AISLAMIENTO DE BACTERIAS CIDO LCTICAS CON ACTIVIDAD SAL BILIAR HIDROLASA UTILIZANDO UN MODELO GASTROINTESTINAL IN VITRO A PARTIR DE AGUA

MIEL Luis Alberto Reyes Nava, Yadira Rivera Espinoza, Alejandro Azaola Espinosa

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas-IPN

RESUMEN

Muestras de aguamiel de tres regiones diferentes de Mxico fueron utilizadas para el aislamiento de bacterias cido lcticas (BAL) con actividad sal biliar hidrolasa a partir de un sistema que simula condiciones gastrointestinales in vitro. Para llevar a cabo el aislamiento de BAL, primero una muestra de aguamiel fue sucesivamente diluida en soluciones que contenan lisozima-pH 6.2, pepsina-pH 2.0 y oxgal-pancreatina-pH 6.8, que simulan la cavidad oral, jugos gstricos y jugos intestinales, respectivamente. Catorce cepas identificadas como bacilos gram positivos, catalasa negativos fueron aisladas a partir de todas las etapas del sistema de simulacin gastrointestinal, utilizando agar MRS con glicocolato de sodio como medio diferencial para la seleccin de bacterias con actividad sal biliar hidrolasa. Posteriormente estas cepas fueron resembradas en agar MRS y conservadas en caldo MRS con glicerol al 50% a -70C. Estas cepas adems de presentar halos de precipitacin en MRS-glicocolato de sodio (una sal biliar primaria), tambin se observaron halos de precipitacin de sales biliares en placas con agar MRS-glicodeoxicolato y MRS-taurodeoxicolato de sodio, dos sales biliares secundarias. Se ha reportado (Ahn et al., 2003) que la presencia de estos halos de precipitacin, son indicadores de la desconjugacin de la sal biliar utilizada en el medio. Esto significa que, para protegerse de la toxicidad que representan las sales biliares conjugadas para las bacterias, estas cepas podran estar produciendo la enzima sal biliar hidrolasa, lo que las hace prometedoras debido a que podran ser utilizadas para conocer su efecto en la reduccin del colesterol srico.

1. INTRODUCCIN

Las bacterias cido-lcticas (BAL) han sido utilizadas durante siglos en fermentaciones industriales y han despertado gran atencin al ser empleadas en la industria farmacutica y de alimentos. Adems, durante la ltima dcada se ha incrementado el nmero de estudios sobre el papel de que algunas cepas de BAL pudieran ser empleadas como cultivos probiticos (Topisirovic y col, 2006). As, por ejemplo para la elaboracin de algunos alimentos funcionales se han utilizado microorganismos probiticos, ya que no solo presentan el prototipo de alimento funcional, si no que, adems, son de gran importancia econmica, ya que representan alrededor del 65% del mercado mundial de tales alimentos (Holzapfel y Schillinger, 1998). Los actuales alimentos probiticos son bsicamente productos lcteos, especficamente en forma de yogurt y por su naturaleza de alimento fermentado, con presencia de microorganismos inocuos, ha facilitado su

introduccin en el mercado. Aunque esta reportado que los microorganismos probiticos tienen numerosos beneficios en la salud (Begley et al., 2005; Begley et al., 2006), la alergenidad que pueden presentar las matrices lcteas reducen la frecuencia en su consumo para ciertas personas con intolerancia a los lcteos (Betoret et al., 2003). Con base a estos inconvenientes, los investigadores se han preocupado por buscar nuevas cepas con diferentes caractersticas probiticas aisladas de diferentes matrices. En un estudio previo realizado por nuestro grupo de trabajo (Sarria, 2010) se encontr que en el pulque (producto fermentado de aguamiel) tambin existen BAL con caractersticas probiticas. El aguamiel es un lquido dulce que se obtiene de diferentes tipos de agaves (Ramrez y Gentry, 1982). Segn investigaciones de Snchez, (1978) y Escalante et al., (2004), en la savia se encuentran microorganismos autctonos tales como levaduras, bacterias etanlicas y BAL, las cuales podran estar utilizndola como sustrato, debido a su contenido considerado de sacarosa. Por lo anterior, el aguamiel puede ser una opcin no lctea como medio para el aislamiento de BAL de inters clnico y alimentario. Aunado a esto, podra agregarse tambin, la importancia de encontrar cepas con caractersticas saludables adicionales y que inclusive tengan la posibilidad de erradicar o disminuir la incidencia de ciertas enfermedades. En la literatura se presenta el caso de algunas cepas de BAL con la capacidad de algunas de reducir el colesterol srico. Este compuesto es precursor de cidos biliares y hormonas esteroides, un componente importante de la membrana celular de los organismos eucariotas superiores (Taranto et al., 2005). Sin embargo, aun cuando el colesterol es imprescindible para la vida, su exceso es un factor de riesgo en el desarrollo de la ateroesclerosis y otras enfermedades coronarias. En los ltimos aos, se ha demostrado que diversas cepas de Lactobacillus reducen el colesterol total o la lipoprotena de baja densidad (LDL, por sus siglas en ingls) en los seres humanos y animales (Grunewald, 1982). Este efecto se ha atribudo, en parte, a la desconjugacin enzimtica de las sales biliares. En diversas investigaciones la actividad sal biliar hidrolasa ha sido detectada en cepas indgenas al tracto gastrointestinal (du Toit et al., 1998) un ambiente rico en cidos biliares conjugados y no conjugados. Sin embargo, el hecho de que la actividad sal biliar hidrolasa en las bacterias se correlaciona con una alta tolerancia a las sales biliares, sigue siendo un objeto de debate (Vizoso et al., 2006).

2. METODOLOGA Materia prima. El aguamiel fue colectado de 3 regiones diferentes: Huitzilac, Morelos; Jocotitlan, Edo. de Mxico y Singilucan, Hidalgo. Para la recoleccin del aguamiel, se utilizaron tubos falcon estriles de 50 mL. Las muestras de aguamiel fueron transportadas en una hielera hasta el laboratorio para su posterior anlisis. Simulacin gastrointestinal. Se adopt un sistema que simula condiciones gastrointestinales para el aislamiento de BAL con actividad sal biliar hidrolasa, de acuerdo con el modelo desarrollado por Vizoso et al., (2006) con algunas modificaciones. Previamente, las muestras de aguamiel de las tres regiones fueron concentradas por centrifugacin a 10 000 rpm por 15 min y el pellet fue conservado en caldo MRS al 50% de glicerol a -70 C. Para la obtencin de BAL, una muestra de 1 mL del pellet fue inoculado en 20 mL de una solucin simuladora de la cavidad oral (regulador de fosfatos salino 60 mM (PBS, por sus siglas en ingls) pH 6.2 y lisozima 0.01%), con agitacin de 180 rpm a 37C por 5 min. Inmediatamente despus, se centrifug a 8000 rpm por 10 min a 4C, se recuper el pellet y se inocul en 20 mL de una solucin simuladora de jugos gstricos (0.5% NaCl, pH 2.0 y pepsina 3 g/L) con agitacin de 180 rpm a 37C por 90 min. Siguiendo la misma secuencia, el pellet recuperado se inocul en una solucin simuladora de jugos intestinales (PBS pH 6.8, oxgal 0.5% y pancreatina 1 g/L) a 180 rpm, 37C y 150 min. Se hizo cuenta viable en cada etapa de la simulacin. Aislamiento de BAL con actividad sal biliar hidrolasa. Se tomaron cajas de siembra representativas de las diluciones seriadas de cada una de las etapas de la simulacin gastrointestinal, incluyendo la inicial (sin tratamiento). Mediante la tcnica de impronta, se tom el sello de todas las colonias que crecieron en la placa con agar MRS seleccionada de cada una de

las etapas de la simulacin y se pasaron a cajas con agar MRS con glicocolato de sodio y 0.37 g/L de CaCl2 (Vinderola y Reinheimer, 2003). Las cajas se incubaron en aerobiosis a 37C por 72 h. Las colonias que presentaron un precipitado, fueron seleccionadas como cepas potenciales con actividad sal biliar hidrolasa. Posteriormente, a estas cepas se les hizo la prueba de gram y catalasa. Las cepas gram positivas-catalasa negativas, fueron probadas en condiciones de anaerobisis sobre cajas con agar MRS adicionado con 0.5% de glicocolato, glicodeoxicolato y taurodeoxicolato de sodio y 0.37 g/L de CaCl2. Las cajas se incubaron a 37C durante 72 horas en cmara de anaerobisis (Forma Scientific). Las cepas gram (+) y catalasa (-) que mostraron precipitado de sales biliares fueron propagadas y conservadas en caldo MRS-glicerol 50% a -70C.

3. RESULTADOS Y DISCUSIN Las figuras 1, 2 y 3 muestran los resultados obtenidos, en cuanto a sobrevivencia, del sistema de simulacin gastrointestinal que se utiliz para el aislamiento de las BAL provenientes del aguamiel de tres diferentes regiones.

Figura 1. Sobrevivencia (%) de los microorganismos presentes en el aguamiel de Jocotitlan en un sistema que simula condiciones gastrointestinales (I: inicial; CO: cavidad oral; JG: jugos gstricos; JI: jugos intestinales).

Figura 2. Sobrevivencia (%) de los microorganismos presentes en el aguamiel de Huitzilac en un sistema que simula condiciones gastrointestinales (I: inicial; CO: cavidad oral; JG: jugos gstricos; JI: jugos intestinales).

Figura 3. Sobrevivencia (%) de los microorganismos presentes en el aguamiel de Singilucan en un sistema que simula condiciones gastrointestinales (CO: cavidad oral; JG: jugos gstricos; JI: jugos intestinales). De acuerdo a los resultados, el aguamiel de Jocotitlan es la que presenta un nmero mayor de microorganismos que sobreviven a condiciones gastrointestinales, con una viabilidad del 10%. A este le sigue Singilucan, con una viabilidad del 3%. Mientras que, el aguamiel de Huitzilac fue la que present menor concentracin de microorganismos que sobreviven a condiciones simuladas del tracto gastrointestinal, con una viabilidad final del 0.1%. De acuerdo al anlisis estadstico (POST-HOC TUKEY, programa R), existen diferencias significativas entre las regiones de Jocotitlan y Huitzilac y, Hutizilac y Singilucan de acuerdo con la viabilidad de los microorganismos al final de toda la simulacin, con una p0.05. Mientras que, entre Jocotitlan y Singilucan no se presentaron diferencias significativas (p0.05). La sobrevivencia superior de los microorganismos del aguamiel de Jocotitlan y Singilucan, puede deberse a las diversas condiciones del aguamiel de cada regin y a los factores como el clima, el tipo de agave y, en particular a los tipos de microorganismos que en su mayora estuvieron presentes en los diferentes tipos de aguamiel. Aislamiento de BAL con actividad sal biliar hidrolasa En cada una de las etapas se seleccionaron nicamente a los bacilos gram (+), catalasa (-) que fueron capaces de crecer en MRS adicionado con glicocolato de sodio, debido a que esta es la sal biliar de mayor toxicidad para las clulas. 12 cepas (2 en la etapa inicial, 8 en cavidad oral y 2 en jugos intestinales) fueron aisladas del sistema de simulacin gstrica en el aguamiel de Huitzilac y las otras 2 (1 en la etapa inicial y otra en cavidad oral) fueron aisladas del aguamiel de Jocotitlan. Mientras que en Singilucan no se pudo aislar ninguna cepa. Esto pudo deberse a que la proporcin de BAL contenidas en el aguamiel, fue menor para la regin de Singilucan y por el contrario, el aislamiento de la mayora de las cepas en el aguamiel de Huitzilac pudo deberse a que la mayora de las especies microbianas de este aguamiel eran en su mayora BAL. Las 14 cepas aisladas mostraron actividad sobre tres tipos de sales biliares en diferente forma. Cuando se utiliz glicocolato de sodio (sal biliar primaria) en el agar MRS las cepas formaron halos finos de precipitado alrededor de las colonias. En el glicodeoxicolato (sal biliar secundaria), se observaron colonias blancas con textura reseca que formaron halos de precipitado granular en forma de puntos alrededor de las colonias. Mientras que en el taurodeoxicolato (sal biliar secundaria), se observaron colonias blancas con textura cremosa que formaron halos de precipitado granular en forma de cristales alrededor de las colonias. Esto sugiere que la expresin de la actividad sal biliar hidrolasa se da de forma distinta en cada tipo sal biliar, ya sea primaria o secundaria. La figura 4 muestra un ejemplo de desconjugacin de sales biliares por parte de las 14 cepas seleccionadas sobre agar MRS suplementado con 0.5% de glicocolato (GC), glicodeoxicolato (GDC) y taurodeoxicolato (TDC) de sodio.

(a)

(b)

(c)

Figura 4. Desconjugacin de sales biliares por las cepas aisladas de aguamiel, sobre placas con agar MRS-sales biliares. (a) GC, (b) GDC, (c) TDC.

Estas formas de las colonias sobre placas de agar MRS-sales biliares, han sido reportadas que se relacionan con la solubilidad de las sales biliares a diferente pH (Dashkevicz y Feighner, 1989). Los pKas de taurina- y glicina-conjugados de sales biliares, y de las sales biliares no conjugadas son pH 1.9, 3.9 y 5.0, respectivamente. Por lo tanto, en valores de pH alcanzados por el metabolismo cido fermentativo de las cepas, las sales biliares no conjugadas podran ser protonadas y precipitadas, mientras que los taurino-conjugados quedaran completamente ionizados en solucin (sin precipitar) y las sales biliares glicino-conjugadas quedaran parcialmente precipitadas sin hidrlisis (Dashkevicz y Feighner, 1989).

4. CONCLUSIONES

La microbiota del aguamiel de Jocotitlan resisti ms a las condiciones gastrointestinales que el aguamiel de las otras dos regiones. Mediante el modelo gastrointestinal in vitro se lograron aislar bacilos gram positivos-catalasa negativos, que fueron capaces de sobrevivir a las condiciones gastrointestinales y presentar actividad sal biliar hidrolasa aparente. Estas cepas son prometedoras, ya que se ha reportado que la actividad sal biliar hidrolasa est relacionada con la reduccin del colesterol en sangre.

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