SRIES EM BIOTECNOLOGIA

volume I

Tecnologia de Bioprocessos

P 436 t Pereira Jr., Nei. (editor-autor) Tecnologia de bioprocessos / Nei Pereira Jr., Elba Pinto da Silva Bon, Maria Antonieta Ferrara. Rio de Janeiro: Escola de Qumica/UFRJ, 2008. 62 p.: il. (Sries em Biotecnologia, v. 1) ISBN 978-85-903967-2-7 Inclui bibliografia. 1. Bioprocessos. 2. Tecnologia. 3. Bioprodutos. I. Bon, Elba Pinto da Silva. II. Ferrara, Maria Antonieta. III. Ttulo. IV. Srie. CDD 600

Biblioteca Nacional

BREVE NOTA BIBLIOGRFICA SOBRE OS AUTORES

Nei Pereira Jr Professor Titular do Departamento de Engenharia Bioqumica da Escola de Qumica da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Possui os ttulos de Engenheiro Qumico (EQ-UFRJ, 1977); MSc em Tecnologia de Processos Bioqumicos (EQ-UFRJ, 1982) e PhD em Biotecnologia (The University of Manchester, UK, 1991). Desde 1991, vem liderando projetos de Pesquisa & Desenvolvimento & Inovao nos Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos da UFRJ, onde j orientou 65 teses (43 MSc e 22 DSc). Coordena as seguintes linhas de pesquisa: Biotecnologia de Lignocelulsicos; Processos com Microrganismos Recombinantes; Biotecnologia Ambiental; Floculao/Imobilizao de Clulas e Enzimas; Tecnologia da Produo de Antibiticos; Produo de Alimentos Funcionais; Gesto Tecnolgica e Tratamento/Minimizao de Resduos e Efluentes Industriais. Atualmente, orienta 05 estudantes de mestrado e 08 de doutorado. J publicou mais de 200 trabalhos (artigos em peridicos indexados e trabalhos em eventos cientficos) e 07 patentes, uma delas relacionada produo de bioetanol de bagao de cana-de-acar via hidrlise enzimtica de celulose, trabalho realizado para a PETROBRAS que resultou na patente de nmero 1000 da empresa. Tambm desenvolve trabalhos cooperativos com instituies de ensino e pesquisa nacionais e internacionais, bem como com empresas. bolsista do CNPq (Produtividade em Pesquisa) e da FAPERJ (Cientista do nosso Estado) em reconhecimento as suas contribuies ao desenvolvimento da cincia e tecnologia nacionais, assim como na formao de recursos humanos altamente capacitados. Ele foi recentemente agraciado com os seguintes prmios: PETROBRAS Inventor 2005, 2006 e 2007; Tese Ouro (2006), concedido pela Escola de Qumica por ter atingido a orientao de 50 teses em seu Programa de Ps-graduao e o prmio nacional da Associao Brasileira da Indstria Qumica (ABIQUIM) - Pesquisador de Destaque 2006. Elba Pinto da Silva Bon Professora Associada do Departamento de Bioqumica do Instituto de Qumica da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). graduada em Cincias Biolgicas (UERJ, 1970), com Mestrado em Bioqumica (UFRJ, 1974) e em Engenharia Bioqumica (UMIST-UK, 1987), Doutorado em Engenharia Bioqumica (UMIST-UK, 1991) e Ps-Doutorado no Departamento de Biologia do Massachusetts Institute of Technology (MIT, Cambridge, USA, 1995). a coordenadora do Laboratrio de Tecnologia Enzimtica do IQ/UFRJ, onde atua nas reas de Microbiologia Aplicada, Biocatlise e Regulao do Metabolismo por Nitrognio, com nfase a produo e uso de enzimas industriais e especiais e regulao da expresso gnica. J orientou 27 teses (15 MSc e 12 DSc) e atualmente, orienta 03 estudantes de mestrado e 02 de doutorado. Coordena projetos de pesquisa desenvolvidos em colaborao com o Instituto Nacional de Tecnologia MCT e a Fundao Oswaldo Cruz - MS. J coordenou ou coordena projetos de pesquisa com colaborao internacional com Portugal, Alemanha e Sucia. coordenadora cientfica e coordenadora setorial da rea de Produo de Celulases do Projeto Bioetanol. Atua tambm na rea de polticas de Cincia e Tecnologia tendo estruturado e organizao muitas edies do evento ENZITEC. Participa das atividades do Frum de Biotecnologia do Governo Federal, como contratada pelo CGEE na rea de Enzimas Industriais e Especiais. Maria Antonieta Ferrara Pesquisadora do Instituto de Tecnologia em Frmacos de FarManguinhos / Fundao Oswaldo Cruz. Possui graduao em Qumica (IQ/UFRJ, 1974), Mestrado (EQ/UFRJ, 1988) e Doutorado (EQ/UFRJ, 2004) em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos. Tem experincia nas reas de Microbiologia, com nfase em Bioprocessos e de Tecnologia Enzimtica, atuando principalmente nos seguintes temas: produo de enzimas, produo de metablitos microbianos bioativos, produo de protenas heterlogas por Pichia pastoris, bioconverso, enzimas teraputicas, fungos endofticos e pr-tratamento e hidrlise enzimtica de biomassa vegetal.

APRESENTAO
A Biotecnologia Moderna oferece inovadoras possibilidades para a produo de substncias qumicas e processos mais limpos. Em seu cerne est o princpio de se trabalhar em harmonia com o mundo natural. A Biotecnologia tem solues para atender humanidade em suas mais diferentes necessidades (alimentos, energia, medicamentos), bem como suplantar tecnologias que poluem a biosfera ou que contribuam para a depleo de fontes finitas. No entanto, a indstria, a comunidade cientfica e o governo necessitam trabalhar em conjunto para que o Brasil possa lanar mo plenamente do potencial da Biotecnologia, a fim de alcanar sua sustentabilidade industrial/econmica/ ambiental e permitir que o pas siga a sua vocao natural para essa rea. neste contexto, que lanamos a primeira verso das Sries em Biotecnologia com a inteno de disponibilizar material instrucional a estudantes que tencionem atuar profissionalmente nesta importante rea. Esta primeira edio apresenta conceitos e fundamentos necessrios para uma melhor compreenso das diferentes etapas que compem a Tecnologia de Bioprocessos, com o objetivo de fornecer aos estudantes uma viso global e integrada desta temtica, imprescindvel quando se pretende transformar conhecimento em realidade produtiva. No entanto, de carter introdutrio e cunho aplicado, no tem a pretenso de ser uma apresentao exaustiva sobre o assunto. Na realidade, so notas de aulas que temos a inteno de transformar em sries didticas, de forma a colocar o estudante em contato com os problemas e desafios da Biotecnologia, quer seja na rea acadmica ou no setor industrial. Esperamos que o contedo desta edio proporcione aos leitores uma viso abrangente da rea para conhecimento e reflexes. Estamos convictos da importncia da Biotecnologia para o Brasil, pois ela concilia o desenvolvimento tecnolgico com a preservao ambiental. Somos conscientes de que o meio ambiente brasileiro representa um ativo de valor incalculvel e contribui decisivamente para a representatividade brasileira no cenrio internacional. Para isto registramos nosso firme propsito e compromisso de contribuir efetivamente na formao de massa crtica capacitada para atuar nesta importante rea, permitindo a insero desses profissionais em um mercado cada vez mais competitivo e regulador em termos de produtos e processos. Os Autores
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NDICE

Tpico 1. A Biotecnologia Microbiana: Conceitos e Aplicaes Biotecnologia de Bactrias Biotecnologia de Leveduras e Fungos Filamentosos Tecnologia do DNA Recombinante 2. Bioprocessos 3. Agente Biolgico: Caractersticas 4. Nutrio dos Microrganismos Fontes de Energia Fontes de Carbono Fontes de Nitrognio Fontes de Minerais Fatores de crescimento 5. Matrias-Primas Glicdicas 6. Meio de Cultivo Otimizao do meio de cultivo Formulao de meio de cultivo com base na composio centesimal de microrganismos 7. Esterilizao de Meios e Equipamentos 8. Biorreator 9. Modos de Operao de Bioprocessos Quanto conduo Quanto ao desenvolvimento do agente microbiano Quanto ao suprimento de oxignio 10. Processos de Separao e Purificao de Produto 11. Extrapolao de Escala 12. Tratamento Biolgico de Resduos e Efluentes 13. Consideraes Gerais 14. Referncias Bibliogrficas Recomendadas

Pgina 7 10 12 14 18 21 23 23 23 24 24 25 25 27 29 31

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TECNOLOGIA DE BIOPROCESSOS
Nei Pereira Jr.1; Elba Pinto da Silva Bon2& Maria Antonieta Ferrara3
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Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos Escola de Qumica - CT/UFRJ nei@eq.ufrj.br 2 Laboratrio de Tecnologia Enzimtica Instituto de Qumica CCMN/UFRJ 3 Instituto de Tecnologia em Frmacos Farmanguinhos/FIOCRUZ

1. A Biotecnologia Microbiana: Conceitos e Aplicaes

Os vrios conceitos da Biotecnologia se referem ao uso de clulas ou sistemas bioqumicos em processos de produo de bens ou de prestao de servios (Tabela 1). Neste contexto, a Biotecnologia tem papel destacado, sob o ponto de vista histrico e tecnolgico, visto que os primeiros processos industriais basearam-se na ao de microrganismos e a grande maioria daqueles consagrados utiliza microrganismos nativos ou modificados geneticamente. A Biotecnologia apresenta carter inter e multidisciplinar, necessitando aqueles que militam nesta rea de conhecimentos fundamentais em Bioqumica, Gentica, Microbiologia Aplicada e Engenharia Bioqumica, a fim de se ter uma maior compreenso sobre a atividade do biocatalisador e buscar suas melhores condies de desempenho em biorreator (otimizao). Outras ferramentas como a Modelagem e a Simulao, bem como o Controle e a Instrumentao so peas-chaves na otimizao de Bioprocessos. Trata-se de uma rea muito extensa, conforme exemplificado a seguir, para processos, produtos e servios: diferentes microrganismos so utilizados para a produo de substncias de interesse comercial, como: antibiticos, cidos orgnicos, solventes, enzimas e biocombustveis por processos fermentativos. O produto pode ser ainda o prprio microrganismo, como a produo de levedura de panificao e inoculantes agrcolas, ou as clulas microbianas podem ser utilizadas em processos de biotransformao, como por exemplo, para a produo de esterides, aromas e fragrncias. Alm da produo de bens de consumo, os microrganismos so tambm utilizados em processos de tratamento de resduos e efluentes urbanos e industriais, na recuperao de metais, tais como cobre, chumbo e urnio, ou em processos de biorremediao de solos contaminados. Os principais produtos da Biotecnologia podem ser agrupados de acordo com o seu uso, em produtos da indstria farmacutica (antibiticos, hormnios, vacinas, vitaminas e protenas teraputicas humanas), da indstria de alimentos (aminocidos, flavorizantes, polissacardeos e gomas xantana) e da indstria qumica (etanol, acetona, butanol, glicerol, cido lctico, cido ctrico, polisteres, inseticidas microbianos). Como as enzimas microbianas so utilizadas em diferentes segmentos industriais, no conveniente classific-las de acordo com a sua aplicao. Em decorrncia das vrias aplicaes de seus produtos, a Biotecnologia insere-se em uma gama de segmentos industriais (Figura 1).
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Tabela1: Definies de Biotecnologia. DEFINIO Conjunto de processos microbianos e outros processos bioqumicos desenvolvidos em escala industrial Uso de organismos vivos para produzir produtos benficos para a espcie humana Integrao de cincias naturais e de cincias da engenharia visando aplicao de organismos, clulas, derivados celulares e anlogos moleculares para produtos e servios toda tecnologia de processo ou produto que lance mo, em pelo menos uma de suas etapas, da ao de microrganismos, clulas animais ou vegetais, ou de substncias produzidas por estes agentes biolgicos, sendo caracterizada por sua multidisciplinaridade Conjunto de tecnologias habilitadoras (enabling technologies), que possuem em comum o uso de clulas ou molculas biolgicas para aplicaes na produo de bens e servios, em reas como sade humana & animal, agricultura, energia e meio ambiente REFERNCIA Stenesh (1989) Glazer & Nikaido (1995)

Smith-Doerr et al. (1997)

Rehn & Reed (1993)

Marx (1989)

agropecurio qumico txtil

veterinrio

BIOTECNOLOGIA

ambiental

alimentcio mdico-farmacutico

energtico

Figura 1: Insero da Biotecnologia em diferentes setores produtivos.

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Todos os microrganismos produzem uma variedade muito grande de enzimas intracelulares em pequenas quantidades, para a catlise das suas reaes metablicas. As enzimas, tambm denominadas de biocatalisadores, so catalisadores proticos com caractersticas particulares pela sua alta eficincia em condies fisiolgicas e alta especificidade, sendo inclusive capazes de catalisar reaes estereoespecficas. Este potencial cataltico utilizado industrialmente no s nos clssicos processos fermentativos, mas tambm em processos de biotransformaes microbianas para a catlise de reaes qumicas de difcil ocorrncia e de grande importncia na indstria farmacutica. Um exemplo tpico refere-se produo de esterides utilizando-se Rhizopus nigricans. O fungo , inicialmente, cultivado em biorreatores em condies otimizadas para se atingir altas concentraes celulares. Finda a fase de crescimento celular, o substrato a ser transformado, a progesterona, adicionado ao biorreator e, aps um perodo de incubao determinado, o produto da biotransformao, a 11hidroprogesterona, extrado com solvente orgnico. Este composto pode ser subseqentemente transformado, por via qumica, para a produo industrial de um outro esteride, a cortisona (Madigan et al., 2000 e Atlas, 1997). Enquanto nas biotransformaes os sistemas enzimticos de interesse no so extrados das clulas, a catlise enzimtica industrial usa enzimas microbianas excretadas ou extradas de microrganismos e com diferentes graus de purificao. As enzimas microbianas excretadas so produzidas em maiores quantidades do que as intracelulares e tm a funo principal de degradar macromolculas presentes no meio ambiente, como a celulose, o amido, a lignina e protenas, para que seus componentes possam ser absorvidos como nutrientes pelos microrganismos. As enzimas so utilizadas em muitos segmentos industriais, como o de alimentos e bebidas, de detergentes, txtil, couro, celulose e papel, qumica fina, medicamentos e cosmticos e, ainda, em metodologia analtica e em biologia molecular. Amilases, glicose oxidase, pectinases, invertase, renina, naraginase, lipases, proteases, celulases e peroxidases so os biocatalisadores mais utilizados (Atlas, 1997 e Bon & Pereira Jr., 1999). Enzimas so tambm empregadas como medicamento, como por exemplo, a asparaginase utilizada no tratamento de leucemia. O mercado mundial de biocatalisadores, atualmente avaliado, em US$ 1,5 bilhes tem previses de crescimento continuado em resposta s demandas por processos industriais com menor impacto ambiental e menor consumo energtico e tambm por produtos de melhor qualidade (Godfrey, 2003). O desenvolvimento da Biotecnologia tem importncia mpar para o Brasil, devido ao seu baixo impacto ambiental, sendo possvel conciliar o desenvolvimento industrial com a preservao de ecossistemas. Sabemos que o Brasil apresenta uma das maiores biodiversidades do planeta e que seu territrio possui recursos hdricos correspondentes a 12% da gua doce do planeta, incluindo o Aqfero Guarani, que o maior do mundo. So esses os recursos naturais mais importantes para a humanidade a partir deste sculo, representando um ativo de valor incalculvel. Essas riquezas, patrimnio da sociedade brasileira, devem ser preservadas da poluio ambiental provocada por prticas inadequadas de diferentes setores industriais e agro-industriais. O equilbrio natural dos ecossistemas, to antigo quanto a vida na Terra, pode ser considerado como uma importante rea da Biotecnologia Microbiana. Os microrganismos habitam praticamente todos os ambientes terrestres, sendo
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transportados por correntes de ar para a atmosfera e de continente para continente. Esses seres microscpios tambm habitam todos os ambientes marinhos, das superfcies aquticas ao fundo dos oceanos. Por causa desta caracterstica de crescimento nos mais variados ambientes, os microrganismos, atravs de suas vias metablicas intracelulares e de molculas bioativas excretadas para o meio externo, atuam na manuteno do ciclo biolgico de elementos qumicos, no controle populacional, na descontaminao de ambientes aquticos e terrestres e na disponibilizao de nutrientes para diferentes formas de vida. Estas tarefas gigantescas, inestimveis e insubstituveis no so facilmente perceptveis, correndo o risco de no serem adequadamente protegidas. Embora a ao antropognica venha interferindo de forma negativa no modus operandi dos ecossistemas e, portanto, no seu equilbrio, as populaes microbianas que habitam o nosso planeta continuam alicerando a manuteno da vida na Terra. O fantstico potencial metablico envolvido na sntese e degradao das mais variadas estruturas qumicas por bactrias, fungos, algas e protozorios est distribudo em microrganismos com caractersticas fisiolgicas muitas vezes peculiares. As bactrias, por exemplo, so encontradas nos mais diferentes climas e microambientes do planeta, alguns considerados inspitos. Bactrias haloflicas vivem em ambientes aquticos com alto teor salino, como o Mar Morto, as termoflicas, em fontes termais, em temperaturas entre 800C e 1000C e as baroflicas se adaptaram s enormes presses das profundezas do mar. Adicionalmente, algumas bactrias so parasitas de tecidos animais e vegetais e algumas vivem em consrcio com outros microrganismos, plantas e animais.

Biotecnologia de Bactrias
Embora as bactrias sejam mais conhecidas como microrganismos patognicos, a grande maioria inofensiva e inclusive benfica a outros seres vivos. Como exemplo, a tarefa fundamental da fixao do nitrognio atmosfrico molecular levada a efeito por bactrias dos gneros Rhizobium, Bradyrhizobium e Frankia, que vivem em associaes simbiticas com plantas leguminosas, como o feijo e a soja. Estas bactrias, que so encontradas no solo, infectam naturalmente plantas hospedeiras formando ndulos nas razes onde proliferam. Este mecanismo natural de infeco tem sido utilizado, h quase cem anos, para aumentar a fertilidade do solo atravs da sua inoculao com bactrias fixadoras de nitrognio produzidas industrialmente por processos fermentativos (Glazer & Nikaido, 1995). So tambm de grande importncia biotecnolgica cepas selvagens ou modificadas geneticamente de bactrias dos gneros Corynebacterium, Bacillus e Microbacterium pela capacidade de excretar produtos do seu metabolismo primrio, como aminocidos. A constatao de que Corynebacterium glutamicum era capaz de produzir grandes quantidades de cido glutmico, quando crescida em glicose, reportada em 1957, resultou na seleo e desenvolvimento de bactrias para a produo de acido L-glutmico, L-arginina, L-isoleucina, Lhistidina, L-leucina, L-lisina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L-treonina, Ltriptofano e L-tirosina, alm de vitaminas e nucleotdeos. Fermentaes com concentraes de L-tirosina e L-fenilalanina em torno de 25g/L esto descritas na literatura (Piepersberg, 1993). A produo anual de aminocidos utilizados na indstria de alimentos estimada em 530 toneladas (Madigan et al., 2000).
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Ainda entre as bactrias, encontramos os estreptomicetos, que tambm apresentam o genoma organizado em um nico cromossomo circular. Os estreptomicetos, que so aerbios, vivem no solo e multiplicam-se formando filamentos ramificados, tm grande importncia biotecnolgica por produzirem compostos com diferentes atividades biolgicas. Assim, esses microrganismos sintetizam molculas que atuam como antibiticos, antitumorais, imunomoduladores, antiinflamatrios, vasoconstritores e vasodilatadores, alm de terem aplicao no tratamento da diabete e como herbicidas. Algumas foram ainda identificadas como inibidores enzimticos. Estes compostos, que apresentam baixa massa molecular, so excretados em condies de metabolismo secundrio, isto , aps a fase de crescimento celular, j tendo sido identificados mais de 10.000 substncias diferentes (Piepersberg, 1993). Os antibiticos, substncias que mesmo em baixas concentraes inibem o crescimento de microrganismos patognicos, so os representantes mais conhecidos deste grupo. Considerando o seu mercado, avaliado em 8 bilhes de dlares (Glazer & Nikaido, 1995), os antibiticos so os produtos mais importantes da biotecnologia microbiana, excetuando-se bebidas alcolicas e queijos. O primeiro depoimento oficial sobre a ao do antibitico penicilina foi feito por Alexander Fleming em 1928, quando relatou a eficincia do filtrado de uma cultura do fungo Penicillium notatum como um teraputico local em uma infeco provocada por Staphylococcus. O grande sucesso dos antibiticos no tratamento de infeces bacterianas em comparao aos quimioterpicos, que comearam a ser disponibilizados na mesma poca, deveu-se sua eficincia em comparao apresentada por drogas como as sulfas. Assim, enquanto concentraes inibitrias mnimas (CIMs) de sulfonamidas nos pacientes esto na faixa de 10 a 100 g/mL, o antibitico penicilina mata bactrias sensveis como Streptococcus pneumoniae com CMIs em torno de 0,01 g/mL (Glazer & Nikaido, 1995). Os antibiticos podem ser classificados quanto ao espectro de atividade, antifngicos, antibacterianos, antivirais, antiprotozorios e antitumorais; quanto a seu mecanismo de ao, interferindo na sntese da parede celular, na sntese de cidos nuclicos, na sntese de protenas e nas funes da membrana citoplasmtica; e quanto sua estrutura qumica, lactonas macrocclicos, quinonas e relacionados, derivados de aminocidos e peptdicos, entre outras estruturas. A grande maioria dos antibiticos com importncia comercial produzida por fungos ou bactrias. Dentre os bacterianos, a maior variedade em estruturas e o maior nmero de antibiticos so encontrados na classe Actinomycetales, especialmente no gnero Streptomyces. Uma relao de alguns antibiticos produzidos por Streptomyces est apresentada na tabela 2. Segundo o Index ABIQUIF 2002, publicado pela Associao Brasileira da Indstria Farmoqumica, so produzidos no Brasil apenas nove antibiticos, a saber: Ampicilina, Anfotericina B, Cefalexina, Cefalotina, Ceftadizina, Eritromicina, Nistatina, Oxacilina e Penicilina G, de um elenco de trinta e nove considerados essenciais segundo a edio de 2002 da Relao Nacional de Medicamentos Essenciais publicada pelo Ministrio da Sade. Entre os antibiticos produzidos no Brasil, trs (Cefalexina, Cefalotina e Ceftazidna) so produzidos pela empresa multinacional Eli Lilly do Brasil Ltda e seis (Ampicilina, Anfotericina B, Eritromicina, Nistatina, Oxaciclina e Penicilina G), por outra multinacional, o
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Grupo Prodotti. Esta relao no inclui a paromomicina, fundamental para o tratamento de doenas negligenciadas de grande ocorrncia no Brasil, como a leishmaniose e a tuberculose. O Brasil no produz e nem importa paromomicina, no estando esta droga disponvel no mercado nacional. Considerando o acima exposto, o abastecimento de antibiticos para uso humano no Brasil depende integralmente de companhias farmacuticas internacionais. Em relao produo de antibiticos para uso animal, o pas encontra-se em posio mais confortvel, pois existem empresas brasileiras, como a Valle, ativas no setor. Tabela 2: Antibiticos produzidos por microrganismos do gnero Streptomyces Antibitico Aminosidina Cicloheximida Cicloserina Cloranfenicol Eritromicina Espectinomicina Estreptomicina Kanamicina Lincomicina Neomicina Nistatina Ribostamicina Tetraciclina Microrganismo Streptomyces rimosus Streptomyces griseus Streptomyces orchidaceus Streptomyces venezuelae Streptomyces erithreus Streptomyces spectabilis Streptomyces griseus Streptomyces kanamyceticus Streptomyces lincolnnensis Streptomyces fradiae Streptomyces noursei Streptomyces ribosidificus Streptomyces rimosus

Fonte: Madigan et al. (2000) e Vandamme (1984)

Biotecnologia de Leveduras e Fungos Filamentosos

Historicamente, o potencial metablico dos microrganismos inseriu-se naturalmente em aspectos fundamentais da vida humana. Assim, fungos unicelulares, as leveduras, apresentam peculiaridades metablicas que permitiram o seu uso de forma emprica na produo do po e do vinho, alimentos simblicos na histria da humanidade. Os antigos egpcios, no preparo do seu po, mantinham a massa, uma simples mistura de farinha e gua, aquecida at a formao de bolhas, indicativo, hoje sabemos, da liberao de CO2 em conseqncia da sua fermentao (Panek, 1993). Assim, a contaminao natural, no apenas da massa do po, mas tambm de uvas e gros de cevada, com a levedura Saccharomyces cerevisiae e a sua subseqente fermentao originaram o vinho e a cerveja que at os dias de hoje fazem parte dos nossos hbitos alimentares. As fermentaes industriais com leveduras contribuem atualmente de forma significativa para a economia de vrios pases. So produzidas por ano centenas de toneladas de leveduras utilizadas para a produo de po, vinho, cerveja, bebidas destiladas, cidra, saqu e licores. Um outro importante produto industrial derivado de S. cerevisiae, cujas clulas so ricas em protenas, cidos nuclicos, vitaminas e sais minerais e apresentam nveis negligenciveis de triglicerdeos, o extrato de levedura que tem
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importantes aplicaes na indstria alimentcia e na de fermentaes industriais, servindo como componente do meio de fermentao. Outras leveduras dos gneros Torulopsis e Candida, sendo capazes de crescer em melao ou em licor sulftico, subprodutos da fabricao de acar e da indstria de papel, respectivamente, so utilizadas para o tratamento destes resduos industriais. A biomassa microbiana formada pode ser, subseqentemente, utilizada como fonte de protena para alimentao animal. Considerando ainda o potencial biotecnolgico das leveduras, microrganismos dos gneros Saccharomyces, Kluyveromyces e Candida so capazes de fermentar diferentes acares a etanol. de particular importncia para o Brasil a produo de lcool combustvel por fermentao da sacarose do caldo da cana-de-acar por S. cerevisiae, tendo em vista ser o pas, juntamente com os Estados Unidos, os maiores produtores mundiais de etanol combustvel. Adicionalmente, o etanol est sendo cada vez mais valorizado internacionalmente como combustvel lquido, em comparao gasolina, derivada do petrleo. Sendo produzido a partir de recursos renovveis, no contribui para o efeito estufa e suas conseqncias, como as grandes modificaes climticas que esto afetando negativamente a Terra. Para a produo deste biocombustvel, podem ser utilizadas matrias primas sacarneas (aucaradas), amilceas e lignocelulsicas, cujas caractersticas esto descritas a seguir. Vale ressaltar, entretanto, que bactrias como Zymomonas mobilis podem ser tambm utilizadas em processos fermentativos de produo de etanol. A diversidade microbiana dos fungos muito grande, estimando-se um nmero de espcies entre 100.000 e 250.000. Os fungos destacam-se pela sua capacidade de atacar tecidos vegetais atravs da secreo de enzimas que degradam biopolmeros tais como polissacardeos, lignina e protenas. familiar a todos ns a colonizao de troncos de rvores em decomposio por diferentes espcies de fungos. Este grupo de microrganismos, semelhana dos estreptomicetos, tambm produz, em condies de metabolismo secundrio, uma variedade de molculas orgnicas de pequena massa molecular com diferentes atividades biolgicas, como a antibitica. A comercializao de produtos teraputicos microbianos iniciou-se h mais de 50 anos com a penicilina. O uso de manipulaes genticas, basicamente tcnicas de mutao associadas otimizao do processo fermentativo, incluindo o desenvolvimento de meios, permitiram a melhoria do processo de produo do antibitico, cuja concentrao passou de 0,06 para 26 g/L (Buckland & Lilly, 1993). Inicialmente empregados apenas como agentes antibacterianos, os produtos do metabolismo secundrio de fungos apresentam hoje em dia uma gama bastante diversificada de aplicaes, incluindo inclusive o uso como imunossupressores em terapias sofisticadas para pacientes transplantados (Pearce, 1997), conforme mostrado na Tabela 3. Este avano relaciona-se, em parte, ao atual entendimento da etiologia bioqumica e gentica de muitas doenas, o que tornou possvel buscar substncias com ao direcionada para alvos especficos no metabolismo celular. Dentre os antibiticos fngicos, apenas dez so produzidos comercialmente e somente penicilinas, cefalosporinas, griseofulvinas e os cidos clavulnico e fusdico so clinicamente importantes.
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Tabela 3: Medicamentos produzidos com metablitos fngicos e microrganismos produtores. PRODUTOS FNGICOS BIOATIVOS APLICAO
Analgsico

PRODUTO
Paxisterol Crisospermina Cefalosporina Penicilina Sorrentanona Equinocandina cido zaragzico

FUNGO
Penicillium sp. Apiocrea chrysosperma Cephalosporium Penicillium, Aspergillus Penicillium chrysogenun Aspergillus nidulans Mycelia sterilia, Leptodontidium elatius, Sporomiella intermedia Phoma sp. Penicillium griseofurvum Penicilium brevicompactum Penicillium citrinum Aspergillus terreus Pestalotiopsis microspora Cladosporium cladosporioides Sporothrix sp Penicillium multicolor Claviceps purprea Paecilomyces carneus Tolypocladium inflatum Trichoderma polysporum Stachybotrys sp. Pestalotiopsis sp. Aspergillus terreus Crucibilum sp.

Antibacteriano

Antifngico

Esqualestatinas Griseofulvina Compactina Mevilonina Dihidromevilonina Taxol Calfostina C KS 501, KS 502

Controlador da sntese de Colesterol

Antitumoral

Antiviral Estimulador da contrao uterina Imunomodulador Imunossupressor Tratamento de problemas cardiovasculares Profiltico em odontologia Tratamento de diabetes Fonte: Pearce (1997)

Isocromofilonas Alcalides Ergo FR-901235 Ciclosporina A Estachibocinas RES 1214-1/2 Mutastena Salfredinas

Tecnologia do DNA Recombinante

A Biotecnologia pode ser dividida em dois perodos principais: o primeiro anterior ao uso de da tecnologia do DNA recombinante e o segundo aps a sua implantao em 1982, a partir dos experimentos realizados em 1973 por Herbert Boyer, Stanley Cohen e seus colaboradores. Enquanto at esta data as bactrias podiam produzir apenas substncias codificadas no seu prprio genoma, a partir da clulas de bactria modificadas geneticamente por tcnicas de Biologia Molecular passaram a produzir substncias codificadas por genes animais e vegetais. Assim, a aprovao para uso clnico de insulina humana produzida pela bactria Escherichia coli, h mais de vinte e cinco anos, definiu a engenharia gentica como um instrumento poderoso para a modificao de microrganismos, de forma a transform-los em unidades de produo de compostos de interesse. O efeito da tecnologia do DNA recombinante pode ser mais facilmente visualizado
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comparando-se o perfil dos principais produtos comercializados antes e aps 1982. At essa data, o mercado mundial de produtos dependentes de Biotecnologia concentrava-se em bebidas alcolicas, queijos, antibiticos, etanol combustvel, xaropes com alto contedo de frutose, aminocidos, levedura de panificao, esterides, vitaminas, cido ctrico, enzimas, vacinas e gomas polissacardicas. Assim, de um mercado total de cerca de 78 bilhes de dlares, 80% relacionavam-se indstria de alimentos (Glazer & Nikaido, 1995). Embora esta predominncia seja uma realidade at os dias de hoje, muitos processos de produo passaram a usar microrganismos modificados por tcnicas da Biologia Molecular com ganhos em rendimento e/ou produtividade. O perfil dos produtos da Biotecnologia Microbiana tambm sofreu uma modificao marcante aps 1982 devido ao aparecimento no mercado de uma sucesso de protenas e peptdeos teraputicos, como o hormnio do crescimento humano, interferons, fatores de coagulao, eritropoietina e soro albumina, entre outros, produzidos por processos fermentativos. Como a obteno e purificao destas protenas e peptdeos, em quantidades relevantes, a partir de tecidos humanos ou animais era muito difcil, os genes humanos que codificam para estes compostos foram clonados em E. coli e estes agentes teraputicos passaram a ser produzidos em grandes quantidades. A produo destas protenas teraputicas, por processo fermentativo, depende inteiramente da tecnologia do DNA recombinante. Embora os processos pioneiros de produo de protenas heterlogas tenham utilizado E. coli, o posterior desenvolvimento de tcnicas de Biologia Molecular para leveduras, baseadas em parte nos protocolos utilizados para bactrias, permitiu a sua insero nestes processos de produo. So considerados marcos da Biologia Molecular de leveduras os trabalhos de Hinnen, Hicks e Fink, Transformation of yeast e de Beggs Transformation of yeast by a replicating hybrid plasmid, ambos publicados em 1978. A partir da, as leveduras Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris, consideradas como GRAS (Generally Regarded as Safe) pelo Food and Drug Administration dos EUA, tm sido empregadas na produo de protenas heterlogas, competindo atualmente com as bactrias pela liderana nesta rea. As vantagens apresentadas pelas leveduras relacionam-se com a sua capacidade de realizar modificaes ps-traducionais, como glicosilaes, que no apenas contribuem para que as protenas heterlogas adquiram a conformao correta, como tambm para a sua estabilidade, prolongando a meia vida enquanto agente teraputico. Alm disso, diferentemente das bactrias, que precisam ser rompidas para a obteno da protena de interesse, as clulas de levedura so capazes de secretar as protenas recombinantes, facilitando as etapas subseqentes de purificao. Assim, a partir da comercializao em 1986 pela companhia Merck, da vacina para uso humano Recombivax contra hepatite B, vrias outras protenas teraputicas heterlogas produzidas por S. cerevisiae, como a insulina, produzida pela Novo-Nordisk, passaram a ser comercializadas. O uso da tecnologia do DNA recombinante em leveduras para a produo de protenas teraputicas uma rea em franca expanso, sendo atualmente estudado tambm em Kluveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis e Yarrowia lipolytica. Neste contexto, tm se destacado as leveduras metilotrficas facultativas Candida boidinii, Hansenula polymorpha, Pichia methanolica e principalmente Pichia pastoris (Walker, 1998).
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Como a P. pastoris pode ser facilmente manipulada para produzir protenas intracelulares ou excretadas em altos nveis, mais de 400 protenas, da endostatina humana protena da seda de aranhas, foram expressas nesta levedura, que tambm capaz de processar a protena heterloga de forma semelhante de eucariotos superiores, realizando reaes de glicosilao, protelise e formao de pontes de enxofre. Os altos nveis de produo de protenas heterlogas devem-se utilizao do promotor do gene da lcool oxidase I (AOX1), eficiente e especificamente regulado, para ativar a expresso do gene de interesse. O promotor do gene AOX1 fortemente reprimido em clulas crescendo em glicose ou na maioria das outras fontes de carbono, mas aumenta a expresso do gene de interesse em torno de 1.000 vezes quando as clulas so transferidas para metanol. Adicionalmente, como P. pastoris uma levedura que preferencialmente respira em lugar de fermentar, no produz etanol e cido actico, cuja toxicidade no meio de cultivo impede fermentaes com altas densidades celulares, desejveis para aumentar a concentrao da protena de interesse. Fermentaes com Pichia podem resultar em concentraes de protena heterloga que variam de 15 mg/L, no caso da antitrombina III humana, at 5 g/L para o caso da gelatina sinttica, passando, por exemplo, por valores de 1,5 g/L para a insulina humana (Cereghino et al., 2002). Embora a maioria das enzimas industriais seja extracelular e produzida por fungos e bactrias, a tecnologia do DNA recombinante vem recebendo uma ateno crescente para a produo de biocatalisadores, tendo especial importncia a expresso heterloga em leveduras metilotrficas dos gneros Pichia, Candida e Hansenula. Muitos genes que codificam para a sntese de enzimas humanas (glutamato descarboxilase e h-lipase), vegetais (glicolato oxidase de espinafre e malato desidrogenase de melo) e microbianas (dipeptil-peptidase, glicose-oxidase e fitase de Aspergillus, glicoamilase de Rhizopus, 1,2-manosiltransferase, adenilato quinase, invertase e catalase de Saccharomyces), j foram expressas nestas leveduras, indicando a possibilidade de uma acentuada diversificao do uso industrial de biocatalisadores. Abrindo ainda mais o leque de possibilidades do uso de enzimas, existem biocatalisadores produzidas por microrganismos extremoflicos do grupo Archea, que so naturalmente estveis em condies extremas de temperatura, pH e salinidade. Devido sua atividade nestas condies, o potencial industrial das extremozimas muito grande. A Taq polimerase de Thermus aquaticus e Puf polimerase de Pyrococcus furiosus apresentam atividade 950C e 1000C, respectivamente, sendo utilizadas nos procedimentos de PCR (polymerase chain reaction) (Atlas, 1997; Gellissen, 2000 e Stetter, 1999). A Tabela 4 fornece outros exemplos de substncias produzidas por espcies microbianas naturalmente ocorrentes e recombinantes, agentes dos processos de biotransformao.

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Tabela 4: Espcies microbianas usadas na manufatura de produtos comerciais.

Produtos qumicos industriais Saccharomyces cerevisiae etanol (de sacarose e glicose) Kluyveromyces fragilis etanol (de lactose) Clostridium acetobulylicum acetona e butanol Aspergillus niger cido ctrico Amino cidos e nucleotdeos flavorizantes Corynebacterium glutamicum L-lisina Corynebacterium glutamicum Vitaminas Ashbya gossypii Eremothecium ashbyii Pseudomonas denitrificans Propionibacterium shermanii Enzimas Aspergillus oryzae Aspergillus niger Trichoderma reesii Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces fragilis Candida lipolytica Asperillus niger Bacillus sp. Polissacardeos Leuconostoc mesenteroides Xantomonas campestris Vacinas Corynebacterium diphtheriae Saccharomyces cerevisiae recombinante Produtos farmacuticos Penicillium chrysogenum Cephalosporium acremonium Streptomyces sp. cido 5 inosnico e cido 5 guanilnico riboflavina riboflavina vitamina B12 vitamina B12 amilases glucoamilase celulases invertase lactase lipase pectinases e proteases proteases dextrana goma xantana difiteria hepatite B

Bacillus brevis Bacillus licheniformis Bacillus polymyxa Rhizopus nigricans Arthrobacter simplex Escherichia coli recombinante Saccharomyces cerevisiae recombinante
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penicilinas cefalosporinas anfotericina B; kanamicinas; neomicinas, estreptomicinas, tetraciclinas; cido clavulnico etc. gramicidina S bacitracina polimixina B transformao de esterides transformao de esterides insulina; hormnios de crescimento, interferons insulina

2. Bioprocessos
Os processos levados a cabo por agentes biolgicos so denominados de Bioprocessos e definidos como um conjunto de operaes que efetuam o tratamento da matria-prima/resduo, o preparo dos meios, a esterilizao (quando o processo demandar) e a transformao do substrato em produto(s) por rota bioqumica, seguida de processos de separao e purificao de produto(s). So consideradas expresses sinonmias: processos fermentativos com microrganismos naturalmente ocorrentes ou recombinantes, processos biotecnolgicos, processos com clulas animais ou vegetais, processos enzimticos ou os tratamentos biolgicos de resduos e efluentes. A distino entre Bioprocessos e Processos Qumicos est calcada na natureza dos catalisadores utilizados em suas reaes. Os Bioprocessos so conduzidos mediante ao de agentes biolgicos, sendo, portanto, as transformaes catalisadas enzimaticamente. A Tabela 5 mostra as principais caractersticas de Bioprocessos e as compara com as dos Processos Qumicos. Bioprocessos conduzidos por microrganismos, tradicionalmente conhecidos como processos fermentativos, so importantes fontes de produtos biolgicos usados nas indstrias farmacutica, qumica e alimentcia. Na ltima dcada observou-se um aumento expressivo na quantidade de bioprodutos comerciais, especialmente metablitos secundrios e protenas teraputicas produzidas com tecnologia de DNA recombinante. Verificaram-se, ainda, significativas mudanas na configurao de biorreatores, visando melhoria de seu desempenho e assegurar operaes com maior segurana. Tabela 5: Bioprocessos versus Processos Qumicos. Bioprocessos Decorrentes de atividade biolgica Catalisadores de alta especificidade Condies brandas de T, P e pH Maiores volumes Podem requerer esterilidade Processos Qumicos Decorrentes de reaes qumicas Catalisadores no especficos Condies drsticas de T, P e pH Menores volumes No requerem esterilidade

Em que pesem as complexidades e particularidades dos Bioprocessos, podemos dividi-los em trs estgios (Figura 2). A etapa que antecede a transformao denominada de montante (upstream), seguida da etapa de transformao propriamente dita e, finalmente, a etapa de jusante (downstream). H autores que incluem a transformao na etapa de montante. No entanto, por envolverem diferentes procedimentos, somos pela diviso de um Bioprocesso em trs etapas e no em duas.
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Tratamento da matria-prima Preparo de meio; Esterilizao upstream process

BIORREATOR
Fenmenos qumicos

Meio de cultivo
Fenmenos fsicos Agente biolgico: clulas microbianas, animais, vegetais ou enzimas

Fenmenos biolgicos

CONDIES AMBIENTAIS TIMAS

Separao de clulas Separao/purificao de produto downstream process

Figura 2: Etapas fundamentais de um tpico Bioprocesso. A Figura 3 apresenta um esquema geral de um Bioprocesso tpico, ressaltando que a forma de conduo do bioprocesso, a configurao do biorreator, assim como a definio das etapas de recuperao do produto tambm se constituem em aspectos importantes para se garantir sucesso na operao destes processos. Estas etapas sero descritas posteriormente com maiores detalhes. Atualmente, nfase dada ao desenvolvimento de Bioprocessos que no sejam apenas cost/effective, mas que tambm atendam s exigncias crescentes de confiabilidade e reprodutibilidade, o que vem aumentando a necessidade de melhoria no monitoramento e controle de tais processos. Algumas transformaes microbianas, analogamente s reaes qumicas, atingem rendimentos prximos ao mximo estequiomtrico (produtos do metabolismo primrio), embora apresentando taxas globais de produo baixas. Outras, como as do metabolismo secundrio, resultam em baixos valores de rendimento e produtividade, havendo um enorme campo para avanos em ambos os casos. Os progressos sero alcanados atravs de uma maior compreenso sobre a fisiologia celular e da interao da clula com o ambiente qumico e fsico no biorreator. esta combinao, este binmio: clula (ou enzima)/meio ambiente (ou condies reacionais), que define o xito de um Bioprocesso.
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TRATAMENTO DA MATRIA PRIMA

PREPARO DO MEIO

EFLUENTE/ RESDUO

TRATAMENTO/ APROVEITAMENTO

ESTERILIZAO

BIORREATOR DE PRODUO
MEIO ISENTO DE CLULAS

BIORREATOR DE PROPAGAO

SEPARAO DE CLULAS

INOCULAO FILTRAO DO AR BIOMASSA BANCO DE CLULAS AERAO ROMPIMENTO CELULAR BIOMOLCULA COM ALTO GRAU DE PUREZA BIOMOLCULA COM ALTO GRAU DE PUREZA PURIFICAO DA BIOMOLCULA EXTRACELULAR

PURIFICAO DA BIOMOLCULA INTRACELULAR

EFLUENTE/ RESDUO

TRATAMENTO / APROVEITAMENTO

EFLUENTE/ RESDUO

Figura 3: Esquema simplificado de um tpico Bioprocesso. Mais recentemente, o escopo da tecnologia de processos fermentativos ampliouse para incluir o cultivo de clulas animais. O cultivo destes agentes biolgicos pode ser adaptado a uma cultura em suspenso e, portanto, uma abordagem similar aplicada ao desenvolvimento/melhoramento de processos fermentativos tradicionais pode ser adotada ao cultivo de clulas animais. Ressalta-se, no entanto, que o fato das clulas animais serem maiores e mais frgeis do que clulas microbianas e mais exigentes impem que tais processos devam ser desenvolvidos e conduzidos com grande conhecimento sobre a fisiologia e morfologia destes agentes biolgicos, bem como sobre as caractersticas hidrodinmicas do meio, condies de aerao no biorreator e suas relaes com a atividade e viabilidade celular.
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A seguir abordar-se-o os principais aspectos de um bioprocesso, descrevendo caractersticas do agente biolgico, matrias-primas, preparo do(s) meio(s), biorreator(es) e separao e purificao de produto(s).

3. Agente Biolgico: Caractersticas

O agente biolgico deve ser selecionado, quando se tenciona transferir o bioprocesso para a escala industrial, em funo das seguintes propriedades: elevada atividade, ou seja, ser capaz de converter rapidamente o substrato em produto com altos rendimentos, conduzindo a altos valores de produtividade; estabilidade sob condies ambientais extremas (elevada presso osmtica do meio, elevada temperatura, elevada fora inica), devendo, ainda, ser tolerante e resistente a substncias txicas, que podem ser geradas no processo de tratamento da matria-prima ou encontradas em resduos e efluentes. Tcnicas da Biologia Molecular aplicada1 e da Engenharia Metablica2 vm sendo utilizadas para se maximizar essas propriedades desejveis em um agente biolgico. importante ressaltar, que estas tcnicas devem ser empregadas, quando necessrias, para maximizar o potencial produtor dos agentes biolgicos responsveis pelas transformaes. A histria da produo de penicilina um clssico exemplo do impacto de manipulaes genticas associadas ao desenvolvimento de meios para melhoria do processo. A combinao de tcnicas de mutao com otimizao do processo fermentativo, resultou em um aumento no rendimento em penicilina da ordem de trs vezes em magnitude (de 0,06 a 26 g/L). Portanto, conhecer as caractersticas/propriedades desses biocatalisadores (bem como melhor-las) levar a inmeras vantagens no desenvolvimento de Bioprocessos industriais. Quando Bioprocessos so realizados por clulas vivas, uma vez definido o produto ou a atividade de interesse, a prxima etapa deve envolver uma pesquisa na literatura para identificar agentes biolgicos portadores da caracterstica desejada ou com potencial de possu-la, seguida da aquisio de linhagens arquivadas em colees de cultura e/ou pelo seu isolamento de amostras naturais, seguido de procedimentos de seleo e melhoramento de linhagens produtoras. No cultivo de clulas microbianas, animais e vegetais em laboratrio necessrio, para se conhecer suas caractersticas/propriedades, determinar seu crescimento, bem como monitorar suas converses. Uma variedade de nutrientes utilizada para os fins acima referidos, incluindo-se fonte de carbono, nitrognio, enxofre, fsforo, oxignio, vitaminas e sais minerais. Esses agentes biolgicos, particularmente microrganismos utilizados em processos industriais, devem ser adequadamente preservados e conservados

Biologia Molecular aplicada: Ramo da Biologia que estuda a origem, transformao e interao dos genes e seus produtos de expresso no indivduo, populao ou espcie, possibilitando o controle a nvel gentico, a construo de agentes biolgicos timos e combinaes timas clula-biorreator.

2 Engenharia Metablica: combinao de mtodos analticos e mtodos matemticos para quantificar fluxos in vivo com o auxlio de tcnicas da Biologia molecular, objetivando programar modificaes genticas dirigidas a fim de melhorar propriedades celulares.

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como cultura pura. Atravs de diferentes tcnicas possvel manter todas as caractersticas da populao microbiana de interesse e, dessa forma, sempre que uma nova produo iniciada a qualidade do produto tambm mantida. Assim, a manuteno e a preservao de microrganismos so etapas de extrema importncia para assegurar a sua viabilidade e atividade, bem como prevenir mudanas genticas que podem levar reduo ou perda das propriedades fenotpicas desejadas. Tcnicas de manuteno e preservao de microrganismos incluem: repiques peridicos, conservao em parafina, em glicerol, liofilizao, criopreservao etc. Estas tcnicas esto amplamente descritas na literatura (ver referncias bibliogrficas recomendadas). Aps procedimento de inoculao, a clula desenvolve seu metabolismo, a fim de produzir energia para suportar suas reaes biossintticas e de manuteno energtica. As molculas-combustveis (carbohidratos, lipdios, protenas) utilizadas pela clula contm elevado nvel de energia qumica, devido ao seu alto grau de ordem estrutural, apresentando, relativamente, baixa entropia. Durante o catabolismo, essas substncias so degradadas a molculas menores, como dixido de carbono, gua, lcoois etc. Como resultado dessa transformao, a molcula-combustvel sofre uma perda do seu contedo de energia livre (forma de energia capaz de realizar trabalho a temperatura e presso constantes). A energia livre liberada durante as reaes do catabolismo, e por isso chamadas de exoergnicas, conservada na forma de energia qumica nas ligaes covalentes de certos compostos, como o ATP. Os processos biossintticos (anabolismo), transporte ativo atravs da membrana e mobilidade celular envolvem reaes endoergnicas (carentes de energia). As clulas tm suas necessidades atendidas atravs da energia produzida durante o catabolismo (Figura 4). Nutrientes Produtos Energia Crescimento ANABOLISMO (Biossntese) CATABOLISMO
Componentes(Degradao) Celulares

Energia Movimento, Transporte, etc.

Fonte de Energia Figura 4: Esquema simplificado do metabolismo celular. Muitas clulas vivas necessitam de oxignio para manuteno de seu metabolismo. Em Bioprocessos conduzidos com microrganismos aerbios, o oxignio suprido ao biorreator, via de regra, com bolhas de ar, atravs de um compressor, como ser visto mais adiante. J em Bioprocessos anaerbicos, os microrganismos obtm o oxignio metablico atravs de substncias que contm
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oxignio ligado molecularmente. Nos primeiros, o adequado suprimento de oxignio para atender a demanda da clula imperativo, assim como a manuteno de condies anaerbicas estritas no segundo caso. Se essas exigncias no forem atendidas o processo encontra-se com seu potencial limitado, podendo haver desvios no metabolismo celular ou mesmo sua interrupo, com a conseqente perda da viabilidade celular. Dentro da concepo de processo integrado, a associao de determinadas caractersticas do agente biolgico (clulas ou enzimas), bem como das particularidades do sistema reacional, com os processos de downstream tem sido tambm uma tendncia no desenvolvimento e melhoria da operacionalidade de Bioprocessos. Assim, se o agente biolgico do processo for um microrganismo portador de propriedades agregativas (floculao), poder-se-o suprimir equipamentos onerosos de separao de clulas, e utilizar novas configuraes de biorreatores mais compactos e menos intensivos em energia, tornando o processo, conseqentemente, mais econmico. Associaes de sistemas reacionais com separao simultnea de produto(s) podem, tambm, ser desenvolvidas (imobilizao de enzimas em suportes de colunas cromatogrficas, sistemas de fermentao acoplados a mdulos de membrana e outros destilao a vcuo), com os conseqentes benefcios tcnicos e econmicos para a operao e a viabilidade dos Bioprocessos.

4. Nutrio dos Microrganismos

As necessidades nutricionais dos microrganismos so diversas, uma vez que estes apresentam diferenas inerentes na sua capacidade de sintetizar os constituintes celulares a partir de nutrientes simples. A demanda por gua, fontes de energia, carbono, nitrognio e elementos minerais, assim como o acesso/utilizao de oxignio, entretanto, comum a todos os microrganismos. 4.1. Fontes de Energia: De acordo com a forma pela qual os microrganismos assimilam energia, eles podem ser classificados em: Fototrficos: possuem pigmentos fotossintticos que permitem a utilizao da luz como fonte de energia. Ex.: algas e bactrias fotossintetisantes. Quimiolitotrficos: obtm energia a partir da oxidao de um substrato inorgnico, geralmente especfico para o microrganismo em particular, como hidrognio, enxfre, amnia, nitritos e sais ferrosos. Ex.: bactrias dos gneros Thiobacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter, Hydrogenomonas e Desulphovibrio. Quimiorganotrficos: obtm energia a partir do catabolismo de substratos orgnicos, acares em particular. A este grupo pertence a grande maioria dos microrganismos utilizados industrialmente (Madigan et al., 2000). 4.2. Fontes de Carbono: Uma clula tpica contm cerca de 50% de sua massa seca em carbono. Este elemento necessrio para a biossntese de diversos constituintes celulares, como carboidratos, protenas, lipdeos, cidos nuclicos etc. A forma de sua utilizao est intimamente relacionada quela que cada microrganismo em particular emprega para seu suprimento de energia. Organismos
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quimiorganotrficos satisfazem a maior parte de suas necessidades de carbono pela incorporao de metablitos obtidos pela degradao de substratos orgnicos, os quais tambm fornecem energia. Os autotrficos, por outro lado, so capazes de induzir a fotlise da gua, que permite a fixao de dixido de carbono e sua utilizao como nica fonte de carbono. Desta forma, o potencial para utilizar fontes de carbono para o metabolismo varia enormemente entre os microrganismos. Desde os chamados compostos C1 (CO, CO2, formaldedo, metanol, metilamina), at macromolculas complexas (glicognio, amido, protenas, celulose, cidos nuclicos), praticamente todos os compostos orgnicos da natureza podem ser utilizados como fonte de carbono e/ou energia por microrganismos, desde que estes possuam os sistemas enzimticos e de transporte adequados a cada fonte. Compostos orgnicos que contm carbono e nitrognio, tais como aminocidos e protenas, podem servir tanto como fonte de carbono, como de nitrognio. As macromolculas so inicialmente convertidas extracelularmente a subunidades menores, oligmeros ou monmeros, por enzimas despolimerizantes. Caminhos metablicos perifricos so, ento, utilizados para transformar estes compostos em metablitos capazes de ser catabolizados por vias metablicas centrais. Os di e oligossacardeos de baixas massas moleculares (sacarose, maltose e outros), assim como oligopeptdeos e oligonucleotdeos podem ser hidrolisados extracelularmente ou primeiramente transportados para o interior da clula e ento hidrolisados (Krmer & Sprenger, 1993). Os carboidratos so as principais fontes de carbono e energia para os microrganismos, sendo a glicose a mais fcil e amplamente utilizada, seguida por frutose, manose e galactose (Gadd, 1988). 4.3. Fontes de Nitrognio: O nitrognio um constituinte essencial s clulas, uma vez que necessrio formao de aminocidos e cidos nuclicos. Seu teor na clula pode atingir at 15% em massa seca. Os microrganismos apresentam grande diversidade na assimilao de fontes de nitrognio. Muitos so autotrficos para nitrognio, sendo capazes de utilizar nitrato, amnio e, algumas vezes, nitrognio gasoso como nica fonte de nitrognio. Outros, entretanto, necessitam do suprimento deste elemento sob a forma de aminocidos ou de bases purnicas e pirimidnicas. Os microrganismos que requerem aminocidos podem ser nutricionalmente deficientes por incapacidade de sintetizar ou o grupamento amino ou certos aminocidos especficos. As necessidades do primeiro grupo podem ser supridas pelo fornecimento de qualquer aminocido como fonte de nitrognio. Os ltimos, entretanto, requerem a proviso dos aminocidos especficos (Rhodes & Fletcher, 1963; Madigan et al., 2000). 4.4. Fontes de Minerais: Os microrganismos necessitam, para suas funes estruturais e fisiolgicas, de hidrognio, oxignio, fsforo, enxfre, potssio, clcio, magnsio, sdio, ferro e, em alguns casos, cloro. Em adio, requerem elementos-traos, os quais desempenham importante papel como constituintes de enzimas e coenzimas. Estes ltimos incluem mangans, cobre, zinco, molibdnio, cromo,
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nquel, cobalto e boro e so, em geral, necessrios em quantidades relativamente baixas (Rhodes & Fletcher, 1963; Madigan et al., 2000). Por sua vez, a gua essencial para a ao enzimtica, dissoluo de materiais orgnicos e inorgnicos e como reagente em muitos processos metablicos. Seu teor nas clulas situa-se na faixa de 70-90%. Os nutrientes inorgnicos podem agir de quatro formas no interior da clula: entrar no metabolismo levando sntese de compostos necessrios ao funcionamento da clula; estimular o metabolismo como co-fator para reaes enzimticas; inibir o metabolismo e, finalmente, contribuir para as propriedades osmticas (Jennings, 1988). 4.5. Fatores de Crescimento: Muitos microrganismos so incapazes de sintetizar certos aminocidos, substncias orgnicas simples e complexas ou vitaminas, os quais so constituintes ou precursores de enzimas e coenzimas. Essas substncias devem ser supridas ao meio de cultura sempre que necessrio (Rhodes & Fletcher, 1963; Madigan et al., 2000).

5. Matrias-Primas Glicdicas
A viabilidade tcnica, os balanos mssicos e energticos e a economicidade so aspectos relevantes que devem ser considerados na escolha da matria-prima. Em geral, esta deve apresentar as seguintes caractersticas: composio adequada ao crescimento do agente biolgico e formao do produto de interesse; baixo custo de obteno, beneficiamento, transporte e estocagem; elevada disponibilidade e facilidade de padronizao dos componentes; no contribuir para dificultar os processos de separao do produto.

Uma grande variedade de matrias-primas, geralmente provenientes da agroindstria, utilizada como fonte(s) de substrato/carbono/energia e outros nutrientes. De uma forma geral, as matrias-primas para Bioprocessos podem ser agrupadas em funo da estrutura e complexidade molecular dos substratos3. Em algumas, os substratos encontram-se na forma polimrica, e sua hidrlise prvia ser necessria, caso o agente biolgico no seja capaz de sintetizar enzimas que catalisam a despolimerizao desses substratos. Assim, estas matrias-primas podem conter: substratos solveis que podem ser facilmente extrados e convertidos prontamente a produto(s), como por exemplo: sacarose, glicose, frutose e lactose, de cana de acar, beterraba, melao, soro de leite etc; polissacardeos insolveis, que precisam de tratamento moderado para solubilizao e hidrlise, antes da converso a produto(s) como por exemplo: amido de milho, mandioca, trigo, cevada, batata etc; polissacardeos insolveis altamente resistentes, que necessitam de prtratamento fsico, seguido de hidrlise qumica ou enzimtica para produzir
Substrato o reagente primrio do qual o produto obtido.

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substratos na forma monomrica, que sero convertidos a produto(s), como por exemplo: celulose e hemicelulose de matrias-primas lignocelulsicas. A figura 5 apresenta a classificao das matrias-primas em funo de seus respectivos substratos.
AUCARADAS AMILCEAS

LIGNOCELULSICAS

LACTOSE

SACAROSE

AMIDO

CELULOSE

HEMICELULOSE

GALACTOSE FRUTOSE

GLICOSE GALACTOSE

XILOSE

MANOSE

ARABINOSE

Figura 5: Principais matrias-primas glicdicas e seus substratos correspondentes. Em determinados Bioprocessos, como a produo de enzimas por fermentao no estado slido, pode-se prescindir de pr-tratamentos, intensivos em energia e, consequentemente, onerosos, j que muitos microrganismos tm a habilidade de atacar o complexo contendo o(s) polissacardeo(s) e outras macromolculas na sua forma ntegra, como fazem na natureza. Obviamente que, quando se avalia a utilizao dessas matrias-primas, existem aspectos particulares que devem ser levados em considerao, por estarem relacionados viabilidade tcnica, a balanos mssicos e energticos e economicidade do Bioprocesso em desenvolvimento, como mencionado anteriomente. H que se ressaltar, que a matria-prima um dos componentes mais relevantes nos custos de produo, havendo casos em que pode representar at 75% dos custos totais, sendo esta uma das razes pelo crescente interesse no aproveitamento de resduos agro-industriais e florestais como matrias-primas para uma grande variedade de bioconverses (Pereira Jr., 1991). O perfil das matrias-primas tradicionalmente utilizadas nos processos microbianos convencionais no sofreu significativas modificaes nos ltimos cinqenta anos. A tecnologia do DNA recombinante, entretanto, vem gradativamente aumentando a importncia de fontes de carbono pouco utilizadas anteriormente. Como exemplo, a crescente utilizao das leveduras metilotrficas Pichia pastoris e Hansenula polymorpha, para a produo de enzimas recombinantes preconiza o seu crescimento inicial em fontes de carbono menos
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repressoras como o glicerol e a induo do gene de interesse com metanol (Cereghino & Cregg, 2000; Gelissen, 2000).

6. Meios de Cultivo
Os meios de propagao e produo devem conter os nutrientes (fonte de carbono/energia/substrato, fonte de nitrognio, co-fatores4, precursores5 e elementos traos) em concentraes tais que resultem em atividade mxima do agente biolgico, no sendo as condies timas para o crescimento celular, necessariamente, as mesmas para o processo produtivo. A escolha dos nutrientes adequados gerao do produto de interesse est relacionada atividade metablica desenvolvida pelo agente biolgico. Nesse ponto destaca-se, ento, a importncia das informaes obtidas sobre as exigncias nutricionais da populao microbiana envolvida no processo. Buscamse, ento, as fontes adequadas que possuam os componentes necessrios ao bom desempenho da clula. Assim, h que se fortificar a matria-prima com componentes que faltam, retirar aqueles que inibem, de modo a permitir uma rpida e eficiente converso do substrato em produto com o rendimento desejado. evidente que quanto maior o atendimento s exigncias nutricionais, mais apta estar o clula viva a responder aos estmulos externos. Conseqentemente, mais eficiente ser a converso do produto de interesse e maior a produtividade. Satisfazer as exigncias nutricionais das clulas ou compor adequadamente o meio de cultivo em laboratrio, cujas dimenses dos biorreatores so pequenas, pode ser fcil, empregando-se nutrientes puros e caros. No entanto, para compor o meio industrial do Bioprocesso, alguns nutrientes devero ser selecionados de acordo com suas caractersticas no s nutricionais, mas tambm econmicas, no podendo ser esquecidas as particularidades inerentes ao agente da transformao, quanto ao que ser aproveitado para suas reaes metablicas ou a algum efeito de inibio sobre essas reaes ou mesmo sobre a sntese do produto final. A escolha da fonte de carbono muito importante devido ao fato de a sntese de diversas biomolculas estar sujeita represso catablica6. A glicose, por exemplo, apesar de ser, em geral, excelente fonte para o crescimento celular, tem sido reportada como repressora para a sntese de diversas substncias, em particular na produo de enzimas e antibiticos (Lambert & Meers, 1983).
4 Cofatores: so componentes essenciais, orgnicos ou inorgnicos, necessrios em pequenas quantidades para a atividade mxima dos sistemas enzimticos. Ex: metais, vitaminas e substncias qumicas complexas. 5

Precursor: um reagente especfico, cuja adio ao meio resulta na incorporao de um determinado grupo estrutural molcula do produto. No obtenvel pela reao de fermentao, tendo que ser fornecido pr-formado. Ex: cido fenil-actico (produo de penicilina) e on cobalto na produo de cianocobalamina (vitamina B12).

Represso catablica: sistema coordenado que determina preferncia por glicose, inibindo a expresso de perons que codificam enzimas de rotas metablicas alternativas. A represso catablica resulta da reduo nos nveis de cAMP na clula pela presena de glicose, ocasionando na inatividade de CAP (catabolic activator protein).

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Da mesma forma, a fonte de nitrognio deve ser escolhida com bastante critrio. conhecido que fontes de nitrognio chamadas de preferenciais, ricas ou de fcil metabolismo, como o on amnio, a glutamina, a asparagina e a mistura de aminocidos e peptdeos presentes na peptona e outros concentrados proticos comerciais, so repressoras da produo de diversas enzimas. Ao contrrio, prolina e uria, ornitina e alantoina, entre outros, denominadas fontes no preferenciais, pobres ou de assimilao mais lenta, so fontes de nitrognio no repressoras e, portanto, o seu uso em geral favorece a produo de biomolculas sensveis represso por nitrognio (Adrio, 2003; Walker, 1998; Magasanik & Kaiser, 2002). Entre as fontes de nitrognio inorgnicas, o sulfato de amnio o sal mais utilizado devido ao seu baixo custo, sendo tambm empregado o nitrato de sdio. Adicionalmente, existe uma grande disponibilidade de fontes de nitrognio orgnico de grande aplicao em Bioprocessos industriais, como a uria. As principais fontes de nitrognio complexas empregadas so: extrato de levedura (rico em vitaminas do complexo B e aminocidos); licor da macerao do milho (subproduto da industrializao do milho, fonte bem balanceada em carbono, nitrognio, enxofre e sais minerais, contendo ainda vitaminas, como riboflavina, niacina, cido pantotnico, biotina e piridoxina); farinha de soja (resduo da indstria de produo de leo de soja, rico em nitrognio, o qual , entretanto, mais complexo e de mais difcil assimilao do que o nitrognio do licor da macerao do milho) (European Comission, 2002). O valor do pH do meio de cultura parmetro de fundamental importncia e tambm deve ser otimizado, de forma a proporcionar um bom crescimento celular e elevados rendimentos em produto. H que se ressaltar que quando o agente biolgico for enzimas, ou mesmo quando estas biomolculas so os produtos do Bioprocesso, a atividade e a estabilidade enzimticas so fortemente dependentes da fora inica do meio, temperatura, pH e da relao entre a concentrao de substrato e de enzima. Estas variveis bsicas influenciam o desempenho cataltico das enzimas por afetarem suas conformaes, estejam elas livres ou imobilizadas. Estudos devem ser conduzidos previamente a fim de se eleger as condies timas para a catlise enzimtica. Os meios de cultivo podem ser complexos ou quimicamente definidos. Os meios complexos so formulados com base em subprodutos industriais e extratos naturais, tais como: melao, milhocina, extrato de levedura e outros. Sua composio complexa e varivel e contm vrias fontes de cada elemento. Estes meios podem requerer suplementao com compostos que proporcionem quantidades adicionais de alguns elementos, tais como: N, Mg e P. Os meios complexos so extensamente utilizados em Microbiologia bsica (taxionomia, fiosiologia e gentica), Microbiologia de guas e de alimentos e em Fermentaes industriais. Exemplos de componentes de meios complexos encontram-se na Tabela 6. Os meios quimicamente definidos so formulados com compostos puros, tais como: glicose, sulfato de amnio, fosfato mono ou di cido de potssio etc. Sua composio qumica conhecida e reproduzvel, contendo fontes de cada elemento e dos nutrientes essenciais requeridos. Estes meios so usados preferencialmente em pesquisa e desenvolvimento de Bioprocessos. Uma classe especial de meio quimicamente definido o meio mnimo, que se pode definir como aquele formado por uma fonte nica de cada elemento ou componente.
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Os meios complexos so adequados em nvel industrial por serem mais baratos e porque, em certos casos, se obtm melhores rendimentos e produtividades volumtricas. Isto se deve a uma variedade de molculas orgnicas, em sua constituio, que evitam que a clula necessite sintetiz-las a partir de glicose e compostos inorgnicos. Por outro lado, os meios quimicamente definidos permitem um melhor controle das condies ambientais para o crescimento e para a produo, sendo fcil excluir substncias txicas ou inibidoras e incluir precursores e/ou indutores nos nveis adequados. Por esta razo, certas fermentaes que requerem um controle estrito das condies ambientais, resultam mais produtivas quando se utilizam meios quimicamente definidos. A Tabela 7 mostra, a ttulo de exemplo, a composio de um meio quimicamente definido para o cultivo de clulas de Saccharomyces cerevisiae. Tabela 6: Exemplos de componentes de meios complexos industriais. Componente Melao Milhocina Licor sulftico Soro/permeado de soro de leite Vinhoto Farinha de soja e pescado Extrato de levedura Origem Indstria aucareira Subproduto do processamento de milho Efluente da indstria de polpa e papel Subproduto do processamento de queijo Subproduto da produo de etanol Industrializao da soja e pescado Indstria de levedura de panificao

Tabela 7: Meio quimicamente definido para o cultivo de clulas de S. cerevisiae. Componente Glicose (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O KH2PO4 NaCl FeSO4.7H2O CuSO4.5H2O ZnSO4.7H2O CaCl2 CoCl2.6 H2O Concentrao (g/L) 18,0 3,2 0,39 0,68 0,008 0,002 0,001 0,003 0,028 0,0002

6.1. Otimizao do meio de cultivo

A otimizao da composio do meio de cultivo para obter-se mximo rendimento em produto no uma tarefa fcil. Tradicionalmente, abordagens empricas tm sido adotadas, nas quais os efeitos de componentes individuais do meio sobre o rendimento em biomassa e produto so investigados em frascos cnicos agitados. As fontes de carbono so examinadas primeiramente e, posteriormente, as fontes de nitrognio, at que todas as combinaes dos componentes do meio sejam estudadas, atingindo-se um meio de composio otimizada. Normalmente, compostos repressores so descartados e aqueles que estimulam ou induzem a sntese de enzimas so mantidos. Ressalta-se que este
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procedimento envolve um grande nmero de experimentos e demanda um tempo muito grande para se chegar a composio otimizada do meio, sendo os constituintes investigados individualmente e, via de regra, negligenciados os efeitos interativos entre os mesmos. Um procedimento alternativo pode ser utilizado na otimizao de meios em Bioprocessos, baseado em mtodos estatsticos que permitem otimizar as concentraes dos componentes fundamentais do meio, levando-se em considerao o grau de inter-relao entre eles (Demain & Solomon, 1986). Aps seleo dos principais componentes do meio que afetam o rendimento em produto e a produtividade, procede-se a combinao dos mesmos de acordo com uma metodologia estatstica (Planejamento Fatorial), que permite o planejamento dos experimentos. Desta forma, os efeitos de vrios componentes podem ser determinados simultaneamente, com um nmero relativamente pequeno de experimentos. O Planejamento Fatorial de experimentos baseia-se no estudo de dois parmetros do processo. So eles os fatores e os nveis. Fatores so as variveis do processo, como por exemplo, a temperatura de crescimento de um microrganismo ou a concentrao de determinado nutriente em um meio de cultivo. J os nveis so as diferentes condies pesquisadas, geralmente so utilizados nveis superiores, inferiores e centrais. Para um melhor entendimento, imaginemos um Planejamento experimental envolvendo a temperatura de crescimento de determinado microrganismo e a concentrao de um nutriente em seu meio de cultivo. Podemos estabelecer para cada fator estudado (temperatura e concentrao) 3 nveis de estudo (Tabela 8): Tabela 8: Definio de Fatores e Nveis para o Planejamento Experimental. Nvel Central 35C 3%

Fator Temperatura de cultivo Concentrao de nutriente

Superior 37C 5%

Inferior 33C 1%

A representao de um planejamento fatorial nk, sendo n o nmero de nveis e k o nmero de fatores. Utilizando os dados da tabela anterior, temos que n = 3 e k = 2, ento o planejamento fatorial em questo ter um total de 32 experimentos, ou seja, 9 condies experimentais diferentes. Estas condies experimentais so representadas por uma matriz de planejamento (Tabela 9), onde cada nvel possui sua representao numrica: o superior representado pelo valor +1, o central pelo valor 0 e o inferior pelo valor 1. Veja que todas as condies possveis esto descritas na Tabela 9. Os experimentos so ento realizados, tendo sido definida previamente a varivel de resposta, geralmente, no caso de otimizao de Bioprocesso, a concentrao do produto ou o fator de rendimento ou, ainda, a produtividade volumtrica ou especfica. Aps a obteno dos resultados de cada um dos experimentos relacionados, a anlise estatstica destes dados pode ser realizada utilizando um software apropriado, que fornecer valores crticos dos fatores, bem como a sua significncia e grau de interao.

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Tabela 9: Matriz de Planejamento Experimental. Experimento

1 2 3 4 5 (C) 6 7 8 9

Temperatura de crescimento
+1 (37C) +1 (37C) +1 (37C) 0 (35C) 0 (35C) 0 (35C) -1 (33C) -1 (33C) -1 (33C)

Concentrao de nutrientes
+1 (5%) 0 (3%) -1 (1%) +1 (5%) 0 (3%) -1 (1%) +1 (5%) 0 (3%) -1 (1%)

Observe que nesta matriz um importante fator foi ignorado: o tempo de cultivo do microrganismo. Caso utilizssemos tambm este fator, teramos uma nova matriz com 33 experimentos, compreendendo 27 condies experimentais diferentes. importante comentar que rplicas so muito importantes para o Planejamento experimental, pois permitem que analisemos o erro intrnseco ao Bioprocesso, chamado de erro experimental. O tipo de rplica mais importante a do ponto central de experimentos, marcado com (C) na Tabela 9. Anlises estatsticas demonstram que a utilizao de um nmero superior a 5 rplicas para o ponto central dispensa duplicatas dos outros pontos experimentais.

6.2.

Formulao de meio de cultivo com base na composio centesimal de microrganismos

Conhecendo-se a composio elementar da clula (Tabela 8), pode-se determinar a sua frmula mnima e estimar estequiometricamente suas necessidades nutricionais. Esta composio dependente do meio em que o microrganismo foi cultivado. Para que o processo de reproduo celular seja possvel, os requerimentos em matria, energia e informao devero ser atendidos, respeitando-se os princpios de conservao de massa e energia, de forma a possibilitar a construo de uma nova clula igual a anterior (Figura 6).

matria

CLULA

energia

CLULA produto

informao

Figura 6: Requerimentos para o crescimento/multiplicao celular.

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A informao para a construo de uma nova clula est contida no material gentico do microrganismo e transmitida de gerao a gerao. A matria deve ser fornecida atravs de componentes do meio de cultivo e a energia obtida do catabolismo da fonte de carbono e energia, de reaes de oxidao ou de radiao solar no caso de microrganismos fotossintticos. As clulas so representadas com base em sua composio elementar. Composies tpicas de bactrias, leveduras e fungos filamentosos esto apresentadas na tabela a seguir. Os elementos quantitativamente mais importantes so: carbono, hidrognio, oxignio e nitrognio (90-92% do total da massa celular), o que justifica a aproximao feita na equao estequiomtrica, descrita a seguir. De grande importncia encontra-se um segundo grupo de elementos, compostos por: Mg, P, S, Ca, Na e K, que devem ser fornecidos como compostos aptos metabolizao pela clula. A fonte de carbono e energia pode ser um carboidrato ou outro composto orgnico, ou mesmo CO2, carbonato ou bicarbonato no caso de clulas quimioautotrficas e fotossintticas. A fonte de nitrognio pode ser amnio, aminocidos, protenas, uria, nitrato ou nitrognio molecular, sendo as duas primeiras as mais comuns. O restante dos elementos suprido atravs de sais inorgnicos. Devido a deficincias genticas, certas linhagens requerem fatores de crescimento, tais como vitaminas, aminocidos e nucleotdeos, como mencionado anteriormente. Tabela 10: Composio centesimal de clulas microbianas. Fonte: Bailey & Ollis (1986). ELEMENTOS Carbono Hidrognio Oxignio Nitrognio Magnsio Fsforo Enxofre Clcio Potssio Ferro Outros COMPOSTOS Protenas Carboidratos Lipdios c. Nuclicos Cinzas BACTRIA 46-52 8-12 18-24 10-14 0,1-0,5 2,0-3,0 0,1-1,0 0,01-1,0 1,0-4,5 0,02-0,2 <0,01 50-60 6-15 5-10 15-25 4-10 LEVEDURA 46-52 8-12 18-24 5-9 0,1-0,5 0,8-2,5 0,01-0,25 0,1-0,3 1,0-4,0 0,01-0,5 <0,01 35-45 30-45 5-10 5-15 4-10 BOLORES 45-55 8-12 18-24 3-7 0,1-0,3 0,4-4,5 0,1-0,5 0,1-1,4 0,2-2,5 0,1-0,2 <0,01 25-40 40-55 5-10 2-10 4-10

possvel representar o crescimento microbiano mediante uma equao qumica que seja regida pelos princpios da estequiometria e da cintica. Note que as estruturas moleculares do substrato, fonte de nitrognio e do produto so conhecidas e sabendo-se que, de uma forma geral, em aerobiose 50-60% do carbono contido no substrato incorporam-se plasticidade celular e em

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anaerobiose apenas 10-20%, pode-se estimar a concentrao dos nutrientes que iro compor o meio de cultivo.

CHlOm + NH3 + O2 CHaObNc + CHpOqNr + H2 O + CO2

SUBSTRATO

FONTE DE NITROGNIO

CLULAS

PRODUTO ou (CHO)

7. Esterilizao de Meios e Equipamentos

H Bioprocessos bastante exigentes quanto esterilidade dos meios de cultivo, havendo, tambm, grande rigor assptico no s no transporte do meio esterilizado ao biorreator, bem como no prprio sistema reacional. Pode-se citar como exemplos de processos que demandam esterilizao: a produo de antibiticos, vacinas, vitaminas e enzimas. Por outro lado, outros requerem apenas uma esterilizao incipiente (pasteurizao), tendo em vista que o prprio produto age como uma barreira contaminao, devido ao seu carter txico aos microrganismos contaminantes. A bioproduo de combustveis, solventes e cidos orgnicos insere-se neste ltimo caso. H, tambm, Bioprocessos em que se prescinde totalmente de assepsia, como o caso dos biotratamentos, nos quais a microbiota nativa ou exgena, atuando de forma consorciada, extremamente desejvel para se reduzir da carga orgnica poluidora. O processo de esterilizao geralmente levado a cabo por agentes fsicos. Os mais empregados so o calor (seco e mido), a filtrao atravs de membranas microporosas e as radiaes (especialmente a ultra violeta). O calor seco empregado na esterilizao de instrumental e vidraria e o calor mido, presso atmosfrica ou saturado sob presso, aplicado esterilizao de equipamentos e, principalmente, de meios de cultivo. Esta ltima, a forma mais usual, pode ser realizada em conjunto ou separadamente do biorreator e, ainda, em batelada ou continuamente. Na prtica industrial verifica-se o emprego da esterilizao de meios de cultivo em batelada e em conjunto com o biorreator, fazendo-se passar vapor saturado sob presso atravs de serpentinas ou jaquetas (aquecimento indireto), ou pela injeo de vapor saturado diretamente no meio contaminado (aquecimento direto). Neste ltimo caso, h que se levar em considerao a diluio do meio de cultivo causada pela condensao do vapor ao entrar em contato com o meio contaminado. Na esterilizao em batelada, o tempo total de esterilizao relativamente grande, podendo dar origem a decomposio de nutrientes termo-sensveis, como as vitaminas, ou provocar reaes indesejveis entre os constituintes do meio, como por exemplo, reaes entre amino-cidos e acares (reao de Maillard) ou de caramelizao (decomposio dos acares). Neste sentido, esta modalidade de esterilizao vem sendo substituda, sempre que possvel, pela esterilizao contnua, na qual se preserva mais a integridade dos constituintes do meio, j que o aquecimento e o resfriamento so praticamente instantneos,
32

no havendo variao de temperatura na seo de espera, que retm o meio de cultivo a ser esterilizado em temperaturas elevadas, por curto tempo de exposio (Figura 8). Obviamente, a esterilizao contnua essencial para sistemas contnuos de fermentao.

Aquecimento com vapor direto

Aquecimento eltrico

Aquecimento com vapor indireto

Resfriamento indireto

Figura 7: Tipos de transferncia de calor na esterilizao de meios e equipamentos.

Figura 8: Esterilizao em Batelada ( esquerda) versus Contnua ( direita).

Ti: temperatura inicial; Tf: temperatura de fermentao; Tm: temperatura mnima letal; Te: temperatura de esterilizao; : tempo de esterilizao; I: seo de aquecimento; II: seo de esterilizao propriamente dita; III: seo de resfriamento.

O meio preparado e esterilizado deve, ento, sofrer a ao dos agentes biolgicos, seja pela inoculao de uma suspenso suficientemente concentrada de clulas ativadas e propagadas ou recicladas ao processo, seja pela adio de unidades de atividades enzimticas suficientes para catalisar a transformao do substrato em produto, com altas converses e taxas de produo.
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8. Biorreator
A mistura reacional, constituda de meio (de cultivo ou para converso enzimtica) e agente biolgico, ser ento processada em biorreatores7, onde devero ser mantidas as condies timas para o agente biolgico expressar o mximo de sua atividade cataltica, seja atravs do metabolismo da clula ou de simples reao enzimtica. Quando se tratar de um processo puramente enzimtico, o meio reacional adicionado de unidades de atividade enzimtica e a catlise realizada tambm em biorreatores para mximo de converso e produtividade. No biorreator, vrios fenmenos qumicos, fsicos e, naturalmente, biolgicos ocorrem. Por essa razo, o desenvolvimento de Bioprocessos constitui-se em uma das mais complexas e fascinantes reas de atuao da Engenharia Bioqumica. Por exemplo, no projeto de um biorreator, devem ser levados em considerao os seguintes aspectos: a cintica do Bioprocesso, o clculo das tubulaes e equipamentos necessrios para manuteno de esterilidade, as caractersticas hidrodinmicas do meio reacional, a transferncia de massa de nutrientes na clula, a transferncia de massa de oxignio da fase gasosa para o seio do lquido e, posteriormente, para as clulas (em processos aerados), a transferncia de massa de produtos e subprodutos das vizinhanas das clulas para o seio do meio de cultivo, a transferncia de calor metablico e o controle da fisiologia microbiana. Pode-se encontrar uma grande variedade de configuraes de biorreatores. Dentre elas, os biorreatores agitados mecanicamente (STB-stirred tank bioreactor) so, sem dvida, os mais estudados e utilizados industrialmente (Figura 9). Embora no necessariamente ideais, os tanques agitados apresentam versatilidade e fornecem bons resultados para uma grande gama de Bioprocessos. Isto particularmente importante para as companhias farmacuticas, pois diferentes substncias podem ser produzidas no mesmo biorreator durante o seu tempo de vida. Adicionalmente, os investimentos em capital para a construo destes equipamentos so normalmente recuperados na comercializao do primeiro produto. Apesar de sua flexibilidade, pois podem ser empregados para uma grande gama de bioconverses, os biorreatores do tipo STB apresentam certas desvantagens, como por exemplo: demandam grande aporte de energia para a agitao mecnica, tendem a afetar a morfologia celular, so de difcil escalonamento e tm de ser cuidadosamente projetados para produzir adequada mistura e aerao. Nos biorreatores agitados pneumaticamente (Figura 10), a potncia necessria para se atingir o grau de mistura desejvel no sistema reacional, a fim de se produzirem altas taxas de transferncia de massa e calor, suprida pela energia cintica do lquido, atravs de sua circulao pelo movimento das bolhas gasosas, isto , pneumaticamente. Este tipo de biorreator, conhecido na literatura inglesa como airlifit (com circulao interna ou externa) ou coluna de bolhas (bubble column), aplicado a sistemas biolgicos suscetveis s foras cisalhantes, to intensas em biorreatores agitados mecanicamente. Alm da sua elevada relao altura:dimetro (6:1 H/DT 20:1), quando comparado com os
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Biorreator: tanque/recipiente no qual clulas ou enzimas realizam uma reao biolgica.

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biorreatores do tipo STB (at 4:1), os biorreatores agitados pneumaticamente possibilitam a operao contnua de bioprocessos com altas densidades celulares (clulas imobilizadas ou floculantes), resultando em altos valores de produtividade volumtrica. H registros na literatura de processos que tiveram seus tempos de converso de substrato em produto reduzidos de dias para horas, pelo emprego deste tipo de biorreator. As altas relaes H/DT so necessrias a fim de se alcanarem elevadas retenes das bolhas gasosas no seio do lquido e de gerar altas presses hidrostticas na regio prxima distribuio do ar (na base do biorreator), que induziro o movimento do lquido.

Figura 9: Biorreator agitado mecanicamente. O biorreator airlift difere da coluna de bolhas pela presena de um dispositivo, colocado interna ou externamente, denominado draft tube. As funes deste dispositivo incluem: o aumento do grau de mistura, imprimindo, fundamentalmente, escoamento axial, a reduo da coalescncia das bolhas e a equalizao das foras cisalhantes ao longo do biorreator. Tanto o biorreator airlift quanto o de coluna de bolhas so comumente utilizados em culturas de microrganismos sensveis ao cisalhamento decorrente da movimentao do lquido.

Figura 10: Biorreatores com escoamento pneumtico.

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Biorreatores a membrana (hollow-fiber e flat-sheet) vm, tambm, sendo utilizados com sucesso, em determinados Bioprocessos. Sua principal vantagem est na possibilidade de confinar clulas ou enzimas dentro do biorreator, separando-as da corrente de sada do sistema quando se opera continuamente, e tornando esta etapa desnecessria durante o processo de downstream. Embora, esta vantagem possa ser tambm conseguida com outras tcnicas de imobilizao, o confinamento de clulas em biorreatores a membrana microporosa , talvez, a maneira mais incua de imobilizao de clulas e enzimas, pois no so utilizados agentes qumicos nem condies drsticas de aprisionamento. O uso de biorreatores de membrana particularmente atraente em sistemas bifsicos, pois muitas dificuldades associadas com emulsificao e separao de fases podem ser evitadas. Biorreatores com clulas/enzimas imobilizadas: Nas ltimas duas dcadas houve grandes e rpidos desenvolvimentos no uso de enzimas e clulas para propsitos industriais, analticos e mdicos. A fim de tornar seu uso mais conveniente, estes agentes biolgicos tm sido imobilizados, assemelhando-se aos catalisadores de fase slida da qumica convencional. Clulas (vivas ou mortas) e enzimas podem ser imobilizadas por vrios mtodos. Em princpio, estes mtodos so classificados em duas categorias: imobilizao ativa ou passiva. A imobilizao ativa requer o uso de agentes qumicos, que ativaro a superfcie do suporte ou possibilitaro a criao de uma matriz porosa, na qual o agente biolgico fique aprisionado, enquanto que a imobilizao passiva ocorre quando filmes biolgicos aderem naturalmente na superfcie ou no interior de um suporte inerte ou, ainda, quando flocos de clulas so formados. A Figura 11 ilustra os mtodos de imobilizao de agentes biolgicos.

Mtodos de Imobilizao

Imobilizao ativa

Imobilizao passiva

Ligao cruzada

Ligao covalente

Adsoro

Colonizao

Envolvimento

Floculao

Figura 11: Mtodos de imobilizao de agentes biolgicos. No mtodo do envolvimento h o confinamento fsico do material biolgico em uma matriz polimrica formadora de gel. O mtodo apresenta como vantagens, a baixa toxidez e a alta capacidade de reteno de clulas. Os materiais mais utilizados so os polmeros naturais como: agar; K-carragenina; alginato e
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pectina ou polmero sinttico como a poliacrilamida. Neste ltimo caso h necessidade de agente funcional para formao de ligaes cruzadas, o que pode conferir certa toxicidade s clulas. Na tcnica da ligao covalente, os suportes so especialmente funcionalizados para conter um grupamento qumico que ser responsvel pela imobilizao do material biolgico ao suporte. Dentre os materiais suportes, as esferas de vidro (dimetro variando de 100 a 500 m) tratadas com -aminopropil-trietoxisilano so bastante empregadas. Posteriormente, o grupamento amina resultante reage com glutaraldedo (agente bifuncional), de forma a se produzir uma estrutura especial que possui um grupamento carbonila (-HC=O) altamente reativo. A interao da clula/enzima com o suporte se d pela ligao da carbonila do suporte funcionalizado com os grupamentos aminas das enzimas ou das protenas da parede celular. Sua limitao est associada a potencial toxicidade do sistema, conferida pela presena do glutaraldedo (Pradella, 2001). A adsoro um mtodo no qual o material biolgico adere a suportes que no foram funcionalizados. As foras de interao envolvem: interaes eletrostticas entre cargas opostas das estruturas proticas e da superfcie do suporte; ligaes inicas entre grupos aminos e carboxlicos e ligaes covalentes parciais entre grupos aminos da parede celular e grupo hidroxila da superfcie do suporte. Sua limitao refere-se influncia acentuada das condies ambientais na capacidade de reteno das clulas (concentrao inica; pH e fluxo do material lquido) ao suporte (Ansejo & Merchuk, 1995). A floculao um fenmeno no qual clulas isoladas, suspensas em um lquido, agregam-se para formar flocos (auto-imobilizao), resultando em rpida sedimentao ou flotao. Os fatores envolvidos na formao de flocos so de natureza gentica, ambiental, fisiolgica e estrutural. As foras de interao associadas floculao envolvem: ligao protena-carboidrato (leveduras) e formao de polissacardeos (biofilmes) em clulas bacterianas (Pereira Jr. & BuLock, 1993 e 1994). Vrias vantagens associadas imobilizao de clulas/enzimas podem ser apontadas: Possibilidade de aplicao em reaes enzimticas de mltiplas etapas; Rendimentos e produtividades elevados; Estabilidade operacional geralmente alta; Operaes de extrao e/ou purificao de enzimas so desnecessrias; Altas densidades celulares podem ser empregadas; Densidades celulares e atividades enzimticas podem ser mantidas por longos perodos de operao; Produtos podem ser facilmente separados da biopartcula cataltica; Menor suscetibilidade a contaminaes microbianas.

Por outro lado as seguintes desvantagens potenciais so apresentadas: Os Reaes indesejveis podem ocorrer pela presena de vrias enzimas cataliticamente ativas; Desprendimento de clulas e enzimas do suporte; Problemas ligados transferncia de massa intra-particular. tipos de biorreatores para clulas/enzimas imobilizadas mais
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comumente utilizados em so: CSTB, leito fixo e leito fluidizado, sendo os dois ltimos mais indicados por minimizarem a exposio da biopartcula (agente biolgico imobilizado) a elevados graus de cisalhamento e colises (Figura 12). Para se aplicar esta tcnica em processos industriais, estudos devem ser realizados para elucidar algumas caractersticas dos sistemas imobilizados, principalmente no tocante fisiologia celular ou conformao da enzima imobilizada e aos problemas de transferncia de massa intra-particular e no prprio biorreator. No entanto, esses sistemas vm sendo utilizados industrialmente, em pases avanados, com sucesso na produo de etanol (combustvel e champanhe), acrilamida, alanina e dos cidos orgnicos: asprtico, mlico e fumrico.

(A)

(B)

Figura 12: Biorreatores com clulas/enzimas imobilizadas. (A) leito fixo; (B) leito fluidizado.

Configuraes de biorreatores tm sido tambm propostas para o cultivo de clulas animais (livres ou imobilizadas/ancoradas). Estes sistemas requerem cuidadosa anlise para a seleo/projeto de biorreatores, tendo em vista a ausncia de parede celular nestas clulas, o que as torna muito mais suscetveis a foras cisalhantes do que outros organismos e, por conseguinte, rompem-se com mais facilidade. Este problema agravado pelo tamanho relativamente grande dessas clulas e pela falta de mobilidade individual. Clulas animais ancoradas em microcarreadores no sofrem movimentos de rotao nem translao, consequentemente, no podem reduzir (amortizar) o impacto das foras decorrentes de sua exposio s foras mecnicas transferidas ao fluido. O cultivo de clulas animais em biorreator tem sido considerado um dos grandes desafios da Biotecnologia moderna (Ansejo & MerchuK, 1995). Da mesma forma, o cultivo de clulas vegetais em biorreator tambm um dos assuntos em voga na Biotecnologia moderna. O interesse comercial nestes cultivos est relacionado com a produo de metablitos secundrios de alto valor agregado, com aplicao na agricultura (inseticidas) e, em especial, nas reas farmacutica e mdica, como por exemplo: analgsicos, anestsicos e outros frmacos utilizados no combate a desordens circulatrias e cardacas, malria, leucemia e etc. A opo pelo cultivo em biorreator deve-se a maior
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facilidade no controle da fisiologia dessas clulas, o que permite maximizar rendimentos e produtividades. Os avanos da Biologia Molecular, Engenharia Metablica e da Engenharia Bioqumica indicam que o sucesso comercial de tais bioprocessos no est distante de realizao. Este um outro campo para grandes desenvolvimentos, assim como o desenvolvimento de foto-biorreatores (Ansejo & MerchuK, 1995). Qualquer que seja a configurao escolhida, para processos conduzidos com rigor estril, a construo do biorreator deve atender aos seguintes requerimentos: passvel de ser esterilizado quando culturas puras so empregadas; deve ser de simples geometria e construo; deve conter um nmero mnimo de flanges e soldas; no deve conter zonas mortas; material deve possuir rugosidade superficial mnima; suportar carregamento (espessura de chapa compatvel com o volume a ser processado); deve ter capacidade de suportar altas presses, particularmente em bioprocessos nos quais esterilizao requerida; deve apresentar timas condies de mistura (baixo e uniforme cisalhamento) e permitir uniforme suspenso de slidos; deve possuir condies de fluxo claramente definidas, com alimentao de substrato compatvel com as taxas de metabolizao; deve possibilitar adequado transporte de massa, particularmente em relao transferncia de oxignio, em processos aerados; adequada instrumentao para o monitoramento e controle (on line ou off line) das variveis de processo; deve prever o controle de espuma; flexibilidade, podendo ser empregado em outros bioprocessos; estabilidade a longo termo; compatibilidade com as etapas de montante (upstream) e jusante (downstream); Fcil escalonamento.

Um dos grandes problemas existentes na operao de biorreatores decorre da dificuldade de medies de variveis de processo a serem controladas. No caso de variveis fsicas, como temperatura, vazo, velocidade de agitao e taxa de aerao, ou fsico-qumicas, como pH, potencial redox, presso parcial de oxignio e a composio dos gases de sada, estas so usualmente empregadas como avaliaes diretas, podendo ser medidas on line, atravs da utilizao de sistemas de controle e outros equipamentos comerciais. Por outro lado, o controle de variveis qumicas ou bioqumicas de difcil realizao e pesquisas vm sendo conduzidas no sentido de desenvolver instrumentos sensveis para o monitoramento destas variveis, capazes de relacionar variaes de espcies qumicas com sinais eltricos ou espectrofotomtricos, utilizando como elemento sensor um agente biolgico (biossensores). Biorreatores so peas-chaves no desenvolvimento de Bioprocessos. No se pode discutir o desenvolvimento/otimizao de bioprocessos sem prestar ateno especial nas caractersticas e fenomenologias que ocorrem nestes equipamentos.
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9. Modos de Operao de Bioprocessos

9.1. Quanto conduo
A forma mais utilizada de conduo de Bioprocessos a batelada simples, na qual ao meio de cultivo adicionada uma suspenso celular e o processo transcorrido, sem adies de meio novo, nem retiradas de meio reacional durante o seu curso. A batelada simples caracterizada pela alterao nas condies ambientais a todo instante do Bioprocesso (as concentraes de nutrientes so reduzidas e de clulas, produtos e sub-produtos aumentadas). O principal problema desta forma de operar Bioprocessos decorrente de fenmenos de inibio pelo substrato, produto e outros metablitos. Por exemplo, elevadas concentraes de substrato so inibitrias ao agente biolgico. Este efeito est relacionado, em clulas vivas, a fenmenos osmticos que resultam em plasmlise celular. As possveis razes para o fenmeno so: represso na sntese de enzimas, desidratao dos sistemas enzimticos, devido perda de gua da clula e/ou inibio do transporte de nutrientes para o seu interior. , tambm, fato bem conhecido que a clula viva polui seu ambiente com produtos do seu metabolismo at cessar o crescimento e, eventualmente, perder sua viabilidade, fenmeno este conhecido como inibio pelo produto. Ressalta-se que esses fenmenos so dependentes da linhagem e das condies de cultivo. Para se contornar esses problemas de inibio/represso, outras formas de conduo podem ser utilizadas, como a batelada alimentada e suas variantes, que possibilitam a manuteno da concentrao desses inibidores/repressores em nveis sub-inibitrios/sub-repressores, com implicaes diretas no desempenho da clula. A tcnica de batelada alimentada definida como um modo de operao na qual um ou mais nutrientes necessrios ao crescimento celular so adicionados ao biorreator, intermitentemente ou continuamente, sem que ocorra retirada de material durante a operao. A flexibilidade de operao oferecida por esta forma de conduo adequada a Bioprocessos em que o crescimento celular e/ou formao de produtos so significativamente sensveis concentrao do substrato limitante. Tcnicas de fermentao em batelada alimentada so adotadas produo de vrias enzimas e antibiticos, uma vez que a formao destas biomolculas muitas vezes sujeita represso pelo substrato. A conduo contnua outra modalidade de se operar biorreatores. Como o prprio nome sugere tanto a alimentao de meio nutriente, quanto a retirada de produto (meio fermentado) so realizadas de forma contnua. Sua principal vantagem, quando comparada com outras formas de conduo, est ligada possibilidade de se operar o sistema por extensos perodos de tempo, resultando em aumento de produtividade. Adicionalmente, o agente biolgico converte substrato em condies estacionrias, que podem ser determinadas previamente para o seu melhor desempenho, em contraste com a batelada simples, na qual o agente biolgico est submetido, a todo o momento, a condies ambientais diferentes. Os processos contnuos podem ser conduzidos com um nico biorreator (com e sem reciclo de clulas) e com biorreatores em srie. As seguintes vantagens da conduo contnua podem ser apontadas: inexistncia de tempos improdutivos, levando o biorreator a permanecer muito mais tempo em servio; as operaes que antecedem e sucedem o processo podem ser realizadas continuamente; possibilidade de instrumentao e controle
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automtico, levando a menores gastos com mo de obra; maior uniformidade do produto; e as condies ambientais so constantes, o que possibilita o estudo das vrias influncias sobre o agente do bioprocesso. No entanto, riscos de contaminao e problemas ligados degenerescncia do agente (mutao e variao) so citados como desvantagens da conduo contnua. Ressalta-se que esta forma de conduo do processo particularmente adequada para a escolha das fontes de carbono e nitrognio e tambm de outros nutrientes. Sumariamente, se uma cultura contnua em estado permanente submetida a pulsos contendo componentes individuais e se a concentrao celular ou do produto de interesse mostrar um aumento transiente, ento aquele componente particular limitante para o crescimento ou para a produo e sua concentrao no meio dever ser aumentada para maximizar os rendimentos. Indutores e repressores podem ser identificados a partir do aumento ou da diminuio transiente do rendimento, em funo da adio de tais molculas. Portanto, os componentes-chaves de um meio podem ser rapidamente identificados sem a necessidade de um grande nmero de experimentos em frascos agitados, como mencionado anteriormente. A eleio da forma de conduo ser funo da cintica do Bioprocesso, tendo-se que avaliar o momento em que a sntese do produto se inicia. Desta forma, em que pesem as complexidades dos bioprocessos, estes podem apresentar a sntese do produto de forma associada, semi-associada e no associada ao crescimento microbiano. Pelo estudo cintico, pode-se orientar no projeto do processo que melhor convm ao bioprocesso. Assim que, os produtos que se formam associadamente ao crescimento podem ter ser processos conduzidos continuamente. J no caso de produtos que tm a sua sntese de forma no associada ao crescimento, a distino de duas fases orienta no sentido de realizar-se a produo do agente separadamente, tendo at um meio de composio diferente ao de produo. O processo dever, portanto, ser operado em duas fases e, desta forma, passvel de ser conduzido continuamente. Concluses anlogas anterior, aplicam-se aos processos que apresentam cintica mista (semi-associada). A seguir, esto ilustradas as diferentes formas de conduo de bioprocessos para uma melhor compreenso dos possveis arranjos produtivos (Figuras 13 a 20). Obviamente, que a escolha de um desses arranjos est ligada, como mencionado anteriormente, cintica do processo, mas tambm aos aspectos tcnicos e econmicos do bioprocesso em desenvolvimento. Por exemplo, a reutilizao de clulas traz benefcios econmicos, no que concerne a utilizao mais efetiva do substrato para a sntese do produto propriamente dita, minimizando o consumo deste reagente primrio para a plasticidade celular. Da mesma forma, o reciclo de clulas na conduo contnua permite que se trabalhe com os biorreatores com altas densidades celulares, resultando em aumentos na produtividade volumtrica e especfica do bioprocesso. Estas estratgias so particularmente interessantes no caso do produto ser uma substncia de baixo valor agregado. Por outro lado, substncias de alto valor agregado (como antibiticos, vitaminas e protenas teraputicas) que, via de regra, apresentam cinticas de produo mais lentas, devem ter seus processos de produo atendendo aos mais altos padres de qualidade. Neste sentido, alto rigor estril requerido e a adoo da reutilizao de clulas no se mostra como uma alternativa interessante para a conduo desses bioprocessos, pelos riscos inerentes de contaminao.
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B1
Inculo recentemente preparado

B2
Inculo recentemente preparado

Meio fermentado encaminhado Seo de separao de clulas e recuperao de produto

Meio fermentado encaminhado Seo de separao de clulas e recuperao de produto

Figura 13: Batelada com um inculo para cada biorreator

...... .

B1
Inculo recentemente preparado Meio fermentado sem clulas Separao de clulas Suspenso concentrada de clulas Tratamento das clulas seguido de inoculao

Seo de recuperao de produto

B2

Meio fermentado sem clulas

Seo de recuperao de produto

Separao de clulas Suspenso concentrada de clulas

Figura 14: Batelada com recuperao do inculo.

...... .

Inculo recentemente preparado

B1i

B1f

B2i

B2f

B3i

B3f

MN

MT

Figura 15: Batelada seqencial ou repetida.

BNi: incio da batelada: BNf: final da batelada. MN: meio novo; MT: meio transformado. 42

Com alimentao intermintente

Estendida F=cte F=F(f linear) F=F(f exponencial)

Vf Vi
Figura 16: Batelada alimentada com diferentes formas de alimentao.
Vi: volume inicial; Vf: volume final.

F (L/h) So Xo=0 Po=0

F (L/h) S1 X1 P1

Figura 17: Processo Contnuo com um nico biorreator.

F: vazo de alimentao e de meio transformado; S: concentrao de substrato; X: concentrao de clulas; P: concentrao de produto (o ndice o refere-se condio inicial e o ndice 1 s concentraes na corrente que sai do biorreator).

F (L/h) So Xo=0 Po=0

F+F (L/h) S1; X1; P1

F (L/h) S1 X2 P1

F CfX1

Figura 18: Processo Contnuo com um nico biorreator e com reciclo de clulas.
F: vazo de alimentao e de meio transformado; S: concentrao de substrato; X: concentrao de clulas e P: concentrao de produto (o ndice o refere-se condio inicial; o ndice 1 s concentraes na corrente que sai do biorreator e o ndice 2 s concentraes que saem do separador). : razo de reciclo e Cf: fator de concentrao de clulas. Note que no separador as concentraes de substrato e produto so as mesmas que saem do biorreator, admitindo-se que no haja transformao na seo de separao de clulas.

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F0 (L/h) S0 X0=0 P0=0

S1 X1 P1 S2 X2 P2 S3 X3 P3

Fn=F0

......

Sn Xn Pn

Figura 19: Processo Contnuo com biorreatores em srie sem alimentao adicional.
Os ndices de S; X e P referem-se aos valores correspondentes ordem do biorreator da srie.

F02 S02 F01 (L/h) S01 X0=0 P0=0

S1 X1 P1

F03 S03
F01+ F02

F0n S0n
Fn

F01+F02+...+ F0n-2+F0n-1

S2 X2 P2

S3 X3 P3

......

Sn Xn Pn

Figura 20: Processo Contnuo com biorreatores em srie com alimentao adicional.
Os ndices de F0; S; X e P referem-se aos valores correspondentes ordem do biorreator da srie.

9.2. Quanto ao desenvolvimento do agente microbiano

Bioprocessos podem ainda ser operados em superfcie, em profundidade (submerso) e por fermentao no estado slido. Os processos em superfcie so aqueles em que a biomassa (massa de clulas) situa-se na superfcie do meio lquido, em contato direto com o ar atmosfrico, que fornece o oxignio necessrio populao celular. O meio de cultivo colocado em recipientes rasos, de modo a oferecer grande rea ao desenvolvimento do agente. A diminuio da concentrao de nutrientes nas camadas superficiais faz com que cheguem superfcie, por difuso, os nutrientes existentes nas camadas mais profundas. Tambm, por difuso, o(s) produto(s) do metabolismo se dispersa(m) no meio em fermentao. Pelo exposto, a difuso e a relao entre a rea oferecida e o volume de meio desempenham papel importante no estudo de bioprocessos operados em superfcie. Este tipo de Bioprocesso limita-se, via de regra, aos fungos filamentosos, que tendem formar pelcula micelial na superfcie do meio. No entanto, registra-se a produo clssica de vinagre pelo processo Orleanense, que realizada por determinadas espcies de bactrias aerbicas do
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gnero Acetobacter. Pelo fato de as taxas de transferncia de massa de nutrientes serem reduzidas, os tempos de fermentao so consideravelmente longos. Adicionalmente, os processos em superfcie so de difcil operacionalidade e considerados anti-econmicos, pois resultam em alto custo de produo devido custosa manipulao com esterilizao (incluindo ambiente), enchimento, esvaziamento e limpeza das vrias bandejas necessrias produo em larga escala. Os processos submersos so aqueles em que a clula produtora se desenvolve no seio do meio de cultivo, geralmente agitado e, no caso de fermentaes aerbicas, o oxignio necessrio populao em desenvolvimento suprido, atravs de um compressor, por borbulhamento de ar no lquido. Comparados com os processos em superfcie, os processos submersos oferecem uma srie de vantagens, como por exemplo: podem-se manipular, com maior facilidade, maiores volumes de meio, facilitando a sua operacionalidade; a massa de clulas responsveis pela transformao fica totalmente submersa no meio nutriente uniforme, que pode ser ajustado para fornecer as condies ideais de crescimento e produo. Absoro de nutrientes e excreo de metablitos so realizadas com maior eficincia, levando a menores tempos de processo e, consequentemente, ganhando-se em produtividade. Atualmente, a maioria das fermentaes industriais importantes realizada por processo submerso. Pode-se citar que uma determinante na reduo no preo de muitos produtos, anteriormente obtidos por processos em superfcie, foi a possibilidade de adaptlos aos processos submersos. O exemplo clssico , novamente, a produo de penicilina que teve seu processo de produo modificado nos idos de 40. O desenvolvimento da tecnologia de fermentao submersa para a produo de antibiticos foi logo adotado pela indstria de enzimas e, hoje, a maioria delas produzida por este processo. A fermentao no estado slido definida como um processo no qual o crescimento microbiano e a formao de produto ocorrem na superfcie de substratos slidos e na ausncia de gua livre, diferentemente da fermentao submersa e em superfcie, em que, via de regra, o(s) substrato(s) e outros nutrientes encontram-se na sua forma solvel. Substratos tradicionalmente utilizados constituem-se em produtos agrcolas como o arroz, o trigo, o paino, a cevada, o milho e a soja, alm de substratos no convencionais como os resduos agro-industriais e florestais, destacando-se: o bagao de cana-de-acar, o sabugo de milho, o farelo de trigo e a palha de arroz. Estes resduos tm despertado grande interesse da comunidade cientfica e industrial, pela possibilidade de seu uso como matrias-primas para bioconverses, o que corroborado pelo nmero crescente de publicaes neste tema. O grande interesse decorre do fato dessas matrias-primas no possurem custos de produo associados diretamente, sendo uma forma de se agregar valor a resduos que se formam em abundncia nos setores agrcolas e agro-industriais. Adicionalmente, d-se soluo para o acmulo dessas biomassas residuais, que representam um srio problema ambiental para as indstrias. Em resumo, a operao da fermentao no estado slido pode ser realizada sem agitao mecnica, com agitao ocasional ou contnua, ou em colunas recheadas com circulao de lquido (Raghavarao et al., 2003). A fermentao em estado slido apresenta as seguintes vantagens: Simplicidade dos meios de cultivo. O substrato slido pode requerer somente
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adio de gua, embora outros nutrientes possam ser adicionados; Ausncia de requerimentos de mquinas e equipamentos sofisticados; Os biorreatores podem ter dimenses menores pelo fato do substrato devido ao baixo contedo em gua do sistema; Demanda reduzida de energia; Baixo grau de umidade, reduzindo os problemas de contaminao; As condies de crescimento do microrganismo agente do bioprocesso so similares s encontradas em seu ambiente natural; Os produtos, principalmente enzimas, so obtidos em maiores concentraes do que em fermentaes submersas; Ausncia de formao de espuma; Material fermentado pode ser extrado imediatamente pela adio direta de solventes, ou por filtrao.

Porm, existem alguns fatores limitantes nas fermentaes no estado slido, tais como: menor disponibilidade e acessibilidade ao(s) substrato(s); s podem ser operadas em batelada; problemas de transferncia de massa (oxignio e nutrientes), calor e momento; dificuldades no aumento de escala e, principalmente, no monitoramento e no controle das variveis fsico-qumicas, tais como: pH, temperatura, oxignio e grau de mistura.

9.3. Quanto ao suprimento de oxignio

O fornecimento de oxignio est intrinsecamente ligado ao metabolimo da clula ou ainda ao direcionamento que se impe a este, de modo a se obter o produto desejado. Sendo assim, os Bioprocessos podem ser desenvolvidos com e sem aerao. Os processos aerados so aqueles que se passam com absoro de oxignio livre, podendo ser realizados com aerao natural ou forada. Na primeira modalidade o oxignio necessrio ao cultivo provm do ar ambiente. Grande parte dos processos em superfcie e em fermentao no estado slido, descritos anteriormente, so aerados de forma natural. Nas clulas de metabolismo aerbio, o oxignio especialmente utilizado como aceptor final de eltrons, participando, ao trmino da cadeia respiratria, na reoxidao de co-enzimas, resultando na produo de ATP, que a principal fonte de energia nas clulas. Por outro lado, como ser visto mais adiante, o oxignio pouco solvel em gua, sendo o valor da sua concentrao de saturao da ordem de alguns miligramas por litro. Em virtude disto, torna-se impossvel fornecer de uma s vez todo o oxignio necessrio a uma cultura em desenvolvimento, devendo o mesmo ser continuamente suprido ao biorrreator, independentemente da forma de operao do Bioprocesso. Em Bioprocessos com aerao forada, o ar atmosfrico esterilizado normalmente borbulhado no seio do meio, onde se dissolve parte do oxignio que utilizado pelo agente da transformao. A Figura 21 ilustra o percurso do oxignio da fase gasosa at o interior da clula, na qual se podem observar as diferentes resistncias opostas a sua transferncia at a absoro pela clula. O grande campo de aplicao da aerao forada situa-se nos processos submersos, que por permitir uma mais rpida solubilizao do oxignio no meio, torna-o mais facilmente utilizvel. Algumas vezes emprega-se oxignio puro ou misturado ao ar, o que resulta em melhorias na transferncia de massa da fase gasosa para a lquida, com a conseqente melhoria no desempenho do Bioprocesso.
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Figura 21: Transferncia de oxignio da fase gasosa at a biopartcula cataltica. O fornecimento de oxignio a uma cultura em desenvolvimento, muitas vezes se constitui no gargalo da tecnologia de produo. comum, que determinadas fermentaes aeradas, estejam limitadas em suas possibilidades de melhorar rendimento e produtividade, no por razes inerentes capacidade das clulas, mas sim por problemas no projeto e operao de biorreatores, em relao necessidade de satisfazer, principalmente, as altas demandas de transferncia de massa, mas tambm de momento e de calor. Para se determinar a taxa tima de transferncia de massa ou taxa de absoro de oxignio da fase gasosa para a lquida, deve-se atentar para dois aspectos: o suprimento e a demanda de oxignio. Evidentemente, que em um meio em fermentao, a taxa com que o oxignio se dissolve dada pela diferena entre o que se fornece e o que efetivamente utilizado pelas clulas. O suprimento est relacionado s variveis de ordem fsica, tais como: vazo de ar, velocidade de agitao, grau de mistura, temperatura, geometria do biorreator etc, sendo estudado pelas teorias clssicas de transferncia de massa gs-lquido. J a demanda est ligada fisiologia da clula e diz respeito quantidade de oxignio dissolvido necessria ao cultivo sendo, portanto, proporcional massa de clulas. Define-se, assim, como demanda a quantidade de oxignio necessria por unidade de tempo e por unidade de volume de meio de cultivo ou em fermentao. Matematicamente, o balano de oxignio para um biorreator em operao pode ser expresso pela seguinte equao (Bailey & Ollis, 1986):

dCL = K L a (CS CL ) qO2 X dt

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onde:
dCL/dt: KL: a: CS : CL: qO2: X: taxa de transferncia de O2 ou taxa de absoro de O2, moles de O2 /m3.h coeficiente global de transferncia de massa de O2 na fase lquida, m/h rea especfica da superfcie de interface, m-1 concentrao de saturao de O2 dissolvido, moles/m3 concentrao de O2 dissolvido no seio do meio em fermentao, moles/m3 demanda especfica de oxignio, moles de O2/g clulas.h concentrao de clulas no meio em fermentao, g/m3

Se a demanda supera as possibilidades de suprimento, o crescimento se realiza com limitao de oxignio, no entanto, muitas vezes a produo de determinada substncia de interesse comercial se d em condies de restrio de oxignio. Na prtica, o ideal e o econmico seria igualar o suprimento demanda, mas isto se torna difcil e no recomendvel devido baixa solubilidade do oxignio em meios lquidos. As temperaturas para a produo de biomolculas por fermentao esto na faixa de 30oC e nesta, a solubilidade do oxignio em gua pura cerca de, apenas, 7 mg/L, diminuindo notoriamente com o aumento da temperatura. Em um meio de cultivo lquido a solubilidade do oxignio torna-se ainda menor devido presena de solutos (clulas e sais). Por conseguinte, o potencial de transferncia encontra-se limitado pelo baixo valor de Cs. Adicionalmente, a alta resistncia dissoluo do oxignio, nestas condies, resulta em um baixo valor para a capacidade de oxigenao do biorreator (KLa). O sistema de fornecimento de ar dever incluir necessariamente tubulaes, vlvulas, medidores e reguladores de presso, rotmetros, pr-filtros e filtros de ar para a remoo de todas as partculas maiores que 0,22 m. Pesquisas na rea de desenvolvimento de Bioprocessos anaerbicos tm sido tambm intensificadas nos ltimos 20 anos. Os microrganismos agentes desses processos, alm de sua importncia clnica, apresentam considervel importncia ecolgica, como tambm grande interesse industrial. O cultivo desses agentes biolgicos, anaerbios estritos, requer tcnicas que efetivamente removam o oxignio (ar) do meio lquido e da fase gasosa em contato com fase lquida. Os biorreatores industriais utilizados nesses cultivos devem possuir alta relao altura:dimetro, e o borbulhamento de gases inertes, como nitrognio, muitas vezes requerido para assegurar condies plenas de anaerobiose. Os dois clssicos exemplos de processos anaerbicos so: a fermentao acetonabutanlica e a metanognica. Analogamente produo de metano, a fermentao acetona-butanlica realizada em duas fases: a acetognica, na qual h a produo de cidos orgnicos e hidrognio e a solventognica, processo que converte cidos orgnicos a solventes (acetona, butanol e etanol). Nestas fermentaes a agitao fsica difcil ou onerosa e o transporte de nutrientes essenciais pode estar limitado pela difuso, o que ocasiona reduo nas taxas de metabolizao. A taxa de reao em biorreatores diretamente proporcional concentrao de biomassa. Em bioprocessos anaerbicos, o rendimento em biomassa baixo e a quantidade de clulas que pode ser produzida a partir do(s) substrato(s) limitada. A economicidade desses processos e as taxas de biorreao podem ser aumentadas pela reteno da biomassa no sistema reacional, empregando tcnicas de imobilizao (passiva ou ativa) ou mesmo pela adoo de
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configuraes de biorreatores que permitam a reteno da biomassa, como os biorreatores a membrana, ou com dispositivos internos de reteno de biomassa (biorreator UASB - Upward-Flow Anaerobic Sludge Blanket Reactor).

10. Processos de Separao e Purificao do Produto

Outra parte integrante de um bioprocesso e que tambm define o seu xito a seo de recuperao de produto (downstream processing). Nesta fase, informaes de aspectos citolgicos e fisiolgicos do microrganismo sero de grande valia. A fisiologia microbiana indicar no apenas a gerao como tambm a localizao do produto. Se o mesmo for secretado, as etapas de recuperao seguem um roteiro diferente da recuperao do produto intracelular, como esquematizado na Figura 3. No segundo caso ser necessrio romper estruturas celulares cuja composio ser importante na escolha das tcnicas adequadas para a liberao do produto. O projeto dos equipamentos que iro compor esta seo ser funo da localizao do produto (intracelular ou extracelular), do seu tamanho molecular, concentrao, solubilidade, polaridade, volatilidade e de outras propriedades fsico-qumicas do meio de fermentao, como viscosidade, densidade, impurezas e partculas indesejveis. A opo pela(s) operao(es) de separao ser influenciada pelo tamanho do prprio bioprocesso e do valor do produto. Os arranjos devero ser em srie a fim de se atingir o grau de pureza requerida (ex. extratos enzimticos brutos ou enzima purificada) e a forma final exigida para um dado produto (produto cristalizado, liofilizado, lquido concentrado, prensado). A seqncia de operaes, atravs da qual o meio contendo a biomolcula a ser separada deve passar para a obteno de um produto de alta pureza, constitui-se basicamente de quatro etapas (Abraho Neto, 2001). 1. 2. Remoo de material insolvel (particulado). Operaes comuns: filtrao, centrifugao, decantao ou sedimentao. Isolamento primrio. Durante esta etapa a concentrao de produto aumenta consideravelmente e substncias com diferentes polaridades so separadas do produto. Operaes tpicas: extrao por solvente, precipitao e ultrafiltrao. Purificao. Destina-se remoo de impurezas como tambm concentrao de produto. Exemplos so: a precipitao fracionada e muitos tipos de cromatografia lquida de alto desempenho. Isolamento final do produto: Esta ltima etapa deve fornecer o produto desejado em uma forma adequada para formulao final ou comercializao direta. As operaes aqui incluem: centrifugao e subseqente secagem de um produto cristalizado (liofilizado ou seco por spray drying).

3.

4.

11. Extrapolao de Escala

A extrapolao de escala um problema comum a vrios ramos da Engenharia Qumica. No caso de Bioprocessos conduzidos com clulas (microbianas ou no), entretanto, o assunto tem tratamento especial. Alm de se utilizar de conceitos estabelecidos no tratamento de outros processos da indstria qumica, deve-se levar em considerao, a caracterstica especial de um
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bioprocesso para a produo de substncias de interesse comercial: a presena de um ser vivo. A extrapolao de escala envolve dois aspectos: a ampliao de escala (scale up) e a reduo de escala (scale down) (Figura 22). Na ampliao de escala, utiliza-se dados obtidos na otimizao do processo em escala piloto ou de laboratrio para estabelecimento das variveis de operao na escala industrial. A reduo de escala diz respeito reproduo em equipamento piloto das condies ambientais que possam ser obtidas na planta industrial, a fim de permitir a obteno de resultados aplicveis melhoria do processo j instalado na fase maior.

Scale up

ESCALA LABORATORIAL

ESCALA LABORATORIAL

ESCALA INDUSTRIAL

Scale down
Figura 22: Ampliao e reduo de escala em Bioprocessos. A extrapolao de escala se constituiu em um dos grandes desafios da Engenharia Bioqumica. Muitas vezes ao se ampliar a escala de produo, obtmse resultados diferentes e insatisfatrios queles obtidos em escalas reduzidas (laboratorial e piloto). Isto se deve seguramente ao fato das condies ambientais no terem sido mantidas constantes, afetando, consequentemente, o comportamento das clulas do agente biolgico em questo. A escala industrial depende do tipo de substncia que se esteja produzindo. Obviamente que o tamanho da escala ser uma funo de fatores econmicos ligados, principalmente, demanda do produto pelo mercado consumidor, bem como o seu valor agregado. Via de regra, quanto menor o valor agregado do produto, maior a escala de produo, a fim de se garantir o xito econmico (rentabilidade) da empresa em relao ao capital nela investido. Em escala de produo industrial, podemos encontrar biorreatores de algumas centenas at alguns milhes de litros (Tabela 9). No entanto, em todos os casos, os Bioprocessos desenvolvidos em escala laboratorial ou de bancada, requerero, em maior ou menor grau, uma etapa de escalonamento. Na ampliao de escala, utiliza-se dados obtidos na otimizao do processo em escala piloto, ou de laboratrio, para estabelecimento das variveis de operao na escala industrial. A regra bsica na ampliao de escala em Bioprocessos procurar manter, nas diferentes escalas, as condies ambientais timas. Estaremos, assim, fornecendo as condies necessrias para se ter a reprodutibilidade da atividade fisiolgica do microrganismo (o agente da transformao qumica do substrato em produto).

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Tabela 9: Escala de produo de Bioprocessos. Bioprocesso lcool; Antibiticos; Amino-cidos e Leveduras Cerveja Tratamento de Efluentes Novas Biomolculas (m.os recombinantes, clulas animais ou vegetais) Tamanho do Biorreator (m3) 50 a 500 2.000 20.000 algumas centenas de litros (mx)

H vrios critrios para ampliao de escala, baseados na similaridade necessria para se conseguir as mesmas respostas obtidas em escalas reduzidas. A aplicao adequada de cada um deles, ou a sua combinao com outro(s) depende de uma srie de fatores, caractersticos para cada Bioprocesso. Os critrios de similaridade usualmente utilizados no trato deste problema so os seguintes: similaridade geomtrica: relao constante entre as dimenses lineares correspondentes nas duas escalas; similaridade cinemtica: manuteno da velocidade do fluido em pontos equivalentes nas duas escalas; similaridade dinmica: manuteno das foras aplicadas nas duas escalas; similaridade trmica: manuteno da temperatura em pontos equivalentes nas duas escalas; similaridade qumica: manuteno da composio qumica do meio em pontos equivalentes nas duas escalas.

A primeira mudana de escala que um bioprocesso experimenta quando se passa da etapa de investigao em frascos agitados a uma que envolve biorreatores pequenos de laboratrio. As condies estabelecidas em frascos agitados so, em geral, de difcil reproduo em escalas maiores. A etapa seguinte no escalonamento de um bioprocesso ocorre quando se trata de reproduzir as condies ambientais entre um biorreator de laboratrio e um de nvel piloto ou industrial. Neste caso, mesmo que se mantenha a similaridade geomtrica entre os biorreatores envolvidos, no possvel manter constantes todas as variveis fsico-qumicas que determinam o micro-ambiente da biomassa presente no biorreator. Ao ampliar-se a escala, h parmetros que modificam necessariamente. Os mais evidentes so a relao rea/volume e a presso hidrosttica. Se considerarmos um biorreator com geometria tipicamente cilndrica, claro que a rea (que determina, por exemplo, a transferncia de calor e o nvel de aerao superficial) aumenta ao quadrado com a escala, enquanto o volume uma funo cbica da escala. Isto faz com que a relao rea/volume se modifique pelo simples fato de se aumentar o tamanho do biorreator, o que implica numa transferncia de oxignio superficial mais importante nos biorreatores de laboratrio, sendo praticamente desprezvel em biorreatores de grande escala (Geraats, 1994).
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Outro aspecto que se altera necessariamente com a escala a presso hidrosttica. Em biorreatores industriais, a presso no fundo do tanque pode assumir vrias atmosferas, enquanto que em biorreatores de laboratrio ou piloto, a diferena de presso entre a superfcie e o fundo do tanque mnima. Isto afeta significativamente a solubilidade do oxignio e mesmo de gases do metabolismo celular, como o CO2. Outra razo para a dificuldade que se impe em relao dificuldade de manuteno das condies ambientais com o aumento de escala, deve-se a problemas ligados homogeneidade do sistema. Os biorreatores pequenos, em geral, podem ser considerados bem misturados, sendo as condies operacionais medidas com sensores, e representativas do que ocorre em todo o equipamento, no sendo o caso de biorreatores industriais, incluindo aqueles de menor tamanho que operam fluidos viscosos e no Newtonianos. Os aspectos de natureza fsica das condies ambientais (transferncia de massa e calor, caractersticas do escoamento, grau de mistura, cisalhamento etc) dependem do tamanho do biorreator, podendo ser grande as variaes quando a geometria da escala ampliada for diferente daquela menor, onde foi otimizado o Bioprocesso. Por outro lado, ao se aplicar a similaridade geomtrica plena, verifica-se que a relao entre a rea superficial (proporcional ao quadrado do dimetro) e o volume (proporcional ao cubo do dimetro) de um biorreator decresce acentuadamente com o aumento da escala. Isto tem implicaes diretas na transferncia de calor para esterilizao do equipamento e meio, bem como para o controle da temperatura de fermentao. Um outro exemplo que impede que a similaridade geomtrica plena seja adotada em biorreatores de mistura completa est ligado velocidade perifrica, definida como vp=DN (onde: D=dimetro do impelidor e N=velocidade de agitao). Ao se ampliar a escala, mantendo-se a velocidade de agitao constante, ter-se-o diferentes valores para este parmetro, refletindo diretamente sobre a reologia do sistema. Adicionalmente, cultivos com microrganismos filamentosos ou suscetveis a foras cisalhantes podero ter sua morfologia alterada, resultando em diferentes respostas metablicas ou perda de sua viabilidade. A recomendao que se identifique a varivel-chave do processo, isto , a mais sensvel ao escalonamento. Os critrios mais usados so parmetros fsicos relacionados com as variveis de operao. Avaliando os critrios mais comumente empregados na extrapolao de escala de fermentadores, Belmar (1984) destaca como mais importantes: o coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (KLa), a potncia por unidade de volume (Pg/V) e a velocidade perifrica (ND). Desta forma, o sistema projetado, mantendo este critrio de ampliao de escala, enquanto que os outros parmetros, menos importantes, variaro.

12. Tratamento Biolgico de Resduos/Efluentes

Com o processo de industrializao e o desenvolvimento de tecnologias e produtos cada vez mais avanados, no s o progresso e o bem-estar foram gerados. Problemas ligados poluio ambiental foram se acentuando e trouxeram como conseqncia a necessidade da conscientizao quanto importncia da restrio de lanamentos indiscriminados de resduos nos solos,
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rios, lagos, oceanos e na atmosfera. Em todos esses ambientes habitam microrganismos. Por causa desta caracterstica de crescimento nos mais variados ambientes, os microrganismos desempenham funo-chave na reciclagem dos elementos na natureza. A tecnologia de tratamento de efluentes difere ligeiramente da tecnologia de obteno de bioprodutos industriais. Para o tratamento de efluentes, prescindese, naturalmente, dos cuidados asspticos ou da manuteno de culturas puras, como ressaltado anteriormente. A natureza nos ensina que uma populao mista que estabelece uma interao positiva entre diferentes grupos ou espcies microbianas capaz de transformar compostos de elevado grau de complexidade. Os compostos intermedirios resultantes so, ento, transformados em outros at que substncias no txicas sejam geradas, numa cadeia de eventos em que todos os microrganismos desempenham um papel metablico de vital importncia para que a descontaminao/destoxificao do ambiente se estabelea. O tratamento de efluentes pode ser dividido basicamente em trs etapas: tratamento primrio, que visa remoo dos contaminantes mais facilmente separveis (partculas com tamanho superior a 100 m). Operaes tpicas: gradeamento; desarenamento e desengorduramento. Retiradas as partculas sedimentveis, partculas suspensas menores e material solvel so removidos no tratamento secundrio. Estes materiais, em sua grande maioria, so orgnicos, sendo comum o tratamento biolgico nestes casos. Devido enorme habilidade em degradar um amplo espectro de substncias orgnicas, bactrias, actinomicetos, leveduras, fungos filamentosos e protozorios tm sido cada vez mais empregados como agentes de transformao dos mais diferentes compostos, apresentando-se como alternativas poderosas aos mtodos convencionais baseados na simples disposio e na energia trmica. A extenso desta degradao varia entre o que se denomina de biotransformao e mineralizao. A primeira se constitui na degradao parcial de um composto e na formao de uma ou mais substncias, que podem ou no ser menos txicas que o composto de origem. J a mineralizao a transformao total de uma substncia orgnica em outras inorgnicas, tais como dixido de carbono e gua. A degradao da matria orgnica, contida em efluentes industriais, realizada biologicamente por uma grande variedade de microrganismos, que agem muitas vezes de forma sinrgica. Esses microrganismos so usados para converter matria orgnica coloidal e carboncea dissolvida em biomassa. Atualmente, diferentes compostos txicos tm sido degradados por ao microbiana, dentre eles hidrocarbonetos derivados de petrleo, herbicidas e pesticidas contendo organoclorados, organofosfatados, polmeros etc (Davis & Cornwell, 1991). Pelo fato de a biomassa possuir densidade ligeiramente superior a da gua, sua sedimentao possvel, permitindo a sua separao do material lquido tratado. Esta importante caracterstica utilizada como base de uma srie de concepes de processo para o tratamento biolgico de resduos e efluentes sanitrios ou industriais. importante notar que a biomassa residual tambm matria orgnica, devendo-se buscar alternativas/solues para sua destinao (reciclo no prprio biotratamento, digesto anaerbica, incinerao, disposio em aterros sanitrios etc).
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Dentre os processos biolgicos tradicionais destacam-se: os Lodos ativados (processo contnuo e aerado, com reciclo da microbiota floculante); a Digesto anaerbica, que alm de reduzir a carga orgnica produz metano; a Nitrificao, processo que possibilita a oxidao de amnia a nitrito e, posteriormente, a nitrato, produzindo um efluente final com baixa demanda bioqumica de oxignio. Outros tipos de processo incluem: lagoas aeradas, biodiscos, filtros percoladores, reatores seqenciais descontnuos. Ressalta-se que muitas vezes faz-se necessria a combinao de processos biolgicos para efetiva degradao do material orgnico e inorgnico. A figura, a seguir, ilustra uma concepo tpica de um processo de tratamento biolgico de efluentes.

Figura 15: Representao esquemtica de um processo de tratamento de efluentes. Fonte: Davis & Cornwell (1991). O sistema de tratamento biolgico por meio de lodos ativados muito eficiente e largamente utilizado no tratamento de resduos e efluentes domsticos e industriais. Para que o sistema funcione deve haver transformao bioqumica da matria orgnica solvel e insolvel (coloidal), assim como da matria inorgnica (N e P), sendo o ambiente bioqumico determinante na diversidade da comunidade microbiana para a efetiva degradao do resduo/efluente a ser tratado. Quanto configurao do biorreator, a biomassa pode estar em suspenso ou aderida em suportes. Em relao ao oxignio, os processos aerbios suportam uma cadeia alimentar completa, desde bactrias at rotferos; os anxicos so mais limitados em variedades de organismos e os anaerbios so predominantemente bacterianos. O tratamento tercirio direcionado a remoo de todos ou alguns contaminantes remanescentes. Esta etapa muitas vezes necessria para enquadrar o efluente final s condies de qualidade exigidas para o lanamento e disposio final no ambiente, seja qual for o corpo receptor. Os processos usados nesta etapa incluem tipicamente a filtrao, ultra-filtrao e adsoro.
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Processos mais sofisticados empregam ainda a eletrodilise e a osmose reversa. Aps o tratamento biolgico, a filtrao uma operao muitas vezes compulsria, para o posterior descarte do efluente tratado e clarificado. Trata-se de um mtodo mecnico de separao, que visa remoo de slidos suspensos ou de flocos resultantes das operaes de floculao/coagulao. Um dos princpios mais importantes da filtrao que os slidos recolhidos acabam por se constituir auxiliares da filtrao, na medida em que se depositam na superfcie filtrante. A remoo do material particulado depende muito do tamanho das partculas em questo, sendo, para as partculas de maiores dimenses, de fcil aplicao. No entanto, para partculas de dimenses relativamente reduzidas, a operao de filtrao pode tornar-se extremamente dispendiosa. A filtrao tambm comum na desidratao de lamas resultantes dos diferentes tratamentos. Para a separao de contaminantes remanescentes de menores dimenses e dissolvidos na frao aquosa, a tcnica de ultra-filtrao vem cada vez mais sendo aplicada no setor industrial, principalmente por possibilitar o reuso da gua. Trata-se de um mtodo que permite a separao de dois ou mais lquidos diferentes por meio da classificao dos tamanhos de molculas existentes em uma mistura. O equipamento de ultra-filtrao consiste em uma (ou vrias) membranas adequadas ao que se deseja separar, onde o fluxo lquido impulsionado por intermdio de uma bomba. O volume filtrado direcionado para o recipiente de coleta e o fluxo reprocessado vrias vezes at que se elimine(m) todo(s) o(s) composto(s) indesejado(s). Na prtica, uma bomba recircula continuamente o efluente contido em um tanque de armazenamento fazendo com que este passe pela superfcie da membrana e retorne para o tanque. Cada passagem pela membrana resulta em um efluente mais concentrado, com molculas maiores, enquanto a gua e outras molculas menores so extradas do efluente. Desta forma, a gua (corrente aquosa com mnima concentrao de contaminantes) pode ser efetivamente separada. Neste processo chamamos a gua que conseguimos extrair do sistema de volume permeado e o restante de volume concentrado. Esta gua recuperada pode ser simplesmente descartada ou reutilizada em outras reas da indstria. Outra tcnica aplicada ao tratamento tercirio a adsoro, que geralmente usada na remoo de compostos orgnicos refratrios (recalcitrantes) presentes em muitos efluentes industriais e cuja remoo se torna difcil ou impossvel por processos de tratamentos biolgicos convencionais. tambm comum utilizar-se a adsoro para tratamento de efluentes com metais pesados, sendo um processo bastante eficiente na sua remoo. O adsorvente mais comum em processos de tratamento de efluentes o carvo ativado, que pode ter origem em diversos materiais. Destes, os mais comuns so o carvo betuminoso e linhito. O carvo ativado pode tambm ser produzido pela transformao, por torrefao, de materiais orgnicos em carvo granular. Os diferentes tipos de carvo ativado tm propriedades especficas dependendo do material de origem e do processo de ativao. A capacidade de adsoro traduz a eficincia do carvo na remoo de determinados contaminantes, como por exemplo, metais, cor, fenis, etc das guas residuais. Dependendo das caractersticas do efluente um tipo de carvo pode ter um desempenho superior ao outro, desde que a sua capacidade seja maior nas concentraes de equilbrio do efluente.
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Qualquer que seja a soluo adotada para o lanamento dos efluentes oriundos do processo produtivo ou na limpeza das instalaes, fundamental que a indstria disponha de sistema para o tratamento ou o condicionamento desses materiais residuais.

13. Consideraes gerais

Para que Bioprocessos possam despertar o interesse tecnolgico e comercial, seja na criao de um processo novo ou na otimizao de um j existente, essencial entender os fatores tecnolgicos que afetam significativamente a sua competitividade. Tais processos tm seu desempenho avaliado atravs dos seguintes parmetros, que ditaro sua viabilidade. Coeficientes de converso em relao ao substrato consumido e matriaprima; Taxas cinticas de consumo de substrato e de formao de produto; Estabilidade do biocatalisador ou da cultura; Produtividade; Concentrao de produto do meio reacional.

De uma maneia geral, o programa de desenvolvimento de um Bioprocesso envolve as seguintes etapas: seleo e melhoramento de linhagens produtoras, otimizao de meio de cultura em frascos agitados, experimentos em biorreatores de laboratrio, avaliao em escala piloto e, posteriormente, estudos de ampliao de escala. Bioprocessos devem ser periodicamente reavaliados e incorporados de inovaes tecnolgicas, a fim de se aumentar seu desempenho e lucratividade. A absoro de inovaes tecnolgicas, somente conseguidas atravs de Pesquisa & Desenvolvimento & Inovao, produz grande impacto no desenvolvimento e otimizao de Bioprocessos. Assim, por exemplo, podemos lanar mo de tcnicas da Biologia Molecular para dotar um microrganismo de uma determinada propriedade de interesse, ou mesmo potencializ-la, quando o agente microbiano a exibe com baixa expresso. Muito conhecimento novo gerado, tambm, na rea de Engenharia Metablica, atravs da manipulao do metabolismo, decorrente de fenmenos de induo, represso e at inativao de determinadas enzimas, levando formao preferencial de um dado produto, por exemplo. As tcnicas de imobilizao celular, que possibilitam a supresso de equipamentos onerosos para separao de clulas; os biorreatores no convencionais, menos intensivos em energia e mais eficientes e produtivos; o desenvolvimento de biossensores, integrados ao controle de bioprocessos; o aproveitamento de resduos como matria-prima para bioconverses; bem como o reciclo de efluentes no prprio processo, minimizando a sua gerao, so outros exemplos de inovaes e estratgias tecnolgicas para se garantir o bom xito de Bioprocessos. Os rpidos avanos em tecnologia de DNA recombinante e fuso celular continuam a abrir novas frentes para a produo de biomolculas, de protenas heterlogas em diferentes sistemas de expresso, que incluem bactrias, leveduras, fungos filamentosos, clulas animais e vegetais. Estas tecnologias tm sido aplicadas com sucesso na produo de protenas de alto valor agregado para diagnoses, vacinas e substncias teraputicas, que vem atingindo vendas em
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bilhes de dlares, com previso de crescimento exponencial, e o Brasil apresenta todos os requisitos para se lanar, plenamente, no desenvolvimento da Biotecnologia, basta existir vontade poltica e mudana de cultura do setor industrial brasileiro.

14. Referncias Bibliogrficas Recomendadas

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Agradecimentos as seguintes instituies e empresas pelo apoio financeiro:

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Os Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos (LADEBIO) da Escola de Qumica da Universidade Federal do Rio de Janeiro

Os temas de pesquisa desenvolvidos no LADEBIO advogam uma mudana de paradigma das atividades econmicas, em particular dos processos de produo industrial, integrando os princpios e estratgias de qualidade total com os requisitos de qualidade ambiental. As linhas de pesquisa coordenadas pelo Professor Nei, ao longo de 30 anos de experincia, so caractersticas da sua rea de especializao e esto ligadas ao Desenvolvimento de Bioprocessos, envolvendo, em sua grande maioria, trabalhos de natureza tericoexperimental, com aplicao prtica. So temas de estudo: o desenvolvimento de processos visando produo de biocombustveis, enzimas, poliis, antibiticos, bioinseticidas, biossurfactantes, cidos orgnicos, aromas e fragrncias, bem como o desenvolvimento de processos biolgicos para o tratamento de resduos e efluentes industriais. Como ferramentas para o desenvolvimento de bioprocessos nos projetos do LADEBIO, as seguintes estratgias so comumente adotadas: seleo e melhoramento de linhagens (naturalmente ocorrentes ou recombinantes), construo de biocatalisadores timos; otimizao de meios; modos de operao e cintica de bioprocessos; imobilizao de clulas e enzimas; caracterizao e aplicao de bioprodutos, como tambm a avaliao do desempenho de biorreatores. Devido caracterstica tecnolgica das pesquisas do LADEBIO, em todos os trabalhos estabelecem-se compromissos com o desenvolvimento de bioprocessos que possam ser transformados em realidade industrial. Alm disso, estudos envolvendo a gesto tecnolgica so realizados a fim de se ter uma viso mais ampla e identificar tendncias e desafios dos diferentes segmentos ligados Biotecnologia, como por exemplo: estudos de Prospeco Tecnolgica para a produo de combustveis e outras substncias qumicas com base nas matrias-primas renovveis (Biorrefinaria), Transgenia, Biodiversidade, Meio Ambiente e Patente. Devido natureza muldisciplinar da rea Biotecnolgica, um grande nmero de trabalhos desenvolvido em parceria com outros grupos de pesquisa da prpria UFRJ e de outras instituies de ensino e pesquisa externas, e tambm com empresas. O conjunto de nossas atividades tem gerado resultados que hoje alimentam consrcios de pesquisa entre nossos laboratrios e Universidades e Centros de pesquisa nacionais e internacionais, tendo sido os Laboratrios de Bioprocessos da EQ/UFRJ credenciados pelo Programa Ibero-Americano de Cincia e Tecnologia para o Desenvolvimento (IBEROEKACYTED/Espanha). Tem propiciado, tambm, interaes entre a Universidade e a Indstria, como o caso de projetos que vem desenvolvidos em parcerias com a PETROBRAS, ARACRUZ CELULOSE, BIONASA e OXITENO. Estas parcerias tm se constitudo em um excelente exerccio, no s para a busca de solues para as empresas, mas tambm para a gerao de conhecimento e formao de recursos humanos altamente capacitados para o desenvolvimento tecnolgico em nosso pas. Contato: Prof. Nei Pereira Jr. Escola de Qumica CT/UFRJ Departamento de Engenharia Bioqumica LADEBIO sala E 121 Cidade Universitria - Ilha do Fundo - Rio de Janeiro RJ Cep: 21949-900 Tels: 0XX.21.2562 7644/7645/7646 Fax: 0XX.21.2562 7616 e-mail: nei@eq.ufrj.br 60

LINHAS DE PESQUISA

Biotecnologia de Materiais Lignocelulsicos Processos com Microrganismos Recombinantes

Biotecnologia Ambiental

Gesto Biotecnolgica

Desenvolvimento de Bioprocessos

Biotransformao

Tecnologia da Produo de Antibiticos

Agregao de Clulas: Fenomenologia e Aplicao Novas Bebidas Fermentadas e Alimentos Funcionais de Frutos da Biodiversidade Amaznica

INFRA-ESTRUTURA LABORATORIAL
LADEBIO Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos

SINFOBIO Sistema de Informao de Biomassas

Central Analtica Center LAPROENZ Laboratrio de Produo Enzimtica

LABENGBIO Laboratrio de Engenharia Bioqumica

LABSBIM Laboratrio de Sistemas Biolgicos Imobilizados

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