ЯМР, ЭПР

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) в настоящее время является широко

используемым методом для изучения структуры биополимеров, о взаимодействиях между
молекулами и о молекулярном движении. Рассмотрим теоретические основы этого метода на
примере ЯМР для ядер атомов водорода 1Н.
Кроме заряда и массы, протон обладает механическим угловым моментом или спином
I. Вращение заряженной частицы порождает магнитное поле; этот заряд можно представить
как точечный магнит, ориентированный вдоль оси вращения. Напряженность этого
магнитного поля выражается как магнитный момент µ я. Подобно стержневому магниту,
имеющему северный и южный полюс, µя имеет направление. Протоны схематически можно
представить в виде микроскопических магнитных стрелок. При отсутствии внешнего
магнитного поля протоны имеют хаотическое распределение. При наложении внешнего
магнитного поля с напряженностью Н 0 возникает взаимодействие между магнитным
моментом протона µя и Н0. Энергия этого взаимодействия равна:

где gя - ядерный g - фактор я – ядерный магнетон

Для протона ядерное спиновое квантовое число I составляет +1/2, или – 1/2. Во внешнем
магнитном поле Н0 возможны две ориентации протонов: магнитные стрелки ориентируются
по полю (параллельно линиям магнитного поля) с энергией E1 = - 1/2gя я H0 ,
или против поля (антипараллельно линиям магнитного поля ) с энергиейE2 = + 1/2gя я H0 ,
Разность энергий между уровнями равна
Е = Е2 - E1 = gя я H0 ,
Между энергетическими уровнями ядер Е2 и E1 возможны переходы. При поглощении
энергии электромагнитного излучения в области радиочастот ядрами происходит переход с
одного уровня на другой. При наложении на систему ядер с различной ориентацией
переменного магнитного поля (перпендикулярно постоянному магнитному полю Н0)
происходит поглощение энергии волны определенной частоты v0.
v0 = gя я H0/h , где h – постоянная Планка.

Поглощение энергии переменного магнитного поля ядрами атомов называют ядерным

магнитным резонансом. Поглощенная энергия тратится на изменение ориентации ядер, т.е
изменение спина ядра. Для измерения ЯМР используются ЯМР-спектрометры (Рис1). Этот
прибор состоит из мощного электромагнита, который создает постоянное магнитное поле H0.
Между полюсами магнита которого поле H1 с частотой до 108 Гц , натравленное
перпендикулярно H0. Для достижения резонанса изменяют частоту переменного магнитного
поля. При определенной частоте магнитные моменты ядер меняют ориентацию, происходит
резонансное поглощение энергии переменного магнитного поля. Резкое изменение
магнитного поля фиксируется детектором (катушка, в которой индуцируется электрический
ток).

Любое ядро, например, протон, в магнитном поле может совершить только один
переход. Спин протона может составлять или +1/2, или – 1/2 . Спектр ЯМР ядра должен
состоять только из одной резонансной линии. Однако это не так, потому что ядра окружены
электронами и H0 индуцирует также и циркуляцию этих электронов. Движущиеся электроны
сами создают магнитное поле, которое также оказывает влияние на ориентацию ядра. Таким
образом, наблюдаемая резонансная частота ядер определенных атомов зависит от их
окружения, т.е. от структуры молекулы. Ценность ЯМР-спектроскопии обусловлена именно
этим эффектом окружения., так как в молекуле резонансная частота определенного ядра

1
одного и того же химического элемента, будет зависит от химической группы, которой
принадлежит ядро. Например резонансная частота протонов метильной группы будет
отличатся от частоты протонов аминогруппы. Более того, частота протонов метильной
группы толуола будет отличаться от частоты метильной группы уксусной кислоты. Такое
смещение резонансной частоты, обусловленное химическим окружением, называется
химическим сдвигом.

Рис. 39. Блок-схема ЯМР-спектрометра:

у–образец; 2–магнит внешнего поля И: 3–генератор внешнего капнятного поля; <–» генератор
электромагнитного поля; 5 – катушка для передачи электромагнитного поля •яастотой v; б–приемная катушка;
7–система регнефаи^и (сигнала ЯМР

Распределение протоне® по уровням £^ и £^ записывается согласно больцмановскому

распределению
• „ -ДЕ" - - ^^ "-^с*.?-. ^.27)
В магнитном поле Но= 10000 Гс при Т = ЖО К. отношение^ составляет всего
1,000007. Это указывает на то,что при комнатной температуре анергия взаимодействия
a
протона с магнитным полем мала по сравнению с разупорядочивающей тепловой
"1
энергией kyT и поэтому наблюдается ничтожное число ядер, ориентирован-яых по полю
(0,0007 %). Однако этот маленький избыток ориентированных ядер будет создавать
намагниченность вещества и вызывать поглощен-ие ЯМР.
Для того чтобы выявить разность двух энергетических уровней A£, необходимо
наложить переменное электромагнитное поле определенной частоты v. Поглощение энергии
этого поля будет происходить при условии, что магнитный вектор переменного поля
'перпендикулярен направлению постоянного магнитного поля //о и частота поля Vg
удовлетворяет условию ядерного магнитного резонанса:
Ь,=^яря^о. (4.28)
'Поглощенная энергия тратится на изменение одной ориентации протонов в другую.
Для изучения ЯМР используются fIMP-спек,-трометры. На рис. 39 представлена
упрощенная блок-схема ЯМР-таектрометра. В ЯМР-спектрометрах используется постоянная
частота электромагнитного поля Vo,- а для получения резонанса изменяется величина
внешнего магнитного ноля Н. Рассмотрим, какие параметры измеряют с помощью ЯМР-
спектроскопии.
Спин-решеточная и спин-спиновая релаксация. В результате существования
преимущественной ориентации вдоль направления внешнего магнитного поля появляется

2
суммарная намагниченность М ц . Это сумма проекций магнитных моментов отдельных ядер
на это направление. При включении внешнего магнитного поля Нц происходит переход ядер
от хаотического состояния к состоянию намагниченности по экспоненциальному закону
.
__ . _<_
My '=Л1в ( – '),
1 е г
(4.29)
где Мц–равновесное значение намагниченности; 7\– время продольной релаксации, или
спин-решеточной релаксации. При включении магнитного поля Ну наблюдается поперечная
релаксация с временем Tg, или спин-спиновая релаксация.
Окружение ядер называется решеткой. Релаксация продольной составляющей М\\ к
равновесию происходит под действием флуктуирующих магнитных полей в решетке, что
сильно влияет на величину 7'i. В твердых телах, где движение молекул ограничено, Ti велико
и достигает нескольких часов. В жидкостях 7\<10с.
Время поперечной релаксации 7'g, или спин-спиновой релаксации,' 1 ^
определяет полуширину линий ЯМР; Avi/a == -т • 1
Химический сдвиг. Экспериментальные значения резо-а нансных линий в ЯМР для
ядер в атомах и молекулах несколько ^ отличаются от теоретического значения ёя^яНу,
полученного для свободного ядра. Это связано с так называемым эффектом экранирования.
Он происходит вследствие влияния локального магнитного поля, создающегося внутри
атома электронными токами, которые индуцируются внешним магнитным полем. Эти
электронные токи образуют дополнительное поле на ядрах, которое по величине
пропорционально, а по направлению противоположно полю Ну. Поэтому эффективное поле
Нз, которое действует на ядро (протон), будет меньшее, чем приложенное поле Нц:
ТГ __ TV
Н^Н,-оН, иог=–^–. (4.30)
где о–постоянная экранирования. Это очень маленькая поправка, ее порядок составляет
10-в. Ценность метода ЯМР именно состоит в том, что резонансные линии будут значительно
отличаться в зависимости от того, в каких атомных группах находится протон. Смещение
резонансной частоты, обусловленное химическим окружением, называется химическим
сдвигом. |
Для измерения химических сдвигов в большинстве случаев у вводят в кювету с
исследуемым веществом стандарт, тетраметил-ls силан (ТМС), (СНз)431. Это вещество
имеет 12 эквивалентных протонов, которые дают одну резонансную линию в более высоких
полях, чем большинство других протонов. Шкала химических сдвигов определяется тогда,
как
и ^^–^ Ю<4м. д.], (4.31)
где Я об и Яст–резонансная напряженность магнитного поля для образца и стандарта.
Значение 6 выражают в миллионных долях [м. Д.] (англ. – ppm-parts per million).

рис. 40. Спектр ЯМР высокого раз- . c,/f,OH решения этанола:

5–химический сдвиг. Резонансная полоса •"' СН^ СНу стандарта тетраметилсилана (ТМС) с 6
=s 0 •

За нулевое значение принимается 6 для ТМС, и по отношению к ней откладываются

резонансные полосы для изучаемых соединений в шкале 6 (рис. 40). Например, спектр ЯМР
для этанола представляет три группы линий, связанные с нахождением протона в различном
окружении атомных групп ОН, CHg и СНз. В условиях высокого разрешения ЯМР-
спектроскопия позволяет получить разделение линий в атомных группах CHg (на 4

3
компоненты) и СНз (на три компоненты). Расстояние между линиями в каждой группе дает
константу спин-спинового взаимодействия.
Использование ЯМР для изучения структуры белка. Анализ спектров ЯМР
белков затруднен вследствие большого количества атомов водорода. Наложение магнитных
линий создает уширенные полосы в спектре ЯМР белков. Большинство резонансных полос
для алифатических групп аминокислотных остатков имеет б между 1 и 4,5 м. д., а для
ароматических боковых групп (гистидин, фенилаланин, триптофан, тирозин)– между 7 и 9 м.
д. По этим характерным полосам изучают развертывание белков при действии различных
факторов (температура, рН), взаимодействие субстратов с активным центром фермента (по
изменению сигналов ЯМР гистидиновых и фенилаланиновых остатков, которые часто
находятся в активном центре), конформационные перестройки бел' ков и динамику белковой
структуры.
ЯМР-томография. Вода–основная часть биологических объектов, поэтому
основным сигналом тканей есть сигнал протонного магнитного резонанса молекул воды.
Поскольку частота ЯМР пропорциональна напряженности внешнего магнитного поля, то,
создавая в ткани градиент магнитного поля, можно получить' спектр ЯМР, в котором
интенсивность сигнала на данной частоте будет характеризовать относительное количество
воды в той части ткани, которая находится в области определенного значения магнитного
поля. Биологический объект «просматривают» в разных направлениях в магнитном поле.
Затем с помощью компьютерного анализа воссоздают изображения по полученным
проекциям. ЯМР-томография обеспечивает возможность изучения различных частей
биологического объекта на основе различий амплитуды сигнала ЯМР в разных частях,
образца. Таким методом определяются размер и положение опухолей в организме.
Поскольку намагниченность (время продольной релаксации Т^) больше у опухолевых, чем у
нормальных, тканей сигнал ЯМР воды опухоли насыщается более легко, чем сигнал
нормальной ткани. Этот метод имеет преимущество перед рентгенографией, так как
радиочастотное электромагнитное облучение не вызывает повреждений биологического
объекта. Этим методом легко получают изображение органов внутри грудной клетки или
области в полостях черепа без хирургического вмешательства.
4.9. Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР). Явление ЭПР было открыто в
СССР в 1944 г. Е. К. Завойским. В парамагнитных полях им было обнаружено интенсивное
резонансное поглощение высокочастотной энергии при строго определенных соотношениях
напряженности постоянного магнитного поля и частоты.
Явление ЭПР состоит в резонансном поглощении энергии электромагнитного поля
парамагнитным веществом, помещенным в постоянное магнитное поле. Однако не все
электроны могут быть исследованы при помощи метода ЭПР. Большинство химических
соединений состоит из комплексов с заполненными электронными оболочками, в которых
все электроны спарены вследствие антипараллельной связи между ними. В соответствии с
принципом Паули в результате попарного взаимодействия электронов их собственные
спиновые магнитные моменты взаимно скомпенсирова-, ны, а суммарный магнитный
момент равен нулю.
ЭПР-поглощение определяется магнитными свойствами вещества, т. е. магнитными
свойствами электронов и ядер атомов. Электрон, хак движущийся заряд, создает вокруг себя
магнитное поде. Движение электрона по орбите приводит к появлению орбитального
магнетизма. Однако вклад орбитального электронного магнетизма незначителен,
возбужденные орбитальные состояния лежат намного выше основного состояния, в
результате чего орбитальный магнетизм в этих атомах практически погашен.
Кроме орбитального движения электрон обладает и собственным механическим
вращением – спином и связанным с ним маг-яитным моментом. Парамагнетизм вещества в
твердой фазе обусловлен в основном спиновым магнетизмом электронов.
Условием возникновения ЭПР является наличие у частиц исследуемого образца

4
нескомпенсированных магнитных моментов, обусловленных спином неспаренных
электронов. В системах с нечетным числом неспаренных электронов каждый электронный
уровень вырожден по спину по крайней мере дважды, т. е. уровни, характеризующиеся
положительным и отрицательным значением магнитного квантового числа электрона m.s
(например,, +1/2 и – 1/2), не отличаются по энергии.
В отсутствие внешнего магнитного поля все электроны парамагнитного вещества
имеют произвольную ориентацию спина и обладают одинаковыми энергиями, т. е.
наблюдается вырождение энергетического уровня (рис. 41, а). При помещении образца,
обладающего парамагнетизмом, в постоянное магнитное поле вырождение снимается, т. е.
появляются энергетические уровни, связанные с разрешенными ориентациями элементарных
магнитных моментов электронов (рис. 41, б). Промежуточные ориентации спинов
относительно магнитного поля запрещены условиями квантования.

Рис. 41. Схема ориентации магнитных моментов электронов в отсутствие внешнего магнитного поля (а)
и при помещении образцов в постоянное магнитное воле (б):
И – напряженность магнитного поля; Ei и Е, – энергетические уровни
Рис. 42. Схема расщепления энергетических уровней одного неспарен-ного электрона при наложении
внешнего магнитного поля при отсутствии сверхтонкого взаимодействия. Объяснение в тексте
При наложении внешнего магнитного поля электронные уровни расщепляются на два
подуровня с квантовым числом –г- t»s и –ту с разницей в энергии
AE=g^H, (4.32)
и „eh
где л – напряженность магнитного поля; р = -,–– – магнетон
•vSntflf-C
Бора, равный 9,274 • 10~24 Дж • Гл"1 (е–заряд электрона– 1,6 х X 10~19 Кл; те–масса
электрона –9,1 • 10~31 кг; h •– постоянная Планка; с – скорость света); g – фактор
спектроскопического расщепления, определяющий величину эффективного магнитного
момента частицы.
На рис. 42 представлена схема расщепления энергетических уровней одного
неспаренного электрона (спиновое квантовое число системы s= 1/2) при наложении
внешнего магнитного поля^. При этом энергия частиц, спины которых ориентированы по
полю, на 1/2 g^iH меньше энергии частиц в отсутствие внешнего магнитного поля (£'i= ЕО–
1/2§рЯ). Энергия частиц, спины которых ориентированы против поля на 1/2 g^H, превышает
значение в нулевом поле .(£'2== £'o~r_l/2gp^0. Следовательно, разность энергий уровней
равна g^H. Электроны в подсистемах Е^ и £a> возникших во внешнем магнитном .поле,
почти равномерно распределяются по двум уровням энергии с незначительным
преобладанием электронов со спином, ориентированным по полю. Распределение
электронов по энергетическим уровням зависит от температуры н описывается
больцмановским распределением (см. (4.27)).
Рис. 43. Схема, иллюстрирующая происхождение сигнала ЭПР в виде производной (3) от истинной
кривой (2) поглощения при помощи модуляции (/) электромагнитного поля:

5
 , /–интенсивность поглощения СВЧ-энергин 1

Между двумя уровнями возможны энергетические переходы, в результате которых

ориентация спинов будет изменяться на противоположную. Согласно основным принципам
квантовой механики, переходы между энергетическими состояниями могут быть вызваны
поглощением кванта hv. Если на спиновую систему, находящуюся в постоянном магнитном
поле, воздействовать переменным сверхвысокочастотным (СВЧ) электромагнитным полем с
частотой v и энергией квантов hv, то при условии резонанса
hv = АЕ = g^H (4.33)
индуцируются переходы между указанными энергетическими уровнями, т. е. происходит
обращение спинов. При переходе с нижне-:» . го уровня Ei на верхний Е^ происходит
поглощение энергииэлек-й: тромагнитного поля; одновременно с такой же вероятностью 'и
осуществляются переходы с уровня Е^ на уровень Е^ с испуска-''-'^нием энергии. Как
правило, поглощение превышает индуцированную эмиссию. Общее число неспаренных
электронов в системе и разница в заселенности электронами двух энергетических уровней
определяют интенсивность наблюдаемого сигнала ЭПР.
Из условия резонанса hv=g^H очевидно, что наблюдение спектра ЭПР вследствие
резонансных переходов электронов можно проводить двумя принципиально различными
способами: 1) изменять напряженность магнитного поля Н при фиксированном значении
частоты v; 2) изменять v при фиксированном значении Н. На практике ЭПР-спектрометры
работают на фиксированной частоте v излучения при изменении Н. Запись спектра ЭПР
осуществляется в координатах /пог = / (Н) . при v= const, где /nor– интенсивность
поглощения С.ВЧ-энергии. В целях повышения _ чувствительности "ЭПР- спектрометров
регистрируется не интенсивность поглощения энергии, а первая производная спектра
ЭПР– /пог» что достигается введением высокочастотной (ВЧ) амплитудной модуляции
магнитного поля. На рис. 43 представлена схема, иллюстрирующая возникновение сигнала
ЭПР в виде первой производной. При регистрации линии поглощения 2 ВЧ-модуляция
магнитного поля / вызывает появление сигнала ЭПР 3, амплитуда которого пропорциональна
величине первой производной поглощения при данном значении напряженности магнитного
поля Н.
На рис. 44 представлен общий вид ЭПР-спектрометра. Как и ЯМР-спектрометр, он
включает электромагнит, источник СВЧ-излучения, электронную систему регистрации. Но
поскольку ядерный магнетон (4.23) более чем на три порядка меньше магнетона Бора, то при
данной напряженности магнитного поля Н резонансная частота v для неспаренного
электрона обычно в КУраз превышает частоту, на которой работают ЯМР-спектрометры.
Если эксперименты по ЯМР проводятся на частотах в диапазоне мегагерц, то ЭПР-
спектрометры работают в диапазоне гигагерц.
Основными параметрами сигнала ЭПР являются фактор спектроскопического
расщепления (g-фактор), интенсивность (количество неспаренных электронов в образце),
ширина и форма линии.

6
 Рис. 44. Исследовательский ЭПР-спектрометр РЭ-Й07 (СССР)

Фактор спектроскопического расщепления характеризует положение линии в спектре

ЭПР, определяемое тем, насколько свойства неспаренных электронов, ответственные за
поглощение энергии в данном веществе, близки к свойствам свободного электрона,
магнетизм которого обусловлен только спиной, а g-фактор равен 2,0023. Значение g-фактора,
который используется для идентификации парамагнитных центров, может быть определено
из уравнения hv = g^H при одновременном измерении напряженности Н резонансного
магнитного поля с помощью протонного датчика и частоты v СВЧ-энергии, при которой
происходит поглощение. Для большинства парамагнитных центров g-фактор отличается от
значения 2,0023 в сторону как уменьшения, так и увеличения.
В связи с тем, что оценка абсолютного количества спинов в образце связана с
ошибками, проводят сравнительные определения амплитуды сигнала ЭПР или площади под
кривой поглощения. по отношению к стандартам. Чувствительность ЭПР-спектрометров
составляет 5- 10м неспаренных электронов при ширине! линии ЭПР 1 Э.
Ширина линии ЭПР, зависящая от концентрации парамагнитных центров и
взаимодействия их с растворителем, позволяет получить информацию о характере
взаимодействия неспаренных электронов друг с другом, с решеткой, о степени
делокализации неспаренных электронов на многих центрах. Ширина линии ЭПР, измеряемая
в эрстедах, определяется обычно сравнением с точно известной шириной линии
стандартного образца. Для ряда парамагнитных комплексов металлов при комнатной
температуре наблюдается уширение сигнала ЭПР, вследствие чего его нельзя
зарегистрировать. Понижая температуру образца, можно за счет ослабления спин-
решеточной релаксации повысить время жизни спина системы в возбужденном состоянии,
что дает возможность зарегистрировать сигнал ЭПР этой системы. Сигналы ЭПР
большинства парамагнитных комплексов в биологических объектах регистрируются по этой
причине при температуре жидкого азота (77 К) и ниже.
Форма линий спектра ЭПР, характеризующаяся формулами Гаусса или Лоренца,
определяется функциональной зависимостью интенсивности поглощения от частоты СВЧ-
энергии или напряженности магнитного поля.
Для парамагнитных центров, содержащих магнитные ядра, в спектре ЭПР возможно
наблюдение сверхтонкой структуры (СТС), которая возникает в результате взаимодействия
неспаренных электронов с магнитными моментами ядер. Аналогично электронным спинам
ядерные магнитные моменты, подчиняясь закону пространственного квантования,
ориентируются в магнитном поле дискретно (либо вдоль внешнего магнитного поля, либо
против него) (параграф 4.8). Ядра многих атомов обладают спином и, следовательно,
собственным магнитным моментом, который по абсолютной величине на три порядка
меньше магнитного момента электрона. Количество компонентов сверхтонкой структуры

7
определяется значениями ядерного спина данного атома по формуле 2/ + 1, где /– значение
ядерного спина атома. Следовательно, взаимодействие электрона с ядром приводит к
расщеплению каждого электронного уровня энергии на 2/+ 1 уровней. Вследствие этого
резонансное поглощение также расщепляется на 2/+ 1 равноудаленных линий одинаковой
интенсивности.
Число компонентов сверхтонкой структуры, величина расщепления, распределение
интенсивностей между компонентами и ширина отдельных компонент позволяют сделать
вывод не только о деталях строения молекулы, но и о распределении плотности
неспаренного электрона между различными атомами, об электронной структуре атома с
данным магнитным ядром, а также о взаимодействии парамагнитной частицы с окружающей
средой.
Следовательно, исследование сверхтонкой структуры спектров ЭПР имеет значение
для идентификации строения свободных радикалов и парамагнитных комплексов. Анализ
параметров сверх тонкой структуры позволяет судить о природе лигандрв в
координационной сфере металлов переходной группы, а также о характере связи этих
лигандов с центральным атомом.

W .

,0-
СНз

Убихинон Убисеми-хинон Дигидроубихино

('свободный н
радикал)
Рис. 45. Схема ступенчатого восстановления убихинона до дигидроубихино-на. При переносе электрона
образуется свободно-радикальная форма–уби-семихинон. В убихиноне из митохон.дрий млекопитакуцих
гидрофобный хвост, . который удерживает убихи-и.он в мембране митохондрий, содержит Ю изо-дреноидных
звеньев Скофермент Ою)

Сигнал ЭПР зависит от результирующего поглощения СВЧ-энергии, которое возникает

благодаря существующей разнице . в заселенности верхнего и нижнего энергетических
состояний. Однако продолжительное подкачивуние системы СВЧ-энергией в условиях
резонанса уравнивает, заселенности энергетических уровней, приводя к уменьшению
амплитуды сигнала ЭПР. Процессы релаксации, которые устанавливают больцмановское
распределение в условиях высокой мощности Р СВЧ-излучения, могут быть недостаточно
быстрыми для его поддержания. Если интенсивность сигнала ЭПР перестает изменяться
пропорционально У^Р, наступает насыщение Эффект насыщения следует учитывать при
исследовании в биологических образцах парамагнитных металлоферментных центров и
свободных радикалов семихинон-ного типа. С помои ью насыщения представляется
возможным разделить два перекрывающихся сигнала ЭПР при условии, что один из них не
насыщается, а другой: зависит т мощности СВЧ-излучения.

8
 С помощью метода ЭПР показано, что биологические системы животного и
растительного происхождения содержат свободные радикалы, которые представляют собой
молекулу или ее компоненты, имеющие неспаренный электрон. Свободные радикалы
обладают парамагнитными свойствами благодаря и ее компенсировав-, ным магнитным
моментам неспаренных электронов.
Схема ступенчатого биологического восстановления или окисления с образованием
промежуточной семихинонной формы, содержащей нечетное число электронов, является
теоретической основой для объяснения образования свободно-радикальных состояний в
окислительно-восстановительных реакциях (рис. 45)? Семихинонами принято называть
различные органические про межуточные свободнорадикальные формы. Основным
источником свободных радикалов в биологических системах являются семи-хинонные
формы убихинона Qio и флавинов, структурные формулы которых представлены на рис. 45 и
46.

Рис. 46. Флавосемихинон

Метод ЭПР нашел эффективное применение для изучения молекулярных переносчиков

электронтранспортной цепи мембран митохондр-ий, включающих НАДН, флавины,
кофермент Qm, железосерные центры, цитохромы в, Ci,c, а также цитохром с-ок-сидазу. В
митохондриях различных органов при температуре 77 К регистрируется сигнал ЭПР с g-
фактором 1,94, который обусловлен комплексами негемового железа в восстановленной
форме. Применение температур ниже 30 К позволило идентифицировать при использовании
метода ЭПР различные железо-серные (F&–S) центры электронтранспортной цепи
митохондрий. Информация о железосерных центрах представлена в параграфе 12.2.
В ряде органов при температуре 77К наблюдаются сигналы .окисленной формы
цитохрома Р-450 электронтранспортной цепи микросом. Сигналы ЭПР, обусловленные
низкоспиновым состоянием гемового железа цитохрома Р-450 имеют gi= 2,42, gg == 2,25 и
gy== 1,91. Характерным свойством цитохрома Р-450 является возможность перехода
низкоспиновой формы в высокоспинов^ ю при его восстановлении, в этом случае
регистрируется СИГНРЛ ЭПР со значениями g^_ =6,1 и g^ =2,0. Сигнал ЭПР цитохрома Ьд
электронтранспортной цепи микросом при 20 К имеет три компонента с gi==3,05, g-a=2,22,
gg= 1,41.
ЭПР-спектроскопия получила дальнейшее свое развитие вследствие применения спин-
меток, т. е. синтезированных соединений, ' содержащих парамагнитный центр. Спиновыми
метками обычно называют нитроксильные радикалы, которые ковалентно связываются с
биологически активными молекулами. Если связь радикала обусловлена
электростатическими силами или гидрофобными взаимодействиями, то такая молекула
называется спиновым зондом. Наиболее широкое применение для биологических
исследований получили нитроксильные свободные радикалы, характеризующиеся
стабильностью благодаря низкому уровню энергии основного состояния нитроксильной
группы N'–О, которая содержит неспаренные электроны (рис. 47). Принципиальным
свойством нитроксильных радикалов является способность к вза-. имодействию без
затрагивания свободной валентности.

Рис. 47. Стабильный нитроксильный свободный радикал – * СН, основа спиновых меток и зондов: Гн
Ri a Ri – химические группы

9
 Спектр ЭПР нитроксильного радикала состоит из /^0 трех узких линий,
эквивалентных по интенсивности ^?г~ i\ и' ширине, которые являются сверхтонкой
(

структурой | сн, вследствие взаимодействия неспаренного электрона ^ с ядром 14N.

Константа сверхтонкого взаимодействия изменяется в пределах 15–17 Э в зависимости от
природы растворителя и структуры остальной части молекулы спин-метки.
Интерпретация интенсивности, ширины и формы линий спектра ЭПР спиновой метки,
введенной в биологическую структуру, дает информацию о физических и физико-
химических параметрах микроокружения нитроксильного радикала. Уменьшение скорости
молекулярного движения приводит к уширению триплетного спектра нитроксильного
радикала, что свидетельствует об увеличении вязкости среды. Кроме определения времени
вращательной корреляции т, которое пропорционально микровязкости мембран» важнейшим
является параметр упорядоченности S. Определение этого параметра позволяет судить о
фазовых переходах в ли- ' пидном слое мембраны и других средах. Так, параметр
упорядоченности для липидов в жидком состоянии в несколько раз выше, чем в твердом.
При снижении вязкости мембран параметр упорядоченности уменьшается.
Благодаря применению спиновых меток и зондов получены новые данные о строении и
функционировании субклеточных структур, о липидах и белках, о липид-белковых
взаимодействиях в мембранах. Применение спиновых меток, обладающих различной
растворимостью в гидрофильной и гидрофобной фазах, открывает возможности для
параллельного изучения структуры молекулярных комплексов мембран. Разработаны
методы синтеза жирных кислот и фосфолипидов, меченных в определенном положении, что
находит применение для характеристики подвижности фосфолипидов в бислое мембраны.
Актуально применение метода 5ПР для изучения первичных и вторичных механизмов
действия ионизирующей радиации на клетки и ткани.
4.10. Ферментный катализ. В живом организме выполняется огромное количество
обратимых химических реакций: гидролиз,» расщепление химических связей, образование
новых, изомеризация, перенос электронов и др. Больших скоростей биологических реакций
невозможно достичь простым увеличением температуры или давления. Ускорение
химических'превращений в клетке связано с функционированием природных катализаторов–
ферментов, работающих при умеренных физиологических температурах и рН.
Отметим ряд особенностей функционирования ферментов^ Не* обычным свойством
ферментов является эффективность их каталитичеекого действия». Катализируемые
ферментами реакции протекают со скоростями, в 108–Ю20 раз большими, чем
соответствующие некатализируемые реакции. Другая особенность ферментов состоит в их
специфичности действия. Фермент взаимодействует и воздействует только на. один тип
субстрата. В основном функция ферментов, состоит в снижении энергетических барьеров
химических реакций:, которые имеют значительную величину при неферментативном
катализе. Например, при неферментативном разложении перекиси водорода энергия
активации большая – 75 кДж • моль"1. При участии фермента каталазы энергетический
барьер снижается до 8 кДж • моль"1, в результате чего происходит увеличение скорости
реакции в 3 • 10" раз.
Как работают ферменты? Какой механизм взаимодействия фер- i мента с субстратом?
Первоначально возникла идея Е. Фишера, предполагающая очень жесткую подгонку
субстрата к активному центру фермента по типу ключ– замок. Со временем накапливалось
все больше фактов о неправомочности статической модели'! Фишера. Так, оказалось, что
малые молекулы, которые легко! проникают в активный центр, не присоединяются к его
поверхности, тогда как их аналоги большего размера легко присоединяются и преобразуются
в активном центре. Эти и другие факты, о которых говорилось в параграфе 4.5, явились
основанием для представления ферментов как динамических флуктуирующих систем.
Д. Кошланд предложил теорию индуцированного структурного,. соответствия

10
фермента и субстрата. Согласно этой теории, субстрат вызывает существенные изменения
геометрии фермента при проникновении в активный центр. В результате конформа-ционной
перестройки активного центра происходит точная ориентация каталитических групп
фермента. В теории Кошланда четко разделяются два процесса – связывание субстрата и его
каталитическое преобразование. Каталитические группы / активного центра свободного
фермента не находятся в той ориентации, в которой они осуществляют эффективный катализ
(рис. 48, а). После связывания субстрата с ферментом происходят конформационные
изменения в активном центре, в результате чего каталитиче-, ские группы занимают
необходимую для катализа ориентации (рис. 48, б). Главная причина увеличения абсолютной
скорости реакции состоит в замене маловероятных реакций высокого порядка, которые
требуют соударений трех и больше числа молекул,' высокоэффективными реакциями
низкого порядка. Теория Кошлан"» да основана на динамическом соответствии фермента и
субстратам не только фермент влияет на структуру субстрата, но и сам суб- 1 етрат изменяет
конформацию фермента.
В настоящее время преобладает точка зрения, что в функционировании ферментов
динамика белковой структуры играет су-| щественную роль. Если бы атомы белков
находились в статических ' положениях, то различные низкомолекулярные лиганды были бы
не в состоянии ни проникать в центры связывания, ни покидать] их пределы.

'Рис. 48. Механизм Рис. 49. Конформационные изменения, вызванные связыванием

индуцированного структурного лиганда:
соответствия фермента Е и а – локальные *конформа.,иолные изменения в области активного
субстрата S: центра; б – крупномасштабные междоменные движения;
д – свободный •S-субстрат; Е – фермент; ш – «шарнирное* соединение; £* –новая
фермент; ,б – фермент-суб- конформация фермента после связывания субстрата
стратньй комплекс; / –
каталитические группы; 2 –
группы, ответственные за
связывание субстрата

11
 Рассмотрим конформационные изменения белков, вызываемые
связыванием низкомолекулярных лигандов. В отсутствие связанного лиганда
белок находится в равновесии с двумя (или больше)" разными
конформационными состояниями, хотя часто одна из конформаций является
наиболее предпочтительней. Связывание лигандов изменяет равновесное
распределение среди этих кон-формаций таким образом, что уже другие
конформации являются предпочтительными для комплекса белок–лиганд. В
настоящее время с помощью рентгеноструктурного анализа высокого
разрешения обнаружено несколько типов конформационных перестроек,
вызываемых связыванием лигандов. Выделяют два типа перестроек.
Первый тм–это небольшие, локальные конформационные перестройки,
которые затрагивают только область активною центра. Для таких
мелкомасштабных конформационных изменений характерны небольшие
локальные смещения– не больше 1,5 нм. В ряде случаев информационное
изменение, вызванное связыванием лигандов, проявляется локально в центре
связывания и может вовлекать только свертывание небольшого полипептида и
связанной с ним боковой группы аминокислотного остатка, как это хорошо
показано для карбоксипептидазы. Тирозиновый остато» 248 этого фермента
смещается на 1,2 нм при конформационном пере-эюде из состояния, когда
лиганд отсутствует, в состояние, когда лиганд связан в активном центре (рис.
49, о).
Другой тип включает крупномасштабные конформационные перестройки,
сопровождающиеся смещением отдельных счруктур-яых блоков фермента на
расстояния больше 1,5 нм. Такая конфор-мационная перестройка может быть
связана с относительным движением структурных доменов (рис. 49, б). Для
гексокиназы показано, что связывание лигандов вызывает 'существенную
реориентацию относительного положения двух доменов, хотя конфори-а-ция
самих доменов изменяется незначительно. Слабоупорядоченная полипептидная
цепь, связывающая два домена, выполняет функцию шарнира.
Во многих сложных ферментах лиганды связываются в глубокой щели,
которая лежит между двумя доменами (рис. 49, б). В результате
конформационной перестройки лиганд «прячется» между доменами. Это
хорошо показано для алкогольдегидрогеназы печени. Алькогольдегидрогеназа
состоит. из двух одинаковых субъединиц, каждая из которых образована одной
полипептидкой цепью, состоящей в свою очередь из двух доменов. С помощью
рентгеноструктурного анализа показано, что алкогольдегидроге-наза может
находиться в двух конформациях. Одна из них, открытая конформация,
свойственна апоферменту (отсутствует кофер-мент). В закрытой конформации
домены сомкнуты вследствие того, что с одним из них связывается кофермент
НАДН, определяющий перенос электронов в электротранспортных процессах.
Открытая-конформация позволяет коферменту проникнуть к центру
связывания, а возникшая в результате конформационной перестройки закрытая
структура создает особое окружение, изолирующее кофермент и субстрат от
внешней среды и обеспечивающее эффективное взаимодействие между ними.
После завершения химической реакции фермент вследствие флуктуации снова
принимает открытую конформацию, т. е. домены раздвигаются и при этом осво-
-бождаются продукты реакции.
Для понимания механизма взаимодействия фермента с субстратом важное
значение имеет молекулярно-динамическое моделирование (Карплус, Мак-
Каммон, 1983), позволяющее детально описать движение белковой структуры,
рассматривая атомы белка как частицы, подчиняющиеся законам механики.
Процесс моделирования состоит из множества небольших шагов
продолжительностью Ю~15 с, на каждом из которых производится расчет
координат и скоростей для всех атомов. Удается получить на дисплее ЭВМ
траектории атомов, отражающие динамику белковой структуры на протяжении
10 ~9 с и больше. Для этого требуется свыше миллиона шагов и несколько сотен
часов машинного времени современной ЭВМ.
Переход алкогольдегидрогеназы из открытой конформации в закрытую
моделируется вращением доменов вокруг гибкого шарнира на угол 30°.
Результаты моделирования показали, что если бы домены имели абсолютно
жесткую структуру, то для их вращения и сближения необходимо преодолеть
чрезвычайно большой энергетический барьер, порядка 4200 кДж • моль""1. При
физиологических температурах тепловой энергии атомов было бы недостаточно
для преодоления такого барьера. Однако если вращение доменов
сопровождается флуктуациями, то энергетический профиль вращения
становится более пологим, и тепловой энергии атомов достаточно для
совершения крупномасштабного перемещения доменов. В результате
множества мелких флуктуирующих смещений атомов возможно постепенное
снижение энергетического барьера. Фермент представляет собой «дрожащую»,
самонастраивающуюся структуру. Расчеты свидетельствуют < qro в растворе
при комнатной температуре случайные броуновские движения доменов
обеспечивают молекулу фермента энергией, достаточной для того, чтобы могли
произойти спонтанные переходы между открытой и закрытой конформациями
за 10 "'9 с. Флуктуации атомов и их релаксация в новое положение не
превышают 0,05 нм, что сопоставимо с амплитудами колебаний атомов вблизи
равновесия. Длительность таких флуктуации (10-12 с) значительно короче, чем
длительность крупномасштабных перемещений и вращений доменов.
Таким образом, небольшие высокочастотные 'флуктуации белковой
структуры играют важную роль в крупномасштабных согласованных
перемещениях доменов. Динамика белковой структуры играет, решающую роль
в ферментативном катализе.
4.11. Кинетика ферментативных реакций