GUIA 7 Cintica y reactores enzimticos

7.1.- Un pesticida inhibe la actividad de una mezcla alfa, que luego deber ser utilizada para la deteccin de este pesticida. A partir de los valores consignados en la tabla adjunta, determinar: V (mL/Lmin) 10-6 S (mol/L) 3.3 10-4 5.0 10-4 6.7 10-4 16.5 10-4 22.1 10-4 a) Parmetros cinticos b) Expresin de la cintica de inhibicin correspondiente a partir del equilibrio cintico c) 50 mL de la misma solucin enzimtica de la parte (a) se mezcla con 50 mL de una solucin 8 10-4 M de sustrato y 25 mL de muestra problema (con pesticida), observndose una velocidad inicial de 43 mol/min. Calcular la concentracin de inhibidor en la muestra problema, asumiendo que en ella no existe cantidad alguna de sustrato. 7.2.- Un reactor batch de tanque agitado, esta produciendo Magneso peroxidasa a travs del cultivo de Trametes versicolor, cuando se introduce a la corriente de alimentacin un inhibidor que acta competitivamente con el sustrato. Determine el tiempo necesario para convertir una concentracin inicial de So a S de sustrato. Deje la expresin en funcin de los parmetros cinticos (Km, Ki, Vm), concentracin de clulas, So y S. 7.3.- En relacin con cintica enzimtica, responda las siguientes preguntas: a) Explique cules son las diferencias que presenta una grfica 1/v vs 1/S de una inhibicin no competitiva frente a una inhibicin competitiva por sustrato. b) Qu pasa con los valores de KM y Vmx en cada caso? c) Disee un experimento para mostrar en forma comparativa, cundo la enzima es inhibida en forma competitiva y cuando es no competitiva. 7.4.- Se conoce parcialmente la reaccin de inhibicin de la hidrlisis de la urea por ureasa. Los datos de la hidrlisis de la reaccin se dan a continuacin para dos concentraciones de sustrato. a) Determine la constante de Michaelis-Menten para esta reaccin. b) Qu tipo de inhibicin tiene esta reaccin? Fundamente su respuesta. c) Basada en la respuesta de la parte b, Cul es el valor de Ki?. S1 = 0.2 M 1/v I 0.22 0 0.33 0.0012 0.51 0.0027 0.76 0.0044 0.88 0.0061 1.10 0.0080 1.15 0.0093 S2 = 0.02M 1/v I 0.68 0 1.02 0.0013 1.50 0.0022 1.83 0.0032 2.04 0.0037 2.72 0.0044 3.46 0.0057 Sin inhibidor 56 71 88 129 149 10-5 M inhibidor 37 47 61 103 125

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7.5.- Los siguientes datos fueron obtenidos para dos concentraciones iniciales de enzima para una reaccin catalizada por esta enzima: [ S ] (g/L) 20.0 10.0 6.7 5.0 4.0 3.3 2.9 2.5 a) Encontrar Km V (g/L min) [E0] = 0.015 g/L 1.14 0.87 0.70 0.59 0.50 0.44 0.39 0.35 V (g/L min) [E0] = 0.00875 g/L 0.67 0.51 0.41 0.34 0.29

b) Encontrar Vm para [E0] = 0.015 g/L c) Encontrar Vm para [E0] = 0.00875 g/L d) Encontrar K2 (referida a reaccin limitante) 7.6.- En el estudio de la cintica de la accin de una enzima que est sujeta a inhibicin se han obtenido los siguientes datos experimentales. S (mmol) 0.001 0.0012 0.0014 0.0016 0.0018 V (I = 0.1) 0.00141 0.00165 0.00182 0.00195 0.00206 V (I = 0.5) 0.000994 0.001097 0.001232 0.001237 0.001276 V (I = 0) 0.002018 0.002369 0.002724 0.003177 0.003536

I = mmol V = mmol/h

a) Determine los parmetros cinticos para cada una de las reacciones b) Qu tipo de inhibicin es la que presenta el inhibidor sobre la enzima? Justifique. 7.7.- Un carbohidrato A se descompone en presencia de enzima E. Se sospecha que el carbohidrato B, tambin presente en la mezcla, tiene algn efecto en esta descomposicin. Para estudiar este fenmeno se realizaron experimentos con diferentes composiciones de A y B y flujo a travs de un reactor perfectamente agitado (continuo operado en regimen estacionario) de volumen 240 cm3. a) A partir de los datos mostrados en la tabla, encuentre la ecuacin de la velocidad de reaccin de descomposicin de A b) Qu puede sealar respecto al papel de B en la descomposicin S0 (mol/m3) 500 300 200 600 400 70 A (mol/m3) 400 100 20 400 100 20 B (mol/m3) 0 0 0 200 200 200 F (cm3/min) 480 120 36 144 60 120 E0 (mol/m3) 20 20 20 20 20 20

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7.8.- Durante la purificacin de una protena (A) se encuentra que la accin enzimtica es inhibida por un compuesto (B). A partir de la siguiente informacin encuentre el tipo de inhibicin y todos sus parmetos. S
Concentracin de protena (mol/L)

0.5 1.0 2.0 4.0

Velocidad de consumo de la protena (mol / L min ) V (sin inhibidor) V ( I = 2.5 mol/L ) 0.400 0.625 0.333 0.910 0.500 1.330 0.625

7.9.- Usted est trabajando con una enzima sujeta a inhibicin por sustrato. Los parmetros cinticos son: Vm = 1 min-1 Km = 2 mmol KSI = 0.1 mmol Cul ser el tiempo de residencia que necesitara usar en un reactor de tanque agitado para obtener una conversin del 50%, si la concentracin de sustrato en la alimentacin es de 100 mmol? 7.10.- La cintica de conversin de lactosa por -galactosidasa se puede asumir sigue la cintica de Michaelis-Menten, con parmetros K2 = 0.6 (mmol/mg min) y Km = 0.5 mM. Si la concentracin de lactosa en la alimentacin es de 10 mM, calcule: a) El tiempo de reaccin en operacin batch en un reactor perfectamente agitado si se necesita una conversin del 95% de lactosa para una concentracin de enzima de 75 mg/mL. b) El tiempo de residencia en un reactor continuo para el mismo grado de conversin con las mismas concentraciones de enzima y lactosa. 7.11.- Para la determinacin de Vmax y de Km por inspeccin, no es necesario recurrir a mtodos grficos muy sofisticados. Dichos valores pueden determinarse rpidamente a partir de las velocidades de reaccin con concentraciones de sustrato crecientes. Empleando las definiciones de Vmax y de Km, calcular el valor aproximado de los parmetros antes mencionados de la reaccin catalizada por una enzima a partir de la cual se obtuvieron los siguientes datos: [S] (M) V (mol/L min) 2.5 x 10-6 28 4 x 10-6 40 1 x 10-5 70 2 x 10-5 95 4 x 10-5 112 1 x 10-4 128 2 x 10-3 139 1 x 10-2 140

7.12.- En un experimento de laboratorio dos estudiantes aislaron independientemente la anzima lactato deshidrogenasa de corazn de pollo, que cataliza la reduccin de piruvato a lactato. La enzima se obtuvo en forma de disolucin concentrada. Los estudiantes midieron despus la actividad de sus propias disoluciones enzimticas en funcin de la concentracin de sustrato en condiciones idnticas y determinaron de este modo la Vmax y la Km de sus preparaciones. Cuando compararon sus resultados observaron que sus valores de Km eran idnticos pero sus valores de Vmax eran radicalmente diferentes. Uno de los estudiantes argumentaba que los diferentes valores de Vmax confirmaban que haban aislado diferentes formas de la enzima. El otro estudiante razonaba que a pesar de la diferencia de los valores de Vmax haban aislado la misma forma de la enzima. Cul de los estudiantes formulaba la afirmacin correcta?, explicar. Cmo podran resolver la discrepancia? Explicar. 7.13.- De acuerdo a la relacin de la velocidad de reaccin y la concentracin de sustrato, segn la ecuacin de Michaelis-Menten, determinar: a) A qu concentracin de sustrato mostrar una enzima la cuarta parte de su velocidad mxima, si el mximo de velocidad en la transformacin del sustrato es de 30 mol/min mg y Km = 0.005 M? b) Determinar la fraccin de Vmax que se encontrara a una concentracin de sustrato de Km, 2Km y 10Km
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7.14.- Una enzima fue analizada a una concentracin de sustrato inicial de 10-5 M, el valor de Km del sustrato es de 2x10-3. Al cabo de 1 min el 2% del sustrato ha sido convertido en producto. a) Qu concentracin de sustrato ha sido convertido en producto al cabo de 3 min y cul es la concentracin de producto? b) Cul es la velocidad mxima posible? c) Alrededor de qu concentracin de sustrato se obtiene Vm? d) A esta concentracin, Qu porcentaje de sustrato es convertido en producto al cabo de 3 minutos? 7.15.- Determinar en forma directa y de acuerdo a los datos que se entregan a continuacin si la reaccin (S P) presenta inhibicin competitiva o no competitiva (la concentracin del inhibidor de la reaccin inhibida es de 0.01 mM). Argumente su respuesta. Determine las constantes cinticas para ambos casos.
S (mM) v (mM/min) s/I v (mM/min) c/I 0.04 5.97 4.73 0.05 6.47 5.27 0.06 6.85 5.71 0.07 7.15 6.06 0.10 7.76 6.83 0.15 8.31 7.58 0.50 9.24 8.95 0.80 9.41 9.22 5.00 9.65 9.62 10 9.67 9.66 40 9.69 9.69 80 9.7 9.7 100 9.7 9.7 200 9.7 9.7

7.16.- Un microorganismo tiene una enzima que hidroliza glucosa 6 fosfato (G6P). El seguimiento de la reaccin est basada en el seguimiento de la formacin de glucosa. La enzima libre de entrada se caracteriza por tener un Km= 6.7x10-4 M y una Vm= 300 mmoles/L min. Se produce una inhibicin de tipo competitiva debido a la adicin de galactosa 6 fosfato. Para una concentracin de 10-5 de galactosa 6 fosfato y de 2x10-5 M de G6P, la velocidad de reaccin es 1.5 mmoles/L min. Calcular KI para la G6P. 7.17.- Una enzima tiene una constante de saturacin Km = 4.7x18-5 M, la velocidad mxima de la preparacin es 22 mol/L min. Qu velocidad observar en presencia de una concentracin de sustrato de 2x10-4 M y de un inhibidor a concentracin de 5x10-4 M en los casos de: a) Inhibicin competitiva b) Inhibicin no competitiva c) Grado de inhibicin en cada uno de los casos 7.18.- Un extracto de levadura conteniendo lactasa ( lactosa glucosa + galactosa ) tiene condiciones ptimas de actividad de 45C y pH 6.4. Una forma de determinar la actividad del extracto es por medio del mtodo del ortonitrofenolgalactsido (ONPG), el cual consiste en agregar 1.5 mL de extracto diluido, 2.7 mL de tampn fosfato y 0.1 mL de solucin de mercaptoetanol. Se incuba por 3 minutos a 40C, luego de lo cual se le adiciona 0.1 mL de solucin sustrato ONPG 0.068M incubando a diferentes tiempos. La reaccin se detiene sumergiendo los tubos en un bao de agua a ebullicin por 5 minutos. Luego, se lee la densidad ptica a 410 nm . El coeficiente de extincin es de 0.2 , y l=1 dm. La reaccin catalizada es la siguiente : ONPG
lactasa

ONP + Galactsido amarillo, se mide a 420 nm t (min) 4 8 12 16 (b) 1:10 0.235 0.348 0.399 0.005 1:15 0.120 0.1314 0.143 0.005

Los resultados de D.O. [g/L*min] son los siguientes : (b) blanco realizado slo con sustrato y 4.2 mL de tampn

Determinar la actividad del extracto, si se tiene que 1 UI = cantidad de enzima que libera 1 mol de ONP en 1 minuto. 4 IIQ-461 Departamento de Ingeniera Qumica
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7.19.- Se disea un mtodo para determinar la actividad de una enzima. Para sto se incuban 0.6 mL de muestra con 0.6 mL de celobiosa, deteniendo la reaccin con 0.2 mL de Na2CO3. Se sabe que la reccin es E3 celobiosa 2 glucosa La muestra se obtiene al diluir 1 mL de caldo en 13 mL de H2O. En mediciones de absorbancia : = 0.22 l = 1 cm de celda t 1:5 1:10 1:15 A=L**C 0 5 0.2655 0.165 0.1163 C [g/L] 10 0.57 0.3375 0.2325 t [min] 15 0.69 0.48 0.345 [UI] = moles de S / seg 20 0.78 0.585 0.4695 25 0.825 0.675 0.57 7.20.- Para determinar la actividad de -glucosidasa producida por fermentacin de Kluyveromyces fragilis la clula se homogeniza extrayendo con esto la enzima. Las mediciones se realizan con 50 mg de clulas homogenizadas, las cuales son diluidas, a pH y T ptimos, segn: a) 150 mL de tampn, b) 70 mL de tampn, c) 250 mL de tampn. Se mezclan 5 mL de solucin de lactosa 50 g/L en tampn pH 6.5 y 1 mL de solucin de levadura permeabilizada segn (a), (b) y (c). Los resultados, luego de 5 y 10 minutos, son los siguientes: t (min) a b c 5 (b1) 0.002 0.005 0.001 5 1.2245 1.781 0.441 10 1.85 3.061 0.781 10 (b2) 0.0225 0.036 0.01 Determinar el rango lineal y la actividad del homogenizado 7.21.- La enzima fructofuranosidasa (invertasa) seca de Sigma Chemical Company, extrada de levadura de panificacin, tiene condiciones ptimas analticas de 55C y pH 4.5. Para la determinacin de la actividad enzimtica, se prepar una solucin de 500 ppm del preparado enzimtico comercial, el cual se utiliz como solucin stock. Las muestras enzimticas (diluidas convenientemente con tampn acetato 0.05M) fueron analizadas incubando 1 mL de muestra enzimtica diluida por un lapso de tiempo en 4 mL de solucin de sacarosa 50 g/L. Luego de ese tiempo, la enzima es inactivada con 0.1 mL de NaOH 10N, con lo cual la solucin enzimtica alcanza un valor de pH cercano a 11. La concentracin de glucosa es determinada mediante el mtodo de Folin-Wu, leyendo absorbancia a 420 nm. La curva de calibrado para glucosa indica que: D.O. = 1.38 *C donde D.O. = Absorbancia a 420 nm La sacarosa, que viene en polvo, tiene una pureza de un 98% y contiene un 1 % de glucosa. De acuerdo al procedimiento descrito, los resultados fueron los siguientes:
Muestra enzimtica (D.O.)

C = [g/L] de glucosa

tiempo de incubacin (min) 1 : 62.5 5 2.6220 10 3.4776 15 3.7260 15 * 0.3864 * Para t = 15 min, es 1 mL de enzima diluda en 4 mL de tampn.
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1 : 125 1.6560 2.4288 2.7876 0.1932

Determinar las UI del extracto enzimtico seco. Indicar cualquier suposicin hecha. IIQ-461
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7.22.- La enzima glutamato deshidrogenasa cataliza la siguiente reaccin:

glutamato + NAD + P + NADH + H+

Los siguientes valores experimentales fueron obtenidos en presencia y ausencia del inhibidor salicilato de sodio:
S (mM) 1.5 2.0 3.0 4.0 8.0 16 I=0 0.21 0.25 0.3 0.33 0.43 0.4 I = 40 mM 0.08 0.09 0.12 0.13 0.16 0.18

Calcular los valores de Km y KI e interpretar los resultados. 7.23.- Se tiene una mezcla de 2 enzimas: E1 y E2, que reaccionan con A para dar un producto B. Obtener la expresin cintica para la reaccin que da origen a B. 7.24.- Defina el concepto de actividad enzimtica y refirase a la unidad que se utiliza para estandarizar su medicin. Comente las razones por las cuales debe ser medida a tiempos iniciales de reaccin y los factores que afectan su cuantificacin. 7.25.- Para el siguiente set de datos:
S (mM) 0.04 0.05 0.06 0.07 0.10 0.15 0.50 0.80 5.00 10 40 80 100 200 Sin inhibidor V (mM/min) 5.97 6.47 6.85 7.15 7.76 8.31 9.24 9.41 9.65 9.67 9.69 9.7 9.7 9.7 Con inhibidor ([I] = 0.02 mM) V (mM/min) 4.04 4.26 4.43 4.55 4.79 4.99 5.31 5.37 5.45 5.45 5.46 5.46 5.46 5.46

Identificar el mecanismo de inhibicin que presenta la reaccin, argumentando adecuadamente su respuesta. Determine las constantes cinticas para ambos casos y la constante de inhibicin.

7.26.- El Viejo Pascuero ha descubierto una nueva enzima que, por razones propias, denomin pascualasa. La pascualasa permite convertir la renosa (complejo azcar de la leche de reno) en un azcar fermentable. Lamentablemente, esta curiosa enzima sufre de inhibicin por sustrato (KSI =0,05 mM). Si la concentracin inicial de renosa es de 10 mM, con parmetros k2=0,6 mmol/(mg min) y KM=0,5 mM. Determine: a. El tiempo de reaccin en operacin batch en un reactor perfectamente agitado si se necesita convertir el 80% de la renosa presente, para una concentracin de pascualasa de 30 mg/mL b. El tiempo de residencia en un reactor continuo operando en estado estacionario para obtener el mismo grado de conversin con las mismas concentraciones de enzima en el medio y lactosa en la alimentacin.
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7.27.- En una reaccin enzimtica con dos sustratos, deducir la ecuacin cintica correspondiente a un mecanismo aleatorio de formacin de complejo ternario. Suponga adems que el compuesto C, presente en el medio, inhibe competitivamente (inhibidor competitivo total) a la enzima.

7.28.- Desarrolle la expresin cintica para la inhibicin por sustrato (el sustrato forma un complejo reversible inactivo con el complejo ES). Derive adems una expresin que permita determinar el tiempo de residencia en un reactor de tanque agitado para lograr una conversin de sustrato del 50%. 7.29.- El Viejo Pascuero descubri otra enzima, que llam navidasa. La navidasa permite convertir la renosa (complejo azcar de la leche de reno) en un azcar fermentable, pero se inhibe competitivamente con un compuesto presente (1mM, KI = 0,1 mM) en esta leche. Si la concentracin inicial de renosa es de 10 mM, con parmetros k2=0,6 mmol/(mg min) y KM=0,5 mM. Determine: c. El tiempo de reaccin en operacin batch en un reactor perfectamente agitado si se necesita una conversin del 90% de la renosa, para una concentracin de navidasa de 80 mg/mL

d. El tiempo de residencia en un reactor continuo operando en estado estacionario para obtener el mismo grado de conversin con las mismas concentraciones de enzima y lactosa. 7.30.- La cintica de conversin de lactosa por -galactosidasa se puede asumir sigue la cintica de Michaelis-Menten, con parmetros k2=0.6 (mmol/mg enz x min) y KM=0.5 mM. La concentracin de lactosa en la alimentacin es de 10 mM. El compuesto B, presente en el preparado en una concentracin de 1 mM, es un inhibidor no competitivo (total). KI = 0.05 mM a. Determinar el tiempo de reaccin en operacin batch en un reactor perfectamente agitado si se necesita una conversin del 85% de la lactosa para una concentracin de enzima de 75 mg/ml. b. Determinar el tiempo de residencia en un reactor continuo para igual grado de conversin con las mismas concentraciones iniciales de enzima y lactosa.

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