REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

- Técnica que ha revolucionado la genética

molecular
- Inicialmente descrita a mediado de los
años 80
- Presenta numerosas aplicaciones en
diagnóstico e investigación clínicos,
criminalística, control de calidad en la
industria alimentaria,investigación
científica, investigación antropológica y
arqueológica.
- Técnica que permite la amplificación in
vitro una secuencia de ADN definida
presente en cualquier fuente de ADN
-Reacción desarrollada por Kary
Mullis, por lo cual recibió el premio
Nobel de Química en 1993.

La reacción de amplificación utiliza

partidores que se asocian por
complementariedad y en forma
específica a los extremos que flanquean
la secuencia de interés para ser
amplificada

Thermus aquaticus, una bacteria termófila
descubierta en 1969 en el parque Nacional de
Yellowstone
Taq DNA polimersa
- DNA polimerasa aislada de la bacteria
Thermus aquaticus encontrada en aguas
termales
- Estable a elevadas temperaturas
- Temperatura óptima de actividad aprox.
72ºC
- Requiere Mg2+ como cofactor (como todas
las DNA polimerasas)
- Sustratos para la reacción:
- ADN templado
- partidores que proporcionen un extremo
3’OH libre
- dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
REACCION DE PCR
 Etapas en una reacción de PCR

• Desnaturalización inicial
- Desnaturalización Desnaturalización
• Ciclado - Alineamiento (templado)
- Elongación
• Extensión final

Alineamiento

Elongación
Especificidad de la
amplificación por PCR
- Diseño de los partidores

Longitud: aprox. 20 nts, dependiendo de la complejidad

del genoma
Especificidad: solo hibridizan con la secuencia de interés
Composición de bases: evitar repeticiones en tandem.
Ambos partidores deben poseer Tm similar.
Estructuras secundarias: evitar la formación de
estructuras secundarias como horquillas, y la formación
de dímeros por complementariedad de bases entre
ambos partidores.
Extremo 3’: evitar la complementariedad de bases entre
los dos partidores. Los dímeros de partidores reducen la
eficiencia de amplificación.

- Temperatura de alineamiento
Lo suficientemente elevada para evitar la hibridación
parcial con secuencias diferentes al templado que se
busca amplificar
Detección de los productos de amplificación por PCR
 APLICACIONES DEL PCR

- Tipificación de marcadores genéticos: RFLP y SRP

- Detección de mutaciones genéticas
- Clonamiento de cDNA y ADN genómico
- Secuenciación de ADN
- Walking genome
- Mutagénesis in vitro
 Reverse Transcriptase -PCR

La Tth polimerasa es una transcriptasa

PCR
La transcriptasa reversa hace una copia complementaria
del ADN a partir de ARN. (Howard M. Temin/David
Baltimore, 1975 Premio Nobel en Medicina)
reversa que trabaja a altas temperaturas y
puede se usada conjuntamente con la Taq
polimerasa en una reacción de PCR
Las secuencias de cDNA amplificadas desde RNA mensajero carecen de regiones intrónicas
 Amplificación de ADN para la identificación de mutaciones
Identificación de polimorfismos (RSP: restriction site polymorphisms)

Permite la identificación de
mutaciones como pequeñas
inserciones o deleciones
(ej: ∆F508 del alelo del
CFTR)

Los alelos 1 y 2 se distinguen por un polimorfismo que altera la secuencia nucleotídica de un sitio
específico para una nucleasa de restricción R: el alelo 1 posee el sitio, pero el alelo 2 no porque posee un
nucleótido alterado (X).
Los partidores de PCR amplifican un fragmento que contiene esta secuencia. Luego se realiza la digestión
de los productos de PCR con la enzima R
Los productos se observan en una electroforesis en gel, donde se observa un patrón diferente para cada
alelo.
 Análisis de polimorfismo por RSP
en un paciente con fibrosis quística

A: región KM19 amplificada por PCR = 550 pb

B: región MetH amplificada por PCR = 223 pb
+ alelo normal (posee el sitio de corte para la enzima
-alelo mutado (no posee sitio de corte)
-KM19 y MetH son secuencias presentes en la regiones adyacentes al gen
CFTR
Polimorfismo por VNTR: Huella dactilar del ADN
Determinación de paternidad por polimorfismo
VNTR
 PCR ANIDADA

Esta modificación consiste en una amplificación de una parte de un producto de una

reacción de PCR realizada con anterioridad. El producto obtenido está comprendido dentro
de la secuencia del producto de la primera ronda. Esta modificación permite aumentar
significativamente la sensibilidad y la especificidad de la reacción de la PCR.
 DESVENTAJAS DEL PCR CONVENCIONAL
CON DETECCION EN GELES DE AGAROSA

- Baja sensibilidad
- Baja resolución
-Estrecho rango de detección
(< 2 logs)
- Discriminación basada solo en el
tamaño del fragmento amplificado
- Resultado cualitativo (no expresado
en números)
- La tinción con BrEt solo permite una
cuantificación estimativa.
-No es un método automatizado
 PCR EN TIEMPO REAL (REAL TIME - PCR)

El PCR en tiempo real monitorea la fluorescencia emitida durante la

reacción como un indicador de la generación de productos de
amplificación por cada ciclo de PCR (en tiempo real)
 PCR EN TIEMPO REAL (REAL TIME - PCR)

El producto de amplificación asociado a fluorescencia en cada ciclo

durante el PCR es monitoreado directamente en un computador

Fluorescencia

Número de Ciclos
CUANTIFICACIÓN A TRAVÉS DE RT-PCR
2.5

NEG
10
100
F2 /F1 1.5 1000
10000

100000
1000000

0.5
0 10 20 30 40 50 60 70
Cycles

50
Ciclo umbral

40

30

20

10

0
1 2 3 4 5 6

Concentración log 10
 Resistencia de M.tuberculosis al antibiótico
rifampicina
Gen rpoB

Codón Codón
507 533

81pb

Producto Normal: …5’-ACGTAGTCAGGTCCACATGGA-3’… Tm1

amplificado
Mutado: -…5’-ACGTAGTCAGGTCCGCATGGA-3’… Tm2
Tm2 > Tm1
La alteración de la secuencia del producto de amplificación (mutación puntuales por
delección, inserción, sustitución) dan origen a productos con distinta Tm
(temperatura media de fusión) que puden ser detectados en PCR en tiempo real a
través de curvas de fusión (melting)
Tm de los productos de rpoB en tres muestras diferentes:
M. tuberculosis H37Rv (sensible)
M. tuberculosis R15 con una mutación puntual en el codón 526
M. tuberculosis R4 con una mutación puntual en el codón 531
Ventajas de la determinación por RT-PCR:

• Detección del producto de amplificación asociado a

fluorescencia en cada ciclo durante el PCR
• Análisis computacional (no en geles), permite la cuantificación
de ADN templado
• Automatización
• Menor tiempo de ejecución (30 min a 2 hrs)
•Más específico y sensible

LightCycler Roche
 PCR ASIMETRICA

En la reacción de PCR se
agrega uno de los partidores
en menor cantidad
permitiendo que este se
agote rápidamente durante
los primeros ciclo de
reacción.
Luego se amplifica
selectivamente solo una de
las hebras.

La secuenciación de ADN requiere una cantidad considerable de ADN que puede

ser obtenido por este tipo de reacción de PCR
 METODOS DE SECUENCIACION DEL ADN

1975 -1977: Allan Maxam y Walter Gilbert crearon un

método basado en la degradación química del ADN.

1975 -1977: Frederick Sanger y cols. crearon la

didesoxi-secuenciación, basada en la replicación del
ADN
 Método de secuenciación de Maxam y Gilbert
Etapas de la secuenciación:

1) Marcaje del ADN con 32P

2) Hidrólisis química selectiva
3) Análisis de los productos

1) Marcaje del ADN a secuenciar

2) Hidrólisis química selectiva
La hidrólisis química selectiva parcial da origen a
una colección de productos de diferente longitud
3) Análisis de los productos
 Método de secuenciación de Sanger

El didesoxinucleótido detiene la síntesis de ADN cuando es incorporado a la

hebra sintetizada
El primer o uno de los dNTPs se marca en forma radioactiva o química para poder detectar el ADN producido