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Blvd. J. Alonso de Torres 312 pte. Col. San Jernimo Len Gto. (477) 718-5948 ventasleon@microelisas.com
REACTIVOS
MATERIAL PROVEEIDO A. Antgeno Car cinoembrionario (CEA) -- 1ml/vial - frascos del A-F Seis (6) frascos de referencia de Antgeno CEA en niveles de 0 (A), 5 (B), 10 (C), 25 (D), 50(E) y 250(F) ng/ml. Almac n en 2-8C. Se ha agregado un preservativo. Nota: Los estndares, basados en suero humano, fueron calibrados usando una preparacin de referencia, la cual fue analizada contra la 1 Preparacin de Referencia Internacional (IRP# 73/601). B. TRAZADOR DE CEA - 13ml/vial. Un frasco (1) que contiene antic uerpo etiquetado de enzima, biotinilado monoclonal de ratn IgG en solucin, tinte y preservativo. Almacn de 2-8C C. 96 Pozos de Reaccin a la Luz - icono ? Un (1) microplato de 96 pozos cubierto con streptavidin y empaquetado en una bolsa de aluminio con un agente deshidratador. Almacn en 2-C. D. SOLUCION CONCENTRADA LAVADORA - 20ml - Icono Un (1) frasco que contiene un surfactante en solucin salina. Preservativo agregado. Almacn en 2-30 C. (Ver Seccin de Preparacin del Reactivo). A E. REACTIVO DE SEAL A -- 7ml/botella del icono S Un (1) bote que contiene Luminol en solucin. Almacn en 2-8C. (Ver Seccin de Preparacin del Reactivo). F. REACTIVO DE SEAL B -- 7ml/botella del icono SB Un (1) bote que contiene el perxido de hidrgeno (H O) en solucin. Almacn en 2-8C. (Ver Seccin de Preparacin del Reactivo). G. INSERTO DE LA PRUEBA. Nota 1: No utilice los reactivos ms all de la fecha de vencimiento del kit. Nota 2: Los reactivos abiertos son estables por sesenta (60) das cuando estn almacenados en 2-8C. Nota 3: Los reactivos son para un s olo microplato de 96-pozos. MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO: 1. Mida con una pipeta capaz de entregar los volmenes 25l y 50l con una precisin mejor de 1.5%. 2. Dispensadores para las entregas repetidas de los volmenes 0.100ml y 0.300ml con una precisin de mejor de 1.5%. 3. Lavador de Micro plac as o una botella de apretn (opcional). 4. Luminmetro de Microplatos. 5. Papel absorbente para retirar los excesos de los pozos de la micro placa. 6. Plstico envolvente o tapa para la micro placa para los pasos de la inc ubacin. 7. Aspirador de vaco (opcional) para los pasos de lavado. 8. Contador de tiempo. 9. Materiales del control de calidad.
PRINCIPIO
ENSAYO INMUNOENZIMOMTRICO (Tipo 3): Los reactivos esenciales requeridos por un ensayo Inmunoenzimomtrico incluyen alta afinidad y antic uerpos espec ficos (enzima e inmovilizado) con diferentes y reconocimiento distinto eptome, en exceso y antgeno nati vo. En este procedimiento, la inmovilizacin toma lugar durante el ensayo en la s uperficie del micro pozo a travs de la interaccin de streptavidin recubierto en el pozo y exgeno agregado anticuerpo monoclonal biotinilado anti-CEA. Mezclando el anticuerpo monoclonal biotinilado, el anticuerpo etiquetado y un suero que contienen el antgeno nativo, la reaccin de la competicin resulta entre el antgeno nativo y los anticuerpos, sin la competencia o steric hidrance, para formar un sndwich complejo soluble. La interaccin es ilustrada por la ecuacin seguida:
PRECAUCIONES
Para el Uso De Diagnstico in Vitro. No Para Uso Interno o Externo en Seres Humanos o Animales. Todos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para ser no-reactivos para el antgeno superfic ial de la hepatitis B, los anticuerpos del VIH 1&2 y de HCV por los reactivos con licencia del FDA. Puesto que ninguna prueba sabida puede ofrecer termine el as eguramiento que los agentes infecciosos estn ausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como potencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedad. Los buenos procedimientos del laboratorio para manejar productos de la s angre se pueden encontrar en el Centro para el Control de Enfermedad/el Instituto Nacional de la Salud, "Bioseguridad en laboratorios microbiolgic os y biomdicos ," 2da Edicin, 1988, publicacin No. (CDC) 88-8395 de HHS.
Simultneamente, el complejo es depositado en el pozo a travs de la reaccin de alta afinidad de streptavidin y anticuerpo biotinilado. Esta interaccin esta ilustrada abajo:
* Las informaciones presentadas en el Ejemplo 1 y figura 1 son ilustrativas solamente no deben usarse para basars e en la curva preparada con cada ensayo. En adicin, los RLUs de los calibradores han sido normalizados aproximadamente a 100,000 RLUs para el calibrador F (mayor salida de luz). Esta conversin elimina las diferencias causadas por la eficiencia de varios instrumentos que pueden s er usados para medir la salida de luz.
PR OCEDIMIENTO DE LA PRUEBA.
Antes de proceder con el ensayo, tenga todos los reactivos cerca, las referencias del suero y controles a temperatura ambiente (20-27C). 1. Ajuste el formato de todos los pozos para cada referencia de suero, controles y espcimen del paciente a ser ensayados en duplicado. Reempaque cualquier tira de micro pozos dentro de la bolsa de aluminio, sllese y gurdese a 2-8C. 2. Pipetear 0.025 ml (25l) de la referencia de suero apropiada, diluir el control o espcimen en los pozos designados. 3. Aada 0.100 ml (100l) del trazador del reacti vo CEA a cada pozo. Es muy importante dispensar todos los reactivos cerca del fondo del pozo cubierto. 4. Remolinear el mic ro plato gentilmente por 20-30 segundos para mezclar y cubrir. 5. Incubar 45 minutos a temperatura ambiente. 6. Descarte los contenidos del micro plato por decantacin o aspirac in. Si decanta, golpee ligeramente y borre la placa seca con toalla absorbente. 7. Agregue 350l de solucin lavadora (ver la seccin de preparacin de reactivos) decante (golpee y borre) o aspire. Repetir cuatro (4) veces adicionales para un total de c inco (5) lavados . Un lavador automtico o manual de platos puede ser usado. Siguiendo las instrucciones del fabricante para un uso apropiado. Si una botella de apretn es empleada, llene cad a pozo presionando el envase (evite las burbujas) para dispensar el lavador. Decante el lavador y repita cuatro (4) veces adicionales. 8. Agregue 0.100 ml (100l) de solucin de trabajo Reactivo de Seal a todos los pozos (ver Seccin de Preparacin de Reactivos). Siempre agregue los reactivos en el mismo orden para minimizar la difer encia de tiempo de reaccin entre los pozos. 9. Incube por cinc o (5) minutos en la oscuridad. 10. Lea las Unidades Relativas de Luz (RLUs) en cada pozo en 0.2 1.0 segundos. Los resultados deben darse dentro de los 30 minutos que se agrego el Reactivo de Seal.
CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe tener controles de ensayo en bajo, medio y alto rango de la curva de la reaccin para monitorear el buen funcionamiento del ensayo. Estos controles deben ser tratados como desconocidos y determinar los valores en cada mtodo de prueba realizada. Las tablas de control de Calidad deben de mantenerse para seguir el funcionamiento de los reactivos provedos. Los mtodos estadsticos pertinentes deben ser empleados para c omprobar las tendencias. Desviaciones significativas del funcionamiento establecido pueden indicar un cambio experimental en las condiciones o degradacin del kit de reactivos. Reactivos frescos deben usarse para determinar la razn de las variaciones.
RESULTADOS
Una curva de la reaccin a cierta dosis se utiliza para comprobar la concentracin de CEA en especimenes desconocidos. 1. Registre los RLUs (Unidades Relativas de Luz) obtenidos de la impresora del lector del micro placas conforme al ejemplo 1. 2. Trac e los RLUs para cada referencia duplicada del suero contra la concentracin correspondiente de CEA en ng/ml en el papel de grfico lineal. (No promedie los duplicados de las referencias del suero antes de trazar). 3. Dibuje la mejor curva a travs de los puntos traz ados. 4. Para determinar la concentracin del CEA para un desconoc ido, localic e el promedio de RLUs de los duplicados para cada desconocido en el eje vertical del grfico, encuentre el punto que se interseca en la curva, y lea la concentrac in (en pg/ml) del eje horizontal del grfico (los duplicados del des conocido se pueden promediar segn lo indicado). En el siguiente ejemplo, promedie los RLUs (23210) de las intersecciones desconocidas la curva de calibracin a (88ng/ml) concentracin CEA (Ver figura 1)*. Nota: El software de reduccin de datos de c omputadora diseado para los anlisis de CLIA se puede utilizar tambin para la reduccin de datos. Los duplicados de un desconocido deben ser promediados como se indica (ver figura 1).
D. Especificidad. Los anticuerpos altamente especficos de las molculas del CEA han sido usadas en el procedimiento de ELISA del CEA. Ninguna interferencia fue detectada con el funcionamiento del CEA de ELISA una vez adicionando las cantidades masivas de las siguientes sustancias a una piscina de suero humano. cido Acetilsaliclico cido Ascrbico Cafena AFP PSA CA-125 hCG hLH hTSH hPRL 100 g/ml 100 g/ml 100g/ml 10 g/ml 1.0 g/ml 10,000 U/ml 1000 IU/ml 10 IU/ml 100 mlU/ml 100g/ml
Es importante tener presente que el establecimiento de una gama de los valores que se pueden esperar s er encontrado por un mtodo dado para una poblacin de "personas -normales" es dependiente sobre una multiplicidad de factores: la especificidad del mtodo, de la poblacin probada y de la precisin del mtodo en las manos del analista. Por estas razones cada laboratorio debe depender de la gama de valores esperados establecidos por el fabricante solamente hasta que una lata interna de la gama determinada por los analistas usando el mtodo con una poblacin indgena al rea en la cual el laboratorio est situado.
REFERENCIAS.
CA RACTERISTICAS DE ACTUACIN
A. Precisin. La prec isin en y entre la precisin del anlisis del procedimiento de CEA CLIA fue determinada por anlisis en tres diversos niveles de los sueros de control. El nmero, el valor medio, la des viacin de estndar (? ) y el c oeficiente de variacin para cada uno de estos s ueros del control se presentan en la tabla 2 y la tabla 3.
B. Sensibilidad El procedimiento del CEA tiene una sensitividad de 0.0125 ng. Esto es el equivalente a una muestra que contiene una concentrac in de CEA de 0.5 ng/ml. C. Exactitud El procedimiento del CEA CLIA fue comparada con un mtodo de referencia de ELISA. Los especimenes biolgicos de concentraciones bajo, normal y elevado fueron analizados. El nmero total de especimenes fue 202. La ecuacin de regresin del ultimo cuadro y el coeficiente de correlacin fueron computadas para el CEA en comparacin del mtodo de referencia. La informacin obtenida se muestra en la Tabla 4. TABLA 4 Ultimo recuadro Mtodo Este mtodo (X) Referencia (Y) Significado 5.67 5.75 Regresin Correlacin Anlisis Coeficiente 0.998
y=0.1164+1.0324(X)