Universidad Nacional Andrs Bello Facultad de Ciencias de la Salud Departamento de Ciencias Biolgicas Laboratorio de Biologa Celular BIO 035

Informe de laboratorio N5 Organizacin subclular

Alumnos: Stephanie fuentes Valdivia Pedro Hernndez Ahumada Hugo Bustamante Reyes Seccin: 12 Profesores: Juan Morgado Jorge Bobadilla

Introduccin

Fraccionamiento subclular Las clulas pueden ser de dos tipos. Procariontes como eucariontes estos ltimos poseen un ncleo que contiene la mayora del ADN envuelto en una membrana quedando separado del citoplasma que contiene organelos como: Las mitocondrias: contienen su propio ADN sintetizan protenas son de un tamao similar a las bacterias y son las responsables de la respiracin celular y produccin de energa. Cloroplastos: se encuentra solo en los organismos capaces de realizar fotosntesis. Estn compuestos por una envoltura, estroma y tilacoides. Retculo endoplsmatico: son sacos tubos y capas de membrana que se extienden a travs del citoplasma se encuentra a continuacin de la membrana nuclear sus funciones son la sntesis de lpidos (retculo endoplasmatico liso) y La sntesis de protenas (retculo endoplasmatico rugoso) Aparato de golgi: est constituido por cisternas discoidales aplanadas, paralelas y superpuestas, formadas por membranas lipoprotecas. Su funcin principal es la modificacin destinacin y empaquetamiento de macromolculas de secrecin o que estn destinadas a otros organelos. Los lisosomas: son vesculas membranosas que contienen enzimas hidrolticas requeridas para la digestin de molculas al interior de la clula. Ribosomas: Son grandes complejos de RNA y protenas se encargan de llevar a cabo el proceso de traduccin en la sntesis de protenas. Cuando se requiere el estudio de los componentes especficos de las clulas se recurre a la tcnica de fraccionamiento subclular la que consiste en un conjunto de procedimientos para llevar a cabo fracciones puras o especializadas en algunos de los componentes de la clula. Tambin este consta de pasos a seguir la primera es la ruptura de la clulas o homogenizado por algunos de los factores que lo hace posible como shock osmtico, sonicacin (por aplicacin de ultrasonidos a una suspensin celular) o moliendo las clulas con homogenizadores mecnicos. Y segunda es el procedimiento de fraccionamiento de los componentes de las clulas por centrifugado despus de ello se obtiene un precipitado o pellet que segn a la velocidad y tiempo que este se mantenga en la centrifugadora y cuantas veces la muestra a sido centrifugado es posible determinar el contenido de su pellet, tambin obteniendo una parte semilquida llamada sobrenadante contiene partes de los organelos sin centrifugado. Generalmente las muestras centrifugadas se procede a una evaluacin a travs de marcadores moleculares estos consisten en identificar y rectificar la distribucin y locacin de los componentes celulares por lo que se pueden mencionar como por ejemplos: el ADN es la molcula marcadora para identificar ncleos para la clara observacin de esta se utilizan colorantes bsicos como azul de tripn, azul B y azul toluidina. Las mitocondrias pueden ser identificadas por la decoloracin del azul de metileno.

Objetivo
El objetivo de este Laboratorio consiste en que el estudiante reconozca los diferentes componentes de la clula a travs del fraccionamiento subclular (Fraccin nuclear, fraccin Microsomal y Fraccin mitocondrial), conocer los distintos procesos para poder llegar a una determinada fraccin celular. Adems de evaluar con marcadores moleculares los componentes de la clulas a travs del reconocimiento de las mitocondrias para determinar las diferencias con los dems organelos.

Materiales y mtodo.
Actividad N1 Para este experimento ser entregado una muestra homogenizada de hgado de ratn. Llevar la muestra de 5ml a un tubo Falcon manteniendo el tubo en hielo hasta antes de ser puesto en la centrifuga (EBA 20) tener en consideracin que en la centrifuga tienen que estar balanceado el peso de las muestras. Centrifugar la muestra a 2500 RPM durante 10 minutos. Luego sacar la muestra en la cual se puede apreciar un pellet y sobrenadante. Retirar el sobrenadante y depositarlo en un nuevo tubo Falcon. Mantener el pellet y sobrenadante obtenido en hielo. Centrifugar el sobrenadante esta vez a 6000 RPM durante 20 minutos nuevamente se obtendr un pellet y sobrenadante el cual hay que retirar y depositar en un nuevo tubo Falcon con lo cual tendremos 3 muestras la primera con fraccin nuclear, la segunda con fraccin mitocondrial y la tercera con fraccin microsomal Con el primer pellet obtenido (fraccin nuclear) se debe colocar una gota sobre un portaobjeto luego colocar un cubreobjetos formando un ngulo para evitar burbujas que interfieran en la observacin colocar la muestra en la platina del microscopio ptico y usar el objetivo de 40X de aumento para realizar las observaciones de la muestra del pellet con fraccin nuclear. Luego agregar a la muestra azul de tripn y vuelva a realizar las observaciones. Informar que es lo que se observa. Preparar 4 tubos de ensayo rotulados y a cada tubo agregue la solucin que corresponda: 1tubo blanco agregar: 1mL Succinato 0,1M, 1mL azul de metileno y 2mL de agua destilada 2tubo fraccin nuclear agregar: 1mL Succinato 0,1M, 1mL azul de metileno, 1mL de agua destilada y 1mL de fraccin nuclear. 3tubo fraccin mitocondrial agregar: 1mL Succinato 0,1M, 1mL azul de metileno, 1mL de agua destilada y 1mL de fraccin mitocondrial. 4tubo fraccin microsomal agregar: 1mL Succinato 0,1M, 1mL azul de metileno, 1mL de agua destilada y 1ml de fraccin microsomal.

Agitar cada uno de los tubo y agregar 1mL de vaselina para evitar contacto de la muestra con oxigeno y luego llevar las muestras a un bao termo regulado a 37C y observar los cambios de las muestras.

Actividad 2 Observacin del corte hgado de un ratn utilizando el objetivo de inmersin (100X) Se entregara una muestra de hgado de ratn en un porta objeto la cual se deber poner sobre la platina y comenzar a observar en el microscopio ptico con el objetivo de 4X luego mover el revlver aumentando a los objetivos de 10X, 40X hasta llegar al objetivo de inmersin (100X) el cual requiere una gota de aceite inmersin. Para enfocar la muestra utilizar el tornillo micromtrico realizar las observaciones. Finalmente limpiar el objetivo de 100X en el cual se utilizo aceite de inmersin con un trozo de papel absorbente y xilol. Dejar el objetivo puesto en el de menor aumento para prximos experimentos.

Resultados
Actividad 1 Al observar la muestra del primer pellet obtenido se puede apreciar una muestra liquida que contiene organelos grandes y parte del sobrenadante que no se logro extraer. Es una muestra uniforme por lo cual no se logra diferenciar exactamente los componentes de la muestra. Fraccin Nuclear Aumento objetivo: 100X Aumento oculares: 10X Aumento total: 1000X Tipo de muestra: Temporal. Descripcin: fraccin nuclear obtenida con el primer centrifugado al cual corresponde a pellet y parte del sobrenadante que no se logro retirar, esta es una mezcla uniforme en la cual no se logra diferenciar los organelos que componen la muestra

Luego al observar la muestra aadiendo azul de tripn el cual tiene como objetivo unirse al ADN para lograr marcar los ncleos. Con esto ahora se puede diferenciar un sector de color azul el cual podemos concluir que es el ADN que est contenido en los ncleos de las clulas y que fueron marcados por el azul de tripn agregado a la muestra

Fraccin Nuclear Aumento objetivo: 100X Aumento oculares: 10X Aumento total: 1000X Tincin: Azul de tripn Tipo de muestra: Temporal. Descripcin: fraccin nuclear obtenida con el primer centrifugado al cual corresponde a pellet y parte del sobrenadante que no se logro retirar, en esta mezcla gracias a la tincin con azul de tripn se logra apreciar un sector de color azul el cual podemos deducir que corresponde al ADN que se encuentra en el interior del ncleo y que es marcado por el azul de tripn. Marcadores moleculares Las siguientes muestras fueron expuestas a un bao termo regulado a 37C. Esta temperatura se debe a que las muestras se encontraban a menos de 4C y se requiere que reacciones a la temperatura corporal que tiene el ratn al que se extrajo el hgado con el que se preparo la muestra. N Tubo Succin ato 0,1M 1 ml 1 ml 1 ml Azul de metile no 1 ml 1 ml 1 ml Agua destila da 2 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Fracci n nuclea r Fraccin mitocond rial Fraccin microso mal

1 2 3

Blanco Fraccin nuclear Fraccin mitocondr ial Fraccin microsom al

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

En la muestra blanco no se vio ninguna alteracin de color, no se presento precipitado por lo cual las dems muestras son comparadas con esta.

En la muestra nuclear se puede observar un precipitado con trozos de hgado que no fueron completamente fraccionados, un sector de color azul el cual corresponde a ncleos y restos de clulas y un sector ms claro que sera el sobrante con el agua destilada que se le agrego a la muestra de fraccin nuclear. En el tubo de fraccin mitocondrial se pudo apreciar un leve precipitado de color azul el cual correspondera a las mitocondrias presentes en la muestra de pellet. En el tubo microsomal se pudo ser un cambio de color sin precipitado y una densidad mayor con partculas en suspensin. Actividad N2 Muestra de hgado de ratn vista con distintos aumentos de microscopio ptico. En las cuales se pueden apreciar ramas de arterias hepticas, conducto biliar, rama de la vena porta, hepatocito, espacio de Disse, celula endotelial, celula de Kupffer, hemate y sinusoide.

Aumento objetivo: 4X Aumento oculares: 10X Aumento total: 40X Tipo de muestra: Permanente

Aumento objetivo: 10X Aumento oculares: 10X Aumento total: 100X Tipo de muestra: Permanente

Aumento objetivo: 40X Aumento oculares: 10X Aumento total: 400X Tipo de muestra: Permanente

Aumento objetivo: 100X Aumento oculares: 10X Aumento total: 1000X Tipo de muestra: Permanente

Discusin
Actividad N1 En general, el proceso de fraccionamiento subclular se tiene como resultado que en el primer centrifugado a una velocidad baja y en pocos minutos se obtiene en un tubo Falcon (tubos exclusivo para centrifuga) un pellet o sedimentado en el fondo de este enriquecido en organelos grandes, es decir, ncleos y tambin un sobrenadante (liquido suspendido). Posterior a este, el sobrenadante anterior se extrae del tubo Falcon y se procede a otro centrifugado de mayor velocidad y tiempo que el anterior en este se obtiene un pellet de fraccin mitocondrial (mitocondrias, cloroplastos, peroxisomas y lisosomas) y su respectivo sobrenadante utilizado en otro centrifugado con un aumento en velocidad y tiempo que el anterior obteniendo como resultado una fraccin microsomal (membrana plasmtica, fragmentos del retculo endoplsmatico) y su sobrenadante es utilizado para el ultimo centrifugado a velocidad alta y bastante tiempo con un pellet enriquecido en ribosomas siendo su sobrenadante el citosol de las clulas. Hay que tener en cuenta que todo el proceso se mantiene a una temperatura baja para que se mantengan inactivas protenas que hacen degradar los componentes de las clulas como fosfolipasas y proteasas Muestra de fraccin nuclear al microscopio En la muestra de fraccin nuclear al microscopio sin colorante de azul de tripn solo se poda ver una imagen uniforme en la cual no se lograban diferenciar organelos que se encuentra en la muestra preparada, esto cambia al momento de agregar el azul de tripn el cual es marcador de ADN con lo cual se hace visible la presencia de ncleos que contienen ADN en su interior con la presencia de sectores de color azul los cuales logran diferenciar ncleos de los dems organelos de la muestras Evaluacin del fraccionamiento subclular mediante marcadores moleculares Tubo blanco: este tubo no presento ningn cambio ya que no tenia presencia de ningn tipo de fraccionamiento celular Tubo fraccionamiento nuclear: su precipitado contena restos de ncleos cito esqueleto y restos de clulas. y el sobrenadante (restos de organelos) correspondiente con restos de agua destilada Tubo fraccionamiento mitocondrial: su precipitado contiene lisosomas, peroxisomas y mitocondrias ya teidas con la mezcla de azul de metileno, Succinato y agua destilada.

Tubo fraccionamiento microsomal: este tubo no presento precipitado solo presento microsomas y pequeas vesculas en suspensin

Actividad N2 Muestra de Hgado al microscopio En la observacin con el objetivo de 4X se puede apreciar solamente la mana de la vena porta y sinosoides. Al aumentar al objetivo a 10x se logra observar los hepatocitos que limitan los espacios ocupados por los capilares sinosoides. Luego en el siguiente objetivo, se logra distinguir con ms exactitud las fibras reticulares formando una red soporte para los hepatocitos. Y girando al objetivo 100X y utilizando una gota de aceite de inmersin se pudo distinguir completamente la estructura del hgado de ratn con todas sus partes incluso hasta la ms pequeas como las clulas de kupffer, el espacio de Disse, las clulas endoteliales y los hemates que son los componentes mas pequeos del hgado.

Otros mtodos de separacin de clulas.

Sedimentacin y centrifugado Centrifugacin diferencial practica utilizada solo cuando existen diferencias de tamao con respecto a los componentes que se estn utilizando por lo menos 10 veces mayor. Algunas de estas son centrifugacin a travs de un medio de densidad constante. Esta se dispone a varios medios de densidades aptas para tipo celulares concretos, tambin la centrifugacin zonal esta se utiliza para componentes celulares que son de similar densidad por ello se utilizan gradientes de densidad para un componente en especial. Adems est la centrifugacin isopcnica o de equilibrio de sedimentacin utilizado para separar clulas con densidades igual que se realizan sobre un gradiente de densidad y a un tiempo mayor para alcanzar el equilibrio de sedimentacin. Elutriacin centrifuga Otro mtodo es el elutriacin centrifuga consiste en separacin de clulas a travs de sus velocidades de sedimentacin en estas las clulas estn sometidas a dos fuerzas que son la fuerza centrifuga y la fuerza de arrastre producido por el flujo continuo en sentido contrario al medio Separacin por afinidad con partculas magnticas Consiste en un tipo de separacin a travs de unas micro esferas magnticas (oxido de hierro) las cuales estn recubiertas de un polmero plstico que permite la absorcin de distintas molculas. Frecuentemente se crean anticuerpos magnticas con los cuales se hacen mas especficos la separacin de ciertas molculas

Bibliografa
Universidad Nacional Andrs Bello. Gua de laboratorio N5: organizacin subclular. Curso BIO035 Biologa general 2009. Jos Luque, ngel Herrez, Biologa Molecular e Ingeniera Gentica, 2000, Elsevier, 2000, Barcelona, pg. 122-133. Luiz C. Junqueira, Jorge Carneiro, Histologa bsica (2005), El sevier, 6 Edicin, Barcelona, Espaa, pg. 326, 328