DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE PARASITOSIS

El diagnstico de las infecciones parasitarias puede establecerse de dos maneras fundamentales:

por mtodos directos, diseados para observar o detectar el parsito o alguno de sus elementos identificables por mtodos indirectos, dirigidos a hacer evidente la respuesta inmune del hospedero frente al parsito. Los mtodos indirectos de diagnstico tienen fundamental importancia para el diagnstico de parasitosis en que es imposible o muy difcil la visualizacin directa del parsito o de alguno de sus elementos o para controlar la evolucin post-teraputica de la infeccin.

A) Dentro de los mtodos directos se encuentra:

el anlisis parasitolgico de heces, el cual consta de un examen microscpico directo, con y sin coloraciones examen macroscpico por tamizado mtodos de concentracin.

La concentracin y la separacin de los quistes de protozoos y huevos de helmintos de otros elementos de la muestra fecal pueden ser de gran ayuda para el diagnstico. Se consiguen por sedimentacin, flotacin o una combinacin de ambos. La sedimentacin se lleva a cabo suspendiendo la muestra fecal en agua o en una solucin acuosa para que sedimente de forma natural o acelerando el proceso por centrifugacin. La flotacin consiste en suspender la muestra en un medio de densidad superior a la de los quistes y los huevos, que por su capacidad de flotacin se concentran en la superficie. El diagnstico de las infecciones parasitarias intestinales puede establecerse por mtodos directos o indirectos como sealamos anteriormente. La seleccin de una o ms tcnicas depender de qu especie parasitaria y en qu fase de su ciclo evolutivo es necesario diagnosticar, dadas las diferentes cualidades de cada mtodo.

Examen parasitolgico de heces Las muestras de heces pueden ser recogidas de varias maneras:

Heces frescas sin conservantes: Si el paciente presenta deposiciones lquidas o heces con moco y sangre, se debe examinar rpidamente una muestra de las mismas siempre que no haya tomado carbn, crema de bismuto, sustancias baritadas o est medicado con hierro.

Heces con conservantes: El paciente debe colocar en un frasco con conservante (formol 10%, SAF, etc.), una pequea cantidad de materia fecal de todas las deposiciones del da y durante 8 das seguidos. Heces despus de tomar un purgante salino: El paciente durante 2 das no debe ingerir verduras de hoja, legumbres o ctricos. Puede ingerir bananas o manzanas peladas, es decir, frutas que no tengan hollejo. La noche anterior a la recoleccin de la muestra deber tomar un purgante salino (no oleoso) y luego recoger la 2 deposicin en un frasco limpio, preferentemente de tapa a roscas.

Los distintos modos de recoleccin presentan ventajas y desventajas. Las heces frescas permiten ver la movilidad de los protozoos y larvas de helmintos. Las que tienen conservantes permite obtener parsitos que se eliminan de manera

intermitente,

aunque

Trichomonas

hominis

no

se

detecta

con

conservantes.

Las heces recogidas luego de la administracin de un purgante salino, permiten el diagnstico ms rpido, pero no puede realizarse en personas con dolores intestinales, diarrea o en quienes estn contraindicados los purgantes. La muestra debe ser procesada rpidamente. Permite ver la movilidad de los protozoos y se logra una mejor visualizacin de los macroparsitos dado que en el tamizado aparecen pocos restos debido a la no-ingestin de verduras, legumbres y frutas. La recoleccin seriada de las heces puede darse a todos los pacientes y al recoger durante 8 das aumenta la posibilidad de hallar los parsitos que tengan un ciclo ms largo y que puedan completarlo durante la recoleccin. Esta recoleccin es engorrosa para el paciente; el formol inmoviliza a los protozoos pero conservan su morfologa lo que hace posible su diagnstico. Una vez remitidas al laboratorio las muestras obtenidas como se ha sealado anteriormente se procede al anlisis parasitolgico.

Anlisis Parasitolgico Las muestras de heces deben ser homogeneizadas. Si las heces son formadas se agrega agua o solucin fisiolgica hasta obtener una muestra semi-lquida. Se realiza:

a) Examen microscpico directo, con objetivos de 100x y 400x aumentos para la bsqueda de trofozoitos, quistes, ooquistes, huevos y/o larvas de parsitos intestinales. Esta observacin microscpica puede hacerse sin coloracin o con coloraciones hmedas como lugol, eosina, azul de metileno, etc. b) Concentracin de huevos, larvas y quistes en heces ha llegado a ser un procedimiento de rutina como parte de un examen completo para la deteccin de los parsitos intestinales, que se puede realizar como complemento del examen directo. c) Examen macroscpico: consiste en tamizar la muestra una vez concluido el examen microscpico directo, para identificar la morfologa de los helmintos macroscpicos. d) Examen microscpico previa coloracin: con las heces llegadas al laboratorio u obtenidas por mtodos de concentracin se pueden preparar extendidos para ser fijados y teidos con coloraciones especficas para cada parsito que se quiera investigar .e) Escobillado anal: el anlisis parasitolgico se debe completar, sobre todo en los nios, con un hisopado anal seriado: es una tcnica especfica para la deteccin de Enterobius vermicularis, nematode cuya hembra coloca los huevos en la zona perianal. Los exmenes microscpicos y macroscpicos de heces presentan poca sensibilidad para este parsito. La tcnica consiste en pasar ocho gasas estriles por la zona perianal, por la maana y sin higiene previa. Se realiza durante ocho das, recogiendo las gasas en un frasco con formol al 10%. Obtenida la muestra, se centrifuga durante 10 minutos a 3.000 rpm, se descarta el sobrenadante y el sedimento se observa por examen microscpico directo con 100x y 400x aumentos para la bsqueda de huevos del parsito. Debe agotarse el sedimento antes de dar por negativo el anlisis. Montaje hmedo directo: este mtodo sigue siendo el gold standard para el diagnstico de la enfermedades parasitarias. Se usa principalmente para observar las caractersticas morfolgicas de los protozoos y detectar la movilidad de los mismos en su forma de trofozoito. El preparado directo se realiza con una pequea cantidad (una gota) de heces entre porta y cubreobjeto; no debe ser mayor porque resultara demasiado espesa para el examen, ni menor porque disminuira la posibilidad de encontrar parsitos. La observacin se realiza utilizando un objetivo de 10x aumentos y ante

un elemento sospechoso se examina con 40x aumentos.

Para poder observar con ms detalle la morfologa de los protozoos (especialmente los ncleos) se puede hacer un montaje hmedo coloreado, colocando una gota de colorante en el borde del portaobjeto o se prepara un nuevo montaje. Varias soluciones de yodo son recomendadas, por ejemplo Lugol y de Dobell y O Connor; otras como solucin de eosina o azul de metileno.

Los trofozoitos y quistes de protozoos, huevos o larvas de helmintos y ooquistes de Isospora belli pueden ser identificados en el extendidos directo. Los ooquistes de Cryptosporidium difcilmente son observados, salvo en grandes infecciones, al igual que las esporas de Microsporidium que son muy pequeas y de forma semejante a restos en materia fecal.

Extendidos coloreados permanentes: la deteccin y la correcta identificacin de la mayora de los protozoos intestinales dependen del examen de estos extendidos observados con un aumento de 100x. La utilizacin de extendidos permanentes no solamente nos proporciona un archivo durable de los protozoos, sino que pueden ser utilizados, cuando la identificacin es dificultosa, para consultar con especialistas. El mtodo ms clsico es la hematoxilina frrica de Heidenhain, pero la generalidad de los laboratorios seleccionan tcnicas ms breves como la coloracin Tricrmica. Es importante mencionar que la mayora de las dificultades en las coloraciones de trofozoitos y quistes se deben a una fijacin inadecuada, al uso de preparados muy densos o por heces muy viejas.

Tcnicas de Concentracin La concentracin de huevos, larvas y quistes en heces ha llegado a ser un procedimiento de rutina como parte de un examen completo para la deteccin de los parsitos intestinales y se puede realizar como complemento del examen directo. Los procedimientos de concentracin permiten la deteccin de protozoos y/o helmintos emplendose dos mtodos: de sedimentacin y flotacin, o una combinacin de ambos, para separar los protozoos y los huevos de helmintos de las heces, utilizando las diferencias en el peso especfico. Se deben emplear cuando la cantidad de muestra fuera pequea, en un control de tratamiento o cuando se deba transportar poca cantidad de muestra a un lugar distante.

1- Concentracin por Sedimentacin

Los parsitos se concentran por accin de la gravedad, suspendiendo las heces en agua corriente, agua destilada o solucin salina y dejando que sedimenten naturalmente o por centrifugacin. Estos mtodos son principalmente tiles para la concentracin de quistes, ooquistes y huevos.

Ventajas: es fcil de realizar, no requiere observacin microscpica inmediata y se puede aplicar a la concentracin de la mayora de los parsitos intestinales.

Desventajas: la observacin microscpica puede dificultarse por concentracin de elementos no parasitarios.

Sedimentacin espontnea:

Mtodo de sedimentacin sencilla

1- Homogeneizar unos 10 gramos de heces en 10 veces su volumen de agua corriente. 2- Verter la materia fecal en copas de vidrio o vasos de precipitado de 250 a 500 ml 3- Dejar que sedimente durante 1 hora. 4- Eliminar por sifn los dos tercios superiores, o verterlos con cuidado, para eliminar los detritus. 5- Agregar agua hasta llenar casi el recipiente y resuspender las heces con varilla. 6- Repetir la operacin 1 o 2 veces ms hasta que el sobrenadante quede relativamente lmpido. 7- Eliminar el lquido y con una pipeta obtener una pequea porcin del sedimento para 8- Observacin microscpica.

Es un mtodo lento y de poca concentracin para los protozoos intestinales. Los huevos de helmintos sedimentan en el fondo del recipiente en un estado viable y sin deformacin.

Mtodo de Lumbreras modificado

Se utiliza para la bsqueda de huevos de Fasciola heptica en heces o bilis. No se puede utilizar un mtodo de centrifugacin porque los huevos se rompen ni de flotacin porque son muy pesados. 1- Colocar 2 ml de la muestra (heces o bilis) en una copa de Lumbreras o tubo de centrfuga. 2- Agregar 5 ml de solucin detergente al 10% para emulsionar las grasas. 3- Agregar 0,5 ml de alumbre frrico al 1% para favorecer el gradiente de densidad. 4- Homogeneizar suavemente. 5- Dejar en reposo 30 minutos. 6- Sacar con pipeta pasteur una gota del fondo de la copa. 7- Observar con microscopio.

Sedimentacin por centrifugacin:

Mtodo de Charles Barthelemy modificado por Bacigalupo y Rivero

1-Mezclar 10 gramos de heces con 50 ml de solucin fisiolgica, o agua de la canilla. 2-Tamizar a travs de un colador metlico. 3-Filtrar sobre gasa en un embudo. 4-Recoger 10 ml del filtrado en un tubo de centrfuga. 5-Centrifugar 5 minutos a 1500 rpm. Descartar el sobrenadante. 6-Repetir esta operacin 3 veces o hasta que el sobrenadante quede lmpido. 7-Resuspender el sedimento con solucin fisiolgica o agua de la canilla ms 2 ml de ter sulfrico. Tapar con tapn de

goma y agitar vigorosamente para extraer las grasas. 8-Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Descartar el tapn graso de un golpe seco, conservando el sedimento. 9-Examinar con microscopio el sedimento.

Mtodo de formol- ter o de Ritchie

1- Filtrar 10 ml de suspensin de heces por un embudo con una capa de gasa. 2- Recoger 10 ml del filtrado sobre un tubo de centrfuga. 3- Centrifugar 5 minutos a 2000 -2500 rpm. Descartar el sobrenadante. 4- Repetir esta operacin 3 veces o hasta que el sobrenadante quede lmpido. 5- Resuspender el sedimento con formol 10%. Dejar 5 a 10 minutos en reposo. 6- Agregar 3 ml de ter sulfrico. Tapar con tapn de goma y agitar vigorosamente 30 segundos para extraer las grasas. 7- Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Se forman cuatro capas: 1) capa de ter, 2) tapn de restos fecales, 3) capa de formol, 4) sedimento. Descartar las 3 capas primeras, conservando el sedimento. 8- Examinar con microscopio el sedimento.

2- Tcnicas de Flotacin El mtodo de flotacin emplea un medio lquido ms pesado que los parsitos permitiendo que los mismos suban a la superficie y puedan ser recuperados de la pelcula superficial. Ventajas: el preparado es ms lmpido, facilitando la observacin microscpica. Desventajas: debe hacerse la observacin microscpica en menor tiempo debido a que la pelcula superficial puede destruirse y los parsitos caer al fondo del tubo, a su vez, los parsitos de mayor peso que la solucin empleada no flotarn. Existen varios mtodos de flotacin, el ms utilizado es el mtodo de Faust

Mtodo de Faust o de Sulfato de Zinc al 33%

La concentracin de sulfato de zinc para hacer flotar los elementos parasitarios tiene un peso especfico de 1.180. Solucin acuosa de sulfato de zinc puro: 333 g. Agua destilada c.s.p.: 1.000 ml 1-Mezclar 10 gramos de heces con 50 ml de solucin fisiolgica o agua de la canilla. 2-Tamizar a travs de un colador metlico. 3-Filtrar sobre gasa en un embudo. 4-Recoger 10 ml del filtrado sobre un tubo de centrfuga. 5-Centrifugar 5 minutos a 1500 rpm. Descartar el sobrenadante. 6-Repetir esta operacin 3 veces o hasta que el sobrenadante quede lmpido. 7-Agregar al sedimento final 2 o 3 ml de solucin de sulfato de zinc al 33% y homogeneizar con varilla. 8-Completar con sulfato de zinc el tubo de centrfuga sin volver a homogeneizar. 9-Centrifugar 1 o 2 minutos a 1500 rpm. Extraer con aro de alambre unas gotas de la pelcula superficial sin retirar el tubo de la centrfuga o hacindolo con sumo cuidado para evitar que por agitacin se destruya la pelcula.