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ESPECTROSCOPIA FTIR Aplicaciones al estudio estructural de biomolculas

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Determinacin de la estructura 2 de protenas por FTIR

Identificacin de interaccin y disposicin de los diferentes fracciones lipdicas. DMPC/DPPC/OC/LC/

H H

H H

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O C C
R

N
H H H

O C C
R

N
H H H

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Efectos de la sustitucin isotpica en las frecuencias de vibracin

Espectros de lipoprotena y tampn deuterado

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Espectros netos de lpidos y protenas

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Efectos de la deuteracin y estructura 3aria de protenas

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Estructura de protenas: Amida I

IR medio (4000-400 cm-1).

U.A.
20

U.A.
1.5

LDL

1 0 .5 -20 U.A. /Nmero de onda (cm-1) U A /N d d ( 1) -40 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 (cm-1) 1750 1700 1650 1600 1550 1500 1450 1400 1350 0

(cm-1)

Estructura de protenas: La banda amida I

Espectro IR de protenas: * Diferentes contribuciones de los grupos amida de las mismas: Amida A, B, I, II, etc. * Pueden encontrarse contribuciones de las cadenas laterales d l aminocidos. l t l de los i id * Amida I : mayor contribucin. Caractersitcas AMIDA I: Mximo de absorcin: aproximadamente 1655 cm-1 . Localizacin: 1700 y 1600 cm-1, aunque su posicin exacta est determinada por la geometra de las cadenas polipeptdicas y los enlaces de hidrgeno. Debida a la vibracin de tensin en el plano del carbonilo contenido en el grupo amida (C=O). Aunque en menor proporcin a las vibraciones de tensin C-N (C-N) , deformacin C-CN, y flexin en el plano NH. Sensible a cambios conformacionales y sufre pequeos desplazamientos (2-10 cm-1) hacia valores menores de nmero de onda cuando la protena est deuterada.

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Estructura de protenas
Estructura 2: plegamiento de cadena aminoacdica. aminoacdica. - Tipos estructura secundaria: secundaria:

Acodamientos Hlices: ; 310 Estructuras : cadena , plegada. (paralela y antiparalela) Desordenada

Estructura de protenas: La banda amida I

Alteraciones en la estructura se ponen de manifiesto estudiando el perfil de la banda y el rea bajo la curva de cada componente. - Componentes de la banda amida I: - Cada componente p aparece a un determinado. - A cada uno corresponde un tipo de estructura secundaria.

1700

1680

1660

1640

1620

1600

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Estudios de interaccin de lpidos diferentes

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Encefalopatias Espongiformes Transmisibles

Transmisibles e inoculables Periodo de incubacin largo Afectan al SNC No producen respuesta inmune Anatomia Patolgica caracterstica:
Espongiosis Astrogliosis Prdida Neuronal

ENCEFALOPATIAS ESPONGIFORMES TRANSMISIBLES EETs

Se denominan as a enfermedades neurodegenerativas de mamferos causadas por priones (proteinaceous infectious particle) S.B. Prusiner ANIMALES Encefalopata Espongiforme Bovina (EEB), escrapie o tembladera la enfermedad crnica caquetizante del ciervo y la encefalopata espongiforme transmisible del visn. AFECTAN AL HOMBRE: la nueva variante de la enfermedad de Creutzfeldt Jacob (vCJD) la enfermedad de Gerstmann-Strussler-Jakob Gerstmann-Strusslerel insomnio familiar fatal.

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Priones : Pequeas partculas infecciosas de naturaleza protenica que son resistentes a procesos de inactivacin que afectan a cidos nucleicos.
Sorpresa a la comunidad cientfica

Es una forma modificada de una protena huesped normal codificada por un exon simple de una simple copia gentica. Posiblemente involucrada en la funcin sinptica

PrPsen o PrPC (protena celular) sensible a enzimas proteolticos

Presentan la misma secuencia aminoacdica, pero diferente estructura secundaria

Posee una estructura de 4 hlices alfa (H1, H2, H3 y H4) en estas regiones se identifican tres zonas de hlice- llamadas A, B y C, y dos de hoja-, llamadas S1 y S2

por la acumulacin, principalmente en SNC, de la isoforma anormal (PrPSc; Prusiner 1991), no solubles completamente en detergentes resistente a proteasas
mayor proporcin de estructura laminar. 30%

de hlice- y un 45% de hoja-. (106-126), que en forma de pptido sinttico es un neurotxico potente

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A)Estructura de la PrPc. B) Lugar donde se cree que la protena X se liga a la PrPc. C) Lugares que se cree relacionados con la transmisin de priones entre las especies y control de unin de la protena X D) Flexibilidad de la cadena del polipptido Prp. E) Modelo para la estructura terciaria de la HuPrPSc.

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la multiplicacin exponencial de agente infeccioso

revientan cuando se supera un determinado volumen, liberando al citosol las PrPSc y protenas hidrolticas que contenan.

La isoforma patgena es captada por fagocitosis en neuronas o glia resistentes a las proteasas y se acumulan

se agregan y forman placas amiloides. transportada al lisosoma para su degradacin

en el lisosoma se produce contacto entre PrPSc y PrPc

la primera induce el plegamiento de la segunda.

Caractersticas de las enfermedades

Vacuolizacin o espongiosis, la vacuolizacin es en el espacio extracelular como resultado de la prdida de neuronas. Reaccin glial o astrogliosis crecimiento exagerado de las clulas gliales) en ausencia de cambios infamatorios. Placas amiloideas.

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Estructura
primaria secundaria terciaria

PrPc

PrPSc

identica -hlice Lmina

cuaternaria Detergentes proteinasas

monmeros solubles sensible

polmeros insoluble resistente

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Monitorizacin de clulas humanas durante la exposicin a agentes txicos medioambientales como PAHs(Tetraclorodibenzodioxina) OCs (Benzopireno).
Hoi-Ying N. Holmana, Miqin Zhangb, Regine Goth-Goldsteina, Michael C. Martinc, Marion Russella, Wayne R. McKinneyc, Mauro Ferrarib,d, and Jennie C. Hunter-Ceveraa Center for Environmental Biotechnology, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720 b Dept. of Material Sciences, University of California, Berkeley, CA 94720 c Advanced Light Source Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720 g y y y d Biomedical Engineering Center, Ohio State University, Columbus, OH 43210-1002 . Hepatocitos procedentes de cncer heptico humano (HepG2) (lnea celular). Se aplican en cultivos de monocapa, sobre matriz extracelular o sobre clulas hepticas precursoras (feeder layer) inactivadas para citoxicidad de molculas cabeza de serie.

Los PAHs y OCs son metabolizados por el citocromo P4501A1, codificado por el gen CYP1A1. El aumento de la actividad del gen en presencia de estos txicos se usa como t t i biomarcador , aumentando los niveles como consecuencia de la exposicin para unir estos compuestos a los receptores. Se cuantifican por tcnicas de PCR

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Regin I (~ 1750-1500 cm-1): vibraciones de bases+proteinas sensibles a parejas de bases y aplilamiento de bases. Region II (~ 1490-1230 cm-1) Movimientos de deformacin acoplados a tra s uniones glicosdicas Mo imientos travs niones vibraciones del azucar. Asociados con el ngulo de torsin glicosdico. Regin III (~ 1230-1000 cm-1) Vibraciones fosfato y azucar. Las posiciones de las bandas de absorcin y intensidades dependen fuertemente de interacciones base-base y la geometra helicoidal de cidos nucleicos.

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Mecanismos moleculares por los cuales se genera la placa de ateroma.

Arteriosclerosis:
Colesterol Lipoprotenas plasmticas Monocitos , plaquetas, Clulas musculares lisas del endotelio vascular

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Mecanismos moleculares por los cuales se genera la placa de ateroma.

Factores de riesgo:
Genticos Ambientales:
Dieta:
Composicin lipoprotica Concentraciones de colesterol Oxidacin lipdica Presin arterial Trombognesis

Lipoprotenas plasmticas

Quilomicrones VLDL ILDL LDL HDL

Apoprotenas monmeros d de diferentes masas molares, con secuencias aa

hidrofbicas Hidroflicas
Colesterol esterificado

Apolipoproteina B-100 Colesterol sin esterificar

fosfolpidos

Lpidos
Fosfolpidos Esteres de colesterol Acidos grasos libres Triglicridos

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CARACTERISTICAS DE LAS APOPROTENAS

Apoprotenas A-I A-II A-IV B48 B100 Masas Molares 28.000 17.400 46.500 264.000 540.000 Lipoproteina
HDL, quilomicrones HDL, quilomicrones HDL, quilomicrones
quilomicrones

Funcin
Activador LCAT Activadora de HL? Activador LCAT y LPL? Ensamblaje de quilomicrones Ensamblaje de VLDL, unin a receptor de LDL Unin a receptor de LDL y a LRP Activador de lipoproten lipasa Inhibidor de lipoproten lipasa y del receptor heptico estimulado por lipolisis Unin a receptor de LDL y del LRP

VLDL,IDL,LDL

C-I C-II C-III

6.600 8.900 8.800 8 800

Todas Todas Todas

34.150

VLDL, HDL, quilomicrones

Receptor de LDL Aclaramiento normal

LDL
Apolipoproteina B 100 B-100

Coleste rol esterific ado

fosfolpi dos Coleste rol sin esterific ar

Acmulo en el endotelio vascular Receptor scavenger de LDL

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LDL

LDLox
Monocito

Endotelio intima LDLox

Celulas espumosas Macrfago

Citokinas

Factores de crecimiento

Migracin de clulas del msculo liso

Citokinas

Msculo liso

Partculas ntegras

Partculas reconstituidas:
L id Lpidos Lpidos-protenas

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Anlisis de las partculas lipoproteicas ntegras

Identificacin de estructura de apoprotenas Influencia de distintos agentes en la estructura g
Patologas
Diabetes Hiperlipemia Ictus Oxidacin

Grasas de la Dieta Agentes hipolipemiantes

Determinacin de la composicin lipdica: cidos grasos constituyentes por CG Proporcin de fosfolpidos, steres de colesterol, triglicridos, cidos grasos libres por TLC Determinacin de la composicin proteica: Apoprotenas presentes por electroforesis

Anlisis de las partculas reconstituidas

Identificacin de interaccin y disposicin de los diferentes fracciones lipdicas. DMPC/DPPC/OC/LC/ Identificacin de interaccin y disposicin de los diferentes fracciones lipdicas y protenas. DPPC/DMPC/ Albmina, ApoB/ApoCI /Apo CII Identificacin de interaccin protenas-glucosa protenasIdentificacin de interaccin protenas-frmacos protenasLpidosLpidos-crisina Interaccin citostaticos y componentes de los cidos nucleicos

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Identificacin de estructura de apoprotenas

VLDL

LDL

Influencia de distintos agentes en la estructura de lipoprotenas Hipolipemiantes LDL FILM

16 14 12 10 8 6 4 2 0 CONTROL CONTROL MANTEQUILLA CERIVASTATINA MANTEQUILLA CERIVASTATINA

HDL FILM

Tratamiento
Acodamientos1666 cm-1 Estructuras 1640 cm-1

Tratamiento

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Influencia de la grasa de la dieta en el perfil de la banda amida I en lipoprotenas LDL , HDL y VLDL

D. Control D. pescado p D. Girasol D.Oliva

1820

1770

1720

1670

1620

1570

1794

1734

1674

1614

1554

1494

VLDL LDL

HDL
1810 1730 1650 1570 1490

Influencia de distintos agentes en la estructura de lipoprotenas plasmticas

sanos
FIGURA 1

Diabetes

diabticos
FIGURA 2

AB BSORBANCE

A ABSORBANCE

HDL

1750

1700

1650

1600

1750

1700

1650

1600

CM -1

CM -1

FIGURA 8

FIGURA 9

ABSORBANCE

VLDL

ABSORBANCE

1750

1700

1650

1600

1750

1700

1650

1600

CM -1

CM -1

FIGURA 5

FIGURA 6

ABSORBANCE

LDL
1750 1700 1650 1600

ABSORBANCE

1750

1700

1650

1600

CM -1

CM -1

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Influencia de distintos agentes en la estructura de lipoprtotenas plasmticas El proceso de oxidacin de lipoprotenas se ha monitorizado por tcnicas : uv-visible determinando la absorcin a 234 nm

Electroforesis, movilidad electrofortica en geles de agarosa , g g

TBARS determinacin de sustancias reactivas al cido tiobarbitrico

Influencia de distintos agentes en la estructura de lipoprtotenas plasmticas Oxidacin

Influencia de la concentracin de la vitamina E en la oxidacin de LDL

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LDL libre de EDTA LDL+2M Cu+2 LDL+1g/ml glucosa LDL+2 g/ml glucosa

0 min

250 min

550min 48 h

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Estructura de lpidos: Transiciones de fase gel-cristal lquido

U.A.
20

.25 .2

.6

-20 U.A. /Nmero de onda (cm-1) -40 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

.15 .1 .05 0 1750 1700 1650 1600 0 2980 2920 2860 .3

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CH2(s)
2854,5 2854 2853,5 2853 2852,5 2852 2851,5 2851 2850,5 2850 25 35 T (C) 45 55

CH2(s) DPPC* CH2(s)80:20 Binaria CH2(s)66:33 bin CH2(s)50:50 bin

frecuenc cia

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