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Concepción
Facultad De Medicina
Departamento de Bioquímica.
Objetivos
• Reactivos:
Muestra proteica problema numero 5
Solución estándar de albúmina 10 mg/ml
Reactivo de Biuret (solución de sulfato de cobre 1% en NaOH 14%)
• Vaso de precipitado de 100 ml
• Pipeta parcial de vidrio de 2 ml
• Propipet
• a para 10 ml y para 2 ml
• Tubos Kahan
• Gradilla para tubos Kahan
• Plumón
• Vórtex
• Reloj
• Cubetas para espectrofotómetro
• Gradilla para cubetas
• Micropipeta de 100-1000 ml
• Agua destilada
• Espectrofótometro Metertek SP-830
Método
V1 * C1 = V2 * C2
• **El paso más importante en esta etapa es el agregado del reactivo de Biuret que solo
se agrega cuando todos los tubos estén con su disolución lista ya que a partir de que
se coloca comienza la reacción, y deben comenzar todas las soluciones al mismo
tiempo.
• Mezclamos y agitamos los tubos durante 10 a 30 segundos en el Vórtex
• Dejamos incubar los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos
• Comienza la etapa de la utilización del espectrofotómetro. Para ello tuvimos que elegir
10 cubetas para espectrofotómetro que estuvieran en buen estado, esto es dentro del
rango de error permitido de +/- 0,015 absorbancia. Esto corresponde a otra parte
crucial dentro del procedimiento, debido a que si usamos una cubeta defectuosa,
el espectrofotómetro no nos dará el resultado realmente esperado
• Después de esto con nuestra muestra blanco lo calibramos a cero para comenzar con
nuestro último paso práctico que corresponde a la lectura de la absorbancia.
• Llenamos las 10 cubetas elegidas con las respectivas soluciones de los tubos kahan
hasta ¾ de su capacidad total, cuidando de limpiarlas después de haber vaciado el
contenido
Resultados
Se prepararon seis disoluciones de 500µl, cada una con distinta concentración de BSA, a partir
de una solución madre 10mg/ml. Para esto se utilizó la igualdad:
Donde
C = Concentración de la solución (mg/ml)
V = Volumen de la solución (µl)
Simplificando llegamos a:
X = 0,5mg/ml . 500µl : 10mg/ml X = 25µl
Tabla nº 1
Volumen Volumen Concentración de
Solución utilizado de utilizado de la solución
BSA agua (mg/ml)
10mg/ml (µl) destilada (µl)
Blanco reactivo 0 500 0,0
Solución problema 2 25 475 .?
Tubo nº1 25 475 0,5
Tubo nº2 50 450 1,0
Tubo nº3 125 375 2,5
Tubo nº4 250 250 5,0
Tubo nº5 375 125 7,5
Tubo nº6 500 0 10,0
Tabla nº 2
Solución Concentración Absorbancia
de la solución
(mg/ml)
Blanco reactivo 0 0
Tubo nº1 0,5 0,016
Tubo nº2 1 0,04
Tubo nº3 2,5 0,086
Tubo nº4 5 0,164
Tubo nº5 7,5 0,253
Tubo nº6 10 0,341
2
El volumen de BSA utilizado para preparar esta solución problema no proviene de la solución madre
10mg/ml, sino de la muestra problema nº 5, de concentración desconocida.
Gráfico I (realizado en Excel)
0,35 y = 0,0339x
2
R = 0,9993
0,3
0,25
Absorbancia
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración (mg/ml)
Luego:
0,188 = 0,0339 . x x1 = 5,546mg/ml
Cálculo de la pendiente
Sean A y B dos puntos de la recta, con las coordenadas A (1,5 , 0,05) y B (7 , 0,2375)
m= pendiente de la recta.
Luego:
0,188 = 0,0341x x2 = 5,513mg/ml
Este es un método muy confiable, siempre y cuando se tengan las precauciones del caso,
como seria la limpieza en el trabajo, el orden y la precisión
El practico realizado nos sirvió para valorar este método bioquímico, ya que es muy usado y útil
como examen en el diagnostico en sospecha de alguna patología de este tipo.
Además nos permitió darnos cuenta de la precisión y la dedicación que se debe tener al
realizar este tipo de procedimientos, ya que cualquier error en el método nos entregaría un
resultado equivoco, cosa que no es para nada conveniente al momento de realizar un
diagnostico medico.
Es por eso que tuvimos el máximo de cuidado en esos puntos críticos. El primer problema que
se nos presento fue calcular correctamente las diluciones necesarias procurando usar
correctamente las unidades de medida, otro punto importante fue realizar una homogenización
correcta de los tubos, con el fin de evitar errores posteriores y realizar una lectura uniforme en
el espectrofotómetro y finalmente para realizar la medición espectrofotométrica tuvimos que
calibrar el aparato a 0 absorbancia para lo cual usamos la muestra blanco, además de esto,
debimos elegir cubetas que estuvieran en buen estado, es decir, que estuvieran dentro del
rango de absorbancia permitida de 0.015, ya que si hubiéramos usado cubetas defectuosas se
alteraría la lectura real de nuestra muestra
Finalmente es importante considerar que, si bien se prepara una curva de calibración con
límites de linealidad determinados, en más de algún caso la muestra a analizar puede tener
concentraciones que se encuentren por sobre ese límite de dilución. En caso que ocurriera
esto, lo más conveniente es separar la muestra en varios recipientes y diluir cada uno de ellos
en diferentes medidas, para así tener una que se pueda ubicar dentro del límite de linealidad y
que por ende sea cuantificable. Se debe tener el cuidado, posterior a la cuantificación, de
multiplicar la concentración por el número de veces que se diluyo la muestra a analizar para así
obtener el resultado que requeríamos
DISCUSION
- Skoog, West, Holler, Química analítica, Séptima edición, Editorial McGraw-Hill, 2001,
México. Páginas 578-581.
- http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/