Universidad Católica de la Santísima Concepción

Facultad de Medicina
Medicina

Práctico N° 6
Glucogenolisis en cortes
de Hígado

Integrantes: Scarlet Rissi

Helga Silva
Jhonattan Soto

Ramo: Bioquímica

Carrera: Medicina (II)

Profesores: BQ. Javier Grandón

BQ. Mirna Muñoz
BQ. Reginald Del Pozo
 Concepción, 21 de Junio de 2007

Introducción
El requerimiento energético de nuestro organismo tiene como centro
coordinador el Hígado, es por esto que en este práctico trabajaremos con cortes de
este órgano para observar experimentalmente la realización de procesos tales
como glucogenolisis y glucogenogénesis.
Necesario para este laboratorio es obtener un hígado, que es este caso es
de rata, bien alimentado y sin condiciones de stress, con el fin de mantener niveles
adecuados de glucógeno, para luego ser cuantificados.
El hígado desempeña múltiples funciones, entre ellas el metabolismo de
carbohidratos, en este práctico comprobamos la realización de dos procesos:
Glucogenólisis que es la formación de glucosa a partir del glucógeno y
Glucogénesis que es la síntesis de glucógeno a partir de glucosa.
Ambos procesos se realizan en el hígado, con el fin de mantener una
concentración estable de glucosa en la sangre, teniendo en el hígado reserva a
modo de glucógeno.
Todos los procesos en el hígado deben ser catalizados por enzimas, y su
velocidad se modificara según diversas circunstancias: concentración de glucosa
en la sangre y la actividad de diversas glándulas endocrinas, que liberan hormonas
que regulan la glicemia.
En el práctico tratamos de simular experimentalmente diversos mecanismos
metabólicos, con el fin de lograr los siguientes objetivos:
- Comprobar experimentalmente el proceso de glucógenolisis
- Comprobar experimentalmente el proceso de glucogénesis
- Demostrar la función metabólica del hígado.
- Analizar la relación entre la glucosa liberada y el tiempo de incubación.
- Analizar la relación entre el glucógeno degradado y el tiempo de
incubación.
 Materiales
• Hígado de rata bien • Embudo
alimentada • Papel filtro
• Puntas para micropipetas • Solución de Krebs.
• Tubos plásticos • Reactivo (tampón fosfato pH
• Gradillas para tubos plásticos 7.3 100mmol/l, fenol 16 mmol/l,
• Cubetas 4 aminoantipirina 0.25 mmol/l,
• Micropipeta (200-1000 ul) glucosa oxidasa > 20.000 U/l,
• Gradilla para cubetas peroxidasa > 1.000 U/l)
• Pipeta de 2ml • Acido tricloroacético 5%
• Propipeta • Reactivo de lugol.
• Vortex • Estándar 0.01% (para medir
glucosa)
• Vaso precipitado de 50 ml
• Estándar 0.05% (para medir
• Espectrofotómetro
glucógeno)
• Pesa digital
• Incubadora a 37°C

Método
Posterior a la discusión teórica del práctico procedemos a obtener los cortes
de Hígado de Rata, bien alimentada y sin estrés, para asegurarnos de que
conserve glucógeno. El hígado lo recibimos en una placa petri.

Se realizan tres cortes. Cada corte debe pesar 200-250 mg. y van en tubos
rotulados con 0’- 10- 30’, lo que corresponde a los tiempos de incubación.
 A cada tubo se le agregan 2 ml de solución de Krebs (solución de
composición iónica similar al plasma). Incubamos los 3 tubos según los tiempos
correspondientes a 37ºC. Finalizado el tiempo de incubación de cada tubo,
vaciamos el sobrenadante a otros tres tubos rotulados también con tiempos 0’s -
10’s - 30’s. Según esto, el primer tubo (tiempo 0’) no se incuba, sino que se vacía
inmediatamente el sobrenadante en el tubo correspondiente.

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• Determinación de glucógeno
Con los tubos que quedaron con los trozos de hígado, realizamos lo
siguiente:
Al tubo con tiempo 0’ (que no incubamos) le agregamos rápidamente 5 ml
de acido tricloroacético 5% (TCA), vortereamos y vaciamos todo el contenido del
tubo al mortero para triturar por 5 minutos, con el fin de romper los hepatocitos.

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Luego de triturar, procedemos a filtrar la

solución con filtro de papel y a recoger el filtrado en un nuevo tubo de ensayo
rotulado 0’f.
Luego tomamos 0.5 ml de este filtrado y le agregamos 1.5 ml de TCA 5% 0
dejándolos incubar por 5 minutos.

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Se realiza el mismo procedimiento con iguales cantidades de reactivos en

los otros dos tubos de tiempo 10’ y 30’, luego de su incubación a 37ºC.
Luego preparamos lo siguiente:
 - 2 estándares que contendrán: 1 ml de solución estándar de glucógeno 0.05
g%, 1 ml de TCA 5%.
- Un blanco con 2 ml de TCA 5%.
Una vez preparadas todas las soluciones les agregamos 0.25 ml de
solución de lugol a cada uno y las dejamos reaccionar por 5 minutos.

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Las 6 soluciones obtenidas las analizaremos en el espectrofotómetro a 540

nm, para obtener sus respectivas absorbancias y determinar la cantidad de
glucógeno a los distintos tiempos.

• Determinación de glucosa
La idea es medir la cantidad de Glucosa mediante el proceso de GOD-
PAD.
Preparamos lo siguiente:
- 2 estándares, que contienen: 100 ul de estándar 0.01%.
- 1 Blanco, que contiene: 100 ul de agua destilada

A los 3 tubos que contienen el sobrenadante anterior y a los tres tubos

preparados recién agregamos 1 ml de reactivo enzimático y vortereamos.

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Incubamos por 10 mintuos a 37º C. Posteriormente leemos en

espectrofotómetro a 500 nm.
 Resultados
a) Calcule los mg. de glucógeno y glucosa obtenidos en cada tubo.

[mg/ml] [mg/ml]
Tiempo Absorbancia Absorbancia
glucosa glucógeno
0’ 0.091 0.006 1.350 0.935
10’ 0.888 0.067 1.209 0.837
30’ 1.068 0.081 1.039 0.719
Std. 0.653 0.050 0.361 0.250

b) Grafique y discuta los resultados obtenidos para glucógeno y glucosa.

Concentración de glucógeno v/ s tiempo

1
Glucógeno [mg/ml]

0,935
0,837
0,8
0,719
0,6

0,4

0,2

0
0 10 20 30 40

Tiempo (min)
 Discusión
La concentración de glucosa en tiempo 0’, debió ser de 0, sin embargo,
obtuvimos un valor de 0.006. Esta situación puede deberse a que el hígado
utilizado, ya contenía trazas de glucosa o bien a algún error experimental, aunque
esta última opción es descartada por el grupo debido al buen trabajo realizado. A
pesar de esto, podemos considerar como despreciable este valor si lo
comparamos con las concentraciones obtenidas en tiempo 10’ y 30’ que son 10
veces mayores en el caso del tiempo 10’
Para cuantificar el producto, utilizamos el espectrofotómetro. Debido a que
trabaja en base a colorimetría, tuvimos que teñir con lugol nuestro preparado de
glucógeno, no así con el preparado de glucosa, puesto que la quinonimina, yase
encuentra coloreada.
Para la medición, debimos de usar longitudes de onda distintas (540 para
glucógeno y 500 para glucosa) debido a que al ser sustancias distintas, absorven
la luz a distintas longitudes de onda
En los primeros 10 minutos, se liberó mucha glucosa, por otra parte, en los
20 minutos siguientes, la cantidad de glucosa liberada, fue mínima con respecto al
periodo anterior. Esto no es debido a la falta de reactante, puesto que a los 30’
aún quedaba gran cantidad de glucógeno sin reaccionar.

Conclusiones
1. La concentración obtenida a tiempo 0’ indica que el trozo de hígado
contenía trazas de glucosa
2. La liberación de glucosa, no es directamente proporcional al tiempo
3. El glucógeno no es medible directamente en el espectrofotómetro
 Bibliografía
• Lehninger, “Principios de Bioquímica”, 2005, Cuarta Edición, Editorial Omega
S.A., Barcelona, España.
• Guía de trabajos prácticos, Carrera Medicina 2007.