir la regulacin a la baja de la expresin del gen diana a travs de los elementos de la maquinaria de RNAi. Promotores de la polimerasa III, como T7 o U6 , fueron inicialmente usados en esas construcciones, ya que ellos producan siRNA que mimetizaban a los requerimientos para un siRNA eficiente. Esos requerimientos incluyen, pero no son los nicos, la ausencia de una cola poli A en la cola y una seal de terminacin que da lugar a un transcrito con un 3 protuberante. Los vectores de expresin para shRNA conducidos por la poL II han sido tambin desarrollados, que permitirn la reculacin regulada de los siRNAs. Esos vectores de iRNA incluyen un marcador seleccionable que permite la seleccin de las clulas transfectadas y tambin incluye elementos inducibles que permiten la regulacin de la expresin de shRNA. En casos donde la eficiencia de transfeccin son bajas, vectores virales han sido diseados para la expresin de sinterso de shRNAs.

RNAs de interaccin con piwi (piRNAs)

Diversos trabajos muestran que las protenas piwi (perteneciente a la familia de protenas argonauta es un miembro bien establecido del complejo ejecutor RNAi) se asocian con especies de RNA de 25-31 nucleotidos que son especficas de la lnea germinal han aadido nuevas dimensiones a nuestor conocimiento hacerca de la variedad de RNA pequeo en la naturaleza. La clonacin y la secuenciacin de las poblaciones de RNA pequeo de la lnea germinal revelan que la mayora de las piRNA secuencias fueron mapeadas en regiones del genoma que previamente se pensaban ser no trascritas, mientas otras se corresponden con regiones intergenicas, exonicas, intronicas y regiones repetidas.

Biognesis de piRNA

Un mejor entendimiento de la biognesis de piRNA ha emergido a partir de estudios dirigidos por Gunawardane y colaboradore, y Brennecke y col. Que propusierno un mecanismo paralelo a la generacin secundaria de siRNA denomindo como modelo ping-pong. Se observaba que los sentidos piRNAs asociados con AGO3 mientra que lo antientidos e asocian con Piwi/Aub y estn complementario hata la primera 10 bases. Tambin el extremo 5 del piRNA antientido fue observado tener fuerte preferencia por las bases de uridina y que el sentido piRNA por la adenina en posicin 10. De acuerdo con el modelo, el complejo piR-Piwi/Aub generadoso a partir del cluster piRNA se une a la diana trascrita (normalmente una secuencia transposon) y lo rompe entre 10 y 11 bases. Subsecuentemente, AGO3 se une y gua el clivado transcrito al cluster piRNA transcrito donde es seguido el clivaje endonucleotido sello depues del dcimo residuo (normalmente adenina). Este bucle de retroalimentacin puede generar rpidamente suficiente piRNA para cuidar de cualquier trascripcin aberrante epecialemnte de retroelemento (Figura 7). El ciclo puede ser regulado por deteccin de produccin reducida del transcrito diana y consecuentemente de lo piRNAs a si mismos. Si las especies de piRNA en un organismo estn generadas sigiendo el modelo ping-pong o por otras vas similare a la biognesis de si- y miRNA sigue siendo una cuestin abierta. As, mietras que los miRNA y los siRNAs son producidos por clivaje de RNAs bicatenarios por la familia de protenas dicer, los piRNAs parecen ser indepedientes de dicer y son geredados por un clivaje mediado por piwi a partir de transcrito de elementos transponibles sintidos y antisentidos en el zigoto por piRNAs derivaos de la madre. IMAGEN 6 Funciones de los piRNA

Estudios previo haban mostrado que PIWI realiza multiple funciones que van dede la programacin epigentica y la represin de la transposicin a la regulacin post trascripcional. Sin embargo, en contra de la regulacin negativa de PTGS de si y miRNAs, los piRNAs promueven la estabilidad del mRNA diana y probablemente mejora tambin su tranduccin . Adems, las piRNA han mostrado tambin participar en la supresin de la actividad de los elementos transponibles en la lnea germinal, proceso que depende de las protenas de la familia piwi de las protenas argonatura, y de su interaccin los los piRNAs.

21U-RNAs
En un intento de redefinir el perfil de los RNA pequeos en C.elegans, Ruby y colaboradores descubrieron un nueva clase de RNA pequeo, el 21U- RNAs. En todos las lecturas analizadas, esas molculas fueron encontradas en tener exactamente 21 nucletido de longitud con uridina en el extremo 5. De las aprox 5454 secuencias obtenidas, la mayora fueron mapeadas en dos regione principales del cromosoma IV, con pocas lectura cayendo entre ambas regione. Biognesis

En ausencia de alguna evidencia para la existencia de un precursor dsRNA, la biognesis de los 21-U RNAs parece ser dependiente de algunos factore, que podran sentir el residuo de uridina como el punto de referencia para contar las bases. 21U-

RNA muestra no particulares cadenas parciales y la mayora estaban mapeadas en regione intergnicas e intronicas.

IMAGEN 7
Funciones de los 21U-RNAs

Considerando el hecho de que las secuencias de lo 21U-RNAs no muestan homologa con ningn transcrito apunta a la posibilidad de un posible papel en la estabilidad del genoma. Sin embargo, en vista de lo encontrado hacerca de que los sRNAs responsable de la estabilidad del genoma tienen un numero mayor a 24 nts, el posible rol de los 21U-RNAs (tamao de 21 nts) en la etabilidad del genoma continua sin estar claro. Adems, dado que los 21U-RNAs parecen someter a maduracin en el nucleo, su posible implicacin en el esplicing no puede ser rechazada.

Protenas implicadas en el iRNA

Un modelo simplicado para la ruta del RNAi esta baso en dos etapas, cada una de las cuales envuelve una maquina ribonucleasa. En el primer paso, el RNA desencadenante (ya sean transcritos primariso de dsRNA o miRNA ) son procesados a siRNA por las enzimas RNAsas III Dicer y Drosha. Las protenas de dominio a unin a dsRNA (dsRBD) Pasha, Loquacious y R2D2 son cofactores para los eventos de procesamiento. En una segunda etapa, los siRNAs son cargados dentro del complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). El siRNA es separado las dos cadenas de manera especifica durante la unin a RISC. El siRNA monocatenario localiza dianas de mRNA por apareamiento de Watson y Creek. As, el silenciamiento gnico resulta en la degradacin nucleolitica del mRNA diana por la enzima RNasaH Argonauta (Slicer). Si el dplex de siRNA/mRNA contiene bases desapareadas en el sitio de escisin, como suele ser el caso de los miRNAs, el mRNA no es clivado. En este caso el silenciamiento gnico es resultado del la imbibicin traduccional. IMAGEN 8

Dicer
Dicer, en general, posee 6 dominios, DExH helicasa, DUF283, PAZ, RNasa IIIa, RNAsa IIIb y un dominio de unin a RNA (RBD). (RBD, figura 2, a). La estructura cristalizada para algunos dominios ha sido resuelta proporcionndonos la oportunidad de predecir el model para la actividad de dicer. RBD reconoce la estructura dplex del DNA mientras que el domino PAZ se une al extremo saliente 3 de 2 nucletidos del RNA. Dicer ha sido propuesto a actuar como un centro de procesamiento simple, donde los dominios RBD y PAZ participan en la asociacin con la molcula de RNA y colaboran ambos con el dominio RNAsa III para formar un dmero intra-molecular. Esos dominios de RNAsa III se yuxtaponen de una manera para el clivaje del dplex de 21 nts de RNA a partir del precursor dsRNA. La generacin de un siRNA a partir de un dsRNA requere potencialmente cuatro reacciones endonucleoticas. Cmo consigue Dicer esto? Datos recientes apoyan un modelo en el cual Dicer actua como un monmero , usando dos reacciones endonucleticas para generar una nueva terminacin. Esto

ocurrira si Dicer se une a una terminacin existente y hace un corte de aprox. 21 nucreotidos desde el final. La primera dicer cristalizada fue la RNAsa III de Aquifex aeolicus, cuya estructura fue obtenida en ausencia de un sustrato dsRNA, pero la posicin del sustrato fue inferida en base a la localizacin de los residuos catalticos esenciales. El modleo estructural predijo dos centros activos por monmero con resudos de cada monmero contribuyendo a la formacin de sitios activos . El dmero entonces podra unirse internamente al sustrato dsRNA, y generar dos nuevas terminaciones. Los dos nucletidos salientes en 3 , as como la longitud de los productos dsRNA, eran el resultado del espaciado entre los residuos de las cadenas peptdicas individuales. Esos datos descartaban la existencia de dos centros activos por dominio de RNAsaIII. El modelo mas congruente se muestra en la figura siguiente. Los dos doiminios RNAsaIII en dicer se asocial en un pseudo-dimero intramolecular estabilizado por puentes de hidrgeno, creando un sitio activo similar al de la RNAsa de E.coli. Cada dominio cortari una cadena simple del dplex, generando as una nueva terminacin, de forma que RIIIDa sera el responsable de la generacin de los extremos 3 OH del producto, mientras que RIIIDb generara los extremos 5`, observndose que sustituciones de aminocidos que inactivan un dominio no afectan a la actividad del otro. Los dos nucletidos salientes son medidos por el alineamiento de los dmeros, en lugar de por la distancia entre los residuos de los sitios activos de una cadena peptdica. El producto de 21 nucreotidos de longitud es medido por la distancia entre el dominio terminal de unin PAZ y el sitio activo. El centro activo de Dicer conserva muchoas residuos de aminocidos caractersticos de la RNasa III bacteriana. IMAGEN 8 Dicer es capaz de clivar dsRNA con extremos romos, pero su actividad es mucho mayor con dsRNA pretarado con RNAsa III. Un loop de RNA o un hibrido DNA-RNA en un extremo del dsRNA suprime la actividad de Dicer. As, Dicer no reconoce solo un extremo del dsRNA, pero requiere una estructura especfica con un extremo 3saliente de 2 nts y un grupo fosfato. Esta estructura es reconocida por el domino PAZ (PIWI/Argonaute/Zwille). La organizacin del dominio PAZ y RIIID en Dicer determina el sitio de clivaje en el dsRNA como hemos dicho. Dicer mide la distancia a el sitio de clivaje (22-25 bp) desde el extremo del dsRNA, clivando un dsRNA de 40 bp en fragmentos de 22 y 18 ph. Recientes anlisis de rayos X de Dicer de Giardia han mostrado como esta regla cuenta 25 bp desde el extremo de un dplex de RNA . La distancia entre el centro activo de RIIID y el bolsillo PAZ acomoda el extremo del RNA coincide exactamente con el tamao de una regin de 25 pb en un dplex de RNA. El dsRNA unido se extenda entre el dominio PAZ y RIIID de Dicer lo largo de susuperficie plana enriquecido en residuos de aminocidos bsicos, que interaccionan con el esqueleto azcar fosfato del dsRNA. As, el tamao del siRNA resultante esta determinado por la distancia entre PAZ y el dominio RIIID. En Drosophila Dicer2 falta un tpico dominio PAZ, por lo que es probable que sea compensado por protenas adaptadoras, como R2D2. Generado por Dicer, el siRNA puede ser incorporado en RISC si este no es impedido por una protena especifica de unin al siRNA. Esta protena supresora de RNAi, otra regla molecular, es codificada por el genoma de algunos virus de plantas y sirve para proteger al virus del sistema de RNAi de la clula. El sitema es inducido en respuesta a la infeccin convirus cuyo genoma o forma replicativa es dsRNA. Por ejemplo, p19 del tomate tiene una afinidad extremadamente elevada por los siRNAs de 20-24 nts. De acuerdo con los datos de rayos X, un dimero de p19 utiliza sus b laminas cncavas para interaccionar con los grupos 2OH del RNA en una forma dependiente de secuencia. Las a hlices, unidas a las b laminas, contienen 2 triptofanos que interaccionan con las bases en los extremos 3y 5del RNA, el stacking determina la habilidad de medicin de p19. La sntesis de p19 bloquea el RNAi en las clulas de

mamferos. No puede ser excluido que similares supresores celulares estn implicados en la generacin de RISC. Dicer juega un papel en la generacin no solo de siRNA, sino tambin de miRNA. Como ya mencionamos el miRNA resulta a partir del procesamiento de pri-mRNA, que forma un hairpin. Solo una cadena del hairpin funciona como miRNA (figura siguiente).La generacin de pre-miRNA a partir de primiRNA es conducida por la RNAsa III Drosha en un complejo con Pasha en Drosophila o con su anlogo DGCR8 en humanos. El dominio PAZ se encuentra en todos las protenas Dicer implicadas en la biognesis de los miRNA. En Schizosaccharomyces pombe a Dicer le falta el dominio PAZ; el miRNA no ha sido encontrado de forma clara en este organismo. El domino cataltico RIIID de Dicer introduce una doble rotura , a distancia de 21-23 nts del extremo reconocido por el domino PAZ. Para procesar pre-miRNA Dicer requiere protenas acompaantes, como Loqs en Drosophila y la protena de unin al RNA TAR (TRBP) en humanos. Tres isomoformas de Loqs resultan del splicing alternativo. Dos de ellas, cada una de las cuales contienen dos dsRBDs cannicos y uno no cannico, enteractua con Dicer1, procesando el pre-miRNA en Drosophila. La tercera isoforma, que le falta el dsRBD no cannico, es incapaz de activar el procesado. Loqs es responsable de la especificidad de Dicer1 al premiRNA: La TRBP humana, que es homologa a Loqus, une a TAR ( respuesta transactivada), un hairpin de RNA regulador del virus de la inmunodeficiencia humana; este RNA es probablemente un pre-miRNA viral y regula muchas protenas diana en la clula. Una Dicer es capaz de procesar tanto pre-miRNA como largos dsRNA en humanos y nematodos, Otros organismos tienen diferentes protenas Dicer que permiten selectiva regulacin de la generacin de siRNA y miRNA. En Drosophila Dicer 1 procesa miRNA mientras que Dicer2 es responsable de la biosntesis de siRNA. Arabidopsis thaliana tiene 4 genes codificadores de protenas similares a Dicer (DCLs). No solo Dicer cliva dsRNA, tambin un componente del complejo de protenas intermedio que carga el siRNA en el RISC. Como Dicer1 y Drosha, Dicer2 de Drosophila actua en un complejo con la protena de unin al dsRNA R2D2, que posee dos dsRBDs. R2D2 no esta implicada en el clivaje de dsRNA. Contenida en RLC, cuyo principal componente es el heterodmero Dicer2/R2D2, R2D2 juegea un rol importante en cargar RISC con el siRNA, as como en la seleccin de la cadena gua. El extremo del dplex de siRNA que es termodinmicamente mas estable se une con R2D2, mientras que el extremo con una temperatura de fusin mas baja se une con Dicer2. La cadena que une con R2D2 atarvs de el etremo 3 actua como cadena gua. Esta regla termodinmica ha sido confirmada por muchos experimentos. Dicer1 de Drosophila esta implicada no solo en la maduracin del miRNA, sino tambin el en silenciamiento inidiado por siRNA o por dsRNA. Cuando siRNA es introducido en una celula en ausencia de Dicer1, la diana no es clivada. Dicer1 y Dicer2/R2D2 son detectables en un gran complejo de protenas en lisados de clulas que contienen siRNA exgenos. Entonces, Dicer1 no solo genera miRNA, sino que tambin estabiliza algunos componentes del siRISC. De este modo, la generacin de siRNA y miRNA se entrecruzan e interrelacionan. IMAGEN 9

Drosha

Los miRNA son transcritos por la RNA polimerasa II como transcritos primarios largos. Las especies activas de miRNA, denominadas RNA maduro, estn presentes en una estructura tallo-loop, el cual puede estar localizado en un intron o un exn. Por ejemplo, los miRNAs miR-106B, miR-93 y miR-25 estan localizados en el interior de un intron de la protena que codifica el gen mcm-7. Despus de la transcripcin, los miRNAs, son extraidos a partir del transcrito primario, mientras que el mRNA maduro es exportado y traducido. No se conoce si los miRNA son procesados antes, duranteo o despus del splicig. El procesado secuencial de de un transcito primario por las enzimas RNAsasIII Drosha y Dicer libera el RNA maduro. Drosha cliva liberando el tallo-lazo, denominado precursor, que es esportado desde el ncleo de una manera dependiente de Exportina-5/RAN-GTPasa. En el citoplasma, el precursor es procesado a una estructura similar a siRNA por Dicer. Drosha es una enzima de clase II que adopta un nucleo cataltico pseudo-dimerico similar a Dicer. El sustrato de Drosha, los transcritos primarios del miRNA, estructuralmente distinto a los sustratos de DICER. Drosha no procesa a partir del extremo del dsRNA, sino que los datos sugieren que la estructura de tallo-lazo es reconocida, en particular , el tamao del loop parece ser importante para el reconocimiento. Adems, secuencias desestructuradas que flanquean el tallo-lazo son esenciales para el procesamiento. No se sabe como Drosha reconocera esas secuencias, ya que estn fuera del tallo del dsRNA Posiblemente otros cofactores no idenfiticados jugen algn rol. IMAGEN 10 Identificado como un componente del procesamiento de los pre-rRNA, Drosha posee dos RIIIDs y un dsRBD. Como Dicer, los dos RIIIDs de Drosha forman un centro de procesado. El sustrato del complejo Drosha/Pasha es un hairpin con un lop de no menos de 10 nts. Drosha tieen solo dbil actividad RNasa, pero el cofactor de unin a dsRNA Pasha/DGCR8 basta para restaurar su actividad hacia pri-miRNA in vitro.Se piensa que la protena compaera, que contiene dos dsRBD, utiliza una a hlice adicinal del dsRBD para reconocer el stem-loop de la estructura del RNA, como en el caso con Saccharomyces cerevisiae Rnt1 (RNAsa III). Presuntamente, Pasha/DGCR8 une a el loop del pri-miRNA y entonces interactua con dos RIIIDs de Drosha, oriendando el centro activo de la endonucleasa aproximadamente 30 nts lejos del loop. La base de la horquilla e dsRNA es posiblemente unida por el dsRBD de Drosha. El dominio RS de Drosha, que contiene repeticiones de dipeptidos de ArgSer, es caracterstico de protenas de splicing. El dominio RS es capaz de interaccionar tanto con otras protenas como con RNA, En el splicing, el dominio RS interactua con una secuencia intronica implicada en la formacin de un lazo, que es debido a la unin 5-2internucleotdica. RS dominios carecen de una estructura distinta y se clasifican como intrnsecamente desordenados regiones de la protena, que siguen siendo capaces de interactuar con las protenas asociadas varias. El carcter desordenado se piensa a facilitar la generacin de nuevos motivos estructurales en esos dominios. El dominio RS de Drosha uno a cadenas sencillas de RNA mas all del hairpin, como forma de asegurar la mxima actividad del complejo. Drosha genera un extremo saliente 3de 2 nts en el precursor que es reconocido por el dominio PAZ de Dicer, anlogo al reconocimiento de los dsRNA terminales. Los miRNA bicatenarios son incorporados dentro de RISC de una manera similar a los siRNAs.

En Drosophila, exportina 5 asegura el transporte del pre-mRNA desde el ncleo al citoplasma, donde Dicer, actuando en complejo con cofactores de unin al dsDNA, cliva el pre-miRNA miRNA bicatenarios de 21-23 bp.

Cofactores con dominio dsRBD

Desde los procariotas a los humanos, la mayora de todas las protenas implicadas en la interaccin con RNA bicatenarios poseen dsRBD.Este dominio se encuentra en muy diversas enzimas como la RNAsaIII procariotica, ADAR (una adenosina desaminasa implicada en la edicin del RNA), en la protena kinasa PKR dependiente de RNA.El anlisis de rayos X de dsRBD que aparece en la RNAsaIII ha revelado que este dominio consiste en 70 residuos de aminocidos y esta formado por una a-helice N-terminal, tre cadenas-b antiparalelas y una a-helice C terminal, que forma un sndwich-ab. Se ha observado que este dominio contacta con 16 pb de la doble hlice en conformacin A. El reconocimiento de los rupos 2OH asegura la unin especfica al RNA, pero no al DNA. Tres contactos principales no especficos de secuencia entre la protena y el RNA resulta de interacciones no inicas entre el esqueleto azcar fosfato: un contacto es formado con el surco menor, y dos contactos se forman con el surco mayor. La forma A del dsRNA no cambia su conformacin al interaccionar con el dsRBD. Datos recientes muestran que tanto Dicer como Drosha requieren la asociacin con protenas con domino dsRBD para desarrollar su actividad.. En Drosophila, Dicer-1, Dicer-2 y Drosha estn asociados con Loquacious, R2D2 y Pasha respectivamente. El papel de R2D2 en dirigir la incorporacin especfica de la cadena del siRNA es bien conocida. Loquacious puede llevar a cabo un rol similar con el microRNA cargndolo dentro de RISC. La funcin de Pasha aun no est clara, dado que la especifidad de la cadena parece ocurrir aguas debajo de la accin de Dicer. Una posibilidad es que Pasha confiera regulacin a la expresin de los microRNA al nivel del procesamiento de Drosha. Los limitados datos no sugirieren ningn papel, dado que el knouckdown de Pasha redujo el procesamiento de todos los microRNA probados.

Complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC)

La existencia de un complejo nucleasa secuencia-especfico fue predido por Fire despus de estudios iniciales sobre la ruta de RNAi en C.elegans. La demostracin formal de su actividad fue reportada por dos grupos independientes trabajando en Drosophila. La primera informacin , a prtir de una colaboracin entre Zamore, Sharp , Bartel y Tushl, demostr que los dsRNA poda inducir el silenciamiento gnico en extracto de embriones de Drosophila, lo cual era acompaado por la destruccin del RNAm diana. En la segunda referencia, usando extractos libres de clulas de Drosophila procedentes de cultivos celulares, el grupo de Hannon caracteriz esta actividad nucleasa. Ellos mostraron que exista como una preformada y fraccionable entidad. Importante, esta referencia tambin mostr que la actividad nucleasa conteni un siRNA como componente integral, lo cual apoyaba la hiptesis de que un RNAi era afectado por un complejo nucleasa secuencia-especfico. La exclusin de tamaos por cromatografa sugera muchos posibles tamaos para RISC, desde 500 a 360 kD a 140 kD, dependiendo del sistema modelo. Esta discrepancia puede reflejar la ausencia o presencia de cofactores no esenciales, o la remanencia de factores de montaje de RISC. Si este fuera el caso, 140 kD representara la nucleasa RISC minima, y ahora sabemos que esto es lo que sucede, dado que Argonauta y un siRNA son suficientes para la mnima actividad de clivaje. La purificacin por cromatografa de la nucleasa RISC de Drosophila muestra que esta posee muchos componentes. El primer componente identificado fue Argonauta2 (Ago2), una protena miembro de la familia de genes conservados en la mayora de los eucariotas y muchos genomas procariotas. Estructuralmente estra protena esta caracterizada por dos dominios, el dominio PAZ y el dominio PIWI. Las estructuras de ambos dominios han sido resueltas (ver debajo). Componentes adicionales de RISC con roles desconocidos en el RNAi han sido tambin identificados. Entre ellos se incluye a la protena de unin al RNA VIG, el homologo de Drosophila de la protena X Fragil, dFXR, protenas helicasas, y Tudor-SN. Esta ltima protena tiene 5 dominios de nucleasa estafilococa, (Snasa) y un dominio Tudor. La presencia de dominios Snasa la hace un obvio candidado para Slicer. Muchas lines de evidencia, sin embargo, son inconsitentes con esto. Muchos residuos catalticos esenciales estn ausentes en los tominios Snasa de Tudor-SN. Mientras queu la protena continua mostrando alguna actividad nucleasa, la

qumica de las reacciones de clivaje difiere de cualquiera de las observadas con Slicer. Especificamente, los productos de la reaccin de Slicer tienen motivos 5fosfato y 3OH. La unin escindible ha sido . mapeada en el centro del siRNA, indicando que una reaccin endonucleotidica. Snasa, sin embargo, es una exonucleasa que produce 5OH y 3fosfato productos. Mientras que Tudor-SN puede tener un papen el la degradacin de los productos de Slicer, no es Slicer en si mismo.

Argonauta

Muchas lneas de investigacin apuntaron a Argonauta como Slicer. La etapa efectora del silenciamiento de RNA es el reconocimiento del una secuencia de RNA complementaria por RNAs pequeos y el clivaje del RNAm por protenas de la familia Ago . Las protenas Ago estn altamente conservadas , existiendo en algunas arqueas y la mayora de los eucariotas. El nombre de la familia deriva del hecho de que una mutacin en la protena relacionada de arabidopsis distorsiona la morfognesis y resulta en hojas deformes pareciendo los tentculos del cefalpodo Argonauta. Los miembros de la familia Argonauta muestran varias funciones biolgicas, que pueden ser explicadas por su papel en el silenciamiento gnico con siRNAs, y especialmente, miRNAs. Mutaciones en los genes Ago muestran varios defctos en el desarrollo. Por ejemplo, mutaciones en el D. melanogaster dAgo1 afecta a las neuronas de todos los tipos y clulas gliales, y provoca letalidad en el embrin. Ratones con los Ago2 mutantes muestran varias anormalidades en el desarrollo y mueren en el estado de embrin que es probablemente causado por un defecto regulacin dependiente de mi-RNAs de la expresin gnica. Las protenas Ago son los principales componentes del complejo efector implicado en el silenciamiento de RNA: ellos catalizan el clivaje de RNA, la supresin de traduccin y el silenciamiento transcripcional. El rol central de las protenas Ago en el silenciamiento gnico es debido a su capacidad de unir siRNA y miRNA, y catalizar el clivaje del mRNA complementario. Las protenas Ago poseen conservados dominios PAZ Y PIWI, que han sido identificados y caracterizados en estudios de RNAi. El dominio PIWI toma su nombre de una mutacin en Drosophila piwi (P-element induced wimpy testes), que codifica para una familia de protenas Ago. La estructura de los dominios Ago ha sido estudiada en Drosophila, humanos y arqueobacterias, por resonancia magntica nuclear y rayos X. La funcin en arqueobacterias y eubacterias de las protenas Ago es oscura, porque el RNAi no ha sido detectado en procariotas. Sin embargo, su anlisis estructural es de inmensa importancia para un mejor entendimiento de las funciones de las protenas Ago en eucariotas. El domino PAZ ha sido encontrado solo en Dicer y en Ago, y es una variante estructural del domino de unin de oligonucletidos/oligosacridos, que une cadenas simples de DNA o RNA. El domino OB se encuentra en un factor de terminacin de trascripcin procariotico, en eucariotas RPA, que une regiones de DNA de cadena simple y juega un rol en la replicacin del DNA; y en protenas de unin de extremos 3 protuberantes de los DNA telomericos. El dominio PAZ de Drosophila Ago1 y Ago2 consisten en 2 subunidades que se estabilizan entre si. El principal subdominio es estructuralmente similar al dominio OB y consiste en 5 cadenas B formando un barril B abierto y dos a-helices; el otro subdomino consiste en un b-hairpin y una a-helice. Entre ambos subdominios hay un bolsillo de acomodacin de los dos extremos 3 protuberantes del siRNA.; los extremos interactan con residuos de aminocidos aromticos e hidrofbicos conservados. Los nucletidos que no estn unidos al bolsillo se encuentran en un surco formado sobre la superficie del domino PAZ. Un anlisis estructural del domino PAZ en complejo con siRNA revela que interacciona con una sola cadena del RNA dplex. La unin del dominio PAZ con el RNA es nucletido-no especifico, debido a que el dominio eficientemente se une al extremo protuberante 3dTdT de una doble cadena artificial de siRNA. El dominio PAZ varia ligeramente en estructura a lo largo de diferentes protenas Ago, mostrando una elevada afinidad por DNA o por RNA. Es posible que la unin al DNA sea esencial para las correspondientes protenas Ago en el silenciamiento gnico a nivel de cromatina.

El papel del dominio PIWI en la unin del siRNA fue descubierto debido a estudios estructurales del complejo de un dplex artificial de siRNA y AfPiwi de la arqueobacteria Achaeoglobus fulgidus y al anlisis de mutacin de la Ago2 humana. AfPiwi tiene el dominio PIWI y difiere de la Ago eucariota en que le falta el dominio PAZ. Nucleotido fosforilado en 5terminal de una cadena de siRNA se une dentro de un bolsillo que es el la estructura mas conservada del dominio PIWI y se alinea con residuos de aminocidos bsicos. El grupo fosfato 5 interactua con un ion metal divalente y cuantro residuos de aminocidos invariantes. Las sustituciones de esos residuos afectan a la actividad de Ago2 en humanos, sugeriendo que la uunin del 5 fosfato tiene significado funcional. La base del nucletido terminal 5descansa sobre el anillo aromtico de la tirosina AfPiwi, que sigue estabilizando la unin. El bolsillo no tiene contactos especficos destinados a reconocer el grupo 2'-OH, es decir, PIWI puede unir varios aminocidos. Los nucletidos fijados por el dominio PIWI no est enlazado con la cadenacomplementaria en el dplex siRNA. La localizacin extrahelicoidal del nucletido 5terminal concuerda bien con la idea de que el apareamiento del nucletido 5terminal del siRNA o del miRNA de la cadena gua con el Mrna es innecesaria para el reconocimiento y clivaje del miRNA. Los nucletidos adjacentes (posiciones 2-5) de la misma cadena forman una conformacin A de hlice y estn organizados en un surco sobre la superficie del dominio PIWI debido a uniontes entre los residuos de aminocidos bsicos de la protenia y el esqueleto azcar-fosfato del RNA. As, el domino PIWI es similar al dominio PAZ en la interaccin una sola cadena del dplex del siRNA. Aunque RISC es cargado con siRNA bicatenario, se piensa que los dominios PAZ y PIWI de Ago se une solo a la cadena gua y forma contactos no intensos con la cadena pasagera, que poda entonces ser separada durante la formacin del RISC activo. En el RISC activo el domino PAZ de Ago une el extremeno 3 de la cadena gua, mientras que el dominio PIWI une el extremo 5. Un anlisis estructural de dos protenas de arqueobacterias, PfAgo y AfPiwi, y el anlisis bioqumico de mutantes humanos Ago2 han mostrado que los dominios PIWI tienen elementos estructurales que son similares a los de la RNAsa H, que cliva la cadena de RN a en hibrodos RNA-DNA. La RNAsa H contiene la triada de aminocidos catalticos AspAspGlu. Un domino de aminocidos similar, AspAspHis, ha sido encnotrado en el domino PIWI de PfAgo y muchas protenas Ago eucarioticas, incluyendo la Ago2 humana. El motivo AspAspHis del dominio PIWI de la humana Ago2 es esencial para el clivaje del mRNA. Los mutantes de Drosophila y de mamferos de Ago aislados a partir de clulas de E.coli no requieren protenas accesorias para catalizar el clivaje del mRNA en presencia de siRNA. Modelando el dplex de la cadena gua-mRNA sobre la superficie del dominio PIWI de AfPiwi coloca el enlace fosfodiester diana del mRNA cerca del centro cataltico putativo. Anotamos que era un anlisis estructural de Ago con un subsecuente anlisis de sustituciones de aminocidos que revelaron que el domino PIWI (Slicer) es el responsable del clivaje del mRNA. Bases en la regin terminal 5 del RNA gua (posiciones de 2-8) son de especial importancia para el clivaje del mRNA. Cuando el mRNA gua y el mRNA forma un dplex completametne complementario, que ocurre en la correcta conformacin A, Ago cliva el mRNA para que el enlace fosfodieste diana es contado hacia atrs desde el extremo 5 de la cadena gua y esta entre los nucletidos del mRNA complementaiors a los nucletidos 10 y 11 a partir del extremo 5 de la cadena gua. Cuando las secuencias son parcialmente complementarias, la iniciacin de la traduccin en un mRNA dado es suprimido. Es probable que las caractersticas estructurales de diferentes protenas Ago son responsables de sus funciones en diferentes niveles de expresin gnica. Clonando pequesos RNAs y experimentos in vitro con plantas y Drosophila revelaron tanto siRNAs pequeos (21-23) y grandes (24-27). Hay evidencias de que los siRNAs pequeos estn implicaos en la degradacin del mRNA y la suprsin de la traduccin, mientras que los siRNAs largos juegan un papel een el silenciamiento transcripcional Dado que el extremo 3 de la cadena gua esta unido al domino PAZ y el extremo 5e esta unido con el dominio PWI de Ago, de acuerdo con los datos estructurales, es posible asumir que las protenas Ago que difieren en la distancia entre los PAZ y los dominis PIWI prefieren siRNAs de diferentes tamaos.

Por ejemplo, una variedad particular de Ago puede unir solo siRNAs grandes para iniciar el silenciamiento gnico. Las variaciones estructurales de los siRNAs y las protenas Ago son posiblemnte responsable de su implicacin tanto en el silenciamietno transcripcional como posttranscripcional. En humanos hay cuatro muy relacionados miembros de la familia Argonauta, denominados Ago1-4, los cuales unen siRNA y microRNA en niveles similares , y estn ampliamente expresados. Solo Ago2, sin embargo, esta presente en una RISC clivaje-competente. De forma similar, el knockout de Ago2 afecta al proceso de RNAi, mientras que el Knockdown de Ago1, Ago3 y Ago4 no tuvieron efecto. Esos datos peuden ser interpretados de dos formas: Solo Ago2 es capaz de interactuar con Slicer, o bien Ago2 es Slicer. La respuesta fue proporcionada por la estructura cristalina de miembros de la familia argonauta procedente de Pyrococcus furiosus. La estructura revel un plegamiento RNAsa H para el dominio PIWI. La estructura cristalizada de una segunta Argonauta de arquea, Archaeoglobus flugus Piwi (AfPiwi), confirm el plegamiento RNAsaH. La demostracin final de que la actividad Slicer estaba en Ago2 fue la reconstruccin del RISC mnimo con expresin bacteriana, purificando Ago2 y una cadena simple de siRNA. Los estudios mecansticos de RISC han alcanzado recientemente un pice con la estructura cristalina del complejo AFPiwi con un dsRNA. Las protenas AfPiwi no son un modelo perfecto, dado que les falta el domino PAZ, y su rol celular es un misterio. Sin embargo su estructura proprocion detalles moleculares a un gra nmero de observaciones experimentales. Por ejemplo, los pares microRNA/diana han demostrado la importancia de lso nucletidos 2-8 en el microRNA, denominados regin semilla (seed regin), para el reconocimiento de la diana. La estructura de AfPiwi muestra que el primer nucletido del siRNA no aparea con la diana, pero es secuestrado en un polsillo de unin. No solo es un apareamiento innecesario, sino que un fuerte apareamiento puede distorsionar la unin del RNA y reducir al actividad Slicer. Interesantemente, un fuerta apareamiento en el extermo 5no debe ocurrir en ningn caso, dado que las reglas que rigen la incorporacin en lnea deRISC se basan en el emparejamiento de bajaenerga en el extremo 5 de la cadena incorporada (gua), comparanndola con la descartada (pasajera). Esto significa que un siRNA o miRNA efectivo empezar con A o U. Por supuesto, otra via para conseguir una carga carga de cadena especifica es tener una G o C desapareada en el extremo 5, lo cual no reducira la tasa cataltica de Slicer. El model cataltico de Slicer se muestra en la siguiente figura. El extremo 5 del siRNA gua esta unido al dominio PIWI. El 5fosfato, que es importante para la unin de alta afinidad, esta coordinado por cuatro residuos conservados, y torsionados lejos de la cadena diana del mRNA. El extremo 3 del siRNA se extiende mas aya del dominio PIWI,. Estudios estructurales de dominios PAZ aislados sugieren su unin el extremo 3OH terminal del RNA, o hibrida con el extremo 3saliente. Dado que a AfPIWI le falta el dominio PAZ, solo se puede predecir que este sominio se une al extremo 3del siRNA gua. El RNAm diana hibrida primero con la regin semilla en 5 del siRNA, en el contexto del dominioPiwi. La afinidad de la unin del mRNA se basa en gran parte en esta interaccin, aunque el la eficiencia de la tasa cataltica de Slicer depende de la formacin del dplex con la regin 3 del siRNA. El motor cataltico es el plegamiento RNAsaH en el domino PIWI. Las RNAsa H endonucleasas tpicas clivan la cadena de RNA o de RNA/DNA dplex, deuna manera dependiente de catin, generando 5fosfato y 3OH productosCuando se present con un largo ARN sustrato dplex con un oligonucletido cortas de ADN, sin embargo, la enzima que rompe el ARN en el centro del oligonucletido. Esto es esencialmente una mquina de cortar la actividad, aunque la gua del siRNA toma ellugar de los oligonucletidos de ADN. Este modelo tambn explica la unin de las dianas de mRNA a los microRNA en RISC. La regin semilla en 5 de el microRNA es esencial para la unin afn.Dado que la actividad de Slicer no es necesaria, la regin 3 de el microRNA es relativamente poco importante. Lo que no esta claro es el mecanismo de supresin traduccional.La degradacin de la diana ocurre, pero no parece ser la principal causa del silenciamiento. La perdida de funcin de la actividad exonucleasa 5-3 en C.elegans casu un incremento

en el let-7 destino lin-41, sin un incremento de la protena 41 . El modelo mas convincente para los microRNA funcin ha sido recientemente publicado por el grupo de Filipowicz. Ellos presentaron evidencias de que el microRNA bloquea la iniciacin de la traduccin dependiente de caperuza en 5.vMensajeros independientes de cap que se inician a partir de una Sitio Interno de entrada al Ribosoma (IRES) no son diana de los microRNAs.

Un IRES, (Internal Ribosome Entry Site) o Sitio Interno de entrada al Ribosoma es una secuencia nucleotdica que se encuentra en el extremo 5UTR (untranslated region o regin no traducida) que permite la iniciacin de la sntesis proteica, la traduccin del marco abierto de lectura de un RNA mensajero (mRNA o ARNm). A diferencia del mecanismo ms conocido de traduccin proteica en organismos eucariontes que requiere una modificacin previa en el extremo 5', en el cual se aade lo que se denomina Cap, y que no es ms que la adicin de un grupo metilo al carbono 7 de laguanina del extremo 5 del mRNA para el ensamblaje de la maquinaria de traduccin, las secuencias IRES son reconocidas por el complejo de pre-iniciacin 43S, de manera que pueden comenzar la traduccin del RNA mensajero a pesar de carecer de modificacin Cap en su extremo 5'. Estas secuencias han sido encontradas en miembros de las familias virales picornavirus, retrovirus yherpesvirus. Adems, recientemente se han encontrado secuencias IRES en mRNA de organismos eucariontes, especialmente en protenas implicadas en la regulacin del ciclo celular, as comomecanismos apoptticos. Los elementos IRES tienen elementos en cis (es decir en la propia secuencia del IRES), los cuales son reconocidos por protenas de la maquinaria de traduccin de la clula. Algunas de estas protenas tambin intervienen en la iniciacin de la traduccin dependiente de cap, como por ejemplo eIF3, eIF4B y eIF4GII. Los mRNA silenciados son localizados en los cuerpos p en el citoplasma (citoplasmatic mRNA processing bodies). Estos son estructuras imprecisamente definidas que contienen las poblaciones de mRNA y la maquinaria de degradacin y procesamiento nucleoltico. El modelo Filipowicz predice que es una consecuencia de la inhibicin traduccional, lo cual esta en armona con la degradacin exonucletica 5-3 de las dianas de mRNA, dado que esta actividad esta localizada en los cuerpos P. Mientras que los microRNA y la RNAi vas comparten la misma maquinaria central, algunas especializaciones pueden existir . Por ejemplo , en Drosophila AGO1 preferencialemente une microRNAs y Ago2 siRNAs. De forma similar, Dicer1 es esencial para el procesamiento del microRNA. Las moscas que carecen de Dicer-1 poseen niveles mnimos de microRNA y exiben fenotipos de desarrollo que serian esperados de su deficiencia. Estas moscas pueden procesar largos dsRNAs en niveles normales.Los mutantes de Dicer-2, inversamente, tienen niveles normales de microRNA maduros pero no pueden procesar los dsRNAs largos. Interesantemente, ambos mutantes tienen reducidos niveles de silencimiento gnico desencadenado por siRNAs. Esto no sorprende para Dicer-2, dado que su rol en en el ensamblaje de RISC. Pero el porque es necesario Dicer-1 para el procesamiento de los siRNAs es un misterio. Es posible que exista algn tipo de solapamiento funcional, dado que el particionamiento de siRNAs y los microRNAs en los complejos Ago2 y Ago1, respectivamente, no es absoluta. Una explicacin alternativa es que las moscas Dicer-1 , que les falta la funcin de microRNAs, tienen una serie de defectos celulares, y esto conduce a reduccin de eficacia de los siRNAs. Es interesante que en humanos hay solo un gen Dicer, que esta mas relacinado con el gen Dicer-1 de Drosophila. De forma similar, la Ago1-4 humanas estn relacionadas con Ago1 de Drosophila, no existiendo ortlogos de Ago2 de Drosophila en humanos. Esto sugiere que el genoma humano se ha mantenido la preferencia sub microRNA-va. Dado que los dslargos son toxicos para las clulas de los mamferos, la via de procesamiento para este tipo de RNAi sera innecesaria. La funcin de Slicer, sin embargo, ha sido mantenida en un miembro de la familia en humanos, Ago2.

Variantes de los genes argonauta en los eucariotas superiores

El genoma de los eucariotas superiores codifican para muchas protenas Ago. Hay 10 genes de protenas Ago en plantas, cinco genes en Drosophila, y siete genes en humanos. Paralogos de la familia Ago pueden estar implicados en diferentes vas de silenciamiento de RNA, y Dago1 esta implicada en la via de miRNA D. melanoganster Dicer2/R2D2 y Dicer1/LOQS entregan miRNA y siRNA para diferentes RISCs, que contienen Dago2 Y dAGO1 respectivamente. El anlisis del silenciamiento de RNA en un sistema in vitro ha hecho posible caracterizar las propiedades de esos complejos efectores, y ha mostrado que tanto siRISC y miRISC son capaces de inducir la degradacin de las dianas complementarias de mRNA. Sin embargo, Ago especficas para el silenciamiento con siRNA o miRNA no han sido encontradas en mamferos. Human Ago1, Ago2 y Ago3 unidos tanto siRNA y miRNA en vitro. Una posible explicacin es que el mismo Dicer esta implicado en la generacin y carga de RISC con RNAs pequeos de ambos tipos. Las variantes de Ago de mamferos pueden ser especialmente adaptados a diferentes mecanismos de silencimiento; la degradacin de mRNA dianas, la supresin de traduccin, o el silenciamiento transcripcional. De hecho, solo RISC que contienen Ago2 induce la degradacin del mRNA en las clulas humanas. Es posible que Ago1 y Ago4 sean incapaces de clivar la diana, porque l la trada cataltica carece en su ago1 y uno de los residuos Asp en ago4. Sin embargo, una falta de Ago2 no previene el silenciamiento traduccional de un gen reportero en clulas cultivadas, sugiriendo que algunas protenas Ago estn implicadas solo en la supresin de la traduccin, pero no en la degradacin del mRNA. En contra de los eucariotas superiores, la levadura Schizosaccharomyces pombe tiene solo una Ago, que juega un rol tanto en el silenciamiento transcripcional como en postranscripcional.

Helicasas en el iRNA

Al principio se crea que la funcin de las helicasas de RNA estaban restringidas a la separacin del dsRNA, debido a la energa de la hidrlisis de los NTP. Estudios recientes han mostrado que las protenas de esta famila juegan un papel en la disociacin de los complejos protena-RNA. Las helicasas de RNA contenidas en los grandes complejos rebonucleoproteicos (RNP)estn implicadas en muchas etapas del metabolismo del RNA, incluido el splicing, la maduracin del ribosoma y la traduccin. El grupo mas abundante de la familia incluye DExH/D helicasas ( donde X puede ser cualquier residuo de aminocdo), que derivan su nombre de la secuencia de aminocidos de uno de los motivos mas conservados. Esas enzimas poseen seis motivos conservados. Uno es el implicado en la unin de NTP, mientras que los otros aseguran la unin de RNA dependiente de NTP. Como las mutaciones y los anlisis de X-ray de DExH/D RBA helicasas de varios organismos han mostrado, los motivos I, II (DExH/D) y IV juegan un rol en la hidrlisis de NTP; el motivo III esta asociado con actividad helicasa; y los motivos IV y V estn implicados en la unin al sustrato. Estructuralmente, las protenas de la familia parecen una garra con residuos de aminocidos de los dominios conservados mirando hacia el interior, donde el sustrato y los NTP estn acomodados. Se piensa que la garra, formada por los dominos I y II, se habre y se cierra de una manera dependiente de NTP para determinar la actividad translocadora del enzima. La mayora de las helicasas de RNA contienen dsRBD, que reconoce 2OH del motivo ribosa de un dplex de RNA sin tener en cuenta la secuencia. Un N terminal extendido, que es caracterstico de muchas DExH/D helicasas esta probablemente implicado en las interacciones con otras protenas. De hecho, las helicasas de RNA suelen encontrarse en grandes complejos nucleoproteicos como el spliceosoma, el complejo inhibidor de la traduccin y otros. En algunos casos, la actividad helicasa es solo detectable en presencia de una protena cofactor.

La mayora de las helicasas son solo activas cuando se unen a un extremo monocatenario de un RNA dplex, uniendo extremos protuberantes 3 y 5 con similar eficiencia. Presumiblemente, una helicasa DExH/D se mueve a lo largo de una cadena del RNA y entonces desplaza a la otra. Una separacin progresiva de los dplex del RNA es caracterstico solo de las protenas DExH/D; las protenas de la familia DEAD tienen baja procesividad. Esas helicasas temporalmetne unen pequeos (alredor de 10 bp) fragmentos de un dplex abierto de RNA para prevenir la reasociacin y permitir nuevas interacciones RNA-RNA y RNA-proteinas. Adems, las helicasas DExH/D son capaces de desplazar protenas asociadas con dplex de RNA. Esta , tambin llamada, actividad RNPasa no esta siempre acompaada por la separacin del dplex. La actividad RNPasa es de inmensa importancia, permitiendo la redistribucin dinmica de las interacciones protena-RNA, que juegan un papel clave en el metabolismo del RNA, en particular en el RNAi. El papel bioqumico de las helicasas de RNA DEAD y DExH/D continua en debate; aunque mtodos genticos han implicado a esas enzimas en el RNAi y el silenciamiento de transgenes, transposones y genes repetidos en varios organismos,. La actividad RNA-helicasa se suele sugerir para componentes proteicos de los complejos RNAi a partir de la presencia de los correspondientes dominios conservados. Inicialmente se asuma que las helicasas de RNA melt? los siRNA o miRNA bicatenarios durante la formacin del RISC activo, que contiene sono una, gua, cadena de RNA pequeo. Los los nucletidos protuberantes en el extremo 3 del RNA pequeo se pensaba de ser los sitos de reposo para las helicasas. La desestabilizacin subsiguiente del dplex por las RNA helicasas puede facilitar la separacin de las cadenas y la eliminacin de la cadena adecuada del RISC. Se encontr, sin embargo, que el siRNA es cargado como un dplex en el RISC y entonces Ago cliva la cadena pasajera y libera la cadena gua. Es posible que las helicasas estn implicadas en el desplazamiento de los fragmentos del siRNA pasajero del RISC y entonces regerar el RISC para la siguente ronda de clivaje. La eficiencia del clivaje del mRNA diana es de hecho alto en presencia de ATP, debido a la elevada multiplicidad de los ciclos de RISC funcional. Actuando como ATPasas, DExH/D helicasas estn presumiblemnte implicadas en las etapas del iRNA que implican cambios en la composicin de los complejos proteicos con pequeos RNA. Los datos indican a continuacin indirectamente el posible papel de helicasas de RNAen particulares etapas de RNAi. Los genes codificados por las helicasas putativas e implicadas en varias etapas del iRNA han sido identificadas en muchos organismos. Una mutacin de D. melanogaster spindle-E (spn-E), que codifica para la helicasa putativa de RNA DExH/D, distorsiona RNAi causado por dsRNA exgeno. SPN-E es probablemente un componente de muchas rutas efectoras. El gen spn-E esta implicado en el silenciamiento de un amplio rango de varios retrotransposones, incluyendo repeticiones largas terminales y LINEs, en tejidos germinales de Drosophila y regula la expresin de las repeticiones endgenas en tamdem de Stellate a travs de un mecanismo similar al RNAi. Ha sido observado que el siRNA especfico para Stellate y los retrotransposones telomricos HeT-A y TART son idetectables en los mutantes spn-E de Drosophila, implicando a SPN-E en la generacin y/o estabilizacin del siRNA. SPN-E esta probablemente implicado en el silenciamiento transcripcional, debido a la distribucin de las proteianas asociadas a las heterocromatinas a lo largo del cromosoma estn distorsionadas en los mutantes spn-E. Otra helicasa de RNA putativa de Drosophila , ARMITAGE (ARMI), es homologa a la helicasa SDE3, que en Arabidopsis esta implicada en el silenciamiento postranscripcional. ARMI no pertenece a las helicasas de RNA DExH/D. Como SPN-E, ARMI es probablemente un componente esencial de varias vas efectoras. Mutaciones en armi conducen al bloqueo de la represin de los retrotransposones y Stellate y a la prematura traduccin del mRNA oskar, que contiene una secuencia complementaria a miRNA en el extremo 3. ARMI es necesario en la formacin el RISC activo en D.melanogaster pero no por la separacin de los siRNA, porque pequeos RNA monocatenarios exgenos no restauran la actividad de RISC en un lisado de embriones con mutantes armi. El homologo ARMI SDE3 esta implicado en un paso temprano del RNAi y es necesario para la generacin de siRNA en Arabidopsis.

Muchos genes de Caenorhabditis elegans codifican para helicasas putativas de DExH/D esenciales para el silenciamiento dependiente de dsRNA. Uno de esos, mut-14, codifica para la helicasa de RNA DEADque no juega ningn papel en la generacin del siRNA y es poblablemente un componente de RISC.

Un anlisis de la composicin de los complejos de protenas caractarsticos de varias etapas de RNAi sugiere que algunas helicasas de RNA son componentes de un complejo intermediario esencial para la formacin del RISC activo. En una evidencia de inmunoprecipitacin, dos helicasas DEAD relacionadas de C. elegans , DRH-1 y DHR-2 , estn unidas con Dicer (DCR-1) y esta interaccin en necesaria para una eficiente iRNA. Adems, esas helicasas interactan con RDE-4 ligadora de RNA, que es un socio de Dicer encontrado encontrado en coplejos similares a RLC, tambin con RDE-1 que pertenece a la familia Ago. Esos descubrimientos apoyan el rol de las helicasa de RNA en la separacin de los dplex de siRNA durante la carga de la cadena gua y la formacin del RISC activo. Actividad separadora de RNA ATP dependiente ha sido observada en vitro solo para la Germin 3 de mamferos, que coinmunoprecipita con Ago2 y miRNA con un componente de las partculas de miRNP. Aunque las helicasas de RNA son factores obligatorios de iRNA y procesos similares en muchos organismos, los datos genticos y bioqumicos disponibles son insuficientes para mostrar tu papel estructural y bioqumico en esos procesos.

Otras protenas de unin al RNA implicadas en el RISC

Purificaciones de Drosophila de RISC han identificado VIG y dFXR como componentes adicionales del complejo efector del iRNA. Evolutivamente conservados VIG contiene los bien conocidos dominios de unin al RNA RGG, que estn enriquecidos en Arg y Gly. En C. elegans, VIG-1 esta contenido en RISC. La otra protena, dFXR, alberga el dominio RGG y dos dominios KH ( K homologos; el dominio ha sido identificado en la protena K del RNP nuclear), que estn inplicados en la unin al RNA. Por el contrario a dsRBD, los dominos KH y RGG consisten solo en 10-25 aas y, mas probablemente, unen cadenas simples de RNA , aunque el dominio KH contiene el mismo elementro estructural alpha-beta de dsRBD. Se piensa que el reconomiento del RNA esta mediado por un loop conformacin de lazo dbil que separa las cadenas beta y las hlices alpha. Sin embargo, el modo de unin al RNA por KH ifiere del modo de unin de dsRNA por dsRBD. FMRP , un homologo de la dFXR humana, esta asociado con la regulacin transcripcional de algunos mRNAs en clulas del sistema nervioso. Adems, FMRP ha sido detectado en complejos con Ago y Dicer, que estn presumiblemente implicados en la regulacin traduccional dependiente de miRNA. As, VIG y FXR homologos son componentes del RISC activo en varios organismos. La funcin de esas protenas en el iRNA continuna oscura. La nucleasa Tudor-SN es otro componente de RISC en Drosophila y C.elegans. Tudor-S alberga 5 dominios homologos al dominio nucleasa de la endonucleasa estafillococa-micrococal. El dominio Tudor ha sido observado en varioas protenas asociadas con la cromatina, el transporte de RNA y su metabolismo. El dominio Tudor esta contenido en SPN-E de Drosophila, pero su funcin no esta clara.

Ensamblaje del RISC

Recientes trabajos han empezado a refinar los roles de las protenas Dicer en el RNAi. Por ejemplo, basado en un modelo de dos etapas para el RNAi, la introduccin directa de siRNA no debera requerir la funcin de Dicer. Sin embargo, la eliminacin de Dicer reduce de forma importante el silenciamiento de siRNA. Hay tambin evidencias de hairpins sintticos que actan como sustratos de dicer son mas

efectivos en desencadar la RNAi que los siRNAs. Esas observaciones apuntan a una interaccin entre Dicer y RISC. Esa interaccin fue primeramente sugerida por estudios de co-inmunoprecipitacin, pero su naturaleza era desconocida. Datos recientes de dos laboratorios han indicado un proceso de ensamblaje multietapa para RISC que requiere Dicer. En un paso temprano, Dicer un socio dsRBD ( ej. R2D2 y Dicer-2 en Drosophila) une al siRNA. El ensamblaje de este complejo de carga de RISC (RLC) puede esr una simple etapa o puede incluir multipes etapas con diferentes y no caracterizadas protenas diferentes.La orientacin de la unin de R2D2 es asimtrica, favoreciendo la carga de la cadena gua de el siRNA dentro del RISC. De forma concertada, el siRNA es separado y la cadaena gua es transferida desde el RLC al RISC. Evidencias sugieren que este ensamblaje ocurre en un complejo 80S. Dado que RISC ha sido mostrado unirse a los ribosomas, este gran complejo puede ser el ribosoma. Este holo-RISC es ahora activo, y puede unir mRNA mientras el ribosoma esta unido, o puede disociarse como RISC libre. Seguido al clivaje por RISC, el dplex de miRNA o siRNA maduros deben ser cargados desde Dicer a Argonauta para formar el RISC activo. Este proceso conduce a la seleccin de la cadena gua y la eliminacin de la pasajera. En humanos, los compnentes mnimos requeridos para la garda de Argonauta 2 (Ago2) son el complejo Diceer con su cofactor dsRBP, TRBP, y un dplex de siRNA maduro . El complejo de carga de RISC en humanos ( RLC) y sus componentes han sido recientemente analizados por negative-stain electron microscopy, proporcionando un marco estructural para probar coom los dplex de siRNA puede ser transferidos desde Dicer-TRBP a Ago2 durante la carga de RISC. La reconstruccin por EM de la Dicer humana (Figura 3) revela una molecula en forma de L conteniendo una grieta en su eje mayor. El brazo corto de la L corresponde al dominio helicasa N terminal (DExH/D) , basado en el anlisis de mutantes de deleccin que han perdido aprox. 80 kDa de la regin helicasa. Recostrucciones de EM de varias combinaciones de varios componentes de RLC fueron usados para diseccionar los componentes restantes del RLC completo. Esos anlisis sugirieron que TRBP interactua flexiblemente con el dominio helicasa de Dicer, mientras que Ago2 se extiende entre TRBP y el brazo largo de Dicer, formando un complejo cerrado een algunas partculas. La interaccin Ago2- Dicer se piensa que ocurre entre el dominio cataltico PIWI de Ago2 y el dominio RNAsa IIIa de Dicer, basado en previos anlisis Para determinar como el dplex de siRNA puede ser acomodado dentro del RLC, un siRNA de 22 pb fue modelado a lo largo de la cara de unin a RNA putativa de Dicer, revelando que el dsRNA se une perfectamente dentro del hueco entre Ago2 y Dicer . IMAGEN 11 En un modelo de unin a RNA alternativo, el dplex de 22 bp puede tambin unirse entre los domigios PAZ y Ago2 de Dicer, sugiriendo que los dos dominios podran unier ambos extremos del siRNA al mismo tiempo. Esta observacin sugiere una cusiosa posibilidad para un intermediario de conformacin de RLC durante el RNA hand-off. Aunque TRBP se sabe que es importante para el reclutamiento de siRNAs a Ago2, su rol exacto no se conoce. La localizacin y flexibilidad del TRBP sugerida por el modelo EM puede permitir al dsRBP accteder al dominio PAA de Ago2. Trbp podra entonces cubrir el espacio entre Dicer y Ago2, reteniendo al siRNA dentro del RLC una vez que Dicer lo libere, y posicionando el correcto extremo del siRNA para la unin por el dominio PAZ de Ago2. El proceso de orientacin del siRNA durante la transferencia de Ago2 es particularmente importante para la seleccin de la cadena, que esta basada principalmente en la asimetra termodinmica del dplex de RNA pequeo. TRBP puede tener un papel adicional de correccin para la selectividad de la cadena durante la carta de RISC mediante la deteccin de la estabilidad termodinmica relativa de cada extremo del dplex. La etapa final de activacin de RISC, la eliminacin de la cadena pasajera, ha sido recientemente el objeto de muchos estudios bioqumicos. En Drosophila melanogaster , la cadena pasajera es eliminada pr

un proceso a travs de diferentes mecanismos dependiendo de qu homologo de Argonauta esta presente en RISC. Sobre la transferencia del dplex de siRNA a RISC , la Ago2 de Drosophila cliva la cadena pasajera y la endoncleasa C3PO elimina los productos clivados, actuvando al complejo Cadena guaAgo2.. En contra , Ago1 ,que une miRNAs y tiene relativamente una actividad de clivaje dbil comparada con Ago2, separa los dplex de miRNA a travs de un mecanismo independiente de slicer. Ago2 Humanos contienen RISC probable sigue el mecanismo dependiente de slicer para la eliminacin de la cadena pasajera, aunque la C3PO humana no ha sido confirmada como un activador de RISC.

Limitaciones en el empleo de iRNA como herramienta biotecnolgica

.. Muchas de esas limitaciones dependen del tipo de polimerasa empleada para el reconocimiento y amplificacin de las secuencias de siRNA. Sin embargo, incluso siguiendo las reglas recomenadas para el diseo de siRNAs, no asegura en silenciamiento seguro de una diana. La eficacia de la supresin mediada por siRNA de la expresin gnica depende de un numero de factores , incluyendo no solo la secuencia de siRNA escogida, pero tambin la estructura del siRNA, y la receptividad del tipo de clula que asimilar el siRNA. Adems la vida media del mensajero diana y/o protenas necesitabas para ser consideradas para conseguir el silenciamiento optimo. El uso de RNAi para fines teraputicos depende de otros factores. Aunque los siRNAs son relativamente estables en condiciones de cultivo de clulas, ellos necesitan una mejorada estabilidad nucleasa y termodinmica in vivo. Mientras hay opiniones mezcladas hacerca de que tipo de modificacin ser mas efectiva en la mejora de la estabilidad, sin comprometar la actividad de silenciamiento, avances han sido hechos para conseugir el propsito de siRNA adecuados para propsitos teraputicos. Otra de las desventajas de la terapia de iRNA es la saturacin de la maquinaria de iRNA, dado que mientras la facilidad y la eficiencia de la inhibicin de siRNA puede ser derivada a partir del hecho de que esas molculas exgenas aadidas estn empleando una via celular natura, problemas de seguridad cada vez mayor es que esto podra interferir con las funciones de regulacin de miRNAs endgenos que son conocidos a compartir algunas de las misma maqunaria. Evidencias sugieren que cuando un exceso de siRNA son liberados en clulas de mamferos, la maquinaria de procesamiento de iRNA intracelular puede saturarse, pudiendo alterar los mecanismos de regulacin gnica en los que intervienen los miRNA. Adems, alteracioens en la expersin de miRNAs o su maquinaria de procesamiento ha sido recientemente implicada em muchas enfermedades neurolgicas y canceres. En algunos casos la sobreexpresin de miRNA ha demostrado ser oncognica, pero en otros casos la expresin reducida de miRNA es observada en clulas cancerosas. Otra limitacin es que , aunque el iRNA es mas potenet que otros mtodos de silneciamiento gnico, hay que tener en cuenta las limitaciones inherentes a esta tecnologa, dado que el iRNA ha mostrado knocks down genes, pero generalemnte no elimina por completo su expresin.

Efectos inspecficos o fuera de diana del iRNA

Dos de las pricipales consideraciones para el desarrollo de iRNA para la terapia clnica son primero, la elaboracin de mecanismos eficientes para el desarrollo de siRNA en las clulas diana en vivo, y segundo, evitar los efectos no especficos del siRNA. Con el incremento del uso del iRNA como una herramienta de investigacin, esta claro que la introduccin de una molecula de siRNA en una celula puede tener mltiples efectos mas haya de los causados por el silenciamiento gen-especfico. En muchos casos esos efectos colaterales pueden no ser aparentes hasta que estudios de expresin gentica

global son llevados a cabo que muestran en los efectos del siRNR mas ay de la inhibicin esperada de la expresin del gen diana. Dos principales tipos de respuesta no especfica ha sido observada. Primpero, los siRNA pueden activar una vira celular de respuesta al dsRNA alternativa que resulta en la sobreregulacin de un gran numero de genes tpicamente asociados con las vas de respuesta inmune innata, incluyendo genes estimulados por inteferon (ISGs). Es representa un mecanismo especfico de siRNA, en lugar de un mecanismo especfico de diana, de la regulacin semiglobal de la expresin gnca en que la secuencia de siRNA es irrelevante. Un segundo tipo de efecto , denominado fuera de objetivo (off target), es observado cuando otros genes adems de los genes diana muestran una expresin alterada en resesta al siRNA. Por ltimo, dado que el iRNA experimental emplea la misma maquinaria celular que es requerida para la regulacin gnica endgena mediada por miRNA , es posible que ambos procesos pudieran interferir entre si. El iRNA ha revolucionado los estudios de funcin de gen y y representa una gran promesa como la validacin de dianas de medicamentos y el tratamiento de enfermedades humanas. Sin embargo, a pesar del xito que ha conseguido esta tecnologa, estudis llevados a cabo en clulas humanas sanguneas han mostrao que los siRNA podran generar diversas alteraciones, incluyendo la activacin de la respuesta innata y la inhibicin de indeseadas dianas gnicas. As, aunque iniciale estudios sugeran que los siRNA eran especficos y suficiente pequeos para evadir los efectos indeseados que podan ser desencadenados por el siRNA, como la respuesta de interfern y la degradacin de mRNA medianda por complementacin parcial de secuenia. Aunque algunos de estos efectos pueden ser reducidos usando bajas concentraciones de siRNAs, la respuesta de interfern fue observada incluso a bajas concentraciones. Interesantemente, siRNAs modificados en 2uridina no desencadenan la sealizacin de TLR (Toll-like receptors). As, a diferencia de lo que se pensaba, el iRNA no tiene una accin tan especfica, y bajo ciertas circunstancias puede condicur a efectos indeseados: las tres principales causas de ello son: algunas siRNA son detectadas por la clula desencadenando la activacin de la respuesta mediada por interfern, la sobreexpresin de los siRNA puede saturar la maquinaria de silenciamiento celular que ens necesaria para el control de la expresin de muchos genes esenciales , y por ultimo , muchos siRNA no son especficos para su diana y pueden actuar como miRNA para inhibir la expresin de otros quenes que podriena ser necesarios para el propio funcionamiento celular. Como los efectos indeseados son dependiente de dosis, es esencial el desarrollo de protocolos que reduzcan al minimo estos efectos.

Combinacin de iRNA y inhibicin de U1

La expresin gnica puede ser tambin inhibidas con U1 small nuclear RNAU1 snRNAinterference (U1i). U1 snRNA acompaado de U1-70K y otras protenas celulares forman una ribonucleoproteina nuclear madura (U1 snRNP), que es un bien conocido factor de splicing constitutivo. U1 snRNP funciona en el splicing uniendo el pre-mRNA a travs del apareamiento de bases entre los nucletidos 211 del U1 snRNA y la secuenica en 5del sitio de splicing. A parte de esta funcin en el splicing, U1 snRNP puede actuar tambin como un potente inhibidor de la expresin gnica mediante la inhibicin de la formacin del extremo 3 del pre-mRNA. Cuando los nts 2-11 de U1 snRNA se unene al extremo 3 de un pre-mRNA, U1 snRNP inhibie la poliadenilizacin de pre-mRNA, y con ello la expresin gnica., dado que sin la cola polyA, el pre-mRNA falla su maduracin y es rpidamente degradado en el nucleo conduciendo a la reduccin de la expresin. Esta actividad inhibidora del U1 snRNP constituye la base de la tecnologa de silenciamiento Uli. Uli requiere la expresin de un U1 snRNA mutado en el extremo 5 diseado para aparear bases del exn 3 terminal del gen diana. El inhibidor U1 snRNA (U1in) se une al mRNA diana y bloquea su expresin. La expresin de genes endgenos ha sido inhibidoa por U1i despus de trasnfecciones estables o transilentes, as indicando una buena especificidad y baja toxicidad de esta tcnica. La expresin de mltiples U1ins que tienen como diana

diferentes partes de un exn terminal del mismo gen ersulta en una inhibicin mejorada sinrgica, mostarndo ser til por ejempolo contra la replicacin del HIV. El RNAi y U1i afectan a dianas de mRN por diferentes mecanismos y en diferentes compartimentos celulares. Mientras que U1i afecta al metabolismo nuclear de una diana de RNA, el RNAi disminuye la estabilidad del RNA en el citoplasma, donde esta localizado el complejo RISC. As, ambas tcnicas pueden ser combiadas sin aumentar el riesgo de saturar la maquinaria de silenciamiento. IMAGEN 12 Diversas investigaciones han demostrado un efecto sinrgico de la combinacin de RNAi y U1i, indicando que esos mecanismos pueden trabajar juntos para producir mayores niveles de inhibicin que los obtenidos por cualquiera de las tcnicas independientemente; dicho sinergismo puede ser resultado de un descenso nuclear en la diana de RINA por U1i acompaada de un descenso citoplasmtico de la misma diana por el iRNA. As, la accin de U1 podra disminuir la cantidad de mRNA diana citoplasmtico. De este modo, la combinacin de ambtas tcnicas permitira inhibicin funcional con un descenso de la dosis de inhibidores, evitando la toxicidad debida a los efectos dependientes de dosis.

miRNA activado por siRNA

Estudios en miRNA han ayudado a determinar la causa de algunos de esos efectos no especficos. Estudios de expresin gnica destinados a explorar la posibilidad de que un siRNA pueda inducir la supresin transcripcinal de la expresin de un determinado gen , actuando de forma similar a los miRNA. Esos efectos de inhibicin no especficos se han observado a bajas concentraciones de siRNA y solo una complementacin parcial de los genes suprimidos es necesaria. Mientras un simple apareamiento incorrecto entre un siRNA y su diana reducir la eficiencia del silenciamiento, el mismo siRNA puede ser capaz de regular a la baja la expresin de genes no objetivo que contienene regiones parcialmente complementarias. Cuando anlisis computacionales fueron llevados a cabo sobre siRNAs, multiples 3UTR potencialmente dianas fueron indentificadas que contenan secuencias parcialmente homologas a cada cadena de un determinado siRNA. Si los siRNA pueden actan de hecho como miRNAs en el control de la expresin de mltiples genes, los perfiles de expresin global deben ser analizados para asegurar la especificidad de los siRNAs, especialmente cuando esos estudios son usados para determinar la funcin de un gen. Respuesta inmune inducida por sRNAs

Los interferones son citoquinas cuya funcin en primer lugar de defensa contra infecciones virales en mamferos. Ellos pueden ser inducidos en respuesta a patrones moleculares especficos de patgenos, incluyendo bacterias, virus y hongos, y son secretados para proporcionar una proteccin paracrina contra infeccin de virus y para mediar la respuesta inmune adaptativa. La activacin de esta respuesta inmune innata es eficientemente desencadenada por dsRNA, un patrn molecular asociado a patgenos (PAMP), comnmente generado durante la el ciclo de replicacin de la mayora de los virus. El dsRNA es ersponsable de la inciacin de 3 conocidos tipos de eventos de sealizacin implicados en la respuesta antiviral. Inicialmente dsRNA une a protenas de reconocimiento de dsRNA constitutivas. Estas protenas actan ya sea para mediar directamente eventos antivirales o iniciando las cascadas de sealizacin que resultan en la sobreregulacin de IFNs y otras protenas antivirales. dsRNA puede tambin activar directamente la transcripcin de genes especficos atraves una una ruta alternativa independiente de IFN. La induccin descontrolada de este mecanismo de defensa innata tiene efectos citotxicos. IFNs inducen la activacin transcripcional de genes estimulados por interfern (ISGs), cuyos protenas producto

confueren actividad antiviral y antriproliferativa. Muchas de esas protenas productos de esos genes antivirales son constitutivamente expresados en clulas no ifectadas. Algunas de esas protenas son PKR, la cual inhibe tanto la replicacin viral como la sntesis celular de protenas, adems de actuar como sear de transduccin en las vas que conducen a la activacin de NFkB y ATF2, , y otro tipo de protenas son las 2-5 oligoadenilato sinthetasas (OASs) , que convierten ATP en pequeos oligoadenilatos asociados 2-5 denominadas molecuas 2-5 A , que unen y activan la RNAsa L, resultando en la degradacin no especfica de RNAs celulares monocadena, y el inicio de la apoptosis. Adems de esas vas, dsRNA tambin es capaz de desencadenar eventos de sealizacin mediados por receptores Toll-like receptor 3, as como la sobrerregulacin de genes directamente controlados por la expresin de dsRNA via activacin del factor de transcripcin IRF3. Aunque los siRNAs se pensaba originalemente que eran demasiaod pequeos para inducir la respuesta iniciada por dsRNA dentro de la clula, la sobreregulacin de genes clsicos estimulados por IFN, como GBP1, CCL2 o FGF2 han sido detectados. Los efectos no especficos eran depedientes de concentracin , y parecan ser consistentes en todos los siRNA sintetizados qumicamente probados. As, es claro que al menos en algunas circunstancias la activacin de estas respuestas puede ocurrir en respuesta a dsRNAs menores de 30 pares de bases, en contra de lo que se pensaba. Diferentes estudios se han realizado para aumentar las caractersticas de los siRNAs que aumentan la funcionalidad mientras minimizan los efectos no especficos: As se ha visto que: Una alta eficiencia de siRNA puede ser conseguida a bajas concentraciones, reduciendo los efectos no especficos dependientes de concentracin Otras 8 caractersticas se han identificado para aumentar la funcionalidad: 30-50% G/C contenido Al menos 3 A/U bases en posicin 15/19 (sense strand) Ausencia de repeticiones internas Una A en posicin 19 (sense strand) Una A en posicin 3 (sense strand) Una U en posicin 10 Una base deferente de G o C en posicin 19 (sense strand) Una base diferente de G en posicin 13

As, bajo condiciones especficas, los ensayos de iRNA usando qumicamente sintetizados siRNA han sido optimizados y los efectos no especficos cmo resultado de esta tcnica han sido minimozados. Efectos no especficos pueden ocurrir en mucho mayor cantidad en respuesta a siRNAs sintetizados a partir de promotores de Pol III. Si bien es muy efectiva en el silenciamiento de genes diana, los siRNAs sintetizados a partir de la pol tipo III (como T7 o U6) suelen resultar en la produccin de efectos no especficos intensos, lo cual se ha visto que puede deberse a elementos presentes en la regin 5 de esos siRNAs producidos enzimticamente , los cuales parecen responsables de la induccin de la ISG.

Efectos teraputicos del iRNA

Son muchas las aplicaciones teraputicas que el iRNA ofrece: 1. Infecciones virales: Uno de los efectos teraputicos mas tempranos propuestos para el uso del iRNA fue la inhibicin de infecciones virales, y muchas commpaias se encuentran trabajando en terapias basadas en el iRNA.

2.

3.

Enfermedades neurolgicas: La enfermedad del Parkinson, el sndrome de Huntington, el sndrome X frgil, la esclerosis lateral amilotrofica o la atrofia muscular espinobulbar son solo algunas de las enfermedades neurolgicas prominentes para los que las terapias basadas en iRNA pueden ser de utilidad. Oncologa. Mientras la quimioterapia convencional ha provado ser efectiva para matar clulas cancerosas, su falta de sensibilidad para distinguir clulas tumorales de clulas normales resulta en un significamente grado de muestes celulares colaterales. Entonces, una terapia que pudiera ser diana especfica a las clulas cancerosas proporcionara una opcin de tratamiento ms atractiva.

4.4. Ocular disease Angiogenesis additionally has a causal role in several ocular diseases including age-related macular degeneration (AMD), herpetic stromal keratitis, and diabetic retinopathy [171]. VEGF has been found to be directly involved in the destructive vascularization associated with these ocular disease. The ability of VEGF-specific siRNAs to reduce VEGF-dependent vascular invasion of the eye has not only been demonstrated in animal models [130,131] (Table 3), but phase I AMD clinical trials in patients is ongoing as well

4.5. Inflammation and apoptosis In some diseases, the pathology observed is caused by the activation of innate cellular processes. Hence, by targeting key molecules involved in these pathways, RNAi therapeutics may provide a means of controlling the cellular processes responsible. For example, tumor necrosis factor (TNF)a is a proinflammatory cytokine involved in the chronic pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA). While drugs currently being used to block the action of TNFa have been shown to be effective in reducing inflammation and slowing RA progression, several risks, such as congestive heart failure, demyelinating diseases, systemic lupus erythematosus, lymphoma, and serious infections, have been associated with the use of systemic TNFa-blockers

Transkingdom RNA Transkingdom RNAi (tkRNAi) As outlined above, the delivery strategies developed thus far have focused mainly on developing chemically modified siRNA to increase stability, and on complexing

siRNA with liposomes, nanoparticles and polymers to prevent degradation and promote cell uptake. The main disadvantage of these approaches, however, is that they tend to have a limited ability to target specific cell types or tissues. Moreover, they typically require large quantities of siRNA that is expensive to manufacture. Viral vectors have also been explored as a means of delivering RNAi in vivo. While this approach has important research applications, problems associated with insertional mutagenesis, safety, lack of tropism, and the generation of host immune responses have significantly limited the utility of viral vectors for gene therapy. Recently, in an effort to overcome the delivery problem, we have developed TransKingdom RNAi (tkRNAi) for in vitro and in vivo gene silencing in mammalian cells (Figure 1) (Xiang et al., 2006). In this system, silencing shRNA are transcribed from a TransKingdom RNAi plasmid (TRIP) by T7 RNA polymerase inside nonpathogenic bacteria that have been engineered to invade target cells. Following uptake into phagosomes, the bacteria are lyzed releasing their silencing shRNA into the host cell cytoplasm. RNAi-mediated gene-silencing is then achieved through the canonical Dicer/RISC pathway. This novel approach has several advantages over delivery mediated by complexed siRNA and viral vectors. First, the TransKingdom system may provide a practical and clinically compatible way to achieve RNAi for medical indications. In contrast to viral vectors, non-pathogenic bacteria have been used clinically for decades with a proven track record of safety in the treatment of gastrointestinal diseases such as diarrhea, irritable bowel syndrome and inflammatory bowel disease. For example, a strain of Lactococcus lactis engineered to secrete interleukin-10 has recently been investigated for the treatment of Crohns disease (Braat et al., 2006). There has also been renewed interest in the use of bacteria to treat human solid tumors (Pawelek et al., 2003; Ryan et al., 2006; Wei et al., 2007). This is based on the observation that various non-pathogenic anaerobic bacteria can infiltrate and replicate within solid tumors when given intravenously. Indeed, attenuated S. typhimurium expressing E. coli cytosine deaminase has proven effective for the selective conversion of the pro-drug 5-fluorocytosine to 5-fluorouracil in tumors of tumor-bearing mice, and has

been tested in 3 phase I clinical trials with demonstrated safety in patients with late stage cancer (Cunningham et al., 2001; King et al., 2002). Thus, this RNAi approach can potentially be exploited to silence genes of interest at various sites colonized by non-pathogenic and/or commensal bacteria.

Second, the production of silencing shRNA by engineered non-pathogenic bacteria eliminates the siRNA manufacture issue, and significantly reduces the cost compared to other delivery technologies. Moreover, the bacterial RNAi approach may circumvent, or mitigate, host interferon-like responses since direct cytoplasmic release of shRNA by the engineered bacteria will likely avoid activation of TLR, PKR and

RIG-I in target cells. Third, tkRNAi may have significant implications for high throughput functional genomics in mammalian systems. Bacteria, especially E. coli, have served as a wellvalidated and versatile vector system for the revolution in molecular biology and biotechnology that has occurred over the last few decades. Using the tkRNAi approach, a laboratory can easily establish E. coli-based RNAi against any gene of interest. A major advantage of this system for functional genomics studies is that it can be easily reproduced and stored for long term use. Thus, tkRNAi should provide a stable and consistent gene silencing tool. Another benefit of the tkRNAi approach is that it can be easily translated to in vivo systems in order to verify in vitro observations in live animals. Furthermore, non-pathogenic bacteria can be used in a routine biological laboratory, rather than a BL2 laboratory which is required for viral vector-based systems. Other advantages of using bacteria as a delivery vector for siRNA include the ability to control the vector using antibiotics and/or auxotrophy, and the ease of engineering specific vectors for particular applications.