INTRODUCCIN

La criopreservacin de semen es una tcnica accesoria para la inseminacin artificial y la fertilizacin in vitro y ha jugado un papel bastante importante en los ltimos aos en el mejoramiento reproductivo en diferentes especies de animales. Con estas tcnicas, se ha logrado realizar mejoramiento gentico de hatos, prevenir y controlar enfermedades, hacer un control reproductivo del hato, mejor aprovechamiento de los sementales y obtener un mejor rendimiento econmico. Un gran nmero de factores afectan la calidad del semen, entre ellos, procedimientos de evaluacin del semen, evaluacin de la morfologa

espermtica, reacciones bioqumicas, empacado y transporte, control de enfermedades, tcnicas de inseminacin, y las interacciones entre el diluyente con factores como temperatura y tiempo de almacenamiento del semen, entre otros. El presente trabajo se enfoca a las diferentes formas de conservacin del semen porcino refrigeracin y congelacin.

BIOTECNOLIGIA DEL SEMEN PORCINO

Tendiendo a la masificacin de la produccin de carne porcina se aplican tcnicas biotecnologas para lograr obtener reproductores de alto valor gentico que por consiguiente darn mayor produccin de carne de mejor calidad. Una de esas tcnicas es la inseminacin artificial (IA) que fue creada para el mejoramiento gentico acelerado de los animales. En porcinos se comenz a practicar en la ex Unin Sovitica en la dcada del treinta. Las primeras experiencias fueron practicadas por Milovanov en 1932 y a partir de la dcada del 60 y 70 se incrementa de manera notable el uso prctico y comercial de la IA en toda Europa, paralelamente se desarrollan los nuevos y especficos diluyentes, as como tambin las adecuadas tcnicas para la extraccin, procesamiento y manejo del semen (1).

El incremento en el uso de la IA se debe a diferentes factores como el hecho de que contribuye al mejoramiento gentico por medio del uso de sementales de calidad comprobada, y que los parmetros reproductivos obtenidos son comparables e incluso superiores a aquellos utilizando monta natural. La IA tambin reduce las posibilidades de introduccin de enfermedades a las explotaciones, a diferencia de la introduccin de animales. Algunas otras ventajas de su uso incluyen una disminucin del nmero de sementales necesarios en granja, facilita el manejo reproductivo al reducir el tiempo, y el trabajo necesarios, as como un mejor control de la calidad del semen (2).

El aumento en el uso de IA ha contribuido a un incremento en la utilizacin de semen comercial, lo cual a su vez ha favorecido el desarrollo de centros de produccin de semen o centros de transferencia gentica (CTGs). Dichos centros tienen la ventaja de que pueden estar aislados de brotes de enfermedades,

pueden establecer laboratorios de excelente calidad para el procesamiento del semen, el personal empleado puede tener un entrenamiento mucho ms especializado que la gente en granja, y se tiene una produccin ms eficiente. Sin embargo para que estos centros tengan un xito completo, el adecuado manejo, preservacin y transporte del semen son de vital importancia (2).

CONSERVACIN DE LA CALIDAD SEMEN

La inseminacin artificial en ganado porcino ha demostrado ser una tcnica con buenos resultados reproductivos y una herramienta exitosa para el logro de rpidos progresos gentico con capacidad de disminuir los costos de produccin y facilitar el manejo. A raz de esto surge la inquietud de estandarizar una tcnica que permita la conservacin del material seminal por largos perodos de tiempo sin sufrir daos en su estructura y sin perder la capacidad fecundante, lo que permitira el transporte de dosis seminales sin mayores complicaciones alrededor del mundo con el fin de mejorar cada da ms la calidad gentica del rebao porcino (3).

Historia de la criopreservacin de semen porcino

La criopreservacion de semen se inicia de forma experimental con previsin de utilizarla en inseminacin artificial (IA) en el ao 1949. En esta fecha Polge y colaboradores, descubrieron el efecto positivo del glicerol como crioprotector aadido a los medios de congelacin. El vacuno fue la especie donde se consiguieron mejores resultados, la resistencia al fro de sus espermatozoides permiti obtener partos en vacas inseminadas artificialmente con semen descongelado (IAC), en el resto de las especies no se tuvo esta expansin, y los modelos de congelacin eran copiados de los utilizados en vacuno (4).

En porcinos los espermatozoides son especialmente sensibles al fro, cuando se someten a temperaturas por debajo de 15C, se inician daos en membrana plasmtica y acrosmica que determinan alteraciones posteriores de la clula; con temperaturas de congelacin los daos son mayores y adems de las membranas se deteriora el citoesqueleto, se daan el ADN, incrementa la oxidacin celular y se producen prdidas de enzimas; todas estas alteraciones provocan daos irreversibles en la viabilidad y funcionalidad de la clula espermtica. En las primeras congelaciones realizadas en porcino en las dcadas 50 y 60, la calidad seminal post-descongelacin era muy mala, y no se consiguieron partos en cerdas inseminadas(4).

En 1970 otra vez Polge y colaboradores, obtuvieron la primera camada de lechones depositando semen descongelado en oviducto previa intervencin quirrgica. Un ao despus tres equipos distintos consiguen fertilidad en cerdas con IAC. En Espaa, Vicente Sarmiento de la Estacin Pecuaria de Murcia, present en 1972 en el Congreso Mundial de de IA y Reproduccin Animal de Munich, el primer trabajo con resultados de fertilidad utilizando semen de verraco congelado en pajuelas. En 1975 se publican dos metodologas de congelacin de semen de verraco que han sido la base de las utilizadas hasta el da de hoy: en EEUU Pursel y Johnson, que congelan en pldoras, y en Alemania Westendorf., en pajuelas de 5 ml. Aunque se mejor notablemente la calidad del semen postdescongelacin, los resultados conseguidos en fertilidad y tamao de camada se alejaban a los obtenidos en monta natural, por lo que no logr expandirse de forma rutinaria como haba hecho en vacuno (5).

En la dcada de los 80 se consiguen mejoras importantes en el manejo de la IA con dosis refrigeradas a 15C (IAR). Las claves de su xito respecto a la utilizacin de IAC, han sido fundamentalmente que los resultados reproductivos igualaban a los de monta natural, se disearon sistemas sencillos de produccin y aplicacin de dosis que permitan acercar su uso a tcnicos y ganaderos. La gran desventaja de la IAR respecto a la IAC es la limitacin de la conservacin de las dosis, mientras que en la primera se pueden mantener de 2 a 8 das, en la segunda la conservacin puede ser permanente; este inconveniente los centros de inseminacin lo salvaron con una produccin y reparto de dosis refrigeradas muy agilizado(5).

Es difcil calcular el grado de expansin que tiene la IAC por no utilizarse de forma contina en el tiempo. El uso de dosis seminales congeladas est limitado a algn programa de seleccin, transporte de dosis en largas distancias, conservacin de poblaciones de inters por su escaso nmero y a las pruebas que realizan los grupos de investigacin. Porque es importante? Ventajas y desventajas. La criopreservacin, fue un gran avance en la biotecnologa reproductiva de los animales, ya que facilitaba el acceso a semen de alto valor gentico, sin tener que obtener el verraco o comprar la monta natural de este, disminuyendo las barreras de las distancias y del tiempo de vida del semen porcino, hoy en da, este mtodo es mas alcanzable para los porcicultores, aunque sigue teniendo sus desventajas; algunas ventajas de la criopreservacin del semen: Conservacin prcticamente indefinida en el tiempo. Eliminacin de riesgos sanitarios. Racionalizacin econmica del eyaculado. Recogida del semen slo en pocas reproductivas favorables.

Permite el comercio internacional de dosis. Reduccin de costos de produccin de las dosis seminales. Mejor aprovechamiento de los verracos lite. Reduccin del retraso gentico entre generaciones de un programa o esquema de seleccin. Al acceder un mayor numero de porcicultores a una gentica superior, y por lo tanto, obtener mejores precios por su producto en el mercado, puede contribuir a establecer una relacin mas estrecha entre el productor y los centros de inseminacin.

Mayor uniformidad de los animales producidos.

Entre las limitaciones presentadas para la utilizacin de esta tecnologa podemos mencionar: Mayor costo de los catteres y sondas de inseminacin. Adaptacin e los productores a una nueva tcnica mas sofisticada. Capacitacin de personal para el manejo de semen congelado. Existen varios mtodos de congelacin sin que se haya estandarizado ninguno. El nmero de dosis por eyaculado es menor y las dosis de semen congelado. resultan 3 4 veces ms caras que las de semen refrigerado. Solo un 20 30% de los verracos dan semen congelable. Entre los que responden bien, las fertilidades mximas no alcanzan los valores del semen refrigerado: la fertilidad al parto es al menos un 10 20% menor, con 1 2 lechones nacidos vivos menos. El semen congelado depende mucho de una buena deteccin de celo y del momento de la inseminacin artificial para igualar su fertilidad a la de semen refrigerado.

Protocolos y diluyentes utilizados en semen porcino.

La Criopreservacin Espermtica, cuyo mtodo consiste en la preservacin del semen en un estado viable a temperaturas extremadamente bajas, es decir, es un proceso mediante el cual se logra la preservacin material gentico contenido en los espermatozoides en el tiempo sin que sufran cambios en la integridad de su estructura, minimizando el dao que podra producir la formacin de hielo intracelular para lo cual se deshidratan las clulas antes del enfriamiento y se exponen a crioprotectores, cuya utilidad radica en la congelacin de semen para rentabilizar los reproductores de gran valor gentico y crear bancos de semen con dosis suficientes para abastecer las explotaciones en situaciones de prohibicin de movimiento de animales y semen (3).

El

proceso

de

congelacin/descongelacin

provoca lesiones en cualquier tipo de clula, pero los espermatozoides son especialmente sensibles a las bajas temperaturas, sufriendo el proceso que se denomina choque por fro. Las particularidades que presenta el

espermatozoide porcino hace que sea muy sensible al choque por fro, ya que produce una alteracin de funcionalidad de la membrana espermtica y la viabilidad celular se ve comprometida. Estas alteraciones del

espermatozoide suponen que la vida media del mismo se ve acortada, es decir, se reduce el tiempo en el cual el espermatozoide puede ser frtil. De tal manera que al usarse en inseminacin artificial se obtenan resultados inferiores a los obtenidos con semen refrigerado como el clsico trabajo de Johnson et al. de

1985. En l, se conclua que la fertilidad del semen congelado era sensiblemente menor a la obtenida con semen refrigerado y que podra estimarse en una reduccin media del 20% en la tasa de partos (5). Echegaray (2003), afirma que para congelar semen de verraco es absolutamente necesario realizar una seleccin previa de los animales que se van a utilizar

1. Seleccin de los verracos por buena calidad seminal (motilidad superior al 80%, calidad de movimiento 4, 80% acrosomas normales).

2. Seleccin de los verracos por buena congelabilidad. Slo el 20-30% de los verracos pueden ser donantes de semen para congelacin con resultados satisfactorios, considerndose como un mnimo exigible, que las dosis descongeladas de los mismos presenten, al menos un 35% de motilidad individual.

La reduccin en el rendimiento reproductivo ha sido el gran limitante de esta tcnica. Sin embargo, en los ltimos aos se ha realizado un gran esfuerzo para mejorar la fertilidad del semen congelado en inseminacin artificial obtenindose resultados a nivel comercial muy prometedores que suponen tasas de partos por encima del 70% y para algunos machos por encima del 80%. Por tanto, hoy en da con estos resultados sera conveniente evaluar si es rentable comercialmente el uso del semen congelado para determinadas aplicaciones, como el uso para las razas en pureza.

En el ao 1975, en Estados Unidos (Pursel y Johnson, 1975) y en Alemania (Westerndorf et al., 1975) se desarrollan dos mtodos de congelacin que pueden ser aplicados a nivel comercial y que en esencia son los que se continan utilizando hoy en da.

Ambos mtodos utilizan diluyentes que estn basados en la

utilizacin de la

yema de huevo y glicerol como agentes crioprotectores, una concentracin elevada de azcares y la adicin de un agente detergente.

Mtodo alemn: Utiliza un medio que consta de lactosa (11%) y yema de huevo (20%) y envasa las muestras seminales en pajuelas de 5 ml. Este mtodo es el que ha perdurado con ciertas modificaciones como el uso de pajuelas de menor volumen (0.5 ml), para mejorar el ratio de superficie/volumen de los envases y garantizar as una congelacin ms homognea o ajustes en las condiciones de adicin del glicerol. Adems, trabajos recientes indican que algunas tcnicas como la eliminacin de componentes de bajo peso molecular del esperma mediante dilisis antes de la congelacin mejora sensiblemente la motilidad espermtica, la integridad de membrana y la funcin mitocondrial. Por el contrario los autores reportaron que no se observo efecto alguno sobre la integridad del acrosoma del mismo modo, se ha observado que la adicin de lipoprotenas de bajo peso molecular al diluyente de congelacin incrementan el porcentaje de

espermatozoides intactos, la motilidad espermtica y la integridad de la membrana plasmtica (5).

La base del protocolo de congelacin la mismo, con mnimas modificaciones: 1. Recoleccin de semen, tomando la fraccin rica del eyaculado y mezclando con diluyente a 32 C. 2. Se calcula la concentracin seminal, y a partir de esta cifra, las dosis que se pueden obtener del eyaculado y cantidad de diluyente de congelacin a emplear. 3. Equilibrio previo a la centrifugacin (23 C y 15 C). 4. Centrifugacin a 800 g por 10 minutos en centrifuga refrigerada a 15 C. 5. Resuspensin y eliminacin de plasma seminal. 6. Adicin de diluyente a 15 C para evitar shock trmico.

7. Equilibrio trmico a 5 C (3 horas). 8. Adicin de diluyente con 3% de glicerol. 9. Envasado. 10. Congelacin. 11. Almacenamiento en nitrgeno lquido a -196 C.

Mtodo americano (Beltsville): Descrito por Pursel y Johnson (1975) utiliza el medio denominado BF-5 (Beltsville freezing 5), en cuya composicin se incluye glucosa, yema de huevo y Tris como agente regulador del pH, y las muestras seminales se colocan sobre nieve carbnica para congelarse en forma de pldoras (pellets) de un centenar de microlitros.

ANEXOS

CONCLUSIN

Con este trabajo podemos concluir las dificultades en la preservacin del semen fresco para inseminacin artificial han promovido las investigaciones en criopreservacin de semen congelado, proceso que en la actualidad ha logrado avances significativos para la industria porcina El proceso de congelacin de

semen afecta las caractersticas espermticas relacionadas con la fertilidad y por esta razn se disminuye la tasa de concepcin y el tamao de las camadas en granjas que utilizan semen criopreservado los espermatozoides de porcino congelados an no tiene la calidad necesaria para lograr resultados adecuados en virtud de la amplia gama de condiciones en la aplicacin prctica de rutina. Por otra parte, la variacin interindividual sigue siendo un problema significativo; por ello la bsqueda de mejores cualidades de los espermatozoides despus del proceso de descongelacin requiere de la utilizacin de eyaculados que presenten caractersticas sobresalientes dentro de las que se destacan la movilidad individual, la vitalidad, la integridad de la membrana celular y la integridad del acrosoma. Po tanto se puede argumentar que en la actualidad los resultados de la crioconservacin de espermatozoides porcinos an presentan una baja eficacia, a diferencia de lo que sucede con otras especies, debido a las limitaciones que todava tiene esta tcnica, su uso an no se ha generalizado.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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3. Noris

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6. C. Gmez-Rinc. Mozo y S. Cabreja. Diluyente de refrigeracin para semen porcino.< en lnea> http://www.magapor.com/images/Veterinarios/Doc_8.pdf.