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Biologia do Desenvolvimento

QUINTA EDIO

Biologia do Desenvolvimento

QUINTA EDIO

Scott F. Gilbert
Swarthmore College

Traduo e Reviso
Adolfo Max Rothschild Zuleika Rothschild Francisco A. de Moura Duarte Maria Helena Corra Marques

A capa
FOTOGRAFIA DA CAPA: O mRNA para o Fator 8 de Crescimento

Fibroblstico pode ser detectado pela hibridizao in situ da montagem total usando RNA marcado quimicamente que complementar a essa mensagem. No embrio de pinto de 3 dias, a mensagem do Fgf8 encontrada no ectoderma mais distal dos brotos dos membros, no limite entre o crebro posterior e o crebro intermedirio, nos somitos, nos arcos branquiais do pescoo e na cauda em desenvolvimento. O FGF8 importante para diversos processos desenvolvimentais e desempenha papis crticos no crescimento dos membros e na padronizao do desenvolvimento do crebro. Captulos 3, 7 e 18. (Fotografia cortesia de E. Laufer, C.-Y. Yeo e C. Tabin.)
FOTOGRAFIA DA CONTRACAPA: Fotografia de um embrio de pinto
Do original: Developmental biology, Fifth Edition Copyrigth 1997 by Sinauer Associates, Inc. Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP) (Cmara Brasileira do livro, SP, Brasil) _____________________________________ Gilbert, Scott F., 1949Biologia do desenvolvimento / Scott F. Gilbert. -5. ed. -- Ribeiro Preto, SP : FUNPEC Editora, 2003. Ttulo original : Developmental biology Vrios tradutores e revisores. Bibliografia. ISBN 85-87528-61-0 1. Biologia do desenvolvimento I. Ttulo. 03-4459 CDD-571.8 _____________________________________ ndices para catlogo sitemtico: 1. Bilogia do Desenvolvimento: Cincias da vida 571.8 Direitos para a lngua portuguesa cedidos pela Sinauer Associates, Inc. para a Fundao de Pesquisas Cientficas de Ribeiro Preto que se reserva a propriedade desta traduo. Proibida a reproduo dos textos originais, mesmo parcial e por qualquer processo, sem autorizao da editora.

de 20-21 dias nos estgios de pipping (bicando a casca internamente) e pr-ecloso. Note o revestimento peridrmico proeminente na extremidade do bico (dente do ovo), usado pelo pinto para fazer buracos na casca do ovo, a qual se tornou mais fina e mais quebradia, como uma conseqncia da utilizao de minerais pelo embrio para seu crescimento esqueltico. Esse estgio desenvolvimental marca a transio do embrio em um pinto que respira ar. Captulos 1 e 5. (Fotografia do International Poultry Journal, cortesia de R. Tuan.)

As pginas de ttulo
PGINA ESQUERDA: A expresso gnica gera limites nos discos imagi-

nais da Drosophila. Os discos grandes e pequenos dentro da larva da mosca formam as asas e os halteres, respectivamente, no adulto. Nesse estgio, a protena Apterous (vermelho) expressa somente nos compartimentos dorsais; a protena Cubitus interruptus (azul) marca os compartimentos anteriores (mas no os posteriores) (uma linha formando esse limite pode ser observada). A colorao verde (originria da protena Vestigial) no interior demarca o limite entre o membro livre e a articulao ligando-o parede torcica. Captulo 19. (Fotografia cortesia de J. Williams, S. Paddock e S. Carroll.)
PGINA DIREITA: Expresso do gene paraxis no embrio de pinto no

estgio de 6 somitos. Hibridizao in situ da montagem total usando RNA marcado com digoxygenin complementar a uma poro da mensagem paraxis do pinto mostra a expresso desse gene durante a formao do somito. A protena Paraxis importante no estabelecimento da estrutura desses grupos mesodrmicos. Captulos 2 e 9. (Montagem fotogrfica cortesia de R. Tuan.)

Para Daniel, Sarah, e David

Tabela de Contedos

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento


Introduo ao desenvolvimento animal 1
O objetivo da biologia do desenvolvimento 1 Os problemas da biologia do desenvolvimento 2 Os estgios do desenvolvimento animal 3 Nossa herana eucaritica 5 Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares 6
Controle da Morfognese no Desenvolvimento em Acetabulria 6 Diferenciao em Ameboflagelados Naegleria 10 As Origens da Reproduo Sexual 12

Genes e desenvolvimento: Introduo e tcnicas 35


As origens embriolgicas da teoria dos genes 35

Ncleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade? 35 O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e Desenvolvimento 37

A ciso entre a embriologia e a gentica 38 Primeiras tentativas da gentica do desenvolvimento Evidncia para a equivalncia genmica 40

39

Eucariotos coloniais: A evoluo da diferenciao


As Volvocaceanas 16

16

Informaes adicionais & Especulaes


Sexo e Individualidade em Volvox 18 Diferenciao e Morfognese em Dictyostelium 21

Metaplasia 40 Clonagem de Anfibios: A Restrio da Potncia Nuclear 42 Clonagem de Anfbios: A Pluripotncia de Clulas Somticas 43

Informaes adicionais & Especulaes


Clonando Mamferos por Prazer e Lucro 45

Informaes adicionais & Especulaes


Evidncia e Anticorpos 25 27

Informaes adicionais & Especulaes


Como o Grex Sabe Qual Lado Est Para Cima

Sobre E.coli e elefantes: O modelo operon Sntese diferencial de RNA 49

47

Hibridizao de cido nuclico Seqenciamento de DNA 59

54
58

Padres desenvolvimentais entre metazorios


Os Porferos 29 Protostomatas e Deuterostomatas 30

28

Clonagem de DNA genmico 55 Hibridizao de DNA: entre e intra espcies

Anlise de mRNA atravs de bibliotecas de cDNA 61 Tcnicas de localizao de RNA 63


Hibridizao In Situ 63 Transferncias Northern 64

Tabela dos Contedos

vii

Encontrando mensagens raras pela reao da polimerase em cadeia 66 Determinando a funo do gene: clulas e organismos transgnicos 69
Tcnicas de insero de DNA novo em uma clula 69 Camundongos quimricos 70 Experimentos com genes com endereamento (Gene targeting ou Knockout) 70

Identificando molculas de adeso celular e seu papel no desenvolvimento 92 Caderinas 92 CAMs da superfamlia de imunoglobulinas 95

Molculas da juno celular: protenas da juno em fenda 97 A base molecular da afinidade clula-substrato 99
Afinidade diferencial a substrato 99 A matriz extracelular 99 Receptores celulares para molculas da matriz extracelular 104 Adeso diferencial resultante de sistemas de adeso mltipla 106

Determinando a funo de uma mensagem: RNA antisense 73 Reinvestigao de velhos problemas com novos mtodos 73 Uma concluso e um alerta 75

Base celular da morfognese: Afinidade celular diferencial 79


Afinidade celular diferencial 80
O modelo termodinmico de interaes celulares

3
84

Molculas de receptores e vias de transduo de sinais 107


A via JAK-STAT 107 A via RTK-Ras 108

Informaes adicionais & Especulaes


Evidncia para o modelo termodinmico 87
88

Informaes adicionais & Especulaes


Mutaes negativas dominantes em receptores 110 A via do inositol fosfato 111 Cruzamentos entre vias 112 A matriz extracelular e a superfcie da clula como fontes de sinais crticos para o desenvolvimento 112 Interaes recprocas na superfcie celular 113

A base molecular das adeses clula-clula Informaes adicionais & Especulaes

88

As classes de molculas de adeso celular

Anticorpos monoclonais e gentica reversa

89

Molculas de adeso celular

92

PARTE II Padres de Desenvolvimento


Fertilizao: Iniciando um novo organismo 121
Estrutura dos gametas
Espermatozide O vulo 125

Preveno da Polispermia

140

Informaes adicionais & Especulaes


A Ativao do Metabolismo dos Gametas 147

121
121

Ativao do metabolismo do vulo


Respostas precoces 149 Respostas tardias 151 Fuso do material gentico

149

Reconhecimento do vulo e do espermatozide: Ao distncia 128


Atrao do Espermatozide 128 Ativao Espermtica: A Reao Acrossmica no Ourio-do-Mar 129

152

Informaes adicionais & Especulaes


A No-Equivalncia dos Proncleos de Mamferos 154

Rearranjo do citoplasma do vulo


Preparao para a Clivagem

156
158

Informaes adicionais & Especulaes


Ao Distncia: Gametas de Mamferos 131
Reconhecimento do vulo e espermatozide: Contato de gametas 132 Reconhecimento Espcie-Especfico em Ouriosdo-Mar 132 Ligao de Gametas e Reconhecimento em Mamferos 135

Clivagem: Criando multicelularidade 167


PADRES DE CLIVAGEM EMBRIONRIA 168 Clivagem holoblstica radial 169
A holotria, Synapta Ourio-do-Mar 170 Anfbios 173 169

Fuso de gametas e a preveno da polispermia


Fuso entre as membranas do vulo e do espermatozide 139

139

Clivagem holoblstica espiral

175

viii

Tabela dos Contedos

Informaes adicionais & Especulaes


Adaptao pela modificao da clivagem embrionria 178 Clivagem Holoblstica Bilateral 179

Mecanismos de gastrulao em aves

238

Gastrulao em mamferos

242

Clivagem holoblstica rotacional


Compactao 181

180

Modificaes para desenvolvimento dentro de outro organismo 242 Formao de membranas extra-embrionrias 245

Informaes adicionais & Especulaes


A Superfcie da Clula e o Mecanismo de Compactao 184 Formao da massa celular interna 185 Fuga da Zona Pelcida 185

Incio do desenvolvimento vertebrado: Neurulao e ectoderma 253


FORMAO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Neurulao: aspectos gerais 254
186

254

Informaes adicionais & Especulaes


Gmeos e clulas embrionrias precursoras

Clivagem Meroblstica

188

Clivagem discoidal 189 Clivagem Superficial 192

Informaes adicionais & Especulaes


Excees, Generalizaes, e Clivagem Parastica da Vespa 195

Neurulao primria 255 A mecnica da neurulao primria 257 A formao da placa neural 257 Formao do assoalho da placa neural 258 A modelagem e dobramento da placa neural 259 Fechamento do tubo neural 260

Informaes adicionais & Especulaes


A modelagem dorsoventral do sistema nervoso 264

MECANISMO DE CLIVAGEM 196 Regulando o ciclo da clivagem

196
197

Neurulao secundria 264 Diferenciao do tubo neural

265
265

Fator promotor de maturao

Formao das regies do crebro

Informaes adicionais & Especulaes


MPF e Seus Reguladores 198

Informaes adicionais & Especulaes


Determinando as regies do crebro anterior e crebro mdio 268 Arquitetura de Tecido no Sistema Nervoso Central 270 Organizao do cerebelo 272 Organizao cerebral 274

O mecanismo citoesqueltico da mitose 201 A formao de novas membranas 203

Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias 209


Gastrulao em ourio-do-mar 210

Tipos de neurnios 276 Desenvolvimento do olho em vertebrados

279

Ingresso do Mesnquima Primrio 210 Primeiro estgio da invaginao do arquntero 215 Segundo e terceiro estgios da invaginao do arquntero 217

Dinmica do desenvolvimento tico 279 Diferenciao da retina neural 280

Informaes adicionais & Especulaes


Porque os bebs no enxergam bem Diferenciao do cristalino e da crnea 282 283

Gastrulao em peixes

218

A transio da blstula intermediria e a aquisio de motilidade celular 218 Formao das camadas germinais 220

A CRISTA NEURAL 284 A crista neural e seus derivados A crista neural do tronco 285

284

Gastrulao de anfbios

221

Movimentos celulares durante a gastrulao de anfbios 221 Posicionando o blastporo 224 Movimentos celulares e a construo do arquntero 226 Migrao do mesoderma involutivo 229

Vias de migrao das clulas da crista neural do tronco 285 A matriz extracelular e a migrao da crista neural do tronco 287

Informaes adicionais & Especulaes


Anlise das mutaes que afetam o desenvolvimento das clulas da crista neural 290

Informaes adicionais & Especulaes


Reguladores moleculares do desenvolvimento: Fibronectinas e as vias da migrao mesodrmica 230 Epibolia do ectoderma 232

A potncia do desenvolvimento das clulas da crista neural do tronco 291


Diferenciao final das clulas da crista neural 292

A crista neural ceflica

293

Gastrulao em aves

233
233

Generalidades sobre gastrulao em aves

Vias migratrias das clulas da crista neural ceflica 293 Potncia de desenvolvimento das clulas da crista neural ceflica 295

Tabela dos Contedos

ix

A crista neural cardaca 296 A EPIDERME E A ORIGEM DAS ESTRUTURAS CUTNEAS


A origem das clulas epidrmicas Apndices cutneos 299 297

297

Concluses

300

Incio do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma 341

Especificidade axnica 307


A gerao da diversidade neuronial 307
Especificao do Neurnio Motor de Vertebrado Especificao dos Neurnios Motores em Drosophila 310

8
308

MESODERMA 341 Mesoderma dorsal: A notocorda e a diferenciao dos somitos 341


Mesoderma Paraxial 341 Somitmeros e a Iniciao da Formao do Somito 343 Gerao de Tipos de Clulas Somticas 344 Miognese: Diferenciao do Msculo Esqueltico 347

Formao de padres no sistema nervoso 312 Seleo de trajetrias: Orientao pela matriz extracelular 313
Orientao pelo Terreno Fsico: Orientao por Contato 313 Orientao para Gradientes de Adeso: Haptotaxia 314 Conduo por Sinais Migratrios especficos do Axnio: A Hiptese das Trajetrias Marcadas 315 Orientao pela Repulso Especfica de Cones de Crescimento 317

Informaes adicionais & Especulaes


Construo Muscular e a Famlia MyoD de Reguladores Transcricionais 349 Osteognese: O Desenvolvimento dos Ossos 351

Informaes adicionais & Especulaes


Controle da Condrognese na Placa de Crescimento 357

Mesoderma da Placa Lateral

358

Informaes adicionais & Especulaes


Sexo,Odor e Adeso Especfica 319

Seleo de trajetria: Orientao por molculas difusveis 320 Sinais para conduo mltipla 323
Neurnios Motores Vertebrados Axnios da Retina 325 323

Formao das Membranas Extra-Embrionrias 359 O Corao 361 Formao dos vasos sangneos

366

Informaes adicionais & Especulaes


Redirecionando o Fluxo Sangneo no Mamfero Recm-nascido 372

O Desenvolvimento de clulas sangneas

373

Selees de alvos

326

Especificidades Adesivas em Diferentes Regies do Tectum 328

Seleo de endereo: Desenvolvimento dependente de atividade 331 Sobrevivncia diferencial aps a inervao: Fatores neurotrficos 331 Informaes adicionais & Especulaes
Neurnios Fetais em Hospedeiros Adultos 334

O Conceito de Clula-tronco 373 Clulas-tronco Pluripotenciais e Microambientes Hematopoticos 374 Desenvolvimento Osteoclstico 377 Locais de Hematopoiese 378

ENDODERMA 380 Faringe 380 O tubo digestivo e seus derivados

382
382

O desenvolvimento de comportamentos: constncia e plasticidade 334

Fgado, Pncreas e Vescula Biliar O Tubo Respiratrio 383

Tabela dos Contedos

PARTE III Mecanismo da Diferenciao Celular


Regulao transcricional da expresso gnica: Fatores de transcrio e a ativao de promotores especficos 391
xons e ntrons 392 Estrutura e funo do promotor
Estrutura do promotor 396 Funo do promotor 397

10

Ruptura e reorganizao de nucleossomos: o papel dos complexos de ruptura 436 Ruptura e reorganizao de nucleossomos: o papel da competio de histonas 437

Regies de controle de loco: transcrio do gene da globina 437 Informaes adicionais & Especulaes
Trocas no gene de globina 440

394

Metilao de DNA e atividade gnica

442

Informaes adicionais & Especulaes


RNA polimerase e os fatores trans-reguladores no promotor 399

Correlaes entre metilao do promotor e inatividade gnica 442 Metilao e a manuteno dos padres de transcrio 443

Estrutura e funo dos intensificadores

402

Informaes adicionais & Especulaes


Metilao e impresso gnica 444

Necessidade de intensificadores 402 Funo do intensificador: Modelos temporais e espaciais de transcrio 403

Fatores de transcrio: Os trans-reguladores dos promotores e dos intensificadores 404


Protenas de homeodomnio 405 Os fatores de transcrio POU 406

Compensao de dosagem do cromossomo X de mamferos 446 Informaes adicionais & Especulaes


O mecanismo de inativao do cromossomo X 449

Associao do DNA ativo com a matriz nuclear

451

Informaes adicionais & Especulaes


Regulao da transcrio dos genes de cadeia leve das imunoglobulinas 409 Fatores de transcrio bsicos do tipo hlice-alahlice 415

Ligao da cromatina ativa a uma matriz nuclear 451 Topoisomerases e a transcrio gnica 453 Isoladores e domnios 454 Resumo 455

Informaes adicionais & Especulaes


Regulando as protenas bHLH miognicas: Governando a troca entre proliferao e diferenciao de clulas musculares 416 Fatores de transcrio do zper bsico da leucina 416

Controle do desenvolvimento pelo processamento e traduo diferencial do RNA 461

12

Informaes adicionais & Especulaes


Armadilhas do intensificador: natural e experimental 418 Fatores de Transcrio Dedo de Zinco 420 Receptores Nucleares de Hormnios e Seus Elementos Responsivos a Hormnios 420

CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO PELO PROCESSAMENTO DIFERENCIAL DE RNA 461 Controle do desenvolvimento precoce pela seleo de RNA nuclear 462 Os mecanismos de emenda de RNA: Spliceosomes 465 Emenda alternativa do RNA: Criando protenas alternativas a partir do mesmo gene 466
Um gene, Muitas Protenas Relacionadas 466 Processamento Alternativo de RNA e Determinao Sexual em Drosophila 468 Uso Disseminado do Processamento de RNA para o Controle da Expresso Gnica 471

Protenas que dobram o DNA 423 Ativao dependente de contexto ou silenciamento 423 Regulao da atividade do fator de transcrio 425

Regulao transcricional da expresso gnica: A ativao da cromatina 431


Acessibilidade a fatores trans-reguladores Stios hipersensveis DNAase I 434

11
431
432

Nucleossomos e a ativao da cromatina reprimida

REGULAO DA TRADUO DOS PROCESSOS DESENVOLVIMENTAIS 471 Mecanismos da traduo eucaritica 472 Controle da sntese protica pela longevidade diferencial do mRNA 474
Degradao Seletiva de mRNAs 475

Controle da traduo de mensagens do ocito

476

Tabela dos Contedos

xi

Caracterizao de RNAs Mensageiros Armazenados em Ocitos 477

Informaes adicionais & Especulaes


A Ativao do Genoma Embrionrio 488

Informaes adicionais & Especulaes


Determinando o Destino Celular por Meio do mRNA Localizado do Ocito 480

Regulao dos genes da traduo em larvas e adultos 490


Determinao de Gametas em C. elegans 490 RNA Antisenso Natural 491 Disjuntores do Controle da Traduo 492 Editorao do RNA 493

Mecanismos para a regulao da traduo das mensagens dos ocitos 481


A Hiptese da Mensagem Materna Mascarada 482 A Hiptese da Cauda Poli(A) 483 A Hiptese da Eficincia da Traduo 486 Outros sistemas de ativao do mRNA: Mensagens sem Cap e Mensagens Seqestradas 486

Controle da traduo e sntese protica coordenada: Produo de Hemoglobina 494 Eplogo: Regulao Ps-traduo 497

PARTE IV Especificao do Destino Celular e os


Eixos Embrionrios
Especificao celular autnoma por determinantes citoplasmticos 505
Comprometimento celular e diferenciao Pr-formao e epignese 507
Os Teratologistas Franceses 509

13
510

A gentica da especificao axial em Drosophila 543

14

505

Especificaes autnomas em embries de tunicados

Resumo do desenvolvimento de Drosophila 543 AS ORIGENS DA POLARIDADE NTERO-POSTERIOR 545 Viso Panormica 545 Os genes de efeito materno 546
Evidncia Embriolgica da Regulao da Polaridade pelo Citoplasma do Ocito 546 O Modelo Molecular: Gradientes Proticos no Embrio Precoce 547

O determinante formador de msculos do crescente amarelo 511 Especificao citoplasmtica das linhagens endodrmicas e epidrmicas e o eixo nteroposterior 514

Informaes adicionais & Especulaes


Modelos de Gradientes da Informao Posicional 551 Evidncia que o Gradiente da Protena Bicoid Constitui o Centro de Organizao Anterior 552 O Centro de Organizao Posterior: Localizando e Ativando o Produto de nanos 556 O Grupo Gene Terminal 557

Localizao citoplasmtica em embries de moluscos 515


O lbulo polar 517

Especificao celular no nematdeo Caenorhabditis elegans 521


Controle maternal da identidade do blastmero: O controle gentico das clulas progenitoras farngeas de C. elegans 524 Regulao em C. elegans 527

Os genes da segmentao

559

Informaes adicionais & Especulaes


Ser ou No Ser: Esse o Fentipo 529

Divises celulares assimtricas no desenvolvimento tardio 530 Localizao citoplasmtica de determinantes de clulas germinativas 531
Determinao de clulas germinativas em nematdeos 531 Determinao da clula germinativa em insetos Componentes do plasma polar da Drosophila Determinao de clulas germinativas em anfbios 536

Uma Viso Panormica 559 Os Genes de gap 561 Os Genes pair-rule 563 Os Genes de Polaridade Segmentar

565

Os genes de Seleo hometica

569

532 534

Padres de Expresso dos Genes Hometicos 569 Iniciando os Padres da Expresso dos genes Hometicos 572 Mantendo os Padres de Expresso dos genes Hometicos 572 Os Elementos Cis-Reguladores e o Complexo Bithorax 574

Resumo

538

xii

Tabela dos Contedos

Informaes adicionais & Especulaes


Regulao Molecular do Desenvolvimento: As Protenas do Homeodomnio 576

Induo de especificidade mesodrmica ventral e lateral 612

A criao da atividade do organizador

613
613

A GERAO DA POLARIDADE DORSOVENTRAL EM DROSOPHILA 577 A protena Dorsal: Morfgeno para a polaridade dorsoventral 577
Translocao da Protena Dorsal 577

Protenas secretadas do organizador

Informaes adicionais & Especulaes


BMP4 e a lagosta de Geoffroy 616 Fatores de transcrio induzidos no organizador 619

Provendo o sinal assimtrico para a translocao da protena Dorsal 578


Sinal do Ncleo do Ocito para as Clulas Foliculares 578 Sinalizao das Clulas Foliculares para o Citoplasma do Ocito 580 O Estabelecimento do Gradiente da Protena Dorsal 581

Informaes adicionais & Especulaes


Como o Organizador Neuraliza o Ectoderma? 621

A especificidade regional de induo

621
621

A determinao das diferenas regionais O modelo do duplo gradiente 623 Correlatos moleculares da caudalizao neural 624

PRIMRDIOS DE RGOS E EIXOS 585 O modelo de coordenadas cartesianas e a especificao dos primrdios dos rgos 585 Resumo: Alguns princpios do desenvolvimento da Drosophila 586

Informaes adicionais & Especulaes


Sinais verticais e horizontais do organizador 626 Genes homeobox na especificao neural 628

Competncia e cascatas indutivas 628

Especificao do destino celular por interaes clula-clula progressivas 591


Desenvolvimento regulativo 591 Testando a teoria do plasma germinativo 592

15

Estabelecimento dos eixos corporais em mamferos e aves 635


Iniciando o eixo ntero-posterior 635

16

August Weismann: A teoria do plasma germinativo 592 Wilhelm Roux: Desenvolvimento em mosaico 593 Hans Driesch: Desenvolvimento Regulativo 594 Sven Hrstadius: Potncia e gradientes em ocitos 597 Formao de um organismo integrado: Restringindo a potncia das clulas vizinhas 598

Estabelecendo um Centro de Nieuwkoop 635 Expresso Gnica em Tecidos Organizadores 636

Especificando o eixo ntero-posterior de mamfero: A hiptese do cdigo Hox 637


Homologia dos Complexos de Genes Hometicos entre Drosophila e Mamferos 637 Expresso de Genes Hox no Sistema Nervoso Central e seus Derivados 638 Anlise Experimental de um Cdigo Hox: Gene Alvo 640 Transformao Parcial de Segmentos por Eliminao de Genes Hox Expressos no Tronco 642 Anlise Experimental do Cdigo Hox: Teratognese do cido Retinico 643 Evidncia para um Cdigo Hox da Anatomia Comparada 645

Regulao durante o desenvolvimento de anfbios

600

Hans Spemann: Determinao progressiva das clulas embrionrias 600 Hans Spemann e Hilde Mangold: Induo embrionria primria 603

O centro de Nieuwkoop

606

A formao do centro de Nieuwkoop e a polaridade mesodrmica 606 A especificao da polaridade dorsoventral na fertilizao 607

Informaes adicionais & Especulaes


Animais como Variaes sobre o Mesmo Tema Desenvolvimental 646

A base molecular da induo mesodrmica

609

Estabelecendo a regionalizao dorsal: o possvel papel da -catenina 609 O funcionamento do centro de Nieuwkoop: funes para Vg1 e Noggin 610

Eixos dorsoventral e esquerdo-direito em mamferos e aves 647

Tabela dos Contedos

xiii

PARTE V Interaes Celulares Durante a


Formao do rgo
Interaes proximais de tecidos: Induo secundria 655
Interaes instrutivas e permissivas Competncia e receptores 656 Fatores parcrinos 657 655

17
658

de crescimento dos fibroblastos como indutores do broto do membro 704 Induo da crista ectodrmica apical 704

Produo do eixo prximo-distal dos membros

706

Os Fatores de Crescimento Fibroblstico A famlia hedgehog 659 A famlia Wnt 660 A superfamlia TGF- 661 Sinalizao Justcrina 662

A crista ectodrmica apical: O componente ectodrmico 706 A zona progressiva: O componente mesodrmico 708 Genes Hox e a especificao do eixo prximodistal do membro 709 Interaes entre a AER e a zona progressiva 711 Mutaes nas interaes entre a zona progressiva e a AER 711

Interaes epitlio-mesnquima

663
663 666 667 668

Informaes adicionais & Especulaes


A regenerao dos membros da salamandra e a reteno do eixo prximo-distal 714

Especificidade Regional da Induo Especificidade Gentica da Induo

Cascatas de induo embrionria: Induo do cristalino 667


Os Fenmenos da Induo do Cristalino A Base Celular da Induo do Cristalino Formao da Crnea 672

Especificao do eixo ntero-posterior dos membros 716


A zona de atividade polarizante 716 Sonic hedgehog como definidor da ZPA 717 Interaes entre a AER e a ZPA para integrar crescimento e padro 718 Especificando a ZPA 721

Formao de rgos parenquimatosos 672


Morfognese do Rim de Mamfero 673 Os Mecanismos da Organognese Renal 676

Informaes adicionais & Especulaes


Diferenciao Coordenada e Morfognese no Dente 682

A produo do eixo dorsoventral 721 Distinguindo o membro anterior do membro posterior 722 Informaes adicionais & Especulaes
Lies de limbless 724

Mecanismos de ramificao na formao de rgos parenquimatosos 683


A Matriz Extracelular como um Elemento Crtico na Ramificao 684 Fatores Parcrinos Efetuando Padres de Ramificao 686

Morte celular e a formao de dgitos 724 Informaes adicionais & Especulaes


Evoluo do membro tetrpode 726

Induo ao nvel de uma nica clula

687

Induo Vulvar no Nematide Caenorhabditis elegans 690

Interaes celulares distncia: Hormnios como mediadores do desenvolvimento 733


Metamorfose: o direcionamento hormonal do desenvolvimento 733 Metamorfose anfbia 734

19

Informaes adicionais & Especulaes


Interaes Clula-Clula e Possibilidade na Determinao de Tipos Celulares 692

Desenvolvimento do membro de tetrpode 701


Padronizao no membro 701 Formao do broto do membro 702

18

Controle hormonal da metamorfose de anfbios 735 Respostas Moleculares aos Hormnios da Tireide Durante a Metamorfose 740

Informaes adicionais & Especulaes


Heterocronia 743

Metamorfose em insetos

746
746

O campo do membro 702 Especificao dos campos do membro: Genes Hox e cido retinico 703 Crescimento do broto de membro precoce: fatores

Everso e Diferenciao dos Discos Imaginais

Informaes adicionais & Especulaes


A determinao dos discos imaginais da perna e da asa 750 Remodelao do sistema nervoso 753

xiv

Tabela dos Contedos

Controle Hormonal da Metamorfose de Insetos


A biologia Molecular da Atividade da Hidroxiecdisona 757

754

Hermafroditismo

795
795

Hermafroditismo no Nematide C. elegans Hermafroditismo em Peixes 797

Informaes adicionais & Especulaes


Controle ambiental sobre a forma e a funo da larva 761

Determinao ambiental do sexo

798

Interaes hormonais mltiplas no desenvolvimento da glndula mamria 762


Estgio embrionrio Adolescncia 765 Gravidez e lactao 762 765

Determinao Sexual Dependente de Temperatura em Reptis 798 Determinao Sexual Dependente da Localizao em Bonellia viridis e Crepidula fornicata 799

Resumo

800

Determinao do sexo 773


Determinao Sexual Primria 774 Determinao Secundria do Sexo 774 As Gnadas em Desenvolvimento 775

20

Regulao ambiental do desenvolvimento animal 805

21
806

Determinao cromossmica do sexo em mamferos 774

REGULAO AMBIENTAL DO DESENVOLVIMENTO NORMAL Sugestes ambientais usadas pelos organismos para completar seus desenvolvimentos 806
A colonizao larval 806 Refeies de sangue 808 Simbiose no desenvolvimento

Determinao sexual primria dos mamferos: Genes cromossmicos Y para a determinao dos testculos 777
SRY: O Determinante Sexual do Cromossomo Y 778

808

Diferenas ambientais previsveis como sugestes para o desenvolvimento 810


Sazonalidade e sexo: Afdios e Volvox Diapausa 812 810

Determinao sexual primria em mamferos: Genes autossmicos na determinao de testculos 780


SOX9: Reverso Autossmica na Displasia Campomlica 780 SF1: A Ligao Entre SRY e as Trajetrias Desenvolvimentais Masculinas 780

Plasticidade fenotpica: Polifenismo e regras de reao 813


Polifenismo sazonal em borboletas 814 Polifenismo nutricional 816 Determinao sexual dependente do ambiente

Determinao sexual primria em mamferos: Desenvolvimento ovariano 781


DAX1: Um Potencial Gene Determinante de Ovrio no Cromossomo X 781 Wnt4a: Um Potencial Gene Determinante de Ovrio em um Autossomo 781

817

Fatores ambientais imprevisveis controlando o desenvolvimento animal 818


Defesas induzveis contra a predao 819 Plasticidade fenotpica e mudanas no ambiente 820

Informaes adicionais & Especulaes


Assimilao Gentica 821

Determinao sexual secundria em mamferos


Regulao Hormonal do Fentipo Sexual Testosterona e Diidrotestosterona 783 Hormnio Anti-Mlleriano 784 O Sistema Nervoso Central 785

782
782

A contnua plasticidade do desenvolvimento

822

O sistema imune: Desenvolvimento no adulto 822 Aprendizado: Um sistema nervoso adaptvel ao ambiente 823

Informaes adicionais & Especulaes


O Desenvolvimento de Comportamentos Sexuais 787

DISTRBIOS AMBIENTAIS DO DESENVOLVIMENTO NORMAL Malformaes e distrbios 827 Agentes teratognicos 828
cido retinico como um teratognico 829 Talidomida como um teratognico 830 lcool como um teratognico 833 Outros agentes teratognicos 835

827

Determinao sexual cromossmica em Drosophila 788


A Via do Desenvolvimento Sexual 788 O Gene Sex-lethal como o Piv para a Determinao do Sexo 790 Os Genes transformer 793 doublesex: O Gene Comutador da Determinao Sexual 793 Genes-alvo para a Cascata de Determinao Sexual 794

Informaes adicionais & Especulaes


Estrgenos Ambientais 836

Interaes gentica-ambiental Resumo 837

837

Tabela dos Contedos

xv

A saga da linhagem germinativa 843


Migrao das clulas germinativas 843
Migrao das Clulas Germinativas em Anfbios 843 Migrao das Clulas Germinativas em Mamferos 844

22

Mecanismos desenvolvimentais da mudana evolucionria 883


Unidade de Tipo e Condies de Existncia
A Sntese de Charles Darwin 883 E. B.Wilson e F. R. Lillie 885

23
883

A evoluo do desenvolvimento precoce: E. Pluribis Unum 885


A emergncia dos embries 885 Formao de um Novo Filo: Modificando os Caminhos do Desenvolvimento 887

Informaes adicionais & Especulaes


Teratocarcinomas e Clulas-Tronco Embrionrias 847 Migrao de Clulas Germinativas em Aves e Rpteis 848 Migrao de Clulas Germinativas Primordiais em Drosophila 849

Modularidade: O pr-requisito para mudana evolutiva atravs do desenvolvimento 891


Modularidade 891 Dissociao: Heterocronia e Alometria Duplicao e Divergncia 893 Co-opo 894 Progresso correlacionada 896 891

Meiose 850 Informaes adicionais & Especulaes


Grandes Decises: Mitose ou Meiose? Espermatozide ou vulo? 853

Restries ao desenvolvimento

898

Espermatognese

855
857

Espermiognese

Informaes adicionais & Especulaes


Expresso Gnica Durante o Desenvolvimento do Espermatozide 858

Restries Fsicas 898 Restries Morfogenticas 898 Restries Filticas 899 Evoluo Conjunta do Ligante e Receptor: Isolamento Reprodutivo 901

Oognese

860

Meiose oognica 860 Maturao do Ocito em Anfibios 861 Concluso da meiose: Progesterona e Fecundao 864 Transcrio Gnica em Ocitos 865 Oognese Merostica em Insetos 867

O mecanismo gentico do desenvolvimento da mudana evolucionria: Genes reguladores homlogos 902


Pax6 e o desenvolvimento do olho 902 BMP4 e a Morfognese dos Membros 904 Genes Hox e a Evoluo dos Vertebrados 905 Genes Hox e a Evoluo dos Artrpodes 907 Caminhos homlogos do desenvolvimento 909

Informaes adicionais & Especulaes


A Origem dos Eixos Embrionrios de Drosophila Durante a Oognese 869 Oognese em Mamferos 870

Criando novos tipos de clulas: O mistrio evolucionrio bsico 911 Uma nova sntese evolucionria 912

Informaes adicionais & Especulaes


O Reincio da Meiose nos Ocitos de Mamferos 875

Fontes Para as Citaes das Aberturas dos Captulos C-1 ndice de Autores IA-1 ndice de Assuntos IA-2 ndice de Abreviaturas IA-3

Prefcio

s ltimos anos do sculo 20 encontram a biologia do desenvolvimento retornando posio que ela ocupou no incio do sculo: a disciplina que unifica os estudos da hereditariedade, evoluo e fisiologia. Em 1896, a primeira edio de B. Wilson do The Cell in Development and Inheritance anunciou a verdade maravilhosa que uma nica clula pode conter em seu interior sua extenso microscpica da soma-total da herana das espcies. Hoje, a biologia do desenvolvimento est na vanguarda desse estudo de nossa herana natural. Nos seus aspectos moleculares, ela toca a qumica fsica na sua investigao dos mecanismos bioqumicos pelos quais protenas diferentes so produzidas em clulas diferentes do mesmo genoma. Ela tambm est na liderana dos estudos evolucionrios que procuram entender como mudanas macroevolucionrias ocorreram. Ela abriu recentemente uma rea nova da biologia do desenvolvimento ecolgico, onde mudanas ambientais so vistas criando alteraes no desenvolvimento do organismo. Durante os ltimos 3 anos, a biologia do desenvolvimento tambm expandiu para a medicina, fundindo-se com a gentica clnica para criar uma cincia revitalizada da embriologia humana, uma cincia que j se tornou importante na explanao das malformaes congnitas. A quinta edio do Biologia do Desenvolvimento foi revisada e reescrita para refletir essas revolues que esto acontecendo. Aconteceram quatro mudanas importantes na estrutura do livro desde sua ltima edio. Primeiro, tornou-se impossvel discutir os princpios fundamentais da embriologia sem o conhecimento da atividade gnica ou vias da transduo de sinais. Portanto, essa informao foi trazida dentro da seo introdutria do livro de modo que interaes celulares, tais como fertilizao e induo, podem ser apreciadas tanto no mbito molecular quanto no morfolgico. Segundo, novo interesse nos efeitos do ambiente no desenvolvimento normal e anormal conduziu a um novo captulo. O Captulo 21, Regulao Ambiental do Desenvolvimento Animal, diz respeito s vias pelas quais o meio ambiente afeta o fentipo do organismo. Interesse na proteo ambiental e em controvrsias envolvendo a possibilidade de poluentes teratognicos foraram uma nova percepo das influncias que o meio ambiente representa no desenvolvimento normal e anormal. Na verdade, os biologistas do desenvolvimento podem rapidamente encontrar-se frente dos movimentos da conservao ecolgica. As primeiras quatro edies deste livro buscaram integrar abordagens molecular, celular e orgnica biologia do desenvolvimento; esta edio adiciona a dimenso ecolgica. Terceiro, esta edio introduz novas nfases nos papis dos fatores parcrinos no desenvolvimento. No somente os estudos da transduo de sinais esto colocados na seo introdutria deste livro, como a Parte V

Prefcio

xvii

da Quinta Edio inicia com uma viso geral das famlias do fator de crescimento fibroblstico, TGF-, Wnt e Hedgehog dos fatores de crescimento e diferenciao. Quarto, este livro est conectado a um website onde estudantes e professores podem encontrar mais material em muitos tpicos selecionados. Tal material inclui (1) detalhes de experimentos que so extremamente especializados para serem colocados no texto, (2) informao histrica sobre reas particulares da biologia do desenvolvimento e personalidades envolvidas, (3) implicaes mdicas de fenmenos particulares do desenvolvimento, (4) debates ou comentrios em questes relevantes para o campo, e (5) atualizaes do material do texto nessa rea da biologia de crescimento cada vez mais rpido. Filmes e entrevistas gravadas esto includas e esses artigos de destaque podero ser expandidos medida que a tecnologia os tornar mais fceis para serem usados. Esse website est conectado tambm a outros websites e podem ser usados para enriquecer a perspectiva de algum sobre o que est acontecendo no desenvolvimento animal. A presena de um website nos permite manter o direcionamento deste livro s pessoas para as quais isso foi originalmente pretendido: estudantes dos ltimos anos da graduao e do incio da ps-graduao. Ele tambm me ajudou a no deixar o livro tornar-se um substituto para peso de papel. A viso de Roux foi que a biologia do desenvolvimento algum dia constituiria a base de todas as outras disciplinas biolgicas e, em continuada simbiose com essas disciplinas, desempenharia uma parte proeminente nas solues dos problemas da vida. Essas foram palavras audaciosas, at mesmo arrogantes h cem anos atrs; hoje, elas expressam uma aceitao amplamente sustentada. O desenvolvimento integra todas as reas da biologia e desempenha um papel crucial em relacionar o gentipo ao fentipo. O desenvolvimento pode ser estudado usando qualquer organismo e em qualquer nvel de organizao, de molculas a filos. medida que o campo continuar a se expandir e se aprofundar , uma palavra de advertncia requerida: a biologia do desenvolvimento no pode ser aprendida ou ensinada em um nico semestre. Este texto uma tentativa para prover cada pessoa com material suficiente para seu curso, mas um instrutor no necessita se sentir culpado por no determinar todos os captulos, e os estudantes no necessitam se sentir privados se eles no lerem todos os captulos. Isto o comeo do caminho, no sua concluso.

Como usar o website


Qualquer pessoa pode entrar no website atravs de sua homepage [http://zygote.swarthmore.edu/index.html] ou atravs da sua lista de arquivos de captulos localizada no [http://zygote.swarthmore.edu/info.html]. Alternativamente, ns colocamos acessos especficos endereados em todo o livro onde quer que exista uma entrada relevante no momento da publicao. Todos esses endereos comeam com [http://zygote.swarthmore.edu/] e so seguidos por um cdigo dado no livro texto. Assim, a localizao especificada na pgina 20 do livro : http://zygote.swarthmore.edu/intro2.html Mais localizaes esto sendo adicionadas no website, e essas podem ser acessadas entrando nos arquivos do captulo. Em adio, clicando no boto Outros Arquivos abaixo de cada captulo, as conexes para outros websites sero facilitadas. Divirta-se.

xviii

Prefcio

Agradecimentos
Esta edio, como suas precursoras, deve muito s sugestes e crticas dos estudantes em minhas classes de biologia do desenvolvimento e gentica do desenvolvimento. O grupo de funcionrios e docentes extremamente corporativo da Universidade Swarthmore tambm desempenharam papis importantes na produo deste livro, e os bibliotecrios da rea de cincia E. Horikawa e M. Spencer merecem agradecimentos especiais por terem segurado volumes recentes na biblioteca enquanto eu estava escrevendo o livro. Os cientistas que revisaram estes captulos forneceram enorme ajuda tanto na preciso tcnica dos captulos quanto nas sugestes para trabalho futuro. Esses investigadores incluem: S. Carroll, J. CebraThomas, E. M. De Robertis, S. DiNardo, E. Eicher, C. Emerson, G. Grunwald, D. J. Grunwald, M. Hollyday, L. A. Jaffe, W. Katz, R. Keller, K. Kemphues, D. Kirk, G. Martin, H. F. Nijhout, D. Page, R. Raff, R. Schultz, C. Stern, S. Tilghman, R. Tuan e M. Wickens. Eu tambm quero agradecer aos muitos cientistas que desviaram do seu caminho para ajudar a tornar esta edio melhor lendo pores especficas dos captulos. Eles incluem: M. BronnerFraser, J. Fallon, N. M. Le Douarin, E. McCloud, J. Opitz, K. Sainio, H. Sariola, I. Thesleff e T. Valente. Se eu deixei algum fora, por favor me desculpem. desnecessrio dizer que os julgamentos editoriais finais foram de minha responsabilidade. Meus agradecimentos especiais a Judy Cebra-Thomas que no somente me aconselhou em certos captulos mas quem deu excelente ajuda durante meu perodo sabtico permitindo-me terminar este livro. Agradecimentos tambm aos cientistas e filsofos, especialmente: C. van der Weele, R. Amundson, L. Nyhart, R. Burian, H. F. Nijhout, A. F. Sterling, K. Smith e A. I. Tauber, que participaram nos workshops de biologia do desenvolvimento da Sociedade Internacional para a Histria, Filosofia e Estudos Sociais da Biologia. Algumas das melhores crticas construtivas deste livro-texto vieram dessas pessoas. Andy Sinauer uma vez mais conseguiu reunir as mesmas e extraordinrias pessoas neste projeto, e foi um privilgio trabalhar com eles. Meus agradecimentos a ele e aos editores Nan Sinauer e Carol Wigg, coordenador de produo Chris Small, artistas John Woolsey e Gary Welch, designer Susan Schmidler, editor de texto Janet Greenblatt, e artista de layout Janice Holabird. As habilidades editoriais de Tinsley Davis so extremamente reconhecidas. Devido ao fato de que os prazos finais devem ser cumpridos e outro trabalho posto de lado, eu tenho que agradecer minha famlia por mais uma vez me permitir prosseguir com isso. Em particular, este livro nunca poderia ter sido completado se no fosse pelo encorajamento de minha esposa, Anne Raunio, que, como uma obstetra, gosta do lado mais prtico da biologia do desenvolvimento. Meus agradecimentos a todos vocs.

SCOTT F. GILBERT 1 DE MARO DE 1997

Introduo Biologia do Desenvolvimento


1 Introduo ao desenvolvimento animal 1 35 79 2 Genes e desenvolvimento: Introduo e tcnicas 3 Base celular da morfognese: Afinidade celular diferencial

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

Introduo ao desenvolvimento animal

A natureza parece nunca mudar, ainda que sua aparncia esteja sempre mudando. nosso dever como artistas transmitir juntamente com todos os seus elementos a emoo dessa permanente transformao. Paul Cezanne (ca. 1900) Feliz a pessoa que consegue discernir as causas das coisas. Virglio (37 A.C.)

CONCEITO DE EMBRIO assombroso, e a formao de um embrio a

tarefa mais rdua que algum haver de realizar. Para se tornar um embrio, voc teve que construir a si mesmo a partir de uma nica clula. Teve que respirar antes que tivesse pulmes, digerir alimentos antes que seus rgos estivessem formados, construir ossos a partir de uma massa e ordenar os neurnios antes mesmo de adquirir a capacidade de pensar. Uma diferena marcante entre voc e a mquina que a mquina nunca requisitada para uma funo antes que esteja terminada. Todo animal tem que estar em funcionamento enquanto se auto-constri.

O objetivo da biologia do desenvolvimento


Para plantas e animais, o nico caminho para o desenvolvimento a partir de uma clula, desenvolvendo um embrio. O embrio o intermedirio entre o gentipo e o fentipo, ou seja, entre os genes herdados e o organismo adulto. Enquanto a maior parte da biologia estuda a estrutura adulta e funo, a biologia do desenvolvimento encontra maior interesse nos estgios mais transitrios. Biologia do desenvolvimento a cincia do vir a ser, a cincia do processo. Dizer que um inseto efmero vive apenas um dia no significa nada para um biologista do desenvolvimento, porque o inseto pode ser adulto apenas por um dia, mas passou outros 364 dias como um embrio e larva. As questes levantadas por um biologista do desenvolvimento so freqentemente questes mais ligadas ao vir a ser do que ao ser propriamente dito. Dizer que mamferos XX so geralmente fmeas e mamferos XY so geralmente machos, no explica a determinao sexual para um biologista do desenvolvimento. Esse quer saber como o gentipo XX produz um ser feminino e como o gentipo XY produz um ser masculino. Da mesma maneira, um geneticista gostaria de saber como os genes globina so transmitidos de uma gerao outra, e um fisiologista pode fazer perguntas sobre a funo da globina no corpo. Porm, o biologista do desenvolvimento pergunta porque os genes globina se expressam somente nas hemcias e como essas se tornam ativas apenas em certas fases do desenvolvimento (ainda no sabemos as respostas). Biologia do desenvolvimento uma cincia excelente para pessoas que querem integrar diferentes nveis da biologia. Diante de um problema, podemos estud-lo a 1

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

nveis molecular e qumico (p. ex., Como os genes globina so transcritos, e como os fatores que ativam sua transcrio interagem uns com os outros e com o DNA?), a nveis celular e tissular (p. ex., Quais so as clulas capazes de produzir globina, e como o mRNA da globina deixa o ncleo?), a nvel de rgos ou sistema de rgos (p. ex., Como vasos capilares so formados em cada tecido, e como so instrudos a se conectarem e ramificarem?) e, at mesmo, a nveis ecolgicos e evolucionrios (p. ex., Como diferenas na ativao do gene globina permitem o fluxo de oxignio da me para o feto, e como fatores ambientais acionam a diferenciao de mais hemcias?). Biologistas do desenvolvimento podem estudar qualquer organismo e todo tipo de clula. Biologia do desenvolvimento um dos campos que mais tem crescido e tambm um dos mais emocionantes da biologia. Parte dessa emoo vem dos assuntos estudados, porque estamos apenas comeando a entender o mecanismo molecular do desenvolvimento animal. Outra parte da emoo vem do papel unificador que a biologia do desenvolvimento assume nas cincias biolgicas. A biologia do desenvolvimento est criando uma estrutura que integra a biologia molecular, fisiologia, biologia celular, anatomia, pesquisa do cncer, neurobiologia, imunologia, ecologia, e biologia evolucionria. O estudo do desenvolvimento tornou-se essencial para a compreenso de qualquer rea da biologia.

Os problemas da biologia do desenvolvimento


O desenvolvimento realizado por duas funes principais: gera diversidade e ordem celular dentro de cada gerao, o que assegura a continuidade da vida que passa de uma gerao outra. Assim, existem duas questes fundamentais para a biologia do desenvolvimento: Como um ovo fertilizado origina um ser adulto, e como esse ser adulto produz um outro ser? Cada espcie tem suas prprias respostas, mas algumas generalizaes podem ser feitas. Tradicionalmente, essas questes tm sido subdivididas em quatro problemas gerais da biologia do desenvolvimento: O problema da diferenciao. Uma nica clula, o ovo fertilizado, se desenvolve e gera centenas de clulas de diferentes tipos - clulas musculares, clulas epidrmicas, neurnios, linfcitos, clulas do sangue, clulas gordurosas, e assim por diante. Essa gerao de diversidade celular chamada diferenciao. Desde que cada clula do corpo contm o mesmo conjunto de genes, precisamos entender como esse mesmo conjunto de instrues genticas pode produzir diferentes tipos de clulas. O problema da morfognese. Nossas clulas diferenciadas no so distribudas aleatoriamente; pelo contrrio, so organizadas em intrincados tecidos e rgos. Esses rgos esto dispostos de tal maneira que: dedos esto nas pontas e no no meio de nossas mos, os olhos esto na nossa cabea e no nos ps ou intestinos. Essa criao de forma ordenada, chamada morfognese. Como as clulas se auto-organizam e formam um arranjo correto? O problema do crescimento. Somos maiores do que um ovo, mas como as clulas sabem quando devem parar de se dividir? Se cada clula de nossa face realizasse mais uma diviso celular, seramos considerados horrivelmente mal formados. Se cada clula de nossos braos tivesse realizado apenas mais uma srie de divises, poderamos amarrar nossos sapatos sem nos abaixar. O problema da reproduo. O espermatozide e o vulo so clulas muito especializadas. Somente eles podem transmitir instrues para produzir um organismo de uma gerao para outra. Como essas clulas so separadas para formar a prxima gerao, e quais as informaes no ncleo e no citoplasma que permitem tal funcionamento? Recentemente, tem-se dado grande nfase a um quinto problema: O problema da evoluo. A evoluo envolve mudanas herdadas durante o desenvolvimento. Quando dizemos que o cavalo de um dedo s de hoje, teve um ancestral de cinco dedos, estamos dizendo que mudanas no desenvolvi-

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

mento da cartilagem e dos msculos ocorreram ao longo de muitas geraes de embries nos ancestrais do cavalo. Como mudanas no desenvolvimento criam novas formas de corpo? Quais modificaes hereditrias so possveis, dadas as restries impostas pela necessidade do organismo sobreviver enquanto se desenvolve?

Os estgios do desenvolvimento animal


De acordo com Aristteles, o primeiro grande embriologista da histria, a cincia comea com a curiosidade: graas a curiosidade que as pessoas comearam a filosofar, e a curiosidade permanece desde o incio do conhecimento. O desenvolvimento de um ser a partir do ovo tem sido motivo de admirao atravs da histria da humanidade. O simples procedimento de se abrir um ovo de galinha a cada dia do seu perodo de incubao de trs semanas proporciona uma notvel experincia quando se observa desde uma fina camada de clulas at o total desenvolvimento da ave. Aristteles realizou esse procedimento e observou a formao dos principais rgos. Qualquer um pode se admirar com esse fenmeno, ainda que ordinrio, mas cientistas so os que procuram descobrir como o desenvolvimento realmente ocorre. E ainda mais do que dissipar essa admirao, novo conhecimento s faz aument-la. Organismos pluricelulares no se formam de imediato, ao contrrio, so formados por um processo relativamente lento de mudana progressiva, o qual chamamos de desenvolvimento. Em quase todos os casos, o desenvolvimento de um organismo pluricelular comea com uma nica clula - ovo fertilizado ou zigoto, que dividido atravs da mitose, produz todas as clulas do corpo. O estudo do desenvolvimento animal tem sido tradicionalmente chamado de embriologia, se referindo ao fato de que entre a fertilizao e o nascimento, o organismo em desenvolvimento conhecido como embrio. Mas o desenvolvimento no cessa no nascimento, ou mesmo na vida adulta, porque a maioria dos organismos nunca pra de se desenvolver. A cada dia ns repomos mais de um grama de clulas de pele (fazendo com que as clulas mais velhas se desprendam assim que nos movemos), e nossa medula ssea sustenta o desenvolvimento de milhes de novos eritrcitos a cada minuto de nossas vidas. Portanto, nos ltimos anos tem sido comum se falar em biologia do desenvolvimento, como a disciplina que estuda processos embrionrios e outros do desenvolvimento. As principais caractersticas do desenvolvimento animal esto ilustrados na Figura 1.1. A vida de um novo indivduo iniciada pela fuso do material gentico de dois gametas, o espermatozide e o vulo. Essa fuso, chamada fertilizao, estimula o ovo a iniciar o desenvolvimento. Os estgios subseqentes do desenvolvimento so coletivamente chamados de embriognese. Por todo reino animal existe uma incrvel variedade de tipos embrionrios, mas a maioria dos padres de embriognese compreende variaes em quatro temas: 1. Ocorrncia de clivagem imediatamente aps a fertilizao. Clivagem uma srie de divises mitticas extremamente rpidas, onde o enorme volume citoplasmtico do zigoto dividido em numerosas clulas menores. Essas clulas so chamadas blastmeros e, ao fim da clivagem, eles geralmente formam uma esfera conhecida como blstula. 2. Aps a reduo na taxa de diviso mittica, os blastmeros passam por mudanas dramticas quanto s suas posies, um em relao ao outro. Essa srie de redistribuio de clulas chamada de gastrulao. Como resultado da gastrulao, o embrio tpico contm trs regies celulares chamadas camadas germinativas*. O ectoderma, a camada exterior, produz as clulas da epiderme e do sistema nervoso; o endoderma, camada interior, produz o
*Do Latim germen, significa broto ou rebento (a mesma raiz da palavra germinao). Os nomes das trs camadas germinativas so do Grego: ectoderma de ektos (fora) mais derma (pele); mesoderma de mesos (meio) e endoderma de endon (dentro).

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Espermatozide Mrula Blstula Ocito Clula germinativa (Germ plasm) Ocito (gameta feminino) GAMETOGNESE Adulto sexualmente maduro Blastporo Gnada Ectoderma Mesoderma Estgios larvais imaturos Endoderma Local das clulas embrionrias Blastocele

Espermatozide (gameta masculino)

INCUBAO (NASCIMENTO)

Figura 1.1

Histrico do desenvolvimento de um representante animal, um sapo. Estgios que vo da fertilizao at o nascimento so coletivamente conhecidos como embriognese. As regies responsveis por produzir clulas embrionrias so mostradas em cores. Gametognese, que completa no adulto sexualmente maduro, comea em pocas diferentes, dependendo da espcie.

revestimento do tubo digestivo e rgos associados (pncreas, fgado, pulmes, etc.); e o mesoderma, camada do meio, d origem a diversos rgos (corao, rins, gnadas), tecidos conjuntivos (ossos, msculos, tendes, vasos sangneos) e clulas sangneas. 3. Uma vez que as trs camadas embrionrias esto estabelecidas, as clulas interagem umas com as outras e se reorganizam para produzir tecidos e rgos. Esse processo chamado organognese. (Nos vertebrados, a organognese iniciada quando uma srie de interaes celulares induzem as clulas ectodrmicas da poro mediana do dorso a formar o tubo neural. Esse tubo originar o crebro e a coluna vertebral). Muitos rgos contm clulas de mais de uma camada embrionria, e no incomum o exterior de um rgo ser derivado de uma determinada camada e o interior de outra. Tambm durante a organognese,

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

algumas clulas sofrem longas migraes do seu lugar de origem at sua localizao final. Essas clulas migrantes incluem os precursores das clulas sangneas, clulas linfticas, clulas pigmentadas e gametas. A maior parte dos ossos de nossa face so provenientes de clulas que migraram ventralmente da regio dorsal da nossa cabea. 4. Como observado na Figura 1.1, em muitas espcies, uma parte especializada do citoplasma do ovo d origem s clulas que so precursoras dos gametas. Essas clulas so chamadas de clulas germinativas, sendo destinadas funo reprodutiva. Todas as outras clulas do corpo so chamadas clulas somticas. Essa separao entre clulas somticas (que do origem a um corpo individual) e clulas germinativas (que contribuem para a formao de uma nova gerao) freqentemente uma das primeiras diferenciaes que ocorrem durante o desenvolvimento animal. As clulas germinativas finalmente migram para as gnadas, onde se diferenciam em gametas. O desenvolvimento de gametas, chamado de gametognese, normalmente no completado at que o organismo tenha se tornado fisicamente maduro. Na maturidade, os gametas podem ser liberados e participar de uma fertilizao dando incio a um novo embrio. O organismo adulto finalmente sofre envelhecimento e morre.

Nossa herana eucaritica


Os organismos esto divididos em dois grupos principais, dependendo apenas se as clulas possuem um envoltrio nuclear ou no. Os procariotos (do grego karion, significa ncleo), onde esto includas as arqueobactrias e as eubactrias, no possuem um ncleo verdadeiro. Os eucariotos que incluem os protistas, animais, plantas e fungos, possuem um tegumento nuclear bem formado circundando os seus cromossomos. Essa diferena fundamental entre os eucariotos e procariotos influencia a maneira como esses grupos organizam e utilizam seu material gentico. Em ambos os grupos, a informao herdada necessria para o seu desenvolvimento e metabolismo se encontra codificada nas sequncias de cido desoxirribonuclico (DNA) dos cromossomos. Os cromossomos procariticos normalmente so hlices duplas de DNA, pequenas e circulares consistindo de aproximadamente 1 milho de pares de bases. As clulas eucariticas geralmente possuem diversos cromossomos, e um simples protista eucaritico possui 10 vezes, ou mais, a quantidade de DNA encontrada na maioria dos procariotos complexos. Alm disso, a estrutura de um gene eucaritico mais complexa do que a de um gene procaritico. A seqncia de aminocidos de uma protena procaritica a reflexo direta da seqncia de DNA do cromossomo. O DNA de um gene eucaritico que codifica uma protena, geralmente, dividido de tal forma que a seqncia completa de aminocidos da protena derivada de segmentos descontnuos de DNA (Figura 1.2). O DNA entre os segmentos freqentemente contm seqncias que esto envolvidas na regulao do momento e lugar em que o gene ativado. Cromossomos eucariticos tambm so muito diferentes dos cromossomos procariticos. O DNA eucaritico reveste complexos proticos especficos, chamados nucleossomos, compostos por protenas histonas. Os nucleossomos organizam o DNA em estruturas compactas e so importantes na designao de qual gene ir se expressar em qual clula. Nas bactrias no existem histonas. Mais ainda, clulas eucariticas sofrem mitose, na qual o tegumento nuclear se parte e os cromossomos replicados so igualmente divididos entre as clulas filhas (Figura 1.3). Nos procariotos, a diviso celular no mittica; no se desenvolve o fuso mittico e, tambm, no existe tegumento celular para se partir. Ao invs disso, os cromossomos filhos permanecem ligados a pontos adjacentes na membrana celular. Esses pontos de ligao so separados entre si pelo crescimento da membrana celular, e finalmente colocam os cromossomos em diferentes clulas filhas.

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Figura 1.2

(A) CLULA PROCARITICA

(B) CLULA EUCARITICA Envoltrio nuclear

Resumo dos passos pelos quais as protenas so sintetizadas a partir do DNA. (A) Expresso procaritica (bacteriana) do gene. Regies codificadoras do DNA so colineares com o produto protico. (B) Expresso de genes eucariticos. Os genes so descontnuos e um envoltrio nuclear separa o DNA do citoplasma.

Gene DNA xon 1

ntron 1 xon 2

ntron 2 xon 3 Ncleo

Transcrio Transcrio RNA nuclear

mRNA Traduo Citoplasma mRNA

Processamento de RNA mRNA Traduo mRNA

Protena

Protena

Procariotos e eucariotos tm mecanismos diferentes de regulao do gene. Em ambos, o DNA transcrito por enzimas chamadas RNA polimerases para produzir RNA. Quando o RNA mensageiro (mRNA) produzido nos procariotos, ele imediatamente traduzido em uma protena enquanto o seu outro terminal est sendo transcrito do DNA (Figura 1.4). Sendo assim, nos procariotos, transcrio e traduo so eventos simultneos e coordenados. Mas a existncia de envoltrio nuclear em eucariotos proporciona a oportunidade de se obter um tipo de regulao celular totalmente novo. Os ribossomos, que so responsveis pela traduo, esto de um lado do envoltrio nuclear, e o DNA e a RNA polimerase necessria para a transcrio esto do outro. Entre a transcrio e a traduo, o RNA transcrito deve ser processado para que possa passar atravs do envoltrio nuclear. A regulao pela qual o mRNA pode passar para o citoplasma, torna a clula capaz de selecionar quais das mensagens recm-sintetizadas sero traduzidas. Assim, um novo nvel de complexidade foi adicionado, que extremamente importante para o organismo em desenvolvimento.

Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares


Todos os organismos eucariticos pluricelulares se desenvolveram de protistas unicelulares. nesses protistas que as caractersticas bsicas do desenvolvimento apareceram primeiro. Eucariotos simples nos deram os primeiros exemplos da morfognese direcionada pelo ncleo, o uso da superfcie da clula para mediar cooperao entre clulas individuais e as primeiras ocorrncias de reproduo sexual. Controle da Morfognese no Desenvolvimento em Acetabulria H um sculo, ainda no havia sido provado se o ncleo continha alguma informao hereditria ou de desenvolvimento. Algumas das melhores evidncias para essa teoria vieram de estudos onde organismos unicelulares foram fragmentados em pedaos

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

Prfase: O envoltrio nuclear quebra e um fuso se forma entre dois centrolos.

Interfase: DNA duplicado em preparao para a diviso celular. Cromatdeos do cromossomo Cromatina Nuclolo Regio do centrmero Fuso em desenvolvimento Centrolos ster Envoltrio nuclear Nuclolo Envoltrio nuclear rompe

Prometfase: Os cromossomos se ligam s fibras dos fusos.

Ncleo

Cromossomos filhos Metfase: Os cromossomos se alinham no equador da clula. Telfase: Os cromossomos atingem os plos mitticos e a clula comea a invaginar. Anfase: Os cromossomos duplicados (chamados cromatdeos) so separados.

Figura 1.3

nucleados e anucleados (reviso por Wilson, 1986). Quando vrios protistas foram fragmentados, quase todas as partes morreram. No entanto, os fragmentos que continham ncleo foram capazes de sobreviver, regenerando todo a complexa estrutura celular (Figura 1.5) O controle nuclear da morfognese celular e a interao do ncleo e citoplasma esto muito bem demonstrados nos estudos da Acetabulria. Essa enorme clula individual (2 a 4 cm de comprimento) consiste de trs partes: o disco reprodutivo, o pednculo e o rizide (Figura 1.6A). O rizide est localizado na base da clula onde essa presa ao substrato. O ncleo individual da clula se localiza dentro do rizide. O tamanho da Acetabulria e a localizao do seu ncleo permitiram que pesquisadores

Diagrama de mitose em clulas animais. Durante a interfase o DNA duplicado em preparao para a diviso celular. Durante a prfase, o envoltrio nuclear quebra e forma-se um fuso entre os dois centrolos. Na metfase, os cromosssomos se alinham no equador da clula e se inicia a anfase, os cromossomos duplicados (cada duplicata de cromossomo um cromatdeo) so separados. Na telfase os cromossomos atingem os plos mitticos e a clula comea a invaginar. Cada plo contm o mesmo nmero e tipos de cromossomos que continha a clula antes da diviso.

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

DNA

Ribossomos

RNA

Figura 1.4

Transcrio e traduo simultnea em procariotos. Uma poro de DNA de Escherichia coli se estende horizontalmente por essa microfotografia eletrnica. Transcries de RNA mensageiro podem ser vistas dos dois lados. Ribossomos se juntaram ao mRNA e esto sintetizando protenas (que no podem ser vistas). O mRNA pode ser visto aumentando de tamanho, da esquerda para a direita, indicando a direo da transcrio. (Cortesia de O. L. Miller, Jr.)

removessem o ncleo de uma clula e o substitusse por outro, de outra clula. Nos anos 30, J. Hmmerling tirou proveito dessa singular caracterstica e trocou ncleos entre duas espcies morfologicamente distintas, A. mediterranea e A. crenulata. Como mostrado na fotografia, essas duas espcies tm discos reprodutivos muito diferentes. Hmmerling descobriu que quando um ncleo de uma determinada espcie era transplantado para o pednculo de outra, o novo disco em formao finalmente assumia a forma associada com o ncleo do doador (Figura 1.6B). Assim, foi considerado que o ncleo era o controlador do desenvolvimento da Acetabulria. A formao de um disco reprodutivo um evento morfognico complexo, envolvendo a sntese de um grande nmero de protenas, que devem ser acumuladas em certa poro da clula e ento organizadas em estruturas complexas especficas da espcie. O ncleo transplantado da clula realmente direciona a sntese de seu disco reprodutivo espcie-especfico, mas uma tarefa que pode levar semanas para ser realizada. Alm disso, se o ncleo for removido da clula de Acetabulria em estgio inicial do desenvolvimento, antes de formar o disco reprodutivo, um disco normal se formar semanas depois, ainda que o organismo ir morrer. Esses estudos sugerem que (1) o ncleo contm informao especfica sobre o tipo de disco reprodutivo produzido (isto , contm informao gentica que especifica as protenas necessrias para a produo de um certo tipo de disco reprodutivo), e (2) o material contendo essa informao entra no citoplasma muito antes dessa produo ocorrer. A informao no citoplasma no ser usada por vrias semanas.
Fragmento anucleado morre Corte Ncleo Fragmento nucleado se regenera

Corte

Figura 1.5

Regenerao do fragmento nucleado do protista unicelular Stylonychia. Os fragmentos anucleados sobrevivem por algum tempo, mas finalmente morrem.

Fragmento anucleado morre

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

(B) Disco reprodutivo

(A) Disco reprodutivo

Pednculo A. crenulata Pednculo A. mediterranea Ncleos transplantados

Ncleo

Ncleo

Rizide Rizide 1 cm Rizide 1 cm A estrutura do disco reprodutivo a do ncleo doador

Figura 1.6

(A) Acetabulria mediterranea (esquerda) e A. crenulata (direita). Cada unidade uma clula singular. O rizide contm o ncleo. (B) Efeitos da troca de ncleos entre duas espcies de Acetabulria. Ncleos foram transplantados para fragmentos de rizides anucleados. Estruturas de A. crenulata esto sombreadas; estruturas de A. mediterranea no esto sombreadas. (Fotografias cortesia de H. Harris.)

Uma hiptese atual, proposta para explicar essas observaes, que o ncleo sintetiza um mRNA estvel, posicionado em estado dormente no citoplasma at a formao do disco reprodutivo. Essa hiptese amparada por uma observao publicada por Hmmerling em 1934. Hmmerling fracionou uma Acetabulria jovem em diversas partes (Figura 1.7). A poro com o ncleo finalmente formou um novo disco, conforme esperado; da mesma forma o fez a extremidade apical do pednculo. No entanto, a parte intermediria do pednculo no formou o disco reprodutivo. Por isso, Hmmerling postulou (aproximadamente 30 anos antes de sabermos da existncia do mRNA), que as instrues para a formao do disco reprodutivo se originavam no ncleo, sendo de alguma forma guardadas dormentes prximo extremidade do pednculo. Muitos anos mais tarde, Kloppstech e Schweiger (1975) estabeleceram que o mRNA derivado do ncleo se acumula nessa regio. Ribonuclease, uma enzima que cliva RNA, inibe completamente a formao do disco reprodutivo quando adicionada gua marinha na qual cresce a Acetabulria. Em clulas anucleadas, esse efeito permanente; uma vez que o RNA destrudo, no pode mais haver a formao do disco reprodutivo. Em clulas nucleadas, no entanto, um novo disco pode ser formado aps a eliminao da ribonuclease, presumivelmente porque um novo mRNA ento produzido pelo ncleo. Garcia e Dazy (1986) tambm demonstraram que a sntese da protena especialmente ativa no pice da Acetabulria. Fica claro pela discusso anterior, que a transcrio nuclear tem um papel importante na formao do disco reprodutivo da Acetabulria. Mas deve ser notado que o

10

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Disco reprodutivo e pednculo regenerados Extremidade apical do pednculo

Poro central do pednculo

Sem regenerao

Rizide e ncleo

Regenerao total

Figura 1.7

Habilidade regenerativa de diferentes fragmentos da A. mediterranea

citoplasma tambm cumpre uma parte essencial na formao desse disco. O mRNA no traduzido durante semanas, mesmo estando no citoplasma. Algo no citoplasma controla quando as mensagens devem ou no ser utilizadas. Portanto, a expresso do disco reprodutivo controlada no somente pela transcrio nuclear como tambm pelo controle de traduo do RNA citoplasmtico. Nesse organismo unicelular, o desenvolvimento controlado em ambos estgios de transcrio e de traduo. Diferenciao em Ameboflagelados Naegleria Um dos casos mais marcantes de diferenciao em protistas, aquele de Naegleria gruberi. Esse organismo ocupa um lugar especial na taxonomia protista porque pode mudar sua forma, de uma ameba para a de um flagelado (Figura 1.8). Durante a maior parte do seu ciclo de vida, a N. gruberi uma ameba tpica, alimentando-se de bactrias do solo e dividindo-se por ciso. No entanto, quando as bactrias so diludas (tanto pela gua da chuva quanto pela gua nos experimentos), cada N. gruberi desenvolve rapidamente uma forma aerodinmica e dois longos flagelos anteriores, que so usados para encontrar regies mais abundantes em bactrias. Nessas condies, ao invs de existirem diversos tipos de clulas diferenciadas em um nico organismo, essa clula nica tem estruturas celular e bioqumica diferentes nos diferentes estgios de sua vida. Diferenciao para a forma de flagelado ocorre aproximadamente em uma hora (Figura 1.9). Durante esse perodo, a ameba tem que criar centrolos para servir como corpos basais do flagelo (centros organizadores de microtbulos), assim como criar o prprio flagelo. Os corpos basais e os flagelos so compostos de diversas protenas, das quais a mais abundante a tubulina. As molculas de tubulina so organizadas em microtbulos; esses so posteriormente arranjados para permitir o movimento flagelar. Fulton e Walsh (1980) mostraram que a tubulina dos flagelos de Naegleria no existe

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

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(A)

(B)

(C)

(D)

Figura 1.8

em seu estgio de ameba. produzida de novo (desde o comeo), comeando com uma nova transcrio no ncleo. Para mostrar isso, os pesquisadores manipularam transcries em vrios estgios com actinomicina D, uma droga antibitica que seletivamente inibe a sntese do RNA. Quando adicionada anteriormente diluio do alimento, esse antibitico previne a sntese da tubulina. No entanto, se a actinomicina D adicionada 20 minutos aps a diluio, a tubulina ainda produzida em tempo normal (aproximadamente 30 minutos mais tarde). Portanto, parece que o mRNA para a tubulina foi produzido durante os primeiros vinte minutos aps a diluio e usado logo em seguida. Essa interpretao foi confirmada quando foi demonstrado que o mRNA extrado da ameba no continha mensagem alguma, detectvel para tubulina flagelar, ao passo que mRNA extrado de clulas diferenciadas continha muitas mensagens desse tipo (Walsh, 1984). Ento, temos aqui um excelente exemplo de controle transcricional de um processo de desenvolvimento: O ncleo da Naegleria responde a mudanas ambientais sintetizando o mRNA para tubulina flagelar. Notamos tambm um outro processo que permanece extremamente importante no desenvolvimento de todos os outros animais e plantas, que o agrupamento de molculas de tubulina para a produo do flagelo. Esse arranjo, pelo qual a tubulina polimerizada em microtbulos, e esses por sua vez agrupados de forma ordenada, visto em toda a natureza. Em mamferos, est evidente no flagelo do espermatozide e nos clios da medula espinhal e do trato respiratrio. Mais ainda, no somente a tubulina que produz o flagelo. Existem em torno de 300 outras protenas em cada flagelo, e o movimento flagelar depende da orientao adequada dessas protenas uma em relao a outra. At mesmo processos celulares tm a sua prpria morfognese baseada em interaes moleculares entre os fragmentos de protena. Tal controle ps-traduo, onde uma protena no funcional at que esteja ligada a outras molculas, ser discutido melhor mais tarde. Vimos ento, que o desenvolvimento em eucariotos unicelulares pode ser controlado nos estgios de transcrio, traduo e ps-traduo.

Transformao de Naegleria gruberi da forma amebide ao estado flagelado. Linha superior corada com Iodo/Lugol; linha inferior corada com um anticorpo fluorescente protena tubulina dos microtbulos. A transformao iniciada pela eliminao do alimento (bactrias) da colnia de Naegleria. (A) 0 minutos; (B) 25 minutos, mostrando sntese de nova tubulina; (C) 70 minutos, emergncia de flagelos visveis (D) 120 minutos, mostrando flagelos maduros e forma aerodinmica do corpo (de Walsh, 1984, cortesia de C. Walsh.)

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Figura 1.9

Diferenciao do fentipo flagelado em Naegleria. Amebas que vinham crescendo em um meio enriquecido com bactria so lavadas afim de se eliminar as bactrias no tempo 0. Aos 80 minutos, praticamente toda a populao desenvolveu flagelo. (Segundo Fulton, 1977.)

a lin bu a tu e da m e co es r nt l a S a g e fl

am o de rp r n to s co ela ca o en al n t is de lag m ula m ve os e pa cl nda is o a f el r i m u v a m ag gr s, o m or os A asai rred Fl o m p l el or f c ta b a F m ag se to Fl co

co

rp

os

100
Porcentagem da populao com flagelo

80 Clulas de corpo com forma flagelar

60

40

20

0 0 20 40 60 Tempo aps suspenso (minutos) 80 100

Figura 1.10

Sexo em bactrias. Algumas clulas de bactrias esto cobertas de numerosos apndices (pilos) sendo capazes de transmitir genes para uma clula recipiente (sem pilos) atravs de um pilus sexual. Nessa figura, o pilus sexual est realado por partculas virais que se ligam especificamente quele estrutura. (Cortesia de C. C. Brinton, Jr. e J. Carnahan.)

As Origens da Reproduo Sexual A reproduo sexual outra inveno dos protistas que teve um profundo efeito em organismos mais complexos. Deve-se notar que sexo e reproduo so dois processos separveis e distintos. A reproduo envolve a criao de novos indivduos. Sexo envolve a combinao de genes de dois indivduos distintos em um novo arranjo. Reproduo na ausncia de sexo uma caracterstica de organismos que se reproduzem por ciso; no h discriminao nos genes quando uma ameba se divide ou quando uma hidra brota clulas para formar uma nova colnia. Sexo sem reproduo tambm comum entre os organismos unicelulares. As bactrias so capazes de transmitir genes de um indivduo para o outro por meio dos pilos sexuais (Figura 1.10). Essa transmisso independente da reproduo. Protistas so tambm capazes de reorganizar genes sem reproduo. Os paramcios, por exemplo, se reproduzem por ciso, mas o sexo realizado atravs de conjugao. Quando dois paramcios se juntam, eles se unem atravs de seus aparelhos orais formando uma conexo citoplasmtica atravs da qual podem trocar material gentico (Figura 1.11). Cada macroncleo (que controla o metabolismo do organismo) degenera enquanto o microncleo passa por meiose para produzir oito microncleos haplides, dos quais todos, exceto um, degeneram. O microncleo remanescente divide-se mais uma vez para formar um microncleo estacionrio e um microncleo migratrio. Cada microncleo migratrio atravessa a ponte citoplasmtica e se funde com o microncleo estacionrio (fertilizante), criando um novo ncleo diplide em cada clula. Esse ncleo diplide se divide mitoticamente fazendo surgir um novo microncleo e um novo macroncleo quando os dois parceiros se separam. Ainda que no tenha ocorrido reproduo, houve sexo.

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

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Microncleo Macroncleo

Fuso meitico

Ponte citoplasmtica Dois paramcios formam ponte citoplasmtica Microncleos passam por meiose, formando 8 ncleos haplides por clula; macroncleos degeneram Todos menos um dos microncleos de cada parceiro degeneram

Microncleo estacionrio Microncleo migratrio Microncleo restante se divide para formar um microncleo estacionrio e um migratrio Microncleos migratrios atravessam a ponte citoplasmtica e fertilizam os microncleos estacionrios do parceiro Ncleo diplide se forma e sofre divises mitticas para gerar um novo macroncleo e dois microncleos quando os paramcios se separam

Figura 1.11

Unio de paramcios atravs da ponte citoplasmtica, onde dois paramcios podem trocar material gentico, deixando cada um com genes que diferem daqueles com os quais iniciaram o processo. (Strickberger, 1985.)

A unio desses dois processos distintos, sexo e reproduo, em reproduo sexual, visto em eucariotos unicelulares. A Figura 1.12 mostra o ciclo de vida da Chlamydomonas. Esse organismo geralmente haplide, portando apenas uma cpia de cada cromossomo (como os gametas dos mamferos). Os indivduos de cada espcie, no entanto, esto divididos em dois grupos de parceiros: mais e menos. Quando se encontram, juntam-se os citoplasmas e seus ncleos se fundem para formar um zigoto diplide. Esse zigoto a nica clula diplide do ciclo de vida e passar por meiose para formar quatro novas clulas de Chlamydomonas. Aqui est uma reproduo sexual, pois cromossomos so realinhados durante as divises meiticas onde mais indivduos so formados. Note que nesse tipo de reproduo sexual protista, os gametas so morfologicamente idnticos e a distino entre espermatozide e vulo ainda no aconteceu. Com a evoluo da reproduo sexual, dois importantes avanos foram alcanados. O primeiro o mecanismo da meiose (Figura 1.13), pelo qual o complemento diplide dos cromossomos reduzido ao estado haplide (discutido em detalhe no Captulo 22). O outro avano o mecanismo pelo qual os parceiros reprodutivos diferentes se reconhecem um ao outro. Em Chlamydomonas, o reconhecimento ocorre primeiro nas membranas flagelares (Figura 1.14; Bergman et al., 1975; Goodenough e Weiss, 1975). A aglutinao dos flagelos permite que regies especficas das membranas celulares se juntem. Esses setores especializados contm componentes reprodutivos especficos que permitem a fuso dos citoplasmas. Seguindo-se aglutinao, os indivduos mais iniciam a fuso estendendo um tubo de fertilizao.

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Figura 1.12

Reproduo assexual (mittica) Parceiro tipo mais (haplide) Parceiro tipo menos (haplide)

Reproduo sexual em Chlamydomonas. Duas linhagens, ambas haplides, podem se reproduzir assexuadamente quando separadas. Respeitando certas condies, os dois cordes podem se unir para produzir uma clula diplide que pode sofrer meiose para formar quatro novos organismos haplides. (Segundo Strickberger, 1985.)

Reproduo sexual Acasalamento

Fuso citoplasmtica

Zigoto (diplide)

Maturao (meiose)

Germinao Dois parceiros tipo mais e tipo menos

Figura 1.13

Sumrio da meiose. O DNA e as protenas associadas replicam durante a interfase. Durante a prfase, o envoltrio nuclear se rompe e os cromossomos homlogos (cada cromossomo duplicado, com os cromatdeos juntos no centrmero) se alinham em pares. Reagrupamentos cromossmicos podem ocorrer entre quatro cromatdeos homlogos nesse estgio. Aps a primeira metfase, os dois cromossomos homlogos originais so segregados em clulas diferentes. Durante a segunda diviso, o centrmero se divide, deixando cada nova clula com uma cpia de cada cromossomo.

MEIOSE I Envoltrio nuclear Ncleo Cromossomos homlogos Cromatdeos homlogos

Cromatina

Interfase

Prfase I precoce

Meia prfase I

Prfase I tardia

Metfase I

O envoltrio nuclear se rompe e cromossomos homlogos (cada cromossomo sendo duplo, com os cromatdeos ligados no centrmero) se alinham aos pares. Rearranjos cromossmicos podem ocorrer entre os quatro cromatdeos homlogos neste momento.

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

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(A)

(B)

Figura 1.14

Microfilamentos

Duas etapas do reconhecimento no acasalamento de Chlamydomonas. (A) Varredura por micrografia eletrnica (7000x) de par em acasalamento. Os flagelos que interagem, torcemse um em torno do outro, aderindo nas pontas (flexas). (B) Microfotografia eletrnica de transmisso (20.000x) de uma ponte citoplasmtica conectando os dois organismos. Os microfilamentos se estendem da clula doadora (abaixo) para a clula recipiente (acima). (de Goodenough e Weiss, 1975 e Bergman et al., 1975; com permisso de U. Goodenough.)

Esse tubo conecta e se funde com um local especfico no indivduo menos. interessante que o mecanismo usado para estender esse tubo - polimerizao da protena actina - tambm usado para estender processos do espermatozide e vulo do ourio-do-mar. No Captulo 4, veremos que o reconhecimento e fuso de espermatozide e vulo ocorrem de uma maneira espantosamente semelhante a desses protistas. Eucariotos unicelulares parecem ter os elementos bsicos do processo de desenvolvimento que caracterizam os organismos mais complexos: a sntese celular controlada pela regulao transcricional, por traduo e ps-traduo; existe um mecanismo para processar o RNA atravs da membrana nuclear; as estruturas de genes individuais e cromossomos so como sero atravs da evoluo eucaritica; mitose e meiose so aperfeioadas; e a reproduo sexual existe, envolvendo a cooperao entre clulas individuais.Tal cooperao intercelular se torna ainda mais importante com a evoluo de organismos multicelulares.

MEIOSE II

Anfase I

Telfase I Os dois cromossomos homlogos originais so segregados em clulas diferentes

Metfase II

Anfase II O centrmero se divide

Telfase II Cada nova clula tem uma cpia de cada cromossomo

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Eucariotos coloniais: A evoluo da diferenciao


Um dos mais importantes experimentos da evoluo foi a criao de organismos pluricelulares. Parece ter havido diversos caminhos pelo qual uma nica clula evoluiu para uma disposio pluricelular; discutiremos apenas dois deles (veja o Captulo 23 para uma discusso mais completa). O primeiro caminho envolve a diviso ordenada da clula reprodutiva e a subseqente diferenciao da sua prognie em diferentes tipos de clulas. Esse caminho para a multicelularidade pode ser visto em uma notvel srie de organismos pluricelulares, coletivamente referidos como a famlia das Volvocaceas ou volvocaceanas. As Volvocaceanas Os organismos mais simples entre as volvocaceanas so reunies ordenadas de numerosas clulas, cada uma parecida ao protista unicelular Chlamydomonas. Um nico organismo de volvocacea do gnero Gonium (Figura 1.15), por exemplo, consiste de uma placa plana contendo de 4 a 16 clulas, cada uma com seu prprio flagelo. Em um gnero relacionado, Pandorina, 16 clulas formam uma esfera; e no Eudorina, a esfera contm 32 ou 64 clulas organizadas em um padro regular. Nesses organismos, um princpio muito importante tem-se desenvolvido: a diviso ordenada de uma clula para gerar um nmero de clulas que so organizadas de uma maneira previsvel. Como ocorre na maioria dos embries animais, as divises celulares pelo qual uma nica clula de volvocacea produz um organismo de 4 a 64 clulas ocorrem em uma seqncia muito rpida e com ausncia de crescimento celular. Os dois prximos gneros da srie volvocacea exibem um outro princpio importante do desenvolvimento: a diferenciao de tipos celulares em organismo individual. As clulas reprodutivas se diferenciam das clulas somticas. Em todos os gneros j mencionados, toda a clula pode, e normalmente o faz, produzir um organismo novo completo por mitose (Figura 1.16 A,B). Nos gneros Pleodorina e Volvox, porm, relativamente poucas clulas podem se reproduzir. Na Pleodorina californica, as clulas da regio anterior so restritas uma funo somtica; somente aquelas

Figura 1.15

Representante da ordem dos Volvocales. (A) o protista unicelular Chlamydomonas reinhardtii. (B) Gonium pectorale com oito clulas Chlamydomonas-smiles em um disco convexo. (C) Pandorina morum. (D) Eudorina elegans. (E) Pleodorina californica. Aqui todas as 64 clulas so originalmente similares, mas as posteriores desdiferenciam e rediferenciam como clulas assexuadas reprodutivas chamadas gondios, enquanto as clulas anteriores permanecem pequenas e biflageladas, como o Chlamydomonas. (F) Volvox carteri. Aqui, clulas destinadas a se tornarem gondios so separadas no comeo do desenvolvimento e nunca desenvolvem caractersticas somticas. As clulas menores, somticas, lembram Chlamydomonas. Todas, menos o Chlamydomonas, so membros da famlia das Volvocaceas. A complexidade aumenta do Chlamydomonas unicelular ao Volvox pluricelular. Barra em A de 5m; BD, 25m; E, F, 50m (Cortesia de D. Kirk.)

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

(F)

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

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Figura 1.16

(A)

(B)

(C)

Reproduo assexuada nas volvocaceanas. (A) Colnia madura de Eudorina elegans. (B) Cada uma das clulas de E. elegans se divide e produz uma nova colnia. (C) Volvox carteri maduro. A maioria das clulas so incapazes de se reproduzir. Clulas germinativas (gondia) comearam a se dividir em novos organismos. (A e B segundo Hartmann,1921; C de Kirk et al., 1982, cortesia de D. Kirk.)

clulas do lado posterior podem se reproduzir. Em P. californica, a colnia normalmente tem 128 ou 64 clulas, e a relao do nmero de clulas somticas para o nmero de clulas reprodutivas normalmente 3:5. Dessa maneira, uma tpica colnia de 128 clulas tem 48 clulas somticas e uma colnia de 64 clulas tem 24 clulas somticas. Nos Volvox, quase todas clulas so somticas, e muito poucas clulas so capazes de produzir novos indivduos. Em algumas espcies de Volvox, clulas reprodutivas como as da Pleodorina, so derivadas de clulas que originalmente parecem e funcionam como clulas somticas antes de crescer e se dividir para formarem uma nova prognie. No entanto, em outros membros do gnero, como o V. carteri, existe uma diviso do trabalho completa: as clulas reprodutivas que vo criar a nova gerao so colocadas de lado durante a diviso das clulas reprodutivas que esto formando um novo indivduo. As clulas reprodutivas nunca desenvolvem um flagelo funcional e nunca contribuem para motilidade e outras funes somticas do indivduo; so inteiramente especializadas para reproduo. Ainda que as volvocaceas mais simples sejam consideradas organismos coloniais (porque cada clula capaz de existncia independente e perpetuao da espcie), no V. carteri temos um organismo verdadeiramente celular com dois tipos de clulas independentes e distintos (somtico e reprodutivo), ambos requeridos para a perpetuao da espcie (Figura 1.16C). Embora nem todos os animais separem suas clulas reprodutivas das clulas somticas (e as plantas raramente o fazem), essa separao de clulas germinativas das clulas somticas no incio do desenvolvimento caracterstica de muitos filos animais e ser discutida em maior detalhe no Captulo 13. Embora todas as volvocaceas, incluindo seu parente unicelular Chlamydomonas, se reproduzam predominantemente por meios assexuados, tambm so capazes de reproduo sexual. Isso envolve a produo e fuso de gametas haplides. Em muitas espcies de Chlamydomonas, incluindo a ilustrada na Figura 1.12, a reproduo sexual isogmica, j que os gametas haplides que se encontram so similares em tamanho, estrutura e motilidade. No entanto, em outras espcies de Chlamydomonas - assim como as vrias espcies de volvocaceas coloniais - gametas nadadores de diversos tamanhos so produzidos por parceiros de acasalamentos diferentes. Isso chamado heterogamia. Mas as volvocaceas maiores desenvolveram uma forma especializada de heterogamia, chamada oogamia, que envolve a produo de vulos grandes e relativamente imveis por um parceiro do acasalamento e espermatozides pequenos e mveis pelo outro parceiro (veja Vises Colaterais & Especulaes). Aqui vemos um gameta especializado para reteno de recursos nutricionais e de desenvolvimento e outro gameta especializado para transporte de ncleos. Assim, as volvocaceas incluem os organismos mais simples que tm macho e fmea distinguveis, e possuem caminhos diferentes para desenvolver o vulo ou o espermatozide. Em todas as volvocaceas, a reao da fertilizao se assemelha do Chlamydomonas porque resulta na produo de um zigoto diplide dormente, inativo, capaz de sobreviver a condies ambientais severas. Quando as condies permitem aos zigotos germinar, eles primeiro sofrem meiose para produzir herdeiros haplides dos dois parceiros em nmeros iguais. [other.html#intro1]

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Informaes adicionais

&

Especulaes

Sexo e Individulidade em Volvox

imples como , o Volvox compartilha muitos traos que caracterizam o ciclo de vida e histrico de desenvolvimento de organismos muito mais complexos, incluindo ns mesmos. Como j foi mencionado, o Volvox est entre os organismos mais simples a exibir a diviso de trabalho entre dois tipos de clulas diferentes. Como conseqncia disso, est entre os organismos mais simples a incluir a morte como uma parte regular, geneticamente programada, da sua histria de vida.

Morte e Diferenciao Organismos unicelulares que se reproduzem atravs de uma simples diviso celular, tais como as amebas, so potencialmente imortais. A ameba que vemos sob um microscpio no tem ancestrais mortos! Quando uma ameba se divide, nenhuma das duas clulas resultantes pode ser considerada ancestral ou prognie; elas

so parentes. A morte chega para uma ameba apenas se ela ingerida ou sofre um acidente fatal; quando isso acontece, a clula morta no deixa prole. Porm, a morte se torna uma parte essencial da vida para qualquer organismo pluricelular que estabelece diviso de trabalho entre clulas somticas e clulas germinativas (reprodutivas). Considere o histrico de vida do Volvox carteri quando se reproduz assexuadamente (Figura 1.17). Cada adulto assexuado um esferide contendo aproximadamente 2000 pequenas clulas somticas biflageladas ao longo de sua periferia e por volta de 16 grandes clulas reprodutivas assexuadas, chamadas gondios, dispostas em umas das extremidades do interior. Quando maduro, cada gondio divide-se rapidamente 11 ou 12 vezes. Parte dessa diviso assimtrica e produz as 16 clulas grandes que iro se tornar um novo

conjunto de gondios. No fim da clivagem, todas as clulas que estaro presentes no adulto, foram produzidas de cada um dos gondios. Mas o embrio est virado de dentro para fora: seus gondios esto do lado de fora e os flagelos de suas clulas somticas esto apontando para o interior da esfera oca de clulas. Essa condio adversa corrigida por um processo chamado inverso, pelo qual o embrio se vira com o lado certo para fora atravs de movimentos celulares que fazem lembrar movimentos de gastrulao no embrio animal (Figura 1.18). Um agrupamento de
Figura 1.17

Embriognese Adulto com juvenis Adulto com gondios maduros

Expanso de adultos e juvenis

Reproduo assexual em V. carteri. Quando as clulas reprodutivas (gondios) esto maduras, entram em um estado semelhante clivagem do desenvolvimento embrionrio para produzir seres juvenis dentro do adulto. Atravs de uma srie de movimentos celulares semelhantes gastrulao, o volvox embrionrio se inverte e finalmente liberado do progenitor. As clulas somticas do progenitor, sem gondios, passam por senescncia e morrem, enquanto a colnia juvenil amadurece. O ciclo sexual total dura dois dias. (Segundo Kirk, 1988.)

Maturao dos gondios

Expanso continuada da matriz extracelular

Expanso continuada de juvenis Liberao de juvenis

Morte de clulas somticas - progenitores

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

19

(A)

(F)

Figura 1.18

(B)

(G)

Inverso dos embries V. carteri produzidos assexuadamente. A-E so micrografias eletrnicas de varredura de embries completos. FJ so cortes sagitais atravs do centro do embrio, visualizado por microscopia diferencial de interferncia. Antes da inverso, o embrio uma esfera cncava de clulas conectadas. Quando as clulas mudam a sua forma, um buraco (o fialoporo) abre-se no topo do embrio (A,B,F,G). As clulas se curvam e se renem em um dos plos (C-E, H-J). (Kirk et al., 1982, cortesia de D. Kirk.)

(C)

(H)

das clulas que as produzem (Pommerville e Kochert, 1982). Alm do mais, nessa morte, as clulas liberam para o uso de outras, incluindo sua prpria cria, todo o nutriente acumulado durante toda a vida. Dessa maneira emerge, como assinala David Kirk, um dos grandes temas da vida no planeta Terra: Alguns morrem para que outros possam viver. Em V. carteri, foi identificado um gene* especfico que tem um papel importante regulando a morte das clulas (Kirk, 1988). Em linhagens laboratoriais possuindo mutaes desse gene, as clulas somticas abandonam suas tendncias suicidas, ganham a habilidade de se reproduzirem
* Esse gene (regA) foi clonado e mostrou codificar uma protena que age para reprimir (direta ou indiretamente) todos os genes cujos produtos so requeridos pela clula para se desenvolver como gondio. Mutaes de perda da funo impediro a protena de agir, e as clulas sero capazes de se tornarem gondios (D. Kirk, comunicao pessoal).

(D)

(I)

(E)

(J)

clulas em forma de garrafa abre um buraco em um dos lados do embrio produzindo tenso sobre a camada de clulas interconectadas (Figura 1.19). O embrio se utiliza desse buraco para fazer a inverso e depois o fecha. Posteriormente, as colnias juvenis so enzimaticamente soltas do progenitor e nadam livres.

O que acontece s clulas somticas do progenitor Volvox agora que as jovens deixaram o lar? Tendo produzido uma cria e sendo incapazes de uma nova reproduo, essas clulas somticas morrem. Para ser mais exato, elas cometem suicdio, sintetizando um conjunto de protenas que causam a morte e a dissoluo

Figura 1.19

Clulas garrafas prximas abertura do fialoporo. Essas clulas permanecem estreitamente conectadas atravs de pontes citoplasmticas prximas a seus pices alongados, desse modo criando a tenso que causa a curvatura da lmina celular interconectada. ( Kirk et al., 1982, cortesia de D. Kirk.)

20

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

(A)

assexuadamente e se tornam potencialmente imortais (Figura 1.20). O fato desses mutantes nunca terem sido encontrados na natureza, indica que a morte das clulas tem um papel importante na sobrevivncia do V. carteri sob condies naturais. [intro2.html] Entra o sexo Mesmo o V. carteri se reproduzindo assexuadamente a maior parte do tempo, na natureza se reproduzem sexualmente uma vez por ano. Quando o faz, uma gerao de indivduos morre, e uma nova gerao geneticamente diferente produzida. O naturalista Joseph Wood Krutch (1956) colocou isso de uma forma mais potica: A ameba e o paramcio so potencialmente imortais...Mas para o Volvox a morte parece inevitvel, assim como o para um camundongo ou o homem. Volvox deve morrer, como Leeuwenkoek observou, porque teve filhos e no mais necessrio. Quando sua hora chegar, tomba em silncio, vai para o fundo juntar-se a seus ancestrais. Como Hegner, o zoologista de Johns Hopkins, escreveu, Esse o primeiro
Figura 1.21

advento da inevitvel morte natural no reino animal, e tudo em nome do sexo. E pergunta: Vale a pena? Para Volvox carteri, certamente que sim. V. carteri vive em pequenas poas rasas que temporariamente se enchem com as guas das chuvas da primavera e secam no calor do vero. Durante a maior parte desse tempo, V. carteri nada livremente, reproduzindo-se assexuadamente. Esses volvox morreriam em minutos se a poa secasse, mas o V. carteri capaz de sobreviver se tornando sexual pouco antes da secagem das poas, produzindo zigotos inativos que sobrevivem ao calor e seca do alto vero e ao frio do inverno. Quando a chuva enche esses pequenos reservatrios na primavera, os zigotos interrompem a sua dormncia e criam uma nova gerao para reproduzirem-se assexuadamente at que as guas ameacem secar novamente. Como esses organismos to simples prevem a chegada de condies adversas com acuidade suficiente para produzir uma gerao sexual no tempo certo, ano aps ano? O estmulo para mudana do modo assexual para o modo sexual de reproduo em V. carteri devido a uma protena

(B)

Figura 1.20

Mutao de um nico gene (chamado regenerador somtico A) elimina a programao de morte em clulas V. carteri. Volvox recmeclodido carregando essa mutao (A) indistinguvel do esferide tipo-selvagem. No entanto, momentos antes das clulas somticas do esferide tipo-selvagem comearem a morrer, as clulas somticas desse mutante se rediferenciam como gondios (B). Finalmente, cada clula do mutante ir se dividir para formar ( regenerar) um novo esferide que ir repetir esse ciclo do desenvolvimento potencialmente imortal.

Reproduo sexual em V. carteri. Machos e fmeas so indistiguveis na sua fase assexuada. Quando a protena indutora sexual est presente, os gondios de ambos parceiros passam por uma embriognese modificada que leva formao de vulos nas fmeas e espermatozides nos machos. Quando os gametas esto maduros, pacotes de espermatozide (contendo 64 ou 128 espermatozides cada), so liberados e nadam para as fmeas. Ao alcanar a fmea o pacote se rompe em espermatozides individuais, que podem fertilizar os vulos. O zigoto resultante tem paredes duras que podem resistir seca, calor e frio. Quando as chuvas da primavera fazem o zigoto germinar, sofrendo meiose para produzir machos e fmeas haplides que se reproduzem assexuadamente at o calor induzir novamente o ciclo sexual.
Desenvolvimento sexual de gondios Pacotes de espermatozide

Indutor sexual Espermatozide Macho assexuado Gondio Desenvolvimento embrionrio modificado dos gondios resultando em produo de gametas Macho sexuado

vulos Indutor sexual vulo Fmea assexuada Meiose e germinao Fmea sexuada

Zigotos

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

21

sexual indutiva de 30-kDa. Essa protena to poderosa que concentraes menores que 6x10-17 fazem com que os gondios sofram um padro modificado de desenvolvimento embrionrio que resulta na produo de vulos ou espermatozides, dependendo do sexo gentico do indivduo (Sumper et al.,1993). Os espermatozides so liberados para nadar para a fmea onde fertilizam os vulos para produzir zigotos dormentes (Figura 1.21). Qual a fonte dessa protena indutora sexual? Kirk e Kirk (1986), descobriram que o ciclo sexual poderia ser iniciado esquen-

tando placas com V. carteri temperaturas que poderiam ser encontradas em um reservatrio raso durante o fim do vero. Quando isso era feito, as clulas somticas dos volvox assexuados produziam a protena sexual indutora. Sendo a quantidade da protena secretada por um indivduo suficiente para iniciar o desenvolvimento sexual em mais de 500 milhes de volvox assexuados, um nico volvox indutor pode converter um reservatrio inteiro para a sexualidade. Essa descoberta explica uma observao feita h quase 90 anos, de que na intensa radiao solar do vero de Nebraska, Volvox capaz

de aparecer, multiplicar-se, realizando uma orgia sexual reprodutiva em poas de gua da chuva de apenas duas semanas (Powers, 1908). Ainda que reservatrios temporrios formados pela gua das chuvas sequem sob o calor do vero, Volvox encontrou um meio de sobrevivncia: usa o calor para induzir a formao de indivduos sexuados cujo acasalamento produz zigotos capazes de sobreviver sob condies que matam o organismo adulto. Observamos, tambm, que o desenvolvimento est criticamente ligado ao ecossistema ao qual o organismo se adaptou para sobreviver.

Diferenciao e Morfognese em Dictyostelium


O CICLO DE VIDA DO DICTYOSTELIUM. Um outro tipo de organizao multicelular

derivada de organismos unicelulares encontrada no Dictyostelium discoideum.* O ciclo de vida desse organismo fascinante ilustrado na Figura 1.22. Em seu ciclo vegetativo, uma solitria ameba haplide (chamada myxamoebae ou ameba social para distingui-las de espcies de amebas que sempre permanecem solitrias) vive em troncos cados, se alimentando de bactrias e se reproduz por ciso binria. Quando tiver esgotado seu suprimento de comida, dezenas de milhares dessas amebas se juntam para formar um fluxo corrente de clulas que convergem em um ponto central. Aqui se amontoam uma sobre a outra sob forma de um cone chamado de agregado apertado ou justo. Subseqentemente, uma ponta surge no topo desse monte, que se dobra formando uma lesma migratria (com a ponta na frente). A lesma (geralmente lhe dado um ttulo mais dignificado de pseudoplasmdio ou grex) mede normalmente de 2 a 4 mm de comprimento e envolvida por uma bainha viscosa. O grex comea a migrar (se o ambiente est escuro e mido) com sua ponta anterior um pouco levantada; quando atinge uma rea iluminada, a migrao cessa, e o grex se diferencia em um corpo de frutificao composto de clulas esporos e pednculo. As clulas anteriores, representando 15 a 20 porcento de toda populao celular, formam o pednculo tubular. O pednculo comea na parte centro-anterior da clula, enquanto as clulas prpedunculares comeam a secretar um revestimento extracelular estendendo um tubo atravs do grex. medida que as clulas pr-pedunculares se diferenciam, formam vacolos e aumentam de tamanho levando a massa de clulas pr-pednculo que havia ficado nos quatro-quintos posteriores do grex (Jermyn e Williams, 1991). As clulas do pednculo morrem, mas as clulas posteriores, elevadas acima do pednculo, transformam-se em clulas-esporo. Essas se dispersam, cada uma tornando-se uma nova mixameba. Em adio a esse ciclo sexual, existe a possibilidade para sexo em Dictyostelium. Duas amebas podem fundir-se para criar uma clula gigante, que digere todas as outra clulas do agregado. Quando tiver ingerido todos seus vizinhos, se enquista em uma parede grossa e sofre divises meitica e mittica; e por fim, novas mixamebas so liberadas. Dictyostelium tem sido um maravilhoso organismo experimental para biologistas do desenvolvimento, porque clulas inicialmente iguais so diferenciadas em dois tipos alternativos de clulas, esporo e pednculo. tambm um organismo onde clulas individuais se juntam para formar uma estrutura coesa composta por tipos de clulas diferenciadas, parecido com a formao de tecidos em organismos
* Embora chamado coloquialmente um fungo celular pegajoso, Dictyostelium no um fungo (como Neurospora), nem consistentemente pegajoso. melhor consider-lo como uma ameba social.

22

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Lesma (Pseudoplasmdio; grex)

15 h 14 h

16 h 17 h

MIGRAO

CULMINAO

20 h

12 h

Esporos

23 h

10 h AGREGAO Mixamebas 9 h Corpo de frutificao 6 h Fluxos celulares maduro

24h

Figura 1.22

Ciclo vital de Dictyostelium discoideum. Esporos haplides originam mixamebas, que podem reproduzir-se assexualmente para formar mais mixamebas haplides. A medida que diminui o suprimento alimentar, ocorre agregao em pontos centrais, e forma-se um agregado de pseudoplasmdio. Finalmente, esse pra de se movimentar e forma um corpo de frutificao que libera mais esporos. Os nmeros referem-se s horas decorridas desde que a diluio nutricional iniciou a seqncia desenvolvimental.

mais complexos. A agregao de milhares de amebas em um nico organismo um feito incrvel de organizao e convida experimentao para resolver perguntas sobre os mecanismos envolvidos.
AGREGAO DE CLULAS DE DICTYOSTELIUM. A primeira pergunta : O que induz a ameba a se agregar? Microcinematografia de espaamento temporal mostrou que no ocorre movimento direcionado durante as primeiras 4-5 horas aps carncia nutricional. Durante as 5 horas seguintes, porm, as clulas so vistas mover-se por aproximadamente 20m / min durante 100 segundos. Esse movimento cessa aps aproximadamente 4 minutos, e em seguida recomea. Embora o movimento seja direcionado para um ponto central, no um simples movimento radial. Antes, as clulas se juntam umas s outras para formar correntes; essas convergem em correntes maiores, e finalmente todas se juntam no centro. Bonner (1947) e Shaffer (1953) mostraram que esse movimento devido quimiotaxia: as clulas so guiadas para os centros de agregao por uma substncia solvel. Essa substncia foi posteriormente identificada como adenosina 3,5 monofosfato cclico (cAMP) (Konijn et al., 1967; Bonner et al., 1969), cuja estrutura qumica est mostrada na Figura 1.23A. A agregao iniciada medida que cada clula comea a sintetizar o cAMP. No h clulas dominantes que comeam a secreo ou controlam as outras. Antes, os locais de agregao so determinados pela distribuio das amebas (Keller e Segal, 1970; Tyson e Murray, 1989). Clulas vizinhas respondem ao cAMP de duas maneiras: ou iniciando sua movimentao de acordo com as pulsaes de cAMP, ou acompanhando a liberao de seu cAMP prprio (Robertson et al., 1972; Shaffer, 1975). Em seguida, a clulas no respondem mais aos pulsos de cAMP por vrios minutos. O

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

23

(A)

Adenina

(B)

(C)

(D)

Figura 1.23

resultado uma onda giratria em espiral de cAMP, que se propaga atravs da populao de clulas (Figura 1.23B-D). medida que chega cada onda, as clulas do mais um passo para o centro.* A diferenciao de amebas individuais em clulas pedunculares (somticas) ou esporos (reprodutivas) uma questo complexa. Raper (1940) e Bonner (1957) demonstraram que as clulas anteriores normalmente formam pednculo, enquanto as clulas remanescentes, posteriores, em geral esto destinadas a formar esporos. No entanto, a remoo cirrgica da parte anterior da lesma no elimina a capacidade do grex formar um pednculo. Em vez disso, as clulas que agora se encontram no final anterior aps a cirurgia (e que originalmente estavam destinadas a formar esporos), agora formam o pednculo (Raper, 1940). De alguma maneira, tomada uma deciso de modo tal, que clulas anteriores virem clulas pedunculares e clulas posteriores virem esporos. Essa habilidade de clulas mudarem seus destinos desenvolvimentais,

* A bioqumica dessa reao envolve um receptor que liga o cAMP. Quando essa ligao ocorre, realiza-se transcrio especfica de genes, iniciada movimentao em direo fonte de cAMP, e enzimas adenilciclases (que sintetizam cAMP a partir de ATP) so ativadas. O cAMP recm-formado ativa seus receptores prprios, assim como aqueles de seus vizinhos. As clulas na rea permanecem insensveis s novas ondas de cAMP at que o cAMP ligado seja removido dos receptores por outra enzima da superfcie celular, a fosfodiesterase (Johnson et al., 1989). A matemtica de tais reaes de oscilao prev que a difuso de cAMP seria inicialmente circular. Porm, medida que o cAMP interage com as clulas que recebem e propagam o sinal, as clulas que recebem a parte frontal da onda comeam a migrar com uma velocidade diferente daquela das clulas atrs delas. O resultado a espiral rotatria de cAMP e a migrao vistas na Figura 1.23. interessante que as mesmas frmulas matemticas predizem o comportamento de certas reaes qumicas e a formao de novas estrelas em galxias espirais rotatrias (Tyson e Murray, 1989).

Quimiotaxia de amebas de Dictyostelium devida ondas espirais de cAMP. (A) estrutura qumica do cAMP. (B) Visualizao de vrias ondas de cAMP no meio. Clulas centrais secretam cAMP em intervalos regulares, e cada secreo difunde para fora como um onda concntrica. As ondas so mapeadas saturando-se papel de filtro com cAMP radioativo e colocando-o sobre uma colnia em agregao. O cAMP das clulas secretoras dilui o cAMP radiativo. Quando a radioatividade no papel registada (colocando-o sobre filme de raiosX), as regies de alta concentrao de cAMP na cultura aparecem mais claras que aquelas de baixa concentrao de cAMP. (C,D) Ondas espirais de amebas movendo-se em direo fonte inicial de cAMP. (C) Essa microfotografia em campo escuro processada digitalmente mostra cerca de 107 clulas. Como clulas mveis e imveis dispersam a luz diferentemente, a fotografia reflete movimento celular. As bandas claras so compostas de clulas migratrias alongadas; as bandas escuras so clulas que pararam de se mover e se arredondaram. (D) As clulas formam correntes, a espiral de movimento ainda pode ser vista movendo-se em direo ao centro. (B de Tomchick e Devreotes, 1981, cortesia de P. Devreotes; C e D de Siegert e Weijer, 1989, cortesia de F. Siegert.)

24

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Figura 1.24

Clulas de Dictyostelium sintetizam um adesivo, glicoprotena 24-kDa, pouco aps a inanio nutricional. Clulas de Dictyostelium foram coradas com um anticorpo fluorescente que se liga glicoprotena 24-kDa e foram em seguida observada sob luz ultravioleta. Essa protena no foi vista em amebas que tinham apenas parado de se dividir. No entanto, como mostrado aqui 10 horas aps o fim da diviso celular amebas individuais so vistas apresentando essa protena em suas membranas celulares e so capazes de aderir umas s outras.

de acordo com sua localizao dentro do organismo inteiro, e assim compensar por partes faltantes, chamada regulao. Veremos esse fenmeno em muitos embries, inclusive naqueles dos mamiferos.
MOLCULAS DE ADESO CELULAR EM DICTYOSTELIUM. Como essas clulas

individuais aderem entre si para formar um organismo coeso? Este o mesmo problema que enfrentam as clulas embrionrias, e a soluo que evoluiu para os protistas a mesma que aquela usada pelos embries: molculas de adeso celular reguladas pelo desenvolvimento. Enquanto esto crescendo mitoticamente em bactrias, clulas de Dictyostelium no aderem umas s outras. Porm, uma vez que a diviso celular cessa, as clulas se tornam progressivamente mais adesivas, alcanando um patamar de coesividade mxima aproximadamente aps 8 horas de inanio. A adeso clula-clula mediada por uma glicoprotena de 24.0000 Da (24-kDa) que est ausente em clulas em crescimento mas pode ser vista pouco depois dessa fase (Figura 1.24; Knecht et al., 1987; Loomis, 1988). Essa protena sintetizada a partir de mRNA recm-transcrito e fica localizada nas membranas celulares das mixamebas. Se essas clulas so tratadas com anticorpos que se ligam a essa protena e a mascaram, as clulas no iro aderir umas s outras e todo desenvolvimento subseqente cessa. Uma vez que essa agregao inicial tiver ocorrido, estabilizada por uma segunda molcula de adeso celular. Essa glicoprotena de 80-kDa tambm sintetizada durante a fase de agregao. Se apresentar defeitos ou estiver ausente nas clulas, lesmas pequenas se formaro, e seus corpos de frutificao s atingiro aproximadamente um tero de seu tamanho normal. Assim, o segundo sistema de adeso celular, parece ser necessrio para a reteno de um nmero de clulas suficientemente grande para a formao de grandes corpos de frutificao (Mller e Gerisch, 1978; Loomis, 1988). Um terceiro sistema de adeso ativado tardiamente no desenvolvimento, quando a lesma estiver migrando. A protena ou grupo de protenas que intervem no terceiro sistema pode existir somente em clulas pr-esporo e pode ser responsvel pela separao de clulas pr-esporo de clulas pr-pednculo (Loomis, comunicao pessoal). Assim, Dictyostelium evoluiu para trs sistemas de adeso clula-clula regulados pelo desenvolvimento, e que so necessrios para a morfognese de clulas individuais para formar um organismo coerente. Como veremos em captulos subseqentes, clulas de metazorios tambm usam molculas de adeso celular para formar os tecidos e rgos do embrio. Dictyostelium um organismo multicelular em tempo parcial que no forma muitos tipos de clulas (Kay et al., 1989), e os organismos multicelulares mais complexos no se formam pela agregao de clulas anteriormente independentes. No entanto, muitos dos princpios do desenvolvimento demonstrados por esse simples or-

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

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ganismo tambm aparecem em embries de filos mais complexos. A habilidade de clulas individuais sentir um gradiente qumico (como a resposta da ameba ao cAMP) muito importante para a migrao celular e morfognese durante o desenvolvimento animal. Ainda mais, o papel das protenas da superfcie celular para a coesividade celular pode ser visto atravs do reino animal, e molculas indutoras da diferenciao esto agora comeando a ser isoladas de organismos metazorios.

Informaes adicionais

&

Especulaes

Evidncia e Anticorpos

Biologia, tal como qualquer outra cincia, no trata de fatos; antes, trata de evidncias. Vrios tipos de evidncia sero apresentados neste livro; no so todos de equivalente vigor. Como exemplo, vamos usar a anlise da adeso celular em Dictyostelium. O primeiro e mais fraco tipo de evidncia a evidncia correlativa. Aqui, so feitas correlaes entre dois ou mais eventos, e infere-se que um evento estimule o outro. Como vimos, anticorpos marcados com fluorescncia para uma certa glicoprotena de 24 kDa, no marcam clulas vegetativas em diviso; porm, esses mesmos anticorpos acham a protena em membranas celulares de mixameba logo que as clulas param de se dividir e tornam-se competentes para agregar (veja Figura 1.24). Assim, existe uma correlao entre a presena dessa glicoprotena da membrana celular e a capacidade de agregao. Evidncia correlativa d um ponto de partida para investigaes, mas no se pode afirmar com certeza que um evento estimula outro somente baseado em correlaes. Embora se possa inferir que a sntese dessa protena causa a adeso das clulas, tambm possvel que adeso celular leve as clulas a sintetizar essa nova glicoprotena, ou que a adeso celular e a sntese da glicoprotena 24-kDa sejam eventos separados, iniciados pela mesma causa subjacente. A ocorrncia simultnea dos dois eventos pode mesmo ser coincidncia e os eventos no terem relao um com o outro.*

Como ento ir para alm da mera correlao? No estudo da adeso celular em Dictyostelium, o prximo passo foi usar aqueles mesmos anticorpos para bloquear a adeso de mixamebas. Usando uma tcnica introduzida pelo laboratrio de Gerisch (Beug et al., 1970), Knecht e colaboradores (1987) tomaram os anticorpos que ligam essa glicoprotena 24-kDa e isolaram seus stios ligantes de antgeno (as partes da molcula do anticorpo que reconhecem o antgeno). Isso foi necessrio porque o todo da molcula de anticorpo contm dois stios ligantes de antgeno que iriam ligar-se artificialmente de maneira cruzada e aglutinar as mixamebas. Quando esses fragmentos ligantes de antgeno (chamados Fragmentos Fab) foram adicionados s clulas competentes para agregao, as clulas no puderam se agregar. Os fragmentos de anticorpo impediram as clulas de aderir entre si, presu mivelmente por ligarse a glicoprotena 24-kDa, bloqueando sua funo. Esse tipo de evidncia chamado evidncia-deperda-de-funo. Se bem que mais forte que a evidncia correlativa, ela ainda no exclui outras inferncias. Por exemplo, possvel que os anticorpos tenham matado a clula (o que poderia acontecer se a glicoprotena 24-kDa for um crtico canal de transporte). Isso tambm impediria a adeso celular. Ou talvez, a glicoprotena 24-kDa nada tinha a ver com a adeso propriamente, mas necessria para o funcionamento da verdadeira molcula adesiva (como atravs da estabilizao de pro-

* Em uma carta irnica, caoando de tais inferncias correlativas, Sies (1988) demonstrou uma notvel boa correlao entre o nmero de cegonhas vistas na Alemanha Ocidental de 1965 at 1980 e o nmero de bebs nascidos durante esses mesmos anos.

tenas de membrana em geral). Nesse caso, bloquear a glicoprotena tambm causaria a inibio da agregao celular. Assim, a evidncia perda-defuno precisa ser amparada por muitos controles demonstrando que agentes causadores de perda de funo derrubam especificamente aquela funo em particular, e nada mais. O tipo mais forte de evidncia evidncia-de-ganho-de-funo. Aqui, o incio do primeiro evento estimula um segundo e mesmo em situaes onde nenhum desses eventos ocorre usualmente. Recentemente, da Silva e Klein (1990) e Faix e colaboradores (1990) obtiveram tal evidncia para mostrar que a glicoprotena 80-kDa uma molcula adesiva. Isolaram o gene para essa protena e o modificaram de uma maneira a motiv-lo ser expresso continuamente. Em seguida, recolocaram-no em mixameba bem-alimentada, crescendo vegetativamente, que usualmente no expressa essa protena e no tem capacidade de adeso. A presena dessa protena na membrana celular dessas clulas em diviso foi confirmada por marcao com anticorpos. Tais clulas agora aderiram umas s outras mesmo nos estados vegetativos, o que normalmente no fazem. Assim, elas tinham ganho uma funo adesiva somente por expressar essa glicoprotena em particular nas suas superfcies celulares. Essa evidncia de ganho-de-funo mais convincente que outros tipos de anlise. Experimentos semelhantes foram recentemente realizados em clulas de mamferos (veja captulo 3), para demonstrar a presena de determinadas molculas adesivas celulares no embrio em desenvolvimento.

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

DIFERENCIAO EM DICTYOSTELIUM. A diferenciao em uma clula-pedncu-

lo ou em uma clula-esporo reflete um dos principais fenmenos da embriognese: a seleo pela clula de uma trajetria desenvolvimental. As clulas freqentemente selecionam um determinado destino desenvolvimental quando alternativas esto disponveis. Uma determinada clula num embrio de vertebrado por exemplo, pode tornar-se uma clula da epiderme ou um neurnio. Em Dictyostelium, vemos uma deciso dicotmica simples, porque somente dois tipos celulares so possveis. Como uma clula torna-se uma clula de pednculo ou uma clula de esporo? Embora os detalhes no sejam totalmente conhecidos o destino de uma clula parece ser regulado por certas molculas difusivas. Os dois principais candidatos so o fator indutor de diferenciao (DIF) e o cAMP. DIF parece ser necessrio para a diferenciao da clula peduncular. Esse fator, tal como o fator indutor de sexo em Volvox, eficaz em concentraes muito baixas (10-10M); e, como a protena de Volvox, parece induzir a diferenciao de um determinado tipo de clula. Quando adicionado s amebas isoladas ou mesmo s clulas pr-esporo (posteriores), induz a formao de clulas pedunculares. A sntese desse lipdeo de baixo peso molecular regulada geneticamente, pois h cepas mutantes de Dictyostelium que formam somente o precursor de clulas-esporo e no de clulas pedunculares. Quando DIF adicionado a essas culturas de mutantes, clulas penduculares conseguem se diferenciar (Kay e Jermyn, 1983; Morris et al., 1987), e novos mRNAs especficos pr-pednculo so encontrados no citoplasma celular (Williams et al., 1987). O mecanismo pelo qual DIF induz 20 porcento das clulas do plasmdio (grex) a tornar-se tecido peduncular ainda controverso (veja Early et al., 1995). DIF pode agir atravs da liberao de ons de clcio de compartimentos intracelulares no interior da clula (Schaulsky e Loomis, 1995). [other.html#intro3] Embora DIF estimule amebas a tornarem-se clulas pr-pednculo, a diferenciao de clulas pr-esporo mais provavelmente controlada por pulsos contnuos de cAMP. Altas concentraes de cAMP iniciam a expresso de mRNA pr-esporo especfico, em amebas agregadas. Alm disso, quando lesmas so colocadas em um meio contendo uma enzima que destri cAMP extracelular, as clulas pr-esporo perdem suas caractersticas de diferenciao (Figura 1.25; Schaap e van Driel, 1985; Wang et al., 1988a,b).

(A)

(B)

Figura 1.25

Substncias qumicas que controlam a diferenciao em Dictyostelium. (A) e (C) (B) mostram os efeitos de se colocar lesmas Dictyostelium em um meio contendo enzimas que destroem cAMP extracelular. (A) Grex (pseudoplasmdio) corado para presena de uma protena pr-esporo especfica (regies claras). (B) Grex semelhante corado aps tratamento com enzimas que degradam cAMP. No visto produto pr-esporo especfico. (C) Amplificao maior de uma lesma tratada com DIF (na ausncia de amnia). O corante usado liga-se parede de celulose das clulas pedunculares. Todas as clulas do grex tornaram-se clulas pedunculares. (A e B de Wang et al., 1988a; C de Wang e Schaap, 1989; cortesia dos autores.)

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

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Informaes adicionais

&

Especulaes

Como o Grex Sabe Qual Lado Est Para Cima

E TODAS AS AMEBAS do grex comearem no mesmo nvel, como podem clulas nos quatro-quintos posteriores da lesma se diferenciar em clulas-esporo, enquanto clulas equivalentes do quinto anterior se tornam clulas pedunculares? A resposta pode estar na observao de que as clulas originais no so todas iguais. Amebas sujeitas inanio durante a parte precoce de seu ciclo celular tendem a se mover para a poro anterior do pseudoplasmdio, enquanto amebas expostas inanio durante o fim do ciclo, tendem a permanecer na poro posterior (McDonald e Durston, 1984; Weijer et al., 1984). Esse trabalho foi confirmado e ampliado por Ohmori e Maeda (1987), que mostraram que clulas no-alimentadas durante a parte tardia do ciclo celular, respondem de maneira diferente ao cAMP e mostram adesividade muito mais alta que clulas jejuadas imediatamente aps a mitose. Williams e colaboradores (1989) acharam que clulas pr-esporo e pr-pednculo podem ser diferenciadas em agregados precoces e que esto distribudas de modo aleatrio atravs desses montes hemisfricos. Assim, as tendncias para certos destinos foram estabelecidas at mesmo antes do grex comear a migrar. Dentro de cada agregado, a maioria das clulas pr-pednculo, migram ativamente para o anterior, enquanto clulas pr-esporo permanecem no que se tornar a regio posterior do grex. Essa migrao provavelmente devida a repetidos pulsos de cAMP que ain-

da esto emanando da ponta apical do agregado. Esses pulsos so quimiotcticos para clulas pr-pednculo, mas no para clulas pr-esporo, de modo que atraem as clulas pr-pednculo para a ponta da agregado (Matsukuma e Durston, 1979; Mee et al., 1986; Siegert e Weijer, 1991; Takeuchi, 1991).Portanto, o AMP cclico parece ter vrias funes no desenvolvimento de Dictyostelium. Agrega as clulas umas s outras, induz diferenciao de clulas pr-esporo e dirige a migrao de clulas pr-pednculo para a parte anterior do agregado. Uma vez completo, o agregado tomba sobre um dos lados e forma o grex migratrio. A maioria das clulas pr-pednculo esto nos 20 porcento anteriores do grex, porm, h tambm algumas clulas pr-pednculo espalhadas atravs da parte posterior. Clulas pr-pednculo podem ser distinguidas pela sua secreo de protena A da matriz extracelular para espaos intercelulares. No centro da poro anterior do grex, um outro grupo de clulas pr-pednculo comea a secretar uma segunda nova protena (protena B), para sua matriz extracelular. Essas clulas so chamadas clulas pr-pednculo B (pstB), enquanto a maioria das clulas pr-pednculo so conhecidas como clulas prpednculo A (pstA) (Figura 1.26). Outro grupo de clulas pr-pednculo, as clulas pstO, esto espalhadas de maneira esparsa atravs das clulas pr-esporo, e migram mais lentamente em direo ao anterior. Quando o grex se encontra na

luz solar, cessa de migrar e sofre a diferenciao final em esporos e pednculo. Durante esse processo (chamado culminao), o grex se apia em um dos terminais fazendo com que as clulas traseiras se tornem sua base. Algumas clulas pstA migram para o tubo central de clulas pstB, e quando entram em contato com o tubo central, diferenciam-se em clulas pstB, sintetizando componentes de uma nova matriz extracelular. As clulas novas so adicionadas regio anterior do tubo, forando-o mais para dentro da estrutura culminativa. Esse tubo se diferencia para tornar-se o pednculo. Ao mesmo tempo, as clulas pstA que tinham ficado na regio posterior do
Figura 1.26

Regulao da diferenciao de clulas pedunculares durante a fase de culminao do crescimento de Dictyostelium. Representao esquemtica mostrando que clulas pr-esporo e pr-pednculo esto em geral misturadas no estgio precoce da agregao, mas se separam de modo que a maioria das clulas prpednculo se encontrem na parte anterior do grex. As clulas pr-pednculo A constituem a maior parte do anterior do grex, com alguma clulas similares no posterior. Clulas prpednculo B so vistas na parte central da poro anterior do grex. Nos estgios precoces da culminao, as clulas pr-pednculo do posterior migram para formar o disco basal e os clices do saco de esporos; as clulas prpednculo A do anterior migram para o centro e se tornam clulas pr-pednculo B. Isso estende o pednculo at que esse eleve a caixa de esporos acima da superfcie. (Segundo Harwood et al., 1992).
Clice superior

Clulas pr-pednculo A Clulas pr-pednculo B Clulas pr-pednculo AB Direo do movimento celular Clulas pr-esporo Pr-pednculo AB Guarda da retaguarda Pr-pednculo A

Clulas pr-esporo Pr-pednculo AB Pr-pednculo B Disco basal interior Disco basal exterior Clice Inferior Pr-pednculo AB

Pr-pednculo B Agregado Grex Culminante precoce Culminante mdio

Pr-pednculo B Culminante tardio

28

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

grex migram para as bordas da regio presporo e diferenciam-se no invlucro dos esporos e disco basal (Williams e Jermyn, 1991; Harwood et al., 1992). Finalmente, os esporos so levantados 2 mm acima do solo, de onde podem ser dispersos pelo vento ou um animal que passa. O gatilho para a culminao parece ser a luz solar ou a baixa umidade. Experimentos recentes sugerem que esses dois fatores causam a difuso de amnia da lesma. A amnia produzida copiosamente por lesmas migratrias e reprime a culminao. Sempre que a amnia estiver exaurida (quer naturalmente ou experimentalmente), a culminao comea (Schindler e Sussman, 1977; Newell e Ross, 1982; Bonner et al., 1985). A amnia inibe a converso de clulas pstA em pstB e probe a continuao da formao do pednculo
cAMP

(Gross et al., 1983; Wang et al., 1990). Bonner e colaboradores (1985), sugeriram que como a luz causa difuso mais rpida da amnia, remove o inibidor permitindo assim, o progresso da culminao. A amnia parece inibir a produo do pednculo pelos menos de duas maneiras. Inibe a ao de DIF (Wang e Schaap, 1989), e inibe a produo de cAMP nas clulas pr-pednculo (Schindler e Sussman, 1977; Harwood et al., 1992). Esse cAMP necessrio para ativar a protena quinase cAMP-dependente (PKA). Clulas pr-pednculo contendo PKA nofuncional, no fosforilam certas protenas. Essas clulas no migram para a regio central anterior, nem se diferenciam em clulas do pednculo (Firtel e Chapman, 1990; Harwood et al., 1992). Os dados sugerem que quando PKA ativada,

passa a fosforilar um repressor que estava inibindo a expresso dos genes de diferenciao do pednculo. No estado fosforilado, o inibidor inativo. Portanto, uma vez que os nveis de cAMP se elevam (pela remoo da amnia), a PKA pode inativar o inibidor dos genes formadores do pednculo (Figura 1.27). [intro.4html]
Figura 1.27

Uma hiptese para a iniciao coordenada da culminao e diferenciao de clulas pedunculares em Dictyostelium. A luz solar dissipa a amnia na parte anterior do grex, permitindo maior produo de cAMP nas clulas pr-pednculo. A concentrao mais alta de cAMP ativa a PKA, que fosforila um inibidor da expresso gnica do pednculo. O inibidor fosforilado no pode mais inibir os genes pednculo-especficos. A seqncia pela qual a formao de esporos inibida, no est clara. (Baseado em modelos de Bonner et al., 1985, e Harwood et al., 1992)

Amnia

Repressor ativo da diferenciao e de genes de migrao peduncular PKA inativa cAMP PKA ativa

Migrao continuada do grex

Luz solar

Repressor inativo (fosforilado)

Transcrio do gene da protena B da matriz extracelular; migrao de clulas pr-pednculo; diferenciao e culminao peduncular

Padres desenvolvimentais entre metazorios


Como o restante deste livro se ocupa do desenvolvimento de metazorios - animais multicelulares que atravessam estgios embrionrios de desenvolvimento - apresentaremos um viso panormica dos seus padres desenvolvimentais.* A Figura 1.28 ilustra os principais rumos evolutivos do desenvolvimento metazorio. A observao mais impressionante que a vida no evoluiu segundo uma linha reta; apresenta diversos caminhos evolutivos ramificados. Podemos ver que a maioria das espcies de metazorios pertence a um de dois principais ramos de animais: protostomatas e deuterostomatas.
*Plantas passam por padres igualmente complexos e fascinantes de desenvolvimento embrionrio e ps-embrionrio. No entanto, o desenvolvimento das plantas difere significativamente daquele dos animais; a incluso de um tratamento abrangente do seu desenvolvimento teria dobrado a extenso deste livro. Por isso, foi tomada a deciso de enfocar neste texto, o desenvolvimento dos animais. Para uma reviso, veja Singer, 1997.

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

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BILATERIA DEUTEROSTOMATAS PROTOSTOMATAS

RADIATA

PARAZOA

Vertebrados

Ascdios (Tunicados)

Moluscos Equinodermos

Artrpodos Aneldeos

Nematelmintos

Platelmintos

Cnidrios (Celenterados)

Porferos (Esponjas)

Segmentados

No-segmentados

Larva trocfora Clivagem em espiral gastrulao protostosomal

da

ma

lo

qu

es

ag

em

Li

nh

ag

Clivagem radial gastrulao deuterostomal

nh

Li

SIMETRIA BILATERAL

Platelmintos primitivos (acelomados)

SIM

ET

RA RIA

DIA

Larvas planulides

Protozorios coloniais primitivos

Protistas flagelados

Figura 1.28

Principiais divergncias evolucionrias em animais existentes. (Outros modelos so possveis, porm, os esquemas em geral so todos semelhantes ao mostrado aqui.)

Os Porferos Considera-se que os protistas coloniais deram origem, ao menos, a dois grupos de metazorios, ambos passando por estgios embrionrios. Um desses grupos o Porfero (esponjas). Esses animais desenvolvem-se de um modo to diferente daquele de qualquer outro grupo de animais, que alguns taxonomistas sequer consideram-nos metazorios (chamando-os, parazorios). Uma esponja tem trs tipos principais de clulas somticas, mas um deles, o arquecito, pode se diferenciar em todos os outros

Li

nh

ag

em

ac

elo

Larva dipleura (tornria)

ce

ps

eu

do

ce

lo

ad em
m ad a

izo

30

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

tipos. As clulas de uma esponja quando passadas por uma peneira, podem regenerar novas esponjas a partir de clulas individuais. Ainda mais, em alguns casos, tal reagregao espcie-especfica: se clulas individuais de esponja de duas espcies diferentes forem misturadas, cada uma que se re-forma contm somente clulas de uma espcie (Wilson, 1907). Nesses casos, admite-se que os arquecitos mveis colecionam clulas de sua espcie, mas no das outras (Turner, 1978). Esponjas no contm mesoderma, no havendo portanto verdadeiros sistemas de rgos em Porfero; esses seres no tm tubo digestivo, sistema circulatrio, nervos ou msculos. Assim, apesar de passarem por estgios embrionrios e larvais, esponjas so muito pouco parecidos com a maioria dos metazorios (veja Fell, 1997). Protostomatas e Deuterostomatas O outro grupo de metazorios emergindo dos protistas coloniais caracterizado pela presena de trs camadas germinativas durante o desenvolvimento. Alguns membros do grupo constituem os Radiatas, assim chamados porque tm simetria radial tal como um tubo ou uma roda. Os Radiatas incluem os cnidrios (medusas, corais e hidras) e ctenforos (medusas de crista). Nesses animais, o mesoderma rudimentar, consistindo de clulas escassamente disseminadas em uma matriz gelatinosa. Porm, a maioria dos metazorios tem simetria bilateral, constituindo assim, os Bilaterias. Esses filos bilaterais so classificados como platelmintos, protostomatas ou deuterostomatas. Pensa-se que todos os Bilateria descendam de um tipo primitivo de platelminto. Esses platelmintos foram os primeiros a ter mesoderma verdadeiro (embora no tivessem ficado ocos para formar uma cavidade corprea), e foram considerados parecidos com as larvas de certos celenterados contemporneos. Enquanto os platelmintos so desprovidos de celoma (cavidade corprea), os nematelmintos (e rotiferas) tm uma cavidade corprea diferente daquela de todos os outros animais, por ser desprovida de revestimento mesodrmico. A maioria dos filos so celomados, isto , possuem uma cavidade corporal revestida por mesoderma. As diferenas entre as duas divises de Bilateria esto ilustradas na Figura 1.29. Protostomatas (do Grego, boca primeiro), incluem os filos dos moluscos, artrpodos e vermes; so assim chamados porque a boca formada em primeiro lugar, junto ou prximo da abertura intestinal, produzida durante a gastrulao. O nus se forma mais tarde em outro local. A cavidade corprea desses animais se forma a partir de uma previamente slida corda de clulas mesodrmicas, tornadas ocas. A outra grande diviso dos Bilateria a linhagem dos deuterostomatas. Os filos nessa diviso incluem os chordatas e os equinodermos. Embora possa parecer estranho classificar seres humanos e cavalos no mesmo grupo que estrelas-do-mar e ourios-do-mar, alguns traos embriolgicos acentuam esse parentesco. Em primeiro lugar, nos deuterostomatas (do Grego significando boca depois), a abertura bucal formada depois da abertura anal. Tambm, enquanto prostostomatas em geral formam suas cavidades corpreas tornando oco um bloco slido de mesoderma (formao esquizelide), a maioria dos deuterostomatas formam suas cavidades corpreas a partir de bolsas mesodrmicas estendendo-se do intestino (formao enteroclica). Porm, deve-se mencionar que h muitas excees a essas generalizaes. Protostomatas e deuterostomatas diferem na maneira pela qual so clivados. Na maioria dos deuterostomatas, os blastmeros so perpendiculares ou paralelos uns aos outros. Isso chamado clivagem radial. Protostomatas ao contrrio, tm uma extensa variedade de tipos de clivagem. Muitas espcies formam blstulas compostas por clulas que esto em ngulos agudos relativamente ao eixo polar do embrio. So por isso considerados sofrer clivagem espiral. Alm disso, os blastmeros em estgio de clivagem, na maioria dos deuterostomatas, tm maior capacidade de regular seu desenvolvimento do que os prostostomatas. Se um nico blastmero removido de um embrio quadricelular de ourio-do-mar ou camundongo, tal blastmero ir desenvolver-se em um organismo inteiro, e os trs-quartos restantes do embrio tambm iro se desenvolver

CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

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(A) PROTOSTOMATAS 1. Clivagem espiral

(B) DEUTEROSTOMATAS 1. Clivagem radial

2. Desenvolvimento esquizoclico Celoma Blastocele Mesoderma se divide Mesoderma

2. Desenvolvimento enteroclico Celoma

Blastocele

Bolsa Intestinal Bolsas se destacam Mesoderma

Intestino 3. Tendncia a no regulao

Intestino

Intestino 3. Tendncia regulao

Intestino

Embrio de de 4 clulas

Um blastmero excludo

Desenvolvimento interrompido

Embrio de de 4 clulas

Um blastmero excludo

Duas larvas normais se desenvolvem

Figura 1.29

normalmente. Porm, se a mesma operao fosse realizada em um embrio de lesma ou de verme, tanto o blastmero isolado como os restantes se desenvolveriam em embries parciais cada um carente daquilo que foi formado a partir dos outros. A evoluo dos organismos depende de alteraes herdadas em seu desenvolvimento. Um dos maiores avanos evolucionrios o ovo amnitico ocorreu entre os deuterostomatas. Esse tipo de ovo, exemplificado pelo da galinha (Figura 1.30), considerado ter-se originado dos ancestrais anfbios dos rpteis, h cerca de 255 milhes de anos. O ovo amnitico permitiu aos vertebrados vagar pela terra longe de suprimentos de gua existentes. Ao passo que a maioria dos anfbios obrigada a voltar para a gua para procriar e permitir o desenvolvimento de seus ovos, o ovo amnitico carrega seu prprio suprimento de gua e nutrientes. O ovo fertilizado internamente e contm a gema para nutrir o embrio em desenvolvimento. Ainda, contm quatro bolsas: o saco vitelnico, que armazena protenas nutrientes, o mnio, que contm fluido banhando o embrio, a alantide, na qual restos do metabolismo embrionrio so coletados, e o crio, que interage com o ambiente externo, seletivamente permitindo materiais chegar ao embrio. O todo dessa estrutura est contido em uma casca que permite a difuso de oxignio, ao mesmo tempo sendo suficientemente dura para proteger o embrio de agresses ambientais. Desenvolvimento semelhante de protees do ovo permitiram aos artrpodes serem os primeiros invertebrados sobre a terra. Assim, a travessia final dos limites entre gua e terra ocorreu com a modificao do estgio mais precoce do desenvolvimento o ovo.

Tendncias principais dos prostostomatas e deuterostomatas. Excees todas essas tendncias gerais evoluram secundariamente em certos membros de cada grupo. (A maioria dos vertebrados por exemplo, no tem uma formao estritamente enteroclica da cavidade corporal; e os embries de certos deuterostomatas, como os tunicados, no sofrem regulao se os blastmeros so deles removidos.)

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Figura 1.30

Embrio Intestino mnio Cavidade amnitica Alantide Crio Gema Saco vitelino (A) (B)

Diagrama do ovo amnitico do pinto, mostrando o desenvolvimento das membranas envolvendo o embrio. (A) Incubao de trs dias. O mesoderma extra-embrionrio se estende do embrio para prover vasos sangneos para e de vrias regies fora do embrio. (B) Incubao de sete dias. A origem das membranas ser detalhada no captulo 9. A gema ser finalmente rodeada pelo saco vitelnico que permite a entrada de nutrientes nos vasos sangneos. O crio derivado em parte do ectoderma e estende-se do embrio at a casca (onde ir trocar oxignio e gs carbnico e obter clcio da casca). O mnio prove o meio fluido no qual cresce o embrio, e a alantide coleta resduos nitrogenados que seriam perigosos para o embrio. Finalmente, o endoderma se transforma no intestino e envolve a gema. A evoluo do mnio e das outras membranas extra-embrionrias constituiu uma grande linha divisria entre aqueles vertebrados cuja reproduo est ligada gua (anamniotas) e aqueles que podem se reproduzir em reas secas (amniotas).

Alantide

A biologia do desenvolvimento proporciona um sortimento infinito de fascinantes problemas e animais. No presente livro, encontraremos apenas uma pequenssima amostra deles, servindo para ilustrar os princpios mais importantes do desenvolvimento animal (para uma cobertura mais completa da diversidade do desenvolvimento animal atravs dos filos, veja Gilbert e Raunio,1997). Estamos apenas observando o conjunto das mars ao nosso alcance, enquanto todo o oceano do desenvolvimento se estende nossa frente. Aps uma breve viso dos princpios genticos e celulares relevantes para a biologia do desenvolvimento, investigaremos os estgios precoces da embriognese animal: fertilizao, clivagem, gastrulao e construo do plano do corpo vertebrado. Captulos posteriores se concentraro nos mecanismos genticos e celulares pelos quais ele elaborado. Embora uma tentativa de cobrir as variaes importantes que ocorreram no reino animal tivesse sido feita, um certo chauvinismo deuterostossmico pode ter ficado aparente.

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CAPTULO 1 Introduo ao Desenvolvimento Animal

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

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Genes e desenvolvimento: Introduo e tcnicas

O que gostaramos de saber se a estrutura determinada diretamente pela informao codificada no DNA, gravada no ovo... na extenso em que estrutura pode ser expressa por informao. JONATHAN BARD (1990) Os segredos que me enlaam e cativam so em geral segredos da hereditariedade: como uma semente de pra vira uma pereira em vez de um urso polar. CYNTHIA OZICK (1989)

NTRE OS CARACTERES que fornecem os dados para a teoria, e os genes postulados, aos quais os caracteres se referem, est todo o campo do desenvolvimento embrionrio. Aqui Thomas Hunt Morgan (1926) estava verificando que o nico caminho de gentipo para fentipo, passava atravs de processos desenvolvimentais. No comeo do sculo vinte, embriologia e gentica no eram consideradas cincias separadas. Divergiram na dcada de 1920, quando Morgan redefiniu a gentica como a cincia que estuda a transmisso dos traos em oposio embriologia, a cincia que estuda a expresso desses traos. Durante a ltima dcada, porm, as tcnicas da biologia molecular realizaram uma reaproximao entre embriologia e gentica. Na realidade, os dois campos se ligaram novamente a tal ponto que se torna necessrio uma discusso prvia da gentica molecular neste texto. Questes do desenvolvimento animal que no poderiam ser consideradas h uma dcada, esto sendo agora resolvidas por um conjunto de tcnicas envolvendo sntese de cidos nuclico e hibridizao. Este captulo procura situar essas novas tcnicas dentro do contexto do dilogo, ora em curso, entre gentica e embriologia.

As origens embriolgicas da teoria dos genes


Ncleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade? Mendel chamou-os Formbildungelementen, elementos construtores de formas; ns os chamamos de genes. Porm, na terminologia de Mendel que vemos como no sculo dezenove os conceitos de herana e desenvolvimento estavam intimamente entrelaados. Entretanto, as observaes de Mendel no indicaram onde na clula ficavam esses elementos hereditrios, nem como eram levados a se expressarem. A teoria dos genes, que viria a ser a pedra angular da gentica moderna, teve origem em uma controvrsia no campo da embriologia. Em fins sculo XIX, um grupo de cientistas comeou a estudar, por seu valor intrnseco, como ovos fertilizados davam origem a organismos adultos. Dois jovens embriologistas americanos, Edmund Beecher Wilson e Thomas Hunt Morgan (Figura 2.1), tornaram-se parte desse grupo de embriologistas fisiolgicos, cada um tornando-se partidrio na controvrsia sobre qual dos dois compartimentos do ovo fertilizado - o ncleo ou o citoplasma - controla a herana. 35

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

(B)

Figura 2.1

(A)

(A) E. B. Wilson (1856-1939; mostrado aqui em aproximadamente 1899), um embriologista cujo trabalho, na fase precoce da embriologia e da determinao sexual, muito avanou as hipteses cromossmicas do desenvolvimento. (Wilson era tambm reconhecido como um dos melhores violoncelistas amadores do pas.) (B) Thomas Hunt Morgan (1866-1945), que desenvolveu a teoria dos genes a partir da embriologia. Essa fotografia - tomada em 1915, quando os elementos bsicos da teoria dos genes estavam se encontrando mostra Morgan usando uma lente manual para identificar moscas. (A) cortesia de W. N. Timmins; (B) cortesia de G. Allen.)

Quando Morgan e Wilson entraram nesse debate, a disputa j estava bem ativa. Uma escola associada a Oskar Hertwig, Wilhelm Roux e Theodor Boveri, propunha que os cromossomos do ncleo continham os elementos construtores de formas. Esse grupo era desafiado por Eduard Pflger, T. L. W. Bischoff, Wilhelm His e seus colegas, que acreditavam que estruturas pr-formadas no poderiam causar to enormes mudanas durante o desenvolvimento; ao contrrio, eles acreditavam que os padres herdados de desenvolvimento eram causados pela criao de novas molculas do gameta interativo, citoplasmas. Morgan aliou-se a esse ltimo grupo e obteve dados que interpretou com sendo consistentes com o modelo citoplasmtico da herana. Em seu experimento mais crucial, ele removeu citoplasma do rcem-fertilizado ovo ctenforo (gelia de crista). Em 1897 Morgan relatou: Aqui, embora todo o ncleo de segmentao esteja presente, devido perda de parte do citoplasma, produz-se embries com defeito... Parece no haver escape da concluso que no citoplasma, e no no ncleo, est o poder de diferenciao dos estgios precoces do desenvolvimento.

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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Wilson, nesse nterim, tornou-se o maior proponente do ponto de vista de que os elementos formadores se encontravam nos cromossomos nucleares. Defendeu vigorosamente essa idia em seu livro A Clula no Desenvolvimento e na Herana (1896), salientando a necessidade da presena do ncleo para regenerao dos protozorios (veja captulo 1): Esse fato presume que o ncleo , se no o local da formao de energia, ao menos, o fator controlador dessa energia e, por isso, o fator controlador da herana. Essa conjectura transforma-se em certeza quando nos voltamos para os fatos da maturao (meiose), fertilizao e diviso celular. Todos convergem em direo da concluso de que a cromatina o elemento essencial para o desenvolvimento. Wilson (1895) no se esquivou das conseqncias dessa concluso* Agora, a cromatina sabida ser intimamente semelhante, se no idntica, substncia conhecida como nuclena...que a anlise demonstra ser um composto qumico toleravelmente bem definido, composto de cido nuclico (um complexo cido orgnico rico em fsforo) e albumina. E assim, chegamos notvel concluso que a herana pode, talvez, ser efetuada pela transmisso fsica de um dado composto qumico do progenitor para a descendncia. Wilson pensou que o material formador de rgos que Morgan havia removido do citoplasma de ovos de ctenforo, j havia sido para ali secretado pelos cromossomos nucleares (Wilson, 1894, 1904). Para Wilson (1905) Os materiais citoplasmticos parecem ser apenas o meio imediato ou a causa eficiente da diferenciao, e ainda procuramos sua determinao primria nas causas que residem mais profundamente. Parte do maior apoio para a hiptese cromossmica da herana estava vindo dos estudos embriolgicos de Theodor Boveri (Figura 2.2 A), um pesquisador na Estao Biolgica de Npoles. Boveri fertilizou vulos de ourio-do-mar com altas concentraes de seu espermatozide e obteve ovos que haviam sido fertilizados por dois espermatozides. Na primeira clivagem, esses ovos formaram quatro plos mitticos e dividiram o ovo em quatro, em vez de duas clulas (veja captulo 4). Boveri ento separou os blastmeros e demonstrou que cada clula se desenvolvia anormalmente e de maneiras diferentes por ter cada clula diferentes tipos de cromossomos. Assim, Boveri declarou que cada cromossomo tinha uma natureza individual e o controle de diferentes processos vitais. O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e Desenvolvimento Em adio evidncia de Boveri, E. B. Wilson (1905) e Nettie Stevens (1905a,b) demonstraram uma correlao crtica entre cromossomos nucleares e o desenvolvimento organizacional. Stevens (Figura 2.2B), uma ex- estudante de Morgan, mostrou que em 92 espcies de insetos (e um cordato primitivo), as fmeas tinham dois cromossomos sexo-especficos em cada ncleo (XX), enquanto machos tinham somente um cromossomo X (XY ou XO). Parecia que uma estrutura nuclear, o cromossomo X, estava controlando o desenvolvimento sexual** . Morgan discordou da interpretao de que
*Note-se que Wilson est escrevendo sobre unidades construtoras de forma na cromatina em 1896 antes da redescoberta do trabalhos de Mendel ou do estabelecimento da teoria dos genes. Para uma anlise mais detalhada das interaes entre Morgan e Wilson que levaram teoria dos genes, veja Gilbert (1978, 1987) e Allen (1986).
** Wilson era um dos amigos mais ntimos de Morgan, que considerava Stevens sua melhor estudante de ps-graduao. Ambos estavam contra Morgan nessa questo. Mesmo assim, Morgan apoiou inteiramente o pedido de Stevens para fundos de pesquisa, confirmando suas qualidades como as melhores possveis. Wilson escreveu uma elogiosa carta de recomendao, apesar de saber que ela seria uma rival na pesquisa (veja Brush, 1978).

(A)

(B)

Figura 2.2

O carter singular do cromossomo foi mostrado por Boveri e Stevens. (A) Theodor Boveri (1862-1915) cujo trabalho Wilson (1918) comentou: conseguiu a verdadeira fuso de citologia, embriologia e gentica um feito biolgico que... no fica atrs de qualquer outro de nosso tempo. Fotografia tirada em 1908, quando os estudos cromossmicos e embriolgicos de Boveri estavam no seu apogeu. (B) Nettie M. Stevens (1861-1912), que treinou tanto com Boveri como com Morgan, vista aqui em 1904 quando era estudante de psdoutorado, realizando a pesquisa que correlacionou o nmero de cromossomos X com o desenvolvimento sexual. [(A) cortesia de Baltzer, 1967; (B) cortesia do Instituto Carnegie de Washington.]

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

os cromossomos determinavam o sexo. Ao contrrio, ele considerou o conjunto de cromossomos como uma caracterstica sexual secundria, controlada por alguma substncia citoplasmtica determinadora do sexo. A converso de Morgan para a hiptese cromossmica ocorreu depois de obter dados contrrios s suas teorias (veja Allen, 1978; Gilbert, 1978; Lederman, 1989). Enquanto criava Drosophila para uma srie de experimentos sobre evoluo, Morgan comeou a obter vrias mutaes correlacionadas com o sexo. (Como ele logo iria mostrar, mutaes ligadas ao X apareciam antes de mutaes em outros cromossomos, porque defeitos no cromossomo X no so mascarados pelo cromossomo homlogo no macho.) Em 1910, Morgan mostrou que os traos para ambos sexos e cor branca dos olhos esto correlacionados de alguma maneira com a presena de um dado cromossomo X; entretanto, evitou consider-los ligados fisicamente. Porm, em 1911mostrou que fatores reguladores da cor dos olhos, cor do corpo, forma das asas e sexo segregavam-se juntos com o cromossomo X, o que o levou a comear a visualizar os genes como fisicamente ligados um ao outro no cromossomo. O embriologista Morgan tinha demonstrado que cromossomos nucleares eram responsveis pelo desenvolvimento de caracteres herdados. [gene1.html]

A ciso entre a embriologia e a gentica


A evidncia de Morgan proporcionou uma base material para o conceito do gene. A gentica havia sido, em geral, uma cincia emprica sobre procriao de animais e plantas; Morgan deu-lhe um fundamento cientfico. Movida pelo desejo de progredir no conhecimento da reproduo de animais e plantas (e seres humanos), e na capacidade dos geneticistas de obter rapidamente resultados concretos e matematicamente verificveis, a gentica logo se tornou a cincia biolgica predominante nos Estados Unidos (veja Allen, 1986; Sapp, 1987; Paul e Kimmelman, 1988). Na dcada de 1930, tornou-se disciplina autnoma, desenvolvendo seu vocabulrio prprio, revistas, sociedades, organismos favorecidos, professorados e regras de evidncia. Hostilidade entre embriologia e gentica tambm emergiu. Os geneticistas acreditavam que os embriologistas eram antiquados e que o desenvolvimento viria a ser inteiramente explicado como o resultado da expresso gnica. Conforme proclamado por Richard Goldschmidt (1938), O desenvolvimento, obviamente, a produo ordenada de um padro e assim, em ltima anlise, os genes controlam o padro. Se os embriologistas no olharem para a embriognese em termos da atividade dos genes, os geneticistas o faro. Reciprocamente, os embriologistas consideraram os geneticistas como irrelevantes e mal-informados. Embriologistas como Frank Lillie (1927), Ross Granville Harrison (1937), Hans Spemann (1938) e Ernest E. Just (1939) (Figura 2.3), argumentaram que no poderia haver uma teoria gentica do desenvolvimento at que ao menos trs principais desafios fossem resolvidos: 1. Os geneticistas teriam que explicar como cromossomos que eram considerados idnticos em cada clula do organismo direcionam tipos diferentes e variveis de citoplasmas celulares. 2. Quase todos genes conhecidos na poca afetavam a modelagem das etapas finais (cor dos olhos, forma das cerdas, vascularizao alar). Os geneticistas teriam que produzir evidncia que os genes controlam os estgios precoces da embriognese. Conforme enunciado por Just (citado por Harrison, 1937), os embriologistas estavam interessados em saber como uma mosca forma o seu dorso e no no nmero de cerdas no seu dorso. 3. Os geneticistas teriam que explicar fenmenos como a determinao do sexo em certos invertebrados (e vertebrados, como rpteis), nos quais o ambiente determina o fentipo sexual.

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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(A)

(B)

Figura 2.3

(C)

Embriologistas tentaram impedir a gentica de conquistar seu territrio na dcada de 1930. (A) Frank Lillie encabeou o Laboratrio de Biologia Marinha em Woods Hole e foi um lder na pesquisa sobre fertilizao e endocrinologia reprodutiva. (B) Hans Spemann ( esquerda) e Ross Harrison ( direita) aperfeioaram operaes de transplante para descobrir quando eram determinados os eixos do corpo e dos membros. Argumentaram que os geneticistas no possuam um mecanismo para explicar como os mesmos genes nucleares podiam criar tipos celulares diferentes durante o desenvolvimento. (C) Ernest E. Just fez descobertas cruciais sobre fertilizao. Rejeitou a gentica e enfatizou o papel da membrana celular na determinao dos destinos das clulas. (A cortesia de V. Hamburger; B cortesia de T. Horder; C cortesia do Laboratrio de Biologia Marinha, Woods Hole.)

O debate tornou-se deveras veemente. Numa retrica, refletindo as ansiedades polticas do fim da dcada de 1930, Harrison (1937) alertou: Agora que a necessidade de relacionar os dados da gentica com a embriologia est sendo usualmente reconhecida e a sede de conhecimento dos geneticistas comea a impeli-los em nossa direo, no pareceria imprprio apontar para um perigo dessa ameaada invaso. O prestgio do sucesso desfrutado pela teoria dos genes poderia facilmente tornar-se um obstculo para a compreenso do desenvolvimento, por dirigir nossa ateno exclusivamente para o genoma, enquanto movimentos celulares, diferenciao e todos os processos desenvolvimentais so de fato realizados pelo citoplasma. J temos teorias que referem os processos do desenvolvimento ao dos genes e consideram toda performance como nada mais que a consecuo dos potenciais dos genes. Tais teorias so totais e demasiadamente unilaterais. At que os geneticistas puderam demonstrar a existncia de variantes herdadas durante a fase precoce do desenvolvimento e at que os geneticistas tiveram uma bemdocumentada teoria sobre como os mesmos cromossomos podiam produzir diferentes tipos de clulas, os embriologistas em geral no sentiram a necessidade de basear sua embriologia na ao dos genes. [gene2.html]

Primeiras tentativas da gentica do desenvolvimento


Porm, alguns cientistas acharam que nem a embriologia nem a gentica estavam completas uma sem a outra. Vrias tentativas foram feitas para sintetizar as duas disciplinas, mas sua primeira integrao bem-sucedida veio no fim da dcada de

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

1930, por parte de dois embriologistas, Salome Gluecksohn-Schoenheimer (agora S. Gluecksohn Waelsch) e Conrad Hal Waddington. Ambos haviam sido treinados em embriologia na Europa e tinham aprendido gentica nos Estados Unidos com estudantes de Morgan. Gluecksohn-Schoenheimer e Waddington, tentaram achar mutaes que afetassem o desenvolvimento precoce e processos afetados por esses genes. Gluecksohn-Schoenheimer (1938, 1940) mostrou que mutaes nos genes de Brachyury do camundongo, causavam desenvolvimento aberrante da poro posterior do embrio, e atribuiu os efeitos desses genes mutantes a defeitos no mesoderma axial que normalmente teriam ajudado a induzir o eixo dorsal.* Alm disso, Gluecksohn-Schoenheimer (1938) considerou que no trabalho com camundongos no era possvel fazer o que os embriologistas experimentais deveriam estar fazendo - alterando a estrutura durante seu desenvolvimento e observando quais eram as conseqncias dessa operao. Em vez disso, um novo tipo de cientista era necessrio, o geneticista do desenvolvimento: Enquanto o embriologista experimental desenvolve um dado experimento e em seguida estuda seus resultados, o geneticista do desenvolvimento tem que estudar primeiro o desenrolar do desenvolvimento (isto , os resultados da perturbao do desenvolvimento) para depois, s vezes, chegar a concluses sobre a natureza do experimento realizado pelo gene. Ao mesmo tempo, Waddington (1939) isolava diversos genes que causavam malformaes alares na mosca das frutas, Drosophila. Tambm analisava como esses genes podiam afetar os primrdios que do origem a essas estruturas. A asa da Drosophila, conforme proclamou corretamente, parecia favorvel para pesquisas sobre a ao desenvolvimental dos genes. Assim, uma das principais objees ao modelo gentico do desenvolvimento levantadas pelos embriologistas - que os genes atuam somente sobre a modelagem final do embrio e no sobre seus principais esquemas de construo foi contrariada. [gene3.html]

Evidncia para a equivalncia genmica


Ainda permanecia uma outra grande objeo para uma embriologia baseada na gentica: Como poderiam genes nucleares dirigir o desenvolvimento se os genes eram os mesmos em cada tipo celular? Essa equivalncia genmica no estava provada mas era assumida (porque cada clula o descendente mittico do ovo fertilizado) e um dos primeiros problemas da gentica do desenvolvimento era o de determinar se cada clula de um organismo tinha o mesmo genoma que outra. Metaplasia A primeira evidncia para equivalncia genmica veio aps a 2a Guerra Mundial, por parte de embriologistas que estavam estudando a regenerao de tecidos excisados. O estudo da regenerao do olho da salamandra demonstrou que mesmo clulas adultas diferenciadas podem reter o seu potencial de produzir outros tipos celulares. Portanto, os genes para os produtos desses outros tipos de clulas devem ainda estar presentes, embora normalmente no expressos. Na salamandra, a remoo da retina

*As observaes de Gluecksohn-Schoenheimer levaram 60 anos para ser confirmadas atravs da hibridizao do DNA. No entanto, quando o gene do T-locus foi clonado e sua expresso detectada pela tcnica da hibridizao in situ (discutida mais adiante neste captulo), Wilkinson e colaboradores (1990) acharam que a expresso do gene T tem um papel direto nos eventos precoces da formao do mesoderma e na morfognese da notocorda. Embora uma histria completa do desenvolvimento precoce da gentica do desenvolvimento ainda permanea por ser escrita, mais informaes sobre suas turbulentas origens podem ser encontradas em Oppenheimer, 1981; Sander, 1986; Gilbert, 1988, 1991, 1996; Burian et al., 1991; Harwood, 1993; Keller, 1995; e Morange, 1996.

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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neural promove sua regenerao a partir da retina pigmentada, e uma nova lente pode ser formada a partir das clulas da ris dorsal. A regenerao do tecido lenticular da ris (a assim chamada regenerao Wolffiana a partir da pessoa que primeiro a observou em 1894) foi intensamente estudada. Yamada e seus colegas (Yamada, 1966, Dumont e Yamada, 1972) acharam que aps a remoo de uma lente, uma srie de acontecimentos leva produo de uma nova lente a partir da ris (Figura 2.4). Os ncleos do lado dorsal da ris comeam a sintetizar quantidades enormes de ribossomos, seu DNA se replica, e divises mitticas se sucedem. As clulas da ris pigmentada comeam, em seguida, a se desdiferenciar expelindo seus melanossomos (os grnulos pigmentados que do ao olho a sua cor; esses melanossomos so ingeridos por macrfagos que entram no local da ferida). A ris dorsal continua a se dividir, formando um globo de tecido desdiferenciado na regio da lente removida. Essas clulas comeam ento a sintetizar os produtos diferenciados de clulas lenticulares, as protenas do cristalino. Essas protenas so fabricadas na mesma ordem que no desenvolvimento normal da lente. Uma vez formada uma nova lente, as clulas do lado dorsal da ris cessam sua atividade mittica. Esses eventos no so a via normal pela qual a lente dos vertebrados formada. Como ser visto em detalhe mais tarde, a lente normalmente se desenvolve a partir de uma camada de clulas epiteliais da cabea, induzida pelas clulas retinais precursoras subjacentes. A formao da lente por clulas diferenciadas da ris representa metaplasia (ou transdiferenciao), a transformao de um tipo celular diferenciado em outro (Okada, 1991). A ris da salamandra, portanto, no havia perdido gene algum daqueles usados na diferenciao das clulas da lente.

Retina pigmentada

Retina neural ris dorsal

Lente

Figura 2.4

ris ventral

Regenerao Wolffiana da lente da salamandra a partir da margem dorsal da ris. (A) Olho normal, no-operado no estgio larval da salamandra Notophtalmus viridiscens. (B-G) Regenerao da lente, vista respectivamente nos dias 5, 7, 9, 16, 18 e 30. A nova lente estar completa no dia 30. (de Reyer, 1954, cortesia de R. W. Reyer.)
(B) (C)

(A)

(D)

(E)

(F)

(G)

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Clonagem de Anfbios: A Restrio da Potncia Nuclear O teste definitivo sobre se, ou no, o ncleo de uma clula diferenciada sofreu qualquer restrio funcional irreversvel, seria o de conseguir que esse ncleo gerasse todo outro tipo de clula diferenciada no organismo. Se cada ncleo fosse idntico ao ncleo do zigoto, o ncleo de cada clula deveria ser capaz de direcionar todo o desenvolvimento do organismo, quando transplantado para um ovo ativado enucleado. Porm, antes que tal experimento pudesse ser feito, trs tcnicas tiveram que ser aperfeioadas: (1) um mtodo para enuclear ovos do hospedeiro sem destru-los; (2) um mtodo para isolar ncleos doadores intactos; (3) um mtodo para transferir tais ncleos para dentro do ovo sem danificar o ncleo ou o ocito. Essas tcnicas foram desenvolvidas na dcada de 1950, em primeiro lugar por Robert Briggs e Thomas King que combinaram a enucleao com a ativao do ovo. Quando um ocito de r-leopardo (Rana pipiens) perfurado com uma agulha limpa de vidro, o ovo sofre todas as mudanas citolgicas e bioqumicas associadas fertilizao. Ocorre rearranjo citoplasmtico interno e a finalizao da meiose perto do plo animal da clula. Esse fuso meitico pode ser facilmente localizado quando empurra os grnulos pigmentados do plo animal; a puno do ocito nesse local induz o fuso e seus cromossomos a fluir para fora do ovo (Figura 2.5). O ovo hospedeiro agora considerado estar ativado (as reaes de fertilizao necessrias para iniciar o desenvolvimento foram completadas) e enucleado. A passagem de um ncleo para o ovo conseguida pela ruptura de uma clula doadora e transferncia do ncleo liberado para o ocito por meio de uma micropipeta. Algum citoplasma acompanha o ncleo para seu novo lar, mas a razo do citoplasma doador para o receptor somente de 1:105, e o citoplasma do doador no parece afetar o resultado dos experimentos. Em 1952, Briggs e King demonstraram que ncleos da clula da blstula podiam direcionar o desenvolvimento de girinos completos quando transferidos para o citoplasma do ocito. O que acontece quando ncleos de estgios mais avanados so transferidos para ocitos ativados e enucleados? Os resultados de King e Briggs (1956) esto delineados na Figura 2.6. Enquanto a maioria dos ncleos da blstula podiam produzir girinos completos, houve um dramtico decrscimo da capacidade dos ncleos derivados de estgios mais tardios direcionar o desenvolvimento direto at o estgio de

Plo animal Agulha de vidro

Fuso meitico isolado

Micropipeta

Fuso meitico

Grnulos pigmentados

Remoo dos cromossomos e do fuso da clula

Ovo ativado enucleado

Extrao e lise da clula doadora

Ncleo doador inserido na clula enucleada

Figura 2.5

Procedimento para o transplante de ncleos da blstula para ovos ativados enucleados de Rana pipiens. As dimenses relativas do fuso meitico foram exageradas para demonstrar a tcnica. A bela R. pipiens na fotografia foi derivada dessa maneira. (Segundo King, 1966; fotografia cortesia de M. DiBerardino e N. Hoffner.)

Membrana cicatriza

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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Estgio desenvolvimental dos embries e girinos dos quais foram retirados os ncleos
to ca a ud l a co

Figura 2.6

Porcentagem de embries de transplantes nucleares que se desenvolvem normalmente

Bl

st

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pr G

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a di N u ru la

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m ard co c om o s n t o c n e os iri m in G ati ir b G

o br

Grfico de transplantes nucleares bem sucedidos, em funo da idade do desenvolvimento nuclear. A abscissa representa o estgio no qual o ncleo doador (de R. pipiens) foi isolado e inserido no ocito ativado e enucleado. A ordenada mostra a porcentagem desses transplantes capazes de produzir blstulas que podiam em seguida direcionar o desenvolvimento para o estgio do girino nadador (Segundo McKinnell, 1978.)

Girinos (Rana pipiens) nadando normalmente

Horas a 18oC

girino. Quando ncleos de clulas somticas de girinos no estgio de broto caudal foram usados como doadores, no ocorreu desenvolvimento normal. Porm, ncleos de clulas germinativas de girinos do estgio de broto caudal (que iro finalmente dar origem a um organismo completo aps a fertilizao), foram capazes de direcionar desenvolvimento completo em 40 porcento das blstulas que se desenvolveram (Smith, 1956). Assim, clulas somticas parecem perder sua capacidade de direcionar desenvolvimento completo medida que se tornam definidas e diferenciadas, e a progressiva restrio da potncia nuclear durante o desenvolvimento parece ser uma regra geral. Porm, possvel que alguns ncleos celulares diferenciados sejam diferentes de outros. Clonagem de Anfbios: A Pluripotncia de Clulas Somticas John Gurdon e seus colegas, usando mtodos ligeiramente diferentes de transplante nuclear na r Xenopus, obtiveram resultados sugerindo que os ncleos de algumas clulas diferenciadas podem permanecer totipotentes. Gurdon tambm achou uma progressiva perda de potncia no decorrer do desenvolvimento, embora clulas de Xenopus tenham retido suas potncias por um perodo de desenvolvimento mais longo (Prancha 1). As excees a essa regra mostraram ser muito interessantes. Gurdon havia transferido ncleos do endoderma intestinal de girinos Xenopus que se alimentavam, para ovos ativados enucleados. Esses ncleos doadores continham um marcador gentico (um nuclolo por clula, em lugar dos dois usuais), que os distinguia dos ncleos do hospedeiro. Entre 276 ncleos transferidos, somente 10 (1.4 porcento) promoveram o desenvolvimento at o estgio do girino que se alimentava. Transplantes seriados (que requeriam colocar um ncleo intestinal em um ovo e quando o ovo tinha se transformado em blstula, transferia-se o ncleo da blstula para vrios outros ovos), aumentavam o rendimento para 7 porcento (Gurdon, 1962). Em alguns casos, ncleos das clulas intestinais dos girinos foram capazes de gerar todas linhagens de clulas neurnios, clulas do sangue, nervos e assim por diante de um girino vivente. Alm disso, sete desses girinos (de dois ncleos originais) se metamorfosearam em rs adultas frteis (Gurdon e Uehlinger, 1966); esses ncleos eram totipotentes (Figura 2.7). King e seus colegas criticaram esses experimentos assinalando que: (1) no haviam sido tomadas suficientes precaues para ter certeza que clulas germinativas primordiais, que podem migrar at o intestino, no foram usadas como fontes de ncleos, e (2) as clulas intestinais de um girino to jovem poderiam no se qualificarem

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Figura 2.7

EXPERIMENTO Ovo no-fertilizado (cepa 2 nu) Girino (cepa 1 nu)

Procedimento empregado para obter rs maduras de ncleos intestinais de girinos de Xenopus. O ovo de tipo selvagem (2 nuclolos por ncleo; 2-nu) irradiado para destruir os cromossomos maternos, e um ncleo intestinal de um girino marcado (1-nu) inserido. Em alguns casos no ocorre diviso; em alguns casos o desenvolvimento do embrio sustado; porm, em outros casos, uma r inteiramente nova formada tendo um gentipo 1-nu. (Segundo Gurdon, 1968, 1977.)

Irradiao UV destri comossomos do ovo

Ncleo intestinal epitelial inserido no ovo irradiado

Micropipeta Ncleo intestinal

Ovo receptor irradiado RESULTADOS

Blstula

Blstula

Blstula

Sem diviso

Girino

Girino (morre)

Embrio anormal

R adulta (Cepa 1 nu)

como um tipo de clula verdadeiramente diferenciada porque clulas de girinos que se alimentam ainda contm plaquetas de gema (DiBerardino e King, 1967; McKinnell, 1978; Briggs, 1979). Para responder a essas crticas, Gurdon e seus colegas cultivaram clulas epiteliais da membrana natatria de rs adultas. Essas clulas mostraram estar diferenciadas; cada uma continha queratina, a protena caracterstica de clulas adultas da pele. Quando ncleos dessas clulas foram transferidos para ocitos ativados e enucleados de Xenopus, nenhum dos transferidos de primeira gerao progrediu alm da formao do tubo neural, pouco aps a gastrulao. Por transplantes seriados, porm, numerosos girinos foram gerados (Gurdon et al., 1975). Embora esses girinos tivessem morrido antes de atingir o estado alimentar, um nico ncleo celular diferenciado ainda retinha potncias incrveis. Um nico ncleo derivado de uma hemcia de uma r adulta (que nem se replica e nem sintetiza RNA) pode sofrer mais de 100 divises aps ser transplantado para um ocito ativado e, ainda, reter a habilidade

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

45

de gerar girinos natatrios (Orr et al., 1986; DiBerardino, 1989). Embora DiBerardino (1987) tenha observado que at o presente, ncleo algum de uma clula documentadamente especializada, nem de uma clula adulta tenha mostrado ser totipotente, tal ncleo pode no entanto instruir a formao de todos os rgos do girino natatrio. Algumas das diferenas entre os resultados dos laboratrios de Briggs e de Gurdon, podem envolver diferenas na fisiologia do desenvolvimento das rs Rana e Xenopus. Quando se transfere um ncleo de uma clula diferenciada para o citoplasma do ocito, se est pedindo ao ncleo para reverter para condies fisiolgicas s quais ele no est acostumado. Os ncleos da clivagem das rs dividem-se rapidamente, enquanto alguns ncleos de clulas diferenciadas dividem-se raramente, se tanto. Falhas em replicar DNA rapidamente podem levar a quebras cromossmicas: tais anormalidades foram vistas em muitas clulas de girinos clonados. Sally Hennen (1970) mostrou que o sucesso desenvolvimental de ncleos doadores pode ser ampliado tratando-se esses ncleos com espermina e resfriando os ovos para dar tempo ao ncleo de se adaptar ao citoplasma do ovo. Acredita-se que a espermina remova histonas da cromatina podendo re-acertar a atividade dos ncleos. Quando ncleos do endoderma de girinos de Rana pipiens, no estgio de broto caudal, foram tratados dessa maneira, 62 porcento daqueles ncleos que iniciaram desenvolvimento normal, prosseguiram at a gerao de girinos normais. Em animais controle, nenhum dos ncleos conseguiu gerar tais girinos. Assim, os genes para o desenvolvimento do girino completo no pareceram ter sido perdidos pelas clulas do endoderma. Podemos olhar para esses experimentos de clonagem de anfbios de duas maneiras. Primeiro, reconhecer uma restrio geral de potncia concomitante ao desenvolvimento. Segundo, facilmente ver que o genoma da clula diferenciada notavelmente potente em sua habilidade de produzir todos os tipos celulares do girino anfbio. Em outras palavras, mesmo existindo um debate sobre a totipotncia de tais ncleos, existe pouca dvida de que eles so extremamente pluripotentes. Certamente, muitos genes no usados na pele ou em clulas sangneas, podem ser reativados para produzir os nervos, o estmago, ou o corao de um girino natatrio. Assim, cada ncleo no corpo contm a maioria (se no todos) dos mesmos genes.

Informaes adicionais

&

Especulaes

Clonando Mamferos por Prazer e Lucro

LONAR SERES HUMANOS a partir de clulas previamente diferenciadas parece ser o objetivo de editores de jornais e novelistas. Deve ter ficado bvio da discusso precedente que clonar um indivduo totalmente desenvolvido, a partir de clulas diferenciadas, uma formidvel tarefa. Mesmo em anfbios, os ncleos das clulas diferenciadas no foram capazes de gerar animais adultos quando colocados em clulas ativadas e enucleadas. Alm disso, mesmo se rs adultas pu-

dessem ser geradas de ncleos diferenciados, essa habilidade no poderia ser extrapolada para clulas humanas. Alm das dificuldades ticas e tcnicas do trabalho com o organismo humano, o citoplasma do ocito humano pode no responder a sinais emitidos por um ncleo de uma clula em estgio avanado. Transplante nuclear foi conseguido em camundongos, pela remoo de proncleos (haplides) de espermatozide e vulo de um zigoto, e substituio por proncleos de outro (Figura 2.8; McGrath e Solter,

1983). Esses zigotos reconstrudos comeam a se dividir e so ento implantados no tero. Os camundongos resultantes exibem o fentipo do ncleo doador. Enquanto mais de 90 porcento dos zigotos enucleados do camundongo, recebendo proncleos de outros zigotos, se desenvolvem at o blastcito (blstula), nem um nico embrio (de 81), desenvolveu-se at esse estgio quando ncleos de embries de 4 clulas foram transferidos para zigotos enucleados (McGrath e Solter, 1984). Similarmente, ncleos de embries de 8 clulas

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

(A)

(C)

(B)

(D)

Figura 2.8

Procedimento para transferir ncleos para o ovo ativado enucleado de mamifero. Um embrio de clula nica, incubado em colcemida e citocalasina para relaxar o citoesqueleto, seguro com uma pipeta de suco. Os ncleos haplides derivados do espermatozide e do vulo, no se juntaram ainda. A pipeta de enucleao perfura a zona pelcida (a protena que envolve o ovo) e aspira a membrana celular adjacente e a rea da clula contendo os proncleos. (A) A pipeta de enucleao retirada e o citoplasma contendo os proncleos removido do ovo. A membrana celular no est rompida; a continuidade do citoplasma limitado pela membrana est indicada pela flexa. (B) A membrana celular forma uma vescula ao redor dos proncleos no interior da pipeta de enucleao. (C) Essa vescula misturada com vrus Sendai (que induz a fuso de membranas nucleares) e inserida no espao entre a zona pelcida e o outro ovo enucleado. (D) O vrus Sendai proporciona a fuso do ovo enucleado e os proncleos envoltos pela membrana, permitindo que os proncleos (flexa) penetrem na clula. (Segundo McGrath e Solter, 1983; cortesia dos autores.)

po de ativao e implantao uterina. Usando modificaes tcnicas, Willadsen (1986) produziu carneiros de termo completo a partir de ncleos transplantados de blastmeros do estgio de 8 clulas; ncleos de embries pr-implantados de gado, porcos e coelhos foram capazes de direcionar o desenvolvimento completo quando transplantados para ocitos ativados e enucleados (Prather et al., 1987; Stice e Robl, 1988; Prather et al., 1989; Willadsen, 1989). Porm, em todos esses casos, os ncleos vieram de embries pr-implantados. Recentemente, Wilmut e colaboradores (1997) mostraram que possvel clonar um carneiro a partir de um ncleo de clula de glndula mamria adulta. Esse resultado poder ter importantes conseqncias agrcolas e legais (Prather, 1991). [gene4.html] Clonagem de Plantas Somente nas plantas os ncleos de clulas diferenciadas de organismos adultos podem ser facilmente vistos como capazes de direcionar o desenvolvimento de outro organismo adulto. Essa habilidade foi dramaticamente demonstrada em clulas de cenouras ou tabaco. Em 1958, F. C. Steward e seus colegas estabeleceram um processo pelo qual os tecidos diferenciados de razes de cenouras podiam dar origem a toda uma nova planta (Figura 2.9). Pequenos pedaos de floema so isolados da cenoura e rodados em grandes frascos contendo leite de coco. Esse fluido ( realmente o endosperma da semente do coco) contm os fatores e nutrientes necessrios para o crescimento da planta e os hormnios exigidos para a diferenciao. Sob essas condies, os tecidos proliferam e formam uma massa

e massa celular interna (os blastmeros que formam o embrio, mas no a placenta*) tambm no puderam apoiar o desenvolvimento. Em contraste com ncleos de ourios-do-mar ou anfbios, os ncleos dos blastmeros precoces do camundongo
*Cada blastmero da massa celular interna totipotente no sentido de reter sua capacidade de formar clulas de qualquer tipo no organismo. Essa capacidade permite o aparecimento de gmeos.

(cujas clulas so totipotentes) no do suporte para o desenvolvimento total. Tais experimentos provavelmente fracassam porque ncleos de blastmeros no funcionam de maneira normal no citoplasma zigtico. Por isso, a clonagem de Elvis Presley a partir de clulas diferenciadas no algo com que possamos contar. Nem todos blastmeros mamferos so os mesmos, todavia, as espcies mamferas diferem muito em termos de temFigura 2.9

Experimento de Steward demonstrando a totipotncia de clulas do floema da cenoura. Clulas livre do calo continuam a se desenvolver em suspenso Floema de raiz Corte transversal da raiz Planta jovem Planta embrionria transferida para meio de cultura de agar Planta de cenoura madura no agar

Planta de cenoura madura

Proliferao de massa celular (calo) em meio de cultura de leite de coco

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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desorganizada chamada calo. A continuao da rotao leva ao desbastamento de clulas individuais do calo para o meio de suspenso. Essas clulas do origem a ndulos celulares semelhantes a razes que continuam a crescer enquanto permanecem em suspenso. A partir desses ndulos, colocados em um meio solidificado com agar, o resto da planta capaz de se desenvolver, formando uma planta

de cenoura completa e frtil (Steward et al., 1964; Steward, 1970). Porm, plantas e animais se desenvolvem de maneira diferente; a propagao vegetativa de plantas por corte (i.e, pores de plantas que quando nutridas, regeneram as partes faltantes) uma prtica agrcola comum. Alm disso, em contraste com anfbios e mamferos (nos quais as clulas germinativas

so destacadas como uma linhagem distinta de clulas no incio do desenvolvimento), as plantas normalmente derivam seus gametas de clulas somticas. Portanto, no to surpreendente que uma nica clula de uma planta possa se diferenciar em outros tipos de clulas e formar um clone geneticamente idntico (clone, do grego klon, significando ramo).

Sobre E. coli e elefantes: O modelo operon


Na maioria dos casos estudados, o genoma o mesmo de clula para clula no organismo. Os genes para a protena globina podem ser encontrados em clulas da pele, e os genes para as queratinas da pele podem ser encontrados em neurnios cerebrais. Porm, isso ainda deixa sem resposta outra grande questo levantada pelos embriologistas: Se o ncleo de cada clula no organismo tem os mesmos genes, como podem esses genes fazer com que essas clulas se tornem diferentes? *Pouco tempo aps a 2a Guerra Mundial, muitos biologistas concordaram que: a maior lacuna, ainda para ser preenchida, entre dois campos da pesquisa em biologia provavelmente aquela entre a gentica e a embriologia. o problema repetidas vezes declarado, porm, at agora no resolvido, de como clulas com genomas idnticos podem se tornar diferenciadas, adquirir a propriedade de confeccionar molculas com novos, ou no mnimo, diferentes padres ou configuraes especficos. Curiosamente, essa citao vem de Jacques Monod (1947), um geneticista microbiano trabalhando na sntese de enzimas adaptativas, que so protenas que embora no sejam usualmente sintetizadas por bactrias ou levedos, sero sintetizadas se os microorganismos encontrarem um novo substrato. Por exemplo, a bactria Escherichia coli s sintetiza -galactosidase e outras enzimas digestoras de lactose, quando encontram a lactose. Se a lactose est ausente do citoplasma, essas enzimas no so sintetizadas. Mas, com a introduo de lactose no citoplasma, esse grupo de novas enzimas aparecem. Em micrbios, ao menos, o mesmo genoma pode produzir dois estados citoplasmticos funcionalmente diferentes, dependendo da presena ou no de determinado composto (no caso, a lactose). Monod lanou a hiptese que o fenmeno da adaptao enzimtica podia oferecer a soluo para o problema de como genomas idnticos podem sintetizar diferentes molculas especficas.

*A grande exceo a essa regra da constncia dos genes os genes das imunoglobulinas discutida no Captulo 10. Cada clula tem todas as subunidades gnicas das imunoglobulinas, mas em linfcitos, algumas dessas subunidades esto rearranjadas ou mesmo suprimidas do genoma. O terceiro desafio - a explicao de como o ambiente pode direcionar o desenvolvimento foi prontamente compreendida, uma vez que a explicao geral para a expresso diferencial da expresso gnica foi estabelecida. Conforme veremos, o modelo do operon demonstrou como uma substncia do ambiente podia efetuar a expreso gnica diferenciada.

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Monod no foi o nico cientista a achar que micrbios unicelulares poderiam explicar a diferenciao multicelular. O microbiologista Sol Spiegelman (1947) declarou que a embriologia estava sendo prejudicada por sua prpria terminologia. O problema da diferenciao no podia mais ser visto como uma propriedade estrutural dos tecidos, mas passar a ser considerado uma propriedade bioqumica de clulas individuais. A diferenciao deveria ser vista no em termos anatmicos, mas como produo controlada de padres enzimticos nicos. Essa redefinio focaliza a ateno para a relao entre os genes do ncleo e as propriedades do citoplasma. Alm disso, a sntese de uma enzima adaptativa em presena do seu substrato deveria ser discutida como uma induo. Esse o termo tcnico usado em embriologia para descrever a habilidade de uma clula produzir uma substncia capaz de influenciar a diferenciao de outra. O agente molecular responsvel deveria ser chamado o indutor. Spiegelman via uma semelhana fundamental entre a induo de novos tipos celulares no embrio e a induo de novas enzimas em microorganismos. [gene5.html] No fim da dcada de 1950, um grupo de pesquisadores acreditava que micrbios eram um excelente (e facilmente estudado) modelo para diferenciao embrionria. Muitos geneticistas microbianos explicitamente ligaram enzimas indutivas a conceitos embriolgicos. Julgavam ser vlida a extrapolao, e apelaram para a unidade da natureza e, em ltima anlise, as regras simples que esperavam encontrar. Como sugerido por Monod (veja Judson, 1979), se algum entender a bactria, entender o elefante. Muitos embriologistas, porm, permaneceram cpticos a respeito da extrapolao de bactrias a embries, enfatizando a complexidade do desenvolvimento e a diversidade da performance embriolgica. Em 1961, Jacob e Monod sintetizaram dados sobre a induo da -galactosidase levando construo do modelo do operon. Esse modelo postula que a pequena molcula do indutor causava a transcrio de diferentes genes em E. coli (Figura 2.10). Em sistemas indutivos, uma protena repressora codificada por genes liga-se ao stio operador adjacente aos genes estruturais, impedindo a ligao da RNA polimerase ao stio promotor que inciaria a transcrio. Estando presente, o indutor liga-se protena repressora alterando sua conformao de forma a impedir a ligao ao operador. Com isso, o gene torna-se capaz de transcrever mRNA, que pode ser traduzido formando protena. Dessa maneira, o mesmo genoma pode sintetizar diferentes enzimas, dependendo da presena ou no do respectivo indutor. Em um importante trabalho de 1961, Jacob e Monod enfatizaram que o mecanismo de controle do operon-smile pode ser parte da regulao gnica universal. Eles conectaram seus resultados ao problema fundamental da embriologia qumica que a compreenso do porqu clulas dos tecidos no expressam constantemente todos os potenciais contidos em seu genoma. O modelo do operon foi imediatamente introduzido nos textos de embriologia por cientistas que procuravam a sntese da gentica com a embriologia. O livro de Waddington (1962), Novos Padres na Gentica e no Desenvolvimento, comea com um captulo relacionando o modelo do operon de Jacob e Monod com o controle da expresso gnica no desenvovimento dos anfbios. Waddington aprovou especialmente esse modelo porque significava que os genes no so apenas ativos, mas reativos, respondendo s mudanas no citoplasma. Waddington considerou genes e citoplasma como mutuamente interativos. Essa perspectiva foi tambm salientada em Hereditariedade e Desenvolvimento (1963), sntese de embriologia com gentica por John Moore, que conclui: Na gerao anterior, poucos embriologistas ou geneticistas teriam previsto que a sntese dos seus campos de trabalho teria se tornado possvel por estudos com a bactria Escherichia coli. No entanto, essa criatura microscpica, sem embrio prprio, mostrou um caminho. Na prxima dcada, poder ser difcil perceber a diferena entre um geneticista e um embriologista, medida que eles avanam em sua cincia para alm daquilo que cada um poderia ter conseguido isoladamente.

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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(A) O operon lac

Figura 2.10

Gene indutor

Promotor Operador

Genes estruturais para utilizao da lactose

(B) Quando no h lactose disponvel Genes estruturais

Protena repressora produzidas por i liga-se a o (C ) Quando a lactose est disponvel

No h transcrio de genes estruturais

Regulao diferencial de genes em E. coli. (A-C) No estado induzvel de tipo-selvagem, no h transcrio de RNA de -galactosidase a no ser que a lactose esteja presente. (B) Quando a lactose no est disponvel, uma protena repressora produzida pelo gene i liga-se ao stio repressor (o), inibindo a transcrio pela RNA polimerase do promotor (p). (C) Quando o indutor lactose est presente, combina com a protena repressora, alterando sua forma, o que faz com que a protena no possa mais se ligar ao DNA operador , fazendo comear a transcrio. (D) A solubilidade dessa protena demonstrada em estudos com o mutante de E. coli. Quando clulas bacterianas haplides com um gene indutor nofuncional (i-) so tornadas parcialmente diplides com o gene tiposelvagem (i+), forma-se repressor tipo-selvagem capaz de tornar indutvel o gene original da -galactosidase.

Genes estruturais

Lactose mRNA

RNA polimerase -galactosidase mRNA transcrito

Lactose combinando com o repressor, previne ligao a o

(D) O repressor da lactose solvel Genes estruturais

O gene i do tipo selvagem pode produzir repressor para ambos cromossomos que se ligam a o na ausncia de lactose Genes estruturais

Sntese diferencial de RNA


A desejada unificao no ocorreu to rapidamente como esperado por Moore. Porm, baseado na evidncia embriolgica a favor da equivalncia genmica e do modelo do operon de E. coli, emergiu na dcada de 1960 um consenso de que as clulas regulam seu desenvolvimento atravs da expresso gnica diferencial. Como bactrias eram os modelos para tal atividade, expresso em geral significava transcrio de mRNA. Os trs postulados da expresso gnica diferencial eram os seguintes:

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

1. Cada ncleo celular contm o genoma completo estabelecido no ovo fertilizado. Em termos moleculares, os DNAs de todas as clulas diferenciadas so idnticos. 2. Os genes no-usados das clulas diferenciadas no so destrudos ou mutados, retendo o potencial de serem expressos. 3. S uma pequena porcentagem do genoma est sendo expressa em cada clula, e uma poro do RNA sintetizado especfica para aquele tipo de clula. Os dois primeiros postulados j foram discutidos. O terceiro que s uma pequena parte do genoma est ativo produzindo produtos especficos dos tecidos foi primeiro testado em larvas de insetos. Aps a ecloso, uma larva de inseto tem duas populaes celulares diferentes, formadas por cerca de 10.000 clulas. A maior parte tem cromossomos politnicos. Tais cromossomos sofrem replicao de DNA na ausncia de mitose, contendo portanto 512 (29), 1024 (210), ou mesmo mais hlices duplas paralelas de DNA em lugar de somente uma (Figura 2.11; Prancha 31). Essas clulas no sofrem mitose, e crescem expandindo seu volume at 150 vezes. Durante a metamorfose, tais clulas morrem sendo substitudas por clulas diplides no politnicas agrupadas em certas regies da larva (veja Captulo 19). Beermann (1952) mostrou que o padro de distribuio das bandas de cromossomos politnicos era idntico ao longo da larva e que no se notavam perdas ou adies de qualquer regio cromossmica quando diferentes tipos de clulas eram comparados (Figura 2.12). Porm, Beermann estudando o mosquito Chironomus e Becker (1959) estudando Drosophila, acharam regies cromossmicas que estavam estufadas. Esses tufos apareciam em lugares diferentes nos cromossomos em cada tecido; seu aparecimento mudava com o desenvolvimento dessas clulas (Figura 2.13). Ainda mais, alguns tufos podiam ser

Figura 2.11

Cromossomos politnicos. (A) Cromossomos politnicos de clulas da glndula salivar de Drosophila melanogaster. Os quatro cromossomos esto conectados em seus centrmeros, formando um denso cromocentro. Os genes estruturais para a lcool desidrogenase (ADH), aldedo oxidase (Aldox) e octanol desidrogenase (ODH) foram mapeados nas posies designadas nesses cromossomos. (B) Fotografia ao microscpio eletrnico de uma pequena regio de um cromossomo politnico de Drosophila. As bandas escuras esto altamente condensadas comparadas com as regies interbandas. (A de Ursprung et al., 1968, cortesia de H. Ursprung; B de Burkholder, 1976, cortesia de G. D. Burkholder.)
Aldox

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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estimulados ou inibidos por certas mudanas fisiolgicas causadas pelo calor ou por hormnios (Clever, 1966; Ashburner, 1972; Ashburner e Berondes, 1978). Beermann (1961) apresentou evidncias que esses tufos representam um afrouxamento localizado de cromossomos politnicos (Figura 2.14) e que so stios de sntese ativa de RNA. Duas espcies intercruzadas diferentes de Chiromonus foram encontradas: uma produzindo grande quantidade de protena salivar e a outra no (Figura 2.15). Os produtores tinham uma tufo grande (anel de Balbiani) em determinada banda; esse tufo no existia nos no-produtores. O cruzamento de produtor com no-produtor resultou em larvas produzindo quantias intermedirias de protena salivar. Cruzando duas moscas hbridas, a capacidade de produzir protena salivar segregou-se de forma Mendeliana: 1 alto produtor: 2 intermedirios:1 no-produtor. Altos produtores tinham dois tufos (um em cada cromossomo homlogo), produtores intermedirios tinham apenas um, e no-produtores nenhum tufo. Beermann concluiu que a informao gentica necessria para a sntese dessa protena salivar est presente nessa banda distal do cromossomo e que sua produo dependia de transformao em uma regio estufada.

(A)

Glndula salivar (B)

Tbulos de Malpighi

Tecido retal

Intestino

Figura 2.12

Identidade genmica em cromossomos politnicos. (A) Uma regio do conjunto cromossmico da mosca Chiromonus tentans. Notar a constncia do nmero de bandas nos diferentes tecidos. (B) Hibridizao do RNA de uma protena da gema com um cromossomo da glndula salivar larval de Drosophila. Os gros escuros (flexa) mostram onde a mensagem da protena radioativa da gema se ligou aos cromossomos. Notar que o gene para a protena est presente no cromossomo da glndula salivar, apesar da protena no ser a sintetizada. (A) Segundo Beermann, 1952; (B) De Barnett et al., 1980; fotografia cortesia de P. C. Wensink.

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Figura 2.13

Seqncia de estufamentos de uma poro do cromossomo 3 da glndula salivar de Drosophila melanogaster. (A,B) larva de 110 horas; (C) larva de 115 horas; (D,E) estgio pr-pupa (aps 4 horas). Notar o estufamento e a regresso das bandas 74EF e 75B. Outras bandas (71DE, 78D) estufam mais tarde, porm, a maioria no estufa de modo algum durante o perodo. (Cortesia de M. Ashburner.)

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

Prova adicional de que tufos cromossmicos produzem mRNA vem de estudos sobre tufos do anel de Balbiani (BR2) em Chironomus tentans. O BR2 pode ser isolado por microdisseco devido seu tamanho excepcional, e seus produtos podem ser analisados por autoradiografia (Lambert e Daneholt, 1975). A Figura 2.16 A, B mostra o isolamento de BR2 do cromossomo 4 de C. tentans. Transcrio de BR2 foi demonstrada incubando glndulas salivares isoladas com precursores de RNA

(A)

(B)

Figura 2.14

Terminao proximal do cromossomo 4 da glndula salivar de Chiromonus pallidivitatus, mostrando o enorme tufo BR2. (A) Fotomicrografia em contraste de fase, de preparaes coradas, mostrando o extenso tufo no cromossomo politnico. (B) Diagrama da regio passando por estufamento. (A de Grossbach, 1973, cortesia de U. Grossbach; B segundo Beermann, 1963)

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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BR4(SZ)
Alto produtor No-produtor

BR2
Todos produtos intermedirios

BR1

BR3
Alto produtor (A) (B) (C) Produtores Intermedirios No-produtor

Figura 2.15

radioativos. O RNA radioativo pde, em seguida, ser extrado da poro BR2 do cromossomo dissecado (Lambert, 1972). Esse RNA era excepcionalmente grande cerca de 50.000 bases. O grande segmento de RNA radioativo, especificamente hibridizado para a regio BR2 do cromossomo, mostrou que o DNA estufado (Puff de DNA) - e nenhum outro local - tinha-o transcrito ativamente (Figura 2.16C). Esse mesmo RNA pde ser isolado de polissomos sintetizadores de protenas, indicando que ativo na sntese protica (Wieslander e Daneholt, 1977). Assim, um RNA transcrito de uma banda especfica de DNA, que estufa na glndula salivar larval, pode posteriormente ser visto produzindo protenas em ribossomos citoplasmticos.

Correlao de padres de estufamento com funes especializadas nas clulas das glndulas salivares de Chironomus pallidivitatus. (A) Cromossomo de uma clula produzindo uma secreo granular e mostrando um anel de Balbiani adicional [BR4(SZ)]. (B) Cromossomo 4 de uma clula salivar, mostrando somente anis de Balbiani 1, 2 e 3 (BR1, BR2, BR3). (C) Evidncia gentica que a sntese de uma importante protena salivar depende da formao de tufos BR4(SZ). Larvas com altos nveis de secrees granulares tm clulas salivares glandulares com tufos BR4(SZ) em ambos cromossomos 4 (coloridos), enquanto larvas sem essas secrees no tm tais tufos. Produtores intermedirios tm somente um cromossomo 4 com uma regio estufada BR4(SZ) em cada clula salivar realizando a secreo. (A e B segundo Beermann, 1961, cortesia de W. Beermann.)

(A)

(B) BR 2

Figura 2.16

(C)

(A,B) Isolamento da regio BR2 de Chironomus tentans por micromanipulao. O cromossomo intacto 4 pode ser dividido em trs regies, uma contendo BR2. (C) Transcrio da regio BR2 mostrado por uma auto-radiografia in situ aps hibridizao do BR2 RNA com a preparao cromossmica. (A e B de Lambert e Daneholt, 1975; C de Lambert, 1972; fotografias cortesia de B. Lambert.)

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Portanto, os tufos nos cromossomos salivares esto produzindo mRNA ativamente. Em clulas que sintetizam essa protena, o gene est ativado; em clulas que no usam essa protena, o gene permanece reprimido.

Hibridizao de cido nuclico


Poucos genes puderam ser analisados como aqueles nos tufos politnicos de Chiromonus. E embora esses genes dos tufos eram ativos em clulas que j se haviam diferenciado (como aquelas da glndula salivar), no eram os genes causadores da diferenciao celular. Para encontrar e analisar os genes que so responsveis pelo desenvolvimento embrionrio, novas tcnicas tiveram que ser aperfeioadas. A maioria das tcnicas para anlise de genes eucariotos baseia-se na hibridizao de cidos nuclicos. Essa tcnica envolve fortalecimento de pedaos de fitas simples de RNA e DNA, para permitir a formao de hbridos de fitas duplas. Por exemplo, se o DNA cortado em pequenos pedaos e cada pedao dissociado em duas fitas simples desnaturado cada fita na soluo dever achar e reunir-se com seu parceiro complementar, quando lhe dado tempo suficiente para isso. As condies de renaturao devem ser tais que ligao especfica entre fitas complementares seja mantida e combinaes no especficas sejam dissociadas. Isso , em geral, conseguido variando a temperatura ou as condies inicas da soluo em que ocorre a renaturao (Wetmur e Davidson, 1968). De maneira semelhante, RNA sintetizado a partir de uma regio particular do DNA poderia ser esperado ligar-se fita do qual foi transcrito (Figura 2.17). Assim, RNA pode ser esperado hibridizar especificamente com o gene que o codifica. Para medir essa hibridizao, uma das fitas de cido nuclico (a sonda) em geral marcada pela incorporao de nucleotdeos radioativos. Um problema tcnico que inicialmente atormentou os estudos de hibridizao de cidos nuclicos foi a dificuldade em conseguir colocar quantidades suficientes de radioatividade na molcula de RNA. Esse problema foi superado isolando o RNA e fazendo uma cpia complementar de DNA (cDNA) na presena de precursores radiativos. Isso pode ser feito em tubo de ensaio contendo o RNA, uma extenso curta de DNA (chamado de iniciador ou primer), precursores radioativos de DNA e a enzima viral transcriptase reversa. Essa enzima pode produzir DNA de um molde de RNA (Figura 2.18). O DNA sintetizado in vitro, no sendo necessrio preocupar-se com a diluio

(A)

Condies de desnaturao (calor, lcali)

Condies de re-anelamento

Figura 2.17

Hibridizao de cidos nuclicos. (A) Se a hlice de DNA for separada em duas fitas, essas devem se re-anelar sob condies adequadas de fora inica e tempo. De maneira semelhante, se o DNA for separado em suas duas fitas, o RNA deve ficar capacitado a se ligar a genes que o codificam. Se presente em quantidades suficientemente grandes em comparao com o DNA, o RNA ir substituir uma das fitas de DNA nessa regio.

(B)

RNA

Desnaturar; adicionar RNA (em grande quantidade em comparao com DNA)

RNA hibridiza com uma fita de DNA

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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dos precursores radiativos. Alm disso, o DNA pode hibridizar tanto com o gene que produziu o RNA (embora a outra fita) e com o prprio RNA, tornando-o extremamente til para a deteco de pequenas quantidades de RNAs especficos.[other.html#gene6]

mRNA Anelar iniciador mRNA

Clonagem de DNA genmico


J em 1904 Theodor Boveri desesperava-se, considerando que as tcnicas de sua poca nunca seriam suficientes para permitir-lhe estudar como os genes criam embries. Havia necessidade de uma tcnica especial de amplificao gnica: Porque no somente o ncleo, nem mesmo cromossomos individuais, mas certas partes de certos cromossomos de certas clulas que precisam ser isolados e coletados em quantidades enormes para anlise; essa seria uma pr-condio para colocar o qumico em uma posio a qual lhe permitiria analisar (o material hereditrio) com mais mincias que o morfologista. Entretanto, desde a dcada de 1970 a hibridizao de cido nuclico permitiu aos biologistas do desenvolvimento realizar o que Boveri aspirava: isolar e amplificar regies especficas do cromossomo. A tcnica principal para isolar e amplificar genes individuais chamada clonagem de genes. A primeira fase desse processo consiste no corte de DNA nuclear em pedaos distintos, por incubao de DNA com uma endonuclease de restrio (geralmente chamada de enzima de restrio). De modo geral, essas endonucleases so enzimas bacterianas que reconhecem seqncias especficas do DNA e o clivam nesses stios (Tabela 2.1; Nathans e Smith, 1975). Por exemplo, quando DNA humano incubado com a enzima BamHI (de Bacillus amyloliquifaciens, cepa H), o DNA clivado em cada stio onde aparece a seqncia GGATCC. Os produtos so fragmentos de DNA de vrios tamanhos, todos terminando com G em um dos lados e GATCC no outro (Figura 2.19). Esses pedaos so freqentemente chamados de fragmentos de restrio.

Transcriptase reversa mRNA cDNA lcali

cDNA

Figura 2.18

Mtodo para preparar DNA complementar (cDNA). A maioria dos mRNA possui uma longa cadeia de resduos de adenosina (AAAn) no terminal 3 da mensagem (a ser discutida no Captulo 12); por isso, o pesquisador anela um iniciador consistindo de 15 resduos de desoxitimidina (dT15) ao final 3' da mensagem. Transcriptase reversa em seguida, transcreve uma fita de DNA complementar, comeando no iniciador dT15. O cDNA pode ser separado aumentando o pH da soluo, dessa maneira, desnaturando o hbrido de dupla fita e clivando o RNA.

Tabela 2.1 Stio enzimtico*

Enzimas de restrio comumente usadas Derivao Reconhecimento e clivagem

EcoRI BamHi HindIII SalI SmaI HhaI HaeIII AluI

Escherichia coli Bacillus amyloliquifaciens Haemophilus influenzae Streptomyces albus Serratia marcescens Haemophilus haemolyticus Haemophilus aegyptius Arthrobacter luteus

G AA T T C C T TAA G G G AT C C C C TAG G A AG CTT TTC GA A G TC GAC CAG C T G CCC GGG GGG CCC GCG C C GCG GG CC CC GG AGCT T C GA

* Todos os stios de reconhecimento de enzimas de restrio tm um centro de simetria. A seqncia de dupla fita lida em uma direo idntica seqncia lida da frente para trs na outra direo.

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

O prximo procedimento na clonagem do gene incorporar esses fragmentos de restrio em vetores de clonagem. Usualmente esses vetores so molculas circulares de DNA, replicadas em clulas bacterianas, independentemente do cromossomo bacteriano. So usados plasmdeos resistentes a drogas ou vrus especialmente modificados (que so muito teis na clonagem de grandes fragmentos de DNA). Por exemplo, um vetor pode ser construdo contendo apenas um stio sensvel BamHI. Esse vetor pode ser aberto por incubao com essa enzima de restrio. Aps a abertura, ele pode ser misturado com os fragmentos de DNA humano, produzidos tambm por BamHI. Em muitos casos, os pedaos do DNA cortado sero incorporados a esses vetores (porque seus terminais so complementares aos terminais abertos do vetor) e ligados covalentemente, colocando-os em uma soluo contendo a enzima DNA ligase. O processo total fornece plasmdeos bacterianos, cada um contendo um nico pedao de DNA humano. Esses so chamados plasmdeos recombinantes ou, geralmente, DNA recombinante (Cohen et al.,1973; Blattner et al., 1978). O plasmdeo ilustrado na Figura 2.19 pUC18, um vetor freqentemente usado por biologistas moleculares (Vierra e Messing,1982). Ele contm (1) um gene resistente a drogas, AmpR, que torna a bactria imune ampicilina e permite ao pesquisador selecionar aquelas bactrias que incorporaram um plasmdeo; (2) uma origem para a replicao de DNA, permitindo ao plasmdeo replicar centenas de vezes em cada bactria; e (3) um poli-ligante, um pedao curto de DNA artificial que contm os stios enzimticos de restrio para vrias dessas endonucleases. O poli-ligante se situa dentro de um gene lacZ que codifica a -galactosidase de E. coli. O poli-ligante suficientemente curto (e tem o nmero correto de pares de bases) de modo a no interferir com a atividade enzimtica da -galactosidase. O processo de clonagem comea quando os fragmentos de restrio do DNA nuclear so misturados aos plasmdeos abertos pUC18 e a eles so ligados, ocasionando o fechamento do plasmdeo. Os plasmdeos recombinantes putativos assim formados so ento incubados com clulas de E. coli sensveis ampicilina e sem o gene da -galactosidase. Mesmo que as bactrias e os plasmdeos sejam misturados em condies que encorajam as bactrias a incorporar os plasmdeos, nem todas as bactrias incorporam um plasmdeo. Para evidenciar aquelas bactrias que incorporaram plasmdeos, as clulas tratadas de E. coli so cultivadas em gar contendo ampicilina. Somente aquelas bactrias que incorporaram um plasmdeo (com seu gene dominante, ampicilina-resistente) sobrevivem. Mas nem todos plasmdeos incorporaram um gene estranho, porque possvel que os terminais adesivos do stio da enzima de restrio sofram uma renaturao entre si mesmos. Para distinguir entre colnias bacterianas que incorporaram DNA estranho e aquelas que no o fizeram, o gar tambm contm um corante chamado Xgal. Esse composto incolor, mas quando transformado pela -galactosidase forma um precipitado azul *.Assim, se um plasmdeo no incorporou um fragmento de restrio ao stio de enzima de restrio no poli-ligante, o gene da -galactosidase (lacZ) est funcional e a -galactosidase resultante torna o corante azul. O resultado o aparecimento de colnias azuis. Entretanto, se o plasmdeo incorporou um fragmento de DNA, o gene da -galactosidase destrudo pela insero. Essas bactrias no vo produzir a cor azul do corante; produzem colnias incolores no gar. Colnias incolores so ento selecionadas quanto a presena de um gene especfico. Clulas de cada uma dessas colnias so colocadas em um finssimo filtro de nitrocelulose ou nylon. Quando essas clulas so lisadas, seu DNA adere aos filtros. Em seguida, as fitas de DNA so separadas por aquecimento, e os filtros incubados em uma soluo contendo o RNA radioativo (ou sua cpia de cDNA) do gene que se

*O corante 5-bromo-4-cloroindol, e azul a no ser quando est complexado com uma molcula como galactose. A -galactosidase codificada pelo gene do plasmdeo cliva a galactose do corante permitindo que adquira a conformao azul.

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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Stio Hind III

Stio BamHI

Stio Eco RI Poli-ligante

Plasmdeo cortado no gene lacZ Quebra endonucleoltica por BamHI

Fragmentos de gene humano incubados e ligados em um plasmdeo

Plasmdeo recombinante com gene lacZ interrompido

DNA humano Quebra endonucleoltica por BamHI Mistura com bactrias (lacZ, sensvel amp.)

Figura 2.19

Um protocolo geral para clonar DNA, usando como exemplo a insero de uma seqncia de DNA humano em um plasmdeo com um stio sensvel BamHI.

Colnias incolores

quer clonar. Em alguns casos, a seqncia do mRNA ou gene no conhecida, devendo-se ento estimar a seqncia a partir da seqncia de aminocidos da protena). Se o plasmdeo contm aquele gene, seu DNA deve estar no filtro, e somente aquele DNA dever ser capaz de ligar o RNA radioativo ou a sonda de cDNA. Portanto, somente aquelas reas sero radioativas. A radioatividade nessas regies determinada por auto-radiografia. Filme sensvel a raios-X colocado sobre o papel tratado. Os eltrons de alta energia, emitidos pelo RNA radioativo, sensibilizam os gros de prata no filme, tornando-os escuros quando o filme revelado. Finalmente, uma mancha escura produzida sobre cada colnia contendo o plasmdeo recombinante que carrega o gene especfico (veja Figura 2.19). Essa colnia ento isolada e cultivada, produzindo bilhes de bactrias, cada uma contendo centenas de plasmdeos recombinantes idnticos. Os plasmdeos recombinantes podem ser separados do cromossomo da E. coli por centrifugao, e incubando o DNA do plasmdeo com BamHI libera-se o fragmento de DNA extranho que contm o gene. Esse fragmento pode ser separado do DNA plasmdico, permitindo ao pesquisador possuir microgramas de seqncias de DNA purificado contendo o gene especfico. Apesar desse procedimento parecer muito lgico e fcil, freqentemente o nmero de colnias a serem selecionadas astronmico. O nmero de fragmentos aleatrios que devem ser clonados para a obteno do gene desejado, aumenta com a crescente complexidade do genoma do organismo*. Para detectar um gene especfico de um genoma de mamfero, milhes de clones individuais devem ser selecionados.
*Complexidade se refere ao nmero de diferentes tipos de genes no ncleo. Apesar que milhes de clones precisam ser selecionados, aproximadamente 100.000 colnias podem, agora, ser selecionadas em uma nica placa. Outra maneira comum de selecionar os clones usar um plasmdeo que tem seu stio da enzima de restrio prximo a um vigoroso promotor bacteriano (tal como aquele para -galactosidase). As bactrias transcrevero o cDNA e o traduziro em protena. Aps a lise das colnias bacterianas no papel de filtro, as protenas aderem ao papel e podem ser identificadas por anticorpos dirigidos contra quela protena. Isso chamado clonagem de expresso, e os plasmdeos referidos como vetores de expresso.

Meio contendo ampicilina Colnias azuis Aplicao das colnias incolores nos crculos do papel de filtro; lisar para expor o DNA

mRNA radioativo Papel de filtro incubado com mRNA radioativo do gene a ser clonado

Preparao de auto-radiografia para indicar os clones bacterianos com fragmento de DNA que formou um hbrido com o DNA radioativo

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Hibridizao de DNA: entre e intra espcies


Clones podem ser selecionados por qualquer segmento de nucleotdeos radioativos. Portanto, os genes clonados de um organismo podem ser sondados com cDNAs radioativos derivados do mRNA de outras espcies. Uma das descobertas mais excitantes da moderna biologia do desenvolvimento foi verificar que genes usados para processos especficos de desenvolvimento em um organismo, podem ser usados para processos similares em outro organismo. Drosophila teve uma importncia crtica na descoberta desses genes. Iniciando com Morgan, esses genes foram mapeados e, nos anos 60, E. B. Lewis confirmou que alguns desses genes so responsveis pela formao de partes bsicas do corpo (veja Captulo 14). Um deles, Antennapedia, um gene cujo produto protico essencial para inibir a formao de estruturas da cabea no trax. Se o gene no est presente, antenas crescem onde deveriam estar as pernas. Se o gene expresso na cabea (como sucede em um mutante especfico), a mosca desenvolve um conjunto extra de pernas saindo das cavidades orbitais (veja Figura 14.28). Poderia tal gene existir em vertebrados? Evidncias desses genes em vertebrados apareceram em transferncias de DNA, algumas vezes chamadas de transferncias Southern devido a seu inventor, E. M. Southern (1975). DNA de numerosos organismos vertebrados e invertebrados, foram tratados com uma enzima de restrio, e os fragmentos de DNA resultantes foram separados em uma eletroforese em gel. As misturas de fragmentos foram colocadas em fendas em um dos lados do gel, que foi em seguida submetido uma corrente eltrica. Os fragmentos de DNA carregados negativamente migraram em direo ao plo positivo, os fragmentos menores movendo-se mais rapidamente do que os maiores. * Como a hibridizao no pode ser feita dentro do gel; o DNA deve ser colocado em uma superfcie plana, e isso feito por transferncia. Aps a desnaturao das fitas de DNA em lcali, os pesquisadores retornaram o gel a um pH neutro e em seguida o colocaram sobre um papel de filtro mido suportado por uma estrutura de plstico (Figura 2.20; Mc Ginnis et al., 1984; Holland e Hogan, 1986). Papel de nitrocelulose (capaz de ligar DNA de fita nica) foi colocado diretamente sobre o gel e coberto com mltiplas camadas de papel-toalha secas. O papel de filtro abaixo do gel estava em comunicao com o interior de uma cuba contendo tampo de alta fora inica. O tampo caminhou para cima atravs do gel e do filtro de nitrocelulose para as toalhas de papel. O DNA tambm foi levado por esse fluxo de tampo, mas foi detido pelo filtro de nitrocelulose; assim, o DNA foi transferido do gel ao papel de nitrocelulose. Aps fixar pelo calor os fragmentos de DNA no papel de nitrocelulose (de outra forma eles
*Considerando a mesma relao carga/massa, fragmentos menores adquirem uma maior velocidade que os maiores quando impulsionados pela mesma energia. Isso uma funo da equao de energia cintica, E=1/2 mv2. Resolvendo para velocidade, encontramos que ela inversamente proporcional raiz quadrada da massa. Filtro de nitrocelulose ou nylon Espaadores Desnaturar fragmentos de DNA fitas simples em lcali Papel-toalha Contatos de papel de filtro Peso

Figura 2.20

Transferncia Southern. DNA tratado com enzimas de restrio e os fragmentos resultantes so colocados em um gel e separados por eletroforese. Aps a separao, o DNA desnaturado em fitas nicas. O gel , em seguida, colocado sobre um papel de filtro saturado com tampo de alta fora inica. Papel de nitrocelulose ou um filtro de nylon colocado sobre o gel e o conjunto coberto com toalhas de papel. O tampo de transferncia atravessa o gel, o papel de nitrocelulose e as toalhas por ao capilar, levando junto o DNA. O DNA de fita nica retido pelo papel de nitrocelulose. As posies do DNA no papel diretamente refletem a posio dos fragmentos de DNA no gel.

Suporte Cuba com soluo tampo Gel Colocar filtro de nitrocelulose ou membrana de nylon sobre gel: colocar papel-toalha e peso

Digesto com restrio e eletroforese em gel de agarose

Colocar gel no papel de filtro mido entre 2 espaadores

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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Figura 2.21

Transferncia Southern do DNA de vrios organismos usando uma sonda radioativa do gene Antennapedia de Drosophila melanogaster. No se espera que as seqncias de espcies to diversas sejam perfeitamente idnticas e por essa razo o rigor da hibridizao diminudo trocando as solues salinas. (Coloquialmente esse baixo rigor das transferncias ao longo dos filos chamado transferncias de zoolgico, por razes bvias). Autoradiografia mostra que os genes de Drosophila contm vrias pores que so como as do gene Antennapedia em termos de estrutura; tambm, muitos organismos contm vrios genes que formaro hbridos com esse fragmento gnico radioativo, sugerindo que genes similares a Antennapedia existem nesses organismos. Os nmeros ao lado das transferncias indicam os tamanhos das bandas, em quilobases. (de McGinnis et al.,1984, cortesia de W. McGinnis.)

Drosophila Besouro melanogaster 10 10

Galinha Camundongo

Ubx ftz

10

10

3 3

Antp 1 1 1 1

se desprenderiam), o conjunto foi incubado com cDNA radioativo de uma poro do gene Antennapedia de Drosophila. Um autoradiograma do papel de nitrocelulose mostrou onde o DNA radioativo encontrou seu semelhante. Os resultados desses experimentos (Figura 2.21) mostraram que mesmo vertebrados (camundongos, humanos e pintos) tm genes que hibridizam com essas seqncias. Essa seco radioativa do gene Antennapedia foi usada para selecionar uma biblioteca genmica de clones de DNA derivados do genoma dessas diferentes espcies. Como veremos no Captulo 16, pesquisadores encontraram clones contendo genes que se parecem com o Antennapedia; esses genes se mostraram extremamente importantes na formao do eixo do corpo dos vertebrados.

Seqenciamento de DNA
Dados de seqncia podem dar informaes sobre a estrutura da protena codificada e podem identificar seqncias regulatrias de DNA que certos genes tm em comum. A simplicidade da tcnica de seqenciamento didesoxi de Sanger (Sanger et al.,1977) tornou-a um procedimento padro em muitos laboratrios de biologia molecular. No incio, usa-se um vetor contendo o gene clonado e se isola uma fita nica do DNA circular (Figura 2.22). Funde-se (anela-se) ento um iniciador (primer) radioativo de DNA (aproximadamente 20 pares de bases) complementar ao DNA do vetor imediatamente 3' ao gene clonado. (Porque essas seqncias dos vetores so conhecidas, iniciadores oligonucleotdicos podem ser facilmente sintetizados ou adquiridos comercialmente). O iniciador tem uma ponta 3' livre qual mais nucleotdeos podem ser adicionados. Coloca-se o DNA alvo e o iniciador juntamente com todos os quatro desoxirribonucleosdeos trifosfatos em quatro tubos de ensaio. Cada um dos tubos contm a subunidade polimerizante da DNA polimerase e um diferente didesoxinucleosdeo trifosfato: um tubo contm didesoxi-G, outro didesoxi-A e assim por diante. As estruturas dos desoxinucleotdeos e dos didesoxinucleotdeos esto representadas na Figura 2.23. Enquanto o desoxirribonucleotdeo no tem um grupo hidroxila (OH) no carbono 2' do seu acar, o didesoxirribonucleotdeo no tem grupos hidroxila em ambos os carbonos, 2' e 3'. Assim, mesmo que um didesoxirribonucleotdeo possa ser ligado a uma crescente cadeia de DNA pela DNA polimerase, ele interrompe o crescimento da cadeia por no ter um grupamento 3' ao qual se ligaria um novo nucleotdeo. Assim, quando a DNA polimerase est sintetizando DNA do iniciador, o novo DNA ser complementar ao gene clonado. No tubo com didesoxi-A, entretanto, sempre que a polimerase coloca um A na cadeia crescente, existe a possibilidade de que um didesoxi-A seja colocado em lugar do desoxi-A. Se isso acontecer, a cadeia pra. Similarmente, no tubo com didesoxi-G, a cadeia tem o potencial de parar toda vez que um G inserido. (O processo foi comparado uma dana folclrica grega na qual uma pequena porcentagem dos danarinos em potencial tem um brao em uma tipia).

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Fita nica desnaturada de DNA de plasmdeo recombinante

Iniciador

Subunidade polimerizante de DNA polimerase I de E. coli + dATP, dGTP, dCTP e dTTP

Seqncia da fita do iniciador Seqncia complementar Fragmentos maiores

Fragmentos menores

Figura 2.22

O mtodo didesoxi de seqenciar DNA. A fotografia contm a regio da auto-radiografia que mostra essa seqncia (Cortesia de G. Guild).

Adenina

Adenina

Base 1

Base 2 Adenina Desoxiadenosina trifosfato (acar desoxirribose) (A) Didesoxiadenosina trifosfato (acar didesoxirribose)

(B)

Figura 2.23

Comparao entre desoxinucleotdeos e didesoxinucleotdeos. (A) Estruturas dos dois tipos de nucleotdeos. A diferena evidenciada em cores. (B) O terminal 3' de uma cadeia que terminou pela incorporao de um didesoxinucleotdeo no tem um grupo hidroxila 3' terminal para continuar a polimerizao do DNA.

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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Em cada tubo esto sendo feitas milhes de cadeias e por essa razo eles contero uma populao de cadeias, algumas interrompidas no primeiro stio possvel, outras no ltimo e algumas em stios intermedirios. O tubo com didesoxi-A, por exemplo, conter cadeias com diferentes e distintos comprimentos, cada uma terminando com o resduo A. Os fragmentos de DNA radioativo resultantes sero separados por eletroforese. O resultado uma escada de fragmentos onde cada degrau uma seqncia de nucleotdeos de comprimento diferente. Lendo escada acima, obtem-se a seqncia do DNA complementar quela do gene clonado.

Anlise de mRNA atravs de bibliotecas de cDNA


Agora podemos retornar especificidade da transcrio de mRNA: possvel isolar populaes de mRNA que caracterizam certos tipos de clulas e esto ausentes em todas as outras? Para encontrar esses RNAs, podemos clonar os mRNA de diferentes tipos de clulas e compar-los. Como mostra a Figura 2.24A, isso feito tomando os RNAs mensageiros de uma clula ou tecido e convertendo-os em fitas de DNA complementar. Levando esse procedimento um passo frente (com o auxlio de DNA polimerase e S1 nuclease), podemos transformar essa populao de cDNA de fita nica em outra contendo pedaos de cDNA com fitas duplas. Essas fitas de DNA podem ser inseridas em plasmdeos, adicionando-lhes finais apropriados com DNA ligase. Acoplando um fragmento GATCC/ G aos terminais rombudos desse pedao de DNA cria-se um corte artificial de restrio BamHI, o que permite a insero em um vrus ou plasmdeo clivado por essa enzima (Figura 2.24B). Tais colees de clones derivados de mRNAs so freqentemente chamadas de bibliotecas. Assim, podemos ter uma biblioteca de fgado de embrio de camundongo de 16 dias, representando todos os genes ativos produzindo protenas hepticas embrionrias. Podemos ter tambm uma biblioteca de ocitos vegetais de Xenopus, representando mensagens presentes somente em uma parte especfica daquela clula. Genes clonados dessa maneira so muito importantes porque eles no tm ntrons. Quando adicionados s clulas bacterianas, esses genes podem ser transcritos e em seguida traduzidos nas protenas que codificam. Bibliotecas tm sido extremamente teis no estudo de desenvolvimento como demonstram os esforos de Wessel e colaboradores (1989) em verificar diferenas nos RNAs de diferentes partes do embrio, em gastrulao, do ourio-do-mar. Para encontrar mRNAs especficos do endoderma em ourio-do-mar, Wessel e colaboradores prepararam uma biblioteca de cDNA de embries gastrulantes. O mRNA dessas amostras (a maior parte do RNA de clulas eucariticas ribossmico) foi isolado por passagem em esferas com oligo-dT, as quais capturam as caudas de poli(A) das mensagens (veja legenda da Figura 2.19). A populao de mRNA foi, ento, convertida em uma de cDNA pelo uso da transcriptase reversa (veja Figura 2.24A). Usando polimerase I de E. coli o cDNA de fita nica foi transformado em fita dupla. No prximo passo, os cDNAs de fita dupla foram ligados a finais de EcoRI que esto disponveis no comrcio. Isso os tornou clonveis em vetores que foram abertos com a enzima de restrio EcoRI. O DNA foi misturado com os braos de um fago geneticamente modificado (veja Figura 2.24B). Esse fago construdo de tal maneira que ao ser cultivado em uma placa de Petri, os fagos que incorporaram o DNA (e assim destruram o gene da galactosidase) produzem placas incolores (Figura 2.24C). Dessa forma, foram gerados aproximadamente 4 milhes de fagos recombinantes, cada um contendo um cDNA representando uma molcula de mRNA. O prximo passo envolvia selecionar os fagos recombinantes. Quais deles representariam mRNAs encontrados no endoderma e no em outras camadas celulares? Wessel e seus colegas isolaram populaes de mRNAs do mesoderma, ectoderma e endoderma. Depois prepararam cDNAs marcados de cada uma das populaes de mRNA, usando precursores radioativos. Agora, possuam trs colees de molculas

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

(A)

Preparao de cDNA clonvel Regio codificadora mRNA Anela iniciador oligo (dT)

(B)

Insero de cDNA de dupla fita no vetor viral (bacterifago )

DNA de fago

BamHI Regio codificadora mRNA Transcriptase reversa Brao esquerdo Brao direito

cDNA mRNA Hidrlise alcalina cDNA de dupla fita preparado como descrito em (A) Inserir cDNA nos terminais do DNA do fago ; ligar No necessrio para a replicao do fago Braos contm todos os genes necessrios para a replicao, mas muito pequeno para o empacotamento

cDNA

DNA polimerase I Regio codificadora cDNA

S1 nuclease Regio codificadora Fita dupla cDNA Adicionar finais Bam HI

cDNA do mRNA, agora clonado em vetores virais

de cDNA radioativos, cada uma representando a populao de mRNA de uma das trs camadas germinativas. Os fagos recombinantes representando os mRNAs do embrio, em gastrulao, do ourio-do-mar foram cultivados e amostras de numerosas colnias cada uma contendo milhares de fagos colocadas em dois filtros de nitrocelulose (Figura 2.24D). O conjunto foi colocado em soluo de lcali para a lise dos fagos e obteno de DNA de fita nica. Um desses papis de filtro foi incubado com cDNA radioativo feito a partir do mRNA total do endoderma; o outro papel incubado com sondas radioativas para ambos, mesoderma e ectoderma. Os filtros foram lavados para a remoo de cDNA radioativo no hibridizado, secos e expostos em filmes para raios-X. Se um mRNA estivesse presente no endoderma, mas no no ectoderma ou mesoderma, o DNA recombinante produzido daquela mensagem deveria ligar cDNA radioativo do endoderma e no deveria encontrar um mRNA em qualquer outro lugar. Como resultado, aquela mancha de DNA recombinante do endoderma deveria ser radioativa (pois foi ligado ao cDNA radioativo do endoderma), mas o mesmo clone no deveria ser radioativo quando exposto a mRNA ectodrmico ou mesodrmico; isso foi confirmado. Um fago recombinante, em particular, ligou somente cDNA radioativo produzido

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

63

(C) Preparao da biblioteca de clones do fago

(D) Seleo da biblioteca de fagos clonados Transferir alguns fagos para filtros de nitrocelulose

Fago hbrido Adicionar camada de clulas de E. coli

Filtros de nitrocelulose

Infeco de E. coli pelo fago

Lise Placa Zona de lise indicando clones do fago

Tratar filtros com soluo alcalina para lisar os fagos e desnaturar o DNA liberado

Camada de bactrias E. coli

Incubar com sonda radioativa para endoderma

Incubar com sonda radioativa para mesoderma e ectoderma

Figura 2.24

Protocolo usado para organizar bibliotecas de cDNA. (A) RNA mensageiro isolado e feito seu cDNA, que em seguida transformado em dupla fita e adicionado de fragmentos finais de restrio. (B) Os genes cDNA so inseridos em vetores especialmente modificados, nesse caso, bacterifagos. (C) Os fagos contendo o DNA recombinante lisaro E. coli formando placas. Tcnicas bioqumicas podem distinguir placas de fagos recombinantes daquelas que no tm o gene inserido. (D) As placas so transferidas para papel de nitrocelulose e tratadas com lcali para lisar os fagos e desnaturar DNA localmente. Esses filtros so ento incubados com sondas radioativas (usualmente cDNA) de um tecido. Para a seleo da biblioteca diferencial de cDNA, discutida no texto, a mesma biblioteca de fagos foi selecionada com sondas radioativas de dois tecidos diferentes, permitindo ao pesquisador procurar por um mRNA encontrado em um tipo de tecido mas no em outro.

Sonda radioativa DNA de fago de fita nica ligado ao filtro Preparao dos autoradiogramas

Clone de DNA representando o mRNA encontrado no endoderma mas no no mesoderma ou ectoderma

de mRNA do endoderma; portanto, representava um mRNA encontrado no endoderma e no no mesoderma ou ectoderma. O fago contendo esse gene pode agora ser cultivado em grandes quantidades e caracterizado.

Tcnicas de localizao de RNA


Hibridizao In Situ O processo de hibridizao in situ, desenvolvido por Mary Lou Pardue e Joseph Gall (1970), permite ao pesquisador visualizar as posies de cidos nuclicos especficos dentro de clulas e tecidos. Se um clone especfico considerado interessante (por exemplo, o clone endoderma-especfico que foi mencionado) ele cultivado em

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

grandes quantidades, e o gene clonado isolado tratando o vetor recombinante com enzimas de restrio. Esse transformado em fita nica e tornado radioativo. Quando o cDNA radioativo adicionado s clulas fixadas apropriadamente em lminas de microscpio, o cDNA radioativo se liga unicamente onde est presente o mRNA complementar. Aps eliminao do cDNA no fixado, a lmina coberta com uma emulso fotogrfica transparente para auto-radiografia. As manchas resultantes, diretamente acima de onde o cDNA radioativo foi ligado, parecem escuras quando visualizadas diretamente, ou brancas quando vistas com iluminao em campo escuro. Assim, pode-se visualizar aquelas clulas (ou mesmo regies dentro das clulas) que acumularam um tipo especfico de mRNA. A Figura 2.25A,B mostra hibridizao in situ usando o cDNA especfico para clulas endodrmicas. O cDNA encontra mRNAs somente no endoderma da gstrula precoce do ourio-do-mar. Continuando a gastrulao, o cDNA (e portanto o mRNA) se localiza de forma ainda mais precisa entre a regio do intestino posterior e o intestino mdio no tubo endodrmico. Trabalhando com sondas radioativas e emulses, torna-se necessrio o uso de seces microscpicas extremamente finas. Uma tcnica mais recente para hibridizao in situ utiliza sondas que ligam reagentes coloridos. Dessa maneira, cientistas podem observar rgos inteiros (e organismos) sem seccion-los, e com uma viso de amplas regies de expresso gnica. A Figura 2.25C mostra uma hibridizao in situ, realizada em montagem integral, em um embrio de camundongo com 10.5 dias. A sonda reconhece o mRNA codificado pelo gene Brachyury (discutido na pgina 40), que sintetiza uma protena necessria para a produo de clulas mesodrmicas na parte posterior do embrio de camundongo. Transferncias Northern Podemos tambm determinar a expresso temporal e espacial de RNAs executando uma transferncia de RNA (freqentemente chamada transferncia Northern). Enquanto transferncias Southern transferem fragmentos de DNA do gel para o papel, transferncias Northern (nome no se relaciona com o inventor) transferem RNA entre os mesmos suportes e da mesma maneira. O pesquisador pode extrair RNAs mensageiros do embrio em vrios estgios de desenvolvimento e submet-los eletroforese lado a lado, em um gel. Aps transferncia dos RNAs separados para o papel de nitrocelulose ou membrana de nylon, o conjunto incubado em uma soluo contendo um fragmento radioativo, mono-fita, de DNA de um determinado gene. Esse DNA adere somente s regies onde est localizado o RNA complementar. Assim, se o mRNA para aquele gene est presente em um determinado estgio embrionrio, o DNA radioativo se liga a ele e pode ser detectado por auto-radiografia. Autoradiogramas desse tipo, onde vrios estgios so comparados simultaneamente, so denominados transferncias Northern de desenvolvimento. A Figura 2.26A mostra uma transferncia Northern de desenvolvimento para a expresso de um gene endoderma-especfico durante o desenvolvimento do ourio-do-mar. Podemos ver que o mRNA para essa protena endodrmica inicialmente sintetizado durante o estgio de blstula mesenquimatosa e continuamente durante todo o resto do desenvolvimento. A transferncia Northern na Figura 2.26B mostra que a acumulao desse mRNA no estgio de prisma restrita ao endoderma (Wessel et al.,1989). Hibridizao in situ e transferncias Northern fornecem as melhores evidncias em favor da transcrio diferencial de RNA, no espao e no tempo. A transcrio de certos genes pode ser especfica para tecidos ou tempo. A distribuio temporal na transcrio de vrios genes pode ser visualizada por transferncia de mancha. Por exemplo, Sargent e Dawid (1983) isolaram da gstrula de Xenopus um mRNA que no estava presente no ovo. Para isso eles extraram o mRNA da gstrula e fizeram cpias cDNA dessas mensagens. Os cDNAs da gstrula foram misturados com grandes quantidades de mRNA de ocitos. Se houvesse hibridizao entre o mRNA dos ocitos e o cDNA da gstrula, significaria que o cDNA era derivado

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

65

(B) (A)

(C)

Figura 2.25

Enzima fosfatase alcalina

Corante (precipitado azul escuro) Ncleo Corante

Anticorpo para biotina Biotina

(incolor) Sonda complementar a mRNA de Brachyury tendo resduos de biotina em suas uridinas

mRNA de Brachyury

Hibridao in situ. (A,B) Fotomicrografias, em fundo escuro, de hibridao in situ, mostrando a localizao de mRNA endodermaespecfico em embrio de ourio-do-mar. O cDNA radioativo usado como sonda foi preparado do gene clonado, feito a partir de mRNA endoderma-especfico (veja Figura 2.24). Esse cDNA radioativo se liga ao mRNA do endoderma da gstrula precoce do ouriodo-mar (A) e ao endoderma do intestino mdio e posterior da gstrula tardia do ouriodo-mar (B). (C) Hibridizao in situ, em montagem integral, de um embrio de camundongo de 9.5-10.5 dias corado para mRNA de Brachyury. Essa mensagem transcrita em clulas formando novo mesoderma, e nesse estgio encontrada na poro posterior do embrio. Embries fixados foram incubados em uma sonda para mRNA de Brachyury (a fita antisense complementar ao mRNA) que foi sintetizada usando uridina biotinilada. Aps eliminar a parte da sonda que no se ligou ao mRNA de Brachyury (e inativar qualquer atividade endgena de fosfatase alcalina do embrio), o embrio foi tratado com anticorpos para biotina. Esses anticorpos foram ligados s enzimas do tipo fosfatase alcalina. Colorir para a presena de fosfatase alcalina permite que se determine a localizao de um mRNA especfico. Fotografias coloridas da hibridizao in situ, em montagem integral, esto nas Pranchas 22, 23 e 25. (A e B de Wessel et al.,1989, cortesia de G. Wessel; C do laboratrio do autor.)

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

(A)

Ovo Clivagem Blstula Blstula Mesenquimatosa Blstula precoce Blstula tardia Prisma Plteo

(B)

Ectoderma / mesoderma Endoderma

Figura 2.26

Transferncia Northern para um gene especfico no endoderma do ourio-do-mar, Lytechinus variegatus. (A) Transferncia Northern de desenvolvimento, mostrando acumulao de mRNA de acordo com o estgio especfico desse gene. mRNA total (10 g por estgio) foi submetido eletroforese em gel de agarose. O gel foi transferido para papel tratado e os mRNAs aderidos ao papel, que foi em seguida incubado com cDNA radioativo de um clone endoderma-especfico. Mostrou-se que esse mRNA sintetizado durante o estgio de blstula do mesnquima e aumentado ao longo do desenvolvimento. (B) Transferncia Northern no estgio de prisma, mostrando que o mRNA est presente no endoderma (com algum mesoderma aderido) mas no no ectoderma. RNA total do endoderma foi eletroforisado (pista 2) prximo ao mRNA do resto do ourio-do-mar (pista1). Ligao com cDNA radioativo detectou mRNA somente no endoderma. (de Wessel et al., 1989, cortesia de G. Wessel.)

de um mRNA presente em ambos os estgios, ocito e gstrula. Essas molculas hbridas com dupla fita foram removidas por filtrao, deixando uma populao de cDNAs gstrula-especfico. Os cDNAs foram transformados na forma de dupla fita (pela DNA polimerase) e inseridos em veculos de clonagem. Essa tcnica denominada de clonagem de subtrao. Como a seleo dupla de bibliotecas de cDNA, a clonagem de subtrao gera um conjunto de clones estgio-especficos cujo mRNA encontrado em alguns estgios, mas no em outros, ou em alguns tecidos mas no em outros (Figura 2.27). Sargent e Dawid usaram embries, dos estgios de zigoto a broto caudal do girino e, separadamente, isolaram seus RNAs. Os RNAs foram aplicados diretamente (sem prvia eletroforese em gel) a filtros de nitrocelulose de modo que cada filtro tinha RNAs de todos os estgios. Aps a fixao (calor) dos RNAs no filtro, DNA de fita nica derivado de um especfico clone gastrular, foi marcado radioativamente e incubado com os filtros. Se um gene estava sendo transcrito em um determinado estgio, o cDNA radioativo daquele gene encontraria seu complemento nos mRNAs daquele estgio, no filtro. Aps eliminaco do cDNA no ligado, a ligao do cDNA radioativo foi observado por auto-radiografia. A transferncia de manchas na Figura 2.28 mostra o esquema temporal de expresso para 17 genes que so ativos em vrios estgios da gastrulao. Nenhum deles expresso antes da transio da blstula mediana em 7 horas. Alguns genes (DG64, DG39) so expressos imediatamente depois, enquanto outros (DG72, DG81) comeam a ser transcritos na gstrula mediana, aps aproximadamente 7 horas. Alguns genes (DG76, DG81) so mantidos aps a ativao, enquanto a atividade de outros (DG56, DG21) muito mais transitria.

Encontrando mensagens raras pela reao da polimerase em cadeia


A reao da polimerase em cadeia (PCR) um mtodo de clonagem in vitro que pode produzir enormes quantidades de um fragmento especfico de DNA a partir de uma pequena quantidade de material de partida (Saiki et al.,1985). Esse mtodo pode ser usado para clonar um gene especfico ou para determinar se um gene especfico est ativamente transcrevendo RNA em um determinado rgo ou tipo de clula. O mtodo padro de clonagem usa microorganismos vivos para amplificar o DNA recombinante. PCR, no entanto, pode amplificar uma nica molcula de DNA por um fator de vrios milhes em poucas horas e o faz em um tubo de ensaio. Essa tcnica tem sido extremamente til em casos onde a quantidade de cido nuclico para estudo muito pequena. Embries de camundongos, por exemplo, na fase de pr-implantao tm muito pouco mRNA e no se pode obter milhes desses embries para estudo. Se fosse necessrio saber se o embrio de camundongo na fase de pr-implantao contm o mRNA para uma protena determinada, seria muito difcil descobrir usando os mtodos padro de clonagem. Entretanto, a tcnica do PCR permite encontrar essa mensagem com poucos embries, por amplificar especificamente somente aquela mensagem, um milho de vezes (Rappolee et al., 1988). O uso de PCR para encontrar mRNAs raros est ilustrado na Figura 2.29. Os mRNAs de um grupo de clulas so purificados e convertidos a cDNA por transcriptase reversa. Usando DNA polimerase e S1 nuclease, a populao de DNAs de fita nica transformada em uma populao de fita dupla. Em seguida, escolhe-se um DNA para ser amplificado. Para isso, separam-se as duplas hlices do DNA, s quais so adicionados dois pequenos oligonucleotdeos iniciadores que so complementares a uma poro da mensagem procurada. Se os oligonucleotdeos reconhecem seqncias no DNA, ento o mRNA estava presente originalmente. Os oligonucleotdeos foram preparados de forma a permitir uma hibridizao com fitas opostas e lados opostos da seqncia alvo. (Se a tentativa isolar o gene ou mRNA para uma protena especfica de seqncia conhecida, essas regies laterais podem ser preparadas,

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

67

Extrair mRNA Ocito mRNA total de ocito Hibridizar

cDNA de gstrula que encontra mensagem complementar em mRNA de ocito

cDNA de gstrula sem seqncia complementar a mRNA de ocitos

Extrair mRNA Gstrula mRNA total de gstrula

Fazer cDNA de mRNA cDNA de gstrula

DNA polimerase S1 nuclease

Figura 2.27

cDNA de dupla fita especfico de gstrula Adicionar ligantes

Clonagem de subtrao de genes de gstrula expressos diferencialmente em Xenopus laevis. cDNA foi produzido para mensagens isoladas de gstrula e hibridizado com mRNA de ocitos. Os cDNA de gstrula que no encontraram seqncias complementares nos mRNAs de ocitos, eram produtos de genes ativos na gstrula mas no nos ocitos. Esses genes foram clonados fazendo o cDNA de fita dupla e adicionando ligantes para permitir sua insero em veculos de clonagem.

Figura 2.28

Colocar em veculo de clonagem

Transferncias de mancha no desenvolvimento mostram os tempos em que 17 genes de Xenopus esto transcrevendo ativamente. Acumulao especfica de mRNA no citoplasma registrada embebendo mRNA total, de genes em estgios embrionrios, em papel de nitrocelulose e incubando a tira de papel com DNA radioativo derivado de um clone de cDNA especfico de gstrula. Justapondo essas tiras, obtem-se um esquema temporal para a atividade de genes especficos. A linha r5 representa um controle de RNA ribossmico que deve estar sempre presente. (de Jamrich et al., 1985, cortesia de I. Dawid e M. Sargent.)
Blstula Estgio Clone Gstrula Nurula

Plasmdeo recombinante contendo DNA para mRNA especfico para gstrula

Broto de cauda

Horas aps a fertilizao

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Finais da seqncia do polipeptdeo

RNAs que codificam o amino terminal (iniciador 1)

RNAs que codificam o carboxi terminal (iniciador 2) RNA iniciador 1 DNA alvo RNA iniciador 2

1 cpia

Primeiro ciclo

Aquecer a 95oC para desnaturar DNA. Esfriar a 37oC para permitir hibridizao dos iniciadores a DNA

Quando aquecido a 72o C, taq polimerase estende fitas complementares a partir dos iniciadores 2 cpias Primeiro ciclo de snteses resulta em duas cpias da seqncia alvo de DNA Desnatura DNA Hibridiza iniciadores

Segundo ciclo

Estende novas fitas de DNA

4 cpias

Segundo ciclo de snteses resulta em quatro cpias da seqncia alvo de DNA

Figura 2.29

Protocolo para a reao de polimerase em cadeia (PCR). Para determinar se um tipo particular de mRNA est presente, todo mRNA convertido a DNA de dupla fita pela transcriptase reversa e DNA polimerase. Esse DNA desnaturado e dois conjuntos de iniciadores so adicionados. Se a seqncia especfica estiver presente, os iniciadores se hibridizaro aos seus terminais opostos. (Iniciadores especficos so produzidos com base na seqncia que se procura. Se conhecida apenas a seqncia da protena codificada pela mensagem, prepara-se um conjunto de diferentes iniciadores, cada um possivelmente complementar ao DNA.) Usando DNA polimerase termoestvel de T. aquaticus, cada fita de DNA sintetiza seu complemento. Essas fitas so, por sua vez, desnaturadas e os iniciadores so hibridizados a elas, iniciando o ciclo novamente. Dessa maneira, o nmero de fitas novas com a sequncia entre os dois iniciadores aumenta exponencialmente.

sintetizando oligonucleotdeos que codificam o amino terminal da protena e oligonucleotdeos complementares aqueles que codificam o carboxi terminal da protena). Os finais 3' desses iniciadores esto face a face de modo que a replicao atravs do DNA alvo. Uma vez hibridizado o primeiro iniciador, a DNA polimerase pode sintetizar uma nova fita.

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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Essa enzima no a DNA polimerase normal de E. coli; uma polimerase de bactrias como Thermus aquaticus ou Thermococcus litoralis. Essas bactrias vivem em fontes de gua quente (como aquelas do Yellowstone National Park) ou nos respiradouros trmicos de submarinos, onde a temperatura atinge valores prximos de 900C. Essas DNA polimerases podem suportar temperaturas prximas ebulio e o PCR se utiliza dessa adaptao evolucionria. Uma vez sintetizada a segunda fita, ela separada de seu complemento por desnaturao em alta temperatura. O segundo iniciador adicionado e agora ambas as fitas podem sintetizar novo DNA. Sucessivos ciclos de desnaturao e sntese amplificaro essa regio do DNA de forma geomtrica. Aps vinte turnos, aquela regio especfica estar amplificada 220 vezes (um pouco mais de um milho). Quando submetido eletroforese esse fragmento amplificado facilmente detectado. Isso mostra que o mRNA original com essa seqncia estava presente na amostra. (A confirmao poderia ser feita por transferncia Southern, como na Figura 2.30). Alm disso, pode-se usar essas cpias amplificadas para clonagem, colocando-as em vetores de clonagem.
Figura 2.30

Ovrio de rato
Adulto

Ovrio de camundongo Rim de camundongo Rim de camundongo Salivares de camundongo Pncreas de camundongo Pulmo de camundongo

Embrio de 14 dias

Sem adio de DNA

Determinando a funo do gene: clulas e organismos transgnicos


Tcnicas de insero de DNA novo em uma clula Apesar de ser importante conhecer a seqncia de um gene e seu esquema temporoespacial de expresso, o que realmente crucial conhecer a funo daquele gene no desenvolvimento. Tcnicas recentes permitem estudar a funo do gene, tirando e repondo certos genes de clulas embrionrias. Pedaos de DNA clonados podem ser modificados (se desejado), e colocados em clulas por vrios meios. Uma tcnica muito direta a microinjeo, na qual uma soluo contendo o gene clonado cuidadosamente injetada no ncleo da clula (Capecchi, 1980). Essa uma tcnica especialmente til para injetar genes em ovos recentemente fertilizados, pois os ncleo haplides do espermatozide e do vulo so relativamente grandes (Figura 2.31). Em transfeco, o DNA incorporado diretamente na clula por incubao em uma soluo determinada onde a clula o incorpora. A probabilidade de incorporao de tal fragmento de DNA no cromossomo relativamente pequena, sendo necessrio misturar o DNA com outro gene que permite a sobrevivncia das raras clulas que o incorporaram, em condies de cultura onde as outras clulas so destrudas (Perucho et al.,1980; Robins et al.,1981). Outra tcnica a eletroporao, onde pulsos de alta voltagem empurram o DNA para dentro da clula. Um mtodo mais natural para introduzir genes na clula colocar o gene clonado em um elemento transponvel ou vetor retroviral. Esses so regies mveis de DNA, de ocorrncia natural, que podem ser integrados no genoma. Retrovrus so vrus contendo RNA. Dentro da clula hospedeira eles produzem uma cpia de seu DNA (usando sua prpria transcriptase reversa); a cpia se transforma em dupla fita e se integra em um cromossomo do hospedeiro. A integrao consumada devido s duas seqncias idnticas (longas repeties terminais) nos terminais do DNA retroviral. Vetores retrovirais so produzidos removendo os genes do empacotamento viral (necessrios para a sada dos vrus da clula) do centro de um retrovrus de camundongo. Essa extrao cria um stio vazio onde outros genes podem ser colocados. Usando enzimas de restrio apropriadas, o pesquisador pode remover genes de um fago ou plasmdeo clonado e reinserir o gene em vetores retrovirais. Retrovetores virais infectam clulas de camundongo com eficincia prxima de 100%. Em Drosophila, novos genes podem ser introduzidos na mosca, via elementos P. Essas seqncias de DNA, so elementos transponveis de ocorrncia natural que podem ser integrados como vrus em qualquer regio do genoma da Drosophila. Ainda mais, eles podem ser isolados, e genes clonados inseridos no centro do elemento P. Quando o elemento P recombinado injetado em um ocito de Drosophila, ele pode se integrar ao DNA e prover o embrio de um novo gene (Spradling e Rubin, 1982).

Evidncia fornecida por PCR, para a sntese de um fator de crescimento, activina, de rgos embrionrios de camundongo. O mRNA desses rgos foi convertido em DNA e amplificado atravs de 20 ciclos de replicao. O DNA foi submetido sucessivamente eletroforese e transferncia Southern usando uma sonda radioativa para uma parte do gene de activina. mRNA de activina foi encontrado no ovrio do camundongo adulto (como esperado) e tambm em vrios rgos embrionrios. A possvel funo de activina nesses orgos ser discutida no Captulo 17. (Cortesia de O. Ritvos.)

70

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Figura 2.31

Injeo de DNA (de genes clonados) em um ncleo (neste caso, um proncleo de um ovo de camundongo). (de Wagner et al.,1981, cortesia de T. E. Wagner.)

Camundongos quimricos As tcnicas descritas tm sido usadas recentemente para transferir genes para todas as clulas do embrio de camundongo (Figura 2.32). Durante o desenvolvimento do camundongo existe um estgio onde somente esto presentes dois tipos de clulas: as clulas externas, que formaro a poro fetal da placenta, e as clulas internas, que daro origem ao prprio embrio. Essas clulas internas so chamadas clulas embrionrias precursoras (clulas tronco), porque cada uma delas pode, se isolada, gerar todas as clulas do embrio (Gardner, 1968; Moustafa e Brinster, 1972). Essas clulas podem ser isoladas do embrio de um camundongo e cultivadas. Uma vez em cultura, elas podem ser tratadas como descrito, de modo a incorporar novo DNA. A nova clula embrionria precursora (no somente o DNA, mas a clula inteira) pode ser injetada em outro embrio de camundongo em fase precoce. Assim, a clula precursora tratada estar integrada no embrio do hospedeiro. O resultado um camundongo quimrico*. Algumas de suas clulas so derivadas das clulas embrionrias precursoras do hospedeiro, mas outra poro de clulas derivada tambm das clulas precursoras tratadas. Se as clulas tratadas se tornaram parte da linha germinal do camundongo, alguns dos seus gametas sero derivados da clula doadora. Quando cruzado com um camundongo do tipo selvagem, alguns de seus descendentes levaro, portanto, uma cpia do gene inserido. Os descendentes heterozigotos, no acasalamento produziro 25% de embries carregando duas cpias do gene inserido em cada clula de seu corpo (Gossler et al.,1986). Assim, em trs geraes o camundongo quimrico, o camundongo heterozigoto e o camundongo homozigoto um gene que foi clonado de um outro indivduo, est agora presente em ambas as cpias dos cromossomos dentro do genoma do camundongo. Camundongos com genes estveis de outros indivduos so chamados camundongos transgnicos. Essas linhagens tm sido particularmente teis na determinao das funes de regies reguladoras que ladeiam os genes. Experimentos com genes com endereamento (Gene targeting ou Knockout) A anlise de embries precoces de mamferos foi durante muito tempo prejudicada pela dificuldade em criar e selecionar mutaes que afetam a fase inicial do desenvolvimento embrionrio. Esse problema foi superado pela tcnica chamada de endereamento de genes (s vezes, chamada de Knockout). As tcnicas so similares quelas que produzem camundongos transgnicos, mas em lugar de adicionar genes, enderear genes significa trocar alelos do tipo selvagem por outros mutados. Chisaka e Capecchi (1991) usaram essa tcnica para estudar a funo do gene Hoxa3 no desenvolvimento do camundongo. Hoxa-3 semelhante a vrios genes de Drosophila que so conhecidos como controladores da expresso gnica de segmentos especficos no embrio precoce; a protena codificada por Hoxa-3 liga-se ao DNA, exatamente como sua correspondente na Drosophila. Seria possvel que Hoxa3 de maneira similar estaria regulando a expresso gnica espao-especfica nos mamferos? Chisaka e Capecchi isolaram o gene Hoxa-3, cortaram-no com uma enzima de restrio e inseriram nesse stio um gene para resistncia neomicina (Figura 2.33). Em outras palavras, eles mutaram o gene Hoxa-3 pela insero de um grande pedao de DNA que continha um gene resistente neomicina, destruindo a habilidade da protena Hoxa-3 em se ligar a DNA. Esses genes mutantes Hoxa-3 foram eletroporados em clulas embrionrias precursoras que eram sensveis neomicina.

* crtico notar a diferena entre uma quimera e um hbrido. Um hbrido resulta da unio de dois genomas diferentes dentro da mesma clula: o descendente de um genitor de gentipo AA e outro de gentipo aa um hbrido Aa. Uma quimera resulta quando clulas de constituio gentica diferente aparecem no mesmo organismo. O termo apto: refere-se a um monstro mitolgico com cabea de leo, corpo de bode e cauda de serpente.

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

71

Clulas embrionrias precursoras

Trofoblasto

Cultura de clulas embrionrias precursoras

Gene clonado no vetor Mistura de clulas embrionrias precursoras com o gene clonado Seleo de clulas embrionrias precursoras que incorporaram o transgene

Microinjetar clulas precursoras transgnicas no embrio hospedeiro

Integrao das clulas no hospedeiro

Injetar no tero Camundongos quimricos

Figura 2.32

Camundongos transgnicos heterozigotos

Camundongos transgnicos homozigotos

Uma vez dentro do ncleo dessas clulas, o gene Hoxa-3 mutado substituiu um alelo normal desse gene por um processo chamado recombinao homloga. Aqui, as enzimas envolvidas no reparo de DNA e replicao incorporam o gene mutante em lugar da cpia normal. Esse um evento raro, mas tais clulas podem ser selecionadas cultivando as clulas precursoras em neomicina. A maioria das clulas morre com a droga, mas aquelas que adquiriram resistncia pelo gene incorporado sobrevivem. As clulas resultantes tm um gene Hoxa-3 normal e um Hoxa-3 mutado. As clulas precursoras heterozigotas so microinjetadas em um blastcito de camundongo e se integram nas clulas do embrio. O camundongo resultante uma quimera composta de clulas do tipo selvagem do embrio hospedeiro e de clulas heterozigotas Hoxa-3, das clulas precursoras. As quimeras so acasaladas com camundongos do tipo selvagem e se algumas das clulas doadoras se integraram linhagem das clulas germinativas, alguns dos descendentes sero heterozigotos

Produo de camundongos transgnicos. Clulas embrionrias precursoras de um camundongo so cultivadas e o genoma alterado pela adio de um gene clonado. As clulas transgnicas so selecionadas e injetadas em um embrio hospedeiro de camundongo na sua fase precoce. Aqui, as clulas embrionrias precursoras transgnicas se integram s celulas precursoras do hospedeiro. Esse embrio colocado no tero de um camundongo fmea grvida e se desenvolve em um camundongo quimrico. Se as clulas precursoras doadoras contriburam para a linha germinativa, e o camundongo quimrico cruzado com um do tipo selvagem, parte dos descendentes sero heterozigotos ao alelo adicionado. Cruzando heterozigotos, pode ser gerada uma linhagem de camundongos que homozigota ao alelo adicionado. Essa seria uma linhagem transgnica. O gene adicionado (o transgene) pode ser de qualquer fonte eucaritica.

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

(A) Massa celular interna Blastcito neo r Cultura de clulas embrionrias precursoras (ES)

Eletroporao

Recombinao homloga Clula precursora embrionria

(B) gene Hoxa-3 Endonucleases de restrio gene neor gene Hoxa-3 mutado com o gene neor inserido Hoxa-3

Figura 2.33

Tcnica de endereamento de genes (gene targeting). Nesse caso o gene alvo o Hoxa-3. (A) Clulas embrionrias precursoras (ES) so cultivadas a partir de uma massa celular interna. (B) Os genes Hoxa-3 clonados so cortados com uma enzima de restrio, e um gene neomicina-resistente inserido na regio que codifica o stio de ligao da protena ao DNA. Esses genes Hoxa-3 mutantes so eletroporados em clulas ES, onde recombinao homloga troca o gene do tipo selvagem pela cpia mutada. As clulas so selecionadas pela sua resistncia neomicina. (C) As clulas ES heterozigotas selecionadas so inseridas na massa interna de clulas de um embrio do tipo selvagem, e o blastcito retornado ao tero. O camundongo resultante uma quimera composta de tecidos Hoxa-3 heterozigotos e tecidos Hoxa-3 do tipo selvagem. Cruzando os animais quimricos com camundongos do tipo selvagem produz-se descendentes Hoxa-3 heterozigotos se as clulas ES contriburam na linhagem germinativa. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si, e aproximadamente 25% de sua cria deve ser de homozigotos mutantes de Hoxa-3.

Seleo de clulas ES heterozigotas por sua resistncia neomicna

(C)

Injeo de clulas ES heterozigotas no blastcito

Injeo dos blastcitos no tero

Produo de camundongos quimricos

Heterozigotos

Cruzamento de quimricos com tipo selvagem Cruzamento de camundongos heterozigotos Hoxa-3/ Hoxa-3+ Heterozigotos Hoxa-3/ Hoxa-3

Homozigoto

para o gene Hoxa-3. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si, e aproximadamente 25% de seus descendentes devem levar duas cpias do gene mutado Hoxa-3. Esses camundongos mutantes homozigotos no possuem as glndulas tireide, paratireide e timo! Dessa maneira, endereando genes pode-se analisar as funes de determinados genes durante o desenvolvimento de mamferos. [gene7.html]

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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Determinando a funo de uma mensagem: RNA antisense


Outro mtodo para determinar a funo de um gene fazer cpias antisense de sua mensagem. Mensagens antisense podem ser produzidas usando cDNA clonado e fazendo sua reclonagem em reverso, prximo a um vigoroso promotor bacteriano, em outro vetor. O promotor bacteriano iniciar a transcrio da mensagem na direo errada quando for incubado com RNA polimerase e nucleosdeos trifosfato. Dessa maneira, sintetizado um transcrito que complementar aquele natural (Figura 2.34A). O transcrito complementar chamado RNA antisense porque o reverso da mensagem original. Quando grandes quantidades de RNA antisense so injetadas ou transfectadas em clulas contendo o mRNA normal desse gene, o RNA antisense se liga mensagem normal; o cido nuclico dupla-fita resultante degradado (enzimas do citoplasma das clulas digerem cidos nuclicos de fita dupla). Isso causa uma depleo funcional da mensagem, como se houvesse uma mutao eliminatria para aquele gene. Esses resultados foram confirmados quando RNA antisense foi produzido a partir do gene Krppel de Drosophila. Krppel crtico para a formao do trax e do abdmen da mosca. Se esse gene est ausente, as larvas da mosca morrem pela falta dos segmentos torcico e abdominal anterior (Figura 2.34B); uma situao semelhante criada quando grandes quantidades de RNA antisense contra a mensagem Krppel so injetados em embries precoces da mosca (Rosenberg et al.,1985). RNA antisense permite ao biologista do desenvolvimento determinar a funo dos genes durante o desenvolvimento e analisar a ao dos genes em animais; de outra forma isso seria inacessvel anlise gentica.

Figura 2.34

Reinvestigao de velhos problemas com novos mtodos


A unio da embriologia com a biologia molecular est permitindo ao biologista do desenvolvimento uma nova apreciao de como trabalham os genes na construo de um organismo. Estamos em meio uma revoluo nos nossos conhecimentos sobre desenvolvimento, e um dos maiores sucessos resultantes de clonagens e seqenciamentos a nova anatomia do gene eucarioto. Descreveremos a estrutura do gene com mais detalhe no Captulo 10, mas importante ressaltar que os genes eucariotos que codificam protenas tm vrios stios regulatrios (Figura 2.35). Um stio, o promotor, est localizado diretamente a montante do gene (antes do incio) e
(A) mRNA de consenso (sense) Krppel (B) Embrio mutante Krppel

Produco de RNA antisense para examinar a funo dos genes no desenvolvimento. (A) Produo da mensagem antisense (neste caso, ao gene Krppel da Drosophila) colocando o fragmento de cDNA clonado para a mensagem Krppel entre dois vigorosos promotores. Os promotores esto em orientao oposta com respeito ao cDNA do Krppel. Nesse caso, o promotor T3 est em orientao normal e o promotor T7 est revertido. Os promotores reconhecem RNA polimerases diferentes (dos bacterifagos T3 e T7, respectivamente). T3 polimerase permite a transcrio de mRNA de consenso, ao passo que T7 polimerase produz transcritos antisense. (B) Resultado da injeo da mensagem Krppel antisense em um embrio precoce (estgio blastodrmico sincicial) de Drosophila antes que a mensagem Krppel seja produzida. A figura central um embrio do tipo selvagem pouco antes de eclodir. Acima est o mutante causado pela falta do genes Krppel. Abaixo est o embrio do tipo selvagem, injetado com a mensagem Krppel antisense no estgio embrionrio precoce. Ambos os embries, mutante e o tratado com antisense, no possuem os segmentos torcico e abdominal anterior. (B, de acordo com Rosenberg et al., 1985.)

mRNA antisense Krppel

T7 RNA polimerase

T3 promotor

T3 RNA polimerase

T7 promotor

Embrio normal

Embrio normal infectado com RNA antisense Krppel

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

o stio onde se liga a RNA polimerase. Localizada em algum lugar dentro do gene (a jusante ou a montante, ou ainda em um ntron dentro do gene), est uma segunda regio chamada intensificadora. Fatores proticos que se ligam ao intensificador permitem sua interao com o promotor e, conseqentemente, com a transcrio do gene pela RNA polimerase. Alguns promotores (como aqueles usados por produtos relacionados ao metabolismo geral da clula) no precisam ser ativados por intensificadores, mas a maioria dos genes ligados ao desenvolvimento so ativados em tempos e clulas especficos. Esses genes precisam ser ativados por fatores que se ligam ao intensificador e ao promotor. Como veremos no Captulo 10, a ligao de diferentes fatores de transcrio aos promotores e intensificadores de genes especficos um dos mecanismos que controlam a produo de protenas diferentes a partir de genomas idnticos. Um exemplo a ativao do gene para ZP3. Como detalharemos no Captulo 4, ZP3 a principal protena ligante de espermatozide na superfcie do vulo de camundongo. uma glicoprotena sintetisada pelo ocito durante sua maturao em vulo (Roller et al.,1989). Uma transferncia Northern mostra que o mRNA para essa protena sintetizado somente em ocitos em crescimento e no pode ser detectado em nenhum outro tipo de clula (Figura 2.36). O que permite a esse gene ser ativado somente nos ocitos? Lira e colaboradores (1990) isolaram o gene para ZP3, determinaram sua seqncia e encontraram um stio promotor, 28 pares de bases a montante do stio onde a transcrio do gene iniciada. Como hiptese, consideraram que seqncias responsveis por ativao ocito-especfica podem existir at mais longe, a montante do gene. Eles usaram enzimas de restrio para isolar o DNA da regio 5', a montante, (com 150 pares de bases) e o fundiram ao gene para a luciferinase de vaga-lume. (No necessrio dizer que essa enzima produtora de luz no encontrada em camundongos. Est sendo usada aqui como um gene reprter para monitorar onde o DNA a montante pode causar sua expresso.) O gene recm-construdo, contendo a regio a montante do gene ZP3 ligada ao gene estrutural para luciferinase, foi injetado em zigotos de camundongo para criar animais transgnicos, levando em cada ncleo o gene luciferinase com a regio regulatria ZP3. Em camundongos transgnicos fmeas, a hibridizao in situ localizou mRNA de luciferinase em um nico tipo de clula, o ocito (Figura 2.37). Assim, a seqncia de DNA com 150 pares de bases foi necessria e suficiente para ativar o gene (qualquer gene!) no ocito. Dentro dessa regio de 150 pares de bases (de 99 a 86 pares de bases a montante do gene estrutural ZP3) existe a seqncia 5-GATAA-3' que liga uma protena chamada OSP-1. OSP-1 encontrada somente em ocitos em maturao; ela ativa o gene ZP3 ligando-se a essa sequncia de DNA no promotor. Parece, ento, que ZP3 sintetizado em ocitos porque eles tm a protena OSP-1 que se liga a certas seqncias de DNA que so parte de seu promotor (Schickler et al.,1992). No momento, est sendo investigado como regulado o gene codificador de OSP-1.
Figura 2.35

Estrutura bsica de um gene regulado pelo desenvolvimento. O promotor da maioria dos genes codificadores de protenas encontrado no terminal 5' (a montante) do gene. O intensificador freqentemente est mais acima, a montante, mas pode ser encontrado dentro de um ntron ou no terminal 3'. Protenas que se ligam ao promotor e aos intensificadores interagem para regular a transcrio do gene. (No exemplo ZP3, o stio OSP-1, GATAA, est localizado no promotor, aproximadamente 95 pares de bases a montante do stio de incio da transcrio. Um stio intensificador sensvel a estrognios encontrado no primeiro ntron do gene ZP3.)

Intensificador Promotor xon ntron xon ntron xon

Intensificador a montante do gene

Intensificador a jusante do gene

CAPTULO 2 Genes e Desenvolvimento

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Figura 2.36

Transferncia Northern de RNA de ZP3 acumulado no camundongo. RNA de vrios tecidos (10g por pista) e ocitos (125ng) foram submetidos eletroforese e transferidos para papel de nitrocelulose. Um fragmento radioativamente marcado do gene ZP3 foi usado como sonda do mRNA. A mensagem ZP3 foi encontrada somente no ovrio, especialmente dentro dos ocitos. (de Roller et al.,1989, cortesia de P. Wassarman).

Ocito Ovrio Crebro Embrio de 13 dias Corao Intestino

Uma concluso e um alerta


Depois de quase um sculo, estamos comeando a entender como as clulas regulam a expresso diferenciada de seus genes, permitindo que genes diferentes possam se tornar ativos em diferentes clulas. Esse conhecimento est ajudando a explicar como a informao herdada utilizada para construir os planos bsicos do corpo e os tipos especficos de clulas do organismo em desenvolvimento. Entretanto, uma palavra de alerta. Caso o tom celebratrio deste captulo deixou a impresso de que desenvolvimento somente uma funo da atividade gnica necessrio relembrar do Captulo 1, que a distino entre talo e esporo (Dictyostelium), estado amebide e flagelado (Naegleria) e gondios sexual e assexual (Volvox) determinada pelo ambiente. Em captulos posteriores (especialmente Captulo 21), veremos outros exemplos do controle ambiental do desenvolvimento: determinao de sexo temperatura-dependente em rpteis, desenvolvimento em insetos dependente da dieta, e a diferenciao, dependente de experincia, dos neurnios e linfcitos em mamferos. Nesses casos o organismo herda a habilidade para responder aos sinais do ambiente, mas no possvel predizer o fentipo a partir do gentipo.

Rim Fgado Msculo Testculos tero

(A)

(B)

Figura 2.37

Hibridizao in situ da expresso do gene reprter luciferinase, quando luciferinase foi ligado ao promotor do gene ZP3. A sonda radioativa era dirigida mensagem luciferinase, a qual apareceu onde foi expressa sob a direo do promotor de ZP3. (A) Viso do ovrio inteiro (60x). (B) Magnificao (160x) de dois folculos ovarianos contendo ocitos em maturao. (de Lira et al., 1990, cortesia de P. Wassarman.)

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

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A base celular da morfognese: Afinidade celular diferencial

Mas a natureza no atomizada. Sua padronizao inerente e primria, e a ordem subjacente beleza nela demonstrada; mais ainda, a natureza s pode ser percebida pela mente humana, porque ela mesmo parte integrante e majoritria daquela ordem. Paul Weiss (1960) Eu fui criado terrivelmente e maravilhosamente. Salmo 139 (ca. 500 a.c).

m corpo no meramente uma coleo de tipos de clulas distribudas ao acaso. Desenvolvimento envolve no s a diferenciao celular, mas tambm sua morfognese em arranjos multicelulares tais como tecidos e rgos. Quando observamos a anatomia detalhada de um tecido como a retina neural, vemos um arranjo preciso e intrincado de muitos tipos diferentes de clulas. Neste Captulo, introduziremos as vias de mudana pelas quais as clulas do embrio em desenvolvimento criam rgos funcionais do corpo. Existem quatro questes majoritrias participando do arcabouo de discusses sobre morfognese: Como se formam tecidos a partir de clulas? De que modo clulas da retina neural aderem a outras clulas da retina neural e no se associam s celulas da retina pigmentada ou da ris que esto prximas a elas? De que modo, os vrios tipos de clulas presentes na retina neural (as trs camadas distintas de fotoreceptores, neurnios bipolares e clulas ganglionares) esto organizados para permitir que a retina seja funcional? Como so os rgos construdos a partir de tecidos? As clulas retinais do olho esto situadas atrs da crnea e da lente a uma distncia exata. A retina seria intil se estivesse situada atrs de um osso ou outro lugar qualquer, onde a lente no pudesse nela focalizar os raios de luz. Alm disso, os neurnios da retina devem penetrar no crebro para inervar as regies do crtex cerebral que analisam a informao visual. Todas essas conexes devem estar precisamente ordenadas. Como clulas migrantes atingem seu destino, e como se formam rgos em determinados locais? Olhos se desenvolvem na cabea, mas em nenhum outro lugar. O que impede a formao de um olho em outras partes do corpo, se todas as clulas tm o mesmo potencial gentico? Em alguns casos, como o de precursores de nossas clulas pigmentadas, clulas germinativas e glndula supra-renal, as clulas devem percorrer longas distncias para alcanar seu destino final. Como as clulas so instrudas para percorrer certas rotas e parar quando atingem uma regio especfica do corpo? Como crescem rgos e suas clulas, e como esse crescimento coordenado ao longo do desenvolvimento? As clulas do olho devem crescer juntas, e as clulas da retina raramente dividem-se aps o nascimento. Nosso intestino, entretanto, est constantemente descartando clulas e regenerando outras, e 79

80

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

ainda assim, sua velocidade mittica cuidadosamente controlada. Se mais clulas fossem regeneradas do que aquelas descartadas, seriam produzidos crescimentos cancerosos. Se o nmero de clulas regeneradas fosse menor, o intestino no poderia digerir o alimento. O que controla essas diferenas na velocidade de crescimento? Todas essas perguntas se referem a aspectos do comportamento celular. Existem dois grupos principais de clulas no embrio: clulas epiteliais, fortemente ligadas umas s outras em camadas ou tubos, e as clulas mesenquimatosas, isoladas e funcionando como unidades individuais. A morfognese nessas duas classes de clulas se d atravs de um limitado repertrio de processos celulares: (1) direo e nmero de divises celulares; (2) mudanas na forma das clulas; (3) movimento celular; (4) crescimento celular; (5) morte celular; e (6) mudanas na composio da membrana celular e da matriz extracelular. A maneira pela qual esses processos se completam pode diferenciar entre clulas epiteliais e mesenquimatosas (Figura 3.1). Parecem existir duas vias principais pelas quais clulas se comunicam umas com as outras para que se efetue a morfognese. A primeira atravs de substncias difusveis que so sintetizadas por um tipo de clula e que mudam o comportamento de outros tipos celulares. Essas substncias incluem hormnios, fatores de crescimento e morfgenos; cada um ser detalhado em captulos subseqentes. O segundo mtodo involve contato entre superfcies de clulas adjacentes. Clulas podem seletivamente reconhecer outras, aderindo a algumas clulas ou migrando sobre outras. Os eventos moleculares que intermediam o reconhecimento seletivo de clulas e sua transformao em tecidos e rgos, ocorrem na superfcie celular. Enquanto o paradigma dominante na gentica do desenvolvimento a expresso diferencial do gene, o paradigma dominante na morfognese envolve afinidade celular diferencial. Essas afinidades podem ser para superfcies de outras clulas ou para molculas da matriz extracelular secretadas pelas clulas. Neste captulo veremos como superfcies de clulas adjacentes interagem durante o desenvolvimento, visando localizar as clulas em stios apropriados dentro de tecidos e rgos.

Afinidade celular diferencial


Assim como a demonstrao da importncia dos genes no desenvolvimento gerou desentendimentos entre pesquisadores, tambm se desenvolveu um debate sobre o papel da superfcie celular na formao do embrio. A superfcie celular parece a mesma em todos tipos de clulas, e muitos pesquisadores mais antigos pensavam at que a superfcie celular no era uma parte vital da clula. Observaes sobre fecundao e desenvolvimento embrionrio precoce feitas por E. E. Just (1939) sugeriam que a superfcie celular diferia em tipos diferentes de clulas, mas a anlise moderna da morfognese se inicia com os experimentos de Townes e Holtfreter em 1955. Considerando a descoberta de que tecidos de anfbios se dissociavam em clulas isoladas quando colocados em solues alcalinas, eles prepararam suspenses de clulas isoladas provenientes de cada uma das trs camadas germinativas dos anfbios, logo aps a formao do tubo neural. Duas ou mais dessas suspenses de clulas isoladas poderiam ser combinadas de vrias maneiras, e quando o pH era normalizado, as clulas aderiam umas s outras, formando agregados em placas de Petri cobertas com agr. Usando embries de espcies que tinham clulas de diferentes tamanhos e cores, Townes e Holtfreter conseguiram observar o comportamento das clulas recombinadas (Figura 3.2).

Figura 3.1

Sumrio dos principais processos morfogenticos em clulas mesenquimatosas e epiteliais

PROCESSO CLULAS MESENQUIMATOSAS

AO

MORFOLOGIA

EXEMPLO

Condensao cartilagem

Mesnquima se torna epitlio

Mesquina da cartilagem

Diviso celular

Mitose para produzir mais clulas (hiperplasia)

Mesnquima dos membros

Morte celular

Clula morre

Mesnquima interdigital

Migrao

Clula se move em tempos e lugares determinados

Mesnquima do corao

Secreo de matriz e degradao

Sntese ou remoo da camada extracelular

Mesnquima da cartilagem

Crescimento

Clulas ficam maiores (hipertrofia)

Clulas gordurosas

CLULAS EPITELIAIS Disperso Epitlio mesnquima (estrutura inteira) Degenerao do ducto Mlleriano

Delaminao

Epitlio mesnquima (parte da estrutura)

Hipoblastos de de galinha

Mudana de forma ou crescimento

Clulas permanecem ligadas com alterao da morfologia

Neurulao

Migrao celular (intercalao)

Linhas do epitlio se fundem para formar menos linhas

Gastrulao de vertebrados

Diviso celular

Mitose dentro da linha ou outra direo

Gastrulao de vertebrados

Secreo de matriz e degradao

Sntese ou remoo da camada extracelular

Formao de rgos vertebrados

Migrao

Formao de bordas livres

Ectoderma de galinha

82

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Clulas epidrmicas presuntivas Segregao de tipos de clulas

Dissociao de clulas

Reagregao espontnea

Clulas da placa neural Seo atravs da bola de clulas segregadas

Figura 3.2

Reagregao de clulas da nurula de anfbios. Clulas epidrmicas presuntivas de embries pigmentados e clulas da placa neural de embries no pigmentados so dissociadas e misturadas entre si. As clulas reagrupamse de tal forma que um tipo (aqui, a epiderme presuntiva) cobre o outro. (Modificado de Townes e Holtfreter, 1955.)

Os resultados de seus experimentos foram surpreendentes. Em primeiro lugar, verificaram que clulas reagregadas se tornavam espacialmente segregadas. Ou seja, em lugar de permanecerem misturadas, cada tipo de clula se posicionava em sua prpria regio. Assim, quando clulas epidrmicas (ectodrmicas) e mesodrmicas foram ajuntadas para formar um agregado misto, as clulas epidrmicas foram encontradas na periferia do agregado e as clulas mesodrmicas no seu interior. Em nenhum caso as clulas permaneceram misturadas ao acaso, e na maioria dos casos, um tipo de tecido envolvia o outro completamente. Em segundo lugar, os pesquisadores observaram que as posies finais das clulas reagregadas refletiam suas posies embrinicas. O mesoderma migra centralmente epiderme, aderindo sua superfcie interna (Figura 3.3A). O mesoderma tambm migra centralmente em relao ao intestino ou endoderma (Figura 3.3B). Entretanto, quando as trs camadas germinativas so misturadas entre si, o endoderma se separa do ectoderma e mesoderma e ento envolvido por eles (Figura 3.3C). Na sua configurao final, o ectoderma est na periferia, o endoderma interno e o mesoderma se situa na regio entre eles. Holtfreter interpretou esse fato em termos de afinidade seletiva. A superfcie interna do ectoderma tem uma afinidade positiva pelas clulas mesodrmicas e uma afinidade negativa para o endoderma, enquanto o mesoderma tem afinidades positivas para ambas as clulas, ectodrmicas e endodrmicas. A mimetizao da estrutura embrionria normal por agregados celulares tambm pode ser vista na recombinao de clulas da epiderme e da placa neural (Figura 3.3D). As clulas epidrmicas presuntivas migram para a periferia, como antes; as clulas da placa neural migram para o centro, formando uma estrutura reminescente do tubo neural. Quando clulas axiais mesodrmicas (notocorda) so adicionadas suspenso de clulas presuntivas, epidrmicas e neurais, a segregao celular resulta em uma camada epidrmica externa, um tecido neural localizado centralmente, e uma camada de tecido mesodrmico entre eles (Figura 3.3E). De alguma maneira, as clulas tm a capacidade de distribuirem-se em suas prprias posies embriolgicas. Tais afinidades preferenciais foram tambm observadas por Boucaut (1974), que injetou clulas individuais de especficas camadas germinativas de volta na cavidade gastrular de anfbio. Ele verificou que essas clulas migram para sua camada germinativa apropriada. Clulas endodrmicas encontram posies no endoderma do hospedeiro, enquanto que clulas ectodrmicas se localizam em seu

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

83

Epiderme + mesoderma

Mesoderma + endoderma

Epiderme + Mesoderma + endoderma

Placa neural + epiderme

Placa neural + Mesoderma axial + epiderme

Epiderme

Endoderma

Mesoderma

Epiderme

Epiderme

Mesoderma

Mesoderma (A)

Mesoderma (B)

Endoderma (C)

Placa neural (D)

Epiderme (E)

Placa neural

Figura 3.3

ectoderma. Assim, afinidade seletiva parece ser importante para fornecer informao posicional s clulas embrionrias. A terceira concluso de Holtfreter e seus colegas foi que afinidades seletivas mudam durante o desenvolvimento. Isso deveria ser esperado, pois clulas embrionrias no mantm uma nica relao estvel com outras clulas. Para que ocorra o desenvolvimento, clulas precisam interagir de forma diferente com outras populaes celulares em tempos especficos. Essas mudanas na afinidade celular foram dramaticamente confirmadas por Trinkaus (1963), que mostrou uma clara correlao entre mudanas de adeso in vitro e o comportamento da clula embrionria. Mais recentemente, os experimentos de Fink e McClay (1985) demonstraram esse comportamento no ourio-do-mar, durante seu desenvolvimento. Na blstula, todas as clulas parecem ter a mesma afinidade umas pelas outras. Cada clula tem tambm uma alta afinidade para a matriz extracelular (camada hialina) que cobre o embrio, e uma baixa afinidade para as protenas dentro da cavidade embrionria (blastocele). Entretanto, ao iniciar-se a gastrulao, um grupo especfico de clulas, no plo vegetal da blstula, perde sua afinidade pelas clulas vizinhas e pela matriz extracelular externa, enquanto adquire simultaneamente afinidade pelas fibrilas proticas que forram a blastocele (Figura 3.4). Essas mudanas de afinidade causam a perda de contato das clulas

Distribuio e reorganizao de relacionamentos embrionrios espaciais em agregados de clulas embrionrias de anfbios. (Modificado de Townes e Holtfreter, 1955.)

84

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Figura 3.4

(A) Camada hialina Clulas da blstula

(B)

Sumrio das modificaes na adeso celular de clulas precursoras do esqueleto (encaixadas). (A) Na blstula do ourio-do-mar, cada clula tem alta afinidade por suas vizinhas e por seu substrato, a camada hialina. (B) Enquanto progride o desenvolvimento, mudanas na superfcie celular produzem um enfraquecimento das afinidades pelas clulas vizinhas e camada hialina e um aumento de afinidade pelas protenas da cavidade interna da blastocele. O resultado que essas clulas migram para a blastocele (flechas) e formaro o esqueleto.

Fibrilas da blastocele

Alta afinidade por clulas vizinhas e camada hialina

Decrscimo de afinidade por clulas vizinhas e camada hialina. Aumento de afinidade por fibrilas da bastocele.

com suas vizinhas e a migrao para dentro da blastocele, onde elas formaro o esqueleto da larva. Quando elas comeam a formar esse esqueleto, suas propriedades adesivas tero que mudar novamente. Essas clulas, que tinham sido antisociais entre si desde seu ingresso na blastocele, devem agora aderir para formar os rudimentos do anel esqueltico. Essas mudanas na adeso so especficas temporalmente e tambm especficas para as clulas precursoras esquelticas (McClay e Ettensohn, 1987). Tais mudanas na afinidade celular so extremamente importantes nos processos da morfognese. A reconstruo de agregados de embries tardios de aves e mamferos foi obtida pelo uso da protease tripsina para dissociar as clulas entre si (Moscona, 1952). Quando as clulas isoladas resultantes foram misturadas em um frasco e agitadas de modo que a fora de cisalhamento destrusse adeses no especficas, as clulas se distriburam de acordo com seu tipo celular. Dessa maneira, elas reconstruram a organizao do tecido original (Moscona, 1961; Giudice, 1962). A Figura 3.5 mostra a reconstruo do tecido da pele de um embrio de camundongo de 15 dias. As clulas da pele so separadas por enzimas proteolticas e depois agregadas em uma cultura rotatria. As clulas epidrmicas migram para a periferia, e as drmicas migram para o centro. Em 72 horas, a epiderme foi reconstituda, formou-se uma camada de queratina e folculos de plo so vistos na regio dermal. Essa reconstruo de tecidos complexos a partir de clulas nicas chamada de agregao histotpica. O modelo termodinmico de interaes celulares A clulas, ento, no se distribuem ao acaso, mas se movem ativamente para criar organizao tissular. Quais foras dirigem o movimento celular durante a morfognese? Em 1964, Malcolm Steinberg props um modelo que explicava o direcionamento da

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

85

Figura 3.5

Epiderme

Derme

Reconstruo da pele a partir de uma suspenso de clulas de pele de um embrio de camundongo de 15 dias. (A) Seo atravs da pele embrionria, mostrando a epiderme, derme e folculos pilosos primrios. (B) Suspenso de clulas isoladas de pele tanto da derme como da epiderme. (C) Agregados aps 24 horas. (D) Seo atravs de um agregado mostrando migrao de clulas epidrmicas para a periferia. (E) Nova diferenciao dos agregados (72 horas), mostrando epiderme e derme reconstitudas, completa com folculos de plo e camada queratinizada. (de Monroy e Moscona, 1979, cortesia de A. Moscona.)

Folculo piloso primrio

distribuio celular baseado em princpios termodinmicos. Usando clulas derivadas de tecidos embrionrios tripsinisados, Steinberg mostrou que certos tipos de clulas sempre migram para o centro quando combinadas com determinados tipos de clulas, mas migram perifericamente quando combinadas com outras. A Figura 3.6 ilustra as interaes entre culturas de clulas pigmentadas e clulas neurais da retina. Quando suspenses de clulas isoladas desses dois tipos so misturadas, elas formam agregados de clulas organizadas ao acaso. Entretanto, aps algumas horas, j no se observa clulas pigmentadas da retina na periferia dos agregados; em dois dias, duas distintas camadas so vistas, com as clulas pigmentadas localizadas internamente s clulas neurais da retina. Os mesmos tipos de interaes podem ser observados quando agregados esfricos de tecidos so colocados em contato, uns com os outros. Um dos tecidos finalmente envolve o outro, e a topografia final independente das posies de partida (Figura 3.7). Alm disso, tais interaes obedecem a uma hierarquia (Steinberg, 1970). Se a posio final de um tipo de clula, A, interna em relao a um segundo tipo, B, e a posio final de B interna a um terceiro tipo, C, ento a posio final de A ser sempre interna a C. Por exemplo, clulas pigmentadas da retina migram internamente s clulas neurais da retina, e clulas do corao migram centralmente em relao retina pigmentada. Portanto, clulas do corao migram internamente s clulas neurais da retina. Essa observao levou Steinberg a propor que as clulas misturadas, interagem para formar um agregado com a menor energia livre interfacial (Figura 3.8). Em outras

(A)

(B)

(C)

(D) Derme

Derme Epiderme Camada queratinizada

(A)

(B)

(C)

Figura 3.6

Agregados formados pela mistura de clulas da retina neural (no pigmentada) de um embrio de galinha de 7 dias com clulas pigmentadas da retina (escuras). (A) Cinco horas aps a mistura das suspenses de clulas isoladas, so vistos agregados de clulas distribudas ao acaso. (B) Em 19 horas, as clulas pigmentadas da retina no so mais vistas na periferia. (C) Aps dois dias, a maioria das clulas pigmentadas da retina esto localizadas em uma massa central interna rodeadas pelas clulas da retina neural. (As clulas pigmentadas espalhadas so provavelmente clulas mortas). (de Armstrong, 1989, cortesia de P. B. Armstrong.)

(E) Folculos de plo

86

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Figura 3.7

Tecido A

Tecido B

Espalhamento de um tipo de clula sobre outro tipo. A posio final de agregados compostos de dois tipos de tecidos independente de sua posio inicial. Uma condio final idntica obtida, se os tecidos so transformados em suspenses de clulas isoladas e, ento, reagregadas ou os tecidos so mantidos intactos e colocados em contato. (De acordo com Armstrong, 1989.)

Colocar tecidos juntos, bem encaixados

Dissociar os tecidos e reagregar

Movimento do tecido B para envolver o tecido A

Movimento das clulas A para dentro, distante da periferia

palavras, as clulas se rearranjam na forma termodinamicamente mais estvel. Se as clulas dos tipos A e B tm diferentes foras de adeso, e se a fora da conexo A-A maior do que aquela entre A-B ou B-B, vai haver distribuio com centralizao das clulas do tipo A. Se a fora da conexo A-A menor ou igual a da conexo A-B, o agregado permanecer com uma mistura de clulas ao acaso. Finalmente, se a conexo A-A tiver uma fora muito maior do que a conexo A-B em outras palavras, as clulas A e B no mostram basicamente nenhuma adesividade entre si ento as clulas A e B formaro agregados separados. Para que as clulas sejam distribudas, o essencial que tenham diferenas em suas foras de adeso. Na forma mais simples desse modelo, todas as clulas poderiam ter o mesmo tipo de cola distribuda na sua superfcie. A quantidade desse produto da superfcie celular, ou a arquitetura celular que permite substncia ser concentrada diferencialmente, originar diferentes nmeros de contatos estveis entre tipos de clulas. Alternativamente, as diferenas termodinmicas poderiam ser causadas por vrios tipos de molculas de adeso. Esse modelo termodinmico chamado hiptese da adeso diferencial. Nessa hiptese, o embrio precoce pode ser considerado como existindo em um estado de equilbrio at que alguma mudana na atividade gnica altere as molculas na superfcie celular. Os movimentos que ocorrem visam restaurar uma nova configurao de equilbrio para as clulas.

Clulas A localizadas centralmente s clulas B (A) DISTRIBUIO

(B) AO ACASO

(C) SEPARAO

Figura 3.8

Distribuio como um processo tendendo estabilidade termodinmica mxima. (A) Distribuio ocorre quando a fora adesiva mdia entre diferentes tipos de clulas (ab) menor que a fora adesiva mdia homotpica (A-A ou B-B) (aa, bb). As clulas mais adesivas se localizam centralmente. (B) Se a fora das adeses A-B maior ou igual mdia das adeses homotpicas, no vai haver distribuio, porque o sistema j atingiu o equilbrio termodinmico, e a mistura dos tipos de clulas ser ao acaso. (C) Se as ligaes A-B so muito mais fracas que a mdia das adeses homotpicas, haver uma completa separao, como caracterstico para leo e gua.

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

87

Informaes adicionais

&

Especulaes

Evidncia para o modelo termodinmico

Blastema no marcado

vidncias recentes para a hiptese da adeso diferencial surgiram em pesquisa com o objetivo de responder duas questes: (1) pode o fenmeno da distribuio ser explicado pela tenso superficial gerada pela adeso celular?, e (2) essa distribuio realmente ocorre durante o desenvolvimento? Foty e colegas no laboratrio de Steinberg (1994) analisaram a tenso superficial interfacial em vrios tecidos embrionrios. Eles comprimiram amostras de tecido entre as placas de vidro de um tensimetro, e mediram a tenso superficial dos tecidos em termos da habilidade desses em retornar forma esferide original. Dessa maneira, a tenso superficial de cada tecido poderia ser calculada em dines por centmetro. Foty e seus colaboradores encontraram uma completa correlao entre a tenso superficial do tecido e sua tendncia de distribuir-se no centro ou na periferia de um agregado misto. Tecidos com uma maior tenso superficial sempre se localizavam internamente quando misturados com outros de menor tenso superficial. Parece que a distribuio pode ser explicada unicamente pelas tenses superficiais das clulas justapostas. [cell1.html] At recentemente, era muito difcil planejar experimentos para testar, in vivo, esse modelo de distribuio celular; entretanto, esto surgindo evidncias para essa hiptese em estudos de regenerao de membros na salamandra. Aqui, o tecido mais proximal (perto do corpo) envolver o mais distal (Nardi e Stocum, 1983).

Membros de salamandra tm alguns atributos surpreendentes. Quando um membro anterior amputado no antebrao, o toco remanescente forma na sua ponta, uma massa de clulas desdiferenciadas (blastema regenerativo), que se divide e diferencia formando um novo membro. O novo tecido do membro se inicia no local da amputao, nesse caso, formando o resto do membro, do antebrao para baixo. Quando o membro amputado no pulso, forma-se um blastema regenerativo parecido. Entretanto, no reformado o tecido do antebrao, cotovelo e cbito; em lugar disso, o local sendo conhecido regenera somente o pulso e os dgitos. Como armazenada essa memria posicional? Nardi e Stocum (1983) demonstraram que colocando junto dois blastemas de membros de salamandra com o mesmo nvel de origem eles se fundem, mas nenhum envolve o outro (Figura 3.9). Entretanto, quando os blastemas so de nveis diferentes, o mais proximal (perto do corpo) envolve o mais distal. Parece, ento, que as propriedades adesivas des-

sas clulas formam um gradiente ao longo do eixo proximodistal; essas propriedades so maiores no pulso e menores no antebrao. Crawford e Stocum (1988) conseguiram relacionar essa distribuio de clulas in vitro ao processo de regenerao de membro ao vivo. Blastemas do pulso, cotovelo ou antebrao foram enxertados na juno blastema-toco de um membro posterior regenerando a partir da meia coxa. Os blastemas de membro anterior migraram distalmente at o nivel correspondente do membro posterior do hospedeiro e regeneraram uma nova estrutura (Figura 3.10). O blastema do antebrao imediatamente regenerou um membro completo a partir do nvel da meia coxa; o blastema do cotovelo se moveu ao nvel do joelho e formou o resto do brao a partir desse ponto; o blastema do pulso foi deslocado at o fim do membro posterior em regenerao, onde formou um pulso ao nvel do tarso do p. Esses dados sugerem que as hierarquias da distribuio celular, vistas in vitro, refletem diferenas que so usadas pelo corpo, in vivo, na construo de novos rgos.

Blastema marcado Pulso Cotovelo Antebrao

Figura 3.9

Distribuio quando blastemas de nveis iguais ou diferentes, de membros anteriores, so colocados juntos em cultura. (Um membro de cada par foi marcado com tritio para distingulo do outro). Depois de trs dias em cultura, os agregados foram fixados e secionados. Blastemas do mesmo nvel fundiram em uma linha reta. Quando os blastemas eram de diferentes nveis, o blastema proximal parecia tentar envolver as clulas mais distais. (de Nardi e Stocum, 1983, cortesia de D. Stocum.)

Antebrao

Cotovelo

Pulso

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Figura 3.10

Distribuio in vivo, onde blastemas de membros anteriores em regenerao (em cores) enxertados em blastemas da coxa mediana (cinza) so deslocados para a regio correspondente do membro posterior em regenerao (pulso ao tarso; cotovelo ao joelho; antebrao coxa mediana) onde iniciam a formao do membro anterior, distalmente daquele ponto. (de Crawford e Stocum, 1988.)

Blastema de pulso

Blastema de cotovelo

Blastema de antebrao

Blastema de coxa mediana

Enxertar blastema no blastema em regenerao da coxa mediana

Permitir crescimento externo dos enxertos

A base molecular das adeses clula-clula


As classes de molculas de adeso celular A formao de tecidos e rgos mediada por eventos que ocorrem na superfcie de clulas adjacentes. A superfcie celular inclui a membrana plasmtica, as molculas diretamente abaixo dela e a ela associadas, e as molculas encontradas no espaos extracelulares. Clulas eucariticas so envolvidas por uma complexa borda molecular chamada membrana plasmtica (ou celular). A membrana plasmtica uma bicamada fluida lipdica que contm protenas capazes de interagir com o ambiente externo. Certas protenas tm seus stios ativos apontando para fora, em direo a outras clulas; existem trs classes de molculas da membrana celular (principalmente protenas) que esto particularmente envolvidas no controle de interaes especficas com outras clulas (Edelman e Thiery, 1985): Molculas de adeso celular. Essas protenas participam da adeso clulaclula. Elas podem unir clulas em lminas epiteliais e condensar clulas mesenquimatosas em agregados coesos. Elas tm um papel crtico na separao de diferentes tecidos entre si. Molculas da juno celular. Essas molculas fornecem vias de comunicao entre o citoplasma de clulas adjacentes e fornecem barreiras de permeabilidade e fora mecnica s lminas epiteliais. Molculas de adeso a substrato. Essas molculas permitem ligao das clulas s suas matrizes extracelulares. Elas incluem componentes da matriz extracelular e seus receptores situados na superfcie da clula. Molculas de adeso a substrato permitem o movimento de clulas do mesnquima e neurnios, e permitem a separao espacial das lminas epiteliais. Os padres locais de expresso dessas molculas da superfcie celular, propiciam uma conexo importante entre o cdigo gentico unidimensional e o organismo tridimensional. Modulando o aparecimento dessas molculas, o potencial gentico pode se manifestar no processo mecnico da morfognese.

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

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Informaes adicionais

Anticorpos monoclonais e gentica reversa


Monitoramento de modificaes da membrana celular atravs de anticorpos monoclonais.
A expresso de componentes da membrana muda no espao e no tempo. Diferentes tipos de clulas possuem componentes da superfcie celular que so diversos, e que mudam enquanto a clula se desenvolve. Esses componentes da membrana, tecido-especficos, so freqentemente reconhecidos por antisoros e, por essa razo, denominados antgenos de diferenciao (Boyse e Old, 1969). Antgenos de diferenciao especficos podem atualmente ser identificados por anticorpos monoclonais (Figura 3.11). Geralmente, esses anticorpos so produzidos injetando celulas estranhas em camundongos (ou clulas de camundongos de uma linhagem em animais de outra linhagem). Os linfcitos B do camundongo comearo a produzir anticorpos contra cada um dos componentes estranhos dessas clulas, sendo que cada linfcito B produz um nico tipo de anticorpo. Esses linfcitos so tornados imortais pela fuso com clulas cultivadas de linfcito B de tumores (mielomas), que foram mutados de modo a: (1) no sintetizar seus prprios anticorpos e (2) no ter a enzima de recuperao de purinas, hipoxantina fosforribosiltransferase (HPRT). Devido a essa ltima alterao, as clulas do mieloma s podem produzir nucleotdeos de purina de novo, no podendo usar as purinas do meio de cultura. Aps a fuso, as clulas so cultivadas em um meio contendo aminopterina, uma droga que inibe a via de sntese de novo da purina. Assim, clulas do mieloma no fundidas morrem por fome de purinas. Elas no podem produzir nucleotdeos de purina usando a via de recuperao mediada por HPRT e a aminopterina bloqueia tambm a via de novo. Linfcitos B normais tambm no dividem-se em cultura, de modo que eles morrem igualmente. O produto da fuso do linfcito B e da clula do mieloma o hibridoma prolifera, porque possui a enzima de recuperao de purina do linfcito B e as propriedades de crescimento do tumor. Mais ainda, cada um
Imunizao Clulas mutantes de mieloma, sem enzima HPRT

&

Especulaes

Clulas de bao de camundongo

Clulas de mieloma

Fuso

Seleo em meio HAT; selecionar anticorpos

Cultivar clones de hibridomas individuais de poos positivos

Secionar e cultivar clones cujos sobrenadantes testam positivo

Figura 3.11

Protocolo para preparar anticorpos monoclonais. Clulas do bao de um camundongo imunizado so fundidas com clulas mutadas de mieloma, sem a enzima HPRT. Clulas so cultivadas em um meio contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (HAT). Clulas de mieloma no fundidas no podem crescer nesse meio porque a aminopterina bloqueia a nica via para sintetizar nucleotdeos purnicos. Clulas B morrem nesse meio, mesmo contendo a enzima (HPRT) que lhes permitiria utilizar a hipoxantina do meio. As clulas fundidas (hibridomas) crescem e se dividem. Os poos nos quais crescem os hibridomas so selecionados quanto presena do anticorpo efetivo, e as clulas de poos positivos so semeadas em densidade suficientemente baixa para permitir que clulas individuais originem clones discretos. Esses clones so isolados e selecionados para o anticorpo efetivo. Tal anticorpo monoclonal. Os hibridomas produzindo esse anticorpo podem ser cultivados e congelados. (de Yelton e Scharff, 1980.)

90

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Segmentos externos de fotorreceptores Somas de fotorreceptores (camada nuclear externa) Camada sinptica externa Camada nuclear interna (soma interneuronal) Camada sinptica interna

Soma das clulas ganglionrias Axnios das clulas ganglionrias (A) (B) (C) (D)

Mas logo em seguida, a clula comea a expressar outra molcula da membrana, o antgeno 24B10. Essa molcula encontrada somente nos neurnios que se transformaro em fotorreceptores. Nos estgios seguintes (aproximadamente 80 horas mais tarde), o antgeno 21A6 expresso em certas regies de fotorreceptores em maturao, e outro antgeno, 28H9, caracterstico de fotorreceptores retinais terminalmente diferenciados (Zipursky et al.,1984). Assim, membranas celulares de diferentes tipos de clulas contm molculas diferentes, e essas podem mudar durante a maturao da clula.

Da protena ao gene
Como antgenos de diferenciao so protenas cuja expresso regulada no tempo e no espao, e como essas mudanas so freqentemente correlacionadas com mudanas morfolgicas especficas (como mostra a Figura 3.13), seria interessante saber como seus genes so regulados. Por exemplo, o conhecimento de como a protena 24B10 se expressa poderia dar indicaces sobre os mecanismos genticos da diversidade neuronal. Como podemos realizar essa gentica reversa indo da protena para o gene? Em primeiro lugar, ligamos anticorpos monoclonais s particulas de resinas e passamos homogenatos de retina em colunas contendo esse material (Figura 3.14). (Essa uma coluna de imunoafinidade.) O anticorpo se liga somente ao antgeno reconhecido originalmente, e a protena ligada resina eluda (por solues salinas) e submetida eletroforese em gel para separ-la de um possvel
Fotorreceptor maduro

Figura 3.12

Especificidade da superficie celular da retina neural de galinha. (A) Fotografia de contraste de fase de uma seo da retina neural de um pinto recm-eclodido. (B) Seo de retina marcada com um anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece clulas retinais (mas no outras neuronais). (C) Seo retinal marcada com anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece processos neuronais mas no corpos celulares na retina. (D) Seo retinal marcada com anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece antgeno em um subconjunto de processos em clulas nervosas nas camadas sinpticas externas e internas. (Cortesia de G. Grunwald.)

desses hibridomas secreta o anticorpo especfico do linfcito B. O meio no qual esto crescendo os hibridomas testado quanto presena de anticorpos que se ligam populao original das clulas estranhas. Tais anticorpos, tendo um nico linfcito B como sua fonte original, denominado anticorpo monoclonal. Anticorpos monoclonais podem ser produzidos em grandes quantidades e podem reconhecer antgenos (protenas, lipdeos e carboidratos) que so fracamente expressos (Khler e Milstein, 1975). Anticorpos monoclonais dirigidos contra tipos especficos de clulas, demonstraram numerosos antgenos de diferenciao aparecendo em diferentes tempos e lugares durante o desenvolvimento. A Figura 3.12 mostra diferentes molculas da superfcie celular, em diferentes camadas espaciais da retina neural de um pinto recm-eclodido. Cada um dos anticorpos monoclonais reconhece uma molcula diferente na membrana celular. Como est evidente nesta fotografia composta, as membranas de todas as clulas da retina neural no so iguais. Na verdade, regies da mesma membrana celular podem ser diferentes; as membranas dos axnios e da soma do nervo, por exemplo, contm molculas diferentes. A Figura 3.13 mostra mudanas temporais na membrana

celular de uma nica clula epitelial de Drosophila enquanto ela se desenvolve em um fotorreceptor retinal. Anticorpos monoclonais foram obtidos aps injetar camundongos com homogenatos de tecido da cabea de Drosophila, e um painel de anticorpos foi testado em clulas do disco imaginal do olho larval que se diferenciavam em estruturas do olho. Assim que as clulas epiteliais, no diferenciadas, do disco mostram propriedades neuronais, elas expressam o antgeno 22C10. Esse antgeno tambm encontrado em outros tipos de clulas neuronais.
Clula epitelial no diferenciada

Fotorreceptor

Neurnio

Neurnio sensorial fotorreceptor

Vrios antgenos no especficos

22C10 antgeno 24B10 antgeno 21A6 antgeno 28H9 antgeno

Figura 3.13

Mudanas temporais na membrana celular correlacionadas com a morfognese de uma clula retinal fotorreceptora da Drosophila. Enquanto se procede a diferenciao, diferentes antgenos se expressam na membrana celular. (de Venkatesh et al., 1885.)

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

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Anticorpo monoclonal ao antgeno 24B10

Juntar anticorpo marcado ao antgeno 24B10, na seo retinal

1 Cobrir partculas de resina com anticorpo monoclonal

Localizao de 24B10 por anticorpo monoclonal marcado com fluorescena 2 Preparar coluna de imunoafinidade com partculas cobertas

Figura 3.14
3 Adicionar homogenato de retina contendo antgeno 24B10 ( ) e outros antgenos ( )

Homogenato retinal

Protocolo para encontrar o gene que codifica a protena identificada por um anticorpo monoclonal. O oligonucleotdeo decodificado pela estrutura da protena no precisa ser um par perfeito com a verdadeira seqncia. (de Venkatesh et al., 1985; fotografia cortesia de S. Benzer.)

4 Depois que outros antgenos ( ) passam atravs da coluna, eluir material ( ) remanescente nas partculas, separar por eletroforese em gel e corar gel para protena

Protena purificada, antgeno 24B10

5 Eluir protena purificada 24B10 do gel e seqenciar o amino terminal

Met-Glu-Glu-Thr-His-Tyr-Pro 6 Gerar uma seqncia mensageira possvel e sintetizar uma seqncia complementar radioativa

AUG - GAA - GAA - AGG - CAG - AAC - CC TAC - C T T - C T T - TCC - GTC - T T G - GG

contaminante. A regio do gel contendo a protena separada, a protena eluda da matriz do gel parcialmente seqenciada. necessrio sintetizar oligonucleotdeos radioativos que se ligariam a uma seqncia de DNA capaz de codificar tal protena. No caso da 24B10, essas sondas radioativas foram usadas para selecionar uma biblioteca de clones de DNA recombinante contendo regies do genoma de Drosophila. O DNA de Drosophila de cada clone positivo foi seqenciado para verificar se esse complementava a seqncia da protena original isolada pelo anticorpo monoclonal. Por essa via, podemos ir de uma rara protena identificada por um anticorpo monoclonal a um pedao especfico do DNA genmico. (Zipursky et al.,1984; Venkatesh et al., 1985.)

7 Usar essa sonda para selecionar a biblioteca de fago do genoma da Drosophila; seqenciar o clone positivo TCC ATG T T C GAT CGC GAG ATG GAG GAG ACG CAT TAC CCG CCC TGC ACC TAC AAC GTG ATG TGC Ser Met Phe Asp Arg Glu Met Glu Glu T h r His Ty r P r o P r o Cys T h r Ty r Asn Val Met Cys Seqncia esperada 8 Isolar e caracterizar gene

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Molculas de adeso celular


Identificando molculas de adeso celular e seu papel no desenvolvimento Os estudos de distribuio de Holtfreter e Steinberg no identificaram as molculas envolvidas na adeso celular diferenciada. Roth (1968; Roth et al., 1971) demonstrou que diferentes tipos de clulas mostram uma adeso celular seletiva independente da distribuio das clulas. Ele modificou o ensaio de agregao rotatrio, incubando clulas de cartilagem marcadas com 3H e hepatcitos marcados com 14C em uma soluo em rotao, contendo pequenos agregados de clulas de cartilagem no marcadas. Medindo as clulas marcadas com 14C e 3H nesses agregados, ele demonstrou que os agregados de cartilagem escolheram especificamente clulas de cartilagem. Experimentos similares estenderam essas concluses s clulas do msculo e do fgado (Figura 3.15). Esses estudos indicaram que tipos diferentes de clulas podiam usar diferentes molculas de adeso. A tarefa seguinte identificar as molculas mediadoras da adeso celular e descobrir como conseguem realizar esse feito. Vrias molculas de adeso celular (CAMs), foram identificadas e agrupadas em duas categorias gerais: as caderinas, cujas propriedades de adeso celular dependem de ons clcio e as CAMs da superfamlia de imunoglobulinas, cujos domnios de ligao s clulas se parecem aqueles de molculas de anticorpos. A Tabela 3.1 lista algumas CAMs recentemente descobertas. Caderinas ons de clcio so freqentemente necessrios para a adeso celular. Os ons estabilizam as conformaes adesivas de certas protenas da superfcie celular chamadas caderinas. Caderinas tm um papel crtico no estabelecimento e manuteno de conexes intercelulares, e parecem ser cruciais para a segregao espacial de clulas e para a organizao da forma animal (Takeichi, 1987). Caderinas interagem com outras caderinas de clulas adjacentes e so ancoradas na clula por complexos de protenas chamados cateninas (Figura 3.16). O complexo caderina-catenina forma a clssica juno aderente que liga as clulas epiteliais entre si. Mais ainda, como as cateninas se ligam ao citoesqueleto de actina, elas integram as clulas epiteliais em uma unidade mecnica. Em embries de vertebrados, quatro classes principais de caderinas foram identificadas:

Figura 3.15

Especificidade da associao clula-clula. Agregados coletores, cada um consistindo de um tipo de clula, so colocados em um frasco de cultura giratrio contendo clulas isoladas do mesmo tipo (isotpico) e de tipos diferentes (heterotpico). As clulas isoladas, isotpicas e heterotpicas, foram previamente marcadas com diferentes radioistopos. Aps seis horas, os agregados foram colhidos, lavados e determinados os nmeros de clulas isotpicas e heterotpicas que aderiram ao agregado, como mostra a tabela abaixo. (Dados de Roth, 1968.)
Contagem das clulas radioativas que aderiram ao agregado

Clula isotpica marcada com 3 H (cartilagem) Clula heterotpica marcada com 14 C (fgado) Agregado (cartilagem) Rotao por seis horas

Clulas isoladas marcadas em suspenso* Tipo de agregado Cartilagem Fgado Msculo peitoral Cartilagem 100 10 38 Fgado 6 100 49 Msculo peitoral 48 0 100

* Porcentagem do nmero mdio de clulas coletadas pelos agregados isotpicos.

Contar clulas radioativas que aderiram ao agregado

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

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Tabela 3.1 Classificao geral das principais molculas de adeso celular (CAMs)
Classe Caderinas (clcio-dependente) CAM N-caderina (a.k.a. A-CAM) P-caderina E-caderina (a.k.a. L-CAM, uvomorulina) N-CAM Ng-CAM (a.k.a. L1, NILE) Neurofascina CAM-celular LFA-1 CD4 glicoprotena (HIV receptor) Tipo celular Nervos, rins, lentes, corao Placenta, epitlio Epitlio, blstula de camundongo

CAMs da super famlia de imunoglobulinas (clcio-independente)

Msculos, nervos, rins Glia, neurnios Neurnios de Drosophila Hepatcitos Linfcitos Indutor de clulas T

E-caderina (caderina epitelial, tambm chamada uvomorulina e L-CAM) expressa em todas as clulas embrionrias precoces de mamferos, mesmo no estgio de uma clula. Mais tarde, essa molcula restrita a tecidos epiteliais de embries e adultos. P-caderina (caderina de placenta) parece ser expressa primariamente em clulas placentrias do embrio de mamfero, que fazem contato com a parede uterina (as clulas trofoblsticas) e o prprio epitlio da parede uterina (Nose e Takeichi, 1986). possvel que a P-caderina facilita a conexo do trofoblasto com o tero, pois a P-caderina nas clulas uterinas visualizada em contato com a P-caderina das clulas trofoblsticas de embries de camundongos (Kadokawa et al., 1989).

Stios de fosforilao Reconhecimento do stio de adeso

Figura 3.16

Stio de ligao de clcio

Membrana celular

Cateninas Actina

Representao esquemtica da adeso celular mediada por caderina. Caderinas esto associadas com trs tipos de cateninas. As cateninas podem se associar com o sistema de microfilamentos de actina. A importncia dessas interaes para o desenvolvimento normal vista na Figura 3.18; caderinas que no tm o domnio extracelular podem interferir com o desenvolvimento. Presumivelmente, elas competem com as caderinas normais, ligando as cateninas disponveis com seus domnios citoplasmticos. (de Takeichi, 1991).

Caderina Ligao caderina-caderina

Caderina

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

(A)

(B) Ectoderma Crista Neural

Clulas migratrias Tubo neural E-caderina N-caderina

(C)

Figura 3.17

Localizao de duas diferentes caderinas durante a formao do tubo neural no camundongo. Foi usada marcao imunofluorescente dupla para localizar E-caderina (A) e Ncaderina (B) na mesma seo transversal do crebro posterior de um embrio de camundongo de 8.5 dias. Anticorpos para E-caderina foram marcados com um tipo de corante fluorescente (o qual fluoresce em um intervalo de comprimento de onda), enquanto anticorpos para N-caderina foram marcados com um segundo tipo de corante (que emite sua cor em outros comprimentos de onda). Fotografias obtidas em diferentes comprimentos de onda. mostram que o ectoderma externo expressa E-caderina predominantemente, ao passo que a invaginante placa neural cessa a expresso de E-caderina, mas passa a expressar N-caderina. (C) quando se forma o tubo neural, ele expressa N-caderina, a epiderme expressa E-caderina e as clulas da crista neural nenhuma das duas. (Fotografias de K. Shimamura e H. Matsunami, cortesia de M. Takeichi; C de Rutishauser, 1988.)

N-caderina (caderina neural) vista inicialmente nas clulas mesodrmicas no embrio em gastrulao enquanto elas perdem sua expresso de E-caderina. intensamente expressa nas clulas do sistema nervoso central em desenvolvimento (Figura 3.17; Hatta e Takeichi, 1986). EP-caderina (C-caderina) crtica na manuteno da adeso celular entre os blastmeros da blstula de Xenopus e necessria para os movimentos normais de gastrulao (Figura 3.18; Heasman et al., 1994; Lee e Gumbiner, 1995). Caderinas promovem a aderncia celular, ligando-se ao mesmo tipo de caderina em outra clula. Assim, clulas com E-caderina grudam em outras clulas que tm Ecaderina, e se separaro de outras clulas contendo N-caderinas em suas membranas. Essa ligao chamada ligao homoflica. Clulas expressando N-caderinas rapidamente se isolam de clulas N-caderina-negativas in vitro, e anticorpos univalentes contra caderinas convertero um agregado de clulas tridimensional histotpico, em uma camada nica (Takeichi et al., 1979). Mais ainda, quando genes ativados de Ecaderina so transfectados em fibroblastos de camundongo cultivados e neles expressos (usualmente eles no expressam essa protena), E-caderina vista em suas superfcies celulares, e os fibroblastos tratados passam a se ligar fortemente uns aos outros (Nagafuchi et al.,1987). Na verdade essas clulas comeam a se portar como clulas epiteliais. Expresso de caderinas freqentemente correlacionada com agregao e disperso. Clulas da crista neural (que esto na poro mais dorsal do tubo neural), inicialmente expressam N-caderina. Em seguida, enquanto deixam o tubo neural, migrando como clulas individuais (para formar clulas pigmentadas, neurnios sensoriais e outros tipos de clulas), elas perdem a expresso de N-caderina (veja Figura 3.17; veja tambm Captulo 7). Entretanto, quando as clulas migrantes chegam ao seu destino e comeam a se agregar entre si para formar gnglios nervosos, elas tornam a expressar N-caderina (Hatta et al.,1987). Expresso diferencial de caderina pode tambm explicar os dados de distribuio homotpica discutida anteriormente. Como foi discutido, Roth e colaboradores demonstraram que clulas de fgado tendem a coletar clulas de fgado e que clulas retinais coletam outras clulas retinais. Takeichi (1987) demonstrou que clulas retinais expressam N-caderina e clulas hepticas expressam E-caderina, e que a distribuio seria a esperada devido a essa diferena na expresso de caderinas. Ele tambm sugeriu que as observaes de Townes e Holtfreter poderiam ser, da mesma forma, explicadas por expresso diferencial de caderinas. Suporte para essa idia veio de estudos nos quais diferentes genes de caderina foram transfectados em fibroblastos de camundongo, que no expressam habitualmente qualquer tipo de caderina. Fibroblastos expressando E-caderina aderiram a outros contendo E-caderina, enquanto fibroblastos de P-caderina se ligavam a outros que expressavam P-caderina. Tambm, quando tecido pulmonar embrionrio foi dissociado e sua recombinao permitida na presena de fibroblastos levando E-caderina ou de fibroblastos sem tratamento, os fibroblastos expressando E-caderina foram integrados nos tbulos epiteliais pulmonares (que expressam E-caderina), enquanto que os fibroblastos no tratados se associaram s clulas mesenquimatosas (que no expressam caderinas) (Nose et al.,1988). Todos esses experimentos foram realizados com clulas cultivadas. Recentemente, estudos in vivo mostraram que caderinas podem ter um papel crtico nos fenmenos de distribuio ocorrendo dentro do embrio. Quando o mRNA para N-caderina de galinha injetado em um dos dois blastmeros da primeira clivagem em embrio da r Xenopus, N-caderina freqentemente expressa em clulas que normalmente no a possuem. Os embries que expressam N-caderina extra so muitas vezes caracterizados por amontoados de clulas e camadas tissulares engrossadas. Normalmente, o tubo neural (que expressa N-caderina) se separa das clulas que se transformaro em epiderme (a qual expressa E-caderina). Em embries nos quais a epiderme e o tubo neural expressam a N-caderina extra, o tubo neural no se separa da epiderme (Detrick

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

95

(A)

(B)

Figura 3.18

Importncia de caderinas em manter a coeso entre clulas em desenvolvimento. (A) Quando ocitos so injetados com oligonucleotdeos antisense contra uma mensagem de caderina herdada maternalmente, as clulas centrais dispersam quando o hemisfrio animal removido. Em embries controle (direita), as clulas internas permanecem juntas. (B) No estgio de quatro clulas, os blastmeros que formam o lado esquerdo do sapo so injetados com um mRNA para N-caderina que no tem a regio extracelular da caderina. Durante a neurulao as clulas com a protena mutante no formam uma camada coerente. (de Heasman et al., 1994; B de acordo com Kintner et al, 1992; fotografias cortesia de J. Heasman e C. Kintner.)

et al., 1990; Fujimori et al., 1990). Assim, as caderinas esto, provavelmente, tendo um papel principal na organizao das clulas em tecidos. [cell2.html] CAMs da superfamlia de imunoglobulinas Como discutimos no Captulo 1, anticorpos foram usados inicialmente para identificar molculas de adeso celular em Dictyostelium. Gerisch e colegas (Beug et al.,1970), prepararam anticorpos contra Dictyostelium e os quebraram quimicamente de modo que somente suas regies monovalentes ligantes de antgeno permanecessem os fragmentos Fab. (Os anticorpos bivalentes tiveram que ser quebrados, porque de outra maneira eles poderiam artificialmente agrupar clulas e o efeito no poderia ser medido). Isso levou descoberta de uma glicoprotena de 80-kDa que mediadora da adeso clula-clula durante a agregao no fungo pegajoso. A mesma estratgia foi usada por Edelman e seus colaboradores (Brackenbury et al., 1977) que levou ao isolamento de uma molcula de adeso de clulas neurais (N-CAM). [cell3.html] N-CAM um membro de uma classe de CAMs que no necessitam ons de clcio e que tm uma estrutura semelhante (Figura 3.19). Essa estrutura extracelular com seus domnios globulares imobilizados por pontes dissulfeto, se assemelha molcula de imunoglobulina, e mesmo possvel que as imunoglobulinas sejam derivadas desse grupo de CAMs (Williams e Barclay, 1988; Lander, 1989). Assim, essas glicoprotenas so chamadas CAMs da superfamlia de imunoglobulinas*. As CAMs da superfamlia de imunoglobulinas podem ter um papel importante no desenvolvimento do sistema nervoso. N-CAM necessria para uma ligao adequada de axnios s clulas musculares alvos (Covault e Sanes, 1986; Tosney et al.,1986). Alm disso, N-CAM parece ser crtica para o empacotamento (fasciculao) de axnios para que se movimentem como uma unidade. Anticorpos N-CAM podem quebrar essas ligaes, permitindo que os axnios se dispersem (Fraser et al., 1988; Landmesser et al.,1988). Uma situao similar parece ocorrer em insetos, onde

* A designao superfamlia freqentemente usada porque as diferentes classes de molculas de imunoglobulinas tambm constituem, elas mesmas, uma famlia. Esses outros membros da superfamlia tm estruturas semelhantes s imunoglobulinas, mas no so exatamente famlia prxima.

96

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Figura 3.19

(B)

Molculas de adeso da superfamlia de imunoglobulinas. (A) Trs membros da superfamlia de imunoglobulinas. A forma da molcula de IgM ligada membrana tem duas cadeias pesadas, cada uma com cinco domnios, e duas cadeias leves, cada uma com dois domnios. N-CAM um polipeptdeo com cinco domnios. Sua ncora na membrana pode ser a seqncia de aminocidos de uma protena transmembrana ou um lipdeo. L1 uma protena transmembrana com seis domnios globulares. Fasciclina II, a molcula de adeso celular de insetos, e neurogliana se assemelham a N-CAM e L1, respectivamente. (B) Modelo para a adeso das CAMs da superfamlia de imunoglobulinas.
(A) N N N N N N

ou

Domnios semelhantes imunoglobulina

Domnios semelhantes fibronectina Extracelular ou Citoplasma CC IgM C N-CAM ou fasciclina II C L1 ou neurogliana

ou C Interaes de N-CAM clula-clula

Figura 3.20

as CAMs da superfamlia de imunoglobulinas, chamadas fasciclinas (Figura 3.20) ajudam a migrao de axnios (Harrelson e Goodman, 1988). L1 necessria para a produo de certos axnios (Lemmon et al., 1989), e mutaes de L1 no homem causam um espectro de anomalias caracterizada por hidrocefalia, retardamento mental e inabilidade em controlar movimentos dos membros (Vits et al., 1994). Expresso diferencial de CAM crtica nos limites entre dois grupos de clulas. Nesses lugares, o corpo segrega diferentes clulas em diferentes regies. Clulas da notocorda no entram no tubo neural e nem clulas dermais trespassam para a epiderme.

Expresso de fasciclina no sistema nervoso do gafanhoto em desenvolvimento. (A) Estrutura em andaime dos axnios fasciculados em um embrio de gafanhoto como visto em um microscpio de Nomarski. A com e P com so as comissuras anterior e posterior cujos axnios atravessam o segmento; ISN um neurnio intersegmental e con um neurnio conectivo. (B,C) Sistema nervoso embrinico como em (A), mas marcado com anticorpos monoclonais feitos para as glicoprotenas fasciclinas da superfcie celular. O anticorpo em (B) reconhece um subconjunto de axnios nas comissuras anterior e posterior, enquanto o anticorpo em (C) se liga a uma glicoprotena de membrana dos mais longitudinais fascculos de axnios. As flechas mostram os mesmos locais em (B) e (C). Note que o anticorpo marca somente uma poro de cada axnio. (de Bastiani et al., 1987, cortesia de C. Goodman.)

(A)

(B)

(C)

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

97

Figura 3.21

Distribuio de diferentes CAMs em bordas tissulares. Enquanto as clulas mesodrmicas se renem para induzir o broto das penas no ectoderma, as clulas mesenquimatosas recmagregadas expressam N-CAM (A) e as clulas ectodrmicas expressam E-caderinas (B) nas suas respectivas membranas celulares. (de Chuong e Edelman, 1985a, cortesia de G. Edelman).

Essa segregagao pode ser conseqncia da diferena de CAMs nas populaes adjacentes. Por exemplo, penas so induzidas quando clulas mesenquimatosas derivadas do mesoderma se agrupam para formar uma bola de clulas imediatamente abaixo da epiderme da pele da galinha. As clulas ectodrmicas esto ligadas entre si por E-caderina, enquanto as clulas mesenquimatosas, CAM-negativas anteriormente, comeam a expressar N-CAM e se juntam para formar um agregado (Figura 3.21). Atravs do desenvolvimento da pena, diferentes grupos de clulas se separam umas das outras, como resultado de sua habilidade para expressar N-CAM, E-caderina, ou ambas as protenas (Chuong e Edelman, 1985a,b).

(A)

Molculas da juno celular: protenas da juno em fenda


Junes em fenda so regies intercelulares especializadas onde clulas adjacentes se encontram entre 15-40 nm de distncia. Finas conexes servem como canais de comunicao entre clulas adjacentes (Figura 3.22A,B). Clulas assim ligadas so chamadas acopladas, e pequenas molculas (MW<1500) e ons podem passar livremente de uma clula para outra. Na maioria dos embries, pelo menos alguns

(B)

(B)

(D)

Figura 3.22
Espao intracelular (15-40 nm)

Canais de comunicao

Membranas celulares Conexes (A) (D)

Protenas das junes em fenda. (A) Micrografia eletrnica de uma fileira de junes em fenda ligando duas clulas justapostas. (B) Micrografia fluorescente de junes em fenda em tbulo renal de embrio de camundongo de 17 dias. (C) Compartimento formado por protenas da juno de fenda entre clulas que se comunicam umas com as outras. Esse compartimento na gstrula de camundongo pode ser visto injetando o corante Lucifer Yellow em um clula e observando sua transferncia a um pequeno grupo de clulas. (D) Estrutura da subunidade da juno em fenda. (A de Peracchia e Dulhunty, 1976, cortesia de C. Peracchia; B de Sainio et al., 1992, cortesia de K. Sainio; C de Kalimi e Lo, 1988, cortesia de C. Lo; D conforme Darnell et al., 1986.)

98

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

(A)

dos blastmeros precoces esto ligados por junes em fenda, dessa forma permitindo que ons e pequenas molculas solveis passem livremente entre eles. A habilidade de clulas em formar junes em fenda com algumas clulas, e no com outras, cria compartimentos fisiolgicos dentro do embrio em desenvolvimento (Figura 3.22 C). A importncia de junes em fenda no desenvolvimento foi demonstrada em embries de anfbios e mamferos (Warner et al., 1984). Quando anticorpos contra protenas da juno em fenda foram microinjetados em uma clula especfica de uma blstula de Xenopus de oito clulas, a prognie daquela clula que usualmente est ligada por junes de fenda, agora no podia permitir a passagem de ons ou molculas pequenas de uma clula outra. Ainda mais, os girinos que resultaram das blstulas tratadas mostraram defeitos especificamente relacionados ao destino desenvolvimental da clula injetada (Figura 3.23). A prognie de tal clula no morreu, mas foi incapaz de se desenvolver de maneira normal (Warner et al., 1984). No embrio de camundongo, os oito primeiros blastmeros so conectados entre si por junes em fenda. Apesar de frouxamente associadas entre si, essas oito clulas se movem juntas para formar um embrio compacto. Se a compactao for inibida por anticorpos contra protenas da juno em fenda, o desenvolvimento posterior cessa. Os blastmeros tratados continuam a dividir-se, mas a compactao no ocorre (Lo e Gilula, 1979; Lee et al., 1987). Se RNA antisense contra as mensagens da juno em fenda injetado em um dos blastmeros de um embrio normal de camundongo, aquela clula no formar junes em fenda e no ser includa no embrio (Bevilacqua et al., 1989). Os canais da juno em fenda so feitos de protenas chamadas conexinas. Em cada clula, seis conexinas idnticas da membrana se agrupam para formar um canal transmembrana contendo um poro central. O complexo de juno em fenda de uma clula se conecta ao complexo de juno em fenda de outra clula, permitindo que se juntem os citoplasmas de ambas as clulas (Figura 3.22D). Existem aproximadamente doze tipos de conexinas, e algumas podem ser reguladas por caderinas. Jongen e colaboradores (1991) observaram que em clulas acopladas por E-caderina, a comunicao entre clulas, mediada por junes em fenda, depende da funo de caderinas. Evidncias sugerem que caderinas permitem no s o contato entre as clulas como tambm modificam as protenas tipo conexina. Os diferentes tipos de protena conexina tm papis separados, mas parcialmente sobrepostos, no desenvolvimento normal. Por exemplo, a protena de juno em fenda conexina-43 encontrada em quase todos os tecidos do embrio do camundongo em desenvolvimento. Entretanto, se os genes da conexina-43 forem derrubados por endereamento de genes, o embrio ainda se desenvolver. Parece que a funo da protena conexina-43 pode ser assumida por outras conexinas. Mas, logo aps o nascimento, esses camundongos tm respirao convulsiva, se tornam cianticos e morrem. Autpsia desses animais mostra que o ventrculo direito a cmara que bombeia sangue aos pulmes atravs da artria pulmonar est cheio de tecido que fecha a cmara e impede o fluxo de sangue (Reaume et al.,1995). Mesmo que a perda da protena conexina-43 possa ser compensada em muitos tecidos, parece que ela crtica para o desenvolvimento normal do corao. [cell4.html] A membrana celular tem, ento, vrios mecanismos pelos quais pode fazer ligaes com membranas de outras clulas. Podem ser usadas CAMs da superfamlia de

Figura 3.23

(B)

Efeitos da juno em fenda no desenvolvimento. Seo de um girino de Xenopus no qual um dos blastmeros, no estgio de oito clulas, foi injetado com (A) um anticorpo controle ou (B) um anticorpo contra a protena da juno em fenda. O lado formado pelo blastmero injetado no tem o olho e tem uma morfologia cerebral anormal. (de Warner et al., 1984, cortesia de A. E. Warner.)

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

99

imunoglobulinas, CAMs dependentes de clcio e protenas de juno. Mas isso no esgota seu repertrio. Como j mencionado, a clula tambm pode se ligar a componentes especficos da matriz extracelular. Agora voltamos nossa ateno para esses componentes.

A base molecular da afinidade clula-substrato


Afinidade diferencial a substrato A migrao de clulas, como a migrao de pssaros e borboletas monarca, depende da percepo de quando comear a migrao, quando cessar a migrao e qual rota tomar. Existem muitos sinais que o ambiente pode dar s clulas, mas os principais parecem envolver substncias na matriz extracelular. A hiptese da afinidade diferencial a substrato postula que diferentes clulas reconhecem diferentes molculas em vrias matrizes extracelulares. Cada tipo de clula migratria prefere certas combinaes de molculas da matriz a outras combinaes, e essas molculas orientam a clula para quando e onde migrar. Weiss (1945) e Tyler (1946) sugeriram que a clula, por vezes, pode interagir com seus substratos atravs do sistema chave-fechadura, ou seja, entre a membrana celular e a matriz extracelular. O relacionamento entre a protena da membrana celular e a molcula da matriz seria semelhante aquele entre enzima e substrato ou anticorpo e antgeno. Durante a ltima dcada foi demonstrado que esse tipo de interao muito importante para a migrao celular. [cell5.html] A matriz extracelular A matriz extracelular consiste de macromolculas secretadas pelas clulas no seu ambiente imediato. Essas molculas interagem de modo a formar uma estrutura insolvel que pode ter vrias funes no desenvolvimento. Em algumas situaes, ela pode separar dois grupos adjacentes de clulas e prevenir qualquer interao. Em outros casos, a matriz extracelular pode servir como o substrato no qual as clulas migram, ou pode at induzir diferenciao em certos tipos celulares. Um tipo de matriz mostrado na Figura 3.24. Aqui, uma lmina de clulas epiteliais est adjacente a uma camada de tecido mesenquimatoso frouxo. As clulas epiteliais formaram uma apertada camada extracelular chamada lmina basal; as clulas mesenquimatosas secretam uma frouxa lmina reticular. Juntas, essas camadas constituem a membrana basal da lmina de clulas epiteliais. Existem trs componentes principais na maioria de matrizes extracelulares: colgeno, proteoglicanos e glicoprotenas grandes que so chamadas molculas de adeso a substrato (Tabela 3.2).

Epitlio

Figura 3.24

Lmina basal

Colgeno

Localizao e formao da matriz extracelular no embrio de galinha. A micrografia eletrnica de varredura mostra a matriz extracelular na juno das clulas epiteliais (acima) e mesenquimatosas (abaixo). As clulas epiteliais sintetizam uma lmina densa com base de glicoprotena, enquanto as clulas mesenquimatosas secretam a lmina reticular feita primariamente de colgeno. (Cortesia de R. L. Trelsted.)

100

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Tabela 3.2 Principais constituintes da matriz extracelular


Matriz extracelular mesenquimatosa Lmina basal das clulas epiteliais

COLGENOS Molculas longas e delgadas (Tipo I o mais comum; Tipos II, III, e V-XIII so tambm encontradas) que se organizam para formar fibrilas, usualmente com 60-70 nm de dimetro. Colgenos proporcionam fora e estabilidade aos tecidos. PROTEOGLICANOS DA MATRIZ Compostos de protenas e dissacardeos repetitivos (glicosaminoglicanos). Glicosaminoglicanos incluem cido hialurnico, uma enorme molcula (108 Da) que liga grandes quantidades de gua. Proteoglicanos sulfatados compreendem uma protena linear interna qual esto ligadas cadeias de um ou mais glicosaminoglicanos sulfatados (condroitina, heparan, queratan e dermatan sulfato). Proteoglicanos estimulam e modulam movimentos celulares; sua disponibilidade sugere que podem ter outras propriedades no conhecidas. MOLCULAS DE ADESO DE SUBSTRATO Molculas s quais clulas aderem permitindo-lhes que se movam. Elas incluem fibronectina, condronectina e tenascina. Fonte: Adaptado de Bard, 1990.

COLGENO IV Os componentes estruturais majoritrios da lmina basal. Ao contrrio de outros colgenos, suas fibrilas so como um fino arame de galinheiro e se organizam em um substrato semelhante a feltro. PROTEOGLICANOS DA MATRIZ cido hialurnico e proteoglicanos sulfatados so freqentes na lmina basal. Sua presena pode facilitar a passagem de produtos secretados pela lmina. MOLCULAS DE ADESO DE SUBSTRATO Laminina, o componente funcional majoritrio da lmina basal. Um trmero de glicoprotena com stios de adeso para a membrana celular, colgeno IV e glicosaminoglicanos. Lmina basal pode conter fibronectina, tenascina, nidogen e outras glicoprotenas adesivas.

COLGENO. Colgeno uma famlia de glicoprotenas contendo altas porcenta-

gens de resduos de glicina e prolina. Quase metade das protenas do corpo so constitudas de colgeno, que o principal suporte estrutural de quase todos os rgos dos animais. Existem numerosos tipos de colgeno servindo funes especiais. Colgeno Tipo I, encontrado nas matrizes extracelulares da pele, tendes e ossos, perfaz quase 90 porcento do colgeno do corpo. Colgeno Tipo II mais evidente como secreo das clulas cartilaginosas, mas tambm encontrado na notocorda e no corpo vtreo do olho. Vasos sangneos apresentam colgeno Tipo III, e o Tipo IV encontrado na lmina basal produzida por clulas epiteliais (Vuorio, 1986). Outros tipos de colgeno so encontrados ao longo do corpo, especialmente em cartilagem. Colgeno importante para a formao da lmina basal, e tambm est implicado na ramificao dos tbulos epiteliais nas glndulas salivares, pulmes e outros rgos. [cell6.html]
PROTEOGLICANOS. So tipos especficos de glicoprotenas nas quais: (1) o peso dos resduos de carboidratos muito maior do que o da protena; (2) os carboidratos so cadeias lineares compostas de dissacardeos repetitivos. Usualmente, um dos acares do dissacardeo tem um grupo amino e a unidade repetitiva chamada glicosaminoglicano (GAG). A Tabela 3.3 lista os glicosaminoglicanos mais comuns; a estrutura bsica dos proteoglicanos mostrada na Figura 3.25. A interconexo de protena e carboidrato forma uma matriz semelhante a uma rede, e em muitos tipos de clulas mveis, o proteoglicano envolve as clulas impedindo que elas se juntem (Figura 3.26). A consistncia da matriz extracelular depende da relao entre colgeno e proteoglicanos. Cartilagem, que tem uma alta porcentagem de proteoglicanos, macia, enquanto tendes, que contm predominantemente fibras de colgeno, so rgidos. Na lmina basal predominam os proteoglicanos que formam uma peneira molecular alm de propiciar suporte estrutural.

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

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Monmeros de proteoglicanos Pequenos glicosaminoglicanos (tal como condroitina sulfato) Protena esqueleto

cido D-glucurnico

N-acetil-D-glucosamina

cido hialurnico cido hialurnico Glicosaminoglicano

Figura 3.25

Glicoprotenas ligantes Agregados de proteoglicanos

A estrutura da subunidade e a montagem de um proteoglicano complexo. O dissacardeo repetitivo do glicosaminoglicano (tal como condroitina sulfato; veja Tabela 3.3) se liga a um esqueleto protico relativamente pequeno (colorido), para produzir as cadeias de proteoglicanos. Essas cadeias podem ser conectadas por glicosamino-glicanos mais longos (mostrado aqui como cido hialurnico) para produzir redes complexas. Glicoprotenas ligantes estabilizam essas ltimas associaes. (Modificado de Cheney e Lash, 1981.)

Tabela 3.3

Unidades dissacardicas repetitivas de glicosaminoglicanos mais comuns encontradas em proteoglicanos da matriz


Unidade dissacardica repetitivaa Distribuio

Glicosaminoglicano

cido hialurnico Condroitina sulfato Dermatan sulfato Queratan sulfato Heparan sulfato

cido glucurnico-Nacetilglucosamina cido glucurnico-Nacetigalactosamina sulfato [cido glucurnico ou idurnico] N-acetilgalactosamina sulfato Galactose-N-acetilglucosamina sulfato [cido glucurnico ou idurnico] N-acetilglucosamina sulfato

Tecidos conjuntivos, osso, corpo vtreo Cartilagem, crnea, artrias Pele, corao, vasos sangneos Cartilagem, crnea Pulmo, artrias, superfcie celular

a Essas so unidades repetitivas tpicas desses glicosaminoglicanos. Entretanto, algumas regies de cada GAG podem ter sacardeos ligeiramente modificados.

102

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

(A)

(B)

(D)

(C)

Figura 3.26

Capa de proteoglicanos envolvendo clulas mveis. (A) Capa de hialuronidato envolve mioblastos de galinha. Mioblastos em cultura excluem pequenas partculas (nesse caso, hemcias fixadas) em distncia significante da borda celular. (B) quando os mioblastos so tratados com hialuronidase (a qual dissolve cido hialurnico), essa capa extracelular desaparece. (C) A capa tambm desaparece quando os mioblastos cessam a diviso e se juntam enquanto se diferenciam. (D) Micrografia eletrnica de hialuronidato em soluo aquosa mostra uma rede fibrilar ramificada. (A-C de Orkin et al., 1985, cortesia de B. Toole; D de Hadler et al., 1982, cortesia de N. M. Hadler.)

Proteoglicanos tambm so importantes como mediadores de conexes entre tecidos adjacentes em um rgo. No rgo, eles renem clulas soltas para formar uma lmina epitelial* (San Antonio et al.,1987; Thesleff et al., 1989; Vainio et al., 1989; Bernfield e Sanderson, 1990). Em alguns casos, proteoglicanos secretados por um tipo de clula so essenciais para o crescimento de clulas vizinhas. Axnios dos gnglios da raiz dorsal tm proteoglicanos de heparan sulfato entre suas protenas da superfcie celular; a remoo desses proteoglicanos impede a proliferao ao seu redor, das clulas de Schwann associadas (Ratner et al.,1985). Uma maneira pela qual cadeias de glicosaminoglicanos, de proteoglicanos, podem funcionar reter e apresentar fatores de crescimento para receptores celulares. Fatores de crescimento so protenas semelhantes a hormnios que regulam mitose ou diferenciao quando se ligam a determinadas clulas. Entretanto, o receptor celular para o fator de crescimento freqentemente no liga o fator com grande afinidade. Na verdade, o fator inicialmente ligado pelos carboidratos do proteoglicano, e isso concentra o fator de crescimento localmente, de modo a ser possvel a ligao com o receptor (Massagu, 1991; Yayon et al.,1991).
GLICOPROTENAS EXTRACELULARES. Matrizes extracelulares contm uma va-

riedade de outras molculas especializadas, tais como: fibronectina, laminina e tenascina. Essas glicoprotenas grandes provavelmente so responsveis pela organizao de colgeno, proteoglicanos e clulas em uma estrutura ordenada. Fibronectina um dmero de glicoprotena, muito grande (460-kDa), sintetizada por fibroblastos, condrcitos, clulas endoteliais, macrfagos e certas clulas epiteliais (como hepatcitos e amnicitos). Uma funo da fibronectina servir como adesivo

*Proteoglicanos de heparan sulfato so considerados como agregadores de condrcitos, as clulas produtoras de cartilagem. Nveis excessivos de glicose inibem a sntese do esqueleto de protena do proteoglicano, inibindo a formao da cartilagem. Leonard e colaboradores (1989) propuseram esse como um possvel mecanismo para explicar problemas esquelticos em crianas nascidas de mes severamente diabticas.

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

103

molecular em geral, ligando clulas a substratos, tais como: colgeno e proteoglicanos. Fibronectina tambm organiza a matriz extracelular por ter vrios pontos de ligao distintos, que interagindo com as molculas apropriadas produz um alinhamento adequado de clulas e sua matriz extracelular (Figura 3.27). Como ser visto em captulos posteriores, fibronectina tem tambm um papel importante na migrao celular. As rodovias pelas quais se movem certas clulas migratrias so pavimentadas com essa protena. A migrao de clulas mesodrmicas na gastrulao vista na superfcie de fibronectina em muitas espcies, e o movimento dessas clulas cessa quando a fibronectina localmente removida. Em embries de galinha, os precursores do corao, as clulas precardacas, migram na fibronectina para se mover das laterais do embrio para a linha mediana. Se embries de galinhas so injetados com anticorpos fibronectina, as clulas precardacas no migram para a linha mediana e desenvolvem dois coraes separados. Anticorpos fluorescentes fibronectina demonstraram um gradiente da protena no caminho de migrao entre o endoderma e o mesoderma. Se essa regio for cortada e sofrer uma rotao, as clulas do corao seguem o gradiente para novas posies se afastando da linha mediana (Linask e Lash, 1988a,b). Assim, a fibronectina parece ter um papel principal na migrao das clulas precardacas para a linha mediana do embrio. Outros tipos de clulas, como as clulas germinativas, precursoras de embries do sapo, tambm migram sobre clulas que secretam fibronectina em suas superfcies (Heasman et al.,1981). Laminina um componente principal da lmina basal. composta de trs cadeias peptdicas, e, como fibronectina, pode se ligar ao colgeno, glicosaminoglicanos e clulas. O colgeno ligado por laminina do Tipo IV (especfico para lmina basal), e a regio ligante de clulas da laminina reconhece principalmente clulas epiteliais e neurnios. A adeso de clulas epiteliais laminina (na qual elas se assentam e usam) muito maior do que a afinidade de clulas mesenquimatosas pela fibronectina ( qual elas devem se ligar e liberar se dever haver migrao). Como a fibronectina, a laminina tem um papel na montagem da matriz extracelular, promovendo adeso celular e crescimento, mudando a forma da clula e permitindo a migrao celular (Hakomori et al.,1984). Nem todas grandes glicoprotenas celulares promovem adeso celular. Tenascina (tambm chamada citotactina) se assemelha a fibronectina em mais ou menos metade
Figura 3.27

(A)

(B) H 2N Domnio ligante de fibrina e heparina Domnio ligante de colgeno

Stio de alta afinidade

Domnios para ligao de clulas da crista neural de aves RGDS CS1 COOH

Fibronectina no embrio de galinha em desenvolvimento. (A) Anticorpos fluorescentes para fibronectina mostram que a deposio de protena no embrio de 24 horas se situa ao longo da lmina basal de muitos rgos. (B) Estrutura e domnios de ligao na fibronectina. Os retngulos representam domnios resistentes a proteases. O domnio para a ligao de fibroblastos compreende duas unidades, o stio RGD e o stio de alta afinidade; ambos so essenciais para ligao da clula. Clulas da crista neural de aves tm outro stio necessrio para sua mobilidade em um substrato de fibronectina. Outras regies na fibronectina permitem ligaes com colgeno, heparina* e outras molculas da matriz extracelular. (A cortesia de J. Lash; B conforme Dufour et al., 1988.)
*Heparina uma poro de um proteoglicano de heparina secretada por mastcitos e basfilos. Heparan e heparan sulfato so nomes dados a glicosaminoglicanos similares encontrados na matriz extracelular ou na superfcie da clula. Presume-se que os stios de ligao para heparina sejam os mesmos que os para heparan sulfato (Bernfield e Sanderson, 1990).

Domnios ligantes de clulas para fibroblastos

Stio II ligante de heparina

Stio II ligante de fibrina

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

do comprimento da molcula, e encontrada transitoriamente em vrias matrizes extracelulares durante o desenvolvimento embrionrio. Entretanto, diferentes clulas reagem de maneira diferente tenascina. Algumas clulas aderem a ela, outras so arrebanhadas e se desligam da tenascina (Figura 3.28; Spring et al., 1989). Diferentes quantidades relativas de fibronectina e tenascina podem gerar substratos de vrios graus de adesividade. Alm disso, tenascinas parecem aumentar a sntese e secreo de proteases das clulas que nela se localizam (Werb et al., 1990). Ambas as caractersticas podem ser importantes na gerao de vias para a migrao celular, e na remodelao da matriz extracelular durante o desenvolvimento (Tan et al., 1987; BronnerFraser, 1988; Wehrle e Chiquet, 1990). Receptores celulares para molculas da matriz extracelular INTEGRINAS. A habilidade de uma clula em ligar essas glicoprotenas adesivas depende da sua capacidade em expressar um receptor da membrana, que se torna o lugar de ligao na clula para essas grandes molculas. Os principais receptores de fibronectina foram purificados usando anticorpos monoclonais que bloqueiam a ligao das clulas fibronectina (Chen et al.,1985; Knudsen et al., 1985). Foi observado que o complexo receptor de fibronectina capaz no s de ligar fibronectina no exterior da clula, como tambm protenas do citoesqueleto dentro da clula. Ento, parece que o complexo receptor de fibronectina atravessa a membrana celular e une dois tipos de matrizes. Dentro da clula, serve como um stio de ancoragem para os microfilamentos de actina que movimentam a clula; fora da clula, se liga fibronectina da matriz extracelular (Figura 3.29). Horwitz e colaboradores (1986; Tamkun et al., 1986) denominaram essa famlia de receptores proticos como integrinas porque elas integram as plataformas intra e extracelulares permitindo que funcionem conjuntamente. Protenas integrinas foram encontradas atravessando a membrana de numerosos tipos de clulas. No lado extracelular, integrina se liga seqncia arginina-glicina-aspartato (RGD) de vrias protenas adesivas em matrizes extracelulares, inclundo vitronectina (encontrada na lmina basal do olho), fibronectina e laminina (Ruoslahti e Pierschbacher, 1987). No lado citoplasmtico, a integrina se liga talina e -actinina, duas protenas que se ligam aos microfilamentos de actina. Essa ligao dupla permite o movimento da clula pela contrao dos microfilamentos de actina contra a matriz extracelular fixa (veja Wang et al., 1993). Tipos diferentes de clulas podem ter diferentes molculas de integrinas com diferentes afinidades por molculas da matriz extracelular (Hemler et al., 1987; Hemler,1990). Cada molcula de integrina tem duas subunidades distintas, e , e diferentes combinaes binrias das subunidades e permitem que a integrina se ligue a determinadas molculas extracelulares. Por exemplo, 21 se liga ao colgeno e laminina, enquanto 41 se liga somente fibronectina. Ambas as unidades e so necessrias para a ligao com fibronectina ou laminina, mas somente a unidade conecta com o citoesqueleto interno. Durante a migrao, as ligaes unindo a unidade da integrina ao citoesqueleto, podem ser continuamente quebradas e refeitas por uma protease que cliva talina e est especificamente localizada em stios da membrana celular onde a integrina se liga ao substrato. possvel que essa protease quebre a ponte entre o receptor de fibronectina e o citoesqueleto (Beckerle et al., 1987). A importncia de integrinas dramaticamente ilustrada durante a embriognese de Drosophila. Como as integrinas de vertebrados, as integrinas de Drosophila so compostas de subunidades e que atravessam a membrana celular. Nas duas integrinas de Drosophila que so conhecidas, as subunidades so idnticas, mas as subunidades so diferentes. Essas duas integrinas freqentemente funcionam em conjunto efetuando adeso tissular e celular durante o desenvolvimento. No desenvolvimento da asa da Drosophila, duas lminas epiteliais so aproximadas. A integrina PS1 est situada na superfcie basal do epitlio na asa presuntiva dorsal, enquanto a integrina PS2 est na superfcie superior do epitlio na asa presuntiva

Figura 3.28

Inibio de adeso celular por tenascina. Fibronectina e tenascina foram colocadas em placas de cultura de tecidos, dispostas em forma de letras. Fibroblastos foram adicionados s placas podendo aderir e migrar. O resultado mostra que fibronectina foi o substrato preferido no plstico da cultura de tecidos, enquanto que as clulas no aderiram ou migraram bem sobre a tenascina. (Cortesia de M. Chiquet.)

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

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(A) Fibronectina

RGD

Stio de ligao de RGD Subunidade de integrina Extracelular Subunidade de integrina

Stios de ligao de clcio Subunidade de integrina

Citoplasma

Actinina

Vinculina

Talina

ventral. Durante a metamorfose, esses dois epitlios se encontram e aderem para formar a lmina de duas camadas da asa. Mutaes nas integrinas produzem asas com regies onde os dois epitlios se separam, como evidenciado por bolhas entre as duas lminas (Brower e Jaffe, 1989; Wilcox et al.,1989). Algumas mutaes de integrinas em Drosophila so letais, porque integrina necessria para anexar msculos epiderme e parede do intestino. Na mutao letal (1) myospheroid, existe uma deficincia nos genes codificando a subunidade das integrinas de Drosophila. Na ausncia dessa subunidade, nenhuma integrina se forma, e os msculos somticos se contraem em esferas sem ligantes para a parede do corpo e do intestino (Leptin et al.,1989). Integrinas no so as nicas molculas capazes de se ligar laminina e fibronectina. Enquanto o receptor integrina se liga a uma seqncia RGD na cadeia A de laminina, outro receptor protico de laminina na membrana celular se liga a uma seqncia diferente (Y1GSR) na cadeia B1 (Graf et al.,1987; Yow et al., 1988). Os receptores tm afinidade diferente por laminina, e essas podem ser importantes para sua funo (Horwitz et al., 1985). A integrina a31 de fibroblastos, por exemplo, tem uma afinidade relativamente baixa por laminina (Kd = 10-6 M), enquanto a afinidade por laminina de seu receptor epitelial muito mais alta (Kd=2 x10-9 M). O receptor usado pode ser importante em permitir que as clulas usem laminina ou como membrana basal (nesse caso a afinidade do receptor seria alta) ou como um substrato para a migrao (na qual receptores de afinidade menor seriam usados).
GLICOSILTRANSFERASES. Outro grupo de protenas que pode aderir clulas a protenas da matriz extracelular so as glicosiltransferases da superfcie celular. Essas enzimas ligadas membrana so rotineiramente encontradas no retculo endoplasmtico e nas vesculas de Golgi, onde elas so responsveis por adicionar resduos de acar a peptdeos para produzir glicoprotenas. Existem numerosas glicosiltransferases, cada uma especfica para um dado acar e algumas mostrando tambm especificidade de substrato. Assim, galactosiltransferase uma enzima capaz de transferir galactose de um molcula doadora ativada (UDP-galactose) a uma unidade aceptora. Devem existir muitas galactosiltransferases com afinidades para diferentes molculas aceptoras. Galactosiltransferases so enzimas funcionais da membrana celular, e sua adeso matriz extracelular representa uma catlise frustrada (Figura 3.30). A enzima necessita de dois substratos para completar a catlise, o carboidrato aceptor e o acar ativado. As glicosiltransferases de membrana reconhecem o carboidrato receptor nas

Actinina

Microfilamento de actina

Figura 3.29

Dupla funo de integrinas ao se ligar com matrizes extracelulares e com o citoesqueleto interno. (A) Imunofluorescncia indireta corando os microfilamentos de actina de uma clula extendendo um lamelapdio. As fibras de actina irradiam da grade ordenada do citoesqueleto para o lamelapdio. (B) Diagrama especulativo relacionando a ligao do citoesqueleto matriz extracelular atravs da molcula de integrina. (A de Lazarides, 1976, cortesia de E. Lazarides; B conforme Luna e Hitt, 1992.)

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

(A) (B) Enzima glicosiltransferase

NDP-acar + aceptor

Glicosil transferase

NDP + acar-aceptor

Doador de acar ativado (NDP-acar) Aceptor insolvel

(C)

Ligao

Ligao de NDP-acar glicosiltransferase

Figura 3.30

Catlise cliva acar de NDP e o adiciona ao aceptor

Interaes da superfcie celular atravs de glicosiltransferases. (A) A reao padro de glicosiltransferase, na qual um acar transferido de um carregador nucleosdeo difosfato a um receptor. (B) Interao entre glicosiltransferases e o grupo carboidrato (aceptor) na glicoprotena da matriz extracelular. Se o acar ativado est ausente, ocorre a adeso (considera-se que isso ocorra durante a fertilizao). Se o acar ativado est presente em pequenas quantidades, a migrao permitida. (C) Marcao da glicosiltransferase da superfcie celular, incubando sees microscpicas de um embrio de galinha de 10-somitos, com UDP-[3H] galactose. Radioatividade insolvel vista por radioautografia mostra que esse acar radioativo foi transferido s superfcies celulares, especialmente das clulas mesodrmicas migratrias. (A e B modificado de Pierce et al., 1980; C de Shur, 1977a, cortesia de B. Shur.)

protenas da matriz extracelular tal como a laminina. Isso causa adeso. Quando o segundo substrato aparece, essas adeses podem ser quebradas pela catlise. Em algumas instncias (como fertilizao no camundongo, onde a galactosiltransferase na membrana celular do espermatozide interage com componentes carboidrato da matriz extracelular secretada pelo vulo), a adeso crtica e a catlise no ocorre. Em clulas migratrias, tanto adeso como catlise so observadas (Toole, 1976; Shur, 1977a,b; Turley e Roth, 1979; Eckstein e Shur, 1989). Adeso diferencial resultante de sistemas de adeso mltipla Apesar de estarmos discutindo sistemas de adeso como unidades separadas, os processos morfogenticos de interao clula-clula so provavelmente realizados por combinaes de molculas de adeso celular. Por exemplo, a fixao inicial do embrio de camundongo parede uterina parece ser mediada por vrios sistemas de adeso. Primeiro, as clulas de fora do embrio (as clulas trofoblsticas) tm receptores para o colgeno e os proteoglicanos de heparan sulfato do endomtrio uterino, e interferncia com essa ligao pode impedir a implantao (Farach et al.,1987; Carson et al., 1988, 1993). Segundo, Dutt e colaboradores (1987) mostraram que as clulas trofoblsticas podem tambm aderir s clulas uterinas atravs das glicosiltransferases da superfcie celular. Terceiro, Kadokawa e colaboradores (1989) mostraram que Pe E-caderinas esto presentes tanto no tecido uterino como no trofoblstico no local da implantao. Assim, clulas podem ter muitos sistemas adesivos que lhes permitem ligar e/ou migrar em substratos especficos. As clulas tambm usam sistemas mltiplos para remodelar tecidos por digesto. Por exemplo, quando embries de mamferos se embebem no tero, eles digerem seu caminho atravs do epitlio do tero e atravs de sua membrana basal de laminina, fibronectina e colgeno Tipo IV (Behrendtsen et al., 1992). Crescimento do osso, regresso da cauda do girino e formao de rgos ramificados (tais como: glndulas salivares, rins e pulmes) tambm requerem quebra da membrana basal. Essa degradao controlada de molculas da matriz extracelular completada por um conjunto de enzimas coletivamente chamadas de Metaloproteinases degradativas de matrizes (Matrisian, 1992; Sato et al., 1994). Algumas dessas enzimas esto ligadas membrana celular, enquanto outras so secretadas diretamente pelas clulas para dentro da matriz que ser dissolvida. Essas metaloproteinases incluem: (1) colagenases que digerem colgenos dos Tipo I, II e III; (2) gelatinases que digerem elastina e colgenos IV e V; e (3) estromelisinas que digerem proteoglicanos, fibronectina e laminina. A ativao dos genes das metaloproteinases realizada coordenativamente, e vrias dessas enzimas interagem para amplificar a intensidade das enzimas digestivas (Figura 3.31). Logo aps a ativao das metaloproteinases, as clulas ativam os genes para os inibidores dessas protenas. A produo e degradao controlada da matriz extracelular parte essencial do desenvolvimento normal.

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

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Procolagenase Plasminognio Ativao transcricional Uroquinase Plasmina

Colagenase Ativa Estromelisina Colagenase muito ativa

Prostromelisina

Figura 3.31

Cascata de ativao de metaloproteinases de membrana. Uroquinase um ativador de plasminognio, que cliva o plasminognio dando plasmina. Plasmina ativa as formas precursoras de estromelisinas e colagenases produzindo uma mistura de enzimas muito ativa capaz de digerir matrizes extracelulares. (Conforme Matrisian, 1992.)

Molculas de receptores e vias de transduo de sinais


Os destinos das clulas so freqentemente determinados pelas interaes em suas superfcies, onde uma molcula de receptor encontra seu ligante complementar. Mas como que certas interaes na superfcie da clula causam a transcrio de genes especficos dentro do ncleo? As vias entre a membrana celular e o genoma so chamadas vias de transduo de sinais. Vrias vias foram descobertas, aqui sero mencionadas as principais. Como veremos, elas parecem ser variaes de um mesmo tema. O tema deveras elegante: cada receptor se estende atravs da membrana tendo uma regio extracelular, uma regio transmembrana e uma regio citoplasmtica. Quando um ligante acoplado na regio extracelular, sua forma muda e a poro citoplasmtica passa a ter atividade enzimtica. Essa atividade usualmente a de uma quinase, que pode usar ATP para fosforilar protenas, inclusive a si mesmo. O receptor ativo pode agora catalizar reaes que fosforilam outras protenas, e finalmente, a fosforilao ativa um fator de transcrio, antes dormente. Esse fator de transcrio pode agora ativar (ou reprimir) um novo conjunto de genes. O ligante iniciador da reao pode estar ligado a uma clula ou matriz extracelular ou, ainda, ser uma molcula difusvel. Quando a molcula difusvel vem do sangue considerada um sinal endcrino. Se o sinal vem de clulas vizinhas difundindo-se de uma para outra chamado parcrino. JAK-STA A via JAK-STAT No Captulo 2 discutimos um conjunto de fatores de transcrio inativos at que um sinal de outra clula produz sua fosforilao. Esses fatores de transcrio so as protenas STAT (transdutores de sinais e ativadores de transcrio) (Ihle,1995, 1996). As STATs so fosforiladas pela forma ativa da uma famlia de quinases, a JAK. A via JAK-STAT muito importante na diferenciao de clulas sangneas e na ativao do gene de casena na produo de leite (Briscoe et al., 1994; Groner e Gouilleux, 1995). Nesses casos, um certo fator de diferenciao se liga a seus receptores membrana-abrangente, fazendo com que esse se dimerize (que forme dmeros) (Figura 3.32). Protenas JAK esto ligadas a cada um dos receptores (em suas respectivas regies citoplasmticas), e agora ao serem aproximadas fosforilam o receptor em vrios stios. Os receptores ativados tm agora sua prpria atividade quinsica e podem fosforilar certos STATs inativos, induzindo sua dimerizao. Os dmeros so a forma ativa dos STAT que so translocados para o ncleo onde se ligam s regies especficas do DNA.

108

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Figura 3.32

Receptores de prolactina

Prolactina

A via JAK-STAT nesse caso, a via de ativao do gene de casena por prolactina. O gene de casena ativado durante a ltima fase do desenvolvimento da glndula mamria (lactognica) e seu sinal a secreo de prolactina, um peptdeo de 9 aminocidos da glndula pituitria anterior. Prolactina causa a dimerizao dos receptores de prolactina nas clulas epiteliais do ducto mamrio. Uma protena JAK especfica (Jak2) est atrelada nesses receptores. Quando os receptores so dimerizados, as protenas JAK fosforilam umas as outras e os receptores vizinhos, ativando a quinase dormente desses receptores. Esses adicionam um grupo fosfato a um resduo de tirosina (Y) de uma protena STAT especfica (nesse caso Stat5). Isso permite que a protena se dimerize e seja translocada para o ncleo onde se liga a regies especficas de DNA. Em combinaes com outros fatores de transcrio (que presumivelmente esperavam sua chegada), a protena STAT ativa a transcrio do gene de casena. GR o glucocorticide receptor, OCT1 um fator de transcrio geral, e TBP o conjunto de protenas responsvel pela ligao de RNA polimerase. (Para detalhes, veja Groner e Gouilleux, 1995.)

Receptores dimerizados ativos

Extracelular

Citoplasma

Envoltrio nuclear

Ncleo

Inicio da transcrio

Promotor do gene de casena

-Ras RTK-R A via RTK-Ras A via de transduo de sinais RTK-Ras foi uma das primeiras vias a unir as vrias reas da biologia do desenvolvimento. Pesquisadores estudando olhos de Drosophila, vulvas de nematdeos e cnceres humanos chegaram concluso que estudavam o mesmo gene. A via RTK-Ras comea na superfcie celular, onde o receptor tirosina quinase liga seu ligante especfico. Ligantes que se ligam a RTKs incluem fatores de crescimento fibroblsticos, fatores de crescimento epidrmico e fatores de crescimento derivados de plaquetas. O receptor tirosina quinase abrange a membrana e, quando conectado com seu ligante, sofre uma mudana conformacional que permite sua dimerizao. Esses dmeros tm uma atividade quinsica latente, ativada por mudana conformacional fazendo com que os receptores se fosforilem um ao outro em resduos particulares de tirosina. Assim, a introduo de um ligante no receptor causa uma autofosforilao no domnio citoplasmtico do receptor. A tirosina fosforilada no receptor reconhecida por uma protena adaptiva (Figura 3.33)especificamente, as tirosinas fosforiladas so reconhecidas por uma poro da protena adaptativa chamada domnio SH2. As protenas adptativas servem como uma ponte que liga a quinase fosforilada do receptor a um poderoso sistema intracelular de sinalizao. Enquanto ligada ao receptor fosforilado pelo seu domnio SH2, a protena adaptativa usa seu domnio SH3 para regular o ativador de uma protena Ras G. Normalmente, a protena de tipo selvagem Ras est na sua forma inativa e ligante de GDP. Quando ativada pelo receptor ligante-acoplado, ela troca um fosfato de outro GTP para transformar o GDP ligado em GTP. Essa catlise ajudada pelo fator de troca guanina nucleotdeo. A Ras ligada a GTP a forma ativa da protena que transmite o sinal. Aps a transmisso, o GTP hidrolizado a GDP. Essa catlise muito estimulada

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

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Ligante Extracelular Citoplasma

Receptor

Figura 3.33

Ativao de eventos dependentes de clcio e PKC Fator de transcrio ativo Fator de transcrio inativo

A via RTK-Ras amplamente usada. O receptor tirosina quinase dimerizado pelo ligante. Isso causa a autofosforilao do receptor. A protena SH3 reconhece as fosfotirosinas e ativa as protenas intermedirias (GRB2 e SOS), as quais ativam a protena Ras G por permitir a fosforilao da poro GDP da Ras. Ao mesmo tempo, as protenas GAP estimulam a hidrlise dessa ligao fosfato. A Ras ativa capaz de ativar a protena quinase C (PKC), que ao seu turno fosforila uma srie de quinases. Por fim, a MAP quinase altera a expresso gnica, fosforilando certos fatores de transcrio (que podem penetrar no ncleo para mudar os tipos de genes transcritos) e certos fatores de traduo (que alteram o nvel de sntese de protenas). Em muitos casos, essa via reforada pela liberao de ons clcio.

Ncleo

Modulao da transcrio

pela complexao normal da protena Ras protena ativadora de GTP-ase (GAP). Essa protena de 120-kDa aumenta a atividade hidrolizante de GTP mais de 100 vezes, e retorna a Ras sua forma inativa (Trahey e McCormick, 1987; Gibbs et al., 1988). Realmente, mutaes no gene RAS esto relacionadas com uma grande proporo de tumores humanos (Shih e Weinberg, 1982), e as mutaes que tornam o gene oncognico inibem a ligao da protena GAP. Sem a protena GAP, a protena Ras no catalisa eficientemente a hidrlise de GTP permanecendo em sua configurao ativa (Cales et al., 1988; McCormick,1989). A protena Ras ativa associa-se com uma quinase chamada Raf. A protena Ras coloca a protena inativa Raf na membrana celular onde ela se torna ativa (Leevers et al.,1994; Stokoe et al., 1994). A protena Raf chamada MAP-quinase-quinase-quinase (MAPKKK). (MAP quer dizer protena associada mitose, mas atualmente considerada como um conjunto maior de fatores de transcrio). A MAPKKK fosforila a MAPKK que, por sua vez, pode fosforilar a MAP quinase. Essa ltima quinase fosforila os fatores de transcrio que especificam o destino da clula ou a proliferao. Em olhos de Drosophila, por exemplo, considera-se que a cascata ativa o fator de transcrio Sina (Sevenless-in-Absentia), cuja presena necessria para a diferenciao do fotorreceptor 7 (Carthew e Rubin, 1990; Dickson et al., 1992). Como veremos mais tarde neste livro, essa via crtica em numerosos processos desenvolvimentais. Em humanos, mutaes nessa via do origem s formas mais comuns de nanismo, incluindo acondroplasia, que ocorre em 1 entre 50.000 nascimentos. Aqui, o trax e a cabea crescem normalmente, mas os braos e as pernas so encurtados proximalmente. A deficincia reside na proliferao mnima da cartilagem da placa de crescimento dos ossos longos. A leso gentica parece estar no gene que

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

codifica o receptor 3 do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR3) (Figura 9.19; Rousseau et al., 1994; Shiang et al., 1994). Esse gene expresso nas clulas da cartilagem em desenvolvimento na placa de crescimento dos ossos longos. Quando ativado por um FGF, o FGFR3 sinaliza o condrcito para parar de dividir e comear a diferenciao. As mutaes nesse gene causam um fentipo de ganho de funo onde o mutante FGFR3 ativo constitutivamente (isto , sem a necessidade de ser ativado por um FGF)* (Deng et al., 1996; Webster e Donoghue, 1996). [cell7.html]

* Nomes podem ser perigosamente ilusivos. Muitos compostos tm mais de uma funo na clula, e o que fazem depende do contexto da clula. Certos fatores de crescimento podem inibir o crescimento, e alguns fatores de transcrio podem ser utilizados para inibir a transcrio. Realmente, alguns fatores de transcrio podem ser usados para regular a traduo. Aqui vemos que molculas de adeso celular podem ser usadas para transduo de sinais. Protenas celulares no respeitam nossas fronteiras disciplinares.

Informaes adicionais

&
(A) FGF

Especulaes

Mutaes negativas dominantes em receptores

significado funcional de uma molcula ligante pode ser verificado eliminando seu receptor. Uma maneira de fazer isso criando mutaes dominantes negativas de receptores. Esse tipo de experimento ser bem sucedido se a dimerizao for crtica para a funo do receptor. Os receptores FGF ativos, em um caso, so dmeros de duas molculas idnticas embebidas na membrana celular. O mutante dominante negativo no formar um dmero ativo, mesmo com um parceiro do tipo selvagem. Portanto, quando presente em concentraes suficientemente altas, o receptor mutante compete com receptores FGF normais impedindo que suas protenas sejam ativadas. Isso pode ocorrer em mutaes naturais ou provocadas. Amaya e colaboradores (1991) injetaram mRNA de uma forma mutante de um receptor FGF em embries de duas clulas de Xenopus. Essas blstulas no conseguem responder ao FGF (Figura 3.34). Nesse experimento, embries que no tinham receptores FGF funcionais tinham mesoderma posterior e lateral dramaticamente reduzido (Prancha 3).

FGFR normal: FGF se liga causando dimerizao do receptor de FGF

(B)

FGFR dominante negativo

Receptor de FGF

FGFR normal

FGFR mutante

Domnio da tirosina quinase

Sinal

Receptores sem domnios intracelulares so inativos Sem sinal

Excesso do receptor mutante pode seqestrar o receptor normal do fator de crescimento. Esse heterodmero inativo. Sem sinal

Figura 3.34

Ensaio para receptor dominante negativo para a importncia de um determinado receptor. O receptor de FGF (FGFR) uma RTK transmembrana. (A) Quando dmeros de FGF se ligam poro extracelular desses receptores, esses se dimerizam e seus dois domnios de protena quinase se fosforilam mutuamente. Quando fosforilados, acionam um sinal atravs do citoplasma. (B) O receptor dominante negativo no tem o domnio da protena quinase. Quando liga FGF, produz um dmero inativo, mesmo se o outro parceiro do tipo selvagem. Assim, o efeito de FGF no transmitido clula.

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

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A via do inositol fosfato Algumas vezes, a transduo de um sinal da superfcie celular causa tantas mudanas, que alteraes na expresso do gene constituem somente um pequeno subconjunto do que faz o sinal. A ativao da via do inositol fosfato promove mudanas drsticas na fisiologia da clula pela liberao de ons clcio do retculo endoplasmtico. Essa via extremamente importante na ativao do espermatozide e do vulo, ambos necessitando de um aumento na concentrao intracelular de ons clcio.

Figura 3.35
(A) Extracelular Fosfolipase C

Citoplasma

A via do inositol fosfato. (A) A reao de fosfolipase C, transformando PIP2 em DAG e IP3. (B) Essa reao pode ser iniciada em dois pontos principais na membrana celular. Primeiro, a via iniciada quando o receptor transmembrana ligado protena G ativado pela introduo do ligante. Essa ativao resulta na ligao de GTP protena heteromrica G e sua dissociao em subunidades ativas. Essas subunidades ativam enzimas fosfolipase C (PLC) que podem catalizar a formao de DAG e IP3. Em segundo lugar, a via pode ser ativada pela via RTK. IP3 pode se ligar a um receptor para liberar ons clcio do retculo endoplasmtico. Neste nterim, DAG (em presena dos ons clcio liberados) ativa a protena quinase C. A protena quinase estimula o transportador sdio/hidrognio a trocar ons hidrognio celulares por ons sdio extracelulares, assim levando a um aumento do pH.

(B) RECEPTORES LIGADOS PROTENA G RECEPTORES LIGADOS TIROSINA QUINASE (PDGF, EGF, etc). Ligante Ligante Extracelular

Citoplasma

Protena G

Via IP 3 PATHWAY PKC Atividade celular e mitognese MAP quinase

Receptor IP 3

Retculo endoplasmtico

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

A via pode ter dois pontos iniciais (Figura 3.35; Berridge, 1993; Shilling et al., 1994). Um ponto de iniciao o receptor tirosina quinase, mencionado anteriormente. Alm de ativar a protena Ras G, as tirosina quinases ativadas podem interagir com um tipo de enzima, fosfolipase C (PLC1-y1, que tambm tem um domnio SH2 que reconhece as tirosinas autofosforiladas). Fosfolipase C pode catalisar a hidrlise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) em dois segundos mensageiros: inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). IP3 capaz de abrir canais de clcio do retculo endoplasmtico, liberando uma grande quantidade de ons clcio no citoplasma. DAG ativa a protena quinase C, que por sua vez ativa a bomba de protena que troca ons sdio por ons hidrognio (Swann e Whitaker, 1986; Nishizuka, 1986). O resultado a elevao de ons intracelulares de clcio e um aumento no pH intracelular. Um segundo ponto de iniciao outra classe de receptores, algumas vezes chamado de receptores serpentina, porque tm sete domnios transmembrana e serpenteiam atravs da membrana. Esses receptores esto relacionados com outro tipo de protena G, a protena G heteromrica. Quando o ligante liga-se ao seu receptor, esse ativa a protena G. Essa ativao dissocia a protena G em suas subunidades, as quais ativam outro conjunto de fosfolipase C, ou seja, PLC-1 e PLC-2. Esses dois tipos de fosfolipase C podem clivar PIP2 em inositol 1,4,5-trifosfato e diacilglicerol. Como veremos em captulos posteriores, as mudanas nos ons hidrognio e clcio, efetuadas por essa via, alteram no somente a transcrio de genes, mas tambm a traduo de mRNA e a replicao de DNA. Cruzamentos entre vias Representamos as vias principais como se fossem cadeias lineares, onde a informao flui em condutes nicos. Na verdade, essas vias so apenas as principais estradas pelas quais se escoa a informao, pois entre elas existem ruas e avenidas que fazem as conexes entre elas. (Essa pode ser a razo da existncia de tantos passos entre a superfcie da clula e o ncleo. Cada passo um ponto de regulao em potencial e um potencial ponto de interseo). Essa comunicao cruzada pode ser vista na Figura 3.35, onde duas vias reforam uma a outra. Deve-se lembrar tambm que a clula tem numerosos receptores e est constantemente recebendo muitos sinais simultaneamente. Em alguns casos, a transcrio de genes requer dois sinais. Isso visto durante o desenvolvimento de linfcitos, onde dois sinais so necessrios, cada um produzindo um dos dois peptdeos de um fator de transcrio envolvido na produo de interleucina 2 (IL-2, tambm conhecida como fator de crescimento da clula T). Um fator, c-Fos, produzido pela ligao do receptor da clula T ao antgeno (Figura 3.36). Isso ativa a cascata Ras, criando um fator de transcrio, Elk-1, ativador do gene c-fos que sintetiza c-Fos. O segundo sinal vem da glicoprotena B7 na superfcie da clula que apresenta o antgeno. Esse sinal ativa uma segunda cascata de quinases, finalmente produzindo c-Jun. Os dois peptdeos, c-Fos e c-Jun, podem produzir a protena AP-1, um fator de transcrio que se liga ao intensificador de IL-2 e ativa sua expresso (Liet al., 1996). A matriz extracelular e a superfcie da clula como fontes de sinais crticos para o desenvolvimento Bissell e colegas (1982; Martins-Green e Bissell, 1995) propuseram que a matriz extracelular capaz de induzir expresso gnica especfica em tecidos em desenvolvimento, especialmente aqueles do fgado e da glndula mamria, onde a induo de fatores de transcrio especficos dependem da ligao clula-substrato (Liu et al., 1991; Streuli et al., 1991; Notenboom et al.1996). Muitas vezes, a presena de integrina ligada previne a ativao de genes que especificam a morte celular (Brooks et al., 1994; Montgomery et al., 1994). Portanto, a matriz extracelular uma fonte importante de sinais que podem ser transduzidos para o ncleo para dar expresso gnica especfica. Estudos recentes mostraram que a ligao de integrinas matriz extracelular

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

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CLULA APRESENTADORA DO ANTGENO

SINAL 1 Citoplasma

SINAL 2

MHC II Antgeno Receptor da clula T B7 CD28

Extracelular

Citoplasma RAF

T-LINFCITO

ELK-1 ativa transcrio de c-fos Intensificador de interleucina 2 Fator de transcrio AP-1

Ncleo Transcrio de IL-2

Figura 3.36

Dois sinais so necessrios para efetuar a diferenciao de linfcitos T. O primeiro sinal vem de receptores que ligam o antgeno apresentado na superfcie das clulas B ou macrfagos. O segundo sinal vem da ligao da protena CD28 protena B7 que est na superfcie da clula apresentante do antgeno. O primeiro sinal dirige a sntese de uma subunidade do fator de transcrio AP-1. A outra subunidade sintetizada sob direo do segundo sinal. As duas subunidades, c-fos e c-jun, formam o fator de transcrio AP-1 que pode ativar intensificadores especficos para a clula T como os que regulam a produo de interleucina 2.

pode estimular a via RTK-Ras, como tambm pode estimular a interao da clula com o L1, N-CAM e caderinas de uma clula vizinha (Bixby et al., 1994; Williams et al., 1994a; Clark e Brugge, 1995). Caderinas (mesmo as solveis) podem dimerizar receptores FGF exatamente como os ligantes normais de FGF, causando a liberao de ons clcio, ativao transcricional e fenmenos de desenvolvimento caractersticos das respostas do FGF celular (Figura 3.37; Williams et al., 1994b; Doherty et al., 1995). Comunicao cruzada quase certa acontecer quando as molculas de adeso celular so tambm transdutores de sinais. Interaes recprocas na superfcie celular Quando duas clulas interagem durante o desenvolvimento, ambas so modificadas na maioria das vezes. Essa induo recproca mediada por interaes na membrana

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PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

Citoplasma

Molcula de adeso celular

Receptor FGF

Extracelular

Citoplasma

Sinal

Figura 3.37

Possveis interaes de molculas de adeso celular com receptores de FGF. Os receptores FGF podem ser seqestrados pelas molculas de adeso e colocados juntos. Isso pode ser feito pela interao de molculas de adeso opostas, ou ligaes cruzadas de receptores de FGF das membranas celulares opostas podem ativar seus domnios quinase.

celular. Uma via intensamente usada o sistema Wingless-Hedgehog. Nessa via, duas clulas (ou grupo de clulas) so adjacentes; uma delas produz a protena Hedgehog e a secreta. O peptdeo age na clula vizinha ocasionando a produo da protena Wingless (Wnt). A protena Wingless, por sua vez, tambm secretada e se liga clula vizinha, estimulando-a a continuar a sntese de Hedgehog. O resultado a estabilizao de uma borda onde o tecido em um lado secreta protena Hedgehog, enquanto o tecido no outro lado produz Wingless. Essa borda crtica na produo de segmentos e apndices em Drosophila, como tambm, subdivises cerebrais e membros em mamferos (Figura 3.38; Ingham, 1994; Niswander et al., 1994; Wilder e Perrimon, 1995). [cell8.html] A superfcie celular um lugar extremamente importante para interaes desenvolvimentais. Essas incluem adeso diferencial de uma clula a outras, a adeso diferencial de um tipo de clula a uma matriz extracelular e a comunicao de sinais para a diferenciao e diviso celulares. Em 1782, o ensaista francs Denis Diderot ps a questo da morfognese no sonho febril de um fsico. Esse elemento podia imaginar que o corpo era formado por uma mirade de pequenos corpos sensveis que se juntavam para formar um agregado, mas ele no podia imaginar como esse agregado poderia se tornar um animal. Estudos recentes mostraram que essa ordenao devida s molculas na superfcie dessas clulas. Em captulos subseqentes, veremos com mais detalhes essas interaes morfogenticas. Estamos agora no estgio onde podemos iniciar o estudo da embriognese precoce e ver a integrao entre os processos orgnicos, genticos e celulares no desenvolvimento animal.

CAPTULO 3 A base celular da morfognese

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Receptor Frizzled

Wingless / protena Wnt

Protena DPP

Figura 3.38

Prot. Dishevelled Quinase Zw3 Prot. Armadillo (-catenina)

wingless patched decapentaplegic

engrailed hedgehog Protena engrailed

Protena Smoothened

Ci ativo Ci inativo Protena G

Interaes recprocas entre clulas na via wingless-hedgehog em Drosophila. A protena Wingless secretada por uma clula e se difunde a uma curta distncia. A clula vizinha liga a protena Wingless originando a ativao da protena, que bloqueia a ao inibidora da quinase Zeste-white-3 sobre a protena Armadillo (uma catenina). A protena Armadillo ativada induz a clula a transcrever o gene hedgehog (hh). Essa protena secretada e ligada pela clula vizinha. Ligando a protena Hedgehog faz com que a clula transcreva o gene wingless e secrete a protena.

Receptor Patched Protena Hedgehog

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118

PARTE I Introduo Biologia do Desenvolvimento

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Padres de Desenvolvimento
4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo 5 Clivagem: Criando multicelularidade 121 167 209

II
253 341

6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

7 Incio do desenvolvimento vertebrado: Neurulao e ectoderma 8 Especificidade axnica 307

9 Incio do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

121

Fertilizao: Iniciando um novo organismo

Desejo e desejo e desejo Sempre o desejo procriativo do mundo. Saindo da obscuridade iguais opostos avanam, Sempre substncia e aumento, sempre sexo, Sempre uma tessitura de identidade, sempre distino, Sempre uma criao de vida.
WALT WHITMAN (1855)

ERTILIZAO (FECUNDAO) o processo pelo qual duas clulas sexuais

O objetivo final de todas as intrigas amorosas, sejam elas cmicas ou trgicas, na realidade mais importante que todas as outras finalidades na vida humana. Ele se volta para nada menos que a composio da prxima gerao.
A SCHOPENHAUER (CITADO POR C. DARWIN, 1871)

(gametas) se fundem para criar um novo indivduo com potenciais genticos derivados dos dois genitores. A fecundao, portanto, realiza duas atividades separadas: sexo (a combinao de genes derivados dos dois pais) e a reproduo (criao de novos organismos). Assim, a primeira funo da fecundao a de transmitir genes dos pais para a prole, e a segunda a de iniciar no citoplasma do ovo aquelas reaes que permitem o desenvolvimento. Embora os detalhes da fecundao variem de espcie para espcie, os eventos da concepo consistem, em geral, de quatro atividades principais: Contato e reconhecimento entre espermatozide e vulo. Na maioria dos casos, isso assegura que o espermatozide e o vulo sejam da mesma espcie. Regulao da entrada do espermatozide para o interior do vulo. Somente um espermatozide pode, em ltima anlise, fecundar um vulo. Isso geralmente conseguido com a permisso de somente um espermatozide entrar no vulo e a inibio da entrada de qualquer outro. Fuso do material gentico do espermatozide e do vulo. Ativao do metabolismo do ovo para comear o desenvolvimento.

Estrutura dos gametas


Existe um dilogo complexo entre vulo e espermatozide. O vulo ativa o metabolismo do espermatozide que essencial para a fecundao, e o espermatozide retorna a mensagem ativando o metabolismo do vulo necessrio para o incio do desenvolvimento. Porm, antes de investigar esses aspectos da fecundao, temos que considerar as estruturas do espermatozide e do vulo dois tipos de clulas especializadas para a fertilizao. Espermatozide Foi somente no sculo XIX que o papel do espermatozide na fertilizao tornou-se conhecido. Anton van Leeuwenhoek, o microbiologista holands que co-descobriu o espermatozide em 1678, acreditou inicialmente que ele continha animais parasitas vivendo em seu interior (da o termo espermatozides, significando animais do esperma). Assumiu originalmente que esses nada tinham a haver com a reproduo do organismo onde se encontravam, porm, posteriormente chegou a acreditar que cada espermatozide continha um embrio pr-formado. Leeuwenhoek (1685) escreveu que 121

122

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Figura 4.1

A criana humana pr-formada no espermatozide, conforme representada por Nicolas Hartsoeker (1964).

espermatozides eram sementes (tanto sperma como smen significam semente), e que a fmea meramente proporcionava o solo nutriente no qual as sementes eram plantadas. Sob esse aspecto, ele estava voltando a uma noo da procriao enunciada por Aristteles 2000 anos antes. Por mais que tentasse, Leeuwenhoek era continuamente desapontado em suas tentativas de achar um embrio pr-formado nos espermatozides. Nicolas Hartsoeker, o outro co-descobridor do espermatozide, desenhou uma figura do que pretendia encontrar: um ser humano pr-formado (homnculo) dentro do espermatozide (Figura 4.1). Essa crena de que o espermatozide continha um organismo embrionrio inteiro, nunca recebeu muita aceitao, porque implicava num enorme desperdcio de vida em potencial. A maioria dos investigadores consideravam o espermatozide como sem importncia (Veja Pinto-Correia, 1997, para detalhes sobre essa extraordinria histria). [fert1.html] A primeira evidncia sugerindo a importncia do espermatozide na reproduo veio de uma srie de experimentos realizados por Lazzaro Spallannzani em fins de 1700. Spallanzani demonstrou que smen filtrado de r, livre de espermatozide, no fecundava vulos. Concluiu, porm, que o fluido viscoso retido pelo papel de filtro, e no o espermatozide, era o agente da fertilizao. Ele acreditava, tambm, que os animais espermticos eram parasitas. A combinao das melhores lentes de microscpio e da teoria celular, levaram a uma reapreciao da funo espermtica. Em 1924, J. L. Prevost e J. B. Dumas afirmaram que os espermatozides no eram parasitas, mas sim os agentes ativos da fertilizao. Notaram a existncia universal de espermatozides em machos sexualmente maduros e sua ausncia em indivduos imaturos ou idosos. Essas observaes, acopladas conhecida ausncia de espermatozides na mula estril, os convenceram que existe uma ntima relao entre sua presena nos rgos e a capacidade fecundadora do animal. Eles propuseram que o espermatozide penetra o vulo e contribui materialmente para a gerao seguinte. Essas assertivas no foram em geral levadas em considerao at a dcada de 1840, quando A. von Kolliker descreveu a formao do espermatozide a partir de clulas contidas em testculos adultos. Kolliker ridicularizou a idia que o smen poderia ser normal e ainda assim tolerar a presena de um nmero enorme de parasitas. Mas ainda assim, negou que haveria qualquer contato fsico entre espermatozide e vulo. Acreditava que o espermatozide excitava o desenvolvimento do vulo de maneira semelhante aquela pela qual o m comunica sua presena ao ferro. Somente em 1876, Oscar Hertwig e Hermann Fol, independentemente, demonstraram a entrada do espermatozide no vulo e a unio de seus ncleos. Hertwig procurou um organismo adequado para observaes microscpicas detalhadas e descobriu que o ourio-do-mar Mediterrneo, Toxopneustes lividus, era perfeito para isso. No somente era freqente na regio e sexualmente maduro a maior parte do ano, como seus vulos eram abundantes e transparentes, mesmo sob alto aumento. Aps misturar espermatozide e vulo em suspenses, Hertwig repetidas vezes observou o espermatozide entrando no vulo e viu a unio dos ncleos dessas clulas. Notou tambm que apenas um espermatozide era visto penetrar em cada vulo e que todos os ncleos do embrio derivavam dos ncleos fundidos por ocasio da fertilizao. Fol fez observaes semelhantes e detalhou o mecanismo de penetrao do espermatozide. A fertilizao estava finalmente reconhecida como a unio de espermatozide e vulo, e a unio dos gametas do ourio-do-mar permanece como um dos exemplos de fertilizao melhor estudado. [fert2.html] Cada espermatozide consiste de um ncleo haplide, um sistema de propulso para movimentar o ncleo, e um saco de enzimas que permitem a entrada do ncleo no vulo. A maior parte do citoplasma do espermatozide eliminada durante o amadurecimento, deixando somente certas organelas modificadas para exercer a funo espermtica (Figura 4.2). Durante o transcorrer do amadurecimento, o ncleo haplide se torna muito aerodinmico e seu DNA altamente comprimido. Na parte frontal desse ncleo haplide comprimido est a vescula acrossmica, derivada do aparelho de Golgi, contendo enzimas que digerem protenas e acares complexos; por isso, pode

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

123

ser considerado como uma vescula secretria modificada. Essas enzimas armazenadas so usadas para lisar os invlucros externos do vulo. Em muitas espcies, tais como os ourios-do-mar, existe uma regio de molculas globulares de actina entre o ncleo e a vescula acrossmica. Essas protenas so usadas para estender um processo de forma semelhante a um dedo durante os estgios precoces da fertilizao. Em ourios-do-mar e vrias outras espcies, o reconhecimento mtuo entre espermatozide e vulo envolve molculas desse processo acrossmico. Juntos, o acrossomo e o ncleo constituem a cabea do espermatozide. Os meios pelos quais o espermatozide impulsionado variam de acordo com o modo pelo qual a espcie se adaptou s condies ambientais. Em algumas espcies (como o nematelminto parasitrio Ascaris), o espermatozide viaja por movimentao amebide de extenses lamelipodiais da membrana celular. Na maioria das espcies, porm, um espermatozide capaz de viajar por longas distncias agitando o seu flagelo. Os flagelos so estruturas complexas. A sua principal poro motora chamada axonema. Um axonema formado pelos microtbulos que emanam do centrolo na base do ncleo do espermatozide (Figuras 4.2 e 4.3). O centro do axonema consiste de dois tbulos centrais rodeados por uma fileira de nove duplas de microtbulos. Realmente, s um microtbulo est completo, contendo 13 protofilamentos; o outro tem forma de C e tem apenas 11 protofilamentos (Figura 4.3B). Um modelo tridimensional de um microtbulo completo est apresentado na Figura 4.3C. Aqui vemos os 13 protofilamentos interligados; os quais consistem exclusivamente da protena dimrica, a tubulina. Embora a tubulina seja a base da estrutura do flagelo, outras protenas tambm so crticas para a funo do flagelo. A fora para a propulso do espermatozide proporcionada pela dinena, uma protena apensa aos microtbulos (Figura 4.3B). A dinena hidrolisa molculas de ATP e pode converter a energia qumica liberada em

Golgi remanescente

Centrolo Flagelo Centrolo Flagelo Vescula acrossmica e grnulo Ncleo Mitocndrias Cauda Microtbulos Poro final

Aparelho de Golgi Mitocndrias

Figura 4.2
Axonema Mitocndrias Centrolo Ncleo Membrana plasmtica Vescula acrossmica Poro mediana Pescoo Cabea do espermatozide

A modificao de uma clula germinativa para formar um espermatozide de mamfero. O centrolo produz um longo flagelo na parte que vir a ser a extremidade posterior do espermatozide, e o aparelho de Golgi forma a vescula acrossmica na futura extremidade anterior. As mitocndrias (pontos abertos) agrupam-se ao redor do flagelo perto da base do ncleo haplide e so incorporadas na parte mediana do espermatozide. O citoplasma remanescente descartado e o ncleo se condensa. O tamanho do espermatozide maduro foi aumentado em relao s outras figuras. (Segundo Clermont e Leblond, 1955.)

124

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Figura 4.3 O aparelho de movimentao do espermatozide. (A) Seo transversal do flagelo de um espermatozide mamfero, mostrando o axonema central e as fibras externas. (B) Diagrama interpretativo do axonema, mostrando o arranjo 9 + 2 dos microtbulos e outros componentes flagelares. O diagrama esquemtico mostra a associao de protofilamentos de tubulina em um microtbulo duplo. A primeira (A) poro do par duplo um microtbulo normal compreendendo 13 protofilamentos. A segunda (B) poro da dupla contm somente 11 (ocasionalmente 10) protofilamentos. (C) Um modelo tridimensional do microtbulo A. As subunidades -tubulina e -tubulina so semelhantes, porm, no idnticas, e o microtbulo pode mudar de tamanho polimerizando e despolimerizando subunidades de tubulina em qualquer um dos lados. (A cortesia de D. M. Phillips; B segundo De Robertis et al., 1975, e Tilney et al., 1973; C de Amos e Klug, 1974, cortesia dos autores.)

(A)

(C)

(B) Membrana plasmtica Trave radial Cabea da trave Nexina Subfibra A Subfibra B Microtbulo central MICROTBULO DUPLO

Brao interno de dinena Brao externo de dinena AXONEMA

energia mecnica que propulsiona o espermatozide. Essa energia pemite o deslizamento ativo das duplas externas de microtbulos, levando o flagelo a se curvar (Ogawa et al., 1977; Asai, 1996). A importncia da dinena pode ser avaliada em indivduos com a sndrome gentica chamada de trade de Kartagener. Esses indivduos no tm dinena em suas clulas ciliadas e flageladas, o que as torna estruturas imveis. Machos com essa doena so estreis (espermatozide imvel), susceptveis infees brnquicas (clios respiratrios imveis), e tm 50 porcento de probabilidade de ter o corao do lado direito de seu corpo (Afzelius, 1976). Outra importante protena flagelar parece ser a histona H1. Essa protena geralmente vista dentro do ncleo, onde dobra e aperta a cromatina em agregados. No entanto, Multigner e colaboradores (1992), mostraram que essa mesma protena estabiliza os microtbulos flagelados impedindo seu espalhamento. O arranjo 9 + 2 dos microtbulos com os braos de dinena foi conservado nos axonemas em todo o reino eucarioto, sugerindo que extremamente adequado na transmisso de energia para a movimentao. A energia para mover o flagelo e assim impulsionar o espermatozide vem dos anis de mitocndrias localizadas na regio do pescoo do espermatozide (veja Figura 4.2). Em muitas espcies (notavelmente mamferos) uma densa camada de fibras se interps entre a bainha mitocondrial e o axonema. Essa camada fibrosa enrijece a cauda do espermatozide. Como sua espessura diminui na direo apical, as fibras provavelmente previnem que a cabea

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

125

do espermatozide balance abruptamente. Assim, o espermatozide sofreu extensa modificao para assegurar a passagem de seu ncleo para o vulo. Entretanto, a diferenciao do espermatozide no se completa nos testculos. Aps sua expulso para a luz dos tbulos seminferos, os espermatozides so armazenados no epiddimo, onde adquirem a capacidade de se mover. Essa mobilidade conseguida atravs de mudanas no sistema gerador de ATP (possivelmente atravs da modificao da dinena), assim como de alteraes da membrana plasmtica que permitem que ela se torne mais fluida (Yanagimachi, 1994). Os espermatozides liberados durante a ejaculao podem se mover, mas ainda no tm a capacidade de se ligar ao vulo e fertiliz-lo. Esses estgios finais do amadurecimento espermtico (chamado capacitao) no ocorrem antes do espermatozide ter permanecido no interior do trato reprodutivo feminino durante um certo tempo. O vulo Todo o material necessrio para o comeo do crescimento e desenvolvimento tem que estar armazenado no vulo maduro. Enquanto o espermatozide eliminou a maior parte do seu citoplasma, o vulo em desenvolvimento (chamado de ocito antes de tornar-se haplide) no somente conserva seu material, mas continua a acumul-lo ativamente. Sintetiza ou absorve protenas, como a gema, que atuam como reservatrios de alimento para o embrio em desenvolvimento. Assim, gametas femininos das aves so enormes clulas singulares que se tornaram entumecidas pela acumulao de gema. Mesmo vulos com gema relativamente esparsa so comparativamente grandes. O volume do vulo do ourio-do-mar de aproximadamente 2 x 10-4 m3, mais de 10.000 vezes aquele do espermatozide. A representao do vulo do ourio-do-mar e do espermatozide na Figura 4.4 mostra seus tamanhos relativos, assim como os vrios componentes do vulo maduro. Assim, enquanto o espermatozide e o vulo tm componentes nucleares haplides iguais, o vulo tem ainda um notvel reservatrio citoplasmtico acumulado durante seu amadurecimento. Esse armazm citoplasmtico inclui protenas, RNAs, substncias qumicas protetoras e fatores morfogenticos:* Protenas. Ser longo o perodo a transcorrer antes do embrio ser capaz de se alimentar ou obter alimento de sua me. As clulas embrionrias precoces precisam de um certo suprimento armazenvel de energia e aminocidos. Em muitas espcies isso conseguido pelo acmulo de protenas na gema do ovo. Muitas protenas da gema so sintetizadas em outros rgos (fgado, corpo gorduroso) e viajam atravs do sangue materno para o ovo. Ribossomos e tRNA. O embrio precoce precisa produzir muitas de suas prprias protenas; em algumas espcies, ocorre um surto de sntese protica pouco aps a fecundao. A sntese protica conseguida pelos ribossomos e tRNA, preexistentes no vulo. O vulo em desenvolvimento tem mecanismos especiais para sintetizar ribossomos, e certos ocitos de anfbios produzem at 1012 ribossomos durante a prfase meitica. RNA mensageiro. Na maioria dos organismos, as mensagens para protenas sintetizadas durante o desenvolvimento inicial j esto acondicionadas no ocito. Estima-se que os vulos do ourio-do-mar contm de 25.000 a 50.000 tipos diferentes de mRNA. Porm, esse mRNA permanece dormente at aps a fertilizao (veja Captulo 12). Fatores morfogenticos. Essas molculas dirigem a diferenciao celular em certos tipos de clulas. Parecem estar localizadas em diferentes regies do vulo e se segregam em clulas diferentes durante a clivagem (veja Captulo 13).

* Os contedos do vulo variam muito de espcie para espcie. A sntese e a colocao desses materiais ser tratada no Captulo 22, quando discutirmos a diferenciao das clulas germinativas.

126

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Figura 4.4

Estrutura do vulo do ourio-do-mar durante a fertilizao. (Segundo Epel, 1977.)

Envoltrio vitelnico Camada gelatinosa Espermatozide

Membrana plasmtica Grnulo de gema Grnulo cortical

Mitocndria

Ncleo

Substncias qumicas protetoras. O embrio no pode fugir de predadores ou movimentar-se para um ambiente mais seguro, necessitando, por isso, estar equipado para enfrentar esses fatores. Muitos vulos contm filtros ultravioleta e enzimas de reparos de DNA que os protegem da luz solar; alguns vulos contm molculas que predadores potenciais acham desagradveis; a gema de vulos de aves contm at mesmo anticorpos. [fert3.html] Dentro desse enorme volume de citoplasma reside um grande ncleo. Em algumas espcies (por exemplo, ourios-do-mar), o ncleo j haplide no momento da fertilizao. Em outras espcies (incluindo muitos vermes e a maioria dos mamferos), o ncleo do vulo ainda diplide, e o espermatozide penetra antes das divises meiticas estarem completas. O estgio do ncleo do vulo no momento da entrada do espermatozide est ilustrado na Figura 4.5. Envolvendo o citoplasma est a membrana plasmtica do vulo. Essa membrana deve regular o fluxo de certos ons durante a fertilizao e deve ser capaz de se fundir com a membrana plasmtica do espermatozide. Acima da membrana plasmtica est o envoltrio vitelnico (Figura 4.6). O componente principal desse envoltrio forma uma esteira fibrosa sobre o vulo. Essa esteira suplementada por extenses de glicoprotenas da membrana plasmtica e pontes proteinceas vitelnicas que aderem a esteira membrana (Mozingo e Chandler, 1991). O envoltrio vitelnico essencial para a ligao espcie-especfica do espermatozide. Nos mamferos, o envoltrio vitelnico uma matriz extracelular separada e grossa chamada zona pelcida. O vulo do mamfero tambm rodeado por uma camada de clulas, as clulas do cumulus (Figura 4.7). A camada cumular representa clulas foliculares ovarianas que estavam alimentando o vulo quando da sua liberao do ovrio. O espermatozide dos mamferos tem que passar por essas clulas para fertilizar o vulo*. Imediatamente abaixo da membrana plasmtica do vulo est uma fina casca (de aproximadamente 5m) de um citoplasma gel-smile chamado de crtex. O citoplasma nessa regio mais duro que o citoplasma interno e contm altas concentraes de molculas globulares de actina. Durante a fertilizao, essas molculas polimerizam-se
*Em mamferos, as coberturas extracelulares do vulo esto divididas em duas regies: A zona pelcida e o cumulus. O termo corona radiata refere-se quelas clulas foliculares imediatamente adjacentes zona pelcida; so as clulas mais internas do cumulus.

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

127

Vescula germinal

Corpos polares

Proncleo feminino

Ocito primrio jovem Os vermes aneldeos Dinophilus e Sacocirrrus O verme poliqueta Histriobdella O platelminto Otomesostoma O onicforo Peripatopsis

Ocito primrio totalmente crescido O nematelminto Ascaris O mesozorio Dicyema A esponja Grantia O verme poliqueta Myzostoma O verme concha Nereis O molusco Spisula O verme equiuride Urechis Ces e raposas

Primeira metfase

Segunda metfase

Meiose completa

O verme nemerteano Cerebratulus O verme poliqueta Chaetopterus O molusco Dentalium O verme central Pectinaria Muitos insetos Estrela-do-mar

O anfioxo Branchiostoma Anfbios Mamferos (maioria) Peixes

Cnidrios (e.g., anmonas) Ourios-do-mar

Figura 4.5

para formar longos fios de actina conhecidos como microfilamentos. Microfilamentos so necessrios para a diviso celular, e so tambm usados para estender a superfcie do vulo para o interior das microvilosidades, que ajudam a entrada do espermatozide para dentro da clula (veja Figura 4.6; veja tambm a Figura 4.19). Ainda, dentro desse crtex esto os grnulos corticais (veja Figuras 4.4 e 4.6). Essas estruturas

Estgios de maturao do vulo no momento da entrada do espermatozide em diferentes animais. (Segundo Austin, 1965.)

Microvilosidades

Envoltrio vitelnico

(A)

(B)

Grnulo cortical

Figura 4.6

A superfcie do vulo do ourio-do-mar. (A) Micrografia eletrnica de varredura de um vulo antes da fertilizao. A membrana plasmtica est exposta onde o envoltrio vitelnico foi retirado. (B) Microfotografia eletrnica de transmisso de um ovo no-fertilizado, mostrando microvilosidades e a membrana plasmtica, que esto estreitamente cobertas pelo envoltrio vitelnico. Um grnulo cortical aparece diretamente abaixo da membrana plasmtica do vulo. (de Schroeder, 1979, cortesisa de T. E. Schroeder.)

128

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Cumulus

vulo

Zona pelcida

(A)

(B)

Figura 4.7

vulos de hamster imediatamente antes da fecundao. (A) O ovo do hamster, ou vulo, est encaixado na zona pelcida. Essa, por sua vez, est envolvida por clulas do cumulus. Uma clula do corpo polar, produzida durante a meiose, tambm est dentro da zona pelcida. (B) Em menor aumento, um ocito de camundongo mostrado em relao ao cumulus. Partculas de carbono coloidal (tinta Nanquim) so excludas pela matriz de hialuronidase. (Cortesia de R. Yanagimachi.)

ligadas membrana so homlogas vescula acrossmica do espermatozide, sendo organelas derivadas do Golgi contendo enzimas proteolticas. No entanto, enquanto cada espermatozide contm uma vescula acrossmica, cada vulo do ourio-do-mar contm aproximadamente 15.000 grnulos corticais. Alm das enzimas digestivas, os grnulos corticais tambm contm mucopolissacardeos, glicoprotenas adesivas e protena hialina. As enzimas e os mucopolissacardeos atuam na preveno da entrada de outros espermatozides no vulo aps a entrada do primeiro, e as protenas hialinas e adesivas envolvem o embrio precoce providenciando apoio aos blastmeros do estgio de clivagem. Muitos tipos de vulos tm uma gelia no exterior do seu envoltrio vitelnico (Figura 4.4). Essa rede de glicoprotenas pode ter numerosas funes, mas principalmente usada para atrair ou ativar o espermatozide. O vulo, portanto, uma clula especializada para receber o espermatozide iniciando o desenvolvimento.

Reconhecimento do vulo e do espermatozide: Ao distncia


Muitos organismos marinhos liberam seus gametas para o ambiente. Esse ambiente pode ser to pequeno quanto uma poa de mar ou to grande como o oceano. Alm disso, esse ambiente compartilhado com outras espcies que podem liberar suas clulas sexuais no mesmo perodo. Esses organismos enfrentam dois problemas: 1) Como podem espermatozides e vulos se encontrarem quando em concentraes to diludas, e 2) que mecanismo inibe o espermatozide da estrelado-mar tentar fertilizar os vulos do ourio-do-mar? Dois mecanismos principais evoluram para resolver essas dificuldades: atrao e ativao espcie-especfica do espermatozide. Atrao do Espermatozide A atrao espcie-especfica do espermatozide (um tipo de quimiotaxia) foi documentada em numerosas espcies, incluindo cnidrios, moluscos, equinodermos e urocordados (Miller, 1985; Yoshida et al., 1993). Em 1978, Miller demonstrou que os vulos do cnidrio Orthopyxis caliculata no somente secretam um fator quimiottico mas tambm regulam o perodo de sua liberao. Ocitos em desenvolvimento, em

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

129

(A)

(B)

(C)

(D)

Figura 4.8

vrios estgios de amadurecimento, foram fixados sobre lminas microscpicas, e espermatozides foram adicionados a uma certa distncia dos vulos. Miller encontrou que quando o espermatozide era adicionado a ocitos que ainda no haviam completado sua segunda diviso meitica, no havia atrao de espermatozide pelos vulos. Porm, aps o trmino da segunda diviso meitica e os vulos estarem prontos para ser fertilizados, o espermatozide migrava em sua direo. Assim, esses ocitos no controlam somente o tipo de espermatozide que atraem, mas tambm o momento em que o atraem. Os mecanismos de quimiotaxia so diferentes em outras espcies (veja Metz, 1978; Ward e Kopf, 1993). Uma dessas molculas quimiotticas, um peptdio de 14 aminocidos chamado resact foi isolado da gelia do vulo do ourio-do-mar Arbacia punctulata (Ward et al., 1985). Resact difunde facilmente na gua do mar e tem um profundo efeito quando adicionado a uma suspenso de espermatozide de Arbacia, mesmo em concentrao muito baixa (Figura 4.8). Quando uma gota de gua do mar, contendo espermatozide de Arbacia, colocada em uma lmina de microscpio, o espermatozide geralmente nada em crculos de aproximadamente 50 m de dimetro. Se uma quantidade mnima de resact for introduzida na gota, em segundos o esperma migra para a regio da injeo e ali se congrega. medida que o resact continua a difundir-se, mais espermatozide recrutado para dentro do crescente agrupamento. Resact especfico para A. punctulata e no atrai espermatozide de outras espcies. Espermatozide de A. punctulata liga resact a receptores na sua membrana celular (Ramarao e Garbers, 1985; Bentley et al., 1986) e pode nadar atravs de um gradiente crescente de concentrao desse composto at alcanar o vulo. Resact tambm age como um peptdio ativador de espermatozide. Esses peptdios (mais de 70 foram isolados de diferentes espcies de ourios-do-mar) causam aumentos dramticos e imediatos da motilidade espermtica e do consumo de oxignio (Hardy et al., 1994). O receptor para resact uma protena transmembrana. Quando ela liga o resact ao lado externo da clula, resact causa uma mudana conformacional que ativa a atividade de guanidil ciclase no lado citoplasmtico. Isso aumenta a concentrao de GMP cclico do vulo (Shimomura et al., 1986), que parece ativar a ATPase da dinena estimulando a agitao da cauda no espermatozide (Cook e Babcock, 1993). Ativao Espermtica: A Reao Acrossmica no Ourio-do-Mar Uma segunda interao entre espermatozide e vulo envolve a ativao do espermatozide pela gelia do vulo. Na maioria dos invertebrados marinhos, essa reao acrossmica tem dois componentes: a fuso da vescula acrossmica com a membrana plasmtica do espermatozide (uma exocitose que resulta na liberao dos componentes da vescula acrossmica) e a extenso do processo acrossmico (Figura 4.9; Colwin e Colwin, 1963). A reao acrossmica pode ser iniciada pela gelia do vulo solubilizada, pela gelia que envolve o vulo, ou mesmo em certas espcies, pelo contato com o prprio vulo. Tambm pode ser ativada artificialmente pelo aumento da concentrao de clcio na gua do mar.

Quimiotaxia do espermatozide em Arbacia. Um nanolitro de uma soluo 10-nM de resact injetado em uma gota de 20ml de suspenso de espermatozide. A posio da micropipeta est indicada em (A). (A) Uma fotografia de 1 segundo, mostrando espermatozide nadando em crculos estreitos antes da adio de resact. (B-D) Exposies semelhantes de 1 segundo mostrando a migrao do espermatozide para o centro do gradiente de resact 20, 40 e 90 segundos aps a injeo. (de Ward et al., 1985, cortesia de V. D. Vacquier.)

130

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Membrana acrossmica Enzimas acrossmicas Membrana do espermatozide Actina globular Bindina

Microfilamentos de actina

Ncleos

Figura 4.9

Reao acrossmica em espermatozide de equinoderma. (A-C) A poro da membrana acrossmica diretamente abaixo da membrana do espermatozide funde-se com essa liberando o contedo da vescula acrossmica. (D) Enquanto as molculas de actina se agregam para produzir microfilamentos, o processo acrossmico se estende para fora. Fotografias reais da reao acrossmica no espermatozide do ourio-do-mar so mostradas em seguida. (Segundo Summers e Hylander, 1974; fotografias por cortesia de G. L. Decker e W. J. Lennarz.)

Em ourios-do-mar, o contato com a gelia do vulo causa a exocitose da vescula acrossmica e a liberao de enzimas digestoras de protenas que podem digerir um caminho atravs da gelia de revestimento at a superfcie do vulo (Dan, 1967; Franklin, 1970; Levine et al., 1978). A seqncia desses eventos est esquematizada na Figura 4.9. A reao acrossmica considerada ser iniciada por um oligossacardeo ligado a uma protena na gelia do vulo que permite a entrada de clcio na cabea do espermatozide (SeGall e Lennarz, 1979; Schackmann e Shapiro, 1981; Keller e Vacquier, 1994 a,b). A exocitose da vescula acrossmica causada por uma fuso, mediada pelo clcio, da membrana acrossmica com a membrana plasmtica adjacente do espermatozide (Figuras 4.9 e 4.10). Essa exocitose permite que a vescula acrossmica libere seu contedo na cabea do espermatozide*. A segunda parte da reao acrossmica envolve a extenso do processo acrossmico (veja Figura 4.9). Essa protruso se origina da polimerizao de molculas globulares de actina em filamentos de actina (Tilney et al., 1978). A exposio do espermatozide do ourio-do-mar gelia do vulo tambm ocasiona a rpida utilizao de ATP e um aumento de 50% da respirao mitocondrial. A energia gerada usada primordialmente para motilidade flagelar (Tombes e Shapiro, 1985). Os fatores da gelia do vulo que iniciam a reao acrossmica em ourios-do-mar so muitas vezes muito especficos. Os espermatozides dos ourios-do-mar Arbacia punctulata e Strongylocentrotus drobachiensis reagem somente com a gelia de seus prprios vulos. No entanto, o espermatozide de S. purpuratus tambm pode ser ativado pela gelia de Lytechinus variegatus (mas no de A. punctulata) (Summers e Hylander, 1975). Portanto, a gelia do vulo pode prover reconhecimento espcieespecfico em algumas espcies, mas no em outras.
* Tais reaes exocitticas podem ser vistas na liberao de insulina das clulas pancreticas e na liberao de neurotransmissores de terminais sinpticos. Em todos os casos, h uma fuso mediada pelo clcio entre a vescula secretria e a membrana celular. Realmente, a semelhana entre a exocitose da vescula acrossmica e a exocitose da vescula sinptica pode ser bastante profunda. Estudos recentes de reaes acrossmicas em ourios-do-mar e mamferos (Florman et al., 1992; Gonzlez-Martnez et al., 1992) sugerem que quando os receptores para os ligantes ativadores do espermatozide ligam essas molculas, causam a despolarizao da membrana que poderia abrir canais de clcio voltagem-dependentes de maneira reminescente transmisso sinptica. As protenas que atracam os grnulos corticais membrana celular tambm parecem ser homlogas quelas usadas na ponta do axnio (Bi et al., 1995).

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

131

Membrana celular do espermatozide Membrana acrossmica Fuso entre a membrana celular do espermatozide e a membrana acrossmica adjacente

Ncleo

Centrolo

Figura 4.10

Reao acrossmica em espermatozide de hamster. (A) Micrografia de transmisso eletrnica de um espermatozide de hamster passando pela reao acrossmica. A membrana acrossmica pode ser vista formando vesculas. (B) Diagrama interpretativo de micrografias eletrnicas mostrando a fuso de membranas acrossmica e celular na cabea do espermatozide. (A de Meizel, 1948, cortesia de S. Meizel; B, segundo Yanagimachi e Noda, 1970.)

Informaes adicionais

&

Especulaes

Ao Distncia: Gametas de Mamferos


MUITO DIFCIL estudar as interaes que podem estar ocorrendo entre gametas de mamferos antes do contato espermatozide-vulo. Um motivo bvio para isso que a fertilizao ocorre dentro dos ovidutos femininos. Embora seja relativamente fcil mimetizar as condies rodeando a fertilizao do ourio-do-mar (usando gua do mar natural ou artificial), ainda no conhecemos os componentes dos vrios ambientes naturais encontrados pelo espermatozide dos mamferos em sua viajem ao encontro do vulo. Um segundo motivo para essa dificuldade que a populao de espermatozide ejaculada para o interior da fmea provavelmente muito heterognea, contendo espermatozides em diferentes estgios de amadurecimento. Dos 280 x 106 espermatozides humanos normalmente ejaculados para o interior da vagina, somente 200 atingem a regio ampolar do oviduto, onde ocorre a fecundao (Ralt et al., 1991). Como menos de 1 em 10.000 espermatozides chegam perto do vulo, difcil analisar aquelas mol-

culas que permitem aos espermatozides nadar em direo ao vulo e serem ativados. H muita controvrsia em relao ao deslocamento do espermatozide mamfero at o oviduto, a capacitao e as reaes de hiperativao que parecem ser necessrias em algumas espcies para lig-lo ao vulo, e a possibilidade que o vulo possa estar atraindo o espermatozide por quimiotaxia. Translocao e Capacitao O trato reprodutivo de mamferos femininos exerce um papel muito ativo no processo de fertilizao. Enquanto a motilidade espermtica necessria para que o espermatozide do camundongo, uma vez no oviduto encontre o ovo, a motilidade espermtica provavelmente um fator de menor importncia para entrar no oviduto. O espermatozide encontrado no oviduto de camundongos, hamsters, cobaia, vacas e seres humanos dentro de 30 minutos aps a deposio, um perodo demasiadamente curto para ser atingido at mesmo pelo espermatozide mais olm-

pico, se confiar somente no poder de seus flagelos (Storey, 1995). mais provvel que o espermatozide seja transportado para o oviduto por meio da atividade muscular do tero. Espermatozide mamfero recm-ejaculado incapaz de sofrer a reao acrossmica sem ter residido por algum tempo no trato reprodutivo feminino (Chang, 1951; Austin, 1952). Esse requisito para capacitao varia de espcie para espcie (Gwatkin, 1976) e pode ser mimetizado in vitro pela incubao de espermatozide em meios de cultura de tecidos (contendo ons de clcio, bicarbonato e soroalbumina) ou em fluido dos ovidutos. Os espermatozides que no foram capacitados so segurados na matriz cumular, no atingindo assim o vulo (Austin, 1960; Corselli e Talbot, 1987). As alteraes moleculares que explicam a capacitao ainda so desconhecidas (veja Yanigamachi, 1994), mas existem quatro conjuntos de alteraess moleculares que podem ser importantes. Primeiro, a membrana da clula espermtica

132

PARTE II Padres de Desenvolvimento

pode se alterar, mudando sua composio de lipdios. A concentrao de colesterol no espermatozide diminuda durante a capacitao do espermatozide em vrias espcies (Davis, 1981), e duas protenas encontradas tanto no soro como no trato reprodutivo feminino (albumina e protena 1 de transferncia lipdica), foram verificadas remover colesterol do espermatozide humano (Langlais et al., 1988; Ravnik et al., 1992). Em segundo lugar, certas protenas ou carboidratos na superfcie do espermaozide so perdidos durante a capacitao (Poirier e Jackson, 1981; Lopez et al., 1985; Wilson e Oliphant, 1987). possvel que essas entidades perdidas durante a capacitao estivessem bloqueando locais de reconhecimento para as protenas que se ligam zona pelcida. Em terceiro lugar, certas protenas so fosforiladas por um caminho cAMP-dependente. O AMP cclico pode induzir artificialmente a competncia atravs da protena quinase cAMP-dependente (PKA), que necessria tanto para a aquisio de competncia como para a fosforilao de tirosino-quinases. possvel que o trato reprodutivo feminino estimule a adenilciclase do espermatozide a produzir mais cAMP e que esse ative a protena quinase que inicia a cascata de fosforilao, terminando na fosforilao e ativao das protenas envolvidas na ligao do espermatozide zona pelcida e mediando a exocitose da vescula acrossmica (Leyton e Saling, 1989a; Visconti et al., 1995a,b). Em quarto lugar, o potencial da membrana do espermatozide dramaticamente reduzido (de cerca de 30 para 50 mV; Zeng et al., 1995). Porm, ainda incerto se esses eventos so independentes um do outro e at que ponto cada um deles produz capacitao do espermatozide.

Hiperativao e Quimiotaxia As diferentes regies do trato reprodutivo feminino podem secretar fatores diferentes, regionalmente especficos. Esses fatores podem influenciar a motilidade espermtica assim como a capacitao. Por exemplo, quando os espermatozides de certos mamferos (especialmente hamsters, cobaias e algumas variedades de camundongos) passam do tero para os ovidutos, ficam hiperativados, passando a nadar com maior velocidade e gerando maior fora. Suarez e colaboradores (1991) mostraram que enquanto essas reaes no so conducentes a viagens em fluidos de baixa viscosidade, parecem ser muito adequadas para o movimento linear do espermatozide no fluido viscoso que poder encontrar no oviduto. Alm de aumentar a atividade do espermatozide, fatores solveis no oviduto tambm podem prover o componente direcional do movimento do espermatozide. Especulou-se que o vulo (ou, mais provavelmente, o folculo ovariano no qual o vulo se desenvolve) pode estar secretando substncias quimiotticas que poderiam atrair o espermatozide em direo ao vulo durante os ltimos estgios da migrao (veja Hunter, 1989). Ralt e colaboradores (1991) testaram essa hiptese usando fluido de folculos humanos cujos vulos estavam sendo usados para fertilizao in vitro. Realizando um experimento semelhante aquele descrito anteriormente com ourios-do-mar, os autores microinjetaram uma gota do fluido folicular em uma gota maior da suspenso de espermatozides. Feito isso, observaram que parte do espermatozide mudou sua direo de movimentao, passando a migrar ao encontro da fonte de fluido folicular. A microinjeo de outras solues no teve esse efeito. Esses estudos no eliminam a

possibilidade de que o efeito fosse devido a uma estimulao geral do movimento ou do metabolismo do espermatozide. No entanto, essas investigaes revelaram uma correlao fascinante: o fluido de somente a metade dos folculos testados mostrou um efeito quimiottico, e em quase todos os casos, o vulo s era fertilizvel se, e somente se, o fluido demonstrasse habilidade quimiottica (P < 0,0001). possvel, portanto, que tal como certos vulos de invertebrados, o vulo humano secrete um fator quimiottico somente quando estiver capacitado para a fertilizao. Deve-se notar que o prmio da corrida no vai sempre para o mais rpido. Embora algum espermatozide possa alcanar a regio ampolar do oviduto (onde ocorre a fertilizao) dentro de meia hora aps a relao sexual, aquele espermatozide pode ter poucas chances de fertilizar o vulo. Wilcox e colaboradores (1995) acharam que quase todas os engravidamentos humanos resultam de relacionamento sexual durante um perodo de seis dias, terminando no dia da ovulao. Isso significa que o espermatozide fertilizador poderia demorar at seis dias para fazer a jornada. Eisenbach (1995) props a hiptese pela qual a capacitao um acontecimento transitrio, e que dada ao espermatozide uma janela de competncia relativamente breve, durante a qual pode ter sucesso na fertilizao do vulo. Quando os espermatozides atingem a ampola, adquirem competncia, mas se a ficam por um perodo demasiadamente longo, perdem-na. O espermatozide pode tambm ter diferentes prazos de sobrevivncia, dependendo da sua localizao dentro do trato reprodutivo; isso pode permitir que algum espermatozide chegue mais tarde, porm com uma melhor probabilidade de sucesso do que aquele que chegou dias antes.

Reconhecimento do vulo e espermatozide: Contato de gametas


Reconhecimento Espcie-Especfico em Ourios-do-Mar Uma vez que o espermatozide do ourio-do-mar tiver penetrado na gelia do vulo, o processo acrossmico do espermatozide faz contato com o envoltrio vitelnico do vulo (Figura 4.11). Um importante passo do reconhecimento espcie-especfico ocorre nesse ponto. A protena acrossmica mediando esse reconhecimento chamada bindina. Em 1977, Vacquier e colaboradores isolaram essa protena insolvel, de 30.500Da, do acrossomo de Strongylocentrotus purpuratus. Essa protena capaz de se

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

133

Figura 4.11

Contato do processo acrossmico do espermatozide do ourio-do-mar com uma microvilosidade do vulo. (de Epel, 1977, cortesia de F. D. Collins e D. Epel.)

Figura 4.12

ligar a vulos desgeleificados de S. purpuratus (Figura 4.12; Vacquier e Moy, 1977). Ainda mais, sua interao com vulos relativamente espcie-especfica (Glabe e Vacquier, 1977; Glabe e Lennarz, 1979); a bindina isolada dos acrossomos de S. Purpurata aglutina seus prprios vulos desgeleificados, mas no aqueles de Arbacia puctulata. Usando tcnicas imunolgicas, Moy e Vacquier (1979) demonstraram que a bindina est especificamente localizada no processo acrossmico, exatamente onde deve estar para o reconhecimento espermatozide-vulo (Figura 4.13). Estudos bioqumicos mostraram que as bindinas de espcies proximamente relacionadas de ourio-do-mar so mesmo diferentes. Esse achado implica na existncia de

(A)

BINDINA DO ESPERMATOZIDE S. purpuratus S. fransciscanus

(B)

Aglutinao espcie-especfica por bindina de vulos desgeleificados . (A) aglutinao promovida pela adio de 212 g de bindina em um recipiente plstico contendo 0.25 ml de suspenso a 2% (volume/ volume) de vulos. Aps 2-5 min de agitao branda, os recipientes foram fotografados. Cada bindina somente se ligou a seus prprios vulos. (B) Fotomicrografia de fluorescncia de vulos de S. purpuratus ligados entre si por partculas de bindina de S. purpuratus marcadas por fluorescncia. As partculas de bindina estavam invariavelmente nos lugares onde dois vulos se encontravam. (A baseado em fotografias de Glabe e Vacquier, 1977; B de Glabe e Lennarz, 1979, cortesia dos autores.)

S. purpuratus

OVOS DESGELEIFICADOS

Partculas de bindina

Aglutinao

Sem aglutinao vulos

S. fransciscanus

Sem aglutinao

Aglutinao

134

PARTE II Padres de Desenvolvimento

(A)

DAB + H2O2 Precipitado denso Anti-bindina de coelho

(B) Precipitado DAB

Imunoglobulina porcina anti-coelho conjugada com a enzima peroxidase

(C) Membrana vitelnica do vulo

Acrossomo

Ncleo

Processo acrossmico
Bindina Espermatozide

Figura 4.13

Localizao de bindina no processo acrossmico. (A) a tcnica de localizao imunoqumica coloca um anticorpo de coelho nos lugares onde a bindina est exposta. Os anticorpos do coelho foram produzidos contra a protena bindina, e esses anticorpos foram incubados com espermatozide que tinha sofrido a reao acrossmica. Quando a bindina estava presente, os anticorpos do coelho permaneciam ligados ao espermatozide. Depois de todo anticorpo no-ligado ser removido por lavagem, o espermatozide foi tratado com anticorpos de porco capazes de ligar-se a anticorpos de coelho. Esses anticorpos de porco haviam sido ligados covalentemente enzima peroxidase. Dessa maneira, molculas de peroxidase foram colocadas em todos os lugares onde havia bindina. Peroxidase catalisa a formao de um precipitado escuro de diaminobenzidina (DAB) e gua oxigenada. O precipitado s se forma onde h bindina. (B) Localizao de bindina no processo acrossmico aps a reao acrossmica (33.200x). (C) Localizao de bindina no processo acrossmico na juno do espermatozide com o vulo. (B e C de Moy e Vacquier, 1979, cortesia de V. D. Vacquier.)

receptores espcie-especficos de bindina no envoltrio vitelnico. Tais receptores tambm foram sugeridos pelos experimentos de Vacquier e Payne (1973), que saturaram vulos de ourio-do-mar com espermatozide. Como pode ser visto na Figura 4.14 A, a ligao do espermatozide no se d sobre a superfcie inteira do vulo. Mesmo

(A)

Figura Figura 4.14

Receptores de bindina no vulo. (A) Micrografia eletrnica de varredura do espermatozide do ourio-do-mar ligado ao envoltrio vitelnico de um vulo. (B) ligao do espermatozide de S. purpuratus a partculas de polistireno que foram cobertas com a protena purificada do receptor de bindina. (A cortesia de C. Glabe, L. Perez e W. J. Lennarz; B de Foltz et al., 1993.)

(B)

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

135

a nveis saturantes de espermatozide (aproximadamente 1500), parece haver espao no vulo para mais cabeas de espermatozide, indicando haver um nmero limitante de locais ligantes de espermatozide. Um grande complexo de glicoprotenas dos envoltrios vitelnicos de vulos de ourio-do-mar foi isolado e mostrou ligar bindina radioativa de maneira espcie-especfica (Glabe e Vacquier, 1978; Rossignol et al., 1984). Essa glicoprotena tambm capaz de competir com vulos pelo espermatozide da mesma espcie. Isto , se espermatozide de S. purpuratus misturado com o receptor de bindina de envoltrios vitelnicos de S. purpuratus, o espermatozide se liga a ele e no ir fertilizar os vulos. O receptor isolado de S. purpuratus, porm, no ir interferir com a fertilizao de outros ourios-do-mar relacionados. Esse receptor de bindina uma glicoprotena transmembrana com quase 1300 aminocidos (Foltz et al., 1993). A regio ligante de bindina se estende para o espao extracelular e provavelmente se torna um componente do envoltrio vitelnico. Esses receptores de bindina se agregam em complexos, e centenas deles so provavelmente necessrios para amarrar o espermatozide no vulo (Figura 4.14B). Assim, reconhecimento espcieespecfico dos gametas do ourio-do-mar ocorrem ao nvel da atrao, ativao e adeso do espermatozide superficie do vulo. [fert4.html] Ligao de Gametas e Reconhecimento em Mamferos
ZP3: A PROTENA LIGANTE DA ZONA PELCIDA DO CAMUNDONGO. A zona pelcida tem nos mamferos um papel anlogo aquele do envoltrio vitelnico nos invertebrados. Essa matriz de glicoprotenas sintetizada e secretada pelo ocito em crescimento, e tem dois papis importantes durante a fertilizao: liga o espermatozide, e inicia a reao acrossmica aps essa ligao (Saling et al., 1979; Florman e Storey, 1982; Cherr et al., 1986). A ligao de espermatozide zona relativamente, porm no absolutamente, espcie-especfica (especificidade por espcie no deveria ser um grande problema quando a fertilizao ocorre internamente), e a ligao do espermatozide do camundongo zona dessa espcie pode ser inibida pela incubao prvia de espermatozide com glicoprotenas da zona. Bleil e Wassarman (1980, 1986, 1988) isolaram da zona pelcida do camundongo uma glicoprotena ZP3, de 83-kDa, que o competidor ativo nesse ensaio de inibio. As outras duas protenas da zona, ZP1 e ZP2, no puderam competir pela ligao do espermatozide (Figura 4.15). Ainda mais, ZP3 radiativamente marcada ligou-se s cabeas do espermatozide do camundongo que tinha acrossomos intactos. Assim, ZP3 a protena especfica na zona pelcida qual se liga o espermatozide do camundongo. ZP3 tambm inicia a reao acrossmica aps os espermatozides terem se ligado a ela. O espermatozide do camundongo pode, dessa forma, concentrar suas enzimas proteolticas diretamente no ponto de fixao zona pelcida.

Figura 4.15

Ligao do espermatozide zona pelcida. (A) ensaio de inibio mostrando a diminuio especfica da ligao do espermatozide do camundongo s zonas pelcidas quando espermatozide e zonas so incubados com aumentos crescentes da poro carboidrato da glicoprotena ZP3. A importncia da poro carboidrato de ZP3 tambm, indicada por essa figura. (B) Ligao de ZP3 marcada radioativamente a espermatozide capacitado do camundongo. (A segundo Bleil e Wassarman, 1980, e Florman e Wassarman, 1985; B de Bleil e Wassarman, 1986, cortesia dos autores.)

Ligao do espermatozide (%)

ZP3 sem carboidratos

(A)

Equivalentes da zona pelcida por l

(B)

136

PARTE II Padres de Desenvolvimento

O mecanismo molecular pelo qual a zona pelcida e o espermatozide do mamfero se reconhecem mutuamente est sendo estudado. A hiptese corrente sobre a ligao dos gametas de mamferos postula um conjunto de protenas do espermatozide capazes de reconhecer regies especficas de carboidratos na zona ZP3 do vulo (Florman et al., 1984; Florman e Wassarman, 1985; Wassarman, 1987; Saling, 1989). A remoo desses grupos de carboidratos ligados por treonina ou serina suprime a habilidade de ligar o espermatozide.
PROTENAS DE ADESO ESPERMATOZIDE-ZONA. O espermatozide do camun-

dongo no fura para chegar ao interior da zona. Na realidade, os espermatozides se aproximam paralelamente ao plano da superfcie da zona e a so ativamente fixados (Baltz et al., 1988). Como a zona capaz de ligar e conservar esses espermatozides contorcedores? Parece que ZP3 pode ligar-se a pelo menos trs protenas adesivas na membrana do espermatozide, e milhares desses stios podem ser necessrios para prevenir que essas duas clulas se separem. H uma controvrsia significativa sobre a questo de se todas as trs protenas no espermatozide so necessrias para ligao zona, e quais as suas respectivas funes (veja Figura 4.16: Snell e White, 1996). Parece que cada uma delas tem papis especficos, mas um tanto sobrepostos na adeso do espermatozide e na reao acrossmica. Essas trs protenas so: a protena ligante de galactose, a galactosil-transferase e a quinase do receptor da zona.
A PROTENA LIGANTE DE GALACTOSE 56-KDA (SP56). Uma protena crtica

ligante da zona do espermatozide parece ser a protena que especificamente se liga aos resduos de galactose de ZP3. Bleil e Wassarman (1980) mostraram que um dos carboidratos crticos da glicoprotena ZP3 o grupo galactose terminal. Se essa galactose terminal for removida ou modificada quimicamente, a atividade ligante de espermatozide perdida. Esses pesquisadores posteriormente isolaram essa protena, ligando
Zona pelcida vulo

Espermatozide

ZP3 (protena ligante de espermatozide) na Zona

ZP3 Protenas candidatas a ligao zona no acrossomo N-acetil glicosamina Galactose Membrana celular do espermatozide

GALACTOSILTRANSFERASE Ligao cruzada ativa protenas G Ativao de sntese de IP3 na membrana acrossmica

SP 56 (protena perifrica da membrana)

P95 Ativao de tirosinoquinase Regulao de canais inicos ou sntese de IP3

Figura 4.16

Liberao de Ca++

Reao acrossmica

Ligao de espermatozide zona pelcida do camundongo: alguns possveis participantes. A protena ZP3 da zona pelcida liga espermatozide. H evidncia da ligao de trs protenas espermticas a galactosiltransferase da superfcie, sp56 e P95 ZP3. Essa ligao induz a reao acrossmica atravs da ativao do fluxo de clcio. Os detalhes ainda tero que ser elucidados. (Segundo Snell e White, 1996.)

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

137

Figura 4.17

ZP3 uma coluna de afinidade, passando em seguida, por essa coluna, as protenas isoladas da membrana de espermatozides de camundongo (Bleil e Wassarman, 1990). A maioria das protenas passou pela coluna; porm um peptdio de 56kDa, ligou-se s partculas recobertas com ZP3, mas no se ligou a partculas recobertas com ZP2 em experimento semelhante. Essa protena foi encontrada exposta na membrana espermtica; ligava-se a resduos de galactose, sugerindo fortemente ser um receptor de espermatozide ligante entidade terminal de galactose na glicoprotena ZP3. A protena sp56 liga-se zona pelcida de ovos no-fertilizados (porm no dos fertilizados), bloqueando a ligao espermatozide-vulo (Figura 4.17; Bookbinder et al., 1995).
GALCTOSILTRANSFERASE. A Segunda protena do espermatozide que parece

Sp56 purificada liga-se zona pelcida e inibe a ligao de espermatozide a vulos de camundongo. (A) Ligao de sp56 zona pelcida de ovos no-fertilizados. A pista 1 o resultado da lise de ovos no-fertilizados, fazendo migrar as protenas extradas em um gel, transferindo o gel, e sondando para a presena de sp56 com anticorpo marcado. No se v sp56. A pista 2 mostra o resultado positivo obtido quando o ovo no-fertilizado pr-incubado com sp56, indicando que sp56 se liga aos vulos. A pista 3 mostra os resultados negativos obtidos quando sp56 foi adicionada a embries bicelulares. A pista 4 mostra o controle quando sp56 purificada feita migrar no gel. (O anticorpo reconhece a forma no-reduzida de sp56, que migra em 40 kDa). (B) Espermatozide ligando-se normalmente a ovos no-fertilizados de camundongo (aproximadamente 76 espermatozides por vulo). Os embries bicelulares (aqui marcados por asteriscos) so controles internos mostrando no ocorrer ligao. (C ) Na presena de sp56, o espermatozide foi impedido de se ligar zona. (de Bookbinder et al., 1995; cortesia de J.D. Bleil.)

ser importante para ligao espermatozides-zona a enzima da membrana celular do espermatozide, glicosiltransferase. No laboratrio de Shur foi demonstrado que esse receptor para a zona uma enzima que reconhece o acar N-acetilglicosamina na ZP3 (Shur e Hall, 1982a,b; Lopez et al., 1985; Miller et al., 1992). Essa enzima, Nacetilglicosamina:galactosiltransferase, est embebida na membrana plasmtica do espermatozide, diretamentre acima do acrossomo, com seu stio ativo apontando para fora. A funo enzimtica dessa enzima de 60-kDa seria a de catalisar a adio de um acar galactose (de UDP-galactose) para uma cadeia de carboidrato terminando em um acar N-acetilglicosamina (veja Captulo 3). No entanto, no h resduos de UDP-galactose no trato reprodutivo feminino. Embora a enzima possa se ligar aos resduos de protenas da zona, exatamente como qualquer enzima se ligaria a um substrato, ela no pode catalisar a reao porque o segundo reagente est faltando. Portanto, as enzimas (no espermatozide) ficam ligadas a seus substratos (na zona). Se essa hiptese estiver correta, poderamos esperar que a ligao vulo-espermatozide seria inibida ou pela inibio da enzima, ou pela adio do segundo reagente, UDP-galactose. Isso exatamente o que Shur e colaboradores acharam ser o caso. A ligao espermatozide-zona foi bloqueada por: (1) adio de UDPgalactose, (2) remoo de resduos de N-acetilglicosamina de ZP3, (3) adio de anticorpos que bloqueiam a atividade da galactosiltransferase, e (4) colocao de um excesso de galactosiltransferase no meio (a enzima em excesso iria ligar-se zona e inibir o espermatozide de se ligar) (Lopez et al., 1985; Shur e Neely, 1988). Alm disso, membranas de espermatozide de camundongo iro transferir um acar de UDP-galactose especificamente para ZP3 (Miller et al., 1992). Assim, a galactosiltransferase da superfcie do espermatozide parece reconhecer um grupo carboidrato na protena ZP3 da zona pelcida do camundongo. A agregao dessas galactosiltransferases ocasiona a ativao de uma protena G que pode ser importante na iniciao da reao acrossmica (Gong et al., 1995).

138

PARTE II Padres de Desenvolvimento

RECEPTOR DE QUINASE DA ZONA (ZRK). Uma terceira protena espermtica que se liga zona pelcida do camundongo parece ser uma protena transmembrana de 95-kDa com dois stios funcionais. O stio extracelular liga especificamente ZP3, enquanto o stio intracelular tem atividade enzimtica de tirosina quinase (Leyton et al., 1992). Essa atividade estimulada quando a protena liga ZP3. Isso implica que a protena de 95-kDa uma tirosina quinase de receptor, e que pode iniciar a reao acrossmica atravs da fosforilao das suas protenas alvo (veja Captulo 3). O espermatozide humano tem uma protena semelhante, e a ZP3 humana estimula a atividade da quinase. Alm disso, peptdios sintticos que mimetizam o domnio extracelular (que liga ZP3) dessa protena, inibem a ligao do espermatozide zona pelcida humana, sugerindo possvel uso como contraceptivo (Burks et al., 1995). INDUO DA REAO ACROSSMICA EM MAMFEROS POR ZP3. Uma vez que o espermatozide capacitado ligou-se zona pelcida, como ocorre a reao acrossmica nos mamferos? A reao induzida pela poro protica de ZP3 (Endo et al., 1987; Leyton e Saling,1989a), e ZP3 parece atuar perfazendo ligao cruzada com seus receptores na membrana espermtica. Esse tipo de ligao abre os canais de clcio, aumentando a concentrao do on no espermatozide (Leyton e Saling, 1992b). O mecanismo pelo qual age o ZP3 e a subseqente exocitose do acrossomo permanece controversa, mas pode envolver a trajetria IP3 (Florman, 1994; Suarez e Dai, 1995). [fert5.html] LIGAO SECUNDRIA DO ESPERMATOZIDE ZONA PELCIDA. Durante a reao acrossmica, a parte anterior da membrana plasmtica do espermatozide solta (veja Figura 4.10). ali que esto localizadas as protenas ligantes de ZP3 e, ainda assim, o espermatozide deve permanecer ligado zona para abrir, por lise, um caminho atravs dela. Em camundongos, parece que uma ligao secundria zona conseguida por protenas na membrana acrossmica interna que se ligam especificamente a ZP2 (Bleil et al., 1988). Enquanto espermatozide com acrossomo intacto no ir se ligar ZP2 glicoprotena, o espermatozide cujo acrossomo reagiu o far. Alm disso, anticorpos contra a protena ZP2 no iro impedir a ligao do espermatozide com acrossomo intacto zona, mas iro inibir a fixao do espermatozide que j tenha reagido. A estrutura da zona consiste de unidades repetitivas de ZP3 e ZP2, ocasionalmente ainda ligadas por ZP1 (Figura 4.18). Parece que os espermatozides com acrossomo que reagiram, transferem sua ligao com ZP3 para as molculas adjacentes de ZP2. Aps a entrada de espermatozide de camundongo no vulo, os grnulos corticais do ovo liberam seu contedo. Uma das protenas liberadas a protease que especificamente altera ZP2 (Moller e Wassarman, 1989). Isso inibe outros espermatozides, cujo acrossomo j reagiu, de mover-se mais para perto do vulo. No conhecido quais das protenas do espermatozide do camundongo se ligam ZP2. No espermatozide porcino, ligao secundria zona parece ser mediada por proacrosina. Proacrosina torna-se a protease acrosina, h muito tempo conhecida por estar envolvida na digesto da zona pelcida. No entanto, proacrosina tambm uma protena ligante da fucose que mantm a conexo entre espermatozide que reagiu com acrosina e a zona pelcida (Jones et al., 1988). possvel que a proacrosina se ligue zona, sendo depois convertida na enzima ativa que digere localmente a zona pelcida. Na cobaia, ligao secundria zona considerada ser mediada pela protena PH-20. Quando essa protena da membrana acrossmica interna foi injetada em cobaias macho ou fmea, 100% desses animais tornaram-se estreis por vrios meses (Primakoffet al., 1988). O soro sangneo dessas cobaias estreis tinha uma concentrao extremamente alta de anticorpos para PH-20. O anti-soro de cobaias esterilizadas por injees de PH-20 no s se ligou especificamente a essa protena, como tambm bloqueou a adeso espermatozide-zona in vitro. O efeito

ZP1

ZP2

ZP3

Resduos de carboidratos

Figura 4.18

Diagrama da estrutura fibrilar da zona pelcida do camundongo. Filamentos principais da zona pelcida so compostos por dmeros repetitivos das protenas ZP2 e ZP3. Esses filamentos esto ocasionalmente ligados por ZP1, formando uma esteira de malhas. (Segundo Wassarman, 1989.)

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

139

contraceptivo perdurou por vrios meses, aps os quais a fertilidade foi restabelecida. Os animais foram temporariamente esterilizados por esses anticorpos. O anlogo humano da protena PH-20 no ainda conhecido, porm, certos antgenos do espermatozide apresentam um padro semelhante de localizao no espermatozide. As protenas da zona pelcida humana e suas funes ainda no foram estabelecidas to claramente como no camundongo. Ainda assim, esses experimentos mostram que o princpio da contracepo imunolgica est bem fundamentado.

Fuso de gametas e a preveno da polispermia


Fuso entre as membranas do vulo e do espermatozide O reconhecimento do espermatozide pelo envoltrio vitelnico ou zona seguido pela lise da poro do envoltrio ou zona na regio da cabea do espermatozide (Colwin e Colwin, 1960; Epel, 1980). Essa lise seguida pela fuso da membrana espermtica com a membrana do vulo. A entrada do espermatozide no vulo do ourio-do-mar est ilustrada na Figura 4.19. A superfcie do vulo est coberta de pequenas microvilosidades; a fuso espermatozide-vulo parece causar a polimerizao da actina e a extenso de vrias microvilosidades para formar o cone de fertilizao (Summers et al., 1975; Schatten e Schatten, 1980, 1983). A homologia entre vulo e espermatozide novamente

(A)

(B)

Figura 4.19

Varredura ao microscpio eletrnico da entrada do espermatozide em vulo de ourio-do-mar. (A) Contato da cabea do espermatozide com microvilosidades do vulo atravs do processo acrossmico. (B) Formao do cone de fertilizao. (C) Internalizao do espermatozide no vulo. (D) Micrografia de transmisso ao microscpio eletrnico da internalizao do espermatozide atravs do cone de fertilizao. (A-C de Schatten e Mazia, 1976, cortesia de G. Schatten; D cortesia de F. J. Longo.)
(C) (D)

140

PARTE II Padres de Desenvolvimento

demonstrada, porque o cone de fertilizao transitrio, tal como o processo acrossmico, parece se prolongar pela polimerizao da actina. Aps a juno, podese encontrar material do espermatozide na membrana do vulo (Gundersen et al., 1970). O ncleo e a cauda do espermatozide passam pela ponte citoplasmtica, que alargada pela polimerizao da actina. Yanagimachi e Noda (1970) mostraram que processo semelhante ocorre na fuso de gametas de mamferos (Figura 4.20). No ourio-do-mar, todas as regies do vulo so capazes de se fundir com o espermatozide; em vrias outras espcies, existem regies especializadas na membrana para o reconhecimento e fuso com o espermatozide (Vacquier, 1979). A fuso um processo ativo, freqentemente mediado por protenas fusognicas especficas. Protenas como a HA do vrus da influenza e a protena F do vrus Sendai promovem a fuso celular, sendo possvel que a bindina tambm seja uma dessas protenas. Glabe (1985) mostrou que a bindina do ourio-do-mar promove a fuso de vesculas fosfolipdicas e que, tal como as protenas fusognicas virais, a bindina contm uma longa regio de aminocidos hidrofbicos perto do terminal amino. Em abalones, a lisina que dissolve o envoltrio vitelnico tambm demonstrou ter atividade fusognica (Hong e Vacquier, 1986). As protenas fertilinas da membrana do espermatozide dos mamferos so essenciais para fuso espermatozide-vulo (Primakoff et al., 1987; Blobel et al., 1992; Myles et al., 1994). A fertilina do camundongo tem regies hidrofbicas semelhantes s das protenas fusognicas virais, alm de uma seqncia que sugere ligao com uma integrina da membrana do vulo. Evidncia atual sugere que a fertilina do camundongo liga-se integrina 61 da membrana assumindo-se que a regio hidrofbica da fertilina pode, em seguida, mediar a unio das duas membranas (Almeida et al., 1995). Quando as membranas se fundem, o ncleo, mitocndrias, centrolo e flagelo podem penetrar no ovo. Preveno da Polispermia Assim que um espermatozide tiver penetrado o vulo, a capacidade de fuso da membrana do vulo, que fora to necessria para conseguir a penetrao, torna-se um risco. No ourio-do-mar, como na maioria dos animais estudados, qualquer espermatozide que penetra o vulo, pode prover um ncleo haplide e um centrolo para o vulo. Na monospermia normal, na qual somente um espermatozide penetra o vulo, um ncleo haplide do espermatozide e um do vulo se combinam para formar o ncleo diplide do ovo fertilizado (zigoto), restaurando o nmero de cromossomos apropriado para a espcie. O centrolo, provindo do espermatozide, se dividir para formar os dois plos do fuso mittico durante a clivagem. A entrada de mltiplos espermatozides polispermia conduz conseqncias desastrosas na maioria dos organismos. No ourio-do-mar, a fertilizao por dois espermatozides resulta em um ncleo triplide, no qual cada cromossomo est representado no duas, mas trs vezes. Pior ainda, como o centrolo se divide para formar os dois plos do aparelho mittico, aqui, em vez de um fuso mittico bipolar separar os cromossomos em duas clulas, os cromossomos triplides se dividiriam em quatro clulas. Como no h mecanismos para assegurar que cada uma das quatro clulas receba o nmero e o tipo apropriado de cromossomos, esses sero distribudos de maneira desigual. Algumas clulas receberiam cpias extra de certos cromossomos e outras clulas no os teriam. Theodor Boveri demonstrou em 1902 que tais clulas ou morreriam ou se desenvolveriam anormalmente (Figura 4.21). [fert6.html] As espcies desenvolveram maneiras de prevenir a unio de mais de dois ncleos haplides. A mais comum a de impedir a entrada de mais de um espermatozide no vulo. O vulo do ourio-do-mar tem dois mecanismos que evitam a polispermia: uma reao rpida, efetivada por uma mudana eltrica na membrana plasmtica do vulo, e uma reao mais lenta, causada pela exocitose dos grnulos corticais.

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

141

(A)

(B)

(C)

Zona

(E) Membrana acrossmica interna

Ncleo

Segmento equatorial do acrossomo

Figura 4.20

Entrada de espermatozide no vulo do hamster dourado. (A) Micrografia eletrnica de varredura do ato da fuso. O ponto calvo (sem microvilosidades) o local abandonado pelo corpo polar. (B) Vista prxima da ligao espermatozide-zona. (C ) Micrografia eletrnica de transmisso mostrando a cabea do espermatozide atravessando a zona. (D) Micrografia eletrnica de transmisso, do espermatozide fundindo em paralelo a membrana do plasma do vulo. (E) Diagrama da fuso do acrossomo do espermatozide e membranas plasmticas com as microvilosidades do vulo. (Segundo Yanagimachi e Noda, 1970; Yanagimachi, 1994; fotografias cortesia de R. Yanagimachi.)

O BLOQUEIO RPIDO DA POLISPERMIA. A membrana celular do vulo notvel

no somente por sua habilidade de se fundir com a membrana espermtica, mas tambm por sua capacidade de resistir a uma ulterior fuso imediatamente aps a entrada de um espermatozide (Just, 1919). O bloqueio rpido polispermia, conseguido pela mudana do potencial eltrico da membrana do vulo. Essa prov uma barreira seletiva entre o citoplasma e o ambiente exterior; a concentrao inica do vulo difere muito daquela do ambiente, uma diferena especialmente pronunciada para os ons de sdio e potssio. A gua do mar tem uma alta concentrao do on sdio, ao passo que o citoplasma do vulo tem relativamente pouco sdio. O oposto acontece com os ons potssio. Essa condio mantida pela membrana celular, que constantemente inibe a entrada de sdio no

142

PARTE II Padres de Desenvolvimento

(A) Ocito Proncleos do espermatozide

Centrossomo do espermatozide

Figura 4.21

Proncleos do ocito

Desenvolvimento aberrante de um vulo de ourio-do-mar fecundado por dois espermatozides. (A) Fuso de trs ncleos haplides, cada um contendo 18 cromossomos, e diviso dos dois centrolos espermticos para formar quatro plos mitticos. (B, C) Os 54 cromossomos se distribuem aleatoriamente nos quatro fusos. (D) Na anfase da primeira diviso, os cromossomos duplicados so arrastados para os quatro plos. (E) Quatro clulas contendo nmeros e tipos diferentes de cromossomos so formadas, causando a morte prematura do embrio (F). (Segundo Boveri, 1907.)

Fuso pronuclear (B)

1a clivagem (C)

(D)

(E)

(F)

ocito e impede o escoamento de ons de potssio para o ambiente. Quando inserimos um eletrodo no vulo e colocamos um outro fora do ocito, podemos medir a constante diferena potencial da membrana plasmtica do vulo. Esse potencial de repouso da membrana geralmente cerca de 70 mV, e usualmente expresso como 70 mV porque o interior da clula est carregado negativamente em relao ao exterior. [fert7.html] Dentro de 1-3 segundos aps a ligao do primeiro espermatozide, o potencial da membrana muda para um nvel positivo (Longo et al., 1986). Um pequeno influxo de ons de sdio no vulo permitido, trazendo a diferena de potencial para +20 mV (Figura 4.22 A). Embora o espermatozide possa se fundir com membranas tendo um potencial de 70 mV, no pode se fundir com membranas com um potencial de repouso positivo. No conhecido como a ligao ou a entrada do espermatozide sinaliza a abertura dos canais de sdio; porm, Gould e Stephano (1987, 1991) forneceram o que poder ser uma pista importante para a compreenso desse processo. Os autores isolaram do espermatozide de Urechis (um verme equiuride marinho) uma protena cromossmica capaz de abrir canais de sdio de vulos de Urechis. Quando tais vulos so expostos a essa protena, a mudana da velocidade do influxo de sdio e do potencial de membrana resultante so muito parecidos com aqueles produzidos pelo espermatozide vivo. A abertura dos canais de sdio no vulo, parece ser causada pela ligao do espermatozide ao vulo. Jaffe e seus colaboradores mostraram que a polispermia podia ser induzida quando vulos foram supridos artificialmente com uma corrente eltrica que mantinha negativo o seu potencial de membrana. Reciprocamente, a fertilizao podia ser inteiramente prevenida conservando tal potencial positivo (Jaffe, 1976). O bloqueio rpido da polispermia podia tambm ser evitado baixando-se a concentrao do sdio da gua (Figura 4.22B-D). Se os ons de sdio no forem suficientes para ocasionar um deslocamento positivo do potencial de membrana, ocorre a polispermia (Gould-Somero et al., 1979; Jaffe, 1980). No conhecido como diferenas no potencial de membrana atuam sobre o espermatozide bloqueando a segunda fecundao. Muito provavelmente, o espermatozide conduz um componente (possivelmente uma protena fusognica carregada positivamente), sendo a insero desse componente na membrana do vulo, provavelmente, regulada pela carga eltrica transmembrana (Iwao e Jaffe, 1989). Um bloqueio eltrico polispermia tambm ocorre em rs (Dross e Elinson, 1980), mas provavelmente no na maioria dos mamferos (Jaffe e Cross, 1983).
O BLOQUEIO LENTO DA POLISPERMIA. vulos do ourio-do-mar (e muitos ou-

Clulas em desintegrao; morte do embrio

tros) tm um segundo mecanismo para assegurar que mltiplos espermatozides no penetrem no citoplasma do vulo (Just, 1919). O bloqueio rpido transitrio, o potencial de membrana do vulo do ourio-do-mar somente permanece positivo por cerca de um minuto. Essa curta mudana de potencial no suficiente para prevenir a polispermia de maneira permanente. Carroll e Epel (1975) demonstraram que a

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

143

Figura 4.22

Adio de espermatozide (A) Segundos

Potencial de membrana de vulos de ourio-do-mar antes e aps a fertilizao. (A) antes da adio do espermatozide, a diferena de potencial atravs da membrana celular do vulo de aproximadamente 70 mV. De 1 a 3 segundos aps o espermatozide fertilizante ter entrado em contato com o vulo, o potencial se desloca na direo positiva. (B) Ovos controle desenvolvendo-se em Na+ 490 mM. (C) Polispermia em ovos fertilizados em Na+ 120 mM (colina foi substituda por sdio). Os ovos de Lytechinus foram fotografados durante a primeira clivagem. (D) Tabela mostrando a elevao da polispermia com o decrscimo da concentrao do on sdio. (de Jaffe, 1980, fotografias cortesia de L. A. Jaffe.)

[Na+] (mM)

Porcentagem de ovos polisprmicos

(B)

(C)

(D)

polispermia ainda pode ocorrer se os espermatozides ligados ao envoltrio vitelnico no forem removidos de alguma maneira. Essa remoo conseguida pela reao dos grnulos corticais, um bloqueio mecnico mais lento da polispermia que se torna ativo cerca de 1 minuto aps a primeira ligao bem sucedida espermatozide-vulo. Diretamente abaixo da membrana do vulo do ourio-do-mar existem 15.000 grnulos corticais, cada um com 1 um de dimetro (veja Figura 4.6B). Com a entrada do espermatozide, esses grnulos se fundem com a membrana plasmtica do vulo, liberando seu contedo para o espao entre a membrana e a esteira fibrosa das protenas do envoltrio vitelnico. H vrias protenas associadas com esse processo de exocitose de grnulos corticais. As primeiras so proteases. Essas enzimas dissolvem os postos vitelnicos que conectam as protenas do envoltrio vitelnico membrana celular, secionando o receptor de bindina e todo espermatozide a ele ligado (Vacquier et al., 1973; Glabe e Vacquier, 1978). Outras protenas, mucopolissacardeos liberados dos grnulos, produzem um gradiente osmtico que permite a entrada da gua no espao entre a membrana celular e o envoltrio e, dessa forma, o envoltrio vitelnico se expande e passa a ser chamado de envoltrio de fertilizao (Figuras 4.23 e 4.24). Uma terceira protena, produto dos grnulos corticais, uma peroxidase, enrijece o envoltrio de fertilizao atravs de ligaes cruzadas entre resduos de tirosina em protenas adjacentes (Foerder e Shapiro, 1977; Mozingo e Chandler, 1991). Como mostra a Figura 4.23, o envoltrio de fertilizao comea a se formar no local da entrada do espermatozide e continua sua expanso ao redor do vulo. medida que esse envoltrio se forma, os espermatozides so liberados. O processo se inicia cerca de 20 segundos aps a fixao do espermatozide e se completa ao fim do primeiro minuto da fertilizao. Finalmente, uma quarta protena granular, a hialina, forma uma capa em volta do vulo (Hylander e Summers, 1982). A clula estende microvilosidades alongadas cujas extremidades se ligam a essa camada hialina, que fornece apoio para os blastmeros durante a clivagem. Em mamferos, a reao granular no cria um envoltrio de fertilizao, porm, o efeito o mesmo. Enzimas liberadas modificam os receptores de espermatozide da

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PARTE II Padres de Desenvolvimento

Figura 4.23

(A)

(B)

Formao do envoltrio de fertilizao e remoo do excesso de espermatozide. Espermatozide foi adicionado a vulos de ourio-do-mar, e a suspenso foi fixada em formaldedo para evitar futuras reaes. (A) Dez segundos aps a adio de espermatozide, esses foram vistos rodeando o vulo. (B,C) 25 e 35 segundos aps a inseminao, um envoltrio de fertilizao se forma em volta do vulo, iniciado no ponto de entrada do espermatozide. (D) O envoltrio de fertilizao est completo, e o excesso de espermatozide removido. (de Vacquier e Payne, 1973, cortesia de V. D. Vacquier.)

(C)

(D)

zona pelcida de maneira que esses no mais podem ligar-se a espermatozide (Bleil e Wassarman, 1980). Essa modificao chamada reao da zona. Durante essa reao, tanto ZP3 como ZP2 so modificadas. Florman e Wassarman (1985), propuseram que os grnulos corticais do vulo do camundongo contm uma enzima que corta os resduos terminais de acares de ZP3, com isso liberando espermatozide ligado zona e evitando a fixao de mais espermatozide. Esses grnulos corticais contm N-acetilglicosaminidases capazes de clivar N-acetilglicosamina de cadeias de carboidrato de ZP3. Miller e colaboradores (1992, 1993) demonstraram que aps a fertilizao, o resduo de N-acetilglicosamina removido, ZP3 no serve como substrato para a ligao de galactosiltransferase. ZP2 cortada pelas proteases granulares perdendo tambm sua habilidade de ligar espermatozide (Moller e Wassarman, 1989). Assim, o espermatozide no pode mais iniciar ou manter sua ligao zona pelcida e rapidamente descartado.
CLCIO COMO O INICIADOR DA REAO GRANULAR CORTICAL . O meca-

nismo da reao dos grnulos corticais semelhante aquele da reao acrossmica. Aps a fertilizao, a concentrao intracelular de clcio do ovo aumenta muito. Nessas concentraes, as membranas corticais se fundem com aquelas do ovo, causando exocitose de seu contedo (veja Figura 4.24). Aps a fuso dos grnulos corticais ao redor do ponto de entrada do espermatozide, uma onda de exocitose se propaga ao redor do corte at o lado oposto do ovo. A liberao de clcio armazenado na regio intracelular, pode ser monitorada visualmente pelo uso de corantes luminescentes (isolados da gua-viva luminescente) como a aequorina ativado pelo clcio, ou de corantes como fura-2. Esses corantes emitem luz quando ligam ons livres de clcio. Os vulos so injetados com o corante e fecundados. A Prancha 12 mostra a notvel onda de liberao de clcio que se propaga atravs do vulo do ourio-do-mar; comeando no ponto de entrada do

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

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Membrana plasmtica (i) do vulo Microvilosidade Envoltrio vitelnico

Figura 4.24

Grnulo cortical (ii) Espermatozide supranumerrio no envoltrio vitelnico

(B)

Enzimas proteolticas e mucopolissacardeos so liberados (iii)

(C)

Exocitose de grnulos corticais. (A) Diagrama esquemtico mostrando os eventos levando formao do envoltrio de fertilizao e a camada hialina. medida que os grnulos corticais sofrem exocitose, liberam proteases que cortam as protenas que ligam o envoltrio vitelnico membrana celular. Mucopolissacardeos liberados pelos grnulos formam um gradiente osmtico, causando a entrada de gua e tumefao do espao entre o envoltrio vitelnico e a membrana celular. Outras enzimas liberadas dos grnulos corticais endurecem o envoltrio vitelnico (agora o envoltrio de fertilizao) e liberam espermatozide a ele ligado. (B,C) Micrografias eletrnicas de transmisso e de varredura do crtex de um ovo no fertilizado de ourio-do-mar. (D, E) Micrografias eletrnicas de transmisso e varredura da mesma regio de um ovo recm-fertilizado, mostrando a elevao do envoltrio de fertilizao e os pontos nos quais os grnulos corticais fundiram com a membrana plasmtica do ovo (flechas em D). (A segundo Austin, 1965; B-E de Chandler e Heuser, 1979, cortesia de D. E. Chandler.)

Microfilamentos Hialina (D) Espermatozide liberado

(iv)

Envoltrio de fertilizao

Camada hialina (A)

Membrana celular (E)

espermatozide um feixe de luz atravessa a clula (Steinhardt et al., 1977; Gilkey et al., 1978; Hafner et al., 1988). Como documentado pelas fotografias, os ons de clcio no se difundem simplesmente atravs do vulo a partir do ponto da entrada do espermatozide. Ao contrrio, a liberao de clcio inicia-se de um lado da clula e termina do outro. O mecanismo dessa onda ser discutido logo adiante (veja Informaes adicionais & Especulaes, pgina 147). A total liberao de ons de clcio completada, a grosso modo, em 30 segundos no ovo do ourio-do-mar; os ons livres de clcio so re-seqestrados pouco aps sua liberao. Quando dois espermatozides entram no citoplasma do vulo, a liberao de clcio pode ser vista comeando em dois pontos separados da superfcie celular (Hafner et al., 1988). Vrios experimentos demonstraram que ons de clcio so responsveis diretos pela propagao da reao cortical e que so armazenados dentro do prprio vulo. A droga A23187 um ionforo que transporta ons de clcio atravs de membranas, permitindo a esses ctions atravessar barreiras antes impermeveis. A colocao de

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PARTE II Padres de Desenvolvimento

ovos no-fertilizados de ourio-do-mar em gua do mar contendo A23187, leva reao granular cortical e elevao do envoltrio de fertilizao, mesmo na ausncia de ons de clcio na gua do mar. Portanto, A23187 provoca a liberao de ons de clcio j seqestrados em organelas dentro do vulo (Chambers et al., 1974; Steinhardt e Epel, 1974). Estudos posteriores (Hollinger e Schuetz, 1976; Fulton e Whittingham, 1978; Hamaguchi e Hiramoto, 1981; Kline, 1988) mostraram que o on de clcio inicia reaes granulares corticais quando injetado em ovos de ourio-domar, camundongo e r. Os ons de clcio internos so armazenados no retculo endoplasmtico do vulo (Eisen e Reynolds, 1985; Terasaki e Sardet, 1991). No ourio-do-mar e na r, cujos vulos sofrem uma reao granular cortical, esse retculo pronunciado no crtex e rodeia os grnulos (Figura 4.25; Gardiner e Grey, 1983; Luttmer e Longo, 1985). Na r Xenopus, o retculo endoplasmtico cortical fica 10 vezes mais abundante durante o amadurecimento do vulo e desaparece localmente dentro de um minuto aps a ocorrncia da onda de exocitose em qualquer regio do crtex. Jaffe (1983) compara esse retculo endoplasmtico seqestrador de clcio, ao retculo sarcoplasmtico do msculo esqueltico ou cardaco. Uma vez iniciada, a liberao de clcio autopropagada. Clcio livre capaz de liberar clcio seqestrado de seus locais de armazenamento, causando assim uma onda libertadora do on clcio e exocitose granular cortical. Variaes em estratgias preventivas da polispermia existem em toda a natureza. Nos mamferos, a polispermia minimizada pelo pequeno nmero de espermatozides que atingem o local da fecundao (Braden e Austin, 1954). O bloqueio polispermia em hamsters parece ser controlado somente pela liberao de stios que ligam o espermatozide na zona pelcida (Miyazaki e Igusa, 1981; Jaffe e Gould, 1985). Coelhos, no entanto, se apoiam num bloqueio da polispermia a nvel da membrana, e ningum iria disputar o seu grau de sucesso. Finalmente, certos mamferos tm defesas para a polispermia sobre as quais pouco sabemos. Nos vulos ricos em gema de certas aves, rpteis e salamandras, vrios espermatozides realmente penetram o citoplasma do vulo. De uma maneira desconhecida, todos menos um so induzidos a se desintegrar no citoplasma aps a fuso do proncleo do vulo com um dos proncleos do espermatozide (Ginzburg, 1985; Elinson, 1986). Qualquer que seja o mecanismo, somente um ncleo haplide de espermatozide pode fundir-se com o ncleo haplide do vulo.

Figura 4.25

Retculo endoplasmtico rodeando grnulo cortical no vulo de ourio-do-mar. (A) O retculo foi corado com smio-iodeto de zinco para permitir a visualizao por micrografia de transmisso eletrnica. O grnulo visto rodeado pelo retculo. (B) Retrato de um vulo inteiro corado por anticorpos fluorescentes para os canais de liberao de clcio. Os anticorpos mostram esses canais no retculo endoplasmtico cortical. (A de Luttmer e Longo, 1985, cortesia de S. Luttmer; B de McPherson et al., 1992, cortesia de F. J. Longo.)

(A)

(B)

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

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Informaes adicionais

&

Especulaes

A Ativao do Metabolismo dos Gametas

e a liberao do on clcio necessria para ativao do ocito, como o espermatozide motiva essa liberao? Realmente no se sabe. Como se pronunciou um investigador (Berridge, 1993): Exatamente como o espermatozide dispara o processo explosivo da liberao do clcio no vulo, ainda permanece algo misterioso. Dados recentes sugerem que produo do inositol 1,4,5, trifosfato (IP3) o evento primrio para a liberao de ons clcio do seu local de armazenamento intracelular. IP3 injetado pode liberar ons clcio seqestrados no vulo e muitos outros tipos de clulas (Swann e Whitaker, 1986; Berridge, 1993); o aumento na concentrao de IP 3 intracelular visto ocorrer dentro de 10 segundos aps a fecundao de ovos do ourio-do-mar (Ciapa e Whitaker, 1986). A libertao de ons clcio e a reao dos grnulos corticais rapidamente seguem a formao ou injeo de IP3 (Whitaker e Irvine, 1984; Busa et al., 1985). Os efeitos mediados por IP3 podem ser abortados pela pr-injeo de agentes quelantes de clcio no vulo (Turner et al., 1986), confirmando que IP3 estimula a liberao de clcio armazenado. Canais de clcio respondendo ao IP3 foram encontrados no retculo endoplasmtico do vulo. O IP3 formado no local da entrada do espermatozide considerado ligar-se a esses receptores de IP3 no retculo endoplasmtico, ocasionando uma liberao local de clcio (Ferris et al., 1989; Furuichi et al., 1989; Terasaki e Sardet, 1991). Uma vez liberados, os ons de clcio podem difundir diretamente, ou facilitar a liberao de mais ons de clcio de receptores sensveis ao clcio localizados no retculo endoplasmtico (McPherson et al., 1992). A ligao de ons de clcio a esses receptores libera mais clcio, e esse pode continuar a onda, ligando-se a mais receptores e assim por diante. Mohri e colaboradores (1995) mostraram que o clcio liberado por IP3 necessrio e suficiente para liberao de clcio. Essa onda de ons de clcio propagada por

toda clula, comeando no ponto da entrada do espermatozide; os grnulos corticais se fundem com a membrana celular na presena de concentraes altas de clcio, respondem com uma onda de exocitose que segue os ons de clcio. IP 3 tambm capaz de liberar ons de clcio em vulos de vertebrados, e o bloqueio do seu receptor em vulos de hamster impede a liberao de clcio no ato da fertilizao. Como em ourio-domar IP3 tambm parece mediar a liberao de clcio de stios no retculo endoplasmtico (Lechleiter e Clapham, 1992; Miyazaki et al., 1992; Ayabe et al., 1995). Xu e colaboradores (1994) mostraram que o bloqueio da mediao por IP3 da sada de clcio, impede todos os aspectos da ativao do vulo pelo espermatozide incluindo exocitose granular, recrutamento de mRNA e recomeo do ciclo celular. A questo ento : o que inicia a produo de IP3? H dois caminhos que parecem estimular a liberao de clcio: aquele do receptor ligado protena G, largamente conhecido como liberadora de ons de clcio na contrao muscular, crescimento celular, secreo hormonal, percepo sensorial e liberao de neurotransmissores (Berridge, 1993). O outro caminho o do receptor da tirosinoquinase em cascata, que tambm usado na proliferao e diferenciao celular. Conforme apresentado no Captulo 3, o primeiro caminho se inicia pela ligao de um ligante extracelular (como a acetilcolina ou a serotonina) uma protena receptora transmembrana. No interior da membrana plasmtica esse receptor ligado protena trimrica G. Esse receptor ativa a protena G (veja Figuras 3.33 e 3.35), levando sua dissociao em subunidades, capazes de ativar um conjunto de enzimas chamadas de fosfolipase C. Essa cataliza a hidrlise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) em dois segundos mensageiros: inositol 1,4,5 trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). O primeiro capaz de abrir canais de clcio. DAG estimula a troca de prtons que permite o efluxo de ons de hidrog-

nio das clulas. O resultado disso a elevao de clcio e do pH intracelulares. O outro segundo mensageiro, DAG, considerado ativar a protena quinase C (PKC) da membrana, que transferida do citosol para a membrana plasmtica do ovo pouco aps a fecundao, e pode ser responsvel pela ativao da protena que troca ons de sdio por ons de hidrognio (Swann e Whitaker, 1986; Nishizuka, 1986; Shen e Burgart, 1986; Olds et al., 1995). O bloqueio da PKC em vulos de ourios-do-mar inibe a alcalinizao do citosol observada durante a fertilizao normal (Shen e Buck, 1990). A protena que faz a troca Na + /H+, tambm necessita de ons clcio para sua atividade. Assim, tanto DAG como IP 3 esto envolvidos nas ativao do vulo. A etapa regulatria chave a ativao da fosfolipase C, que produz esses dois compostos. Jaffe e seus colaboradores encontraram a protena G em vulos de ourio-do-mar e r; e quando injetaram ativadores da protena G nesses vulos, causaram exocitose granular na ausncia de espermatozide (Turner et al., 1986; Kline et al., 1991). Tal ativao foi inibida por quelantes de clcio, como o EGTA. [fert8.html] Parece, portanto, que uma protena G pode estar envolvida na regulao de ons seqestrados de clcio, e na exocitose de grnulos corticais. Existem vrias maneiras pelas quais isso pode acontecer. Em primeiro lugar, a ligao do espermatozide a um receptor na membrana celular do vulo pode mudar a sua conformao de modo a ativar a protena G e iniciar a cascata (Figura 4.26A), conforme demonstrado por Kline e colaboradores (1988, 1991). Eles levantaram a hiptese que se essa protena mediar a fertilizao por ser ativada por um receptor ligante de espermatozide, ento a mesma protena G poderia ser ativada por um neurotransmissor se o ovo contiver um receptor para neurotransmissor capaz de ativar a protena G. Eles injetaram mRNA para o receptor de serotonina ou de acetilcolina em vulos de r. Esses receptores da superfcie

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PARTE II Padres de Desenvolvimento

celular foram sintetizados e foram detectados na membrana celular do vulo. Os vulos puderam ser fertilizados por serotonina e acetilcolina e foi observado a reao cortical. Experimentos semelhantes mostraram que quando neurotransmissores ativam o caminho da protena GIP3 em ocitos de camundongo, so induzidos os eventos da fertilizao (Williams et al., 1992; Moore et al., 1993).

Entretanto, a cascata ligada protena-G no o nico caminho capaz de gerar IP3 (veja Captulo 3). Evidncias recentes (Moore et al., 1994; Shilling et al., 1994; Yim et al., 1994) demonstram que a ativao do receptor da tirosinoquinase tambm produz IP3 e ativa a onda de clcio e a reao granular cortical (Figura 4.26b). Quando o mRNA para o receptor dessa quinase (o receptor para o fator de crescimento derivado das plaquetas,
Figura 4.26

PDGF) foi injetado em ocitos de estrela-do-mar, o receptor PDGF foi sintetizado e incorporado nas membranas celulares desse organismo. Quando, aps a maturao dos ocitos, PDGF foi adicionado gua banhando os vulos, esses apresentaram aumento de clcio intracelular livre, exocitose de grnulos corticais e sntese de DNA. Alguns se desenvolveram em larvas. Quando o mRNA continha um ponto de mutao que impedia

Mecanismos possveis da ativao do vulo. (A) Trajetria do fosfatidilinositol mediado pela G-protena. (B) Trajetria do receptor da tirosinoquinase (RTK). (C) Trajetria da tirosinoquinase citoplasmtica. (D) Trajetria na qual a G protena ou tirosinoquinase ativadas na membrana espermtica ativam trajetrias no vulo. (E) Trajetrias de ativadores solveis.
CAMINHOS ANTERIORES FUSO DO ESPERMATOZIDE (A) Espermatozide (B) (C)

Fosfolipase C (PLC)

Receptor G-protena Receptor de Tirosinoquinase Receptor de IP3 Tirosinoquinase

Retculo endoplasmtico APS A FUSO DO ESPERMATOZIDE (D)

Fator solvel do vulo

Fatores solveis do Espermatozide

G-protena

Receptor de IP3

Retculo endoplasmtico

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

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o receptor interagir com a fosfolipase C, nenhuma dessas reaes ocorreu (Shilling et al., 1994). Assim, tanto o caminho ligado ao receptor protena-G como aquele do receptor da tirosinoquinase, parecem ser capazes de ativar essa fosfolipase, criar IP3 e induzir o fluxo de clcio no vulo. O receptor da bindina no oferece pistas para explicar como ocorre essa ativao, por no ter semelhante em outras protenas transmembrana. No entanto, 5 segundos aps ligar a bindina, fica fosforilado em um dos seus resduos tirosina citoplasmticos (Abassi e Foltz, 1994). Isso sugere que o receptor de bindina ligado, pode interagir com a tirosinoquinase plasmtica tal como aqueles que medeiam a liberao de clcio durante a ativao de clulas T (Figura 4.26 C; Hall et al., 1993).

Outra possibilidade que a ativao do caminho do IP3 no devida ligao do espermatozide e vulo, mas fuso das membranas do vulo e do espermatozide. Mc Culloch e Chambers (1992) obtiveram evidncia eletrofisiolgica que a ativao dos vulos do ourio-do-mar no ocorre at depois da juno do espermatozide com o vulo. Eles sugerem que os componentes ativadores do vulo se localizam na membrana ou no citoplasma do espermatozide. at mesmo possvel que por ocasio da fuso das membranas, as protenas G da membrana espermtica ou as tirosinoquinases (ativadas pela gelia do vulo para iniciar a reao acrossmica) ativem a cascata polifosfoinositdica para liberao de clcio do vulo. (No cenrio apresentado na Fi-

gura 4.26 D, a bindina meramente liga o vulo ou, talvez, motive a fosforilao de protenas necessrias em fases mais avanadas do desenvolvimento.) Ainda outra possibilidade que o agente ativo na liberao de clcio ligado venha do citosol do espermatozide. Parrington e colaboradores (1996) isolaram uma protena de 33-kDA, chamada oscilina, localizada no escasso citoplasma da cabea do espermatozide (Figura 4.26 E). A microinjeo dessa protena em vulos de camundongo pode iniciar liberao de clcio, porm, os outros parmetros da ativao do vulo (exocitose dos grnulos, recrutamento de mRNA e retomada do ciclo celular) no so observados. No conhecido qual o papel que essa protena pode ter na fisiologia da ativao do vulo.

Ativao do metabolismo do vulo


Embora a fertilizao seja freqentemente descrita como mero meio de juno de dois ncleos haplides, ela tem um papel igualmente importante na iniciao de processos que iniciam o desenvolvimento. Esses eventos acontecem no citoplasma e ocorrem sem o envolvimento dos ncleos.* O vulo do ourio-do-mar maduro uma clula metabolicamente lenta, reativada pelo espermatozide. Essa ativao apenas o estmulo; aciona um conjunto de eventos metablicos pr-programados. As respostas do vulo ao espermatozide podem ser divididas em precoces que ocorrem em poucos segundos aps a reao cortical e tardias que acontecem vrios minutos aps o inicio da fertilizao (Tabela 4.1). Respostas precoces O contato entre o espermatozide do ourio-do-mar ativa dois principais bloqueios polispermia: o bloqueio rpido, iniciado pelo influxo de sdio na clula, e o bloqueio lento, iniciado pela liberao intracelular de ons de clcio. A ativao de todos os vulos parece depender do aumento da concentrao de ons livres de clcio dentro do vulo. Em protostomatas, como lesmas e vermes, ao menos parte do clcio geralmente entra no vulo vindo de fora. Em deuterostomatas, tais como: peixes, rs, ourios-do-mar e mamferos, a ativao acompanhada pela liberao de ons de clcio do retculo endoplasmtico, resultando na onda de clcio varrendo o vulo (Jaffe, 1983; Terasaki e Sardet, 1991).

*Em certas salamandras, essa funo desenvolvimental da fertilizao est totalmente divorciada da funo gentica. A salamandra prateada (Ambystoma platineum) uma espcie hbrida que consiste somente de fmeas. Cada uma produz um ovo com um nmero no-reduzido de cromossomos. Esse ovo, porm, no pode se desenvolver sozinho; assim, a salamandra prateada copula com o macho da salamandra Jefferson (A. jeffersonianum). O espermatozide desse macho somente estimula o desenvolvimento do ovo; no contribui com material gentico (Uzzell, 1964). Para detalhes desse complexo mecanismo de procriao veja Bogart et al., 1989.

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PARTE II Padres de Desenvolvimento

Tabela 4.1
Evento

Eventos da fertilizao do ourio-do-mar


aproximado Tempo aproximado aps a inseminaoa

Ligao espermatozide-vulo Elevao do potencial de fertilizao (bloqueio rpido da polispermia) Fuso das membranas espermatozide-vulo Primeira deteco de aumento de clcio Exocitose das vesculas corticais (bloqueio lento da polispermia) Ativao da NAD quinase Aumento de NADH e NADPH Aumento do consumo de O2 Entrada do espermatozide Efluxo de cido Aumento de pH (permanece alto) Descondensao da cromatina do espermatozide Migrao do ncleo do espermatozide para o centro do vulo Migrao do ncleo do vulo para o ncleo do espermatozide Ativao da sntese protica Ativao do transporte de aminocidos Iniciao da sntese de DNA Mitose Primeira clivagem

O segundos dentro de 1 sec dentro de 6 sec 6 sec 15-60 sec comea em 1 min comea em 1 min comea em 1 min 1-2 min 1-5 min 1- 5 min 2-12 min 2-12 min 5-10 min comea em 5-10 min comea em 5-10 min 20-40 min 60-80 min 85- 95 min

Principais fontes: Whitaker e Steinhardt, 1985; Mohri et al., 1995. a Tempos aproximados baseados em dados de S. purpuratus (15-17oC), L. pictus (16-18oC), A . punctulata (18-20oC) e L. variegatus (22-24oC). A contagem de tempo para os eventos dentro do primeiro minuto melhor conhecida para Lytechinius variegatus, assim os tempos apresentados referem-se essa espcie.

Essa liberao de clcio essencial para a ativao do desenvolvimento do embrio. Se o quelante de clcio EGTA for injetado no vulo do ourio-do-mar, no ocorre exocitose dos grnulos corticais, mudana do potencial da fertilizao, descondensao do espermatozide, nem reincio da diviso celular (Kline, 1988). Reciprocamente, vulos podem ser ativados artificialmente na ausncia de espermatozide por procedimentos que liberam clcio livre no ocito. Steinhardt e Epel (1974) acharam que quantidades micromolares do ionforo A23187 induzem no vulo a maioria das respostas caractersticas de um ovo fertilizado normalmente. A elevao do envoltrio de fertilizao, o aumento do pH intracelular, o surto de utilizao de oxignio e o aumento da sntese de protena e DNA so todos gerados com sua seqncia prpria. Essa ativao acontece na ausncia total de ons de clcio na gua do mar. Na maioria desses casos, o desenvolvimento cessa antes da primeira mitose porque os ovos ainda so haplides e desprovidos do centrolo espermtico necessrio para a diviso. Essa liberao de clcio ativa uma srie de reaes metablicas (Figura 4.27). Uma delas a ativao da enzima NAD+ quinase, que converte o NAD+ em NADP+ (Epel et al., 1981). Essa mudana pode ter importantes conseqncias para o metabolismo lipdico, pois NADP+ (mas no o NAD+) pode ser utilizado como coenzima para biossntese lipdica. Assim, a mudana de NAD+ em NADP+ pode ser importante na construo de novas membranas exigidas durante a clivagem. Outro efeito dessa mudana se refere ao consumo de oxignio. Um surto de reduo de oxignio visto ocorrer durante a fertilizao, e muito desse surto respiratrio usado para cruzamento ligado da membrana de fertilizao. A enzima responsvel por essa reduo do oxignio (para gua oxigenada) tambm dependente de NADPH (Heinecke e Shapiro, 1989). Por ltimo, o NADPH ajuda na regenerao da glutationa e de ovotiois (ovothiols) que podem ser cruciais para remoo de radicais livres que poderiam de outra maneira prejudicar o DNA do ovo e do embrio precoce (Mead e Epel, 1995).

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

151

Influxo de Na+

Alterao do potencial da membrana

Bloqueio rpido da polispermia

Ativao da NAD+ quinase Ligao e/ou fuso de espermatozide membrana celular do vulo

Converso de NAD+ em NADP+ Bloqueio lento da polispermia Formao da camada hialina

Produo de IP3 Ativao de fosfolipase C

Liberao de Ca2+

Exocitose de grnulos corticais

Estimulao de protena G ou de tirosinoquinase?

Produo de diacil-glicerol

Ativao de proteno-quinase C

Estimulao de sntese protica, replicao de DNA, e movimentos citoplasmticos de material morfogentico

Figura 4.27

Troca Na+/H+

Modelo de um possvel mecanismo de ativao do vulo do ourio-do-mar. (Segundo Epel, 1980 e L. A. Jaffe, comunicao pessoal.)

Aumento do pH intracelular

Respostas tardias Pouco tempo aps o aumento dos nveis de ons clcio, o pH intracelular tambm aumenta. Acredita-se que essas duas condies inicas (> [Ca2+], < [H+] ajam em conjunto para fornecer o espectro completo dos eventos da fertilizao, incluindo a sntese de protenas e de DNA (Winkler et al., 1980; Whitaker e Steinhardt, 1982). O aumento do pH intracelular comea com o segundo influxo de ons de sdio, causando uma troca 1:1 entre ons de sdio da gua do mar e os ons hidrognio do vulo*. Essa perda de hidrognio faz o pH elevar-se de 6.8 a 7.2, ocasionando enormes mudanas na fisiologia do ovo (Shen e Steinhardt, 1978). As respostas tardias da fertilizao produzidas por essas alteraes inicas, incluem a ativao da sntese de DNA e da protena. O surto de sntese de protena ocorre vrios minutos aps a entrada do espermatozide e no depende da sntese de novo RNA mensageiro (Figura 4.28). Em seu lugar, a sntese de protena nova utiliza mRNAs j presentes no citoplasma do ocito (muito mais sobre isso ser mencionado no Captulo 12). Esses RNAs incluem aqueles que codificam protenas como histonas, tubulinas, actinas e fatores morfogenticos que so utilizados durante o desenvolvimento precoce. Tal surto de sntese protica pode ser induzido pelo aumento artificial do pH citoplasmtico por ons amnio (Winkler et al., 1980). Reciprocamente, agentes que bloqueiam o aumento do pH inibem eventos da fertilizao tardia como a sntese de DNA e protena. Quando ovos recm-fertilizados so colocados em solues contendo baixas concentraes de ons de sdio e amiloride (uma droga que inibe a troca Na+/H+), a sntese protica falha, os movimentos dos proncleos do vulo e do espermatozide so prevenidos, e a diviso celular no ocorre (Dube et al., 1985).
*Novamente, a variao espcie-para-espcie est solta. No vulo muito menor do camundongo, no h elevao do pH aps a fertilizao. Similarmente no camundongo, no h um aumento dramtico na sntese protica imediatamente em seguida fertilizao.

152

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Figura 4.28

Surto de sntese protica na fertilizao emprega mRNA armazenado no citoplasma do ocito. (A) Sntese protica em vulos do ourio-do-mar Arbacia punctulata fertilizada na presena ou ausncia de actinomicina D, um inibidor da transcrio. Durante as primeiras horas, a sntese protica ocorre sem nova transcrio dos ncleos do zigoto ou embrio. Um segundo surto de sntese protica ocorre durante os estgios medianos de blstula, e isso representa traduo de mensagens recm-transcritas (e, portanto, no visto em embries crescendo em actinomicina). (B) Aumento na porcentagem de ribossomos recrutados para polissomos durante as primeiras horas do desenvolvimento do ourio-do-mar, especialmente durante o primeiro ciclo celular. (A segundo Gross et al., 1964; B segundo Humphreys, 1971.)

Incorporao de valina[14C] na protena/mg protena (cpm x 10-3)

gua do mar normal

gua do mar tratada por actinomicina

Horas aps a fertilizao

Porcentagem de ribossomos em polissomos

Tempo de desenvolvimento (horas)

Fuso do material gentico


Em ourios-do-mar, o ncleo do espermatozide penetra o vulo perpendicularmente superficie do vulo. Aps a fuso das membranas do espermatozide e do vulo, o ncleo do espermatozide e seu centrolo se separam das mitocndrias e do flagelo. A mitocndria e o flagelo se desintegram dentro do vulo; assim, poucas, se tanto, mitocndrias derivadas do espermatozide so encontradas em organismos em desenvolvimento ou em adultos (Dawid e Blackler, 1972; Giles et al., 1980). Em camundongos estima-se que 1 em cada 10.000 mitocndrias so derivadas do espermatozide (Gyllensten et al., 1991). Assim, embora cada gameta contribua para o zigoto com um genoma haplide, o genoma mitocondrial transmitido principalmente pelo parente materno. Reciprocamente, em quase todos os animais estudados (o camundongo sendo a principal exceo), o centrossomo necessrio para a produo do fuso mittico das divises subseqentes derivado do centrolo espermtico (Sluder et al., 1989, 1993). O ncleo do vulo sendo haplide chamado de proncleo feminino. Dentro do citoplasma do vulo, o ncleo do espermatozide descondensa para formar o proncleo masculino. Uma vez dentro do vulo, o proncleo masculino sofre uma dramtica transformao. O envoltrio pronuclear forma vesculas com pequenos pacotes, expondo, com isso, a compacta cromatina do espermatozide ao citoplasma do vulo (Longo e Kunkle, 1978). As protenas que prendem a cromatina no seu estado condensado, inativa, so trocadas por protenas derivadas do citoplasma do vulo. Essa troca permite a descondensao da cromatina do espermatozide. Em ourios-do-mar, a descondensao parece ser iniciada pela fosforilao de duas

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

153

(A)

(B)

Proncleo do vulo

Ponte internuclear

Tempo (seg)

Proncleo do espermatozide

Figura 4.29

histonas espermatozide-especficas, que se ligam fortemente ao DNA. Esse processo comea quando o espermatozide entra em contato com uma glicoprotena na gelia do vulo que eleva o nvel da atividade proteinoquinase cAMP-dependente. (Tais proteino-quinases cAMP-dependentes foram mencionadas no Captulo 1.) Essas quinases fosforilam vrios resduos bsicos das histonas espermatozideespecficas interferindo, desse modo, com sua ligao ao DNA (Garbers et al., 1980, 1983; Porter e Vacquier, 1986). Esse afrouxamento considerado facilitar a substituio das histonas espermatozide-especficas por outras histonas que haviam sido estocadas no citoplasma do ocito (Poccia et al., 1981; Green e Poccia, 1985). Uma vez descondensado, o DNA pode iniciar a transcrio e a replicao. [fert9.html] Depois que o espermatozide do ourio-do-mar entra no citoplasma do vulo, o proncleo masculino gira 180o fazendo com que o centrolo fique entre o proncleo do espermatozide e o proncleo do vulo. Em seguida, o centrolo espermtico age como um centro organizador de microtbulos, estendendo seus prprios microtbulos e integrando-os com os microtbulos do vulo formando um ster*. Esses microtbulos se estendem atravs de todo o vulo, contatam o proncleo feminino, e trazem os dois proncleos um para perto do outro (Hamaguchi e Hiramoto, 1980; Bestor e Schatten, 1981). A fuso forma o ncleo zigtico diplide (Figura 4.19). A iniciao da sntese de DNA pode ocorrer no estgio pronuclear (durante a migrao) ou depois da formao do ncleo zigtico. Em mamferos, o processo da migrao pronuclear dura aproximadamente 12 horas, comparado com menos de uma hora no ourio-do-mar. O espermatozide do mamfero entra quase tangencialmente superfcie do vulo em vez de aproxim-la perpendicularmente, e funde com numerosas microvilosidades (veja Figura 4.20). O ncleo do espermatozide mamfero tambm se parte quando sua cromatina descondensa, sendo depois reconstrudo por vesculas coalescentes. O DNA do ncleo espermtico ligado por protenas bsicas chamadas protaminas; essas protenas nucleares esto firmemente compactadas atravs de ligaes dissulfeto. Uma vez no vulo, a glutationa reduz essas ligaes de dissulfeto, permitindo o desdobramento da cromatina do espermatozide (Calvin e Bedford, 1971; Kvist et

Eventos nucleares na fertilizao do ouriodo-mar. (A) Migrao dos proncleos do vulo e do espermatozide em um ovo de Clypeaster japonicus. O proncleo do espermatozide est rodeado por microtbulos do seu ster. (B) Fuso de proncleos no ovo do ourio-do-mar. (A de Hamaguchi e Hiramoto, 1980, cortesia dos autores; B cortesia de F. J. Longo.)

*Quando Oskar Hertwig observou esse arranjo radial de steres de espermatozide no seu recm-fertilizado ovo de ourio-do-mar, chamou-o de sol dentro do ovo, e considerou-o feliz indicao de uma fertilizao bem-sucedida (Hertwig, 1877). Mais recentemente, Simerly e colaboradores (1994) descobriram que certos tipos de infertilidade em homens eram devidos a defeitos na capacidade do centrossoma formar esses steres microtubulares. Essa deficincia causa a falncia da migrao pronuclear e a interrupo do desenvolvimento.

154

PARTE II Padres de Desenvolvimento

(A)

(B)

(C)

Figura 4.30

Movimento pronuclear em hamster. (A) Entrada de espermatozide na clula e tumefao do proncleo do espermatozide. (B) Aposio dos proncleos do espermatozide e do vulo. (C ) Estgio bicelular mostrando duas clulas de tamanhos iguais com ncleos bem definidos. Entulho no espao perivitelnico so os corpos polares em degenerao. (de Bavister, 1980, cortesia de B. D. Bavister.)

al., 1980). O proncleo masculino dos mamferos aumenta enquanto o ncleo do ocito completa sua segunda diviso meitica (Figura 4.30 A). O centrossomo que acompanha o proncleo masculino produz seus steres (principalmente a partir de protenas armazenadas no ocito) e contata o proncleo feminino. Ento, cada proncleo migra ao encontro do outro, replicando seu DNA ao longo do trajeto. No encontro, os dois envoltrios nucleares se desintegram (Figura 4.30B). No entanto, em lugar de produzir um ncleo zigtico comum (como acontece na fertilizao do ourio-do-mar), a cromatina condensa-se para formar cromossomos que se orientam num fuso mittico comum. Assim, um ncleo zigtico verdadeiro em mamferos visto primeiro no no zigoto, mas no estgio bicelular (Figura 4.30 C). [fert10.html]

Informaes adicionais

&

Especulaes

A No-Equivalncia dos Proncleos de Mamferos

ERALMENTE ASSUME-SE que machos e fmeas portam genomas haplides equivalentes. Um dos princpios fundamentais da gentica Mendeliana que os genes derivados do espermatozide so funcionalmente equivalentes aqueles derivados do vulo. No entanto, estudos recentes mostram que em mamferos o genoma derivado do vulo pode ser funcionalmente diferente e ter papel complementar durante certos estgios do desenvolvimento. A primeira evidncia dessa no-equivalncia veio de estudos de um tumor humano chamado mola hidatidiforme. Esses tumores parecem tecido placentrio. A maioria dessas molas se desenvolve de um espermatozide haplide ferti-

lizando um vulo no qual o proncleo feminino est ausente. Aps penetrar no vulo, os cromossomos do espermatozide se duplicam restaurando seu nmero diplide. Assim, todo o genoma derivado do espermatozide (Jacobs et al., 1980; Ohama et al., 1981). Aqui vemos uma situao em que as clulas sobrevivem, se dividem e tm um nmero normal de cromossomos, porm, apresentam um desenvolvimento anormal. Em vez de formar um embrio, o ovo se transforma numa massa de clulas placentosmiles. No h desenvolvimento normal quando o genoma inteiro vem do parente masculino. Evidncia para a no-equivalncia dos proncleos mamferos vem tambm de tentativas de conseguir que

vulos se desenvolvam na ausncia de espermatozide. A habilidade de desenvolver um embrio sem contribuio espermtica chamada partenognese (do grego, significando nascimento virgem). Os vulos de muitos invertebrados e de alguns vertebrados so capazes de se desenvolver normalmente na ausncia do espermatozide se o vulo for ativado artificialmente. Nessas situaes, a contribuio do espermatozide para o desenvolvimento parece dispensvel. Os mamferos, no entanto, no apresentam a partenognese. A colocao de ocitos de camundongo em um meio de cultura que artificialmente ativa o ocito, ao mesmo tempo suprimindo a formao do segundo corpo polar, produz

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

155

ovos diplides de camundongo cuja herana deriva somente do vulo (Kaufman et al., 1977). Essas clulas se dividem para formar embries com medula espinhal, msculos, esqueleto e rgos, incluindo coraes latejantes. Porm, o desenvolvimento no continua e no dia 10 ou 11 (metade do tempo da gestao), observam-se profundas diferenas entre os embries normais e os partenogenticos, esses deteriorando e ficando grosseiramente desorganizados (Figura 4.31). Nem no homem nem no camundongo o desenvolvimento pode ser completado com cromossomos derivados somente do vulo. A hiptese que proncleos masculinos e femininos so diferentes, tambm ganha apoio de experimentos de transplante pronuclear (Surani e Barton, 1983; Surani et al., 1986; McGrath e Solter, 1984). Proncleos recm-fertilizados de machos ou fmeas podem ser removidos e adicionados a outros ovos recm-fertilizados. (Os dois proncleos podem ser diferenciados nesse estgio, porque o feminino fica debaixo dos corpos polares.) Assim, podem ser construdos zigotos com dois proncleos masculinos ou dois femininos. Embora ocorra a clivagem embrionria, nenhum desse tipos de ovos

Tabela 4.2 Experimentos de transplantes pronucleares


Classe de zigotos reconstrudos Operao Nmero de transplantes bem-sucedidos Nmero de sobrevivente

Bimaternal Bipaternal Controles Fonte: McGrath e Solter, 1984.

339 328 348

0 0 18

se desenvolvem at o nascimento, ao passo que alguns ovos controle (contendo um proncleo masculino e um feminino de zigotos diferentes) que sofreram tal transplante se desenvolvem normalmente (Tabela 4.20). Ainda mais, os embries bimaternos ou bipaternos cessam o desenvolvimento ao mesmo tempo que camundongos partenogenticos. Portanto, embora os dois proncleos sejam equivalentes em muitos animais, nos mamferos existem importantes diferenas funcionais entre eles. A razo para essas mortes embrionrias que em algumas clulas somente o alelo de certos genes derivado da me ativo, enquanto em outras clu-

Figura 4.31 (A) Embries controle e (B) partenogenticos (dois proncleos femininos) de camundongos no 11 o dia de gestao. Os camundongos estavam se desenvolvendo na mesma fmea. Alm de serem menores e em deteriorao, os embries partenogenticos tambm tinham placentas muito menores. (de Surani e Barton, 1983, cortesia dos autores.)

las somente o alelo de genes derivado paternalmente funcional. (Na maioria dos genes, naturalmente, os alelos derivados do macho e da fmea so equivalentes e so ativados no mesmo grau em cada clula. Aqui estamos tratando de excees a essa regra Mendeliana.) Por exemplo, o fator de crescimento insulina-smile II (IGF-II) promove o crescimento de rgos embrionrios e fetais. Em embries de camundongos, o alelo de IGF-II derivado paternalmente ativo em todo o embrio, ao passo que o alelo derivado maternalmente em geral inativo (exceto em algumas clulas neurais). Assim, se um camundongo herda um alelo mutante IGF-II de sua me, ir se desenvolver at o tamanho normal (j que o alelo derivado maternalmente no expresso); porm, se o mesmo alelo mutante for herdado do pai, o camundongo ter crescimento prejudicado (DeChiara et al., 1991). O padro oposto de expresso allica se encontra para um dos receptores de IGF-II. Aqui, o gene paterno para o receptor mal transcrito, enquanto o alelo materno ativo (Barlow et al., 1991). As diferenas entre os alelos ativos e inativos so consideradas ser causadas por modificaes do DNA que ocorrem de maneira diferente nos ncleos do vulo e do espermatozide (sero discutidos posteriormente no Captulo 11). Como certos genes importantes para o desenvolvimento somente so ativos quando provindos do espermatozide e outros tais genes s so ativos quando vm do vulo, tanto proncleos maternos como paternos so necessrios para o desenvolvimento completo dos mamferos.

156

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Rearranjo do citoplasma do vulo


A fertilizao pode iniciar deslocamentos radicais nos materiais citoplasmticos do vulo. Esses rearranjos do citoplasma do ocito so muitas vezes cruciais para a diferenciao nas etapas seguintes do desenvolvimento. Como veremos nos captulos 13 e 14, o citoplasma do vulo freqentemente contm determinantes morfogenticos que ficam segregados em clulas especficas durante a clivagem. Esse determinantes, em ltima anlise, conduzem ativao ou represso de genes especficos conferindo, dessa maneira, certas propriedades s clulas que os incorporam. O arranjo espacial correto desses determinantes crucial para o desenvolvimento adequado. Em algumas espcies, esse rearranjo na orientao pode ser visualizado pela presena de grnulos pigmentados citoplasmticos. Um exemplo o vulo do tunicado Styela partita (Conklin, 1905). O ovo no-fertilizado desse animal est apresentado na Figura 4.32A. Um citoplasma cinzento central est envolvido por uma camada cortical contendo incluses lipdicas amarelas. Durante a meiose, a desintegrao nuclear libera uma substncia clara que se acumula no hemisfrio animal (superior) do vulo. Dentro de 5 minutos aps a entrada do espermatozide, o citoplasma interno claro e o cortical amarelo migram para o hemisfrio vegetal (inferior) do vulo. Quando o proncleo masculino migra do plo vegetal para o equador da clula, ao longo do futuro lado posterior do embrio, as incluses lipdicas migram com ele. Essa migrao forma um crescente amarelo, que se estende do plo vegetal ao equador (Figura 4.32B), trazendo o citoplasma amarelo para a rea onde mais tarde clulas musculares iro se formar na larva tunicada. O movimento dessas regies citoplasmticas depende de microtbulos que so gerados pelo centrolo e por uma onda de ons de clcio que contraem o citoplasma do plo animal (Sawada e Schatten, 1989; Speksnijder et al., 1990; Roegiers et al., 1995). Movimento citoplasmtico tambm visto em vulos de anfbios. Na r, um nico espermatozide pode entrar em qualquer lugar do hemisfrio animal; quando o faz, altera o padro citoplasmtico do vulo. Originalmente, o vulo radialmente simtrico em torno do eixo animal-vegetal. Aps a entrada do espermatozide, porm, o citoplasma cortical (externo) se desloca cerca de 30 relativos ao citoplasma interno, em direo ao ponto de entrada do espermatozide (Manes e Elinson, 1980; Vincent et al., 1986). Em algumas rs (como Rana), uma regio do vulo que antes estava coberta pelo citoplasma cortical escuro do hemisfrio animal fica agora exposta (Figura 4.33). Esse citoplasma subjacente, localizado perto do equador, no lado oposto do ponto de entrada do espermatozide, contm grnulos pigmentados difusos e, por isso, tem aparncia cinzenta. Essa regio tem sido referida como o crescente cinzento (Roux, 1987; Ancel e Vintenberger, 1948). Como veremos em captulos subseqentes, o crescente cinzento demarca a regio onde se iniciar a gastrulao em embries de anfbios.

Figura 4.32

Rearranjo citoplasmtico no vulo do tunicado Styela partita. (A) Antes da fertilizao, citoplasma cortical amarelo rodeia citoplasma cinzento, tipo gema. (B) Aps a entrada do espermatozide, o citoplasma cortical amarelo e o citoplasma claro derivado da degradao do ncleo do ocito escorrem vegetativamente em direo ao espermatozide. (C) medida que o proncleo do espermatozide migra para o plo animal em direo ao proncleo do vulo, os citoplasmas amarelo e claro os acompanham. (D) A posio final dos citoplasmas amarelo e claro, marcam os locais onde as clulas do origem ao mesnquima e aos msculos, respectivamente. (Segundo Conklin, 1905.)
Plo animal Citoplasma Cortical amarelo Ncleo do ocito

Material do ncleo do ocito

Gema cinzenta

Citoplasma claro

(A) Crio Plo vegetal

(B) Proncleo do Citoplasma espermatozide amarelo

(C) Proncleo do espermatozide Citoplasma amarelo

(D) Crescente amarelo Material da gema

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

157

(A) Ponto de entrada do espermatozide

(B) Crescente cinzento

Crtex

Citoplasma interno

Zona de deslizamento

Figura 4.33

Reorganizao do citoplasma no ovo recm-fertilizado da r. (A) Corte transversal esquemtico de um ovo na metade do primeiro ciclo de clivagem. O ovo tem simetria radial em torno do seu eixo animal-vegetal. O espermatozide entrou por um lado e seu ncleo est migrando para o interior. O crtex est representado como o de Rana, com um hemisfrio animal altamente pigmentado e um hemisfrio vegetal transparente. (B) Quando est aproximadamente em 80% de seu caminho na primeira clivagem, o citoplasma cortical gira cerca de 30 o em relao ao citoplasma interno. Essa rotao importante porque a gastrulao ir comear na regio oposta ao ponto de entrada do espermatozide onde ocorre o maior deslocamento do citoplasma. (Segundo Gerhart et al., 1989.)

Em rs como Xenopus, nas quais no se v um crescente cinzento, podemos assim mesmo, observar a rotao do citoplasma cortical em relao camada interna, subcortical. Esse movimento foi demonstrado por Vincent e seus colaboradores (1986). Esses investigadores imprimiram uma grade hexagonal de corante (Azul Nilo) sobre o citoplasma abaixo do crtex enquanto aplicavam outro tipo de corante (uma lectina ligada fluorescena) superfcie do ovo. Quando o ovo foi mantido em sua posio por incluso em gelatina, os pontos de Azul Nilo puderam ser vistos rodar de 30 em relao s manchas da lectina fluorescente (Figura 4.34). Em ovos normais, no inclusos, a superfcie do ovo considerada girar enquanto o citoplasma subcortical, tornado pesado pelas plaquetas de gema, permanece estabilizado por gravidade. O motor para esses movimentos citoplasmticos em ovos de anfbios parece ser um conjunto de microtbulos paralelos que ficam entre os citoplasmas interno e cortical do hemisfrio vegetal, na direo da rotao citoplasmtica. Os rastros dos microtbulos so primeiramente vistos imediatamente antes do comeo da rotao, e desaparecem quando esse movimento cessa (Figura 4.35; Elinson e Rowning, 1988). Tratamento do ovo com colchicina ou radiao ultravioleta interrompe a formao desses microtbulos, com isso parando as rotaes citoplasmticas. Usando anticorpos ligantes desses microtbulos, Houliston e Elinson (1991a) acharam que esses rastros eram formados por microtbulos derivados do espermatozide e do vulo, e que o centrolo espermtico direciona sua polimerizao, fazendo com que cresam para o interior da regio vegetal do ovo. Ao atingir o crtex vegetal, esses microtbulos se desviam do ponto de entrada do espermatozide, em direo ao plo vegetal. A posio descentralizada do centrolo espermtico quando esse inicia a polimerizao microtubular, proporciona direo rotao. A fora motriz para a rotao possivelmente, fornecida pela ATPase cinesina. Tal como a dinena e a miosina, a cinesina pode fixar-se s fibras e produzir energia pela hidrlise de ATP. Essa ATPase est localizada nos microtbulos vegetais e nas membranas do retculo endoplasmtico cortical (Houliston e Elinson, 1991b). O movimento do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno causa profunda movimentao nesse ltimo. Danilchik e Denegre 1991) marcaram plaquetas da gema

158

PARTE II Padres de Desenvolvimento

(A)

(B)

(C)

(D)

Figura 4.34

Rotao do citoplasma subcortical relativa ao citoplasma de superfcie da clula. (A) Um ovo recentemente fertilizado foi marcado com uma grade hexagonal de corante Azul Nilo (que cora os lpidios nas plaquetas de gema). O ovo foi embebido em gelatina, e as posies originais de alguns dos pontos marcados na superfcie celular com fluorescena (crculos em A). O ponto de entrada do espermatozide est marcado com um S. (B,C) Com o progredir do primeiro ciclo, os pontos do citoplasma subcortical mudaram de aproximadamente 30 o em relao superfcie externa imobilizada do ovo. O local no ovo designando a futura superfcie dorsal do embrio est marcado com um D. (D) Sumrio desses movimentos na regio vegetal (inferior) do ovo. (de Vincent et al., 1986, fotografias cortesia de J. C. Gerhart.)

com Azul Nilo e observaram seu movimento por microscopia fluorescente (o corante ligado emite fluorescncia vermelha). Durante a parte intermediria do primeiro ciclo celular, a massa do citoplasma central do ovo flui do presumvel lado ventral (abdome), para o futuro lado dorsal (posterior) do embrio (Prancha 7). Ao fim da primeira diviso, o citoplasma presumivelmente do lado dorsal do embrio, distintamente diferente daquele do provvel lado ventral. O que havia sido um embrio radialmente simtrico, agora um embrio bilateralmente simtrico. Como veremos nos Captulos 6 e 15, esses movimentos citoplasmticos iniciam uma cascata de eventos que determina o eixo dorso-ventral da r. Realmente, os microtbulos paralelos que permitem esses rearranjos parecem estender-se ao longo do futuro eixo dorso-ventral (Klag e Ubbels, 1975; Gerhart et al., 1983). Preparao para a Clivagem O aumento dos nveis de ons livres de clcio intracelular tambm inicia a movimentao de aparelhagem para a diviso celular. O mecanismo iniciador da clivagem provavelmente difere entre espcies, dependendo do estgio de meiose em que

CAPTULO 4 Fertilizao: Iniciando um novo organismo

159

Figura 4.35

(B)

Arranjo paralelo de microtbulos se estendem ao longo do hemisfrio vegetal, ao longo do futuro eixo dorso-ventral. (A) Arranjo paralelo de microtbulos vistos na segunda parte do primeiro ciclo celular por anticorpos fluorescente tubulina. (B) Antes da rotao citoplasmtica (cerca de metade do ciclo) nenhum arranjo pode ser visto. (C) No trmino da rotao do citoplasma, os microtbulos despolimerizam. (de Elinson e Rowning, 1988, cortesia de R. Elinson.)

(A)

(C)

ocorre a fecundao. No entanto, em todas as espcies estudadas, o ritmo das divises celulares regulado pela sntese e degradao de ciclina. A ciclina mantm as clulas em metfase, e a sua degradao permite s clulas voltarem para interfase. Alm de suas outras atividades, os ons de clcio tambm parecem iniciar a degradao da ciclina (Watanabe et al., 1991). Uma vez degradada a ciclina, os ciclos de diviso celular podem se reiniciar. A clivagem tem uma relao especial com essas regies citoplasmticas. Em embries tunicados, a primeira clivagem secciona o ovo em imagens duplicadas em um espelho. Desse estgio em diante, cada diviso em um lado do sulco de clivagem tem uma imagem em espelho do lado oposto. De maneira semelhante, o crescente cinzento seccionado pelo sulco da primeira clivagem em ovos de anfbios. Assim, a posio da primeira clivagem no aleatria, mas tende a ser especificada pelo ponto de entrada do espermatozide e a subseqente rotao do citoplasma do ovo. A coordenao do plano de clivagem e dos rearranjos citoplasmticos provavelmente mediada pelos microtbulos do ster do espermatozide (Manes et al., 1978; Gerhart et al., 1981; Elinson, 1985). Portanto, perto do fim do primeiro ciclo celular , o citoplasma se rearranja, os proncleos se encontram, o DNA est se replicando e novas protenas esto sendo sintetizadas. O palco est preparado para o desenvolvimento de um organismo multicelular. [fert11.html], [other.html#fert13]
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CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

167

Clivagem: Criando multicelularidade

Para nossa limitada inteligncia, pode parecer simples dividir um ncleo em partes iguais. A clula, manifestadamente, abriga uma opinio muito diferente. E. B. WILSON, (1923) Deve-se mostrar o mximo respeito por tudo que cresce exponencialmente, no importa o seu tamanho. GARRETT HARDIN, (1968)

mento. O zigoto, com o seu novo potencial gentico e com sua nova disposio do citoplasma, inicia agora a produo de um novo organismo multicelular. Em todas as espcies de animais conhecidas, isso comea por um processo chamado clivagem, uma srie de divises mitticas pelo qual o enorme volume do citoplasma do ovo dividido em numerosas pequenas clulas nucleadas. Essas clulas em estado de clivagem so chamadas de blastmeros. Na maioria das espcies (mamferos sendo a principal exceo) a velocidade da diviso celular e a colocao dos blastmeros um em relao ao outro esto completamente sob controle das protenas e dos mRNAs armazenados no ocito pela me. O genoma zigtico transmitido por mitose para todas as outras clulas, no funciona em embries com clivagem precoce. Poucos, se alguns, mRNAs so produzidos mais tarde durante a clivagem, o embrio pode dividir-se apropriadamente at mesmo quando produtos qumicos so usados para inibir a transcrio. Tambm em muitas espcies, no h aumento do volume embrionrio durante a clivagem. Isso difere da maioria dos casos de proliferao de clulas, do qual existe um perodo de crescimento celular entre as mitoses: a clula se expande para quase o dobro de seu volume, da se divide. Esse crescimento produz um aumento total de clulas enquanto mantm uma razo relativamente constante entre volume nuclear e volume citoplasmtico. Durante a clivagem embrionria, no entanto, o volume citoplasmtico no aumenta. Antes, o enorme volume do citoplasma zigtico dividido cada vez mais em clulas menores. O primeiro ovo dividido ao meio, em seguida em quartos, em oitavos, e assim por diante. Essa diviso do citoplasma do ovo, sem o aumento do seu volume, acompanhada pela abolio do perodo de crescimento entre as divises, enquanto a clivagem dos ncleos ocorre numa razo to rpida nunca vista antes (nem mesmo em clulas de tumor). Um ovo de r, por exemplo, pode ser dividido em 37.000 clulas em apenas 43 horas. A mitose na Drosophila, em estgio de clivagem, ocorre a cada dez minutos por mais de duas horas, e em apenas 12 horas forma algo em torno de 50.000 clulas. Esse aumento em nmero de clulas pode ser apreciado comparando a clivagem com outras fases do desenvolvimento. A Figura 5.1 mostra o logaritmo de nmeros celulares em um embrio de r representado graficamente em funo do tempo de desenvolvimento (Sze, 1953). Ela ilustra uma evidente descontinuidade entre clivagem e gastrulao. Uma conseqncia dessa diviso rpida a razo do volume citoplasmtico/nuclear se tornar cada vez menor assim que a clivagem progride. Em muitos tipos de embries, a diminuio da razo entre os volumes citoplasmtico e nuclear crucial na

OTVEL COMO S ELA , a fertilizao o passo inicial do desenvolvi-

167

168

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Figura 5.1
Log10 do nmero de clulas por embrio

Formao de novas clulas durante o desenvolvimento precoce da r Rana pipiens. (Segundo Sze, 1953.)

Clivagem

Gastrulao

Horas a 150C

regulagem do tempo da ativao de certos genes. Por exemplo, na r Xenopus laevis, a transcrio de novas mensagens s ativada aps 12 divises. A essa altura, a razo da clivagem diminui, os blastmeros tornam-se mveis e os genes nucleares comeam a ser transcritos. sabido que algo no ovo est sendo titulado pela recm-produzida cromatina, porque o tempo dessa transio pode ser mudado experimentalmente alterando na clula a razo da cromatina para o citoplasma (Newport and Kirschner, 1982a,b), ainda que a clivagem comece logo aps a fertilizao e termine assim que o embrio atinja um novo equilbrio entre o ncleo e o citoplasma.

PADRES DE CLIVAGEM EMBRIONRIA


Clivagem um processo muito bem coordenado e regulado pelas leis genticas. O padro da clivagem embrionria de uma dada espcie determinado por dois parmetros principais: (1) a quantidade e a distribuio de protena do vitelo dentro do citoplasma e (2) aqueles fatores no citoplasma do ovo que influenciam no ngulo do fuso mittico e na determinao do tempo de sua formao. A quantidade e distribuio de vitelo determina onde a clivagem pode ocorrer e o tamanho relativo dos blastmeros. Quando um plo do ovo relativamente livre de vitelo, a diviso celular ocorre nesse plo de uma forma mais rpida do que a do plo oposto. O plo rico em vitelo chamado de plo vegetal; a concentrao de vitelo no

Tabela 5.1 Classsificao dos tipos de clivagem Padro de clivagem Holoblstica (clivagem completa) Posio do vitelo Isolcito (oligolcito) (vitelo escasso, distribudo por igual) Simetria de clivagem Radial Espiral Bilateral Rotacional Radial Bilateral Discoidal Superficial Animais representativos Equinodermos, Amphioxus Maioria dos moluscos, aneldeos, nematelmintos, platelmintos Ascdios Mamferos Anfbios Moluscos cefalpodos Rpteis, peixes, aves Maioria dos artrpodos

Meroblstica (clivagem incompleta)

Mesolcito (moderadamente telolcito) Telolcito (vitelo denso, concentrado em uma extremidade do ovo) Centrolcito (vitelo concentrado no centro do ovo)

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

169

plo animal relativamente baixa. O ncleo do zigoto freqentemente deslocado em direo ao plo animal. No geral, o vitelo inibe a clivagem. A Tabela 5.1 fornece a classificao dos tipos de clivagem e mostra a influncia do vitelo no padro e na simetria da clivagem. Em zigotos com relativamente pouco vitelo (ovos isolcitos e mesolcitos) a clivagem holoblstica, significando que o sulco da clivagem se extende por todo o ovo. Zigotos contendo grande acmulo de protena vitelnica sofrem clivagem meroblstica, onde somente uma poro do citoplasma clivado. O sulco da clivagem no chega a penetrar na poro de vitelo do citoplasma. Clivagem meroblstica pode ser discoidal, como nos ovos das aves, ou superficial, como em zigotos de insetos, dependendo onde o depsito de vitelo estiver localizado, de um lado (telolcito) ou no centro do citoplasma (centrolcito), respectivamente. O vitelo uma extraordinria adaptao que permite ao embrio se desenvolver na ausncia de uma fonte externa de alimentao. Animais desenvolvidos sem grandes concentraes de vitelo, como os ourios-do-mar, normalmente formam o estgio larval muito rapidamente. Esse estgio larval pode se alimentar por si s, o desenvolvimento continua com a larva nadando livre. Embries de mamferos, que tambm no possuem uma grande quantidade de vitelo, adotam uma outra estratgia: a placenta, como veremos adiante, se torna a primeira diferenciao do embrio mamfero separando as clulas que iro formar a placenta. Esse rgo fornece alimento e oxignio para o embrio durante sua longa gestao. No outro extremo esto os ovos dos insetos, peixes, rpteis e aves. A maior parte do seu volume celular vitelo. O vitelo deve ser o suficiente para nutrir esses animais, sendo que eles se desenvolvem sem um estgio larval ou placentrio. A correlao entre grandes concentraes de vitelo e a falta do estado larval conhecida em algumas espcies de rs. Algumas rs tropicais, tais como as Eleutherodactylus e a Arthroleptella no passam pelo estgio de girino. Ao contrrio, eles provm seus ovos com quantidades enormes de concentrao de vitelo (Lutz, 1947). Os ovos no necessitam ser colocados na gua porque o estgio de girino foi eliminado. (Isso ser discutido mais adiante no Captulo 19.) No entanto, o vitelo somente um fator influenciando o padro de clivagem em uma espcie. Existem tambm padres herdados de divises celulares que so adicionados s restries do vitelo. Isso pode ser prontamente observado em ovos isolcitos, nos quais muito pouco vitelo est presente. Na ausncia de grandes quantidades de vitelo, quatro tipos principais de clivagem podem ser observados: holoblstica radial, holoblstica espiral, holoblstica bilateral e clivagem holoblstica rotacional.

Clivagem holoblstica radial


Clivagem holoblstica radial a forma mais simples de clivagem de se entender. Nesse tipo de clivagem os sulcos tm orientao paralela e perpendicular ao eixo animalvegetal do ovo. Esse tipo de clivagem caracterstico de equinodermos e do protocordato Amphioxus, assim como de rs e salamandras. A holotria, Synapta A clivagem padro da holotria, Synapta digita, ilustrada na Figura 5.2. Aps a unio dos proncleos, o eixo da primeira haste mittica formado perpendicularmente ao eixo animal-vegetal do ovo. Para esse fim, o primeiro sulco da clivagem passa diretamente atravs dos plos animal e vegetal, criando duas clulas filhas do mesmo tamanho. Essa clivagem conhecida como meridional porque passa pelos dois plos como um meridiano no globo. Os sulcos da segunda clivagem esto no ngulo reto dos sulcos da primeira clivagem, mas continuam perpendiculares ao eixo animal-vegetal do ovo. Os dois sulcos da clivagem aparecem simultaneamente em ambos blastmeros e tambm passam pelos dois plos. Dessa maneira, as primeiras duas divises so, ao mesmo tempo, meridional e perpendicular uma com a outra. A terceira diviso equatorial: as hastes mitticas de cada blastmero esto agora em posio

170

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Figura 5.2

Plo animal

Clivagem holoblstica no equinodermo Synapta digita, levando formao de uma blstula oca, conforme mostrado no corte (ltimo painel). (Segundo Saunders, 1982.)

Plano de clivagem meridional

Plano de clivagem equatorial

Plo vegetal

Metade Animal

Plo animal

Metade Vegetal

Blstula oca (aberta por corte)

Plo vegetal

paralela ao eixo animal-vegetal, e o sulco resultante da clivagem separa os dois plos um do outro, dividindo o embrio em oito blastmeros iguais. Cada blastmero na metade animal do embrio est agora diretamente acima do blastmero da metade vegetal. A quarta diviso meridional novamente, produzindo duas fileiras de 8 clulas cada, enquanto a quinta diviso equatorial, produzindo quatro fileiras de 8 clulas cada. Sucessivas divises produzem embries de 64,128 e 256 clulas, com divises meridionais alternando com divises equatoriais. Os embries resultantes consistem de blastmeros dispostos em fileiras horizontais ao longo de uma cavidade central. Em ambos os plos do embrio, os blastmeros se movem, uns em direo aos outros, para criar uma esfera oca composta de uma nica camada de clulas. Essa esfera oca chamada de blstula, e a cavidade central referida como blastocele. A qualquer momento durante a clivagem da Synapta, um embrio seccionado atravs de qualquer meridiano produz a imagem refletida de duas metades. Esse tipo de simetria caracterstico de uma esfera ou cilindro e chamada de simetria radial. Dessa maneira, Synapta tem clivagem holoblstica radial. Ourio-do-Mar Ourio -do-Mar O ourio-do-mar tambm apresenta clivagem holoblstica radial, mas com algumas importantes modificaes. A primeira e a segunda clivagem so similares as da Synapta; ambas so meridionais e perpendiculares em relao a outra. Similarmente, a terceira clivagem equatorial, separando os dois plos um do outro (Figura 5.3). Na quarta clivagem, no entanto, os eventos so bem diferentes. As quatro clulas da camada animal se dividem meridionalmente em oito blastmeros, cada qual com o mesmo volume. Essas clulas so chamadas mesmeros. A camada vegetal, no entanto, sofre uma clivagem equatorial desigual para produzir no plo vegetal quatro clulas grandes, os macrmeros, e quatro pequenas, os micrmeros (Figura 5.4; Summers et al., 1993). Assim que a clula com 16 embries clivar, os oito mesmeros se dividem para formar duas camadas animais, an1 e an2, uma se equilibrando em cima da outra. Os macrmeros se dividem meridionalmente, formando uma camada de oito clulas abaixo de an2. Os micrmeros tambm se dividem, produzindo um pequeno grupo abaixo da camada maior. Todos os sulcos de clivagem da sexta diviso so equatoriais; a stima clivagem meridional, produzindo uma blstula com 128 clulas.

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

171

(A)

Plo animal

Figura 5.3

Plo vegetal Mesmeros

Metade animal

an 1 an 2

derivados derivados veg1 veg2

Clivagem no ourio-do-mar. (A) Planos de clivagem nas primeiras trs divises e formao de camadas particulares de clulas nas divises 3-6. (B-D) Fotomicrografias de embries vivos do ourio-do-mar Lytechinus pictus, viso de cima para baixo do plo animal. (B) O estgio de 2 clulas. (C) O estgio de 4 clulas. (D) O estgio de 32 clulas, mostrado sem a membrana de fertilizao para permitir a visualizao dos mesmeros do plo animal, os macrmeros centrais e dos micrmeros vegetais em ngulo para o centro. (Fotografia cortesia de G. Watchmaker.)

Metade vegetal (B)

Micrmeros

Macrmeros (C) (D)

Em 1939, Sven Hrstadius realizou um experimento simples demonstrando que o controle do tempo e colocao de cada clivagem de ourio-do-mar independente de clivagens preexistentes. Ele demonstrou que se inibisse a primeira, a segunda e terceira clivagens, sacudindo os ovos, ou colocando-os em gua do mar hipotnica, a clivagem desigual (quarta) que forma os micrmeros, ainda ocorreria no tempo apropriado. Sendo assim, Hrstadius concluiu que existem trs fatores que determinam a clivagem em um embrio de 8 clulas: (1) existem mudanas progressivas no citoplasma,

Figura 5.4

(A)

(B)

Formao de micrmeros durante a quarta diviso de embries de ourios-do-mar. Os plos vegetais dos embries so visualizados por baixo. (A) A localizao e orientao do fuso mittico na parte baixa das clulas vegetais so visualizadas com luz polarizada no embrio vivo. (B) A clivagem atravs desses fusos, colocados assimetricamente, produziu micrmeros e macrmeros. (de Inou, 1982, cortesia de S. Inou.)

172

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Clio

Blastocele

(A) Blstula jovem

(B) Blstula mais velha com placa vegetal achatada e tufo ciliar

(C)

Figura 5.5

Blstulas de ourio-do-mar. (A) Esquema de um corte controle atravs de uma blstula precoce de ourio-do-mar, mostrando uma camada nica de clulas arredondadas rodeando uma grande blastocele. (B) Com a contnua diviso, as clulas da blstula tardia mostram diferenas de forma medida que as clulas da placa vegetal se alongam, (C) Junes apertadas (flecha) formando se entre clulas de uma blstula de equinodermo com 1024 clulas. (A e B segundo Giudice, 1973; C de Dan-Sohkawa e Fujisawa, 1980, cortesia dos autores.)

algum tempo aps a fertilizao, que direcionam os fusos formados para uma certa direo; (2) deve haver material formador de micrmero no citoplasma vegetal; e (3) deve haver algum mecanismo pelo qual o material formador de micrmeros seja ativado no tempo correto (Hrstadius,1973). No desenvolvimento do ourio-do-mar, o estgio de blstula comea na fase de 128 clulas. Nesse estgio, as clulas formam uma esfera oca circundando a blastocele central (Figura 5.5A,B). Nessa altura, todas as clulas so do mesmo tamanho, os micrmeros tendo diminuda sua diviso celular e clivando menos freqentemente. Toda a clula est em contato com o fluido proteinceo da blastocele e com a camada hialina dentro do envoltrio de fertilizao. Durante esse tempo, os contatos entre as clulas so estreitados. Dan-Sohkawa a Fujisawa (1980) analisaram esse mtodo em embries de estrela-do-mar e mostraram que o fechamento da cavidade esfrica contempornea com a formao de junes apertadas entre os blastmeros. Essas junes unem as clulas frouxamente conectadas num tecido epitelial onde a blastocele isolada do ambiente externo (Figura 5.5C). Dando prosseguimento a sua diviso, a camada celular expandida e se afina. Durante esse perodo, a blstula permanece como uma camada unicelular grossa. Duas teorias surgiram para explicar a concomitante proliferao de clulas e formao da blastocele. Dan (1960) conjeturou que o motivo maior dessa expanso o influxo de gua na cavidade da blastocele. J que o blastmero secreta protena na blastocele, seu fluido torna-se espesso. Esse fluido absorve grandes quantidades de gua por osmose, exercendo presso nos blastmeros para se expandirem. Essa presso tambm alinha o longo eixo de cada clula para que a diviso nunca seja para dentro da blastocele. Isso criaria uma expanso adicional fazendo com que a populao fosse orientada somente para um plano. Wolpert e Gustafson (1961) e Wolpert e Mercer (1963) propuseram que a presso da blastocele no necessria para se conseguir esse efeito. Eles enfatizaram o papel de adesividade das clulas entre si e a camada hialina. Eles mostraram que enquanto permanecessem fortemente atracadas na camada hialina, as clulas no tm alternativa a no ser a de se expandir. Essa expanso cria a blstula ao invs do contrrio. Certamente, a camada hialina vital para expanso da blastocele, e se a adeso de clulas da camada hialina inibida por anticorpos para a hialina, ento a expanso da blastocele cessa (Adelson e Humphreys, 1988). Em um trabalho recente (Ettensohn e Ingersoll, 1992) concluram que provvel que ambos

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

173

mecanismos expandem a blastocele. Durante a clivagem precoce, a adeso camada hialina parece ser o fator mais importante, enquanto que em estgios mais tardios, a presso osmtica tambm parece exercer o seu papel. A clulas da blstula desenvolvem clios em sua superfcie externa (Figura 5.6), desse modo, causando a rotao da blstula dentro do envoltrio de fertilizao. Logo aps, as clulas da parte animal do embrio sintetizam e secretam uma enzima de ecloso que lhes permite digerir a membrana fertilizante (Lepage et al., 1992), o embrio se torna uma blstula eclodida livre para nadar. Anfbios Clivagem na maioria dos embries de rs e salamandras radialmente simtrica e holoblstica, como na clivagem do equinodermo. O ovo do anfbio, no entanto, contm muito mais vitelo. Esse vitelo, que concentrado no hemisfrio vegetal, um impedimento clivagem. Sendo assim, a primeira diviso comea no plo animal e vagarosamente se estende at a regio vegetal (Figura 5.7). Na salamandra axolotle, o sulco da clivagem se estende atravs do hemisfrio animal a uma velocidade prxima de 1mm/min. O sulco da clivagem seciona o crescente cinzento e depois diminui para menos de 0.02-0.03mm/min ao se aproximar do plo vegetal (Hara, 1977). A Figura 5.8A uma varredura no microscpio eletrnico, mostrando a primeira clivagem em um ovo de r. Podemos notar as dobras nos sulcos da clivagem e a diferena entre os sulcos nos hemisfrios animal e vegetal. A Figura 5.8B mostra que enquanto o sulco da primeira clivagem ainda est tentando clivar o vitelo citoplasmtico do hemisfrio vegetal, a segunda clivagem j comeou prxima ao plo animal. Essa clivagem est em ngulos retos em relao primeira, e tambm meridional. A terceira clivagem, como era de se esperar, equatorial. No entanto, por causa do vitelo vegetalmente colocado, esse sulco da clivagem em ovos anfbios muito mais prximo do plo animal. Ele divide o embrio de r em quatro blastmeros animais pequenos (micrmeros) e quatro grandes blastmeros (macrmeros) na regio vegetal. Essa clivagem holoblstica desigual estabelece duas regies embrionrias principais: uma de diviso rpida de micrmeros, prxima ao plo animal, e outra de macrmeros, mais lenta (Figura 5.8C). Assim que a clivagem progride, a regio animal se torna abarrotada com numerosas clulas pequenas, enquanto a regio vegetal contm uma pequena quantidade de grandes macrmeros carregados de vitelo (ver Figura 5.7). Embries anfbios contendo de 16 a 64 clulas so freqentemente chamados mrulas (do Latim amora, da qual sua forma vagamente reminiscente). No estgio de 128 clulas a blastocele se torna aparente e o embrio considerado uma blstula.

Figura 5.6

Clulas ciliadas da blstula. Cada clula desenvolve um nico clio. (Cortesia de W. J. Humphreys.)

(A)

(B)

(C)

(D)

Figura 5.7

Crescente Cinzento (E) (F) (G) (H) Blastocele

Clivagem de um ovo de r. Sulcos de clivagem, designados por nmeros romanos, esto enumerados por ordem de aparecimento. (A, B) O vitelo vegetal impede a clivagem fazendo com que a segunda diviso comece na regio animal do ovo, antes da primeira diviso ter dividido o citoplasma vegetal. (C) A terceira diviso deslocada em direo ao plo animal. (D-H) No final, o hemisfrio vegetal contm blastmeros mais longos e mais escassos que os da metade animal. (Segundo Carlson, 1981.)

174

PARTE II Padres de Desenvolvimento

(A)

Figura 5.8

Pregas Sulco de clivagem

Micrografias ao microscpio eletrnico da clivagem de um ovo de r. (A) Primeira clivagem. (B) Segunda clivagem (4 clulas). (C) Quarta clivagem (16 clulas), mostrando a discrepncia de tamanho entre as clulas animais e vegetais aparecendo aps a terceira diviso. (A de Beams e Kessel, 1976, cortesia dos autores; B e C cortesia de L. Biedler.)

(B)

(C)

Na realidade, a formao da blastocele foi traada desde o primeiro sulco de clivagem. Kalt (1971) demonstrou que na r Xenopus laevis o primeiro sulco da clivagem se alarga no hemisfrio animal para criar uma pequena cavidade intercelular que isolada do ambiente externo por junes intercelulares muito apertadas (Figura 5.9). Essa cavidade se expande durante clivagens subseqentes para se tornar uma blastocele. A blastocele provavelmente presta duas principais funes no embrio das rs: (1) uma cavidade que permite migrao celular durante a gastrulao, e (2) previne clulas que esto abaixo interagir prematuramente com as clulas de cima. Quando Nieuwkoop (1973) tirou clulas do topo da blastocele de um embrio de salamandra aqutica e colocou-as junto a clulas do vitelo vegetal na base da blastocele, essas clulas animais se tornaram mesoderma ao invs de ectoderma. Como o tecido mesodrmico normalmente formado dessas clulas animais, que so adjacentes aos precursores do endoderma, parece plausvel que clulas vegetais influenciam clulas adjacentes para se diferenciar em tecidos mesodrmicos. Sendo assim, a blastocele aparece para prevenir o contato do endoderma com clulas destinadas para dar origem pele e aos nervos. Enquanto essas clulas esto dividindo-se, numerosas clulas com molculas de adeso mantm as clulas juntas. Uma das mais importantes dessas molculas a EPcaderina. O mRNA para essa protena fornecido no citoplasma do ocito, e se essa mensagem destruda (injetando no ocito oligonucleotdeos antisense complementares para esse mRNA), a EP-caderina no produzida e a adeso entre os blastmeros dramaticamente reduzida (Heasman et al., 1994). Isso resulta na obliterao da blastocele (Figura 5.10).

Figura 5.9

Formao da blastocele num ovo de r. (A) Primeiro plano de clivagem mostrando uma pequena fenda, que posteriormente se desenvolve na blastocele. (B) embrio de oito clulas mostrando uma pequena blastocele (flecha) na juno de trs planos de clivagem. (de Kalt, 1971, cortesia de M. R. Kalt.)

(A)

(B)

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

175

(A)

(B)

Figura 5.10

Depleo de EP-caderina mRNA no ocito de Xenopus, resultando na perda de adeso entre os blastmeros e na obliterao da blastocele. Oligonucleotdeos antisense complementares mensagem da EP-caderina foram injetados no embrio unicelular, prevenindo a expresso da EPcaderina. A blastocele obliterada em embries depletados de EP-caderina, mas (B) no pelos controles. (de Heasman et al., 1994; fotografia, cortesia de J. Heasman.)

Clivagem holoblstica espiral


Clivagem espiral caracterstica de vermes aneldeos, platelmintos turbelrios, vermes nemertinos e todos os moluscos, exceto cefalpodos. Difere da clivagem radial em muitas maneiras. Primeiro, os ovos no se dividem em paralelo ou em orientaes perpendiculares ao eixo animal-vegetal do ovo; de preferncia, a clivagem se d em ngulos oblquos, formando a disposio espiral de blastmeros filhos. Segundo, as clulas se tocam entre si em mais lugares do que em embries clivados radialmente. Na realidade, elas assumem o empacotamento com a orientao termodinamicamente mais estvel, parecido com o de bolhas de sabo adjacentes (Figura 5.11). Terceiro, embries de clivagem espiral normalmente realizam menos divises antes de comear a gastrulao, tornando possvel saber o destino de cada clula da blstula. Quando os destinos das clulas individuais em embries de aneldeos, platelmintos turbelrios e moluscos foram comparados, as mesmas clulas foram vistas no mesmo lugar e o seus destinos, de uma maneira geral, foram idnticos (Wilson, 1898). As blstulas ento produzidas no tm blastocele e so chamadas de estereoblstulas. As Figuras 5.12 e 5.13 retratam a clivagem de embries de moluscos. As duas primeiras clivagens so quase meridionais, produzindo quatro grandes macrmeros (marcados A, B, C e D). Em muitas espcies, os blastmeros so de tamanhos diferentes (D sendo o maior), uma caracterstica que permite serem individualmente identificados. Em cada sucessiva clivagem, cada macrmero origina um pequeno micrmero no seu plo animal. Cada quarteto sucessivo de micrmeros deslocado para a direita ou para a esquerda de seu macrmero irmo, criando um relacionamento espiral caracterstico da clivagem. Observando o embrio pelo plo animal, as partes superiores do eixo mittico parecem alternar entre o sentido horrio e o anti-horrio. Isso faz com que micrmeros alternados se formem obliquamente para a esquerda e para a direita do seu macrmero. Na terceira clivagem, o macrmero A dar origem a duas clulas filhas, macrmero 1A e micrmero 1a. As clulas B, C e D se comportam similarmente, produzindo o primeiro quarteto de micrmeros. Na maioria das espcies, os micrmeros esto direita do seu macrmero (olhando para o plo animal), uma disposio indicando uma espiral dextra (oposta sinistra). Na quarta clivagem,

Figura 5.11

Diagrama mostrando o arranjo de quatro e oito bolhas de sabo num prato ligeiramente cncavo. O arranjo termodinmico maximiza o contato e muito reminiscente daquele de embries que se clivam em espiral. (Segundo Morgan, 1927.)

176

PARTE II Padres de Desenvolvimento

(A)

Vista do plo animal

(B)

Vista lateral

Figura 5.12

Clivagem em espiral do molusco Trochus vista do plo animal (A) e de um lado (B). Em B, as clulas derivadas do blastmero A esto coloridas. Os fusos mitticos, esquematizados nos estgios precoces, dividem as clulas desigualmente e em ngulo aos eixos vertical e horizontal.

o macrmero 1A se divide para formar o macrmero 2A e o micrmero 2a; e o micrmero 1a se divide para formar mais dois micrmeros, 1a1 e 1a2. Mais clivagens iro produzir blastmeros 3A e 3a a partir do macrmero 2A; e micrmeros, como por exemplo o 1a2, se dividem para produzir clulas tais como as 1a21 e 1a22. A orientao da clivagem plana para a esquerda ou para a direita controlada por fatores citoplasmticos dentro do ocito. Isso foi descoberto analisando mutaes da espiral do caracol. Alguns caracis tm sua espiral aberta direita da concha, enquanto outros tm sua abertura para esquerda. Normalmente, a rotao da espiral a mesma para todos os membros de uma determinada espcie. Todavia, ocasionalmente, ainda so encontrados mutantes. Exemplificando, em espcies em que a espiral abre para a direita, sero encontrados alguns indivduos com a abertura espiral para a esquerda. Crampton (1984) analisou os embries desses caracis aberrantes e observou que sua clivagem precoce difere da normal.

Figura 5.13

Clivagem espiral do caracol Ilyanassa. O blastmero D maior que os outros, permitindo a identificao de cada clula. A clivagem dextra. (A) estgio de 8 clulas. PB o corpo polar. (B) Metade da quarta clivagem; os macrmeros j se dividiram em clulas grandes e pequenas orientadas espiralmente. (de Craig e Morrill, 1986, cortesia dos autores.)

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

177

(A)

Enrolamento sinistrogiro

(B)

Enrolamento dextrogiro

Figura 5.14

Olhando do plo animal de caracis enrolados para a direita e para a esquerda. A origem do enrolamento para direita e para a esquerda do caracol pode ser reconhecida pela orientao do fuso mittico na segunda clivagem. Os caracis sinistrogiros e dextrogiros se desenvolvem como imagens espelhares uma da outra. (Segundo Morgan, 1927.)

A orientao das clulas aps a segunda clivagem estava diferente (Figura 5.14), graas a uma orientao diferente do aparelho mittico nos caracis com enrolamento sinistrogiro. Todas as subseqentes divises em embries de espiral para a esquerda so imagens espelhares daqueles embries com espirais dextras. Na Figura 5.14, podemos notar que a posio do blastmero 4d (o qual muito importante, j que sua prognie ir formar os rgos mesodrmicos) diferente nos dois tipos de espirais dos embries. Geralmente, os dois caracis so formados com seus corpos em lados diferentes da abertura da espiral. A direo da abertura na espiral da concha do caracol controlada por um nico par de genes (Sturtevant, 1923; Boycott et al., 1930). No caracol Limnaea peregra a maioria dos indivduos so espiralados para a direita. Raros mutantes, exibindo abertura esquerda, foram encontrados e acasalados com caracis tipo-selvagem. Esses acasalamentos mostraram que existe um alelo D dextrogiro que dominante em relao ao alelo d sinistrogiro. No entanto, a direo da clivagem no determinada pelo gentipo do caracol em desenvolvimento, mas pelo gentipo da me do caramujo. Caramujo fmea do tipo dd pode produzir somente herdeiros de espiral sinistra, mesmo quando o gentipo dos herdeiros Dd. Um indivduo Dd ir se espiralar tanto para a direita quanto para a esquerda dependendo do genoma de sua me. Esses cruzamentos produzem o seguinte quadro:

178

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Os fatores genticos envolvidos no enrolamento do caracol so trazidos ao embrio no citoplasma do ocito. o gentipo do ovrio, no qual o fentipo se desenvolve, que determina em que direo a clivagem vai ocorrer. Quando Freeman e Lundelius (1982) injetaram no ovo de mes dd, uma pequena quantidade de citoplasma proveniente de caracis com espirais dextras, os embries resultantes apresentaram espirais para a direita. Citoplasmas de caracis com espiral esquerda no afetaram os embries com a espiral direita. Isso confirma a observao que mes do tipo selvagem estavam colocando um fator em seus ovos que estava ausente ou defeituoso nas mes dd. [cleave1.html] Outra descoberta emocionante com relao a clivagem dos moluscos est na comunicao entre os blastmeros. Nos moluscos de blastmeros de igual tamanho no estgio de quatro clulas*, a determinao de que a clula que originar a clula precursora mesodrmica ser alcanada entre a quinta e a sexta clivagem. Nessa altura, o macrmero 3D se estende para dentro entrando em contato com os micrmeros do plo animal. Sem esse contato, a clula 4d produzida pelos macrmeros 3D no produz mesoderma (van den Biggelaar e Guerrier, 1979). Injetando corantes de baixo peso molecular, de Laat e colegas (1980) demonstraram que na hora do contato (e no antes), pequenas molculas so capazes de difundirem-se entre os macrmeros 3D e os micrmeros centrais. Imagens ao microscpio eletrnico mostram que nesse momento, aparecem junes de fenda na superfcie dessas clulas.
*No se preocupe, daremos no Captulo 16 mais informaes sobre embries de moluscos com blastmeros de tamanhos desiguais.

Informaes adicionais

&

Especulaes

Adaptao pela modificao da clivagem embrionria

VOLUO causada pela alterao hereditria do desenvolvimento embrionrio. s vezes, somos capazes de identificar uma modificao da embriognese que impediu o organismo de sobreviver diferentemente em ambientes hostis. Uma dessas modificaes, descoberta por Frank Lillie em 1898, causada pela alterao do padro tpico da clivagem espiral na famlia uniondeo das ostras. Ao contrrio da maioria das ostras, Unio e seus aparentados vivem em locais de gua corrente. As correntes criam um problema para a disperso das larvas, porque os adul-

tos so sedentrios e as larvas que nadam livremente seriam sempre carregadas correnteza abaixo. Essas ostras, no entanto, resolveram esse problema efetuando duas modificaes no seu desenvolvimento. A primeira altera a clivagem embrionria. Na tpica clivagem dos moluscos, ou todos os macrmeros so iguais em tamanho, ou o blastmero 2D a maior clula no estgio embrionrio. No entanto, a diviso desse Unio tal que o blastmero 2d fica com a maior parte do citoplasma (Figura 5.15). Essa clula se divide para produzir a maior parte das estruturas larvais, incluindo uma gln-

dula capaz de produzir uma concha macia. Essas larvas (chamadas gloqudias) assemelham-se a pequenas armadilhas para urso; possuem plos sensveis que permitem as vlvulas da concha fecharem-se abruptamente quando tocadas pelas guelFigura 5.15

Formao de larvas de gloqudia pela modificao da clivagem em espiral. Aps formao do embrio de 8 clulas (A), a disposio do fuso mittico motiva a maioria do citoplasma D penetrar no blastmero 2d (B). Esse blastmero grande 2d se divide (C), para finalmente originar a grande concha armadilha de urso da larva (D). (Segundo Raff e Kaufman, 1983.)

(A)

(B)

(C)

(D)

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

179

ras ou barbatanas dos peixes que por ali estiverem passando. Elas pegam uma carona com o peixe at estarem prontas para cair e, atravs de metamorfose, transformarse em moluscos adultos. Dessa maneira, podem se espalhar correnteza acima. Em algumas espcies, as gloqudias so liberadas da bolsa de criao da fmea e meramente aguardam um peixe passar. Outras espcies, tal como a Lampsilis ventricosa, aumentaram as chances de suas larvas encontrarem um peixe realizando outra modificao no seu desenvolvimento (Welsh, 1969). Muitos moluscos desenvolvem um manto fino e saliente em volta da concha circundando a bolsa de criao. Em alguns uniondeos, a forma da bolsa de criao (marspio) e as ondulaes do manto

Figura 5.16

Peixe falso sobre o molusco uniondeo lampsilis ventricosa. O peixe , na verdade, a bolsa da cria e o manto do molusco. (Fotografia, cortesia de J. H. Welsh.)

imitam o comportamento e a forma de pequenos peixes nadando. Para tornar a iluso mais completa, desenvolveram uma mancha preta em forma de olho (ocelo) de um lado e uma nadadeira do outro. O peixe visto na Figura 5.16 no um peixe real, mas sim a bolsa de criao e o manto abaixo dela. Quando o peixe que estiver ao alcance for atrado, o molusco despeja as gloqudias da bolsa de criao. Dessa maneira, a modificao de padres de comportamentos j existentes permitiram moluscos uniondeos sobreviver em ambientes hostis.

Clivagem Holoblstica Bilateral Clivagem holoblstica bilateral encontrada primariamente nos ascdios (tunicados). A Figura 5.17 mostra a clivagem padro de um tunicado, Styela partita. O fenmeno mais admirvel nesse tipo de clivagem que o primeiro plano de clivagem estabelece o nico plano de simetria no embrio, separando o embrio do que ser o seu futuro lado direito e esquerdo. Cada diviso sucessiva orienta-se em relao a esse plano de simetria, e o meio embrio formado de um lado da primeira clivagem a imagem espelhar do meio embrio do outro lado. A segunda clivagem meridional, como a primeira diviso; mas ao contrrio da primeira diviso, no passa atravs do centro do ovo. Em vez disso, ela cria duas grandes clulas anteriores (blastmeros A e D) e duas pequenas clulas posteriores (blastmeros B e C). Cada lado tem agora um blastmero grande e um pequeno. Durante as trs prximas divises, as diferenas no tamanho e na forma destacam a simetria bilateral desses embries. No estgio de 32 clulas, uma pequena blastocele se forma e comea a gastrulao. Como foi mencionado no captulo 4, certos tunicados (incluindo S. partita) contm regies citoplasmticas coloridas. Durante a clivagem, essas se tornam fracionadas em clulas diferentes. Alm do mais, o tipo de citoplasma que a clula recebe determina seu destino. Clulas recebendo citoplasmas claros se tornam ectoderma; aquelas contendo citoplasma amarelo se transformam em clulas mesodrmicas; as clulas

Figura 5.16

Simetria bilateral em um ovo de tunicado. (A) Ovo no-clivado, mostrando os destinos das vrias regies citoplasmticas. (B) embrio de oito clulas, mostrando os blastmeros e os destinos das vrias clulas. Pode ser visualizado como duas metades de 4 clulas; daqui em diante, cada diviso no lado direito do embrio tem uma diviso espelhar do lado esquerdo. (C, D) Vistas de embries mais tardios do plo vegetal. (As regies do citoplasma destinadas a formar determinados rgos esto marcadas em A e so codificadas por cor em todo o diagrama.) (Segundo Balinsky, 1981.)
(D)

(A

(B)

(C)

Ectoderma

Ectoderma neural Msculo Mesnquima Plo vegetal Notocorda Endoderma Plo vegetal Vista do plo vegetal

180

PARTE II Padres de Desenvolvimento

que incorporam incluses ardsia se tornam endoderma e as clulas cinza claro, o tubo neural e a notocorda. Esses plasmas coloridos esto localizados bilateralmente em volta do plano de simetria e, assim, eles sero divididos pelo sulco da primeira clivagem em metades direita e esquerda do embrio. A segunda clivagem motiva o provvel mesoderma se posicionar nas duas clulas posteriores, enquanto o provvel tubo neural e cordomesoderma sero formados pelas duas clulas anteriores. Mais adiante, a terceira diviso ir repartir essas regies citoplasmticas, de modo que as clulas formadoras do mesoderma so confinadas aos dois blastmeros vegetais posteriores, e as clulas do cordomesoderma so restritas as duas clulas vegetais anteriores. O destino de cada clula do embrio precoce de Styela tem sido acompanhado e ser discutido em detalhe no Captulo 13.

Clivagem holoblstica rotacional


No surpresa alguma que o estudo da clivagem em mamferos tenha-se tornado um desafio. Os ovos de mamferos esto entre os menores do reino animal, tornando difcil seu manuseio experimental. O zigoto humano, por exemplo, tem somente 100 m de dimetro, praticamente invisvel, sendo seu volume menor de um milsimo do ovo de Xenopus. Tambm, zigotos de mamferos no so produzidos em nmeros comparveis aos embries do ourio-do-mar ou de rs. Normalmente, menos de 10 ovos so ovulados por uma fmea em um determinado tempo, tornando difcil a obteno de material para estudos bioqumicos. E como uma barreira final, o desenvolvimento dos embries dos mamferos se completa dentro de outro organismo ao invs de um ambiente externo. S recentemente foi possvel a duplicao de algumas dessas condies internas e observar o desenvolvimento in vitro. Com todas essas dificuldades, valeu a pena esperar o conhecimento da clivagem de mamferos, j que a clivagem nos mamferos completamente diferente de outros padres de diviso celular embrionria. O ocito dos mamferos liberado pelo ovrio e varrido pelas fmbrias at o oviduto (Figura 5.18). A fertilizao ocorre na ampola do oviduto, regio prxima ao ovrio. A meiose ento completada, e a primeira clivagem comea um dia depois. A clivagem nos mamferos est entre as mais lentas do reino animal de 12 a 24 horas de separao. Enquanto isso, os clios no oviduto empurram o embrio em direo ao tero; a primeira clivagem ocorre durante essa jornada. Existem vrias caractersticas da clivagem dos mamferos que as distinguem de outros tipos de clivagem. A primeira relativa a lentido das divises. A segunda diferena fundamental a singular orientao dos blastmeros dos mamferos um em relao ao outro. A primeira clivagem uma diviso meridional normal; no entanto, na

Estgio de 2 clulas tero Primeira clivagem

Zona pelcida

Figura 5.18

Desenvolvimento de um embrio humano desde a fertilizao at a implantao. A compactao em embries humanos ocorre no dia 4, quando ele est no estgio de 10 clulas. O ovo eclode da zona quando alcana o tero, e provvel que a zona evite a adeso das clulas em clivagem de se colarem ao oviduto, em lugar de viajar para o tero. (Segundo TuchmannDuplessis et al., 1972.)

Oviduto Mrula Blastocisto Ovrio Estgio precoce da implantao Fertilizao Ovulao

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

181

Plano de clivagem II

Plano de clivagem I

Plano de clivagem IIA

Plano de clivagem I

Figura 5.19

Comparao da clivagem precoce (A) em equinodermos (clivagem radial) e (B) em mamferos (clivagem rotacional). Nematides tambm tm uma forma rotacional de clivagem, porm, no formam a estrutura blastocstica caracterstica dos mamferos. Detalhes sobre a clivagem dos nematides sero fornecidos no Captulo 13. (Segundo Gulyas, 1975.)
Plano de clivagem IIB

(A) EQUINODERMO (Ourio-do-mar)

(B) MAMFERO (Coelho)

segunda clivagem um dos dois blastmeros se divide meridionalmente e o outro se divide equatorialmente (Figura 5.19). Esse tipo de clivagem chamada de clivagem rotacional (Gulyas, 1975). A terceira principal diferena entre a clivagem nos mamferos e a da maioria dos outros embries marcada pela falta de sincronizao das divises precoces. Os blastmeros de mamferos no se dividem ao mesmo tempo. Dessa maneira, embries de mamferos no aumentam por igual do estgio de 2 para 4 e para 8 clulas, mas freqentemente contm nmeros mpares de clulas. Tambm, diferente dos outros genomas animais, o genoma mamfero ativado durante a clivagem precoce, sendo o responsvel pela produo de protena necessria para a clivagem. No camundongo e na cabra, a mudana do controle maternal para o zigtico ocorre no estgio de duas clulas (Piko e Clegg, 1982; Prather 1989). [cleave2.html] Compactao Talvez a diferena mais crucial entre a clivagem de mamfero e todos os outros tipos envolva o fenmeno da compactao. Como mostra a Figura 5.20, blastmeros mamferos, atravessando o estgio de 8 clulas, formam um arranjo solto com espao suficiente entre eles. Seguindo a terceira clivagem, no entanto, os blastmeros passam

(A)

(B)

(C )

Figura 5.20

(D)

(E)

(F)

Clivagem de um nico embrio de camundongo in vitro. (A) estgio de 2 clulas. (B) estgio de 4 clulas. (C) incio do estgio de 8 clulas. (D) Estgio de 8 clulas compactado. (E) Mrula. (F) Blastocisto. (de Mulnard, 1967, cortesia de J. G. Mulnard.)

182

PARTE II Padres de Desenvolvimento

(A)

(B)

Figura 5.21

Micrografia ao microscpio eletrnico de embries de camundongos de 8 clulas. (A) nocompactados e (B) compactados. (Cortesia de C. Ziomek.)

por uma mudana espetacular em seu comportamento. De repente, se amontoam, maximizando seu contato com outros blastmeros, formando uma bola compacta de clulas (Figuras 5.20C,D e 5.21). Esse pacote estabilizado por junes apertadas que se formam entre as clulas, selando o interior da esfera (Figura 5.22). As clulas no interior da esfera formam junes com espaos, desse modo, permitindo pequenas molculas e ons passarem entre elas. As clulas do embrio compactado se dividem para produzir uma mrula de 16 clulas. Essa mrula consiste de um pequeno grupo de clulas internas rodeadas por um grupo maior de clulas externas (Barlow et al.,1972). A maior parte dos descendentes das clulas externas se tornam clulas do trofoblasto (trofectoderma). Esse grupo de clulas no produz estruturas embrionrias. Ao invs disso, formam o tecido do crio, a parte embrionria da placenta. O crio permite ao feto conseguir oxignio e nutrientes da me. Tambm secreta hormnios para que o tero da me retenha o feto e produza reguladores de resposta imune, fazendo com que a me no rejeite o embrio como faria com um rgo transplantado. No entanto, clulas do trofoblasto no so capazes de produzir clulas do prprio embrio. Elas so necessrias para implantar clulas do embrio na parede uterina (Figura 5.23). O embrio do camundongo derivado dos descendentes das clulas internas do estgio de 16 clulas, suplementada por clulas divididas do trofoblasto durante a transio para o estgio de 32 clulas (Pedersen et al., 1986; Fleming, 1987). Essas clulas geram a massa celular interna que dar origem ao embrio, acompanhada da bolsa com vitelo, alantide e mnio. Essas clulas no aparentam ser somente diferentes das clulas do trofoblasto, mas tambm sintetizam protenas diferentes nesse estgio do desenvolvimento precoce. Durante o estgio de 64 clulas, a massa celular interna (aproximadamente 13 clulas) e as clulas do trofoblasto se tornam camadas de clulas separadas, nenhuma delas contribuindo para clulas do outro grupo (Dyce et al., 1987; Fleming, 1987). Dessa forma, a distino entre os blastmeros do trofoblasto e da massa celular interna representa o primeiro evento diferenciado no desenvolvimento dos mamferos. Inicialmente, a mrula no tem uma cavidade interna. No entanto, durante um processo chamado cavitao, a clula do trofoblasto secreta um fluido para dentro da mrula para criar a blastocele. A massa celular interna fica posicionada de um lado do anel de clulas do trofoblasto (veja Figuras 5.20, 5.22 e 5.23). Essa estrutura chamada blastocisto e outro marco da clivagem de mamferos.

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

183

(A) Estgio precoce de 8 clulas: no-polar, porm com efeitos de contato local

Figura 5.22

Compactao e formao do blastocisto de camundongo. (A,B) embrio de 8 clulas, (C) mrula de 16 clulas, (D) blastocisto de 32 clulas. O lado esquerdo representa o organismo inteiro ou sua viso em corte. O lado direito detalha as mudanas associadas com o amadurecimento do trofoblasto. (Figuras direita segundo Fleming, 1992.)

(B) Compacto de 8 clulas: polar, correntes inicas. Basolateral: adeso de E-caderina; junes de fendas, ZO-1. Microtbulos acetilados. Apical: microvilosidades, actina cortical, endossomos, actina citoplasmtica, microtbulos Apical

Junes apertadas Lateral

Basal (C) 16 clulas: Adeso basolateral intensificada, laminina, cingulina, mitocndria, vesculas lipdicas. Basal: lisossomos, Golgi Junes apertadas entre clulas exteriores

Junes de fendas entre clulas interiores

(D) 32 clulas: transporte vetorial de fluido. Basolateral: desmossomos. Basal: Na+, K+ - ATPase. Apical: transportadores e canais Microvilosidades

Massa celular interna (ICM) Blastocele

Trofoblasto

E-caderinaDesmossomos Direo da corrente inica Na+, K+ - ATPase Junes de fendas Protenas da membrana apical

Desmossomos Lisossomos secundrios Golgi Filamentos de citoqueratina Microtbulos e actina citoplasmtica

Junes apertadas (ZO-1) (ZO-1) + cingulina Actina cortical Microvilosidades Mitocndrias

184

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Figura 5.23

Implantao de blastocistos de mamferos no tero. (A) Blastocistos de camundongo entrando no tero. (B) Implantao inicial do blastocisto no tero de um macaco Rhesus. (A de Rugh, 1967; B cortesia da Carnegie Institution of Washington, Chester Reather, fotgrafo.)

(A)

(B)

Informaes adicionais

&

Especulaes

A Superfcie da Clula e o Mecanismo de Compactao

OMPACTAO CRIA AS circunstncias que trazem tona a primeira diferenciao no desenvolvimento de mamferos: a separao do trofoblasto da massa celular interna. Como isso feito? Existe uma crescente evidncia que a compactao realizada por intermdio de eventos que ocorrem na superfcie das clulas dos blastmeros adjacentes. No primeiro estgio da compactao, cada um dos oito blastmeros interage com os seus vizinhos para sofrer polarizao da membrana. Componentes diferentes da superfcie das clulas migram para regies diferentes da clula (veja Figura 5.22; Ziomek e Johnson, 1980). Isso pode ser observado, marcando certas molculas da superfcie celular com corantes fluorescentes. Uma dessas marcaes, que reconhece a classe das glicoprotenas, mostra que no estgio de 4 clulas, essas glicoprotenas so aleatoriamente distribudas por toda a membrana (Figura 5.24A). No entanto, na metade do estgio de 8 clulas, essas molculas so encontradas predominantemente nos plos mais distantes do centro do agregado (Figura 5.24B). A polarizao da membrana influenciada por interaes clula a clula porque acontece somente quando a clula est em contato, no mnimo, com um outro blastmero. Se um blastmero for separado do resto do embrio perde sua polarizao. Protenas especficas da superfcie celular cumprem o seu papel na compactao. Uma dessas molculas, E-caderina (tam-

(A)

(B)

Figura 5.24

Polarizao de componentes da membrana em blastmeros de camundongo durante o estgio de 8 clulas. (A) Distribuio homognea, no-polar, de componentes da membrana marcados com concanavalina A fluorescente no estgio de 4 clulas. (B) Distribuio heterognea, polar, desses componentes no estgio de 8 clulas. (A de Fleming et al., 1986; B de Levy et al., 1986. Fotografias cortesia dos autores.)

bm conhecida como uvomorulina), uma glicoprotena adesiva de 120-kDa, sintetizada no estgio de 2 clulas distribuda uniformemente por toda a membrana celular. No entanto, com a ocorrncia da compactao, a E-caderina se torna restrita aqueles stios da membrana celular que esto em contato com os blastmeros adjacentes. Anticorpos para essa molcula causam a descompactao da mrula (Figura 5.25; Peyrieras et al., 1983; Johnson et al., 1986). A poro de carboidrato dessa glicoprotena pode ser essencial para o seu funcionamento, sendo a tunicamicina (droga que inibe a glicosilao das protenas) tambm capaz de prevenir a compactao. Experimentos recentes mostraram que a via do fosfatidilinositol tambm pode ser importante para inicializar a compactao. Se embries de 4 clulas de camundongo forem colocados em um meio contendo drogas que ativam a protena quinase C, ocorre compactao prematura. Similarmente diacilglicerdeos podem momentaneamente provocar a compactao de embries de 4 clulas. Quando isso ocorre, a E-caderina acumula-se especificamente nas junes entre os blastmeros (Winkel et al., 1990). Esses resultados sugerem que a ativao da protena quinase C pode iniciar a compactao mudando a localizao da E-caderina. E finalmente, a membrana celular pode tambm ser modificada durante a compactao, por meio de reorganizao do citoesqueleto. As microvilosidades, extendidas

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

185

por actino-filamentos, aparecem na superfcie de clulas adjacentes, unindo uma clula outra. Essas microvilosidades podem ser os stios onde a E-caderina est funcionando para mediar adeso intercelular. O achatamento dos blastmeros um contra o outro pode, portanto, ter acontecido em virtude do encolhimento do blastmero atravs da despolimerizao da actina (Pratt et al., 1982; Sutherland e Calarco-Gillam, 1983). Dessa maneira, existem evidncias crescentes de que a compactao causada por mudanas na arquitetura da superfcie celular dos blastmeros. No entanto, no est totalmente certo como esses eventos se relacionam um com o outro, ou como so coordenados e integrados na cadeia de eventos que causa a compactao.

(A)

(B)

Figura 5.25

Preveno da compactao por anti-soro contra a glicoprotena da superfcie celular, E-caderina, promotora da adeso. (A) Compactao normal ocorrendo em ausncia do anti-soro. (B) Proliferao sem compactao ocorrendo na presena de anticorpos contra a E-caderina. (Fotografias cortesia de C. Ziomek.)

Formao da massa celular interna O processo crucial para o precoce desenvolvimento dos mamferos a criao da massa celular interna distinta do trofoblasto. Como a clula direcionada para um ou outro desses caminhos? Como a clula informada que dar origem a uma poro do mamfero adulto ou que dar origem a um singular tecido de sustentao que ser descartado no nascimento? As observaes de embries vivos sugerem que essa importante deciso est meramente no fato de a clula estar no lugar certo na hora certa. At o estgio de 8 clulas, no existem diferenas bvias na bioqumica, morfologia ou potncia de qualquer um dos blastmeros. No entanto, a compactao forma clulas internas ou externas com propriedades muito diferentes. Marcando os vrios blastmeros, muitos investigadores descobriram que as clulas que estavam do lado de fora formariam o trofoblasto, enquanto que as clulas do lado de dentro formariam o embrio (Tarkowski e Wrblewska,1967; Sutherland et al.,1990).*Hillman e colegas (1972) mostraram que quando cada blastmero de um embrio de camundongo de 4 clulas colocado na superfcie externa de uma massa de blastmeros agregados, as clulas externas transplantadas somente daro origem ao tecido trofoblasto. Portanto, a opo da clula transformar-se em trofoblasto ou embrio depende se essa clula era externa ou interna aps a compactao. Pelcida Fuga da Zona Pelcida Enquanto o embrio est se movendo atravs do oviduto, rumo ao tero, o blastocisto se expande dentro da zona pelcida (a matriz extracelular do vulo foi essencial para a ligao do espermatozide durante a fertilizao). As membranas celulares das clulas trofectodrmicas contm uma bomba para o sdio (a Na+/K+-ATPase) de frente para a blastocele; as protenas bombeiam sdio para a cavidade central. Essa acumulao de ons de sdio permite que a gua entre por osmose, dessa maneira, dilatando a blastocele (veja Figura 5.22; Borland, 1977; Wiley, 1984). Durante esse perodo, essencial que a zona pelcida previna o blastocisto de aderir s paredes do oviduto. Quando tal aderncia acontece em humanos, chamada de ectpica ou

* As clulas internas mostraram virem mais freqentemente da primeira clula a se dividir no estgio de 2 clulas. Essa clula normalmente produz o primeiro par de blastmeros a alcanar o estgio de 8 clulas, e essas clulas se dividem de tal modo que elas esto soltas dentro dos blastmeros agregados (Graham e Kelly, 1977).

186

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Figure 5.26

Blastocisto de camundongo eclodindo da zona pelcida. (Fotografia de Mark et al., 1985, cortesia de E. Lacy.)

gravidez tubria. Essa condio especialmente grave, porque a implantao do embrio no oviduto pode causar uma hemorragia com perigo de morte. Quando o embrio alcana o tero, no entanto, ele deve livrar-se da zona pelcida para que possa aderir parede uterina. O blastocisto do camundongo se livra da zona pelcida perfurando um pequeno buraco e se espremendo atravs dele enquanto se expande (Figura 5.26). Uma protease semelhante tripsina, a estripsina, localizada na membrana celular lisa a matriz fibrilar da zona pelcida (Perona e Wassarman, 1986; Yamazaki e Kato, 1989). Uma vez fora, o blastocisto pode fazer contato direto com o tero. O epitlio uterino agarra o blastocisto em uma matriz extracelular contendo colgeno, laminina, fibronectina, cido hialurnico e receptores heparan sulfato. As clulas do trofoblasto contm os elementos que iro se juntar ao colgeno uterino, fibronectina e laminina; eles sintetizam o proteoglicano heparan sulfato dramaticamente no momento anterior implantao (veja Carson etal., 1983). Uma vez na clula epitelial uterina, o trofoblasto secreta outro conjunto de proteases, incluindo colagenase, estromelisina e ativador de plasminognio. Essas enzimas digestoras de protenas digerem a matriz extracelular do tecido uterino, impedindo o blastocisto de cobrir a si mesmo com a parede uterina (Strikland et al., 1976; Brenner et al.,1989).

Informaes adicionais

&

Especulaes

Gmeos e clulas embrionrias precursoras

S CLULAS PRECOCES do embrio podem substituir uma outra e compensar uma clula ausente. Isso foi primeiramente demonstrado em 1952, quando Seidel destruiu uma clula de um embrio de coelho e demonstrou que a clula remanescente poderia produzir o embrio por inteiro. Uma vez que a massa celular interna (ICM) se separou do trofoblasto, as clulas da ICM constituem um grupo de equivalncia onde cada clula da ICM tem a mesma potncia (nesse caso, cada clula pode originar todos os tipos de clulas do embrio, menos o trofoblasto), e seus respectivos destinos sero determinados por interaes entre os seus descendentes. Gardiner e Rossant (1976) tambm mostraram que se as clulas da massa celular interna (mas no clulas do trofoblasto) so injetadas no blastocisto, tambm contribuem para um novo embrio. J que seus blastmeros podem gerar qualquer tipo de clula no corpo, a massa celular interna tem sido referida, s vezes, como pluriblasto (Johnson e Selwood, 1996).

Gmeos humanos so classificados em dois grandes grupos: gmeos monozigticos (um ovo ou idnticos) e gmeos dizigticos (dois ovos ou fraternos). Gmeos fraternos so o resultado de dois eventos separados de fertilizao, ao passo que, gmeos idnticos so formados de um nico embrio cujas clulas, de alguma forma, dissociam uma da outra. Gmeos idnticos so provavelmente produzidos pela separao de blastmeros precoces ou mesmo pela separao da massa celular interna em duas regies no mesmo blastocisto. [cleave3.html] Casos de gmeos idnticos ocorrem em aproximadamente 25% dos nascimentos humanos. Cerca de 33 % dos gmeos idnticos tm dois crios completos e separados, indicando que a separao ocorreu antes da formao do tecido trofoblasto, no quinto dia (Figura 5.27A). O restante dos gmeos idnticos compartilham do mesmo crio, sugerindo que a separao ocorreu dentro da massa celular interna, aps a formao do trofoblasto. No nono dia, o embrio humano j completou a construo de uma outra camada extra-embrio-

nria, o mnio. Esse tecido forma a bolsa amnitica (ou bolsa de gua), envolvendo o embrio com fluido amnitico, protegendo-o da dessecao e movimentos bruscos (veja Captulo 6). Se a separao do embrio acontecesse aps a formao do crio, no quinto dia, mas antes da formao do mnio, no nono dia, os embries resultantes deveriam ter um crio e dois mnios (Figura 5.27B). Isso acontece em aproximadamente dois teros dos casos de gmeos humanos idnticos. Uma pequena porcentagem de gmeos idnticos nascem com um nico crio e mnio (Figura 5.27C). Isso significa que a diviso do embrio aconteceu aps o nono dia, e tais recmnascidos correm o risco de serem gmeos ligados (Siameses). [cleave4.html] A habilidade de produzir um embrio completo, a partir de clulas que normalmente iriam produzir somente uma poro, chamada de regulao e discutida no Captulo 15. Regulao tambm vista na habilidade que dois ou mais embries precoces tm para formar um camundongo quimrico ao invs de gmeos, trigmeos ou um monstro de mltiplas cabeas. Camun-

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

187

Embrio

Saco vitelnico mnio

2 Crios

(A)

2 mnios Massa celular interna 1 Crio

(B)

Embrio bicelular Blastocele

2 mnios

1 Crio

(C)

1 mnio Crio

Figura 5.27

Diagrama mostrando a relao entre a formao de gmeos monozigticos humanos e as membranas extra-embrionrias. (A) A ciso ocorre antes da formao da trofectoderma, de modo que cada gmeo tem o seu prprio crio e mnio. (B) A ciso ocorre aps a formao da trofectoderma, porm, antes da formao do mnio, resultando em gmeos que tm sacos amniticos individuais, porm, compartilhando um crio. (C) Ciso aps a formao do mnio conduz a gmeos em um saco amnitico, e um nico crio. (Segundo Langman, 1981.)

dongos quimricos so o resultado de duas ou mais clivagens precoces (normalmente 4- ou 8-clulas) de embries que foram agregados artificialmente para formar um embrio composto. Como mostrado na Figura 5.28A, as zonas pelcidas de dois embries geneticamente diferentes so removidas e os embries so unidos para formar um blastocisto em comum. Esses blastocistos preparados so implantados no tero da me adotiva. Quando nascem, os descendentes quimricos tm algumas clulas de cada embrio. Isso prontamente observado quando os blastmeros agregados vm de uma linhagem que difere na cor da pelugem. Quando blastmeros de linhagem preta e branca so agregados o resultado normalmente um camundongo malhado (Figura 5.28B). Existe at evidncia que embries

humanos podem formar quimeras (de la Chappelle et al.,1974; Mayr et al.,1979). Esses indivduos tm dois tipos de clulas diferentes (XX e XY) dentro do mesmo corpo, cada uma com o seu conjunto de caractersticas genticas. A explicao mais simples para tal fenmeno que esses indivduos resultaram da agregao de dois embries, um macho e outro fmea, que estavam se desenvolvendo ao mesmo tempo. Se essa explicao estiver correta, ento dois gmeos fraternos se fundem para criar um nico indivduo composto. Markert e Petters (1978) mostraram que embries precoces de 8-clulas podem se unir para formar uma mrula compactada comum (Figura 5.29) e que o camundongo resultante pode ter a cor da pelugem de trs linhagens diferentes (prancha 21).

Alm disso, eles mostraram que cada um dos trs embries deram origem a precursores dos gametas. Quando um quimrico (preto/marrom/branco) fmea de camundongo acasalava com um macho de pelugem de cor branca (recessivo), a ninhada era um de cada cor. De acordo com nossas observaes sobre formao de gmeos e camundongos quimricos, cada blastmero da massa celular interna deve ser capaz de produzir qualquer clula do corpo. Essa hiptese tem sido confirmada, e ter importantes conseqncias no estudo do desenvolvimento dos mamferos. Quando as massas celulares internas so isoladas e crescem sob certas condies, permanecem indiferentes e continuam a se dividir em cultura (Evans e Kaufman,

188

PARTE II Padres de Desenvolvimento

(A)

Figura 5.28

Pronase

Zona pelcida

Blastmeros

Produo de camundongos quimricos. (A) Procedimento experimental para a produo de camundongos quimricos. Embries de camundongos geneticamente distintos (aqui aqueles com diferentes cores do plo) no incio do estgio de 8 clulas so isolados dos ovidutos dos camundongos e reunidos aps remoo de suas zonas pelcidas por ao de enzimas proteolticas. As clulas formam um blastocisto composto, que implantado no tero de uma me de criao. (B) Um camundongo adulto quimrico mostrando contribuies dos embries pigmentados (pretos) e no-pigmentados (brancos). (Fotografia cortesia de B. Mintz.)

(A)

Blastocisto Blastocistos implantados na me de criao

1981; Martin, 1981). Essas clulas so chamadas de clulas-tronco embrionrias (clulas ES). Como foi mostrado no captulo 2, essas clulas podem ser alteradas na placa de Petri. Genes clonados podem ser inseridos dentro de seu ncleo, ou genes existentes podem ser mutados. Quando essas clulas ES so injetadas nos blastocistos de um outro gene de camundongo, elas podem integrar a sua massa celular interna hospedeira. O embrio resultante tem clulas vindas de ambos tecidos, hospedeiro e doador. Essa tcnica se tornou extremamente importante para determinar a funo dos genes durante o desenvolvimento de mamfero.

(B)

(B) (C )

Figura 5.29
Agregao e compactao de trs embries de camundongo, no estgio de 8 clulas, para formar um nica mrula compactada. Clulas de trs diferentes embries (A) so agregadas para formar uma mrula (B) que sofre compactao para formar um blastocisto nico (C). O camundongo quimrico resultante mostrado na Prancha 21. (de Markert e Petters, 1978, cortesia de C. Markert.)

Clivagem Meroblstica
Como j foi mencionado anteriormente, concentraes de vitelo cumprem um papel importante na clivagem celular. Em parte alguma isso est to aparente como nos tipos de clivagem meroblstica. Aqui, as grandes concentraes de vitelo probem a clivagem no seu todo, exceto em uma pequena poro do citoplasma do ovo. Na clivagem

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

189

discoidal, a diviso celular limitada a um pequeno disco de citoplasma sem vitelo no topo de um monte formado por vitelo. Na clivagem superficial, o vitelo centralizado permite a clivagem somente na borda perifrica do ovo. Clivagem discoidal Clivagem discoidal uma caracterstica de aves, peixes e rpteis.
AVES. A Figura 5.30 mostra a clivagem de um ovo de ave. A massa do ocito
Sulcos de clivagem

tomada pelo vitelo, permitindo que a clivagem ocorra somente no blastodisco, uma regio de citoplasma ativo de aproximadamente 2-3mm de dimetro no plo animal do ovo. Porque essas clivagens no se estendem para o vitelo citoplasmtico, as clulas da clivagem precoce so, na realidade, contnuas nas suas bases. O primeiro sulco de clivagem aparece centralizado no blastodisco, e outras clivagens se seguem para criar um blastoderma de camada nica. Num primeiro instante, essa camada celular est incompleta, j que as clulas permanecem contnuas ao vitelo subjacente. Da por diante, clivagens equatoriais e verticais dividem o blastoderma em um tecido de cinco a seis camadas celulares. Essas clulas permanecem ligadas com junes apertadas (Bellairs et al.,1975; Eyal-Giladi, 1991). Entre o blastoderma e o vitelo existe um espao chamado cavidade subgerminal, criado quando uma clula blastodrmica absorve fluido da albumina (branco do ovo) e secreta-o entre si e o vitelo (New, 1956). Nesse estgio, as clulas mais profundas do centro do blastoderma so descartadas para criar uma zona pelcida unicelular (as clulas descartadas parecem morrer). O anel perifrico das clulas blastodrmicas que no so descartadas constituem a zona opaca. Quando uma galinha se considera pronta para botar um ovo, o blastoderma j contm 60.000 clulas. Algumas dessas clulas so delaminadas em cavidades subgerminais para formar uma segunda camada (Figura 5.31). Dessa maneira, logo aps a galinha ter botado o ovo, esse contm duas camadas de clulas: a superior epiblasto e a inferior hipoblasto. Entre elas est a blastocele. Detalharemos a formao do hipoblasto no prximo captulo.
PEIXES. Nos ltimos anos, o peixe zebra, Danio rerio, se tornou o organismo favorito para quem deseja estudar o desenvolvimento dos vertebrados. Esses peixes tm grandes crias, procriam o ano inteiro, so facilmente mantidos, tm embrio transparente que se desenvolve fora da me (uma caracterstica importante para a microscopia), e pode ser criado para que mutantes possam ser protegidos e propagados. Ademais, eles se desenvolvem rapidamente, para que 24 horas aps a fertilizao, o embrio j tenha formado a maior parte de seus tecidos e rgos primordiais, apresentando como caracterstica a forma semelhante ao girino (veja Granato e Nsslein-Volhard, 1996; Langeland e Kimmel, 1997). Os ovos de peixes com muito vitelo desenvolvem-se similarmente aos das aves, com a diviso celular ocorrendo somente no blastodisco do plo animal. Observaes da clivagem de ovos de peixe atravs de micrografia ao microscpio eletrnico

Blastoderma

Figura 5.30

Clivagem discoidal em um ovo de galinha, vista do plo animal. Os sulcos de clivagem no penetram no vitelo, e produzido um blastoderma formado por uma nica camada de clulas.

Figura 5.31

Formao de um embrio do pinto com duas camadas. Essa seo sagital prxima margem posterior, mostra uma camada superior consistindo de um epiblasto central que ir entrar nas clulas da foice de Koller (ks) e na zona marginal posterior (mz). Certas clulas do epiblasto caem (delaminam) da camada superior para formar ilhas de polinvaginao (pi) com 5 a 20 clulas cada. Essas clulas sero acrescidas por aquelas clulas hipoblsticas (hyp) que migraram anteriormente da foice de Koller para formar a camada inferior (hipoblstica). (Sc a cavidade subgerminal; gwm a margem da parede germinal). (de Eyal-Giladi et al., 1992, cortesia de H. Eyal-Giladi.)

190

PARTE II Padres de Desenvolvimento

(A)

(B)

(C)

(D)

Figura 5.32

Clivagem discoidal em um peixe-zebra, criando uma regio celular acima do vitelo denso. Em (A), BD significa a regio do blastodisco. (de Beams e Kessel, 1976, cortesia dos autores.)

(E)

(F)

de varredura mostram, de uma bela maneira, a natureza incompleta da clivagem discoidal (Figura 5.32). Como nos embries de anfbios e de ourios-do-mar, divises com clivagens precoce seguem um padro altamente reprodutvel de clivagem meridional e equatorial. Essas divises so rpidas, com periodicidade de aproximadamente 15 minutos cada. As primeiras 12 divises ocorrem sincronicamente, formando um monte celular situado no plo animal de uma grande clula de vitelo. Inicialmente, todas as clulas mantm conexes abertas umas com as outras e com a clula de vitelo subjacente para que clulas de tamanho moderado (17-kDa) passem livremente de um blastmero ao outro (Kimmel e Law, 1985). Comeando por volta da dcima diviso, pode ser detectado o incio da transio da blstula intermediria: comea a transcrio do gene zigtico, desacelerao das divises celulares e o movimento celular evidente (Kane e Kimmel, 1993). Neste ponto, duas populaes de clulas podem ser distinguidas. A primeira a camada de vitelo sincicial (YSL). A YSL formada no nono ou dcimo ciclo, quando as clulas da parte vegetal do blastoderma se fundem com a clula do vitelo adjacente. Isso produz um anel de ncleos com essa parte do citoplasma da clula do vitelo localizado bem embaixo do blastoderma. Expandindo vegetalmente, o blastoderma envolve a clula do vitelo, parte do vitelo sincicial se mover para baixo do blastoderma, para formar a YSL interna e parte dos ncleos se mover vegetalmente, ficando frente da margem do blastoderma, para formar a YSL externa (Figura 5.33A,B). A funo da YSL ainda no foi esclarecida. A segunda populao celular distinguida na transio da blstula intermediria a camada envolvente (EVL; veja Figura 5.33A). Essas so as clulas mais superficiais do

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

191

(A) Blastoderma Camada envolvente (EVL) Clulas profundas

(B)

YSL interna Ncleos sinciciais do vitelo YSL externa Microtbulos

Clula do vitelo

Figura 5.33
(C) Plo animal Nariz, olho Epiderme Crista neural Ventral Somito do msculo Prnefron Intestino Crebro Medula espinhal Mesoderma Cabea Dorsal
Notocorda Sangue Nadadeiras Corao Msculo

Ectoderma

Faringe Fgado Margem do blastoderma Clula do vitelo

Endoderma

A blstula do peixezebra. (A) antes da gastrulao, clulas profundas esto rodeadas pelo EVL. A superfcie animal do vitelo achatada e contm os ncleos do YSL. Microtbulos se estendem atravs do citoplasma vitelnico e da regio externa do YSL. (B) Estgio tardio de blstula, mostrando a YSL. Os ncleos dessas clulas so derivados de clulas da margem do blastoderma, que liberou seus ncleos para o citoplasma vitelnico. (C) Mapa do destino das clulas profundas depois que a mistura de clulas cessou. A vista lateral mostrada, e no todos os destinos dos rgos esto identificados (para clareza). O mapa gerado injetando clulas com corante de alto peso molecular, determinando em seguida, quais rgos as clulas carregadas de corante geraram. (A e C segundo Langeland e Kimmel, 1996; B de Trinkaus, 1993, cortesia do autor.)

Plo vegetal

blastoderma, e a EVL uma cobertura epitelial fina composta apenas de uma camada de clulas. A EVL finalmente forma a periderme, uma proteo extra-embrionria cobrindo o que se pensa ser descartado mais tarde durante o desenvolvimento. Entre a EVL externa e a YSL interna esto as clulas profundas, das quais surgir o embrio propriamente dito. Os destinos das clulas blastodrmicas precoces no esto determinados, e os estudos de linhagem celular (onde um corante fluorescente no difusvel injetado em uma das clulas e os descendentes daquela clula podem ser seguidos) mostram que existe muita mistura de clulas durante a clivagem. Alm do mais, qualquer clula pode dar origem a uma variedade imprevisvel de descendentes de tecido (Kimmel e Warga, 1987; Helde et al., 1994). O destino da clula blastodrmica parece ser fixado pouco antes do comeo da gastrulao. Nesse perodo, clulas em regies especficas do embrio originam certos tecidos de uma maneira altamente previsvel, permitindo que um mapa do destino possa ser traado (Figura 5.33C; Kimmel et al., 1990). O processo pelo qual a clula contribui para o tecido envolve uma narrativa progressiva de possveis destinos para o desenvolvimento de uma determinada clula. Esse comportamento pode ser observado em algumas das primeiras clulas a terem seu destino estabelecido - as clulas precursoras do corao (Stainer et al., 1993; Lee et al., 1994).

192

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Figura 5.34

(A)

(B)

Mapa do destino das clulas profundas da blstula do peixe-zebra. Injeo de um nico blastmero na blstula precoce (estgio de 256-512 clulas) com rodamino-dextrano. Se a clula estiver perto da margem, a meio caminho entre os plos dorsal e ventral, a prognie da clula est restrita a formar parte do corao. Nesse estgio, as clulas marcadas formam descendentes que podem popular tanto a aurcula como o ventrculo. Se a injeo em tais clulas for feita em um estgio mais tardio da blstula, seus descendentes iro popular uma cmara somente. (Segundo Stainier et al., 1993.)

Ventral

Dorsal

Clula do vitelo

Saco vitelnico

Figura 5.35

Clulas individuais que margeiam na metade do caminho as futuras superfcies dorsal e ventral de um embrio em estgio de meia clivagem, podem dar origem s clulas que povoam ambos, o endocrdio e o miocrdio (Figura 5.34A,B). Um pouco mais tarde, os descendentes de qualquer clula podem povoar somente o miocrdio ou o endocrdio. Mais tarde ainda, os descendentes de uma clula somente sero capazes de povoar subcompartimentos especficos de tecido. Por exemplo, clulas da blstula intermediria podem contribuir para a prognie de ambos, trio e ventrculo do corao. Clivagem Superficial A maior parte dos ovos dos insetos passa por clivagem superficial, onde uma grande quantidade de vitelo centralizada confina a clivagem para a borda citoplasmtica do ovo. Um dos detalhes fascinantes desse tipo de clivagem que as clulas no se formam at que os ncleos tenham se dividido. A clivagem de um ovo de inseto mostrada na Figura 5.35. O ncleo do zigoto sofre vrias divises mitticas dentro da parte central do ovo. Na Drosophila, 256 ncleos so produzidos por uma srie de divises nucleares durando, em mdia, 8 minutos cada. Depois o ncleo migra para a periferia do ovo, onde as mitoses continuam, embora com uma velocidade diminuda. O em-

Clivagem superficial em embrio de Drosophila. O numeral acima de cada embrio corresponde ao nmero de minutos decorrido aps a deposio do ovo; o numeral abaixo de cada embrio indica o nmero de ncleos presentes. Clulas polares (que formaro as clulas germinativas) so vistas no estgio de 512 ncleos, embora o blastoderma celular se forme 3 horas mais tarde. Os tempos so representativos, j que a durao de cada ciclo de diviso depende, em parte, da temperatura em que o ovo est sendo incubado.

Ncleos (enrgides)

Enrgides migram para a periferia

Clulas polares

Blastoderma celular

Clulas polares

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

193

brio chamado agora de blastoderma sincicial, significando que todas clivagens nucleares esto contidas em um nico citoplasma. Nenhuma membrana celular existe a no ser a do prprio ovo. Aqueles ncleos migrando para o plo posterior do ovo logo ficam envolvidos pelas novas membranas celulares para formar o plo de clulas do embrio. Essas clulas do origem s clulas germinativas dos adultos. Dessa maneira, um dos primeiros eventos do desenvolvimento dos insetos a separao das futuras clulas germinativas do resto do embrio. Aps as clulas polares terem sido formadas, a membrana do ocito dobra-se para dentro, entre os ncleos, conseqentemente, separando cada ncleo somtico para uma nica clula (Figura 5.36). Isso forma o blastoderma celular, com todas as clulas arranjadas como uma cobertura de camada nica envolvendo o ncleo do ovo. Como qualquer outra formao celular, a criao do blastoderma celular envolve uma interao delicada entre microtbulos e microfilamentos. A primeira fase da celularizao do blastoderma caracterizada pela invaginao das membranas celulares e sua rede de actina subjacente nas regies entre o ncleo. Esse processo inibido por drogas que bloqueiam os microtbulos. Aps as membranas e sua actina terem passado o nvel do ncleo, a segunda fase da celularizao ocorre. Aqui a velocidade da invaginao aumenta, e o complexo de actino-membranas comea a apertar o que ser o terminal basal da clula (Schejter e Wieschaus, 1993; Foe et al., 1994). Na Drosophila, essa camada composta por aproximadamente 6000 clulas e formada 4 horas aps a fertilizao. [cleave5.html] Embora os ncleos se dividam originalmente dentro de um citoplasma em comum, isso no significa que o citoplasma seja uniforme. Karr e Alberts (1986) mostraram que cada ncleo dentro do blastoderma sincicial est contido dentro de seu prprio pequeno territrio de protenas citoesquelticas. Quando o ncleo alcana a periferia durante o dcimo ciclo da clivagem, cada ncleo fica cercado por microtbulos e

Superfcie do ovo

Fuso mittico Sulco de clivagem ster Ncleo

Canal do sulco Microtbulos

Figura 5.36

Membrana vitelnica

Alongamento nuclear e celularizao do blastoderma de Drosophila. (Segundo Fullilove e Jacobson, 1971.)

194

PARTE II Padres de Desenvolvimento

(A)

(B)

(C)

Prfase 12

Ncleos

Microfilamentos

Microtbulos

Figura 5.37

Localizao do citoesqueleto em volta de ncleos no blastoderma sincicial de Drosophila. Um embrio de Drosophila entrando na prfase da dcima-segunda diviso mittica, foi secionado e corado triplamente. (A) Os ncleos foram localizados por um corante que se liga ao DNA. (B) Microfilamentos foram identificados usando anticorpo fluorescente para actina. (C) Microtbulos foram reconhecidos por um anticorpo fluorescente para tubulina. Domnios do citoesqueleto podem ser vistos em volta de cada ncleo. (de Karr e Alberts, 1986, cortesias de T. L. Karr.)

microfilamentos. O ncleo e suas ilhas citoplasmticas associadas so chamados enrgides. A Figura 5.37 mostra o ncleo e seu microfilamento essencial e os domnios do microtbulo na prfase da dcima segunda diviso mittica. Aps o ncleo alcanar a periferia, o tempo necessrio para completar cada uma das prximas quatro divises se torna gradualmente maior. Enquanto os ciclos de 1 a 10 duram 8 minutos cada, o ciclo 13, o ltimo ciclo no blastoderma sincicial, leva 25 minutos para se completar. O embrio de Drosophila forma clulas no ciclo 14 (i.e. aps 13 divises), e o ciclo 14 assincrnico. Alguns grupos de clulas completam esse ciclo em 75 minutos, enquanto outro grupo leva 175 minutos (Foe, 1989). A transcrio desses ncleos (que comea por volta do dcimo primeiro ciclo) muito intensificada. A desacelerao da diviso celular da Drosophila e o aumento concomitante na transcrio do RNA freqentemente referido como transio da blstula intermediria (midblastula transition). Tais transies tambm so vistas nos embries de inmeros vertebrados e de filos invertebrados. O controle dessa desacelerao mittica (em embries de Xenopus, ourio-do-mar, estrela-do-mar e Drosophila) aparenta sofrer efeito da razo da cromatina para o citoplasma (Newport e Kirshner, 1982a; Edgard et al., 1986). Edgard e seus colegas compararam o desenvolvimento inicial de embries de Drosophila do tipo selvagem com os do mutante haplide. Os embries haplides de Drosophila tm a metade da cromatina a cada diviso celular, em comparao com os do tipo selvagem. Daqui para frente, um embrio haplide no oitavo ciclo celular tem a mesma quantidade de cromatina quanto um embrio do tipo selvagem no stimo ciclo. Esses investigadores descobriram que enquanto embries do tipo selvagem formam sua camada celular imediatamente aps a dcima terceira diviso, os embries haplides passaram por uma diviso extra, a dcima quarta, antes da celularizao. Alm do mais, a durao dos ciclos 11 a 14 em embries do tipo selvagem, corresponde aos ciclos 12 ao 15 em embries haplides. Dessa maneira, os embries haplides seguem um padro similar aos embries do tipo selvagem, porm, com defasagem de uma diviso celular. Se essa defasagem fosse devida ao fato dos mutantes haplides terem uma razo de cromatina para o citoplasma de metade, em relao a do tipo selvagem, em um determinado ciclo, ento seria possvel acelerar a celularizao amarrando (ligando) algum citoplasma, fazendo com que os ncleos se dividam em um volume menor. Quando essa ligao foi realizada, o padro mittico do embrio foi acelerado. A diviso final do blastoderma, sinalizando o fim do perodo de clivagem,

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade alcanada quando existe um ncleo para cada 61 m3 de citoplasma. Em Xenopus, uma desacelerao similar na taxa mittica observada aps a dcima segunda diviso celular. Aqui tambm, as divises daqui para frente se tornam assincrnicas. Experimentos de ligao sugerem que o tempo de durao da transio dessa blstula intermediria tambm funo da razo volumes cromatina/ citoplasma (Newport e Kirschner, 1982a,b). Em ambos, Drosophila e Xenopus, a iniciao da transcrio pode ser induzida prematuramente aumentando artificialmente a durao do ciclo celular. Quando cicloheximida (um inibidor da sntese protica) atrasa a diviso celular, a transio da blstula intermediria induzida precocemente em Xenopus, e uma exploso de transcries ocorre em Drosophila (Edgard et al., 1986; Kimelman et al., 1987).

195

Informaes adicionais

&

Especulaes

Excees, Generalizaes, e Clivagem Parastica da Vespa

QUE CONSIDERAMOS normal e o que marginalizamos como excees, freqentemente reflete quais animais so mais acessveis para o estudo e mais facilmente domesticados para o laboratrio. No necessrio dizer, que isso no reflete necessariamente as condies do mundo natural. Pelo contrrio, nossas discusses de desenvolvimento animal so freqentemente dificultadas por certos organismos em particular. O desenvolvimento de anfbios geralmente representado pelo Xenopus laevis, e o camundongo e o homem so os nicos mamferos cujos desenvolvimentos so usualmente estudados. Similarmente, embora haja mais de 800.000 espcies de insetos conhecidas, a maior parte dos biologistas do desen-

volvimento conhecem apenas o desenvolvimento de uma espcie: Drosophila melanogaster. A Drosophila ganhou proeminncia somente depois que se fez necessrio relacionar fenmenos embriolgicos com genes particulares. Em 1941, o maior compndio do desenvolvimento de insetos (Embriologia dos insetos e Miripodes, Johannsen e Butt) sequer mencionava essa espcie em seu ndice. Insetos so um excepcionalmente bemsucedido e espalhado subfilo, no sendo surpreendente encontrar uma grande variabilidade no seu desenvolvimento. O desenvolvimento da vespa parasita Copidosomopsis tanytmemus difere marcadamente daquele da Drosophila cannica. Como muitas outras espcies parasitrias, a fmea C. tanytmemus deposita seu ovo den-

tro do ovo de uma outra espcie. Com o desenvolvimento do ovo hospedeiro (normalmente de uma mariposa), o mesmo acontece com o ovo do parasita. No entanto, enquanto o ovo do hospedeiro comea o seu desenvolvimento no padro superficial usual, o ovo da vespa divide holoblasticamente. Ademais, ao invs de diferenciar o eixo do corpo, as clulas do embrio parasita dividem-se repetidamente para se tornar uma massa de clulas no diferenciadas chamadas poligerme. Em duas semanas, a poligerme em crescimento fica suspensa no hospedeiro, permanecendo frouxamente atada ao crebro e traquia larvais (Figura 5.38A; Cruz, 1986a).
Figura 5.38

Olho/cabea da lagarta hospedeira

Desenvolvimento de vespas parasitrias (Encyrtidae). (A) Clivagem holoblstica do ovo de Copidosomopsis tanytmenus produz uma poligerme de clulas no-diferenciadas. (B) Larvas precoces de um gnero relacionado, Pentalitomastix, atacam a larva de Trathala dentro do mesmo hospedeiro. A fotografia de um hospedeiro recmaberto. (A segundo Cruz, 1986a; B de Cruz, 1981, cortesia de Y. Cruz.)

Mrula de 4 dias Ovo (A) Poligerme precoce

Esfago Corpo gorduroso do hospedeiro

Poligerme

(B) Poligerme em expanso

196

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Com o crescimento, a poligerme se divide em dzias (s vezes milhares, dependendo da espcie) de discretos grupos de clulas. Cada um desses grupos se torna um embrio! A vespa poliembrionria Copidosoma floridanum produz at 2000 indivduos de um nico ovo fertilizado (Grbic et al., 1996). Essa habilidade que um ovo tem para se transformar em uma massa de clulas, que rotineiramente forma numerosos embries, chamada de poliembrionia. (Poliembrionia caracterstica de certos grupos de insetos e certas espcies de mamferos, tais como o tatu de nove bandas, cujos ovos formam qudruplos idnticos.) A maior parte desses embries de vespa parasita se desenvolvem em larvas normais que levam aproximadamente 30 dias para se desenvolver. Um grupo menor, de cerca de 10 porcento do nmero total de embries, se tornam larvas precoces (Figura 5.38B), que se desenvolvem em uma semana. Elas no s se desenvolvem precocemente, como tm muito pouca estrutura e no sofrem metamorfose. So essencialmente um conjunto de mandbulas mveis. Essas larvas no se

reproduzem, morrendo assim que as larvas normais se formam. Enquanto elas vivem, no entanto, vo at o embrio hospedeiro matando as larvas parasitas de outros indivduos (de espcies diferentes e de outros clones da mesma espcie). Em outras palavras, as larvas precoces so formas predatrias que eliminam possveis competidores (Cruz, 1981, 1986b; Grbic and Strand, 1992). Com a morte das larvas precoces (e suas presas), a larva normal emerge da sua primeira mudana de pele, comea a se alimentar vorazmente dos rgos da larva hospedeira. Em 40 dias, a criao parasita j se alimentou dos msculos do hospedeiro, gordura corporal, gnadas, glndulas de seda, intestinos, cordes nervoso e hemolinfa, e o hospedeiro um pouco mais do que um saco de pele segurando cerca de 70 larvas pupantes de vespa. Aps outros 5 ou 6 dias, os novos adultos perfuram o tegumento do hospedeiro e, em uma cena recordando o filme Alien, provocam a abertura e a sada do hospedeiro, literalmente por comer o seu corpo. Esses adultos freqentemente co-

pulam (a maioria das vezes sobre o corpo do hospedeiro morto), acham um novo hospedeiro para depositar os seus ovos e morrem logo em seguida. Tal ciclo de vida incomodava Charles Darwin, fazendo-o questionar o conceito de uma divindade benigna conhecida por todos. Em 1860 ele escreveu ao biologista americano Asa Gray: Eu no consigo me convencer de que o benevolente e onipotente Deus tenha planejado e criado a Ichneumonidae com a expressa inteno delas se alimentarem dentro dos corpos vivos de lagartas. No entanto, alm de sua utilidade de provocar noes de desconforto no que se refere a ordem natural e natureza da individualidade, as vespas parasitas podem ter conseqncias econmicas importantes. Macrocentrus grandii uma vespa poliembrionria que parasita a broca Europia do milho. A habilidade de um inseto se formar de um embrio por clivagem holoblstica, deve tambm nos encorajar a apreciar a plasticidade da natureza, desencorajando generalizaes precipitadas sobre um completo subfilo de organismos.

I MECANISMO

DE

CLIVAGEM

Regulando o ciclo da clivagem


O ciclo celular das clulas somticas funcionalmente dividido em quatro estgios (Figura 5.39A). Aps a mitose (M), temos o intervalo da pr-replicao (G1), em seguida acontecendo a sntese do DNA (S). Aps o perodo da sntese, temos o intervalo pr-mittico (G2), seguido pela mitose. A progresso dessas fases regulada por fatores de crescimento. Em blastmeros de clivagem precoce, no entanto, a diviso celular pode ser muito simples. Blastmeros precoces de ourio-do-mar no tm G1 replicando o seu DNA durante a ltima parte (telfase) da mitose prvia (Hinegardner et al., 1964). Os ncleos de Xenopus e Drosophila eliminaram as fases G1 e G2 durante a clivagem precoce. (Embries de Xenopus adicionam essas fases ao ciclo celular, algum tempo aps a dcima segunda clivagem. Drosophila adiciona G2 durante o ciclo 14 e G1 durante o ciclo 17.) Nas primeiras 12 divises, Xenopus divide-se sincronicamente em um ciclo celular bifsico: S para M e M para S (Figura 5.39B; Laskey et al., 1977; Newport e Kirschner, 1982a). Os fatores que regulam esse ciclo bifsico esto localizados no citoplasma. Ocitos normais de Xenopus, quando aumentam, so detidos na primeira prfase meitica. So incapazes de se dividirem. Se os ncleos de clulas divididas forem transplantados para esses ocitos, tambm param a diviso. Quando ocitos normais so estimulados por progesterona, retomam sua diviso meitica e param na metfase da segunda meiose. Se o ncleo de clulas no divididas (como neurnios) so colocados no citoplasma de ocitos tratados com progesterona, tambm iniciam a diviso e param

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

197

(A)
Ciclina B

(B)

Ciclina D Ciclina A

Ciclina E Ciclina A

Figura 5.39

Ciclos celulares de clulas somticas e blastmeros precoces. (A) Ciclo celular de uma clula somtica tpica. A Mitose (M) seguida por uma condio de interfase. Esse ltimo perodo subdividido em fases G1, S (sntese) e G2. Clulas que esto se diferenciando so geralmente removidas do ciclo celular e esto numa fase G1 estendida chamada G0. As ciclinas e suas respectivas quinases, responsveis para progresso atravs do ciclo celular, so mostradas no seu ponto de regulao do ciclo celular. (B) Ciclo celular bifsico mais simples dos blastmeros precoces de anfbios, tendo somente dois estados, S e M. (A segundo Nigg, 1995.)

na metfase (Gurdon, 1968). O citoplasma de ocitos estimulados com progesterona ainda passam por contraes corticais peridicas (caracterstica da diviso), mesmo na ausncia de ncleos ou centrolos. Se fragmentos clonados de DNA so injetados nesses embries anucleados, sua replicao sofre o controle desse ciclo (Hara et al., 1980; Harland e Laskey, 1980; Karsentiket al.,1984). Dessa maneira, a capacidade de diviso celular regulada pelo citoplasma. Fator promotor de maturao Alguns dos fatores que governam a sntese do DNA e a diviso celular foram identificados. O fator induzido por progesterona que permite o ncleo do ocito retomar suas divises uma fosfoprotena de duas subunidades chamada de fator de promoo da maturao (MPF, tambm conhecida como fator promotor da mitose. O MPF foi primeiro descoberto como o principal fator responsvel pela retomada das divises celulares meiticas no ovo ovulado de r (Smith e Ecker, 1969; Masui e Markert, 1971). Esse mesmo fator continua realizando o seu papel aps a fertilizao, regulando o ciclo bifsico dos blastmeros precoces de Xenopus. Gerhart e colegas (1984) mostraram que o MPF sofre mudanas cclicas nos nveis de atividade nas clulas mitticas. A atividade do MPF de blastmeros precoces de rs maior durante M e no detectvel durante S. Durante essa fase S, o MPF existe em estado inativo. Essa ciclicidade tambm observada em blastmeros anucleados. Newport e Kirschner (1984) demonstraram que a replicao do DNA (S) e mitose (M) so dirigidas somente pelo ganho ou perda de atividade do MPF, mesmo na ausncia de sntese protica. As clulas em clivagem pode ficar presas na fase S, incubando-as com um inibidor de sntese protica. Quando o MPF microinjetado nessas clulas, elas entram em M. Seus envoltrios nucleares se partem e suas cromatinas condensam-se em cromossomos. Aps uma hora, o MPF degradado e os cromossomos retornam fase S.

198

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Informaes adicionais

&

Especulaes

MPF e Seus Reguladores


A pequena subunidade do MPF: A cdc2 Quinase (QuinaseCiclina-dependente, CDK)
MPF tem uma subunidade grande e outra pequena. A pequena subunidade de MPF uma protena quinase que, quando ativada, pode fosforilar uma variedade de protenas. Dessa forma, MPF funciona adicionando grupos fosfatos s protenas especficas. Um desses alvos a histona H1, que se liga ao DNA. A fosforilao dessa protena pode levar condensao cromossmica. Outro alvo o envoltrio nuclear. Quinze minutos aps a adio do MPF, as trs protenas principais (as lminas) do envoltrio nuclear se tornam hiperfosforiladas, e nos prximos 15 minutos, o envoltrio se despolimerizou e est se desfazendo (Miake-Lye e Kirschner, 1985; Arion et al., 1988). A MPF quinase purificada j foi mostrada fosforilar esses envoltrios nucleares de protenas, e realizar sua despolimerizao in vitro (Peter et al., 1990; Ward e Kirschner, 1990). Um terceiro alvo parece ser a RNA polimerase (Cisek e Corden, 1989), e a fosforilao da RNA polimerase pode ser a responsvel pela inibio da transcrio durante a mitose. Um quarto alvo da quinase parece ser a subunidade reguladora de miosina citoplasmtica. Quando essa protena fosforilada, ela se torna inativa e incapaz de funcionar como uma ATPase dirigindo os filamentos de actina envolvidos na diviso celular (Satterwhite et al., 1992). A inibio dessa miosina durante os estgios iniciais da mitose, pode prevenir divises da clula at depois dos cromossomos terem-se separado. A pequena subunidade de MPF tem sido notavelmente conservada atravs da evoluo e quase idntica quela da fosfoprotena indutora de mitose, p34, sintetizada pelo gene cdc2 da levedura (Dunphy et al., 1988; Gautier et al., 1988). De fato, o gene humano que codifica a protena correspondente pequena subunidade do MPF de Xenopus pode ser inserido no genoma da levedura e causar diviso nos mutantes de levedura deficientes em cdc2 (Lee e Nurse, 1987). A protena p34 pode existir em formas fosforiladas e desfosforilada. A forma ativa parece ser fosforilada

Figura 5.40 O desenvolvimento da regulao do ciclo celular na embriognese de Drosophila.

(A) Ciclina e protena cdc25 (cordo) so abundantes antes da fertilizao. Portanto, durante os primeiros sete ciclos celulares, a atividade da MPF quinase permanece constante e as divises celulares prosseguem to rapidamente quanto funcionam as enzimas e os substratos. medida que a ciclina degradada, sua sntese (de mRNA estocado no citoplasma) torna-se limitante no ciclo 8. No ciclo 14, o mRNA materno para ciclina desapareceu, e deve ser sintetizado de genes nucleares. Alm disso, a degradao das protenas do cordo comanda nova sntese a partir do ncleo. Pr-MPF acumula mas no ativado at que a fosfatase cordo cliva os fosfatos T-14 e Y-15 da cdc2 quinase. O mecanismo que relaciona a atividade do MPF com o trmino da sntese de DNA e a iniciao da citocinese esto sendo investigados. (Segundo Edgar et al., 1994.)
Regulado zigoticamente

Regulado maternalmente Ciclina maternal e protenas de cordo presentes MPF ativo Protena Ciclina Ciclina Ciclina Protena maternal de cordo presente Ciclina Ciclina mRNA Ciclina Degradao

Pr-MPF Ciclina Sntese de ciclina (zigtica) Desfosforilao cdc 25/cordo fosfatase (zigtica)

MPF ativo Ciclina

Sntese de ciclina

MPF ativo Ciclina Degradao da ciclina

Mitose Quinase ativa de protenas maternas (limita substrato) Ciclo Divises nucleares

Mitose Ciclo dirigido pela traduo de nova ciclina de mRNA materno

Mitose Ciclo dirigido pela cdc25/fosfatase de cordo

Mitose

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

199

em treonina-161 (T-161) e desfosforilada em tirosina-15 (Y-15). Ambas condies so importantes para a atividade da quinase (Gould e Nurse, 1989; Solomon, 1993).

A maior subunidade do MPF: Ciclina


Ento, como regulado o MPF? Desde que a clivagem de Xenopus parecia ser regulada por uma protena similar quela que regula a diviso celular da levedura, pensou-se que qualquer regulador da protena da levedura teria contrapartida no embrio animal. Um dos principais reguladores da protena MPF de levedura o produto do gene cdc13, uma protena 56-kDa chamada p56cdc13. Esse gene foi clonado, e a seqncia de sua protena codificada foi considerada muito semelhante s protenas ciclina B encontradas em numerosos animais (Goebl e Byers, 1988; Solomon et al., 1988). As protenas ciclina B em clulas em estgio de clivagem mostram um comportamento peridico, acumulando durante a fase S e sendo degradada durante a mitose (Evans et al., 1983; Swenson et al., 1986). Ciclinas so freqentemente codificadas pelo mRNA armazenado no citoplasma do ocito, e se sua transformao em protenas seletivamente inibida, a clula no entrar em mitose (Minshull et al., 1989). A protena ciclina B combina com a quinase cdc2 do MPF para criar o comple-

xo MPF. A ciclina permite a subunidade quinase cdc2 tornar-se fosforilada nos resduos treonina-14 (T14), tirosina-15 (Y15) e treonina-161 (Figura 5.40). A fosforilao no T-161 necessria para a atividade do MPF, mas fosforilaes nos T-14 e Y-15 a inibem. Dessa forma, quando fosforilada nessas posies a quinase permanece inativa, porm, potencialmente funcional. O suprimento de molculas MPF potencialmente funcionais (pr-MPF) acumula durante o perodo tardio de S.

A Fosfatase cdc25: Iniciadora de Mitose


A mitose se inicia com uma abrupta desfosforilao de todas essas subunidades MPF quinase na posio 15. Isso conseguido pelo aparecimento da fosfatase cdc25 (Edgar e OFarrell, 1989; Gautier et al., 1991; Jessus e Beach, 1992; Lee et al., 1992). Dessa maneira, a acumulao gradual do MPF convertida em uma breve exploso de atividade quinase que inicia a mitose. Essa fosfatase (que tem sido encontrada em inmeros organismos) ela prpria regulada pelo desenvolvimento. Na Drosophila, a fosfatase cdc25 (produto do gene string, de cordo) inicialmente sintetizada pelo mRNA armazenado no ocito durante os 13 primeiros ciclos celulares. No entanto, durante o pr-

ximo ciclo, o cordo mRNA materno degradado; se o ncleo no transcrever seu prprio cordo mRNA, as clulas no se dividiro. Edgard e OFarrel (1989) mostraram que aquelas clulas que se dividem esto sintetizando a sua prpria fosfatase cdc25, enquanto aquelas que no so capazes de se juntar a esse ciclo, no realizaro a diviso (Figura 5.41). Essa degradao e a necessidade de re-sintetizar essa protena explicariam a mudana de controle citoplasmtico para controle nuclear da diviso como visto no ciclo 14. Em Drosophila, existe uma maturao desenvolvimental da regulao da quinase MPF ativa (veja Figura 5.40; Edgard et al., 1994). Na ovulao, o complexo pr-MPF armazenado no ovo desfosforilado em T14 e Y-15 pelo recm-traduzido cordo (cdc25) da protena. Durante os primeiros sete ciclos nucleares, o MPF ativo permanece em nveis altos, e o ncleo divide-se to rapidamente quanto as enzimas sintetizadoras de DNA permitem. Durante os ciclos 8-13, a ciclina comea a ser degradada na metfase, levando a flutuaes peridicas de atividade MPF-quinase. A sntese da ciclina do mRNA armazenado no ocito armazenado se torna o passo limitante para a mitose. A degradao do cordo da ocito-protena leva parada do ciclo celular na interfase do ciclo 14.

(A)

Figura 5.41 Correlao da expresso do gene string (cordo) com a diviso celular em embries de Drosophila. (A) Nesse exemplo, um embrio de estgio tardio 14 corado com uma seqncia nucleotdica radioativa que especificamente reconhece e liga o mRNA cordo (visto aqui como pontos brancos na auto-radiografia). (B) Um embrio ligeiramente mais velho corado com anticorpos fluorescentes para tubulina para mostrar os microtbulos dos fusos mitticos. Uma comparao da microfotografia de fluorescncia com a auto-radiografia obtida da ligao da sonda radioativa mostra que somente aquelas clulas capazes de se dividirem, sintetizam mRNA string. (C) Anticorpos para a protena ciclina A mostram que ela degradada aps a mitose e no vista nas regies que contm a protena de cordo. (de Edgar e OFarrell, 1989, cortesia de B. A. Edgar.)

(B)

(C)

200

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Grandes concentraes de pr-MPF se acumulam. As mitoses para as divises 14, 15 e 16 so iniciadas somente quando essa pr-MPF desfosforilada nas posies T14 e Y-15 pela protena cordo. Essa protena derivada de transcrio nuclear ao final de cada perodo G2. A mitose passou do controle citoplasmtico para o nuclear.

Outras ciclinas e quinases ciclinadependentes


MPF o primeiro membro descoberto de uma famlia de protenas dimricas que tm estruturas muito similares. Cada uma dessas protenas contm uma ciclina e uma quinase ciclina-dependente, que quando dependente do MPF chamada cdk1. Pelo menos outras sete quinases ciclina-dependentes esto envolvidas em clulas maduras de vertebrados, e mais de uma dzia de ciclinas foram identificadas. Os papis de algumas dessas quinases foram determinados (como mostra a Figura 5.39). Entre essas enzimas, uma das mais crticas a ciclina E/cdk2. Enquanto MPF (ciclina B/cdk1) crtica para a entrada na mitose (M), ciclina E/cdk2 crtica para a habilidade da clula entrar na fase S, permitindo a ocorrncia de sntese do DNA. A regulamentao do desenvolvimento dessa protena uma fase crtica no desenvolvimento da Drosophila. Embries de Drosophila adicionam um estgio G2 antes da mitose, quando a protena de cordo se torna limitante no ciclo 14. A fase G1 adicionada ao ciclo 17 quando ciclina E se torna o fator limitante para a replicao do DNA. Em embries precoces, ciclina E e cdk2 esto sempre presentes, seus mRNA sendo fornecidos pelo ocito e traduzidos atravs de todos os primeiros 15 ciclos de diviso. A mensagem para ciclina degradada durante o ciclo 16, levando deficincia dessa protena no ciclo 17. Dessa forma, a maioria das clulas param no G1 desse ciclo, no entrando no perodo de sntese do DNA. A comeam a diferenciar-se. (As excees so as clulas precursoras dos nervos que continuam a proliferar, e as clulas do intestino, que continuam a produzir DNA na ausncia de diviso celular. Nesses casos, a ciclina E derivada dos genes zigticos.) Se ciclina E induzida ectopicamente, as clulas retidas sofrem uma nova rodada de sntese de DNA (Knoblich et al., 1994). Pensa-se que a ciclina E controla a sntese do DNA, fosforilando certos fatores de transcrio que regulam as transcries das protenas necessrias para a

replicao do DNA (Duronio e OFarrell, 1994). Certamente, quando as clulas saem normalmente do ciclo para comear a se diferenciarem, expressam a protena Dacapo, um inibidor de ciclina E/cdk2 (Lane et al., 1996; de Nooij et al., 1996). A regulao das ciclinas uma funo crtica no desenvolvimento. Primeiro, imagine as clulas da cartilagem de nossas pernas sofrendo mais uma diviso celular; seramos muito maiores do que agora. Pior, imagine que essa desregulao ocorresse em somente uma de nossas pernas. Ainda pior, imagine se a diviso da cartilagem no fosse coordenada com a diviso da pele e dos vasos sangneos. A regulao desses eventos coordenada atravs de hormnios e fatores de crescimento que, por fim, regulam as ciclinas que controlam a passagem atravs dos ciclos das clulas. Segundo, quando a ciclina se torna ativa sem regulao externa ou quando ciclinas se tornam estimuladas por protenas mutantes, o crescimento das clulas continua sem controle externo, e se desenvolve um tumor. Em clulas maduras de vertebrados, as ciclinoenzimas D/cdk4,6 cumprem um papel crucial no desenvolvimento. Em diversos tipos de clulas, controlam a dicotomia entre a diviso e a diferenciao celular. [cleave6.html]

comeo da mitose; mas a prpria montagem do fuso necessria para o funcionamento apropriado da ciclina B (Minshull et al., 1994). Se os fusos so formados incorretamente, a ciclina B cessa seu funcionamento, e a mitose pra. Tambm parece haver retroalimentao entre a cromatina replicante e as quinases ciclina-dependentes, fazendo com que a mitose no comece at que o DNA tenha comeado a replicarse, e somente uma rodada de replicao normalmente permitida durante a diviso celular (Chong et al., 1995; Madine et al., 1995). As molculas que mediam essas trocas esto agora sendo estudadas.

Fator Citosttico
A sntese e a degradao do MPF leva a ciclagem das clulas. No entanto, se a degradao da ciclina for prevenida, o MPF permanece ativo e a clula travada na metfase (Murray et al., 1989). Isso o que acontece, aparentemente, durante o desenvolvimento do ocito da r. O ocito maduro da r cessa a diviso celular produzindo uma protena chamada fator citosttico (CSF), que mantm o ocito preso na metfase da segunda diviso meitica (Figura 5.42). Essa protena contm os produtos dos genes c-mos e cdk-2, e parece agir bloqueando a degradao da ciclina (veja o Captulo 22). Uma vez que a ciclina no degradada, MPF permanece ativo, e

Pontos de Controle para Diviso Celular: DNA e Fusos


O ciclo celular exige uma excepcional intricada coreografia da citocinese, replicao de DNA, montagem de fusos e metabolismo celular. Nesse conjunto, ciclinas e quinases ciclina-dependentes so alvos e causadores da regulao. O sistema ciclinaquinase parece coordenar esses eventos. Por exemplo, a fibra do fuso mittico no pode formar at a ciclina B/cdk1 sinalizar o

Figura 5.42

Nveis do fator promotor de amadurecimento (MPF) durante o desenvolvimento precoce da r Xenopus laevis. O sinal normal de maturao o hormnio progesterona, que estimula a ovulao dos ocitos e o incio da meiose. (Segundo Murray e Kirschner, 1989.)
Entrada de espermatozide, aumento de Ca2+ livre, inativao de CSF

Estmulo para amadurecimento (progesterona ou MPF) Alta Atividade de MPF Baixa

CSF estabiliza MPF

Ocito Imaturo

Meiose I

Meiose II

Ocito maduro

Primeira clivagem

Segunda clivagem

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

201

o ocito permanece na metfase. A liberao de ons de clcio durante a fertilizao ativa a protease que especificamente inativa o CSF (Watanabe et al., 1991). Quando o CSF degradado, a ciclina pode ento ser degradada, e a clula pode retornar fase S. Dessa maneira, um dos efeitos da

liberao de ons de clcio na fertilizao de iniciar a degradao da ciclina e permitir que a clula comece a replicao do DNA. Em seguida, os ritmos da diviso celular so controlados pela atividade do MPF, que por sua vez baseada nos ritmos cclicos da sntese e degradao da ciclina.

Enquanto os ons de clcio esto ocupados desligando a mitose, os sinais da fertilizao que ativam a protena quinase C esto estabelecendo condies de interfase: descondensao da cromatina e reforma do envoltrio nuclear (Bement e Capco, 1991).

O mecanismo citoesqueltico da mitose


Clivagem na verdade o resultado de dois processos coordenados. O primeiro desses processos cclicos a cariocinese, a diviso mittica do ncleo, cujo agente mecnico o fuso mittico, com seus microtbulos compostos de tubulina (o mesmo tipo de protena componente do flagelo do espermatozide). O segundo processo a citocinese, a diviso da clula. O agente mecnico da citocinese o anel contrtil de microfilamentos feitos de actina (o mesmo tipo de protena que alonga os microvilos do vulo e o processo acrossmico do espermatozide). A Tabela 5.2 apresenta uma comparao desses sistemas de diviso. O relacionamento e coordenao entre os dois sistemas durante a clivagem representado na Figura 5.43A, onde o ovo do ourio-do-mar mostrado passando pela primeira clivagem. O fuso mittico e o anel contrtil esto perpendiculares um com o outro, e o fuso interno ao anel contrtil. O sulco da clivagem finalmente seciona o plano da mitose criando, portanto, dois blastmeros geneticamente equivalentes. Os microfilamentos de actina so encontrados no crtex do ovo ao invs do citoplasma central. Sob o microscpio eletrnico, o anel de microfilamentos pode ser visto formando uma banda cortical distinta de 8-10 m de espessura (Figura 5.43B). Esse anel contrtil existe somente durante a clivagem e se estende por 0.1m para o centro do ovo. responsvel por exercer a fora que separa o zigoto em blastmeros; se interrompido, a citocinese pra. Schroeder (1973) props um modelo de clivagem em que o anel contrtil parte o ovo como um fecho de bolsa apertando o ovo, enquanto a clivagem continua. Esse aperto dos anis de microfilamentos cria o sulco da clivagem. Embora a cariocinese e a citocinese sejam normalmente coordenadas, elas so, s vezes, separadas por condies naturais ou experimentais. Nos ovos dos insetos, a cariocinese ocorre diversas vezes antes da citocinese. Outra maneira de induzir esse estado tratar os embries com a droga citocalasina B, que inibe a formao e a organizao de microfilamentos no anel contrtil, assim, interrompendo a clivagem sem parar a cariocinese (Schroeder, 1972). Em alguns momentos, o ncleo continua a se dividir e expressar protenas reguladoras do desenvolvimento, mesmo quando a clivagem bloqueada (Lillie, 1902; Whittaker, 1979).

Tabela 5.2

Cariocinese e citocinese Principal composio protica Microtbulos de tubulina Microfilamentos de actina Principal droga disruptora Colchicina, nocodazola Citocalasina B

Processo Cariocinese Citocinese

Agente mecnico Fuso mittico Anel contrtil

Localizao Citoplasma central Citoplasma cortical

Como foi verificado que a colchicina inibe independentemente vrias funes da membrana, incluindo a osmorregulao e o transporte de ons e nucleosdeos, nocodazol tornou-se a principal droga usada para inibir processos mediados por microtbulos (veja Hardin, 1987).

202

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Figura 5.43

(A) Microfilamentos (anel contrtil)

(B)

Papel dos microtbulos e microfilamentos na diviso celular. (A) Diagrama da telfase da primeira clivagem. Os cromossomos esto sendo arrastados para os centrolos por microtbulos, enquanto o citoplasma est sendo apertado pela contrao dos microfilamentos. (B) Localizao de microfilamentos da actina no sulco de clivagem. Marcao fluorescente dos microfilamentos de actina mostra o anel contrtil no sulco da primeira clivagem (flecha) de um ovo de ourio-do-mar na telfase. (C) marcao fluorescente da tubulina mostra os steres microtubulares de um ovo de ourio-do-mar durante a telfase da primeira clivagem. (B de Bonder et al., 1988; C de White et. al., 1987.)

Centrolo Cromossomo (C)

Microtbulos

Um dos mais intrigantes problemas no resolvidos da clivagem embrionria, como a citocinese e a cariocinese so coordenadas entre si. Pesquisas in vitro sugerem que a replicao do DNA pode controlar a fosforilao da subunidade quinase cdc2 do MPF e que essa fosforilao pode controlar a habilidade da actina de se contrair (Smythe e Newport, 1992). No entanto, essas observaes podem no ser consistentes com as observaes feitas em clulas embrionrias precoces (Ferrell et al., 1991). O nmero e o local desses sulcos de clivagem parecem ser controlados pelos steres dos microtbulos. Esses steres (Figura 5.43C) so raios microtubulares que se estendem dos plos do fuso mittico para a periferia da clula. Clivagem normal ocorre somente se um par de steres est presente (Wilson, 1901), e ovos polisprmicos (obtendo centrolos de cada espermatozide) formam sulcos de clivagem mltiplos no mesmo ovo (veja Figura 4.20). Em estudos mais recentes, Raff e Glover (1989) mostraram que no embrio de Drosophila, se os centrolos migram ao plo posterior, eles podem formar clulas polares, mesmo na ausncia de ncleo. Dessa maneira, parece que os steres so elementos sine qua non da clivagem. O segundo tipo de evidncia ligando os steres com a formao do sulco de clivagem vem de experimentos nos quais a direo de clivagem mudada pela colocao do ovo sob presso. Pflger (1884) descobriu que quando um zigoto de rs levemente comprimido entre duas placas de vidro, as direes das primeiras trs clivagens so todas perpendiculares ao plano das placas. Ambos, Driesch e Morgan (revisto por Morgan, 1927) fizeram observaes semelhantes com embries de ourio-

CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

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Zigotos (A) (B)

Sulco de clivagem normal (C)

Sulco extra de clivagem extra (D)

Bola de vidro deslocando o aparelho mittico

steres

Interrupo do sulco de clivagem

Fuso

Figura 5.44

do-mar. Em ambos os casos, o plano da terceira clivagem (que normalmente paralelo ao equador do ocito) foi deslocado em 90o. Dessa maneira, com a mudana do local do fuso mittico, pode-se alterar a direo do sulco de clivagem. Rappaport (1961) estendeu esse tipo de experimento, deslocando os fusos mitticos para os lados das clulas. Na Figura 5.44, uma bola de vidro foi usada para deslocar os steres do centro da clula em direo periferia. O sulco de clivagem resultante se estende somente enquanto a bola no aparece do outro lado. Dessa maneira, formada uma clula binucleada, em forma de ferradura. Na prxima diviso, dois aparelhos de fuso se formam entre quatro steres, mas so gerados trs sulco de clivagem! Cada brao da ferradura tem o seu prprio fuso mittico e sulcos de clivagem como esperado, mas um terceiro sulco aparece entre os dois steres no topo da ferradura (Figura 5.44C). Isso demonstra claramente que se os dois steres estiverem prximos um do outro, suas interaes causam a formao de um sulco de clivagem, mesmo na ausncia de um fuso mittico entre eles. Novamente ns observamos que a diviso celular pode ocorrer sem diviso nuclear enquanto os steres estiverem presentes.

Criao de um novo sulco de clivagem pelo deslocamento dos steres. (A,B) Pela interrupo de um sulco de clivagem com uma bola de vidro, cria-se uma clula com forma de ferradura. Na prxima diviso (C,D), cria-se um novo sulco de clivagem, apesar de no haver fuso mittico que o atravessa. (de Rappaport, 1961, cortesia de R. Rappaport.)

A formao de novas membranas


Nossa ltima considerao sobre clivagem embrionria envolve a formao de novas membranas celulares. Sero essas membranas recm-sintetizadas ou so meras extenses da membrana celular do ocito? A resposta que provavelmente ambos mecanismos contribuem para as membranas celulares internas. Embries de anfbios fornecem evidncias que novos componentes da membrana esto sendo sintetizados durante a clivagem precoce. A Figura 5.45A mostra o primeiro sulco da clivagem de um zigoto pigmentado de r. Ao passo que a membrana original tem uma regio cortical pigmentada associada a ela, a nova membrana branca. Essa nova membrana tem tambm propriedades de condutividade eltrica diferentes daquelas da membrana original. Byers e Armstrong (1986) radiorotularam componentes de membrana de ovos de Xenopus recm-fertilizados e seguiram a redistribuio dessas molculas atravs da clivagem, por auto-radiografia. Durante a primeira clivagem, a membrana da superfcie externa do embrio e a membrana da borda principal do sulco de clivagem so altamente marcadas (mostrando serem as regies originais da membrana). Entre elas h uma grande regio desprovida de rtulo radioativo (Figura 5.45B). Dessa maneira, a membrana do sulco um mosaico de diferentes partes. A membrana da parte onde o sulco termina derivada de uma superfcie externa preexistente do ovo, marcada, mas a maior parte da membrana do sulco derivada de regies que so inacessveis aos marcadores de superfcie. Byers e Armstrong especulam que o domnio da membrana intensamente marcada, na borda do sulco, contm as membranas ncoras para o anel subjacente de microfilamentos corticais. A borda do

204

PARTE II Padres de Desenvolvimento

(A)

Nova membrana no-pigmentada

(B)

Figura 5.45

Formao de novas membranas na primeira clivagem do ovo de Xenopus. (A) A membrana antiga tem grnulos de pigmento. A nova membrana aparece clara porque no tem esses grnulos. (B) Auto-radiografia de protenas de membrana no sulco da primeira clivagem. A superfcie celular foi radiativamente marcada antes da diviso. (A de Laat e Bluemink, 1974; B de Byers e Armstrong, 1986, cortesia dos autores.)

sulco em embries precoces de Xenopus, tambm contm microtbulos curtos, dispostos radialmente. Pensa-se que esses microtbulos poderiam fornecer um caminho para o movimento de vesculas das membranas em direo ao lugar onde so inseridos na membrana (Danilchik e Funk, 1996). Esses processos de clivagem dividem o citoplasma do zigoto em numerosas clulas. Cada clula pode ter os mesmos genes nucleares, mas seus respectivos citoplasmas podem diferir significativamente. No prximo captulo veremos como esses blastmeros se locomovem e interagem um com o outro para iniciar a estrutura do corpo.

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CAPTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade

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Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

Meu querido amigo..... a vida infinitamente mais complexa do que qualquer coisa que a mente humana possa imaginar. No ousaramos sequer conceber as coisas que so meros detalhes da existncia. A. CONAN DOYLE (1891) No o nascimento, o casamento ou a morte, mas a gastrulao que verdadeiramente a parte mais importante de nossa vida. LEWIS WOLPERT (1986)

ASTRULAO o processo pelo qual movimentos altamente integrados

de clulas e tecidos, dramaticamente, reorganizam as clulas da blstula. A blstula consiste de numerosas clulas, cujas posies foram estabelecidas durante a clivagem. Durante a gastrulao, essas clulas recebem novas posies e novos vizinhos, e estabelecido o multifacetado plano do corpo do organismo. As clulas que formaro os rgos endodrmicos e mesodrmicos so trazidas para dentro do embrio, ao passo que as precursoras da pele e do sistema nervoso so distribudas na superfcie externa. Assim, as trs camadas germinativas ectoderma externo, endoderma interno e mesoderma intersticial so produzidas inicialmente durante a gastrulao. Ainda, o palco est montado para as interaes desses tecidos recmposicionados. Os movimentos da gastrulao envolvem o embrio inteiro, e migraes celulares em uma parte do organismo gastrulante devem estar intimamente coordenadas com outros movimentos ocorrendo simultaneamente. Mesmo que o padro de gastrulao seja extremamente variado em todo o reino animal, relativamente poucos mecanismos esto envolvidos. A gastrulao, geralmente, envolve os seguintes tipos de movimentos: Epibolia. O movimento de camadas epiteliais (usualmente de clulas ectodrmicas) que se espalham como uma unidade e no individualmente, para envolver as camadas mais profundas do embrio. Invaginao. O dobrar para dentro de uma regio de clulas, de maneira semelhante cavidade formada quando se empurra com o dedo a superfcie de uma bola de borracha macia. Involuo. A internao ou movimento de interiorizaro de uma camada externa em expanso, de modo a se espalhar na superfcie interna das clulas externas remanescentes. Ingresso de clulas. A migrao de clulas individuais da camada superficial para o interior do embrio. Delaminao. A separao de uma camada celular em duas ou mais camadas mais ou menos paralelas. Ao considerarmos gastrulao em diferentes tipos de embrio, devemos levar em conta as seguintes questes (Trinkaus, 1984a): Qual a unidade da atividade migratria? a migrao dependente do movimento de clulas individuais, ou so as clulas parte de uma camada migrante? Por mais extraordinrio que possa parecer, propriedades migratrias regionais podem ser totalmente controladas por fatores citoplasmticos que 209

210

PARTE II Padres de Desenvolvimento

so independentes da celularizao. F. R. Lillie (1902) conseguiu ativar, partenogeneticamente, vulos do aneldeo Chaetopterus e suprimir sua clivagem. Muitos eventos do desenvolvimento precoce ocorreram mesmo na ausncia de clulas. O citoplasma do zigoto se separou em regies definidas, e os clios se diferenciaram nas partes apropriadas do ovo. Ainda mais, o citoplasma claro externo migrou para baixo em direo regio vegetativa, de uma maneira muito parecida epibolia das clulas do hemisfrio animal durante o desenvolvimento normal. Isso ocorreu precisamente no momento em que ocorreria a epibolia durante a gastrulao. Assim, a epibolia pode ser (pelo menos em alguns aspectos) independente das clulas que formam a regio migratria. A expanso ou dobramento de uma camada celular deve-se a fatores intrnsecos prprios, ou s foras extrnsecas que a estendem ou a distorcem? essencial conhecer a resposta a essa pergunta se queremos entender como os vrios movimentos celulares da gastrulao so integrados. Por exemplo, esto as clulas involutivas puxando as clulas epibolizantes para baixo em sua direo, ou so os dois movimentos independentes? Existe uma expanso ativa do tecido total, ou a margem limitante que se expande e arrasta o resto da camada celular, passivamente? So as mudanas na forma e na motilidade celular, durante a gastrulao, conseqncias de mudanas nas propriedades da superfcie celular, tais como adesividade ao substrato ou a outras clulas? Considerando essas questes, observaremos os vrios padres de gastrulao encontrados em equinodermos, anfbios, peixes, aves e mamferos*.

Gastrulao em ourio-do-mar
A blstula do ourio-do-mar consiste de uma nica camada de mais ou menos 1000 clulas. Essas clulas derivadas de diferentes regies do zigoto tm tamanhos e propriedades diferentes. As Figuras 6.1 e 6.2 mostram o destino das vrias regies do zigoto enquanto ele se desenvolve atravs da clivagem e da gastrulao na larva pluteus, caracterstica dos ourios-do-mar. O destino de cada camada pode ser visto atravs de seus movimentos durante a gastrulao. Ingresso do Mesnquima Primrio
FUNO DAS CLULAS PRIMRIAS DO MESNQUIMA. Logo aps a ecloso

da blstula da membrana de fecundao, o seu hemisfrio vegetal comea a se espessar e achatar (Figura 6.2, 9 horas). No centro dessa placa vegetativa achatada, um aglomerado de pequenas clulas comea a se modificar. Essas clulas apresentam movimentos de vibrao em suas superfcies internas, estendendo e contraindo longos e finos processos (30x5 m) chamados filopdios. As clulas ento se dissociam da monocamada epitelial e ingressam na blastocele (Figura 6.2, 9-10 horas). Essas clulas so chamadas de mesnquima primrio e so derivadas dos micrmeros. As 64 ou mais clulas mesenquimatosas primrias do ourio-do-mar so as descendentes dos quatro blastmeros que se formaram pela quarta clivagem assimtrica. Gustafson e Wolpert (1961) usaram filmes com exposio contnua para seguir os movimentos microscpicos das clulas mesenquimatosas dentro da blastocele. No

*A discusso da gastrulao de Drosophila ser transferida para o Captulo 14, quando ela ocorre no contexto da formao do eixo. Lembre-se do alerta feito pelo pesquisador de gastrulao, Ray Keller (comunicao pessoal) Estudantes NO deveriam ler esse material apressadamente, ao contrrio uma cena tpica aquela em que um pobre coitado est debruado sobre este texto s 2.30 horas da madrugada com uma xcara de caf, examinando desesperadamente as figuras para ver se ele ou ela podem entender o que est se passando. Gastrulao (como diz Wolpert na citao no comeo deste captulo) a poca mais importante da sua vida. Vale a pena examin-la criticamente e apreci-la vagarosamente.

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

211

Animal (A)

(B)

(C) Mesmeros

(D)

(E)

(F)

(G)

Macrmeros Vegetal Tufo ciliar (I) Mesnquima secundrio Mesnquima primrio Endoderma invaginante Micrmetros veg1 veg2 (K) Estomodeu (boca) Envoltrio ectodrmico Bastonetes esquelticos (mesoderma) Intestino (endoderma) (L) (Vista lateral)

(H)

(J)

(M)

Figura 6.1

Desenvolvimento normal do ourio-do-mar, seguindo o destino das camadas celulares da blstula. (A-F) Clivagem at o estgio de 60 clulas (omitindo o estgio de 2-clulas). (G) Blstula precoce com clios. (H) Blstula tardia com tufo ciliar e placa vegetal achatada. (I) Blstula com mesnquima primrio. (J) Gstrula com mesnquima secundrio. (K) Larva em estgio prismtico. (L,M) Larva pluteus. Os destinos do citoplasma zigtico podem ser seguidos pelas variaes no sombreamento. (N) Fotomicrografia de uma larva pluteus viva de ourio-do-mar. (A-M segundo Hrstadius, 1939; N cortesia de G. Watchmaker.)

(Vista ventral) (N) Boca

Bastonetes esquelticos

nus

9 hs.

9.5 hs.

10 hs.

10.5 hs.

11 hs.

11.5 hs.

12 hs.

13 hs.

Figura 6.2
15 hs. 13.5 hs. 17 hs. 18 hs.

Seqncia completa da gastrulao em Lytechinus variegatus. O tempo mostra a durao do desenvolvimento a 25oC. (Cortesia de J. Morrill.)

212

PARTE II Padres de Desenvolvimento

(A) (B)

Figura 6.3

Formao dos cordes sinciciais por clulas mesenquimatosas do ourio-do-mar. (A) Clulas mesenquimatosas primrias da gstrula precoce se alinham e se fundem para depositar a matriz da espcula de carbonato de clcio. (B) microfotografia eletrnica de varredura de espculas formadas pela fuso das clulas mesenquimatosas primrias para formar os cordes sinciciais. (C) Anel de clulas mesenquimatosas em volta do arquntero (intestino primitivo). A metade animal e todo o arquntero foram removidos. (D) Colocao das clulas mesenquimatosas primrias na larva precoce de Lytechinus variegatus. (A e D de Ettensohn, 1990; B e C de Morrill e Santos, 1985; todas as fotografias, cortesia dos autores.)

(C) Agregados Ventrolaterais

comeo, as clulas parecem se movimentar ao acaso, ao longo da superfcie interna da blastocele, ativamente produzindo e quebrando conexes filopdicas com a parede da blastocele. Finalmente, essas clulas tornam-se localizadas dentro da provvel regio ventrolateral da blastocele, onde considera-se que sua aderncia seja maior. Aqui, as clulas mesenquimatosas primrias se fundem em cordes sinciciais, que formaro o eixo das espculas de carbonato de clcio do esqueleto larval (Figura 6.3). Estudos mais recentes (Cherr et al., 1992) sugerem que a migrao inicial das clulas mesenquimatosas primrias dirigida pela parede da blastocele e pelas fibrilas paralelas do material da matriz extracelular que invadem a blastocele. As clulas mesenquimatosas primrias parecem migrar ao longo da superfcie da blastocele e so envolvidas no emaranhado dessas fibrilas (Figura 6.4).
IMPORTNCIA DA LMINA EXTRACELULAR NO INTERIOR DA BLASTOCELE.

Cadeia dorsal (D)

Cadeia ventral

Espcula

Os eventos que se do no citoplasma e na superfcie celular so fundamentais para o ingresso e a migrao das clulas mesenquimatosas primrias. Gustafson e Wolpert (1967) propuseram um modelo no qual o ingresso dos micrmeros se d atravs de modificaes de sua adeso a outras clulas e s matrizes extracelulares que os rodeiam. Em 1985, Fink e McClay confirmaram as especulaes de Gustafson e Wolpert, medindo as foras de adeso dos blastmeros de ourio-do-mar, em relao camada hialina, lmina basal e a outras clulas. Originalmente todas as clulas da blstula esto ligadas pela sua superfcie externa camada hialina e sua superfcie interna ligada lmina basal secretada pelas clulas (veja Captulo 3). Na sua lateral, cada clula tem outra clula como vizinha. Fink e McClay verificaram que os futuros ectoderma e endoderma (descendentes dos macrmeros e mesmeros, respectivamente) se ligam fortemente entre si e camada hialina, mas aderem fracamente lmina basal (Tabela 6.1). Os micrmeros da blstula mostram, originalmente, um padro similar de ligao. Entretanto, o padro de ligao dos micrmeros muda na gastrulao.

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

213

(A) (B)

Figure 6.4

Fotografias ao estreo-microscpio eletrnico de varredura de clulas mesenquimatosas primrias dentro da matriz extracelular de fibrilas da blastocele. (A) Clulas mesenquimatosas primrias enredadas na matriz extracelular da gstrula precoce de Strongylus centrotus. (B,C) migrao de clulas mesenquimatosas em estgio de gstrula. As fibrilas da matriz extracelular da blastocele ficaram paralelas ao eixo animal-vegetal e esto intimamente associadas com as clulas mesenquimatosas primrias. (de Cherr et al., 1992; cortesia de G. Cherr.)

(C)

Enquanto outras clulas mantm sua forte ligao camada hialina e s clulas vizinhas, as precursoras do mesnquima primrio perdem sua afinidade a essas estruturas (para aproximadamente 2% do valor original), enquanto que sua afinidade aos componentes da lmina basal e matriz extracelular aumenta 100 vezes. Essa mudana na afinidade faz com que os micrmeros percam suas ligaes com a camada hialina externa e com as clulas circundantes e, atrados pela lmina basal, migram para o interior da blastocele (Figura 6.5). As modificaes na afinidade celular foram

Tabela 6.1 Afinidades de clulas mesenquimatosas e no-mesenquimatosas aos componentesa celulares e extracelulares Fora de deslocamento (em dinas) Tipo celular Micrmeros em estgio de 16 clulas Clulas mesenquimatosas em estgio migratrio Ectoderma e endoderma gastrular Hialino Monocamadas de clulas gastrulares 6.8 x 10-5 1.2 x 10-7 5.0 x 10-5 Lmina basal

5.8 x 10-5 1.2 x 10-7 5.0 x 10-5

4.8 x 10-7 1.5 x 10-5 5.0 x 10-7

Fonte: Segundo Fink e McClay, 1985.

a Clulas testadas foram colocadas em placas contendo hialino, lmina basal extracelular, ou monocamadas celulares. As placas foram invertidas e centrifugadas a vrias foras para deslocar as clulas. A fora de deslocamento calculada pela fora centrfuga necessria para remover as clulas teste do substrato.

214

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Matriz extracelular fibrilar Blastocele Lmina basal

Clulas Mesenquimatosas primrias

(A)

Camada hialina

Clios

(B)

(C)

(D)

(E)

Figure 6.5

Ingresso de clulas mesenquimatosas primrias. (A-E) Diagramas interpretativos descrevendo alteraes nas interaes adesivas nas presumidas clulas mesenquimatosas primrias (cor). Essas clulas perdem suas afinidades pelo hialino e por seus blastmeros vizinhos enquanto adquirem afinidade pela lmina basal. Blastmeros no-mesenquimatosos retm suas originais afinidades pelo hialino e clulas vicinais. (F) Montagem de micrografia eletrnica de varredura mostrando o ingresso de clulas primrias de Lytechinus variegatus. (F cortesia de J. B. Morrill e D. Flaherty.)

(F)

correlacionadas com modificaes nas molculas da superfcie celular que ocorreram durante esse perodo (Wessel e McClay, 1985). Como mostra a Figura 6.4, h uma alta concentrao de material da lmina extracelular ao redor das clulas mesenquimatosas primrias ingressantes (Galileo e Morrill, 1985; Cherr et al., 1992). Alm disso, uma vez dentro da blastocele, as clulas mesenquimatosas primrias parecem migrar ao longo da matriz extracelular da parede da blastocele, extendendo seus filopdios a sua frente (Galileo e Morrill, 1985; Karp e Solursh, 1985). A orientao das fibrilas, ao longo do eixo animal-vegetal, pode estar guiando as clulas em sua migrao. Trs protenas parecem ser importantes nessa migrao. Uma a fibronectina, uma grande glicoprotena (400-kDa), que um componente comum das lminas basais, incluindo aquela da blastocele do ourio-do-mar (Wessel et al., 1984). Fink e McClay mostraram que durante a gastrulao, a afinidade dos micrmeros por essa molcula especfica aumenta dramaticamente. O segundo grupo de molculas consiste de proteoglicanos sulfatados encontrados na superfcie das clulas mesenquimatosas ingressantes (veja Captulo 3; Sugiyama, 1972; Lane e Solursh, 1991). Se a sntese (ou sulfatao) desses proteoglicanos inibida, as clulas mesenquimatosas entram na blastocele, mas no continuam a migrar* (Figura 6.6; Karp e Solursh, 1974; Anstrom et al., 1987). A terceira protena, ECM18, encontrada nas matrizes extracelulares das clulas da blastocele e expressa somente durante a gastrulao. Bloquear ECM18 com anticorpos previne tanto a migrao mesenquimatosa primria quanto a invaginao secundria do endoderma (Berg et al., 1996). Porm, esses sinais de orientao no so suficientes, pois os micrmeros sabem quando parar seu movimento e formar espculas perto do equador da blastocele. As clulas mesenquimatosas primrias se organizam em forma de anel em uma posio especfica ao longo do eixo animal-vegetal. Em dois stios perto do futuro lado ventral da larva, muitas dessas clulas mesenquimatosas primrias se agrupam para iniciar a formao de espculas (Figura 6.3). Se um micrmero marcado de outro embrio injetado na blastocele em gastrulao de um embrio de ourio-do-mar, ele migra para o local correto

*Em um dos primeiros experimentos em embriologia qumica, Curt Herbst (1904) observou que embries de ourio-do-mar no gastrulavam adequadamente quando colocados em gua do mar que no continha ons sulfato. Na poca, ele no podia entender o porqu.

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

215

(A)

(B)

Figura 6.6

Efeito da privao de sulfato no movimento do mesnquima primrio do ourio-do-mar Lytechinus. (A) Gstrula normal. (B) Gstrula anormal formada quando embries so cultivados em gua do mar livre de sulfato. (de Karp e Solursh, 1974, cortesia de M. Solursh.)

e contribui para a formao das espculas embrionrias (Prancha 35). Se clulas mesenquimatosas primrias de embries mais velhos so injetadas em gstrulas mais jovens, elas atrasaro sua diferenciao, migraro como as clulas mais jovens e sero incorporadas normalmente no mesnquima do hospedeiro. Alm disso, se todas as clulas mesenquimatosas do hospedeiro so removidas antes da injeo de clulas mesenquimatosas mais velhas, essas repetiro os estgios iniciais de sua migrao, formando um anel mesenquimatoso e o esqueleto, normalmente (Ettensohn, 1990). Considera-se que essa informao posicional fornecida pelas futuras clulas ectodrmicas e suas lminas basais (von bisch, 1939; Harkey e Whiteley, 1980). Somente clulas mesenquimatosas primrias (e no outros tipos de clulas ou partculas de ltex) so capazes de responder a esses sinais modeladores (Ettensohn e McClay, 1986). Miller e colegas (1995) observaram a existncia de filopdios extremamente delgados (0.3 m de dimetro) no mesnquima esqueletognico (skeletonogenic); esses parecem explorar e sentir a parede da blastocele (Figura 6.7). Esses filopdios contm actina e no so considerados como locomotores. Em lugar disso, so considerados como sensores do ambiente, da mesma maneira que os filopdios nas pontas dos cones de crescimento axonal. Essas extenses delgadas podem ser responsveis pela captao de sinais modeladores dorsoventral e animal-vegetal, a partir do ectoderma (Malinda et al., 1995). Primeiro estgio da invaginao do arquntero Enquanto se forma o anel de clulas mesenquimatosas primrias no plo vegetal da blastocele, mudanas importantes esto ocorrendo nas clulas que permanecem na

Figura 6.7

Videomicrografia de Nomarski mostrando um filopdio longo e fino estendendo-se de uma clula mesenquimatosa primria at a parede ectodrmica da gstrula, assim como um filopdio mais curto estendendo-se para dentro do ectoderma. Os filopdios mesenquimatosos estendem-se atravs da matriz extracelular e contatam diretamente a membrana celular das clulas ectodrmicas. (de Miller et al., 1995; fotografia cortesia de D. McClay.)

216

PARTE II Padres de Desenvolvimento

placa vegetativa. Essas clulas permanecem ligadas umas s outras e camada hialina do ovo, e se movem para ocupar os vazios deixados pelo ingresso do mesnquima; portanto, a placa vegetal se achata ainda mais. Verifica-se, tambm, que a placa vegetal se dobra para dentro e se estende por um quarto ou at a metade do seu caminho para a blastocele (veja Figura 6.2, 10.5-11.5 horas; Figura 6.8A). Ento, repentinamente, a invaginao cessa. A regio invaginada chamada de arquntero (intestino primitivo) e sua abertura no plo vegetal chamada de blastporo. Quais foras atuam para invaginar essas clulas? Lane e colaboradores (1993) mostraram que o envergamento semelhante aquele produzido pelo aquecimento de uma faixa bimetlica. A camada hialina , na verdade, formada de duas lminas: uma externa, formada primariamente de protena hialina, e uma interna, composta de protenas fibropelinas* (Hall e Vacquier. 1982; Bisgrove et al., 1991). As clulas da placa vegetal (e somente essas clulas) secretam um proteoglicano de condroitina sulfato na lmina interna da camada hialina, diretamente abaixo delas. Essa molcula higroscpica (absorvente de gua) incha a lmina interna mas no a externa. Isso causa o envergamento da camada hialina (Figura 6.8B,C). Um pouco mais tarde, uma
*Fibropelinas so armazenadas em grnulos secretores dentro dos ocitos. So secretadas desses grnulos aps a liberao da protena hialina pela exocitose granular cortical. No estgio de blstula, as fibropelinas j formaram um envoltrio, tipo rede, sobre a superfcie do embrio. (A)

Figura 6.8

Invaginao da placa vegetal. (A) Invaginao da placa vegetal de Lytechinus variegatus vista por micrografia eletrnica de varredura da superfcie externa da gstrula precoce. O blastporo est claramente visvel. (B) a camada hialina consiste de lminas internas e externas. Microvilosidades da placa vegetal estendem-se atravs da camada hialina e seu citoplasma contm vesculas secretoras que armazenam um proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG). (C) Os grnulos de armazenamento secretam o proteoglicano para dentro da lmina interna da camada hialina. O proteoglicano absorve gua e entumece a lmina interna, enquanto a lmina externa, ao qual est fixado, no entumece. Isso ocasiona a curvatura para dentro do envoltrio hialino e do epitlio a ele ligado. (A de Morrill e Santos, 1985, cortesia de J. B. Morrill e C segundo Lane et al., 1993.)
(B) (C) Clulas da placa vegetal empurradas para cima

Blastocele interior

Clulas de placa vegetal

Camada hialina

Lmina interna Lmina externa

Microvilosidades

Vesculas secretoras com proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG)

CSPG secretado para a lmina interna absorve gua, causando tumefao

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

217

Gastrulao precoce

Gastrulao tardia

Figura 6.9

blastporo

Rearranjo celular durante a extenso do arquntero em embries de ourio-do-mar. Nessa espcie, o arquntero precoce tem 20 a 30 clulas ao redor de sua circunferncia. Mais tardiamente na gastrulao, o arquntero tem uma circunferncia constituda de somente 6 a 8 clulas. Clones marcados fluorescentemente podem ser vistos estendendo-se apicalmente. (Segundo Hardin, 1990.)

segunda fora resultante dos movimentos das clulas epiteliais adjacentes placa vegetal, pode facilitar essa invaginao puxando para dentro a camada envergada (Burke et al., 1991). Segundo e terceiro estgios da invaginao do arquntero A invaginao das clulas vegetais ocorre em trs estgios discretos. Aps uma breve pausa, comea a segunda fase da formao do arquntero. Durante essa fase, o arquntero se estende dramaticamente, algumas vezes triplicando seu comprimento. No processo de extenso, o largo e curto intestino rudimentar transformado em um tubo longo e delgado; mas no so formadas novas clulas (veja Figura 6.2, 12 horas; Figura 6.9). Para produzir essa extenso, as clulas do arquntero se reorganizam migrando umas sobre as outras e sofrendo um achatamento (Ettensohn, 1985; Hardin e Cheng, 1986). Esse fenmeno, onde clulas se intercalam para estreitar o tecido e, ao mesmo tempo, lev-lo adiante chamado extenso convergente. Em pelo menos algumas espcies de ourio-do-mar, ocorre um terceiro estgio no alongamento do arquntero. Essa ltima fase iniciada pela tenso propiciada pelas clulas mesenquimatosas secundrias, que se formam na ponta do arquntero e l permanecem (veja Figura 6.2, 13 horas; Figura 6.10). Os filopdios se estendem dessas clulas atravs do fluido da blastocele e fazem o contacto com a superfcie interna da

Figura 6.10

(A)

(B)

Estgio de gstrula intermediria do ouriodo-mar Lytechinus pictus, mostrando extenses de filopdios do mesnquima secundrio estendendo-se da ponta do arquntero at a parede da blastocele. (A) Clulas mesenquimatosas estendendo filopdios da ponta do arquntero. (B) Cabos de filopdios conectando a parede da blastocele ponta do arquntero. A tenso nos cabos pode ser avaliada pela trao exercida sobre a parede da blastocele no ponto de fixao. (Fotografias cortesia de C. Ettensohn.)

218

PARTE II Padres de Desenvolvimento

parede da blastocele (Dan e Okazaki, 1956; Schroeder, 1981). Os filopdios se ligam parede nas junes entre as clulas do blastoderma e, em seguida, se contraem, arrastando o arquntero para cima. Hardin (1988) removeu as clulas mesenquimatosas secundrias com um laser, e como conseqncia o arquntero s pode se alongar aproximadamente em dois teros do seu comprimento total. Quando algumas clulas mesenquimatosas secundrias foram deixadas, o alongamento continuou, embora em velocidade menor do que nos controles. As clulas mesenquimatosas secundrias tm, ento, um papel essencial em elevar o arquntero at a parede da blastocele durante a ltima fase da invaginao. Mas, podem os filopdios mesenquimatosos secundrios se ligar a qualquer parte da parede da blastocele, ou existe um alvo especfico no hemisfrio animal que precisa estar presente para que a ligao ocorra? Existe alguma regio da parede da blastocele que predestinada a se tornar o lado ventral da larva? Estudos de Hardin e McClay (1990) mostram que existe um alvo especfico para os filopdios do hemisfrio animal, que difere de outras regies. Os filopdios das clulas mesenquimatosas secundrias se estendem, tocam a parede da blastocele ao acaso e, em seguida, se retraem. Entretanto, quando os filopdios atingem uma regio especfica da parede, eles permanecem ligados naquele local, se achatam contra essa regio e puxam o arquntero em direo a ela. Quando Hardin e McClay comprimiram o outro lado da parede da blastocele, de modo que o contato com a regio se tornou mais eficiente, os filopdios continuaram a se estenderem e a se contrarem ao tocar a parede daquela regio. Somente quando os filopdios encontraram o alvo que cessaram os movimentos. Com a gstrula contrada de modo a impedir que os filopdios jamais atingissem a rea alvo, as clulas secundrias mesenquimatosas continuaram sua explorao at que finalmente se afastaram do arquntero e encontraram o tecido alvo, como clulas migratrias livres. Parece ento, que existe uma regio alvo destinada a se transformar na regio ventral da larva, que reconhecida pelas clulas mesenquimatosas secundrias e que posiciona o arquntero na regio onde se formar a boca. Quando o topo do arquntero encontra a parede da blastocele nessa regio, as clulas mesenquimatosas secundrias se dispersam no interior da blastocele, onde proliferam para formar os rgos mesodrmicos (veja Figura 6.2, 13.5 horas). Onde o arquntero contata a parede se formar, finalmente, uma boca que se fundir a ele formando um tubo digestivo contnuo. Assim, como caracterstico para os deuterostomatas, o blastporo marca a posio do nus.

Gastrulao em peixes
A transio da blstula intermediria e a aquisio de motilidade celular Durante o dcimo ciclo de clivagem do peixe-zebra, as divises celulares perdem sua sincronia, novos genes so expressos e as clulas se tornam mveis. Essa transio da blstula intermediria (MBT) tambm evidente em rs e em Drosophila. Como discutido no Captulo 5, a MBT parece ser regulada pela relao entre cromatina e citoplasma. Peixes haplides entram na MBT um ciclo mais tarde; peixes tetraplides entram um ciclo antes (Kane e Kimmel, 1993). Parece que alguma coisa na cromatina est removendo por titulao alguma substncia (at agora desconhecida) do citoplasma. O primeiro movimento celular a epibolia das clulas blastodrmicas sobre o vitelo. Na fase inicial, as clulas blastodrmicas internas se movem para o exterior e se intercalam com as clulas mais superficiais (Warga e Kimmel, 1990). Mais tarde, as clulas se movem sobre a superfcie do vitelo envolvendo-o completamente (Figura 6.11). Esse movimento no devido a um arrasto ativo dos blastmeros. Pelo contrrio, o movimento propiciado pela expanso autnoma da camada sincicial do vitelo (YSL) dentro do citoplasma do hemisfrio animal. A camada envolvente (EVL) est

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

219

(A) 30% DE EPIBOLIA (4.7 HS) Camada envolvente Camada profunda Camada sincicial do vitelo Ventral Dorsal Plo animal

Figura 6.11

Movimentos celulares durante a gastrulao do telesteo Danio rerio. (A) O blastoderma com epibolia 30 porcento completa. (B) Formao do hipoblasto, por involuo de clulas na margem do blastoderma em epibolizao ou por delaminao de clulas do epiblasto. (C) Detalhe da regio marginal. (D) Com 90 porcento de epibolia, o mesoderma pode ser visto rodeando o vitelo, entre o ectoderma e o endoderma. (E) Trmino da gastrulao. (Segundo Driever, 1995, e Langeland e Kimmel, 1997.)

Clula do vitelo Ncleo do vitelo Plo vegetal

(B) ESCUDO (6.0 HS.)

(C) Plo animal Ingresso celular Epiblasto Hipoblasto Escudo Hipoblasto Camada envolvente Epiblasto Dorsal Clulas em involuo Clulas em noinvoluo Sinais indutores mesodrmicos e dorsais Camada sincicial do vitelo Grnulo do vitelo

Ventral

Sinal indutor mesodrmico Plo Vegetal

(D)

Plo animal Mesoderma dorsal Camada envolvente

(E) Anterior

Plo animal Regio ceflica

Camada envolvente Somito #1

Ventral

Dorsal Ventral Dorsal

Mesoderma Ectoderma, neuroectoderma Plo vegetal Mesendoderma: precursores para mesoderma e endoderma Endoderma (90% EPIBOLIA (9 HS) Coto caudal Posterior Plo animal 1 SOMITO (10.3 HS) Regio do tronco

fortemente ligada YSL e arrastada junto com ela. As clulas mais profundas do blastoderma enchem o espao entre a YSL e a EVL enquanto a epibolia se desenvolve. Isso pode ser demonstrado cortando a ligao entre YSL e EVL. Quando isso feito, as clulas blastodrmicas retornam ao topo do vitelo enquanto YSL continua sua expanso ao redor da clula do vitelo (Trinkaus, 1984b, 1992). A expanso de YSL tem como base uma rede de microtbulos em sua estrutura, e radiao ou drogas que

220

PARTE II Padres de Desenvolvimento

impedem a polimerizao de tubulina inibem a epibolia (Strahle e Jesuthasan, 1993; Solnica-krezel e Driever, 1994). Durante a migrao, um dos lados do blastoderma se torna visivelmente mais grosso do que o outro. Experimentos com marcao de clulas indicam que o lado mais delgado marca o stio da futura superfcie dorsal do embrio (Schmidt e CamposOrtega, 1995). Formao das camadas germinais Depois que as clulas blastodrmicas cobrem aproximadamente a metade da clula do vitelo do peixe-zebra (e mais cedo em ovos de peixes com vitelos maiores) um espessamento ocorre ao longo de toda a margem. Esse espessamento chamado de anel germinativo, e composto de uma camada superficial, o epiblasto, e uma camada interna, o hipoblasto. No entendemos como produzido o hipoblasto. Alguns laboratrios alegam que o hipoblasto formado pela involuo das clulas superficiais abaixo da margem, seguida por sua migrao para o plo animal (veja Figura 6.11). A involuo comea na futura poro dorsal do embrio, mas ocorre na margem inteira. Outros laboratrios alegam que essas clulas hipoblsticas ingressam para formar o hipoblasto (veja Trinkaus, 1996). ( possvel que ambos os mecanismos ocorram com diferentes maneiras de formar o hipoblasto predominando em espcies diferentes.) Uma vez formado o anel, as clulas profundas de ambos, epiblasto e hipoblasto, se intercalam no futuro lado dorsal do embrio, para formar um espessamento localizado, o escudo embrionrio (Figura 6.12). Esse escudo funcionalmente equivalente ao lbio dorsal do blastporo de anfbios, pois ele pode organizar um eixo embrionrio secundrio quando transplantado a um embrio hospedeiro (Oppenheimer, 1936; Ho, 1992; veja discusso de gastrulao em anfbios). Assim, enquanto as clulas realizam a epibolia em torno do vitelo, elas tambm esto involuindo nas margens e convergindo anteriormente e dorsalmente em direo

(A)

Plo animal Extenso Escudo embrionrio

Figura 6.12

Convergncia Involuo Epibolia Clula do vitelo

Convergncia e extenso no peixe-zebra. (A) Vista dorsal de movimentos de convergncia e extenso durante a gastrulao do peixe-zebra. A epibolia estende o blastoderma sobre o vitelo; a involuo ou o ingresso geram o hipoblasto; convergncia e extenso trazem clulas do hipoblasto e epiblasto para o lado dorsal para formar o escudo embrionrio. Dentro do escudo, a intercalao estende o cordomesoderma em direo ao plo animal. (B,C) Extenso convergente do cordomesoderma mostrada por aquelas clulas exprimindo o gene no tail (sem cauda), um gene que expresso pelas clulas da notocorda. (D,E) Extenso convergente de clulas mesodrmicais adaxiais (marcadas pela sua expresso de gene snail para flanquear a notocorda. (de Langeland e Kimmel, 1997.)

(B)

(C)

(D)

(E)

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

221

(A) Vidro para segurar o embrio

(B) Manchas de corante no embrio

(C)

Discos de gar com corante

Lbio dorsal do blastporo

Embrio

Figura 6.13

Colorao vital de embries de anfbios. (A) Mtodo de Vogt para marcao de clulas especficas da superfcie embrionria com corantes vitais. (B-D) Vistas da superfcie do corante em embries sucessivos. (E) Embrio de trito dissecado no plano mediano para mostrar clulas coradas no interior. (Segundo Vogt, 1929.)

Seco em plano de viso (E) (D)

ao escudo embrionrio (Trinkaus, 1992). As clulas hipoblsticas do escudo embrionrio convergem e se estendem anteriormente, finalmente estreitando-se ao longo da linha dorsal mdia do hipoblasto. Esse o cordomesoderma, o primrdio da notocorda (Figura 6.12B,C). As clulas adjacentes ao cordomesoderma, as clulas adaxiais, so as precursoras dos somitos mesodrmicos (Figura 6.12D,E). A convergncia e a extenso no epiblasto traz as clulas presuntivas do crebro de todo o epiblasto para a linha mdia dorsal onde formam a quilha neural. O resto do epiblasto se torna a pele do peixe. O mapa de destino do peixe-zebra, ento, no to diferente daquele da r ou outros vertebrados (como logo veremos). Se abrirmos, conceitualmente, uma blstula de Xenopus no plo vegetal e esticarmos a abertura em um anel marginal, o mapa de destino resultante se parece muito com aquele do embrio do peixe-zebra quando metade do vitelo estava coberto pelo blastoderma (Langeland e Kimmel, 1997).

(E)

Gastrulao de anfbios
O estudo da gastrulao em anfbios ao mesmo tempo uma das mais antigas e uma das mais novas reas da embriologia experimental; mesmo considerando que gastrulao de anfbios foi estudada extensamente no sculo passado, a maior parte de nossas teorias relacionadas aos mecanismos do movimento no desenvolvimento, foram revisadas na dcada passada. O estudo da gastrulao em anfbios foi complicado pelo fato de existir mais de um tipo de gastrulao nos anfbios. Espcies diferentes empregam diferentes maneiras para atingir o mesmo objetivo (Smith e Malacinski, 1983; Lundmark, 1986). Nos ltimos anos, a pesquisa mais intensa se concentrou em Xenopus, portanto, daremos nfase ao seu processo de gastrulao. Movimentos celulares durante a gastrulao de anfbios As blstulas de anfbios tm as mesmas tarefas que seus companheiros, equinodermos e peixes, ou seja, trazer para dentro aquelas reas destinadas a formar os rgos endodrmicos, envolver o embrio com clulas capazes de formar o ectoderma e colocar as clulas mesodrmicas no lugar apropriado entre elas. Os movimentos pelos quais isso conseguido podem ser visualizados pela tcnica de colorao vital. Vogt (1929) saturou fragmentos de gar com corante, como vermelho neutro ou sulfato de azul do Nilo, os quais coram mas no danificam as clulas embrionrias. Esses fragmentos corados de gar foram pressionados contra a superfcie da blstula e uma parte do corante foi transferida para as clulas contatadas (Figura 6.13). Os movimentos de cada grupo de clulas coradas foram acompanhados atravs da gastrulao, e

222

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Figura 6.14

Epiderme Placa neural Endoderma acima do blastporo Endoderma abaixo do blastporo (A) EXTERIOR

Mapas do destino da blstula da r Xenopus laevis. Mapas de destino (A) de clulas exteriores e (B) interiores indicam que a maioria dos derivados mesodrmicos so formados de clulas interiores. Nessa vista lateral, o ponto em que se forma o lbio dorsal do blastporo est indicado por uma flecha. (Segundo Keller, 1976.)

Mesoderma lateral Blastporo Somitos (B) INTERIOR

Notocorda

Blastporo

os resultados sumariados em mapas de destino. Esses mapas foram recentemente confirmados e ampliados por tcnicas de microscopia eletrnica de varredura e de injeo de corantes (Smith e Malacinski, 1983; Lundmark, 1986). Estudos com corantes vitais de Lvtrup (1975; Landstrom Lvtrup, 1979) e de Keller (1975, 1976) mostraram que as clulas da blstula de Xenopus tm diferentes destinos, conforme se encontrem nas camadas profundas ou superficiais do embrio (Figura 6.14). Em Xenopus, os precursores mesodrmicos existem somente na camada profunda, enquanto que o ectoderma e endoderma se originam da camada superficial do embrio. Os precursores da notocorda e outros tecidos mesodrmicos esto localizados abaixo da superfcie, na regio equatorial (marginal) do embrio. Em urodelos (salamandras, tais como: Triturus e Ambystoma) e em algumas rs sem ser o Xenopus, os precursores da notocorda e do mesoderma so encontrados em ambas, nas clulas da superfcie e nas clulas marginais profundas (Purcell e Keller, 1993). A gastrulao em embries de r iniciada no futuro lado dorsal do embrio, logo abaixo do equador na regio do crescente cinzento (Figura 6.15). Nesse ponto, as futuras clulas endodrmicas locais invaginam dando lugar formao de um blastporo em forma de fenda. Essas clulas modificam sua forma dramaticamente. O corpo principal de cada clula deslocado na direo interna do embrio, mas o contacto com a superfcie externa mantido por um delgado filamento semelhante a um pescoo (Figura 6.16). Essas clulas garrafa revestem o arquntero inicial. Assim, como na gastrulao do ourio-do-mar, uma invaginao de clulas inicia a formao do arquntero. Entretanto, ao contrrio da gastrulao em ourio-do-mar, a gastrulao na r no comea no plo vegetativo, mas na zona marginal prxima ao equador da blstula, onde se encontram os hemisfrios animal e vegetal. Aqui, as clulas endodrmicas no so to grandes e nem to ricas em vitelo como os blastmeros do plo vegetativo. A prxima fase da gastrulao envolve a involuo das clulas da zona marginal, enquanto as clulas do plo animal sofrem epibolia e convergem no blastporo. Quando as clulas marginais migratrias chegam ao lbio dorsal do blastporo, elas se dirigem para dentro e migram ao longo da superfcie interna das lminas celulares externas. Dessa forma, as clulas que constituem o lbio do blastporo esto constantemente mudando. As primeiras clulas que compem o lbio dorsal so as clulas garrafa que invaginam para formar a borda anterior do arquntero. Essas clulas, mais tarde, se tornam as clulas farngeas do intestino anterior. Enquanto essas primeiras clulas passam para o interior do embrio, o lbio do blastporo passa a ser composto de clulas que involuem para dentro do embrio, tornando-se os precursores do mesoderma da cabea. As prximas clulas involuindo para o embrio, atravs do lbio dorsal do blastporo, so as clulas cordomesodrmicas. Essas clulas formaro a notocorda, uma espinha dorsal mesodrmica transitria que essencial para o incio da diferenciao do sistema nervoso. medida que as novas clulas migram para dentro do embrio, a blastocele deslocada para o lado oposto ao lbio dorsal do blastporo. Enquanto isso, o lbio do blastporo se expande lateral e ventralmente, bem como os processos de formao das clulas garrafa e involuo continuam no blastporo. O blastporo em expanso

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

223

Plo animal (AP) Arquntero Blastocele Clulas superficiais Clulas profundas Plo vegetal Lbio dorsal do blastporo Blastocele deslocada (B) (C) Mesoderma

Endoderma

(A)

Mesoderma dorsal

Ectoderma Arquntero Notocorda

Mesnquima

Ectoderma Notocorda Lbio lateral do blastporo

Lbio dorsal do blastporo

Lbio dorsal do blastporo Lbio lateral do blastporo

Endoderma (D) Ectoderma Endomesoderma anterior (E)

Tampo do vitelo Lbio ventral do blastporo

(F) Mesoderma ventral

Figura 6.15

Movimentos celulares durante a gastrulao da r. As sees so cortadas atravs da metade do embrio, e so posicionadas de modo que o plo vegetal seja inclinado na direo do observador e ligeiramente para a esquerda. Os principais movimentos celulares esto indicados por flechas, e as clulas superficiais do hemisfrio animal esto coloridas para permitir o seguimento de sua movimentao. (A,B) Gastrulao precoce. Clulas de garrafa da margem movem-se para o interior para formar o lbio do blastporo, e precursores mesodrmicos involuem sob o teto da blastocele. AP marca a posio do plo animal, que ir mudar medida que a gastrulao prossegue. (C,D) Gastrulao intermediria. O arquntero se forma e desloca a blastocele, e as clulas migram dos lbios lateral e ventral do blastporo para dentro do embrio. As clulas do hemisfrio animal migram em direo da regio vegetal, movendo o blastporo para regio prxima do plo vegetal. (E,F) Perto do fim da gastrulao, a blastocele obliterada, o embrio fica envolvido pelo ectoderma, o endoderma foi internalizado, e as clulas mesodrmicas se posicionaram entre o ectoderma e o endoderma. (Segundo Keller, 1986.)

Figura 6.16

(A)

(B)

Estrutura do lbio do blastporo. (A) Diagrama de clulas de uma seo da gastrulao do embrio da salamandra, mostrando a extenso das clulas-garrafa do blastporo. (B) Viso de superfcie de um lbio dorsal precoce do blastporo de Xenopus. A diferena de tamanho entre os blastmeros animais e vegetais est claramente aparente. (C) Detalhe da regio onde as clulas do hemisfrio animal esto involuindo atravs do lbio do blastporo. (A segundo Holtfreter, 1943; B e C, micrografias de varredura eletrnica cortesia de C. Phillips.)
(C)

Clulasgarrafa

Blastporo

224

PARTE II Padres de Desenvolvimento

(A)

(B) i

Lbio dorsal ii iii

Obturador do vitelo Lbio do blastporo

Lbio lateral

iv

Lbio ventral

Obturador do vitelo

Figura 6.17

Epibolia do ectoderma. (A) Movimentos morfogenticos de clulas migrando para o interior do blastporo e em seguida sob a superfcie. (B) Mudanas na regio ao redor do blastporo quando se formam sucessivamente os lbios dorsal, lateral e ventral. Quando o lbio ventral completa o crculo, o endoderma torna-se progressivamente internalizado. Nmeros ii-v correspondem s Figuras 6.15B-E, respectivamente. (B de Balinsky, 1975, cortesia de B. I. Balinsky.)

como um crescente, desenvolve lbios laterais e, finalmente, um lbio ventral sobre o qual passam clulas precursoras adicionais, mesodrmicas e endodrmicas. Com a formao do lbio ventral, o blastporo forma uma anel ao redor das grandes clulas endodrmicas que permanecem expostas na superfcie do plo vegetativo. Esse pedao remanescente de endoderma chamado de rolha ou obturador do vitelo; ele tambm finalmente internalizado (Figura 6.17). Naquele ponto, todos os precursores endodrmicos foram trazidos para o interior do embrio, o ectoderma envolveu a superfcie e o mesoderma foi colocado entre eles. Posicionando o blastporo Tendo visto os aspectos gerais da gastrulao em anfbios, podemos agora nos ocupar de cada passo em detalhe. A gastrulao no existe como um processo independente na vida do animal. Na verdade, a preparao para a gastrulao j pode ser visualizada no preciso momento da fuso vulo-espermatozide. O vulo tem uma polaridade ao longo do eixo animal-vegetal. O destino geral dessas regies pode ser previsto antes da fecundao. A superfcie do hemisfrio animal se transformar nas clulas do ectoderma (pele e nervos), o hemisfrio vegetal formar as clulas do intestino e rgos associados (endoderma), e as clulas mesodrmicas sero formadas a partir do citoplasma interno, ao redor do equador. Assim, as camadas germinativas podem ser mapeadas no vulo; porm, isso nada diz sobre qual parte do ovo formar a frente e qual as costas. Os eixos dorsoventral (dorso-frente), ntero-posterior e direito-esquerdo ainda no foram determinados. Os eixos dorsoventral e ntero-posterior so especificados pelo deslocamento do citoplasma do zigoto durante a fecundao. No Captulo 4 discutimos a rotao do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno no ovo da r. O citoplasma interno permanece orientado em relao gravidade devido a sua densa acumulao de vitelo, enquanto o citoplasma cortical gira 30o na direo do hemisfrio animal (para cima) em direo ao ponto de entrada do espermatozide (veja Figura 4.34).

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

225

Essa rotao faz com que o eixo animal-vegetal da superfcie do ovo se desloque 30o relativo ao eixo animal-vegetal do citoplasma interno. Dessa maneira, um novo estado de simetria adquirido. Enquanto que o vulo era radialmente simtrico em relao ao eixo animal-vegetal, o ovo fecundado agora tem um eixo dorsoventral e bilateralmente simtrico (tem lados direito e esquerdo). O citoplasma interno tambm se move, e microscopia de fluorescncia de embries precoces mostrou que os padres citoplasmticos das clulas presuntivas dorsais so diferentes daqueles das clulas presuntivas ventrais (Prancha 7). Esses movimentos citoplasmticos ativam o citoplasma oposto ao ponto de entrada do espermatozide, a iniciar a gastrulao (Figura 6.18). O lado pelo qual entra o espermatozide marca a futura superfcie ventral do embrio; o lado oposto, onde se inicia a gastrulao, marca o futuro dorso (costas) do embrio (Gerhart et al., 1981; Vincent et al., 1986). Mesmo que o espermatozide no seja necessrio para induzir esses movimentos no citoplasma do ovo, ele importante na determinao da direo dessa rotao. Se um ovo artificialmente estimulado anucleado, a rotao cortical ainda se d no tempo correto. Entretanto, a direo desse movimento imprevisvel. (De fato, em ovos disprmicos existe uma nica direo de rotao.) O espermatozide parece fornecer um sinal espacial que orienta a rotao autnoma do citoplasma, mas a rotao citoplasmtica que essencial para o futuro desenvolvimento. Alm disso, se essa rotao cortical bloqueada, no h o desenvolvimento dorsal, e o embrio morre como uma massa de clulas ventrais (primariamente intestinais) (Vincent e Gerhart, 1987). A direo do movimento citoplasmtico determina qual lado ser o dorsal e qual ser o ventral. A direo preferencial fornecida pelo ponto de entrada do espermatozide pode ser sobrepujada por um redirecionamento mecnico da relao espacial entre os citoplasmas cortical e subcortical. Quando se impede a rotao do ovo (por imerso em um polissacardeo que provoca o colapso do espao perivitelino entre o ovo e o envoltrio de fertilizao) ele pode sofrer uma rotao de 90o de modo que o eixo animal-vegetal fique horizontal e no vertical e o ponto de entrada do espermatozide voltado para cima (Gerhart et al., 1981; Kirschner e Gerhart, 1981; Cooke, 1986). Quando ovos fecundados so inclinados dessa maneira por trinta minutos, partindo da metade do primeiro ciclo de clivagem, o citoplasma gira de tal maneira que quase todos os embries iniciam a gastrulao no mesmo lado da entrada do espermatozide (veja Figura 6.18). A discusso precedente sugere que deve ser possvel ter dois stios de iniciao de gastrulao se houver a combinao de rotao orientada pelo espermatozide com uma rotao do ovo artificialmente induzida. Black e Gerhart (1985) permitiram a rotao inicial orientada pelo espermatozide, mas em seguida imobilizaram os ovos em gelatina e os centrifugaram levemente, de modo que o citoplasma interno se movesse para o ponto de entrada do espermatozide. Quando foi permitido que os ovos centrifugados se desenvolvessem em gua normal, apareceram dois stios de gastrulao, levando ao aparecimento de larvas gmeas ligadas (Figura 6.19). A hiptese de Black e Gerhart (1986) que tal produo de gmeos causada pela formao de duas reas de interao: um eixo se forma onde a rotao cortical normal deu origem s interaes citoplasmticas no plo vegetal da clula; o outro eixo se forma onde o citoplasma dirigido pela centrifugao interage com os componentes do plo vegetal. Gmeos tambm podem ser produzidos em gravidade normal, colocando o lado do ovo onde penetra o espermatozide voltado para cima, aps remover o envoltrio de fertilizao (Gerhart et al., 1981). A possibilidade de se obter dois lbios funcionais dos blastporos tambm sugere que no h nada especial a respeito do crescente cinzento, onde se observa pela primeira vez o incio da gastrulao. Na verdade, os fatores indutores da gastrulao parecem ser criados pelas interaes dos citoplasmas animal e vegetal, interaes essas que, provavelmente, ativam algum componente do citoplasma vegetal. Gimlich e Gerhart (1984) realizaram uma srie de experimentos de transplante que confirmaram

Normal
Porcentagem de embries

Girada

ngulo do lbio do blastporo do ponto de entrada de espermatozide

Figura 6.18

Relao entre o ponto da entrada do espermatozide e o lbio dorsal do blastporo em ovos de r normais e naqueles que sofreram rotao. Ovos de Xenopus foram fertilizados, desgeleificados e colocados em Ficoll para desidratar o espao perivitelino. A entrada do espermatozide foi marcada com corante. Os ovos sofreram rotao, foram inclinados em 900, com o ponto de entrada do espermatozide virado para cima, 50-80 minutos aps a fertilizao. (Segundo Gerhart et al., 1981.)

226

PARTE II Padres de Desenvolvimento

(A)

(B)

Figura 6.19

Blastporos gmeos produzidos pela rotao de ovos desgeleificados de Xenopus com o lado ventral para cima (ponto de entrada do espermatozide), no momento da primeira clivagem. (A) Dois blastporos so instrudos para formar: o original (oposto ao ponto de entrada do espermatozide) e o novo, criado pelo deslocamento de material citoplasmtico. (B) Esses ovos desenvolvem dois eixos completos, que formam girinos gmeos, ligados ventralmente. (Cortesia de J. Gerhart.)

a hiptese de que os fatores que iniciam a gastrulao originalmente esto no citoplasma profundo das clulas vegetativas dorsais, e no no crescente cinzento. Eles demonstraram que em um embrio de Xenopus, no estgio de 64 clulas, os trs blastmeros vegetais mais dorsais so capazes de induzir a formao do lbio dorsal do blastporo e de um eixo dorsal completo em embries hospedeiros irradiados com luz ultravioleta (que, de outra maneira, no seriam capazes de iniciar a gastrulao; Figura 6.20A). Alm disso, esses trs blastmeros, situados abaixo da regio do prospectivo lbio dorsal, podem tambm induzir uma invaginao secundria e um eixo quando transplantados para o lado ventral de um embrio normal, no estgio de 64 clulas, no irradiado (Figura 6.20B). Esse pequeno grupo de blastmeros vegetais permite a invaginao de clulas marginais adjacentes e a formao do eixo mesodrmico dorsal do embrio. Holowacz e Elinson (1993) observaram que o citoplasma cortical, das clulas vegetativas dorsais do embrio de Xenopus, no estgio de 64 clulas, era capaz de induzir a formao de eixos secundrios quando injetado em clulas vegetativas ventrais. Nem o citoplasma cortical de clulas animais e nem o citoplasma profundo das clulas ventrais puderam induzir esses eixos. Parece, ento, que os rearranjos internos do citoplasma, provavelmente orientados pela entrada do espermatozide, so responsveis pela distribuio assimtrica de fatores subcelulares. Essa assimetria cria uma distino dorsoventral no ovo que, em ltima instncia, dirige o posicionamento do blastporo acima de um conjunto de blastmeros vegetais e oposto ao ponto de entrada do espermatozide. As molculas que podem estar envolvidas na formao do stio vegetal de iniciao da gastrulao (o centro de Nieuwkoop) sero discutidas no Captulo 15. Movimentos celulares e a construo do arquntero
O INCIO DA GASTRULAO. A gastrulao em anfbios iniciada quando um

grupo de clulas endodrmicas marginais, na superfcie dorsal da blstula, penetra no interior do embrio. As superfcies externas (apicais) dessas clulas se contraem dramaticamente, enquanto seus terminais internos (basais) se expandem. O comprimento apical-basal dessas clulas aumenta bastante, originando a forma caracterstica de garrafa. Na salamandra, essas clulas parecem ter um papel ativo nos movimentos iniciais da gastrulao. Johannes Holtfreter (1943, 1944) observou que as clulas garrafa de gstrulas precoces de salamandra poderiam aderir s lamnulas de vidro e guiar o movimento das clulas ligadas a elas. At mais convincentes foram os experimentos

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

227

(A) Ponto de entrada do espermatozide DOADOR NORMAL RECEPTOR IRRADIADO POR UV DOADOR NORMAL

(B) RECEPTOR NORMAL Ponto de entrada do espermatozide

Ponto de entrada do espermatozide

UV Sem transplante

Transplante

Pea embrionria ventral carente de eixo corporal

Novo local de gastrulao e forma de eixo corporal

Figura 6.20

de recombinao de Holtfreter, nos quais clulas da zona marginal dorsal (que dariam origem ao lbio dorsal do blastporo) foram combinadas com o tecido endodrmico interno. Quando as clulas da zona marginal dorsal foram removidas e colocadas no prospectivo tecido endodrmico interno, as clulas precursoras do blastporo formaram clulas garrafas e se aprofundaram abaixo da superfcie do endoderma interno (Figura 6.21). Mais ainda, ao se aprofundarem, criaram uma depresso reminiscente do blastporo precoce. Sendo assim, Holtfreter sugeriu que a habilidade de invaginar com profundidade para dentro do endoderma uma propriedade inata das clulas da zona marginal dorsal.

Experimentos de transplante demonstrando que as clulas vegetativas, abaixo das regies do futuro lbio dorsal do blastporo, so responsveis pelo incio da gastrulao. (A) Salvamento de embries irradiados pelo transplante de blastmeros do segmento mais dorsal (cor) de um embrio, no estgio de 64 clulas, para uma cavidade criada pela remoo de um nmero semelhante de clulas vegetais. Um zigoto irradiado sem tal transplante no sofre gastrulao normal. (B) Formao de um novo local para gastrulao e eixo corporal pelo transplante das clulas vegetativas, mais dorsais, de um embrio de 64 clulas, para regio vegetal mais ventral, de outro embrio de 64 clulas. (Segundo Gimlich e Gerhart, 1984.)

Implante

Clulas endodrmicas

Sulco no blastporo

Figura 6.21

Um implante de clulas de anfbios da regio do lbio dorsal do blastporo submerge para dentro de uma camada de clulas endodrmicas e forma um sulco do blastporo. (Segundo Holtfreter, 1944.)

228

PARTE II Padres de Desenvolvimento

A situao no embrio da r um pouco diferente. R. E. Keller e seus orientados (Keller, 1981; Hardin e Keller, 1988) mostraram que apesar das clulas garrafa terem um papel na iniciao da involuo da zona marginal ao adquirem a forma de garrafa, elas no so essenciais para a continuao da gastrulao. A forma peculiar de garrafa dessas clulas necessria para iniciar a gastrulao; a constrio das clulas que puxa a zona marginal na direo vegetativa, enquanto empurra as clulas vegetativas para dentro (Figura 6.22 A,B). O estiramento da zona marginal permite a expanso do ectoderma em direo ao plo vegetal e o envolvimento do embrio; empurrar as clulas vegetais permite a esses precursores da mesoderme anterior contatar o lado de
(A) Endoderma Intercalao radial de clulas profundas Clulas marginais superficiais Clulasgarrafa Futuro mesoderma anterior Lbio dorsal do blastporo Blastporo Morfologia de mudanas das clulas profundas Clulas garrafa (E) Precursores do mesoderma ceflico do endoderma da faringe Clulas garrafa re-espalhadas IMZ superficial movendo-se em direo do plo animal Endoderma Intercalao medianolateral (F) Ectoderma Precursores do mesoderma ceflico do endoderma da faringe Plo animal Blastocele O lbio se extende lateral e vegetalmente (B) (C) (D) Clulas marginais profundas Clulas garrafa

Futuro mesoderma posterior

IMZ profunda

Figure 6.22

Modelo integrativo dos movimentos celulares durante a gastrulao precoce de Xenopus. (A) Estrutura da zona marginal involutiva (IMZ) antes da gastrulao. A IMZ profunda consiste do futuro mesoderma anterior e do futuro mesoderma posterior. (B) Constrio das clulas garrafa arrasta o futuro mesoderma anterior para cima e gira a IMZ para fora. (C) Os precursores do mesoderma anterior conduzem o movimento do mesoderma para dentro da blastocele. (D) Ocorre intercalao radial (interdigitao) das clulas profundas da IMZ. O mesoderma move-se na direo ao plo animal, arrastando as clulas superficiais e as clulas garrafa por involuo. (E) medida que continua a gastrulao, as clulas marginais profundas se achatam, e as clulas previamente superficiais formam a parede do arquntero. (F) Intercalao como em (D), olhando da superfcie dorsal para baixo em direo do lbio dorsal do blastporo. Na NIMZ (zona marginal no involutiva) e parte superior da IMZ, clulas profundas (mesodrmicas) esto se intercalando radialmente, configurando uma fita estreita de clulas achatadas. Esse estreitamento de vrias camadas em poucas outras causa extenso na direo lbio do blastporo. Imediatamente acima do lbio, intercalao medianolateral das clulas produz tenses que arrastam a IMZ por cima do lbio, a intercalao medianolateral continua, alongando e estreitando o mesoderma axial. (Segundo Hardin e Keller, 1988; Wilson e Keller, 1991.)

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

229

baixo dos precursores mesodrmicos posteriores e comear a migrar no teto da blastocele (Hardin e Keller, 1988). Entretanto, aps comear esses movimentos, as clulas garrafa do Xenopus no so mais necessrias. Quando as clulas garrafa so removidas aps sua formao, a involuo, a formao do blastporo e o fechamento continuam. O fator principal no movimento das clulas para dentro do embrio parece ser a involuo das clulas marginais subsuperficiais mais do que as superficiais. Parece que essas clulas subsuperficiais ou clulas da zona marginal involutiva profunda se viram para dentro e migram em direo ao plo animal, ao longo das superfcies internas das clulas profundas remanescentes (Figura 6.22C-E), e que a camada superficial forma o revestimento do arquntero unicamente porque ela est ligada s clulas profundas, que esto migrando ativamente. O movimento das clulas garrafa mais profundamente dentro do embrio depende da sua ligao s clulas profundas subjacentes. A remoo das clulas garrafa no afeta a involuo das clulas profundas ou das clulas superficiais da zona marginal para dentro do embrio, mas a remoo das clulas marginais dorsais profundas e sua substituio por clulas do hemisfrio animal (que normalmente no sofrem involuo) interrompe a formao do arquntero.
A FORMAO DO MESODERMA DURANTE A GASTRULAO DE XENOPUS

A Figura 6.22 (D-F) esboa o comportamento dessas clulas da zona marginal involutiva (IMZ) em sucessivos estgios da gastrulao em Xenopus (Keller e Schoenwolf, 1977; Keller, 1980, 1981; Hardin e Keller, 1988). Pouco antes de sua involuo atravs do lbio do blastporo, as vrias camadas de clulas IMZ profundas se intercalam radialmente para formar uma fina e larga camada. Essa intercalao estende ainda mais a IMZ vegetalmente. Ao mesmo tempo, as clulas superficiais se espalham se dividindo e achatando. Quando as clulas profundas atingem o lbio do blastporo, elas involuem para dentro do embrio e iniciam um segundo tipo de intercalao. Essa intercalao causa uma extenso convergente ao longo do eixo mediolateral (Figura 6.22F) que integra vrias correntes mesodrmicas para formar um longa e estreita banda. A parte anterior dessa banda migra em direo ao hemisfrio animal. Assim a corrente mesodrmica continua a migrar em direo ao plo animal e a camada superposta de clulas superficiais (incluindo as clulas garrafa) so passivamente puxadas em direo ao hemisfrio animal, formando o teto do arquntero (Figuras 6.15 e 6.22E). Portanto, ainda que as clulas garrafa possam ser responsveis pela indentao inicial, a fora motivadora para essa involuo parece vir da camada profunda de clulas marginais. Mais ainda, a intercalao radial e mediolateral da camada de clulas profundas parece ser responsvel pelo movimento contnuo do mesoderma para dentro do embrio. Migrao do mesoderma involutivo Com o progresso dos movimentos mesodrmicos, a expanso convergente tambm continua a estreitar e encompridar a zona marginal involutiva. A IMZ contm o prospectivo teto endodrmico do arquntero na sua camada superficial (IMZS) e as prospectivas clulas mesodrmicas, incluindo aquelas da notocorda na sua regio profunda (IMZD). Durante o tero mdio da gastrulao, a lmina em expanso do mesoderma converge em direo linha mediana do embrio. Esse processo dirigido pela contnua intercalao mediolateral de clulas ao longo do eixo ntero-posterior, estreitando ainda mais a banda. No fim da gastrulao, a notocorda localizada centralmente se separa do mesoderma somtico em ambos os lados, e as clulas sofrem elongao separadamente (Wilson e Keller, 1991). Essa extenso convergente do mesoderma parece ser autnoma, porque os movimentos dessas clulas ocorrem mesmo se essa regio do embrio isolada do resto (Keller, 1986). Durante a gastrulao, o plo animal e as clulas da zona marginal no-involutiva (NIMZ) expandem-se por epibolia cobrindo todo o embrio. A poro dorsal das clulas marginais no-involutivas expande-se mais rapidamente que a poro ventral,

230

PARTE II Padres de Desenvolvimento

assim, causando o movimento dos lbios do blastporo em direo ao lado ventral. Enquanto essas clulas mesodrmicas, entrando atravs do lbio dorsal do blastporo, do origem ao mesoderma dorsal axial, o resto do mesoderma do corpo (o qual forma o corao, os rins, sangue, ossos e partes de vrios outros rgos) entra atravs dos lbios ventral e lateral para criar o manto mesodrmico. O endoderma derivado das clulas da IMZS que formam o revestimento do teto do arquntero e das clulas vegetativas sub-blastoporais que se tornam o assoalho do arquntero (Keller, 1986).

Informaes adicionais

&

Especulaes

Reguladores moleculares do desenvolvimento: Fibronectinas e as vias da migrao mesodrmica

omo que as clulas involutivas so informadas para aonde ir, uma vez que se encontram no interior do embrio? Na salamandra, parece que os precursores mesodrmicos involutivos migram em direo ao plo animal em uma rede de fibronectina secretada pelas clulas do teto da blastocele. Pouco antes da gastrulao, o ectoderma presuntivo do teto da blastocele secreta uma matriz extracelular que contm fibrilas de fibronec-

Figura 6.23

Fibronectinas e gastrulao de anfbio. (A) Imunofluorescncia revela uma rede fibrilar de fibronectina na superfcie basal de prospectivas clulas ectodrmicas forrando o teto da blastocele do embrio da salamandra. (B-E) Micrografias ao microscpio eletrnico de varredura de gastrulao normal (B,C) e anormal (D,E) da salamandra. A blastocele em (D) e (E) foi injetada com o fragmento ligante clula de fibronectina, enquanto a blstula gastrulando normalmente foi injetada com a soluo controle. (B) Seo durante gastrulao intermediria. (C) O obturador do vitelo ao fim da gastrulao. (D,E) Os estgios finais da gastrulao detida, onde os precursores mesodrmicos, tendo fixado fibronectina sinttica, no conseguem reconhecer a via de migrao normal forrada de fibronectina. O arquntero no se forma, e os precursores noinvoludos do mesoderma permanecem na superfcie. (ar, arquntero; bc, blastocele; bl, blastporo; ec, ectoderma; en, endoderma; mes, mesoderma; yp, obturador do vitelo.) (A de Boucaut et al., 1985; B-E de Boucaut et al., 1984, cortesia de J. C. Boucaut e J.-P. Thiery.)

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

231

tina (Figura 6.23A; Boucaut et al., 1984; Nakatsuji et al., 1985). O mesoderma involutivo parece migrar nessas fibras de fibronectina. Isso foi confirmado pela sntese qumica de uma falsa fibronectina que pode competir com a genuna da matriz extracelular. Clulas se ligam a uma certa regio da protena fibronectina que contm uma seqncia de trs aminocidos (Arg-Gly-Asp; RGD). Boucaut e colaboradores injetaram grandes quantidades de um pequeno peptdio contendo essa seqncia na blastocele de embries de salamandra, pouco antes do incio da gastrulao. Se a fibronectina fosse essencial para a migrao celular, ento as clulas ligadas a esse fragmento solvel de peptdio, em lugar da fibronectina real ligante de clulas, deveriam parar. Impossibilitadas de encontrar sua estrada, as clulas mesodrmicas deveriam cessar sua involuo. Isso precisamente o que ocorreu (Figura 6.23B-E). No foram vistas clulas migratrias ao longo do lado de baixo do ectoderma. Em vez disso, os precursores mesodrmicos permaneceram fora do embrio, formando uma massa celular convoluta. Outros pequenos peptdios sintticos (incluindo outros fragmentos da molcula de fibronectina) no impediram a migrao. Considera-se que as clulas mesodrmicas aderem fibronectina atravs da v1 protena integrina (Alfandari et al., 1995). A migrao mesodrmica pode ser tambm interrompida pela microinjeo de anticorpos contra fibronectina ou contra a subunidade 1 de integrina que funciona como parte do receptor de fibronectina (DArribre et al., 1988, 1990). Alfandari e colegas (1995) mostraram que logo aps a fecundao, a subunidade v da integrina progressivamente perdida das membranas das clulas do blastmero. Entretanto, pouco antes e durante a gastrulao, a subunidade v expressa na superfcie das clulas mesodrmicas migratrias. Parece ento, que a sntese desse receptor de fibronectina pode sinalizar o tempo para o mesoderma comear e continuar a migrao. A matriz extracelular contendo fibronectina, permite a ligao das clulas mesodrmicas rede de fibronectina e, alm disso, parece fornecer sinais para a direo da migrao celular. Shi e colegas (1989) removeram os tetos da blasto-

cele de gstrulas precoces de salamandra e os depositaram em recipientes de plstico com suas matrizes extracelulares tocando o plstico (Figura 6.24A). O eixo do blastporo ao plo animal foi marcado e, aps 2 horas, o explante foi removido, deixando sua matriz extracelular. Um explante menor da zona marginal dorsal foi removido de outra gstrula precoce e colocado sobre a matriz com seu prprio eixo blastporo-plo animal, perpendicular quele da matriz. Seria possvel s clulas desse explante migrarem na matriz, e se migrassem o fariam em uma direo particular? Foi verificado que as clulas migraram, e que a migrao podia ser inibida por anticorpos que impedem que a clula

(A) Plo animal

reconhea a fibronectina. Alm disso, as clulas das DMZ no migraram ao acaso, mas migraram em direo ao plo animal da matriz extracelular que havia sido absorvida no plstico (Figura 6.24B). Em Xenopus, a extenso convergente empurra as clulas migratrias para cima, em direo ao plo animal. Entretanto, a fibronectina parece delinear os limites dentro dos quais esses movimentos podem ocorrer. A fibronectina das gstrulas de Xenopus no forma grades complexas, mas se organiza em pequenos aglomerados fibrilares. Se a fibronectina for sintetizada mas no organizada nessas fibrilas, as clulas mesodrmicas dorsais vo aderir superfcie basal do ectoderma presuntivo, mas no migraro (Winklbauer e Nagel, 1991). As fibrilas de fibronectina so necessrias para que as clulas mesodrmicas da cabea se achatem e estendam largos processos (lameliformes) na direo da migrao (Winklbauer et al., 1991; Winklbauer e Keller, 1996). A importncia dessas fibrilas de fibronectina tambm vista em hbridos interespecficos que se detm na gastrulao. Delarue e colegas (1985) mostraram que certos hbridos inviveis, entre duas espcies de sapos, morrem durante a gastrulao porque no secretam essas fibrilas de fibronectina. Parece ento, que a matriz extracelular do teto da blastocele, e particularmente seu componente fibronectina, importante na migrao das clulas mesodrmicas durante a gastrulao em anfbios.

Figura 6.24

(B)

AP

A direo da migrao das clulas da zona marginal dorsal (DMZ) depende da orientao da matriz extracelular do teto da blastocele. (A) Explantes do teto da blastocele do blastforo (BP) para o plo animal (AP) foram dissecados de embries de salamandra em estgio precoce de gastrulao e colocados em placas plsticas. A matriz extracelular aderiu placa, e o tecido foi ento removido. Um explante menor de uma gstrula precoce, contendo clulas da DMZ, foi ento colocado sobre essa matriz, com o seu prprio eixo perpendicular aquele da matriz. (B) Clulas da DMZ do explante migraram para o plo animal da matriz. A linha pontilhada indica a borda original do explante, e a flecha branca representa seu eixo blastporo-plo animal. (de Shi et al., 1989, fotografia cortesia dos autores.)

232

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Epibolia do ectoderma Enquanto a involuo est ocorrendo no lbios do blastporo, os precursores ectodrmicos esto se expandindo sobre todo o embrio. Keller (1980) e Keller e Schoenwolf (1977) usaram microscopia eletrnica de varredura para observar as modificaes tanto nas clulas superficiais como nas clulas profundas das regies animal e marginal. O mecanismo principal de epibolia na gastrulao do Xenopus parece ser um aumento no nmero de clulas (atravs de diviso), acoplado a uma concomitante integrao de vrias camadas profundas em uma s (Figura 6.25). Durante a gastrulao precoce, trs rodadas de diviso celular aumentam o nmero de camadas de clulas profundas no hemisfrio animal. Ao mesmo tempo, completa integrao de numerosas clulas profundas em uma camada tambm ocorre. A camada mais superficial se expande por diviso e achatamento celular. O espalhamento de clulas nas zonas marginais dorsal e ventral, se d provavelmente pelo mesmo mecanismo, ainda que mudanas na forma celular parecem ter um papel mais importante do que no hemisfrio animal. O resultado dessas expanses a epibolia das clulas superficiais e profundas do plo animal e regies marginais no involutivas sobre a superfcie do embrio (Keller e Danilchik, 1988). A maior parte das clulas da regio marginal, como mencionado anteriormente, involuem para se juntar corrente de clulas mesodrmicas dentro do embrio. Gastrulao no Xenopus uma orquestrao de vrios eventos distintos. A primeira indicao de gastrulao envolve a invaginao local das clulas garrafa do endoderma na zona marginal, em tempo e lugar precisamente definidos. Em seguida, a involuo das clulas marginais atravs do lbio do blastporo, comea a formao do arquntero. Essas clulas involutivas, na margem anterior do manto mesodrmico, migram ao longo da superfcie interna do teto do blastporo, e o prospectivo cordomesoderma atrs delas, se estreita e se alonga posteriormente, por extenso convergente, na poro dorsal do embrio. Ao mesmo tempo, as clulas precursoras ectodrmicas epibolizam vegetalmente por diviso celular e pela integrao de camadas celulares previamente independentes. O resultado desses movimentos celulares o posicionamento adequado das trs camadas germinativas em preparao para sua diferenciao em rgos do corpo. Estudos moleculares (a serem discutidos no Captulo 15) esto comeando a nos dar pistas relacionadas a mecanismos pelos quais as clulas so informadas de como comear e finalizar essas migraes

Estgio

Figura 6.25

Micrografias eletrnicas de varredura do teto da blastocele de Xenopus, mostrando as mudanas na forma e arranjo das clulas. Os estgios 8 e 9 so de blstula; estgios 10-11.5 representam gstrulas progressivamente mais avanadas. (de Keller, 1980, cortesias de R. E. Keller.)

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

233

Gastrulao em aves
Generalidades sobre gastrulao em aves A clivagem em embrio de aves cria um blastodisco acima de um enorme volume de vitelo. Essa massa subjacente e inerte de vitelo impe vrias restries aos movimentos celulares, e a gastrulao em aves parece, primeira vista, ser muito diferente daquela do ourio-do-mar ou da r. Realmente, logo veremos que existem numerosas similaridades entre a gastrulao em aves e as gastrulaes que j estudamos. Alm disso, veremos que embries de mamferos - que no tem vitelo- retm movimentos de gastrulao muito parecidos com aqueles dos embries de aves e rpteis.
FORMAO DO HIPOBLASTO E EPIBLASTO. As clulas centrais do blastodisco das aves so separadas do vitelo por uma cavidade subgerminativa e parecem mais claras - por isso, o centro do blastodisco chamado de rea pelcida. Em contraste, as clulas da margem da rea pelcida parecem opacas, devido a seu contato com o vitelo, formam a rea opaca (Figura 6.26). Enquanto a maioria das clulas permanece na superfcie formando o epiblasto, certas clulas migram individualmente para a cavidade subgerminativa, para formar as ilhas de polinvaginao (hipoblasto primrio), um arquiplago de aglomerados desconectados contendo cada um de 5 a 20 clulas (veja Figuras 6.26 e 5.33). Pouco tempo depois, uma lmina de clulas da margem posterior do blastoderma (crescente de Koller e a zona marginal atrs dele) migra em direo anterior para se juntar s ilhas de polinvaginao e formar o hipoblasto secundrio (Eyal-Giladi et al.,1992). O blastoderma de duas camadas (epiblasto e hipoblasto) tem as camadas unidas na margem da rea opaca, e o espao entre as camadas uma blastocele. Assim, a estrutura do blastodisco das aves no diferente da blstula de anfbios ou equinodermos.

Blastoderma Epiblasto

Anterior

Zona marginal posterior

rea opaca Espao subgerminativo Vitelo Clulas do hipoblasto delaminando-se do epiblasto rea pelcida

Figura 6.26

rea opaca

rea opaca

Epiblasto

Blastocele

Clulas do hipoblasto migrando de clulas profundas da regio posterior

Formao do blastoderma de duas camadas do embrio da galinha. As primeiras clulas hipoblsticas delaminam individualmente, para formar ilhas de clulas sob o epiblasto. Clulas da margem posterior (clulas de foice de Koller e clulas marginais posteriores) produzem uma populao de clulas que migra abaixo do blastodisco e incorpora as ilhas poli-invaginadas. Essa camada inferior tornase o hipoblasto. A camada superior o epiblasto. medida que o hipoblasto se move no sentido anterior, clulas do epiblasto se agregam na regio anterior foice de Koller para formar a linha primitiva.

234

PARTE II Padres de Desenvolvimento

O mapa de destino para o embrio de aves restrito ao epiblasto. Ou seja, o hipoblasto no contribui com clulas para o embrio em desenvolvimento (Rosenquist, 1966, 1972). Em lugar disso, as clulas do hipoblasto formam pores da membrana externa, especialmente o saco vitelnico e o pednculo, que liga a massa do vitelo ao tubo digestivo endodrmico. Todas as trs camadas germinativas do embrio propriamente dito (mais uma quantidade considervel de membrana extra-embrionria) so formadas das clulas epiblsticas. Mapas de destino de epiblasto de galinha esto representados na Figura 6.27. Esses mapas integram vrios tipos de mapeamento. Corantes vitais e transplantes de clulas radioativas foram teis no mapeamento de tendncias prioritrias, pois com esses mtodos se marcam grupos de clulas que se difundem ao prosseguir o desenvolvimento. Transplantar clulas marcadas geneticamente, tais como clulas de codorna colocadas em embries de galinha, contornou o problema de difuso, mas ainda assim marcava aglomerados relativamente grandes de clulas. Recentemente, o uso de vrus ou corantes fluorescentes permitiu aos pesquisadores acompanhar clulas individuais atravs do desenvolvimento (Schoenwolf, 1991). Como pode ser visto nessas figuras, existe uma significante extenso convergente enquanto a linha primitiva progride anteriormente. Mesmo que clulas em uma regio especfica da gstrula tendam a se transformarem em tipos especficos de clulas, elas ainda podem produzir diferentes tipos celulares se transplantadas a uma outra regio do embrio.
FORMAO DA LINHA PRIMITIVA. A estrutura majoritria caracterstica da gas-

trulao em aves, rpteis e mamferos a linha primitiva. Essa linha visvel inicialmente como um espessamento de uma camada de clulas do epiblasto, na regio posterior do embrio, imediatamente anterior ao crescente de Koller (Figura 6.27A). Esse espessamento causado pelo ingresso de clulas mesodrmicas do epiblasto para dentro da blastocele, e pela migrao de clulas da regio lateral do epiblasto posterior em direo ao centro (Figura 6.27B; Vakaet, 1984; Bellairs, 1986; Eyal-Giladi et al., 1992). medida que a rea espessada se estreita, ela se move anteriormente e se contrai para formar a linha primitiva definitiva. Essa linha se estende em 60-75% do comprimento da rea pelcida e marca o eixo ntero-posterior do embrio (Figura 6.27C-E). Enquanto as clulas convergem para formar a linha primitiva, se forma uma depresso na linha. Essa depresso chamada fenda primitiva, e serve como um blastporo, atravs do qual as clulas migratrias passam para a blastocele. Assim, a fenda primitiva anloga ao blastporo de anfbios. Na ponta anterior da linha primitiva h um espessamento regional de clulas chamado ndulo primitivo ou ndulo de Hensen. O centro desse ndulo contm uma depresso em forma de funil (algumas vezes chamada cova primitiva), atravs da qual as clulas passam para a blastocele. O ndulo de Hensen o equivalente funcional do lbio dorsal do blastporo de anfbios. [gast1.html] To logo se forma a linha primitiva, as clulas do epiblasto comeam a migrar sobre os lbios dessa e para dentro da blastocele (Figura 6.28). De maneira similar ao blastporo de anfbios, a linha primitiva tem uma populao celular se modificando constantemente. Clulas migrando atravs do ndulo de Hensen passam para dentro da blastocele, migram anteriormente formando o intestino anterior, o mesoderma da cabea e a notocorda; clulas passando atravs das pores laterais da linha primitiva do origem maioria dos tecidos endodrmicos e mesodrmicos (Schoenwolf et al., 1992). Em contraste com o mesoderma de Xenopus, o qual migra como lminas de clulas para a blastocele, clulas entrando no embrio de aves o fazem individualmente. Em lugar de formar uma lmina de clulas fortemente organizadas, a populao ingressante cria um mesnquima fracamente conectado. Alm disso, no se forma um verdadeiro arquntero na gstrula de aves. Enquanto as clulas entram na linha primitiva, essa se estende na direo da futura regio da cabea. Ao mesmo tempo, as clulas do hipoblasto secundrio esto continuando a migrar da margem posterior do blastoderma, na direo anterior. A elongao

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

235

(A)

Anterior

(B) rea opaca

(I) Ectoderma

Endoderma Mesoderma Axial Paraxial (vrtebras, rins, musculatura) Placa lateral (incluindo o corao) Extra-embrionria

rea pelcida rea de engrossamento do blastoderma rea opaca rea pelcida

Posterior (C)

(D) (J)

Linha primitiva tomando forma (E) Ndulo de Hensen rea pelcida rea opaca Anterior Processo ceflico (F) (K)

Figura 6.27

Ndulo de Hensen Sulco primitivo

(G)

Borda anterior do mesoderma

Ectoderma da dobra ceflica Dobra neural Somito Notocorda

(H)

Dobra ceflica Intestino anterior

Movimentos celulares da linha primitiva do embrio de galinha. (A-E) Viso dorsal da formao e alongamento da linha primitiva. O blastoderma visto em (A) 3-4 horas, (B) 5-6 horas, (C) 7-8 horas, (D) 10-12 horas e (E) 1516 horas. O movimento precoce das clulas epiblsticas HNK-1+ mostrado por flechas. (F-H) A formao da notocorda e somitos mesodrmicos medida que a linha primitiva regride mostrada em (F) 19-22 horas, (G) 23-24 horas e (H) no estgio de quatro somitos. (I-K) Mapas do destino do epiblasto em dois estgios da gastrulao. Extenso convergente mostrada na linha mediana, e as clulas precursoras endodrmicas ingressam mais rapidamente que as clulas precursoras mesodrmicas. (Adaptado de vrias fontes, especialmente Spratt, 1946, e Balinsky, 1975; I-K segundo Vakaet, 1985.)

Ndulo de Hensen

Placa segmental Linha primitiva

da linha primitiva parece ser coincidente com a migrao em direo anterior dessas clulas do hipoblasto secundrio.
MIGRAO ATRAVS DA LINHA PRIMITIVA: FORMAO DO ENDODERMA E MESODERMA. As primeiras clulas a migrarem atravs da linha primitiva so

aquelas destinadas a se transformarem no intestino anterior. Essa situao, novamente, similar quela vista nos anfbios. Uma vez dentro da blastocele, essas clulas migram anteriormente e finalmente deslocam as clulas do hipoblasto na poro anterior do embrio. As clulas hipoblsticas esto confinadas a uma regio na poro anterior da rea pelcida. Essa regio, o crescente germinativo, no forma estruturas

236

PARTE II Padres de Desenvolvimento

Figura 6.28

(A)

Migrao de clulas endodrmicas e mesodrmicas atravs da linha primitiva. (A) Micrografia eletrnica de varredura mostra clulas epiblsticas passando para a blastocele, estendendo seus terminais apicais para transformarem em clulas garrafa. (B) Estereograma de um embrio gastrulante de galinha, mostrando a relao da linha primitiva, das clulas migratrias e das duas camadas originais do blastoderma. A camada inferior se transforma em um mosaico de clulas hipoblsticas e endodrmicas; porm, as clulas hipoblsticas finalmente se separam para formar uma camada abaixo daquela do endoderma e contribuem para o saco vitelnico. (A de Solursh e Revel, 1978, cortesia de M. Solursh; B segundo Balinsky, 1975.)
(B) Ndulo de Hensen

Linha primitiva

Epiblasto

Blastocele Hipoblasto Endoderma Clulas migratrias (mesnquima)

embrionrias, mas contm os precursores das clulas germinativas, que mais tarde migram atravs dos vasos sangneos at as gnadas. As prximas clulas que entram na blastocele atravs do ndulo de Hensen (e o primeiro quarto anterior da linha primitiva) tambm se movem anteriormente, mas no se movem to ventralmente como as clulas presuntivas endodrmicas do intestino anterior. Essas clulas permanecem entre o endoderma e o epiblasto para formar as clulas do mesoderma da cabea e do cordomesoderma (notocorda) (veja Psychoyos e Stern, 1996). Essas clulas de ingresso precoce se moveram todas anteriormente, empurrando para cima a regio medianoanterior do hipoblasto, a fim de formar o processo ceflico (Figura 6.29). Enquanto isso, as clulas continuam a migrar para dentro, atravs da poro lateral da linha primitiva. Quando entram na blastocele, essas clulas se separam em duas correntes. Uma corrente se move mais profundamente e encontra o hipoblasto em sua regio mediana, deslocando as clulas hipoblsticas para os lados. Essas clulas de movimento profundo do origem a todos os rgos endodrmicos do embrio, assim como a maioria das membranas extra-embrionrias (o hipoblasto forma o restante). A segunda corrente migratria se espalha atravs da blastocele como uma camada frouxa, mais ou menos a meio caminho entre o hipoblasto e o epiblasto. Essa camada origina as pores mesodrmicas do embrio e das membranas extra-embrionrias. Aps 22 horas de incubao, a maior parte das clulas presuntivas endodrmicas esto no interior do embrio, apesar das clulas presuntivas mesodrmicas continuarem a migrar para o interior por um tempo mais longo.

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

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Endoderma farngeo Processo ceflico (notocorda anterior)

Ilhas de sangue

Dobra ceflica

Intestino anterior Sulco neural

Ndulo de Hensen Linha primitiva rea pelcida

Somito

Linha primitiva rea opaca (A) (B) (C)

Linha de referncia

Regr es da li s o p r i m nha itiva

Borda posterior da rea pelcida

Horas (D) (E)

Figura 6.29

Agora comea uma nova fase da gastrulao. Enquanto continua o ingresso do mesoderma, a linha primitiva comea a regredir, movendo o ndulo de Hensen de uma posio prxima do centro da rea pelcida, para uma posio mais posterior (veja Figura 6.29). Ela deixa em seu lugar o eixo dorsal do embrio e o processo ceflico. Ao mesmo tempo que o ndulo avana posteriormente, a poro remanescente (posterior) da notocorda estabelecida. Finalmente, o ndulo regride para sua posio mais posterior, formando a regio anal. Nesse ponto, o epiblasto composto inteiramente de clulas ectodrmicas presuntivas. Como uma conseqncia desse processo de gastrulao em duas etapas, os embries de aves (e mamferos) exibem um distinto gradiente de maturidade de desenvolvimento ntero-posterior. Enquanto clulas das pores posteriores do embrio esto gastrulando, clulas da poro anterior j esto comeando a formar rgos. Pelos prximos dias, a ponta anterior estar mais avanada no seu desenvolvimento (podese dizer que teve uma vantagem inicial) do que a poro posterior. Enquanto as clulas presuntivas do mesoderma e do endoderma se moviam para dentro, os precursores ectodrmicos proliferavam para se tornar a nica populao de clulas remanescente na camada superior. Ainda mais, clulas ectodrmicas migraram para fora do blastodisco para envolver o vitelo por epibolia. O enclausuramento do vitelo (novamente reminiscente da epibolia do ectoderma de anfbios) uma tarefa de Hrcules, que dura 4 dias para ser completada e envolve a produo contnua de novo

Gastrulao do embrio de galinha de aproximadamente 24 at perto de 28 horas. (A) A linha primitiva totalmente estendida (24 horas). O processo ceflico (notocorda anterior) pode ser visto estendendo-se a partir do ndulo de Hensen. (B) Estgio de dois somitos (25 horas). Anteriormente v-se o endoderma farngeo, enquanto a notocorda anterior empurra para cima o processo ceflico que estava embaixo. A linha primitiva est regredindo. (C) Estgio de quatro somitos (27 horas). (D) Aps 28 horas, a linha primitiva regrediu at a poro caudal do embrio. (E) Regresso da linha primitiva, deixando a notocorda em seu rastro. Vrios pontos da linha foram acompanhados aps atingir seu comprimento mximo. O tempo representa as horas decorridas aps atingir o comprimento mximo em aproximadamente 18 horas. (Fotografias cortesia de K. Linask; E segundo Spratt, 1947.)

Alongamento da notocorda

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PARTE II Padres de Desenvolvimento

material celular e a migrao das clulas ectodrmicas presuntivas ao longo da superfcie inferior do envoltrio vitelnico. Assim, chegando ao fim da gastrulao em aves, o ectoderma envolveu o vitelo, o endoderma substituiu o hipoblasto e o mesoderma se posicionou entre essas duas regies. Mecanismos de gastrulao em aves
O PAPEL DO HIPOBLASTO E A FORMAO DOS EIXOS EMBRIONRIOS. O eixo dorso-ventral (costa-frente) crtico para a formao do hipoblasto e para o contnuo desenvolvimento do embrio. Esse eixo estabelecido quando as clulas em clivagem do blastoderma, produzem uma barreira entre a albumina bsica (pH 9.5) acima do blastodisco e o espao subgerminativo cido (pH 6.5), abaixo do disco. gua e ons de sdio so transportados da albumina atravs das clulas para dentro do espao subgerminativo criando uma diferena de potencial de membrana de 25 mV atravs da camada de clulas (positivo no lado ventral das clulas). Isso cria dois lados para as clulas: um lado frente albumina negativa e bsica, e outro lado frente ao fluido do espao subgerminativo positivo e cido. O lado frente albumina se torna o dorsal, e aquele frente ao espao subgerminativo se torna o ventral. Isso pode ser revertido ou invertendo o gradiente de pH ou invertendo a diferena de potencial atravs da camada de clulas (reviso em Stern e Canning, 1988). A converso de um blastoderma radialmente simtrico em uma estrutura simtrica bilateral determinada pela gravidade. Enquanto o vulo rola oviduto abaixo, ele gira a uma velocidade de 10 a 15 revolues por hora. O citoplasma que dever se tornar a camada celular est sempre girando para baixo, mas deslocado para cima pelo vitelo mais denso. Portanto, no est em cima do vitelo, mas um pouco deslocado para o lado. A poro mais alta do blastodisco se transforma na ponta caudal (rabo) do blastoderma, a parte onde comea a gastrulao (Kochav e Eyal-Giladi, 1971). Assim, os eixos ntero-posterior e dorsolateral so determinados antes da gastrulao, enquanto o vulo est lentamente rolando oviduto abaixo. O blastoderma do embrio de galinha age como um sistema nico integrado para formar um nico embrio; se o blastoderma separado em partes, cada uma tendo sua zona marginal, cada parte vai formar seu prprio embrio (Spratt e Haas, 1960). O controle desse campo parece residir na zona marginal posterior, a regio onde comea a formao do hipoblasto. Essas clulas marginais posteriores no s contribuem com as clulas indutoras do hipoblasto, como tambm impedem que outras regies marginais induzam seus hipoblastos. Khaner e Eyal-Giladi (1989) verificaram que na transposio da zona marginal posterior para uma rea marginal lateral (Figura 6.30A), o rasgo posterior cicatriza e duas linhas primitivas aparecem. Similarmente, se uma regio posterior reciprocamente transposta com uma regio lateral (Figura 6.30B), somente se forma uma linha primitiva e ela provm da regio posterior original. Entretanto, se uma zona marginal posterior colocada em um embrio que retm sua margem posterior original (Figura 6.30C), somente a margem posterior original do hospedeiro forma o hipoblasto que est subjacente linha primitiva. Khaner e Eyal-Giladi sugerem que as clulas da zona marginal formam um gradiente de atividade cujo pico est na ponta posterior. As clulas posteriores formaro o hipoblasto e, ao mesmo tempo, evitaro que qualquer clula, com menos atividade, forme hipoblastos prprios.*

*Pesquisadores anteriores (Waddington, 1932; Azar e Eyal-Giladi, 1981) consideravam que o hipoblasto induzia formao da linha primitiva e a contemplava com uma polaridade nteroposterior. Entretanto, Khaner (1995) girou o epiblasto com relao ao hipoblasto, em diferentes estgios do desenvolvimento da galinha, e mostrou que o epiblasto inicia a formao da linha primitiva e mantm sua polaridade independentemente da orientao do hipoblasto.

CAPTULO 6 Gastrulao: Reorganizando as clulas embrionrias

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EXPERIMENTO (A) Anterior Zona marginal rea opaca Epiblasto

RESULTADOS

INTERPRETAO

Posterior (B)

Cicatriz

Linhas primitivas

(C)

Figura 6.30

ACUMULAO CELULAR NA LINHA PRIMITIVA. Evidncias dos estudos de Stern e Canning (1990) sugerem que o epiblasto no um tecido homogneo, nodiferenciado, como foi assumido por muito tempo. Pelo contrrio, parece haver diferenciao nas clulas epiblsticas mesmo antes que a formao da linha primitiva se inicie. Esses estudos mostram que certas clulas, dispersas ao acaso no epiblasto, podem ser distinguidas por uma molcula especfica na superfcie celular (HNK-1, uma forma sulfatada do cido glucurnico). As clulas expressando HNK-1 ingressam individualmente na blastocele e migram para a regio posterior. provvel que o tecido marginal posterior secrete uma substncia que atrai as clulas que expressam HNK-1, enquanto o tecido marginal anterior secreta uma molcula repelente (Jephcott e Stern, citado em Stern, 1991). As clulas expressando HNK-1, que se juntam na margem posterior, produziro o endoderma e o mesoderma, e nenhuma clula expressando HNK-1 formar derivados ectodrmicos. Se as clulas HNK-1 so seletivamente destrudas (por anticorpos), enquanto ainda esto no epiblasto, o embrio no formar mesoderma nem endoderma. Essas clulas HNK-1 positivas interagem com as clulas do epiblasto acima delas, para formar o rudimento inicial da linha primitiva. Esse rudimento de linha sofre um processo de extenso convergente que o estreita e alonga. Quando a linha chega ao seu comprimento quase total, as

Experimentos de Khaner e Eyal-Giladi demonstrando que a poro posterior da zona marginal (PMZ) contribui para as clulas indutoras da linha primitiva do hipoblasto e impedem outras regies marginais de criarem seus prprios hipoblastos. (Segundo Khaner e Eyal-Giladi, 1989.)

240

PARTE II Padres de Desenvolvimento

clulas HNK-1 positivas dissolvem a lmina basal do epiblasto central para formar uma canal atravs da linha primitiva. Isso permite que clulas do epiblasto (que nunca expressaram HNK-1) sejam recrutadas para a linha que est se estendendo anteriomente e, assim, contribuir (junto com as clulas HNK-1 positivas) para os mesoderma e endoderma embrionrios. Movimento dentro da blastocele amniota feito por clulas individuais, e no por uma camada epitelial. Mas, como na gastrulao de anfbios, clulas de aves passando pelo blastporo sofrem uma constrio no seu terminal apical e se tornam clulas garrafa (Figura 6.28). Na ponta anterior do canal, ndulo de Hensen, a destruio da lmina basal e a liberao dessas clulas do epiblasto pode ser realizada por uma protena de 190-kDa chamada fator de espalhamento (Stern et al., 1990). O fator de espalhamento secretado somente no ndulo de Hensen, e tem sido implicado na dissociao de clulas nessa regio e na induo do tecido neural a partir do epiblasto, na vizinhana do ndulo (Streit et al., 1995). Quando se implantam resinas contendo o fator de espalhamento abaixo do epiblasto de embries de galinha, em gastrulao precoce, novas regies da linha primitiva podem ser induzidas. O fator de espalhamento se liga a receptores tirosina quinase em clulas adjacentes, e agindo atravs da cascata da protena G, fosforila as -cateninas que ancoram as E-caderinas membrana celular (Hartmann et al., 1994). Na ausncia de E-caderina funcional, a lmina epitelial se desmonta naquela regio e as clulas se tornam mesnquima. As clulas, uma vez liberadas da linha primitiva, entram na blastocele, so achatadas e passam a fazer parte de uma corrente de clulas migratrias independentes. Polissacardeos extracelulares podem tambm ter um papel importante nessa migrao. Um desses complexos polissacardeos o cido hialurnico, um polmero linear de cido glucurnico e N-acetilglicosamina (veja Figura 3.35). Esse composto produzido pelas clulas ectodrmicas e se acumula na blastocele, onde reveste a superfcie das clulas que esto chegando. Fisher e Solursh (1977) mostraram que quando esse material digerido (injetando a enzima hialuronidase na blastocele), as clulas mesenquimatosas se aglomeram e no conseguem migrar adequadamente. Muito estudos tm mostrado que o cido hialurnico importante para manter as clulas mesenquimatosas migratrias separadas umas das outras. Alm disso, o cido hialurnico comea a se acumular precisamente no momento em que as primeiras clulas entram na blastocele. O cido hialurnico capaz de manter as clulas separadas, provavelmente devido a sua capacidade de se expandir em gua. Em ambiente aquoso, esse polmero pode expandir em at 1000 vezes o seu volume original. Portanto, o cido hialurnico pode ser um fator importante para manter as clulas mesenquimatosas dispersas durante sua migrao, assegurando que a migrao continue. cido hialurnico e outros polissacardeos facilitam a migrao de clulas individuais (veja Captulo 3), mas no parecem dirigir o movimento dessas clul