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Preparación de colorantes

  • 1. Acido-Alcohol: (decolorante para tinción Ziehl-Neelsen)

o

Ácido clorhídrico concentrado ..........................................................

3

ml

o

Etanol 95% ....................................................................................

97

ml

  • 2. Azul de metileno: Colorante de contraste para tinción de flagelos.

o

Azul de metileno

1

g

o

Agua destilada

100

ml

 
  • 3. Azul de metileno de Loeffler: Tinciones simples.

 

o

Solución de hidróxido potásico al 1%

1

ml

 

o

Azul de metileno, sol. saturada en etanol al 95%

30

ml

o

Agua destilada

100

ml

4.

Colorante para esporas:

 

o

Solución acuosa saturada de verde malaquita

 
  • 5. Colorante para flagelos de Leifson:

 
 

o

Solución A

 

Fucsina básica .........................................................................

1,2

g

Etanol 95%

100

ml

 
 

o

Solución B Ácido tánico

3

g

 

Agua destilada

100

ml

 

o

Solución C

 

Cloruro sódico

1,5

g

Agua destilada

100

ml

Para preparar la solución de uso, se mezclan cantidades iguales de las soluciones A, B y C y se guarda en frasco cerrado herméticamente en la nevera donde es estable durante varias semanas.

  • 6. Cristal violeta: Para tinción Gram y tinción simple.

o

Cristal violeta (violeta de genciana)

0,5

g

o

Agua destilada

100

ml

  • 7. Eosina: Para observación de células sanguíneas. Eosina

o

0,3

g

o

0,025

ml

o

Agua destilada

100

ml

  • 8. Fucsina diluida: Para tinción Gram y tinción simple.

 

o

Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen

10

ml

o

Agua destilada

100

ml

  • 9. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Para tinción ácido-alcohol resistente.

o

Fucsina básica

1

g

o

Etanol 95%

10

ml

 

o

100

ml

10. Hematoxilina: Para observación de células sanguíneas. Hematoxilina .........................................................................................

o

o

2

g

Agua destilada

1

l

11. Lactofenol: Para preparaciones microscópicas en fresco de mohos.

 

o

Ácido láctico

100

ml

 

o

Fenol

100

g

o

Glicerol

200

ml

 

o

Agua

100

ml

  • 12. Lactofenol al Azul Algodón: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos.

o

Solución de azul algodón

 

Sol. saturada de azul algodón (azul anilina soluble)

10

ml

Glicerol

10

ml

Agua Mezclar esta solución con lactofenol a partes iguales

80

ml

  • 13. Lugol: Solución de yodo para tinción Gram. Yodo

o

1

g

o

2

g

o

Agua destilada

300

ml

 
  • 14. Orceína A: Tinción de cromosomas. Orceína ................................................................................................

o

o

o

2

g

Ácido acético Ácido clorhídrico 1 mol/l

45,8

ml

8,3

ml

o

Agua

45,8

ml

  • 15. Orceína B: Tinción de cromosomas. Orceína

o

2

g

o

Ácido acético

55

ml

 

o

Agua

55

ml

  • 16. Safranina: Colorante de contraste para tinción Gram (preferible a la fucsina) y esporas.

 

o

Safranina

0,25

g

 

o

Agua destilada

100

m

 
  • 17. Sudán III: Tinción específica de grasas.

 

o

Alcohol etílico

100

ml

 

o

Sudán III

hasta

saturación

 
  • 18. Verde de metilo acético: Igual composición que la eosina (num. 7)

Prueba de la Catalasa

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus.

Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).

Bacillus (+) de Clostridium (-).

Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas:

1.

Método del portaobjetos (recomendado):

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24

horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H 2 O 2 al 30% sobre el

microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.

Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

2.

Método del tubo de ensayo:

Agregar 1ml de H 2 O 2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en

slant densamente inoculado. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo.

Prueba del Citrato

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Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros:

Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella

paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.

Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de

Fenilalanina Desaminasa

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Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies del género Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos géneros de otras enterobacterias

Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant con abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se añade 0,2ml de una solución de cloruro férrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparición de un color característico verde oscuro o verde- azulado.

Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvicoFoto de los resultados de esta prueba Prueba del Indol Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa. Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes: " id="pdf-obj-4-12" src="pdf-obj-4-12.jpg">

Prueba del Indol

Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvicoFoto de los resultados de esta prueba Prueba del Indol Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa. Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes: " id="pdf-obj-4-16" src="pdf-obj-4-16.jpg">

Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa.

Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes:

Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)

........

150ml

p-dimetilamino-benzaldehído 10g .......................................................... HCl (concentrado) 50ml .........................................................................

Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega lentamente a esta mezcla el ácido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las más convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de Klebsiella (indol-).

Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas del reactivo de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba será considerada positiva. Si esto ocurre después de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porción de unos 2ml que se retira de él asépticamente.

∑ Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico) ........ 150ml ∑ p-dimetilamino-benzaldehído 10g .......................................................... ∑Foto de los resultados de esta prueba " id="pdf-obj-5-25" src="pdf-obj-5-25.jpg">

Prueba de la Lactosa

Prueba de la Lactosa Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general yFoto de los resultados de esta prueba Manitol-Movilidad-Nitratos " id="pdf-obj-6-4" src="pdf-obj-6-4.jpg">

Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a que los coliformes se utilizan como organismos indicadores de contaminación fecal en análisis, sobre todo, de aguas. En bacteriología se define el grupo de organismos coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la

lactosa con formación de gas a 35ºC en 48 horas". No se trata de un grupo taxonómico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayoría de ellas de origen intestinal.

Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentación de la lactosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que este medio, además de selectivo frente a bacterias no entéricas, es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro).

En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento debido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y sólo crecerán las enterobacterias, pero entre ellas las que fermenten la lactosa (coliformes) liberarán productos ácidos que producirán un cambio de pH que se detectará gracias al rojo neutro. Las colonias lactosa (+) aparecerán de color rojo o violeta contrastando con la coloración amarillenta de las colonias lactosa (-).

Prueba de la Lactosa Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general yFoto de los resultados de esta prueba Manitol-Movilidad-Nitratos " id="pdf-obj-6-20" src="pdf-obj-6-20.jpg">

Manitol-Movilidad-Nitratos

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Se incluyen en este apartado 3 pruebas bioquímicas debido a que se pueden realizar cultivando el microorganismo en un único medio, el Manitol Movilidad, que se prepara en tubo con agar recto y se siembra en picadura, incubándose a 37ºC durante 24 horas. También existe la posibilidad de hacer las pruebas en otros medios y por separado.

Prueba del Manitol

Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las

enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae.

Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para

diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).

Prueba de la Movilidad

Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos móviles.

El medio manitol movilidad permite la realización de esta prueba gracias a ser semisólido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, las bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del medio debido a la distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmóviles permanecerán en la misma línea de la picadura en que se sembraron.

Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el género Klebsiella (-) de las restantes que suelen ser movilidad (+).

Dentro del género Bacillus, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especies generalmente (+).

Prueba de la reducción de nitratos

Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos después de su incubación se añaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc purísimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretación final.

Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre sí determinadas bacterias de los géneros

Haemophylus y Neisseria.

Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre sí determinadasFoto de los resultados de manitol-movilidad Foto de los resultados de nitratos " id="pdf-obj-8-11" src="pdf-obj-8-11.jpg">
Prueba de la Oxidasa Bú s queda Google Esta prueba sirve para determinar la presencia de( ver prueba de la catalasa ) que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica. " id="pdf-obj-9-2" src="pdf-obj-9-2.jpg">

Prueba de la Oxidasa

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Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asímismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno (ver prueba de la catalasa) que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.

La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para

Identificar todas las especies de Neisseria (+)

Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.

El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.

Realización de la prueba:

1.

Método en placa directa

Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No

inundar toda la placa y no invertirla. Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.

2.

Método indirecto sobre papel

Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una

placa de Petri. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.

Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.

La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.

Rojo de Metilo/Voges-Proskauer

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Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetrías y permiten la diferenciación dentro de las enterobacterias del grupo coli y aerógenes. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en dos fases: primero la metabolizarán aerobiamente (respiración oxibióntica) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizándola por vía anaerobia (fermentación). Ésta puede ser de dos tipos:

Fermentación ácido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y

los productos finales son ácidos orgánicos (ácidos fórmico, acético, láctico y succínico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4. Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter (antiguo aerógenes). Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario que podrá ser detectada añadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges- Proskauer) que reaccionarán con este compuesto produciendo un color rojo característico.

Para la realización de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30ºC durante un periodo de 3 días como mínimo y 5 como máximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que servirán para cada uno de los ensayos.

Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) de

solución indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la coloración. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo. Foto de los resultados de esta prueba Voges-Proskauer: A la otra porción de cultivo se le añade:

o

0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol

5% en etílico absoluto). El medio adquiere un aspecto lechoso.

o

0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%).

Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente.

Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado- violáceo, más o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloración alguna.

Prueba de la Ureasa Bú s queda Google Determina la capacidad de un organismo de desdoblarFoto de los resultados de esta prueba " id="pdf-obj-12-2" src="pdf-obj-12-2.jpg">

Prueba de la Ureasa

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Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado.

Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se complementa después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta será degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.

Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubación ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después de la inoculación y sus resultados deben ser leídos en las primeras 2-6

horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen

actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubación.

PRUEBA RESULTADO POSITIVO Catalasa Aparición de burbujas de O <a href=Citrato Fenilalanina desaminasa Indol Lactosa Manitol Movilidad Nitratos Medio de color azul Aparición de color verde oscuro Aparición de un anillo rojo Colonias de color violeta Aparición de color amarillo Difusión a partir de la línea del inóculo Cambio de color ( rojo oscuro ) Oxidasa Aparición de color azul Rojo de Metilo Ureasa Aparición de color rojo Aparición de color rojo Voges-Proskauer Aparición de color rojo /03/2009 Prova de Kligler Iron Agar ou de Triple Sugar Iron Agar TSI " id="pdf-obj-13-2" src="pdf-obj-13-2.jpg">

PRUEBA

RESULTADO POSITIVO

Catalasa

Aparición de burbujas de O 2

Medio de color azul Aparición de color verde oscuro Aparición de un anillo rojo Colonias de color violeta Aparición de color amarillo Difusión a partir de la línea del inóculo Cambio de color (rojo oscuro)

Oxidasa

Aparición de color azul

Aparición de color rojo Aparición de color rojo

Voges-Proskauer

Aparición de color rojo

/03/2009

Esta prova é, geralmente, usada para diferenciar os diferentes géneros das Enterobacteriaceae e para distinguir esta

Esta prova é, geralmente, usada para diferenciar os diferentes géneros das Enterobacteriaceae e para distinguir esta família de outros bacilos Gram negativo de origem intestinal. Esta diferenciação é feita atendendo às diferenças na fermentação dos hidratos de carbono presentes no meio e à produção de sulfureto de hidrogénio (H2S). Tanto o meio agar TSI (triple sugar iron) como o agar Kligler Iron contêm glicose em pequena concentração (0,1%), lactose em concentração superior (1%), o indicador de pH, vermelho de fenol, para detectar a produção de ácidos resultantes da fermentação dos hidratos de carbono, tiossulfato de sódio, substrato para a produção de H2S, e sulfato de ferro para a detecção desse produto final. A diferença entre estes dois meios diferenciais é que o TSI possui mais um açúcar, a sacarose, em concentração igual à da lactose (1%). Ambos os meios são inoculados por picada, no cilindro e por estria, na rampa. É essencial que as culturas sejam observadas após 18 a 24 h de incubação para evitar que os hidratos de carbono sejam completamente utilizados e que ocorra degradação das peptonas, formando produtos finais alcalinos. É na rampa que se faz a leitura da lactose e da sacarose, no fundo do cilindro a da glicose e no meio do cilindro a de H2S. Após incubação podem ser determinadas as actividades fermentativas, a produção de gás e a produção de H2S, podendo ocorrer vários resultados: Cilindro ácido (amarelo) e rampa alcalina (vermelha): Só a glicose foi fermentada. Os microrganismos degradam, preferencialmente, a glicose em primeiro lugar, mas como este substrato está presente em concentração mínima, a quantidade de ácido produzida é limitada e é rapidamente oxidada na superfície da rampa. Por outro lado, as peptonas do meio são também usadas na produção de substâncias alcalinas. No cilindro, a reação ácida é mantida devido à tensão reduzida do oxigênio e ao crescimento mais lento dos microrganismos. O indicador, vermelho de fenol, muda para amarelo devido à persistência da formação de ácido no cilindro. Cilindro ácido (amarelo) e rampa ácida (amarela): Ocorreu a fermentação da lactose e/ou da sacarose, para além da glicose. Como as duas primeiras substâncias estão presentes em altas concentrações são substratos para a atividade fermentativa contínua com manutenção da reação ácida (cor amarela) em todo o meio (rampa e cilindro). Produção de gás: Nota-se pela ocorrência de fraturas no meio de cultura. Produção de H2S: Ocorre enegrecimento, principalmente na zona intermédia do cilindro. Isto deve-se ao fato do microrganismo em estudo ser capaz de produzir sulfureto de hidrogênio (H2S), que se conjuga com um composto de ferro existente no meio, dando origem a sulfureto de ferro que, sendo

insolúvel, precipita. Cilindro alcalino (vermelho) e rampa alcalina (vermelha) ou inalterada (tijolo): Não ocorreu fermentação dos hidratos de carbono presentes no meio, nem produção de gás ou de H2S. As peptonas do meio podem ser catabolizadas sob condições anaeróbias e/ou aeróbias, resultando num pH alcalino devido à produção de amônia. Se só ocorrer degradação aeróbia das peptonas, a reação alcalina só é evidenciada na superfície da rampa. Se houver degradação aeróbia e anaeróbia das peptonas, a reação alcalina é visível em todo o meio. Postado por Horikini às 1/03/2009 05:46:00 PM Marcadores: Bioquimica, Enterobacteriaceae, H2S, Kligler Iron Agar, Lactose, Prova, Teste, Tripli Sugar Iron, Triplice de acuçar e ferro, TSA

insolúvel, precipita. Cilindro alcalino (vermelho) e rampa alcalina (vermelha) ou inalterada (tijolo): Não ocorreu fermentação dos1/03/2009 05:46:00 PM Marcadores: Bioquimica , Enterobacteriaceae , H2S , Kligler Iron Agar , Lactose , Prova , Teste , Tripli Sugar Iron , Triplice de acuçar e ferro , TSA /03/2009 Prova do sulfureto de hidrogênio (H2S) Permite determinar a capacidade dos microrganismos para produzirem sulfureto de hidrogênio (H2S) a partir de substratos como aminoácidos sulfurados ou compostos sulfurados inorgânicos. Muitas proteínas são ricas em aminoácidos sulfurados, como a cisteína. Quando estas proteínas estão presentes no meio de cultura podem ser degradadas pelas enzimas microbianas a aminoácidos que são utilizados como nutrientes. O aminoácido cisteína, na presença da enzima cisteína desulfurase, perde o seu átomo de enxofre que por sua vez é reduzido pela adição de hidrogênio da água para formar H2S. O H2S é então produzido pela hidrogenação (redução) do enxofre orgânico presente no aminoácido cisteína. Por outro lado, o H2S pode ser produzido pela redução de compostos sulfurados inorgânicos, como os tiossulfatos (S2O32-), os sulfatos (SO42-) e os sulfitos (SO32-). Quando o meio contém tiossulfato de sódio alguns microrganismos têm capacidade para o reduzir a sulfitos usando a enzima tiossulfato redutase, com libertação de H2S. Os átomos " id="pdf-obj-15-26" src="pdf-obj-15-26.jpg">

/03/2009

insolúvel, precipita. Cilindro alcalino (vermelho) e rampa alcalina (vermelha) ou inalterada (tijolo): Não ocorreu fermentação dos1/03/2009 05:46:00 PM Marcadores: Bioquimica , Enterobacteriaceae , H2S , Kligler Iron Agar , Lactose , Prova , Teste , Tripli Sugar Iron , Triplice de acuçar e ferro , TSA /03/2009 Prova do sulfureto de hidrogênio (H2S) Permite determinar a capacidade dos microrganismos para produzirem sulfureto de hidrogênio (H2S) a partir de substratos como aminoácidos sulfurados ou compostos sulfurados inorgânicos. Muitas proteínas são ricas em aminoácidos sulfurados, como a cisteína. Quando estas proteínas estão presentes no meio de cultura podem ser degradadas pelas enzimas microbianas a aminoácidos que são utilizados como nutrientes. O aminoácido cisteína, na presença da enzima cisteína desulfurase, perde o seu átomo de enxofre que por sua vez é reduzido pela adição de hidrogênio da água para formar H2S. O H2S é então produzido pela hidrogenação (redução) do enxofre orgânico presente no aminoácido cisteína. Por outro lado, o H2S pode ser produzido pela redução de compostos sulfurados inorgânicos, como os tiossulfatos (S2O32-), os sulfatos (SO42-) e os sulfitos (SO32-). Quando o meio contém tiossulfato de sódio alguns microrganismos têm capacidade para o reduzir a sulfitos usando a enzima tiossulfato redutase, com libertação de H2S. Os átomos " id="pdf-obj-15-32" src="pdf-obj-15-32.jpg">

Permite determinar a capacidade dos microrganismos para produzirem sulfureto de hidrogênio (H2S) a partir de substratos como aminoácidos sulfurados ou compostos sulfurados inorgânicos. Muitas proteínas são ricas em aminoácidos sulfurados, como a cisteína. Quando estas proteínas estão presentes no meio de cultura podem ser degradadas pelas enzimas microbianas a aminoácidos que são utilizados como nutrientes. O aminoácido cisteína, na presença da enzima cisteína desulfurase, perde o seu átomo de enxofre que por sua vez é reduzido pela adição de hidrogênio da água para formar H2S. O H2S é então produzido pela hidrogenação (redução) do enxofre orgânico presente no aminoácido cisteína. Por outro lado, o H2S pode ser produzido pela redução de compostos sulfurados inorgânicos, como os tiossulfatos (S2O32-), os sulfatos (SO42-) e os sulfitos (SO32-). Quando o meio contém tiossulfato de sódio alguns microrganismos têm capacidade para o reduzir a sulfitos usando a enzima tiossulfato redutase, com libertação de H2S. Os átomos

de enxofre atuam como aceitadores de hidrogênio durante a oxidação dos compostos inorgânicos. O meio de cultura agar SIM contém peptonas (a cisteína é um dos componentes) e tiossulfato de sódio como substratos sulfurados, e sulfato ferroso amoniacal (Fe (NH4)2 SO4) que atua como indicador da presença de H2S. Como o H2S é incolor, e por conseguinte não é visível, o sulfato ferroso amoniacal serve como indicador, pois o ferro combina-se com o H2S formando sulfureto de ferro que é um precipitado negro insolúvel. A presença deste composto ocorre ao longo da linha de inoculação e indica que houve produção de sulfureto de hidrogênio (reação positiva). A ausência do precipitado negro evidencia uma reação negativa. O meio de SIM é um meio semi-sólido que também pode ser usado para detectar a presença ou ausência de mobilidade nas bactérias e a produção de indol. Postado por Horikini às 1/03/2009 06:42:00 PM Marcadores: Bacteriana, bacterias, Bioquimismo, H2S, Hidrogênio, Prova, Sulfureto, Teste

de enxofre atuam como aceitadores de hidrogênio durante a oxidação dos compostos inorgânicos. O meio de1/03/2009 06:42:00 PM Marcadores: Bacteriana , bacterias , Bioquimismo , H2S , Hidrogênio , Prova , Sulfureto , Teste 1/03/2009 Prova da Coagulase As coagulases são enzimas com capacidade para coagular o plasma sanguíneo através de um mecanismo similar ao da coagulação normal. A atividade da coagulase é utilizada para distinguir espécies patogenicas de Staphylococcus de espécies não patogenicas, sendo um bom indicador da patogenicidade do S.aureus . A prova da coagulase em tubo consiste em juntar num tubo de ensaio contendo plasma (obtido de sangue a que se juntou um anticoagulante, por exemplo oxalato, citrato, heparina) uma suspensão de microrganismos (caldo de cultura) ou colônias provenientes de um meio sólido e incubar a 37º C. A formação de coágulos às 2 h, às 6 h ou às 24 h de incubação é interpretada como uma prova positiva. A ausência de coagulação após 24 horas de incubação é uma prova negativa. " id="pdf-obj-16-22" src="pdf-obj-16-22.jpg">

1/03/2009

de enxofre atuam como aceitadores de hidrogênio durante a oxidação dos compostos inorgânicos. O meio de1/03/2009 06:42:00 PM Marcadores: Bacteriana , bacterias , Bioquimismo , H2S , Hidrogênio , Prova , Sulfureto , Teste 1/03/2009 Prova da Coagulase As coagulases são enzimas com capacidade para coagular o plasma sanguíneo através de um mecanismo similar ao da coagulação normal. A atividade da coagulase é utilizada para distinguir espécies patogenicas de Staphylococcus de espécies não patogenicas, sendo um bom indicador da patogenicidade do S.aureus . A prova da coagulase em tubo consiste em juntar num tubo de ensaio contendo plasma (obtido de sangue a que se juntou um anticoagulante, por exemplo oxalato, citrato, heparina) uma suspensão de microrganismos (caldo de cultura) ou colônias provenientes de um meio sólido e incubar a 37º C. A formação de coágulos às 2 h, às 6 h ou às 24 h de incubação é interpretada como uma prova positiva. A ausência de coagulação após 24 horas de incubação é uma prova negativa. " id="pdf-obj-16-28" src="pdf-obj-16-28.jpg">

As coagulases são enzimas com capacidade para coagular o plasma sanguíneo através de um mecanismo similar ao da coagulação normal.

A atividade da coagulase é utilizada para distinguir espécies patogenicas de Staphylococcus de espécies não patogenicas, sendo um bom indicador da patogenicidade do

S.aureus.

A prova da coagulase em tubo consiste em juntar num tubo de ensaio contendo plasma (obtido de sangue a que se juntou um anticoagulante, por exemplo oxalato, citrato, heparina) uma suspensão de microrganismos (caldo de cultura) ou colônias provenientes de um meio sólido e incubar a 37º C. A formação de coágulos às 2 h, às 6 h ou às 24 h de incubação é interpretada como uma prova positiva. A ausência de coagulação após 24 horas de incubação é uma prova negativa.

Esta prova pode ser realizada de um modo mais rápido (prova em lâmina) colocando-se duas porções de bactérias da espécie em estudo nos extremos de uma lâmina, fazendo-se de seguida uma pequena suspensão, sendo depois adicionado a uma delas uma gota de água destilada (controle) e a outra uma gota de plasma. Homogeneiza-se bem e observa-se, no fim de uns minutos. Se o aspecto é idêntico a prova é negativa ou se ocorreu formação de pequenos agregados resultantes do fato das bactérias ficarem aprisionadas na rede de fibrina então formada a prova é positiva. Procedimento

Em um tubo contendo 0,3 mL de plasma de coelho adicione o mesmo volume da

cultura líquida do microrganismo.

Incube a 37 o C por cerca de 2 horas.

Interpretação

O teste de coagulase tem a finalidade de demonstrar se o microrganismo produz a

enzima capaz de coagular o plasma. Postado por Horikini às 1/03/2009 01:02:00 PM Marcadores: Coagulase, Prova, Staphylococcus, Teste

Esta prova pode ser realizada de um modo mais rápido (prova em lâmina) colocando-se duas porções1/03/2009 01:02:00 PM Marcadores: Coagulase , Prova , Staphylococcus , Teste 1/03/2009 Prova da utilização do citrato " id="pdf-obj-17-43" src="pdf-obj-17-43.jpg">

1/03/2009

Esta prova pode ser realizada de um modo mais rápido (prova em lâmina) colocando-se duas porções1/03/2009 01:02:00 PM Marcadores: Coagulase , Prova , Staphylococcus , Teste 1/03/2009 Prova da utilização do citrato " id="pdf-obj-17-49" src="pdf-obj-17-49.jpg">

Permite diferenciar microrganismos atendendo à sua capacidade para usar o citrato como única fonte de carbono.A prova é feita no meio de citrato ou meio de Simmons. Na ausência de glicose ou lactose fermentáveis, alguns microrganismos são capazes de usar o citrato como única fonte de carbono para produzir energia. Esta capacidade depende da presença de citrato permease que facilita o transporte do citrato para o microrganismo. Uma vez dentro da célula o citrato é degradado pela enzima citrase, produzindo ácido oxalacético e acetato. Estes produtos são depois convertidos enzimaticamente em ácido pirúvico e CO2. O meio de Simmons contém citrato de sódio como única fonte de carbono, NH4+ como fonte de azoto e o indicador de pH, azul de bromotimol. Esta prova é feita em tubos em rampa, uma vez que o O2 é necessário para a utilização do citrato. Quando o microrganismo remove o citrato do meio e o oxida, ocorre libertação de CO2. Durante esta reação o meio torna-se alcalino, pois o CO2 gerado combina-se com sódio (fornecido pelo citrato de sódio) e água para formar carbonato de sódio, que é um produto alcalino. A presença de carbonato de sódio faz aumentar o pH e virar o indicador de pH do meio de verde para azul forte. Após incubação, as culturas citrato positivo são identificadas pela presença de crescimento, na superfície da rampa, acompanhado de coloração azul no meio de cultura. Nas culturas citrato negativas a cor do meio mantém-se verde e não apresentam crescimento no meio de cultura. Postado por Horikini às 1/03/2009 06:34:00 PM Marcadores: bacterias, Bioquimismo, Citrato, Prova, Teste

Permite diferenciar microrganismos atendendo à sua capacidade para usar o citrato como única fonte de carbono.A1/03/2009 06:34:00 PM Marcadores: bacterias , Bioquimismo , Citrato , Prova , Teste 1/03/2009 Prova de Voges-Proskauer - VP " id="pdf-obj-18-16" src="pdf-obj-18-16.jpg">

1/03/2009

Permite diferenciar microrganismos atendendo à sua capacidade para usar o citrato como única fonte de carbono.A1/03/2009 06:34:00 PM Marcadores: bacterias , Bioquimismo , Citrato , Prova , Teste 1/03/2009 Prova de Voges-Proskauer - VP " id="pdf-obj-18-22" src="pdf-obj-18-22.jpg">

O objetivo é determinar a capacidade dos microrganismos produzirem produtos finais não ácidos ou neutros, como o acetilmetilcarbinol, a partir dos ácidos orgânicos que resultam da metabolização da glicose. Prova feita no meio MR - VP (Methyl Red, Voges - Proskauer). A adição do reagente de Barritt’s (solução 40% KOH e solução de - naftol em etanol absoluto) permite detectar a presença de acetilmetilcarbinol (acetoína) que é percursor da síntese de 2,3 butanediol, pois ocorre a formação de um complexo rosa/vermelho que dá essa cor ao meio de cultura. O desenvolvimento de uma cor rosa/vermelha na cultura, 15 minutos após a adição do reagente de Barritt’s representa uma prova positiva. A ausência dessa cor é uma prova negativa. Este tipo de fermentação da glicose é característico do E.aerogenes. Postado por Horikini às 1/03/2009 06:26:00 PM Marcadores: Prova, Teste, Voges - Proskauer

O objetivo é determinar a capacidade dos microrganismos produzirem produtos finais não ácidos ou neutros, como1/03/2009 06:26:00 PM Marcadores: Prova , Teste , Voges - Proskauer Prova Vermelho de Metila - MR Tem como objectivo determinar a capacidade dos microrganismos para oxidar a glicose com produção e manutenção de concentrações altas de produtos finais ácidos. Fazer a prova no meio MR - VP (Methyl Red, Voges-Proskauer). A glicose é o mais importante substrato oxidado por todos os microrganismos intestinais para a produção de energia. No entanto, os produtos finais deste processo variam, dependendo do equipamento enzimático presente na bactéria. Apesar de todos os microrganismos intestinais fermentarem a glicose com produção inicial de ácidos orgânicos, há uns (ex. Escherichia coli) que mantêm um pH de 4 até ao fim da incubação, enquanto outros (ex. Enterobacter aerogenes) durante o último período de incubação convertem esses ácidos a produtos finais não ácidos como o etanol e a acetoína, resultando assim num pH mais elevado (pH 6) no final da incubação. Nesta prova o indicador de pH, vermelho de metila, detecta a presença de grandes concentrações de produtos finais ácidos, pois tem um ponto de viragem baixo. A pH 4, o vermelho de metila vira para vermelho, o que indica uma reação positiva. Quando o pH é 6, " id="pdf-obj-19-16" src="pdf-obj-19-16.jpg">
O objetivo é determinar a capacidade dos microrganismos produzirem produtos finais não ácidos ou neutros, como1/03/2009 06:26:00 PM Marcadores: Prova , Teste , Voges - Proskauer Prova Vermelho de Metila - MR Tem como objectivo determinar a capacidade dos microrganismos para oxidar a glicose com produção e manutenção de concentrações altas de produtos finais ácidos. Fazer a prova no meio MR - VP (Methyl Red, Voges-Proskauer). A glicose é o mais importante substrato oxidado por todos os microrganismos intestinais para a produção de energia. No entanto, os produtos finais deste processo variam, dependendo do equipamento enzimático presente na bactéria. Apesar de todos os microrganismos intestinais fermentarem a glicose com produção inicial de ácidos orgânicos, há uns (ex. Escherichia coli) que mantêm um pH de 4 até ao fim da incubação, enquanto outros (ex. Enterobacter aerogenes) durante o último período de incubação convertem esses ácidos a produtos finais não ácidos como o etanol e a acetoína, resultando assim num pH mais elevado (pH 6) no final da incubação. Nesta prova o indicador de pH, vermelho de metila, detecta a presença de grandes concentrações de produtos finais ácidos, pois tem um ponto de viragem baixo. A pH 4, o vermelho de metila vira para vermelho, o que indica uma reação positiva. Quando o pH é 6, " id="pdf-obj-19-20" src="pdf-obj-19-20.jpg">

Tem como objectivo determinar a capacidade dos microrganismos para oxidar a glicose com produção e manutenção de concentrações altas de produtos finais ácidos. Fazer a prova no meio MR - VP (Methyl Red, Voges-Proskauer). A glicose é o mais importante substrato oxidado por todos os microrganismos intestinais para a produção de energia. No entanto, os produtos finais deste processo variam, dependendo do equipamento enzimático presente na bactéria. Apesar de todos os microrganismos intestinais fermentarem a glicose com produção inicial de ácidos orgânicos, há uns (ex. Escherichia coli) que mantêm um pH de 4 até ao fim da incubação, enquanto outros (ex. Enterobacter aerogenes) durante o último período de incubação convertem esses ácidos a produtos finais não ácidos como o etanol e a acetoína, resultando assim num pH mais elevado (pH 6) no final da incubação. Nesta prova o indicador de pH, vermelho de metila, detecta a presença de grandes concentrações de produtos finais ácidos, pois tem um ponto de viragem baixo. A pH 4, o vermelho de metila vira para vermelho, o que indica uma reação positiva. Quando o pH é 6,

apesar de ainda ser ácido, como há menos ions de hidrogénio, o indicador muda para amarelo e é uma prova negativa. Postado por Horikini às 1/03/2009 06:17:00 PM Marcadores: Bacteriana, Bioquimismo, Enterobacteriaceae, Methyl Red, MR-VP, Teste, Vermelho de Metila, Voges - Proskauer

apesar de ainda ser ácido, como há menos ions de hidrogénio, o indicador muda para amarelo1/03/2009 06:17:00 PM Marcadores: Bacteriana , Bioquimismo , Enterobacteriaceae , Methyl Red , MR-VP , Teste , Vermelho de Metila , Voges - Proskauer 1/03/2009 Prova do Indol O objetivo é determinar a capacidade do microrganismo degradar o aminoácido triptofano (presente em quase todas as proteínas) até indol. O triptofano é um aminoácido essencial que pode sofrer oxidação pelas atividades enzimáticas de algumas bactérias. A conversão do triptofano em produtos metabólicos é mediada pela enzima triptofanase. Como a capacidade de hidrolisar o triptofano com produção de indol (não é utilizado e acumula-se no meio) não é uma característica de todos os microrganismos serve como marcador bioquímico. Há microrganismos que não metabolizam o triptofano ou então fazem metabolização completa desse aminoácido sem produzir indol. Utiliza-se um meio de cultura que contenha o aminoácido triptofano por ex.: água peptonada. Após o crescimento pesquisa-se a presença de indol adicionando o reagente de Kovac’s (cor amarelo) ao longo das paredes do tubo, de modo que não se misture com o meio de cultura. Este reagente reage com o indol produzindo um composto rosado. As culturas que produzem um anel avermelhado na superfície do meio após adição do reagente são indol positivo. A persistência da coloração amarela do reagente demonstra que o substrato triptofano não foi hidrolisado a indol e indica uma reação negativa. " id="pdf-obj-20-22" src="pdf-obj-20-22.jpg">

1/03/2009

apesar de ainda ser ácido, como há menos ions de hidrogénio, o indicador muda para amarelo1/03/2009 06:17:00 PM Marcadores: Bacteriana , Bioquimismo , Enterobacteriaceae , Methyl Red , MR-VP , Teste , Vermelho de Metila , Voges - Proskauer 1/03/2009 Prova do Indol O objetivo é determinar a capacidade do microrganismo degradar o aminoácido triptofano (presente em quase todas as proteínas) até indol. O triptofano é um aminoácido essencial que pode sofrer oxidação pelas atividades enzimáticas de algumas bactérias. A conversão do triptofano em produtos metabólicos é mediada pela enzima triptofanase. Como a capacidade de hidrolisar o triptofano com produção de indol (não é utilizado e acumula-se no meio) não é uma característica de todos os microrganismos serve como marcador bioquímico. Há microrganismos que não metabolizam o triptofano ou então fazem metabolização completa desse aminoácido sem produzir indol. Utiliza-se um meio de cultura que contenha o aminoácido triptofano por ex.: água peptonada. Após o crescimento pesquisa-se a presença de indol adicionando o reagente de Kovac’s (cor amarelo) ao longo das paredes do tubo, de modo que não se misture com o meio de cultura. Este reagente reage com o indol produzindo um composto rosado. As culturas que produzem um anel avermelhado na superfície do meio após adição do reagente são indol positivo. A persistência da coloração amarela do reagente demonstra que o substrato triptofano não foi hidrolisado a indol e indica uma reação negativa. " id="pdf-obj-20-28" src="pdf-obj-20-28.jpg">

O objetivo é determinar a capacidade do microrganismo degradar o aminoácido triptofano (presente em quase todas as proteínas) até indol. O triptofano é um aminoácido essencial que pode sofrer oxidação pelas atividades enzimáticas de algumas bactérias. A conversão do triptofano em produtos metabólicos é mediada pela enzima triptofanase. Como a capacidade de hidrolisar o triptofano com produção de indol (não é utilizado e acumula-se no meio) não é uma característica de todos os microrganismos serve como marcador bioquímico. Há microrganismos que não metabolizam o triptofano ou então fazem metabolização completa desse aminoácido sem produzir indol. Utiliza-se um meio de cultura que contenha o aminoácido triptofano por ex.: água peptonada. Após o crescimento pesquisa-se a presença de indol adicionando o reagente de Kovac’s (cor amarelo) ao longo das paredes do tubo, de modo que não se misture com o meio de cultura. Este reagente reage com o indol produzindo um composto rosado. As culturas que produzem um anel avermelhado na superfície do meio após adição do reagente são indol positivo. A persistência da coloração amarela do reagente demonstra que o substrato triptofano não foi hidrolisado a indol e indica uma reação negativa.

Postado por Horikini às <a href=1/03/2009 06:08:00 PM Marcadores: Bacteriana , Bioquimica , Bioquimismo , Indol , Prova 1/03/2009 Hidrólise de Gelatinase O objetivo desta prova é determinar a capacidade do microrganismo excretar uma enzima hidrolítica extracelular capaz de degradar a gelatina (gelatinase). A gelatina é uma proteína produzida pela hidrólise do colagénio que abaixo dos 25º C mantém as suas propriedades de gel e é sólida, enquanto acima dos 25º C é líquida. Determinados microrganismos têm capacidade para produzir a gelatinase, que atua hidrolisando a gelatina em aminoácidos. Se a degradação ocorre não se consegue restaurar as características de gel da gelatina, mesmo a baixas temperaturas (fica líquido). A hidrólise da gelatina é uma característica importante na diferenciação dos microrganismos e pode também ser usada para determinar a sua patogenicidade. A liquefacção da gelatina pode ser determinada inoculando-se por picada um meio de cultura nutritivo, em tubo, suplementado com 12% de gelatina. Após incubação a 37º C durante 24 a 48 h, as culturas são colocadas no frigorífico a 4º C durante 30 minutos ou em banho de gelo durante 3 a 5 minutos. Se a gelatina foi hidrolisada pela gelatinase, o meio mantém-se líquido após refrigeração (reação positiva). Se o microrganismo não possui gelatinase, o meio resolidifica durante o período em que está no frigorífico (reação negativa). " id="pdf-obj-21-2" src="pdf-obj-21-2.jpg">

Postado por Horikini às 1/03/2009 06:08:00 PM Marcadores: Bacteriana, Bioquimica, Bioquimismo, Indol, Prova

1/03/2009

Postado por Horikini às <a href=1/03/2009 06:08:00 PM Marcadores: Bacteriana , Bioquimica , Bioquimismo , Indol , Prova 1/03/2009 Hidrólise de Gelatinase O objetivo desta prova é determinar a capacidade do microrganismo excretar uma enzima hidrolítica extracelular capaz de degradar a gelatina (gelatinase). A gelatina é uma proteína produzida pela hidrólise do colagénio que abaixo dos 25º C mantém as suas propriedades de gel e é sólida, enquanto acima dos 25º C é líquida. Determinados microrganismos têm capacidade para produzir a gelatinase, que atua hidrolisando a gelatina em aminoácidos. Se a degradação ocorre não se consegue restaurar as características de gel da gelatina, mesmo a baixas temperaturas (fica líquido). A hidrólise da gelatina é uma característica importante na diferenciação dos microrganismos e pode também ser usada para determinar a sua patogenicidade. A liquefacção da gelatina pode ser determinada inoculando-se por picada um meio de cultura nutritivo, em tubo, suplementado com 12% de gelatina. Após incubação a 37º C durante 24 a 48 h, as culturas são colocadas no frigorífico a 4º C durante 30 minutos ou em banho de gelo durante 3 a 5 minutos. Se a gelatina foi hidrolisada pela gelatinase, o meio mantém-se líquido após refrigeração (reação positiva). Se o microrganismo não possui gelatinase, o meio resolidifica durante o período em que está no frigorífico (reação negativa). " id="pdf-obj-21-21" src="pdf-obj-21-21.jpg">

O objetivo desta prova é determinar a capacidade do microrganismo excretar uma enzima hidrolítica extracelular capaz de degradar a gelatina (gelatinase).

A gelatina é uma proteína produzida pela hidrólise do colagénio que abaixo dos 25º C mantém as suas propriedades de gel e é sólida, enquanto acima dos 25º C é líquida.

Determinados microrganismos têm capacidade para produzir a gelatinase, que atua hidrolisando a gelatina em aminoácidos. Se a degradação ocorre não se consegue restaurar as características de gel da gelatina, mesmo a baixas temperaturas (fica líquido).

A hidrólise da gelatina é uma característica importante na diferenciação dos microrganismos e pode também ser usada para determinar a sua patogenicidade.

A liquefacção da gelatina pode ser determinada inoculando-se por picada um meio de cultura nutritivo, em tubo, suplementado com 12% de gelatina. Após incubação a 37º C durante 24 a 48 h, as culturas são colocadas no frigorífico a 4º C durante 30 minutos ou em banho de gelo durante 3 a 5 minutos. Se a gelatina foi hidrolisada pela gelatinase, o meio mantém-se líquido após refrigeração (reação positiva). Se o microrganismo não possui gelatinase, o meio resolidifica durante o período em que está no frigorífico (reação negativa).

Foto: (A) negativo, (B) e (C) Positivo. Postado por Horikini às 1/03/2009 05:56:00 PM Marcadores: bacterias, Bioquimica, Bioquimismo, Gelatina, Gelatinase, Hidrólise, Prova

Foto: (A) negativo, (B) e (C) Positivo. Postado por Horikini às <a href=1/03/2009 05:56:00 PM Marcadores: bacterias , Bioquimica , Bioquimismo , Gelatina , Gelatinase , Hidrólise , Prova Observación microscópica de hongos OBJETIVOS 1. Realizar preparaciones en fresco y en cinta adhesiva de distintas especies de mohos. 2. Observar la morfología de los hongos y distinguir entre hifas septadas y no septadas y entre distintos tipos de esporas y las estructuras que las originan MATERIAL ∑ Microscopio ∑ Trozo enmohecido de fruta o pan o ∑ Portaobjetos y cubreobjetos (22x22 un cultivo de hongos mm) muy limpios y desengrasados con alcohol ∑ Solución de lactofenol al azul algodón ∑ Aguja enmangada o lanceta ∑ Cinta adhesiva transparente PREPARACIÓN EN FRESCO DE MOHOS TÉCNICA 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa. Realizar la misma operación en otro portaobjetos que se usará para lavar la muestra. 2. Tomar el material a observar en una mínima cantidad con agujas finas o lancetas procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno de los portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el exceso de conidios que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver lo que realmente interesa, los conidióforos. 3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que será ya el definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas tapizadas en su interior por los conidióforos), se aplastarán éstos ligeramente sobre la gota o se seccionarán con un bisturí. 4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quede amontonado. " id="pdf-obj-22-20" src="pdf-obj-22-20.jpg">

Observación microscópica de hongos

OBJETIVOS

  • 1. Realizar preparaciones en fresco y en cinta adhesiva de distintas especies de mohos.

  • 2. Observar la morfología de los hongos y distinguir entre hifas septadas y no septadas y entre distintos tipos de esporas y las estructuras que las originan

MATERIAL

Microscopio

Trozo enmohecido de fruta o pan o

Portaobjetos y cubreobjetos (22x22

un cultivo de hongos

mm) muy limpios y desengrasados con alcohol

Solución de lactofenol al azul algodón

Aguja enmangada o lanceta

Cinta adhesiva transparente

PREPARACIÓN EN FRESCO DE MOHOS

TÉCNICA

  • 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa. Realizar la misma operación en otro portaobjetos que se usará para lavar la muestra.

  • 2. Tomar el material a observar en una mínima cantidad con agujas finas o lancetas procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno de los portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el exceso de conidios que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver lo que realmente interesa, los conidióforos.

  • 3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que será ya el definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas tapizadas en su interior por los conidióforos), se aplastarán éstos ligeramente sobre la gota o se seccionarán con un bisturí.

5.

Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que se formen burbujas entre los dos vidrios.

PREPARACIÓN EN CINTA ADHESIVA

TÉCNICA

  • 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa.

  • 2. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2cm.

  • 3. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la fruta o el pan enmohecidos o el borde de una colonia de hongo de un cultivo. En la zona central de una colonia puede haber una excesiva concentración de esporas.

  • 4. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos.

  • 5. Eliminar el colorante sobrante con un papel de filtro.

RESULTADOS

Moho del tomate:

Aspergillus: x150

Penicillum: x600

Aspergillus

5. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que sex600 x1500 ∑ Aspergillus : x150 x600 ( foto a / foto b ) ∑ Penicillum : x600 x1500 Aspergillus Penicillum : " id="pdf-obj-23-64" src="pdf-obj-23-64.jpg">

Penicillum:

Tinción de esporas ∑ Microscopio ∑ Pinzas ∑ Portaobjetos ∑ Frasco lavador ∑ Cubreobjetos ∑ MecheroFoto de los resultados " id="pdf-obj-24-2" src="pdf-obj-24-2.jpg">

Tinción de esporas

Microscopio

Pinzas

Portaobjetos

Frasco lavador

Cubreobjetos

Mechero de alcohol

Asa de siembra

Papel de filtro

Cubeta de tinción

Verde Malaquita

Cultivo bacteriano

Safranina

REALIZACIÓN

  • 1. Preparar los frotis bacterianos indicados.

  • 2. Teñir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de

la llama del mechero para que el colorante humee, pero sin que hierva, durante 5 min. Añadir más colorante si la muestra se seca.

  • 3. Lavar con agua el resto de colorante.

    • 4. Teñir con safranina 1 min.

  • 5. Lavar con agua el resto de colorante.

    • 6. Secar la preparación.

  • 7. Observar la preparación al microscopio.

Tinción de esporas ∑ Microscopio ∑ Pinzas ∑ Portaobjetos ∑ Frasco lavador ∑ Cubreobjetos ∑ MecheroFoto de los resultados " id="pdf-obj-24-97" src="pdf-obj-24-97.jpg">

Tinción ácido-alcohol resistente

Microscopio

Frasco lavador

Portaobjetos

Mechero de alcohol

Cubreobjetos

Papel de filtro

Asa de siembra

azul de metileno

Cubeta de tinción

fucsina-fenol

Cultivo bacteriano

 

mezcla de ácido y alcohol

Pinzas

REALIZACIÓN

  • 1. Prepara un frotis bacteriano.

  • 2. Cubrir la preparación con carbofucsina.

  • 3. Calentar la preparación en un mechero Bunsen durante 5 min. No debe hervir. Si se evapora, se añade más carbofuxina para que no se seque en ningún momento.

  • 4. Lavar con agua el resto de colorante.

  • 5. Decolorar con la mezcla ácido-alcohol.

  • 6. Lavar con agua para que no prosiga la decoloración.

  • 7. Teñir con azul de metileno 1 min.

  • 8. Lavar con agua el resto de colorante.

  • 9. Secar la preparación.

10. Examinar al microscopio.

Tinción ácido-alcohol resistente ∑ Microscopio ∑ Frasco lavador ∑ Portaobjetos ∑ Mechero de alcohol ∑ Cubreobjetos

Gemación de levaduras

MATERIAL

Microscopio

Agua azucarada

Portaobjetos

Aguja enmangada

Cubreobjetos

 

Lactofenol-safranina

Levadura

TÉCNICA

  • 1. Disolver con ayuda de una aguja enmangada un poco de levadura sobre un porta que contenga 2 o 3 gotas de agua ligeramente azucarada.

  • 2. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio.

  • 3. Repetir los pasos anteriores mezclando sobre el portaobjetos la suspensión acuosa de la levadura con una gota de lactofenol-safranina. Con este procedimiento se consigue una doble finalidad:

o

Ver mejor las células de las levaduras, teñidas por la safranina.

o

Retrasar un poco el desprendimiento de las células hijas gracias a la acción desfavorable del fenol para la vida normal de las levaduras.

RESULTADOS

Las siguientes fotos han sido obtenidas a partir de preparaciones teñidas con azul de metileno y no con lactofenol-safranina.

Tinción Gram
Tinción Gram
Tinción Gram

Tinción Gram

Microscopio

Frasco lavador

Portaobjetos

Mechero de alcohol

Cubreobjetos

Papel de filtro

Asa de siembra

Cristal violeta

Cubeta de tinción

Lugol

Cultivo bacteriano

Alcohol-acetona

Pinzas

Safranina

REALIZACIÓN

  • 1. Preparar los frotis bacterianos.

  • 2. Teñir con cristal violeta 1min.

  • 3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

  • 4. Cubrir con Lugol 1min.

  • 5. Lavar con agua el exceso de Lugol.

  • 6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación deje de perder color (30seg)

  • 7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.

  • 8. Teñir con safranina 1min.

  • 9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.

    • 10. Secar la preparación.

    • 11. Examinar al microscopio fijándose sobre todo en el color de cada preparación.

Los tiempos de exposición a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la batería de colorantes para realizar la tinción Gram presentan algunas diferencias respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos. En un laboratorio de Microbiología, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrón de los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar así los tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan mientras duren esos colorantes son fiables. Otra posibilidad es adquirir el equipo completo de colorantes ya preparados, pero es mucho más caro.

FOTOS DE LOS RESULTADOS