Tcnicas em Biologia Molecular

Por que estudar o DNA, o RNA, as protenas?

Questes
Qual a funo de um determinado gene? Ser que o gene A esta sendo expresso no paciente? Ha algum tipo de mutao ou polimorfismo nesse paciente? Qual o tipo de microorganismo esta infectando o paciente? Essa paciente tem predisposio para o cncer de mama? Quem matou? Quem o pai?

Desenvolvimento de Tcnicas de Biologia Molecular

Afim de isolar, analisar e sintetizar as seqncia de DNA e dos genes Estudar a funo e os mecanismos que controlam a expresso dos genes atravs da introduo dos DNAs recombinantes em clulas vivas. Entender as relaes entre os cidos nuclicos e as protenas e a promoo de todos os eventos genticos na clula.

Plano da aula
Clonagem Molecular e Transformao Celular Extrao e Purificao do DNA Eletroforese em gel Analise do DNA e RNA por blotting PCR Sequenciamento do DNA Analise das protenas por blotting

Mtodos para estudar o DNA e detectar suas variaes gnicas

Clonagem Molecular

Clonagem Molecular
Consiste no isolamento e propagao de molculas de DNA idnticas Primeiro: inserto + vetor = DNAr Sagundo: DNAr + clula hospedeira = clula transformada

Clonagem Gnica
clonagem gnica
introduzir o gene dentro de bactrias e isol-las em colnias.

As clulas de cada colnia so idnticas entre si (NASCIMENTO et al., 1999).

Clonagem gnica
consiste em duas etapas bsicas: 1 liga o entre um fragmento de DNA ) (inserto) contendo o gene de interesse com uma outra molcula de DNA (o vetor) para formar uma quimera ou molcula de DNA recombinante (BROWN, 2003).

Clonagem gnica

Clonagem gnica
2) O DNA recombinante transportado para dentro de uma clula hospedeira, em geral uma bactria A clula que recebeu o DNA recombinante chamada de clula transformada, a qual sofre muitos ciclos de diviso, produzindo vrias cpias do DNA recombinante

como produzir esses DNArecombinantes?

Vetores
So molculas de transporte de DNA Diversos tipos: plasmdeos, cosmdeos, fagos, vrus, YACs, etc. Diferenas de tamanho de inserto Podem ter comportamento linear e/ou circular

Vetores
Todos contm trs caractersticas comuns:
marca seletiva, origem de replicao (ori) stio mltiplo de clonagem
(NASCIMENTO, 1999).

Vetores
A marca seletiva
genes que conferem resistncia a antibiticos proporcionam a seleo dos clones transformados daqueles no transformados.

adicionado ao meio de cultura o antibitico adequado, permitindo diferenciar a clula no-transformada (sensvel ao antibitico) da clula transformada (resistente ao antibitico).

Vetores

Vetores
Origem de replicao
permite ao DNA do plasmdeo replicar-se independentemente do DNA cromossmico. Ori uma seqncia especfica de 50-100 pb
presena obrigatria para a replicao do plasmdeo

Vetores
A replicao pode ser sincronizada com o ciclo celular ou independente

Vetores
O stio mltiplo de clonagem ou polylinker um stio de clivagem de endonucleases de restrio no qual inserido um fragmento de DNA de interesse sem interferir na funcionalidade do plasmdeo (BROWN, 2003; WEAVER, 2001).

Vetores
Plamdeos Bacterifagos lambda Cosmdeos YACs

Plasmdeos

Molculas de DNA fita dupla extracromossomal encontrados em todas as espcies de bactrias. Variam em estrutura, tamanho, modo de replicao, nmero de cpias por clula e habilidade para propagarem-se em diferentes bactrias.

Outros vetores
FAGOS: Bacterifagos lambda Vrus bacteriano com uma molcula de DNA grande (45kb) O lambda se replica na E. coli e produz milhes de vrus infecciosos Destruio celular e liberao dos bacterifagos 1/3 do genoma do bacterifago no essencial Excelente para DNAr (fragmentos de at 20kb)

Outros vetores

Outros vetores
Cosmdeos
At 50kb de DNA exgeno

Outros vetores
YACs 1987
Possvel clonar grandes fragmentos de DNA, at 1000kb Vetores que se replicam na Saccharomyces cerevisiase (levedura de padaria) Possuem centrmeros e telmeros cromossomos artificiais

Transformao ou transfeco celular

introduo de um DNA exgeno em clulas hospedeiras, que podem ser: bactrias, leveduras, fungos filamentosos, clulas vegetais e clulas de mamferos.

Transformao ou transfeco celular

A clula mais comumente utilizada a Escherichia coli. O processo de transformao bacteriana utilizada na Biologia Molecular ocorre in vitro, e pode ser afetado pelo tamanho e conformao da molcula de DNA a ser introduzida na clula

Transformao ou transfeco celular

Plasmdeos pequenos incorporam-se mais facilmente clula bacteriana competente. A transformao bacteriana utilizada para a preparao de DNA plasmidial, em larga escala, e para a seleo de clones recombinantes (BROWN, 2003; MARANHO, 2003a).

Agora que tenho meu DNAr como transform-lo ou transfect-lo na minha clula?

Transformao ou transfeco celular

Naturalmente, no h atrao do DNA pelas clulas bacterianas, devido ocorrncia da repulso eletrosttica entre:
as cargas negativas dos fosfolpideos da membrana e as cargas negativas dos grupamentos fosfatos da molcula de DNA

Tcnica de transfeco celular

Dois diferentes mtodos de transformao:

Choque trmico Eletroporao

Transformao ou transfeco celular

Choque trmico
Comumente chamado transformao ou transfeco com cloreto de clcio Mtodo fcil e relativamente barato de transformao.

Transformao ou transfeco celular

Choque trmico
Tratamento das clulas com cloreto de clcio (cloreto de ltio ou magnsio) par torn-la competente. Os ons neutralizam as cargas negativas da membrana e do DNA. Aps um choque trmico na temperatura de 37 a 42C, criam se poros na membrana e o DNA pode alcanar o interior da clula
(MARANHO, 2003b; NASCIMENTO et al., 1999).

Transformao ou transfeco celular Eletroporao

um mtodo mais eficiente para transformao de clulas com DNA plasmidial. Consiste, inicialmente, na preparao das clulas comum a soluo aquosa para torn-las competentes e aptas a receber o DNA.

Transformao ou transfeco celular Eletroporao

As clulas so submetidas a alta voltagem (choque eltrico) que provoca uma desestabilizao da membrana externa e a formao de poros, possibilitando a entrada do DNA para o interior da clula.

Transformao ou transfeco celular Eletroporao

transfeco celular Eletroporao

Esse tipo de transformao, requer um equipamento denominado eletroporador O eletroporador deve ser ajustado para cada tipo celular (AUSUBEL et al.,
2003; MARANHO, 2003b).

Aplicaes do DNA recombinante

Estudo da estrutura dos genes Melhoramento gentico Criao de modelos animais Diagnostico clinico Terapia gnica

ENZIMAS e o DNA

Enzimas para manipulao de DNA

As enzimas modificadoras de DNA so as principais ferramentas da engenharia gentica e possibilitam a manipulao in vitro de molculas de DNA ou RNA. A tecnologia do DNA recombinante possvel devido a descoberta das enzimas bacterianas que catalisam reaes especficas nas molculas de DNA.

Enzimas para manipulao de DNA

As enzimas podem ser agrupadas em cinco classes:
Nucleases Ligase Polimerases Modificadoras Topoisomerase

Enzimas para manipulao de DNA

Nucleases e ribonucleases
clivam a ligao fosfodister do DNA e RNA podem ter atividade exonuclesica 3' - 5' e/ou 5' - 3 ou endonuclesica.

Enzimas para manipulao de DNA

Endonucleases
1970, fundamental no desenvolvimento da clonagem molecular, tecnologia do DNA recombinante. comumente chamadas de enzimas de restrio, elas clivam seqncias de DNA especficas em ambas as fitas, chamadas de stios de restrio, e podem gerar extremidades abruptas ou coesivas

Enzimas para manipulao de DNA

Sitio de restrio
Local de clivagem do DNA Ex. sitio de restrio da E coli
As seqncia so PALINDROMOS

Cada vez que essa seqncia encontrada, ela clivada entre o G e A, gerando fragmentos de restrio

Outras enzimas de restrio

Enzimas para manipulao de DNA

As enzimas de restrio so nomeadas conforme o microrganismo do qual foram isoladas; a primeira letra representa o gnero, as segunda e terceira letras representam a espcie, as seguintes, representam a linhagem e a ordem da descoberta.

Enzimas para manipulao de DNA

Ligases - catalisam a formao de uma ligao fosfodister entre grupos 3'- OH e 5'-PO4-, unindo covalentemente molculas de DNA de fita dupla, resultando em uma molcula de DNA recombinante.

Enzimas para manipulao de DNA

Polimerases - catalisam a sntese de molculas de DNA a partir de um molde, ou seja, sintetizam uma nova fita de DNA, complementar a um molde de DNA ou RNA preexistente.

Como extrair o DNA das clulas ou tecidos?

Extrao e Purificao do DNA

procedimento bsico e fundamental para a clonagem molecular. Inmeras tcnicas que permitem o isolamento de DNA

Extrao e Purificao do DNA

A purificao consiste na separao do DNA a partir dos restos celulares e das protenas, principalmente as DNAses que degradam as molculas de DNA, tanto em clulas bacterianas como em clulas eucariticas.

Extrao e Purificao do DNA

O procedimento de preparao de DNA, a partir de uma cultura de clulas bacterianas, pode ser resumido da seguinte maneira: 1 - As clulas so cultivadas em meio de cultura, depois recuperadas por centrifugao, a partir da cultura, e concentradas no menor volume possvel. 2 - As clulas so rompidas por macerao mecnica e seu contedo liberado, formando um extrato celular.

Extrao e Purificao do DNA

3 - as clulas maceradas so ressuspensas em um tampo de extrao, contendo: algum detergente (SDS no caso da extrao que utiliza fenol), antioxidantes, EDTA agente tamponante, visando a solubilizao de membranas lipoproteicas e desnaturao de protenas enquanto o DNA protegido da ao de enzimas de degradao. Esta suspenso submetida a uma temperatura entre 50 e 65 durante 15 a 60 minutos para C facilitar a solubilizao e homogeneizao da suspenso.

Extrao e Purificao do DNA

4 - A suspenso submetida a uma extrao com um solvente orgnico, clorofrmio-alcool isoamlico. As fases orgnica e aquosa so separadas atravs de centrifugao. Nesta extrao, lipdios, protenas e a maioria dos polissacardeos so retidos na fase orgnica inferior , enquanto que o DNA, RNA e alguns polissacardeos so retidos na fase superior (aquosa).

Extrao e Purificao do DNA

5 - um lcool (isopropanol ou etanol) e sal (NaCl) so adicionados fase aquosa. O DNA na presena de sal e lcool forma um precipitado freqentemente visvel que pode ser pescado ou peletizado por centrifugao.

Extrao e Purificao do DNA

6 - este precipitado de DNA/RNA ressuspenso em um tampo TrisEDTA contendo RNAse para degradar o RNA, restando apenas o DNA genmico desejado.

Fazendo em casa

Como analisar o DNA?

Eletroforese em gel de agarose

mtodo simples e eficiente que permite separao, identificao e purificao de molculas de DNA.

Eletroforese em gel de agarose

Principio: As molculas so separadas atravs da migrao de partculas no gel, com a aplicao de uma diferena de potencial eltrico, onde as molculas de menor massa migram mais rpido.

Eletroforese em gel de agarose

O protocolo padro de gel de agarose permite separar fragmentos de DNA entre 0,5 a 25 kb. A eletroforese tambm pode ser utilizada para separar protenas e molculas de RNA.

Eletroforese em gel de agarose

A agarose um polissacardeo que forma uma rede e permite regular a velocidade da migrao das molculas durante a separao. A adio de corante fluorescente (brometo de etdio ou sybr), que se intercala entre as bases do DNA, e o uso de radiao ultravioleta permitem a visualizao e a fotografia

Leitura da eletroforese

Analise do DNA e RNA em blotting

Baseada nas propriedades de hibridizao das molculas de cidos nuclicos. Foram propostas para localizar a posio de um gene em uma molcula de DNA. Anlise de DNA: Southern blotting. Anlise de RNA: Northern blotting. Anlise de proteinas: Westhern blotting.

Southern blotting

Analise do DNA em blotting

Primeiramente, o DNA digerido com uma ou mais enzimas de restrio e separado em uma eletroforese em gel de agarose.

Analise do DNA e RNA em blotting

Os fragmentos de DNA fita dupla so desnaturados in situ e transferidos para uma membrana de nylon ou nitrocelulose, na qual so imobilizados no mesmo padro de bandeamento do gel.

IMOBILIZAO
radiao UV, para as membranas de nylon, calor, para as membranas de nitrocelulose.

A membrana colocada sobre o gel e um tampo de alta concentrao salina adicionado Por capilaridade, passa atravs do gel, promovendo a transferncia dos fragmentos de DNA para a membrana. A membrana resultante uma rplica do gel de agarose

Analise do DNA e RNA em blotting

Sondas de RNA ou DNA marcadas com radioatividade so utilizadas, a hibridizao com o DNA fixo na membrana ocorre e uma auto-radiografia revela qual fragmento de restrio contm o gene clonado

Analise do DNA e RNA em blotting

Para a anlise de RNA, a tcnica, recebeu o nome de Northern blotting. Um RNA extrado submetido eletroforese em gel de agarose, transferido para uma membrana e hibridizado com sondas radioativas de RNA ou DNA. Esta tcnica permite identificar em qual tecido ou tipo celular um determinado gene expresso.

O que so sondas e para que servem?

So molculas de cidos nuclicos clonadas (DNAr) ou sintticas, marcadas com radioisotopos. Usadas em reaes de hibridizao DNA-DNA ou DNA-RNA Ex. usar uma sonda para o gene da distrofina ligado ao X para investigar uma amostra de RNA muscular obtida de um paciente com distrofia muscular de Duchenne

Em busca de polimorfismos ou mutaes

RFLP polimorfismo por comprimento do fragmento de restrio O primeiro mtodo para a criao de um perfil de DNA Princpios:
DNA com milhares de pb, 3 sitos de restrio para EcoRI. Se existir um polimorfismo GAATTT ao invs da GAATTC Enzima no cliva Fragmento maior Fazendo a eletroforese em gel, os fragmento maiores migram menos, produzindo bandas diferentes do controle

Anemia falciforme

Anemia falciforme
Enzima de restrio cliva CCTNAGG Dois fragamentos 1.100pb e 200pb Se houver a mutao = fragmento de 1300pb

Sonda de DNA
Para pesquisar fragmentos especficos

VNTRs polimorfismos de nmeros de repeties tandem

Fingerprints do DNA
Pequena probabilidade de ter o mesmo alelo em cada locus Medicina forense

RFLP e VNTR dependem de Southern e clonagem

O mtodo j no to utilizado atualmente porque requer uma amostra grande de DNA
at 25 fios de cabelo, ou uma mancha de fluidos corpreos do tamanho de uma moeda de 10 centavos.

Alm disso, o teste pode demorar at um ms e requer o exame de sees mltiplas do DNA, para localizar variaes, o que aumenta a possibilidade de erro humano.

PCR
Polimerase Chain Reaction

PCR
A reao em cadeia da polimerase (PCR) um procedimento rpido que possibilita a amplificao in vitro de fragmentos de DNA especficos, partindo-se de uma quantidade mnima de DNA alvo ou de RNA previamente convertido em cDNA.

PCR
A tecnologia da reao de polimerase em cadeia (PCR) foi concebida por Kary Mullis em meados da dcada de 80. Esta tecnologia causou uma verdadeira revoluo na biologia:
na pesquisa visando o entendimento de processos biolgicos fundamentais, nas reas aplicadas, envolvendo diagnsticos, deteco de variaes genticas e melhoramento gentico de plantas e animais domsticos.

Componentes da PCR
Para a aplicao da tcnica, so necessrios quatro componentes:
1. a construo de dois oligonucleotdeos (primers) especficos - de fita simples e complementares as duas fitas molde de DNA - desenhados de modo a flanquear a seqncia a ser amplificada.

PCR desenho dos primers

Comprimento: em torno de 20 bases GC: ideal em torno de 50% Software para desenhar iniciadores: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome

PCR desenho dos primers

Componentes da PCR
2. DNA polimerase. Geralmente derivada da bactria Thermus aquaticus, faz o processo vital de replicao do DNA (extenso do primer)

bactria encontrada em altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.

Componentes da PCR
3. Um grande numero de bases do DNA livres (dNTPs) dNTPs 4. DNA genmico a ser pesquisado (peq. quantidade)

Mg2+

DNA Polimerase

dNTP

Primers

PCR
A reao de PCR se baseia no anelamento e extenso enzimtica de um par de oligonucleotdeos (pequenas molculas de DNA de fita simples) utilizados como iniciadores (primers), que delimitam a sequncia de DNA de fita dupla alvo da amplificao. Estes primers so sintetizados artificialmente de maneira que suas seqncia de nucleotdeos sejam complementares s sequncias especficas que flanqueiam a regio alvo

PCR
A tcnica consiste de ciclos repetitivos:
1 passo (94-96C) - Desnaturao do DNA a alta temperatura, devido ao rompimento das pontes de hidrognio que unem as duas fitas. 2 passo (30-60C) - Anelamento ou hibridizao dos primers em posies especficas (essa temperatura definida em funo da seqncia nucleotdica dos primers). 3 passo (72-75C) - Extenso da seqncia a ser amplificada pela ao da DNA polimerase.

E o ciclo se repete 20-30 vezes

PCR
Durante cada ciclo, as fitas complementares de DNA so copiadas pela extenso dos primers que se anelam em posies opostas. Desta forma, cada fita de DNA recm amplificada usada como molde no ciclo seguinte, resultando assim, no acmulo exponencial do fragmento de DNA flanqueado pelos dois primers

PCR
Uma vez que a quantidade de DNA da sequncia alvo dobra a cada ciclo, a amplificao segue uma progresso geomtrica de maneira que, depois de apenas 20 ciclos, so produzidos mais de um milho de vezes a quantidade inicial de sequncia alvo.

PCR
Vantagem
Pode ser utilizada com quantidades extremamente pequena de DNA No requer clonagem gnica (+ rpida) No utiliza sondas radioativas

Desvantagem
necessidade do conhecimento prvio das seqncia de nucleotdeos que flanqueiam a seqncia de DNA de interesse. Devido a extrema sensibilidade, corre risco de contaminao

PCR
Para o isolamento de um gene especfico podem ser utilizadas diferentes estratgias de PCR:
RT-PCR (amplificao de seqncias de cDNA) RACE-PCR (amplificao das extremidades 3' e 5' de seqncias de cDNA) Tail-PCR (isolamento de segmentos de DNA adjacentes a seqncias conhecidas) PCR inverso (isolamento de seqncias que flanqueiam uma regio genmica conhecida).

Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD)

O grande avano na rea de marcadores moleculares baseados em PCR ocorreu em 1990, com a idia de se utilizar primers mais curtos e de sequncia arbitrria para dirigir a reao de amplificao, eliminando assim a necessidade do conhecimento prvio de seqncia.

Tcnica de PCR

PCR- preparo da reao

http://wwwuser.gwdg.de/~instphyt/karlovsky/lab/lab_photos_1/pages/Workshop%20on%20re al-time%20PCR.htm

CICLOS DA PCRPCR
Programa
94 0C por 5 min

94 0C por 1 min 55 0C por 1 min 72

0C

por 1 min

35 ciclos

72 0C por 5 min 4 0C

Desnaturao
Processo no qual ocorre a separao da fita dupla de DNA por meio da elevao da temperatura.

As amostras so aquecidas a 94-96 C durante um a vrios minutos.

Hibridao
A temperatura reduzida a 55-65 C durante alguns segundos.

Os iniciadores hibridam com as sequncias complementares do DNA molde

Extenso
Eleva-se a temperatura a 72C por alguns segundos.

A DNA polimerase faz a duplicao da cadeia a partir dos iniciadores

Lendo a PCR
Estudo da leishimaniose por PCR

Roselino 2008

Aplicaes do PCR
Os produtos amplificados por PCR podem ter as seguintes utilidades/ aplicaes: 1. Deteco de delees / inseres determinadas pela gerao de produtos amplificados que apresentam alteraes em seu tamanho. Deteco de mutaces pontuais (substituio de bases), conhecidas ou no, que geram polimorfismos genticos podem ser determinadas pela ao das enzimas de restrio ou atravs do seqenciamento.

2.

Aplicaes do PCR
3. 4. No diagnstico pr-natal ou pr-implantacional (particularmente para doenas herdadas). Na tipagem para transplantes de rgos e susceptibilidade para doenas auto-imunes especficas (deteco de polimorfismo para HLA). 5. No diagnstico e prognstico de doenas de ordem gentica, como o cncer, atravs do estudo dos genes relacionados a essas doenas. 6. 7. Na medicina forense (DNA fingerprint). No diagnstico de doenas infecciosas por agentes patognicos diversos

APLICAES DA TCNICA DE PCR

TESTE DE PATERNIDADE
Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata

Trio Normal (sup. Pai, me e criana) ............................. R$ 600,00 Visualizao do Gel em Paternidade Comprovada para um "loci" estudado

PCR em tempo real

uma tcnica para a deteco e medida de produtos gerados durante cada ciclo da PCR A emisso dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumentar na proporo direta da quantidade de produto da PCR. Em tempo real possvel saber a quantidade de produto em um ponto no qual a reao ainda est na fase exponencial Por este motivo, essa tcnica permite a quantificao, o acompanhamento da reao e a apresentao dos resultados de forma mais precisa e rpida, pois no mais requer a deteco em gel de eletroforese.

PCR em tempo real

PCR em tempo real

SYBR Green um fluorforo em suspenso, intercalante de DNA dupla fita, que emite uma fluorescncia verde com a excitao da luz emitida pelo sistema tico do termociclador. Durante a PCR, as molculas do SYBR Green vo se ligando ao DNA recm sintetizado Um aumento da fluorescncia observado em tempo real, o que possibilita o monitoramento contnuo da reao

PCR em tempo real

SYBR Green

PCR em tempo real

PCR em tempo real

Aplicaes Quantificao Deteco de carga viral Determinao do nmero de cpias de um gene Anlise da expresso gnica

PCR em tempo real

Exemplo de aplicao: Investigao de amplificao ou deleo dos genes BCHE e ACHE em tecido mamrio tumoral com relao ao tecido normal.

PCR e PCR in real time

Clonagem de produtos da PCR

Clonagem de produtos de PCR

A Taq DNA polimerase adiciona um resduo de deoxiadenosina (A) extremidade 3' das fitas de DNA, durante a amplificao por PCR. Esse A protuberante permite ligar o fragmento de DNA a vetores especficos, especialmente preparados, contendo um resduo de deoxitimidina (T) protuberante na extremidade 3'.

Clonagem de produtos de PCR

Clonagem de produtos de PCR

A molcula do vetor tem somente um stio de clivagem para uma determinada enzima de restrio que abre o vetor na seqncia onde o inserto ser inserido.

Clonagem de produtos de PCR

Os fragmentos de DNA oriundos da reao de PCR so misturados ao vetor linearizado juntamente com a enzima T4 DNA ligase, a qual permite a ligao entre eles, gerando uma molcula de DNA plasmidial, contendo o gene de interesse. Este plasmdeo pode ser inserido dentro de uma bactria por transformao e, ento, ser replicado.

Clonagem de produtos de PCR

Clonagem de produtos de PCR

Alm do fragmento de PCR, outras molculas de DNA podem ser inseridas em vetores previamente clivados com enzimas de restrio. A DNA ligase pode atuar em ligaes de fragmentos com extremidades coesivas ou abruptas

Clonagem de produtos de PCR

Seqenciamento do DNA

Seqenciamento do DNA
A seqncia do DNA um pr-requisito para a anlise detalhada de um gene. Pode indicar:
sobre a natureza de uma mutao especifica O funcionamento de um gene O grau de similaridade de um gene com outros desconhecidos

Seqenciamento do DNA
O mtodo mais utilizado o didesoxi, baseado no mtodo de Sanger-Coulson, Tambm conhecido como mtodo de terminao de cadeia, Usa-se didesoxiribonucleotideos finalizadores de cadeia

1. No apresentam o grupo OH 2. Impede as ligaes fosfodister com as bases livres de DNA

Seqenciamento do DNA
No seqenciamento automtico, os nucleotdeos so marcados com quatro fluorocromos diferentes, um para cada nucleotdeo (A, C, G, T)..

Seqenciamento do DNA
O mtodo baseia-se na sntese de uma segunda fita de DNA complementar ao DNA molde, na presena de um primer complementar seqncia adjacente ao stio mltiplo de clonagem do vetor

Seqenciamento do DNA
O fragmento de Klenow da DNA polimerase I inicia o elongamento da cadeia complementar a partir da extremidade 3' do primer; os desoxinucleotdeos - dNTP - so selecionados de acordo com o pareamento ao molde e ligados a cadeia por ligaes fosfodister

Seqenciamento do DNA
Como, para cada dNTP, utiliza-se um fluorocromo diferente, a eletroforese realizada em um nico canal do gel de seqenciamento. medida que os fragmentos passam pelo feixe de laser, os fluorocromos so excitados e a luz emitida, em diferentes comprimentos de onda, detectada por um fotomultiplicador.

etapas

Adio dos ddNTPs

Tipos de analise

SEQUENCIAMENTO MANUAL
Auto-radiogramas de um gel de seqenciamento de DNA

Seqenciamento Manual X Automtico

Anos 80 seqenciador semi-automtico
Substituio das tcnicas de deteco por radioatividade pelo uso de marcadores fluorescentes Radioistopos danosos sade, dificuldade de automao Fluorfos sistema de deteco que permite a leitura automtica das seqncias Preparao do gel e aplicao das amostras Utilizao ddNTPs fluorescentes lidos automaticamente durante a eletroforese Corantes fluorescentes reaes no mesmo poo no gel

Mtodo de Sanger automatizado

Sanger sequencing
anelamento dos primers

denaturao

SEQUENCIADOR

SEQUENCIAMENTO AUTOMTICO
Seqenciadores de capilares - duas vezes mais rpidos, completamente automatizados Associao de capilares preenchidos com gel a um sistema de deteco atravs de fluorescncia confocal excitada por laser Eliminao da montagem da placa e preparao do gel Aplicao das amostras por eletroinjeo Alta velocidade e resoluo na separao das amostras

ANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regio de qualidade alta

Picos bem definidos e grandes. Linha de base boa. Distncia entre picos anterior e posterior constante.

ANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regio de qualidade mdia poucas ambigidades

Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho mdio. Linha de base boa a razovel. Distncia entre picos anterior e posterior razovel.

ANALISANDO O CROMATOGRAMA
Regio de qualidade baixa baixa confiabilidade

Picos mal definidos e de tamanho pequeno. Linha de base confusa. Distncia entre picos anterior e posterior inconstante.

ANALISANDO O CROMATOGRAMA

Mtodos para estudar as protenas

Western blotting