Aislamiento, seleccin, conservacin de los microorganismos aislados de la elaboracin de vino de Araz

INDICE 1. 2. 3. 4. 5. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. 6.6. ANTECEDENTES: PROBLEMA 3 3

JUSTIFICACION 4 OBJETIVO GENERAL: MARCO TERICO VINO DE FRUTAS 5 5 6 6

FERMENTACIN DE LOS ZUMOS DE FRUTAS FERMENTACIN DE PULPA DE FRUTAS 6 ARAZ 7

CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA DEL FRUTO DE ARAZ EN ESTADO MADURO 7 BIOQUIMICA DE LA FERMENTACION: 8

6.7.

6.8. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA BIOQUMICA DE LA LEVADURA Y LA FERMENTACIN ALCOHLICA 8 6.9. 6.10. 7. 7.1. 7.2. PRODUCTOS SECUNDARIOS DE LA FERMENTACIN ALCOHLICA CRITERIOS PARA LA SELECCIN DE LEVADURAS 9 MARCO METODOLOGICO 9 8

DESCRIPCION DEL PROCESO PARA LA ELABORACION DEL VINO 9 PREPARACIN DEL MOSTO: 10

7.2.1. CONSIDERACIONES DE LA MATERIA PRIMA (ARAZ) PARA EL MOSTO EN LA ELABORACION DE VINO DE ARAZ: 10 7.2.2 7.2.3 MEZCLA EN LAS SIGUIENTES PROPORCIONES: 11 CARACTERIZACIN ESPERADA DEL VINO DE ARAZ 12

7.3. FUNDAMENTO DE LOS METODOS DE AISLAMIENTO, SELECCIN Y CONSERVACION DE LAS CEPAS FERMENTADORAS EN EL VINO DE ARAZ 12 7.4 TECNICA A UTILIZAR EN EL AISLAMIENTO, SELECCIN Y CONSERVACION DE CEPAS DE LA FERMENTACION PARA ELABORACION DE VINO DE ARAZ 17 7.4.1. 7.4.2. 7.4.3. 7.4.4. 8. 9. TECNICA PARA AISLAMIENTO METODO DE ENRIQUECIMENTO 17 17 17

TECNICA DE AISLAMIENTO EN MEDIO SELECTIVO CONSERVACION BIBLIOGRAFIA: 17 ANEXOS: 18 17

1.

ANTECEDENTES:

En las regiones de clima clido hmedo existe una enorme variedad de especies frutcolas tropicales nativas de gran potencial que, si se explotan racionalmente, podran contribuir al desarrollo local. Entre estas frutas regionales, se encuentra el araz (Eugenia stipitata) que despierta cierto inters por las cualidades organolpticas del fruto y por el ndice de produccin de la planta. El araz es una especie que se adapta a suelos de baja fertilidad, as como a las variaciones climticas de la regin Su fruto suculento posee un aroma y sabor agradable, el mismo que puede ser consumido en jugos, dulces, nctares, jaleas, licores, yogurt, etc. La planta produce su fruto durante el ao entero y dependiendo del manejo de la plantacin, existe problemas en la post cosecha por la abundante produccin y suele existir desperdicio. Siendo una fruta altamente perecible; y principalmente debido a sus caractersticas organolpticas especiales se percibe la posibilidad de generar una alternativa tecnolgica para el aprovechamiento de la fruta y uno de ellos es aplicar procesos fermentativos como mtodo de transformacin y conservacin de la fruta. En investigaciones recientes sobre el anlisis de la actividad de levaduras y la utilizacin de sustratos de jugos de frutas tropicales como la pia, mango y papaya, se encontr un alto grado de adaptabilidad de las levaduras en estos sustratos, la pia fue la fruta que mejores resultados dio para la elaboracin de vinos de fruta tropical, para el mango y papaya se debe aumentar la cantidad de azcar. 2. PROBLEMA

En muchas de las regiones de nuestro pas se lleva a cabo la elaboracin de vinos de frutas tropicales y exticas de manera artesanal y mediante una fermentacin espontnea que llega a ser un proceso relativamente largo de tiempo. En algunos procesos fermentativos naturales si las condiciones no son las adecuadas el vino no posee las caractersticas de flavor propias de la fruta que se va a fermentar como el aporte de elementos aromticos y la intensidad de sabor. Siendo la uva la materia prima ideal para la elaboracin de vino, el desarrollo satisfactorio de las levaduras en especial la de la especie de Saccharomyces cerevisiae encargadas de la fermentacin en jugos de frutas distintos al de la uva est limitado por la alta acidez y bajo contenido de azcar del araz.

En el pas no se venden comercialmente cultivos iniciadores (starter) para la fermentacin de otras frutas que no sean las de la uva para la elaboracin de vino. La necesidad de asegurar la fermentacin y la calidad del producto, ante el hecho de que hay un gran nmero de variables que intervienen en una fermentacin espontnea, favorece el uso de las levaduras aisladas, identificadas y conservadas.

Todas las fbricas productoras de vino de cualquier fruta utilizan starter comercial que se importan de diferentes pases principalmente europeos, pero que no se encuentran adaptadas a las condiciones de fermentacin del araz

Para la fermentacin del araz a vino no existen cultivos iniciadores con cepas nativas, se utilizan cepas comerciales de Saccharomyces cerevisiae, microorganismo aislado comnmente de las diferentes variedades de uva, por lo que se obtienen bajos rendimientos y falta de caractersticas sensoriales propias de esta fruta en contraste a utilizar una cepa nativa adaptada a las condiciones del mosto y que ha sido aislada directamente del proceso de fermentacin natural de esta fruta

3.

JUSTIFICACION

En el Ecuador, la importacin de vinos se ha convertido en el negocio rentable. En nuestro pas no existe una cultura vincola y menos de frutas exticas como es el ARAZA, solo se conoce productores artesanales de este tipo de productos. El ARAZA es una fruta extica tropical que contiene un alto contenido de agua es lo que es muy perecible, y por ello nos hemos visto en la necesidad de aplicar un proceso tecnolgico y cientfico para evitar su perdida y aumentar su valor agregado. El ARAZA no es una fruta estacionaria por lo que no existiran problemas de produccin y se elaborara sin importar la estacin en la que nos encontremos. El ARAZA es originario de la regin amaznica occidental comprendida entre los ros Maran y Ucayali y en las proximidades de Requena y el nacimiento del ro Amazonas. Su origen corresponde a uno de los 5 centros de diversidad que se encuentran en la Amazonia. Lo que nos indica que en nuestro pas tenemos ARAZA en suficiente cantidad para la fabricacin de vino de esta fruta extica y dado el gran desperdicio que se produce en la fruta una alternativa tecnolgico para el aprovechamiento de la fruta seria la fabricacin de vino. Como es un producto perecedero debido a su gran contenido de agua se puede aplicar procesos fermentativos como mtodo de transformacin y conservacin de la fruta. En nuestro pas las pocas fabricas productoras de vinos utilizan starder comercial que se importan de otros pases pero no se encuentran adaptadas a las condiciones de fermentacin de frutas exticas y menos con un pH bajo como es el caso del ARAZA. Por lo que seria un producto innovador con sabor caracterstico y muy agradable que gustara mucho al consumidor. 4

4.

OBJETIVO GENERAL:

Aislar, seleccionar y conservar los mejores microorganismos resistentes a pH cidos, aislados del mosto de araz (fruta tropical).

5.

OBJETIVO ESPECIFICO:

1. 2.

Elaboracin del mosto de araz. Aislar las mejores cepas fermentadoras del araz en la segunda y tercera etapa de fermentacin. Seleccionar las mejores cepas con criterio de rendimiento y capacidad de adaptacin. Caracterizar los microorganismos por biotipo. Preservar las cepas seleccionadas. MARCO TERICO

3. 4. 5. 1.

Vinificacin es el proceso que transforma el jugo de uvas en vino, al originarse la fermentacin alcohlica mediante la accin de las levaduras. La fermentacin, convierte los azcares que contiene el jugo de uva en alcohol. El vino es, por lo tanto una bebida que resulta de la fermentacin del jugo de uva por las levaduras adicionadas, con el procedimiento controlado. Esta bebida ha sido producida desde tiempos antiguos. La diversidad y la calidad del vino son el resultado del tipo de uva, la calidad distintiva del suelo, el clima y los procesos diseados en las diferentes partes del mundo. Todos los vinos son hechos en un proceso comn, con variaciones de acuerdo al tipo que se pretende producir. 1. LEVADURAS Y EL VINO

Las levaduras juegan un papel trascendental en el proceso de elaboracin del vino junto con factores climticos, de cultivo, de la fruta, pH del mosto, etc. Las levaduras del gnero Saccharomyces son las ms utilizadas en la elaboracin del vino, sin embargo, varias especies no pertenecientes a este gnero han sido encontradas en el mosto fermentado, tales como Hanseniaspora guillermondii, Kloeckera apiculata, Pichia anomala, Candida stellata, Torulaspora delbrueckii. Estas levaduras no pertenecientes al gnero Saccharomyces contribuyen a mejorar el bouquet del vino, sin embargo no son capaces de resistir todo el proceso de fermentacin debido a su escasa tolerancia al etanol. Por esta razn, varios autores han estudiado la fermentacin con mezclas de levaduras, aplicadas simultneamente o 5

encultivos secuenciales. Las levaduras favorecen el sabor del vino de tres modos significativos: influencia la ecologa del proceso de la vinificacin, el metabolismo y las actividades enzimticas y el impacto organolptico de especies individuales o combinaciones de especies en el sabor del vino.

2.

VINO DE FRUTAS

Se define como vino de frutas la bebida proveniente de mostos de frutas frescas, distintas de la uva, sometidos a la fermentacin alcohlica y que han sufrido procesos semejantes a los exigidos para los vinos. Los vinos de frutas se producen a escala industrial, en diversos pases de Europa y muchas otras partes del mundo, especialmente en aquellas zonas que no renen las condiciones adecuadas para el cultivo de las cepas de uva utilizadas para la elaboracin del vino. El vino de fruta fortificado con alcohol segn la Asociacin de Productores de Sidra y Vinos de Fruta de la Unin Europea, se define como: una bebida alcohlica obtenida por la fermentacin total o parcial de zumo fresco, concentrado o reconstituido, o pulpa de frutas comestibles frescas o de otras partes de vegetales frescos, excepto uvas, con o sin adicin de agua, azcar y alcohol agrcola. Al producto fermentado se le puede aadir zumo fresco, concentrado o reconstituido, o aromas. El contenido alcohlico de los vinos de frutas tiene que hallarse entre un 8 y un 20% v/v.; la mayora tendr un contenido alcohlico de 12 a 15% v/v. Existe gran variedad de frutas utilizadas en la elaboracin de vinos de frutas como por ejemplo manzanas, cerezas, grosellas, peras, ciruelas y fresas, y de frutas ctricas, como araz, naranjas. Un vino de frutas que ha sido correctamente elaborado debe saber a la fruta de que est hecho; es decir, un vino de fresas debe mantener el aroma fresco y agradable que caracteriza a esta fruta. Cada una de las frutas le confiere a su vino unas caractersticas especiales que se deben mantener.

3.

FERMENTACIN DE LOS ZUMOS DE FRUTAS

La fermentacin de los vinos de frutas se lleva a cabo fundamentalmente en cubas de hormign, acero o alternativamente en barriles de madera. Es frecuente que en este proceso sea necesario ajustar la acidez del zumo mediante la adicin de cidos utilizados en la industria alimentaria o, ms comnmente, por neutralizacin del exceso de acidez, con carbonato clcico.

4.

FERMENTACIN DE PULPA DE FRUTAS

La fermentacin de la pulpa permite niveles de extraccin ms altos de antocianos y otros pigmentos de frutas tales como arndanos, cerezas, fresas y facilita la extraccin de los zumos 6

de la mayor parte de las frutas. Por esto la clarificacin final del vino se simplifica por ello. Sin embargo, las elevadas tasas de levaduras en la fruta hacen necesario asegurar la adicin de inculos de levadura pura de gran vigor, para competir eficazmente con la poblacin salvaje. Como la pulpa es una fuente de nutrientes ms rica que el zumo, la fermentacin es vigorosa y no resulta necesaria la suplementacin de nutrientes

5.

ARAZ

Fruta originaria de la Cuenca Amaznica Occidental. Domesticada y consumida inicialmente por los pueblos indgenas. El Araz es una de las frutales cuyos registros se remontan a los principios de la fruticultura amaznica. Siendo identificado en el principio como un ambientador natural, por su delicioso aroma algunos locales se abstenan de consumir y solo lo utilizaban para aromatizar los ambientes. Se desarrolla en zonas con temperaturas medias de 18 a 30C, con precipitaciones que van desde los 1.500 a 4.000 mm/ao y una altitud variable desde el nivel del mar hasta los 650 msnm. Se adapta en suelos con alta saturacin de aluminio y bajos niveles de fertilidad, con un pH de 4,5 a 5,5. El fruto de araz posee un alto contenido de humedad, alrededor del 90%, lo que contribuye al incremento de la tasa respiratoria e incide directamente en la alta perecibilidad. Los contenidos proteicos resultan moderadamente altos y pueden estar asociados a una alta tasa metablica, con un importante nivel de actividad enzimtica. Por otra parte, la fibra cruda constituye un interesante aporte a la dieta bsica. El araz aporta una moderada cantidad de cido ascrbico, entre otras vitaminas, favoreciendo de esta forma la seguridad alimentaria en la regin amaznica, ya que de otra manera el consumo de vitaminas provendra siempre de frutos importados a la regin. 6. CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA DEL FRUTO DE ARAZ EN ESTADO MADURO

7.

BIOQUIMICA DE LA FERMENTACION:

Podemos definir la fermentacin alcohlica como el proceso bioqumico por el cual las levaduras transforman los azcares del mosto en etanol y CO2. Para que la fermentacin alcohlica tenga lugar, el mosto ha de hallarse en condiciones de limitacin de oxgeno. En condiciones de aerobiosis las levaduras se multiplican abundantemente con un rendimiento en biomasa muy alto ya que se consigue 1 g de levadura por cada 4 g de azcares consumidos. En anaerobiosis las levaduras realizan la fermentacin, es decir degradan los azcares de forma incompleta generando etanol, CO2 y energa. En estas condiciones el rendimiento en biomasa es de tan slo 1 g de levadura por cada 100 g de azcares consumidos. 8. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA BIOQUMICA DE LA LEVADURA Y LA FERMENTACIN ALCOHLICA La temperatura de fermentacin es una de las caractersticas que deben tomarse en cuenta para determinar el tipo de fermentacin. De hecho, dependiendo del tipo de vinificacin que se quiera realizar, se utilizar una temperatura u otra y por tanto, puede ser de gran inters tener cepas que fermenten bien a las temperaturas elegidas. As, las vinificaciones en blanco se llevan a cabo a una temperatura baja, favoreciendo la retencin de aromas, caracterstica distintiva de un buen vino blanco. Las fermentaciones de vinos tintos, en cambio, se realizan a temperatura ambiente, pero sin dejar que la temperatura supere los 30C, favoreciendo la extraccin de los polifenoles, responsables del color de los vinos 9. PRODUCTOS SECUNDARIOS DE LA FERMENTACIN ALCOHLICA 8

Durante la fermentacin anaerbica, adems de etanol y CO2 se produce cierta cantidad de otros compuestos que en gran medida contribuyen al sabor y aroma final del vino. Se identifica los siguientes: Glicerol. Cuantitativamente es el segundo componente mayoritario del vino despus del etanol y agua. Se encuentra en cantidades de 6 a 10 g/L y a l se atribuyen los caracteres de suavidad y aterciopelado del vino. Se genera a partir de la fosfodihidroxiacetona por reduccin y de fosforilacin de la misma. Acetaldehdo. Aparece durante la F.A. por descarboxilacin del cido pirvico, aunque tambin puede proceder de la oxidacin del etanol. En exceso provoca en el vino la denominada maderizacin o gusto oxidado. 10. CRITERIOS PARA LA SELECCIN DE LEVADURAS

Algunas caracteristicas deseables y no desableas en la seleccin de levaduras para la produccion de vinos de calidad

2.

MARCO METODOLOGICO 1. DESCRIPCION DEL PROCESO PARA LA ELABORACION DEL VINO Recepcin: consiste en cuantificar la fruta que entrar a proceso. Esta operacin debe hacerse utilizando recipientes adecuados y balanzas calibradas y limpias. Lavado: se hace para eliminar bacterias superficiales, residuos de insecticidas y suciedad adherida a la fruta. Se debe utilizar agua clorada. Seleccin: se elimina la fruta que no tenga el grado de madurez adecuado o presente golpes o magulladuras. Preparacin de la fruta: la eliminacin de la cscara permite ablandar ms rpidamente la fruta, as como obtener un producto de mejor calidad.(Esta operacin depende de la fruta de la cual se quiera hacer vino), puede realizarse manual o mecnicamente. Si se hace mecnicamente, existen en el mercado una variedad de modelos de peladoras o bien construirse de forma casera. La preparacin puede incluir un escaldado que permita por una parte desactivar la accin enzimtica y por otra ablandar los tejidos de la fruta para facilitar la extraccin de la pulpa. Extraccin de la pulpa: se hace por medio de un despulpador o bien licuando la fruta. Extraccin del jugo: se hace con una prensa manual o hidrulica. O bien la pulpa obtenida en la fase anterior, se hace pasar por un colador, para obtener el jugo. En esta parte la 9

1. 2. 3. 4.

5. 6.

7.

8.

9.

10. 11.

12. 13.

pulpa debe estar a 70 C, para evitar el oscurecimiento y garantizar el sabor, el olor y el color. Preparacin del mosto: al jugo obtenido en la etapa anterior se adiciona una solucin de agua azucarada al 20%, levadura al 2% en relacin al mosto. El nutriente, que puede ser fosfato de amonio, se agrega en una proporcin de 1 gramo por litro aproximadamente. Fermentacin: en este paso se coloca una trampa de aire, para evitar su oxidacin a vinagre. La mezcla se deja fermentar en barriles, entre 3 y 7 das como mnimo, a una temperatura de 30C. La fermentacin se interrumpe cuando ya no hay produccin de gas. Trasiego: consiste en separar la parte superior del fermento, mediante succin. Durante el fermento existe una separacin de fases, quedando el vino en la parte superior y residuos de fruta o levadura en la parte inferior. Filtrado: se hace pasar la mezcla fermentada por una tela fina o colador, previamente esterilizado, para eliminar la levadura y la pulpa residuales. Estandarizado: es una etapa opcional que se hace agregando alcohol, en diferentes proporciones, segn la clase de vino que se requiera. Si es un vino generoso, el volumen de alcohol est entre el 15 y 25%, pero si es una bebida espirituosa el contenido es de 30 a 50%. Envasado: por lo general, se hace en botellas de vidrio. Los envases deben esterilizarse sumergindolos en agua caliente (95 C) durante 10 minutos. Sellado: el sellado puede hacerse manual o mecnicamente. Es frecuente que el tapn de la botella sea de corcho. 1. PREPARACIN DEL MOSTO: 1. CONSIDERACIONES DE LA MATERIA PRIMA (ARAZ) PARA EL MOSTO EN LA ELABORACION DE VINO DE ARAZ:

Composicin y propiedades de los sustratos de la materia prima (Araz) a ser fermentados

Slidos solubles totales pH Acidez total

4.34 Bx 2.88 2.661 % Ac. Ctrico 10

Nitrgeno Fsforo Potasio Calcio Magnesio Sodio Manganeso

152.7 mg/100 g pulpa 9.0 mg/100g pulpa 215.3 mg/100g pulpa 19.3 mg/100g pulpa 10.3 mg/100g pulpa 0.8 mg/100g pulpa 13 ppm /100g pulpa

Cobre

5 ppm/100g pulpa

Hierro Zinc

87 ppm/100g pulpa 11 ppm/100g pulpa

Segn la tabla anterior el araz no aporta con un contenido significativo de azcar que las bacterias puedan fermentar por lo que vamos a proceder a la chaptalizacin para alcanzar los 200 g/ L de azcar en el mosto. El araz cuenta con la cantidad necesaria de nitrgeno por lo que no va a ser aadido en el mosto.

El pH no ser corregido pues al valor indicado en la tabla el proceso de fermentacin no se ver afectado por el crecimiento de otros microorganismos acompaantes en el inicio a la fermentacin.

1.

MEZCLA EN LAS SIGUIENTES PROPORCIONES:

1L de pulpa 2L de agua 0.22mg /L de levadura 1. de azcar para alcanzar 22Bx 100 mg/L NH4SO4 11

1.

CARACTERIZACIN ESPERADA DEL VINO DE ARAZ

Caractersticas fsicas vino de araz

Aroma y Sabor Color

Araz Blanco

Caractersticas qumicas vino araz Slidos solubles totales pH GL 10 Bx 3-3.5 Esperado 14 Mn 11.5 Azcar residual Acidez voltil Acidez total Extracto seco Densidad 1. 1-2 g/L 0.2g/L 5-8 g/L 20-25g/L 0.990-0.995 g/cc

FUNDAMENTO DE LOS METODOS DE AISLAMIENTO, SELECCIN Y CONSERVACION DE LAS CEPAS FERMENTADORAS EN EL VINO DE ARAZ 1. AISLAMIENTO

Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de fuentes naturales o de una coleccin de cultivos. Si el organismo a utilizar es aislado de fuentes naturales como agua, suelo, plantas y desechos, la eleccin del material de partida puede hacerse teniendo en cuenta que el organismo exprese en ese ambiente las propiedades que son de inters. Por ejemplo, en suelos tratados con pesticidas se podran encontrar organismos adaptados a la degradacin de estos productos qumicos; o en larvas de insectos muertos agentes causales de la muerte.

12

Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de xito dependen de la tcnica elegida para el mismo Aislamiento directo: en este caso es deseable que el medio que se utiliza para el aislamiento permita la mxima expresin del material gentico del organismo.

2.

ENRIQUECIMIENTO DEL CULTIVO

Esta tcnica consiste en incrementar en una poblacin mixta el nmero de organismos de inters en relacin al resto. De esta forma se busca favorecer el crecimiento de un tipo dado de microorganismos mediante condiciones de cultivo adecuadas al mismo, o de condiciones inapropiadas para el desarrollo de los otros. Esto se logra mediante el empleo de sustratos especficos o ciertos inhibidores. Para mantener la fuerza selectiva del medio, el cual se modifica por el crecimiento del organismo buscado, se realizan subcultivos peridicos en medio fresco. Esto lleva a que el organismo de inters sea el dominante de la poblacin, lo cual facilita su posterior aislamiento en medio slido.

2.

SELECCIN

Para seleccionar una cepa de S. cerevisiae para utilizarla como iniciador de fermentacin se parte de un nmero elevado de cepas diferentes aplicando una seleccin masiva por competencia. Este mtodo de seleccin se basa en la propia competencia entre las cepas por los nutrientes del medio, para elegir aqullas que tengan una mejor capacidad fermentativa. En nuestro caso tambin se emple para la seleccin la temperatura de fermentacin, el pH del mosto, la cantidad de minerales y nitrgeno que las levaduras necesitan para su crecimiento, la resistencia al alcohol producido y la finalizacin correcta del proceso y los anlisis organolpticos del vino.

Caractersticas deseables y no deseables de cepas que van a ser aisladas 1. 2. 3. 4. 5. 6. Alta tolerancia al etanol Total degradacin de los azcares fermentables Resistencia al SO2 Capacidad fermentativa a bajas temperaturas Mxima reduccin de la fase de latencia Degradacin del cido mlico 13

7. 8. 9. 10. 11.

Capacidad fermentativa a altas presiones Produccin de SO2 Produccin de H2S Produccin de acidez voltil Produccin de acetaldehdo y piruvato

Primer paso: Para seleccionar una levadura propia de una fruta, el primer paso es conocer la flora autctona de esta fruta. Se ha confirmado que muchas cepas de Saccharomyces llevan a cabo las fermentaciones alcohlicas espontneas, aunque muy pocas son predominantes al final de fermentacin. Para realizar un estudio ecolgico, se debe hacer un seguimiento de fermentaciones espontneas que se realicen en el proceso fermentativo a estudiar. Evidentemente es muy importante que se trate de fermentaciones espontneas, pero no slo eso, sino que se elijan para este estudio, si es posible, mostos que no hayan sido inoculados, porque as se garantiza que las cepas que se aislarn sern cepas autctonas de esta fruta.

Segundo paso: Una vez que se tiene una coleccin de cepas aisladas de la fermentacin de la fruta, el siguiente paso es la identificacin de estas cepas. Aunque la especie principal y responsable de la fermentacin alcohlica es Saccharomyces cerevisiae, en las fermentaciones espontneas, tambin se encuentran otras especies, sobretodo en las primeras fases del proceso (cepas de Candida, Hansenioaspora, Metschnikowia, etc.). Por tanto, la primera diferenciacin que debe realizarse es a nivel de especie, mediante medios selectivos, concretamente en el medio lisina. Se utiliza este medio porque las cepas de Saccharomyces no pueden crecer en un medio donde la lisina sea la nica fuente de nitrgeno. La mayora de las cepas de no Saccharomyces, en cambio, crecen sin problema.

Proceso de seleccin Los criterios utilizados hasta ahora para la seleccin de cepas consistan en una sucesin de pruebas para determinar la ausencia o presencia de determinados caracteres que se consideraban importantes en cepas vnicas. Estas pruebas se realizaban inicialmente con todas las cepas, para segn se iban aplicando los diferentes criterios, ir descartando cepas. Algunos de los criterios ms utilizados son: factor killer, tiempo de fermentacin, capacidad 14

fermentativa en mostos con elevadas concentraciones de azcares, formacin de H2S, formacin de espuma, etc.

1.

Fermentaciones masivas por competencia.

Se elige un nmero definido de cepas de Saccharomyces, se inoculan en un mismo fermentador y se hace un seguimiento de cmo evolucionan estas cepas a lo largo de la fermentacin. La poblacin inicial de todas las cepas es la misma, para que todas tengan las mismas posibilidades de imposicin. El nmero de cepas a analizar depender de las cepas aisladas, pero no sera aconsejable utilizar un nmero superior a 20 cepas.

2.

Medio de fermentacin

Las fermentaciones se hacen a escala de laboratorio, es decir, en pequeos fermentadores. Para ello, lo ideal es utilizar mosto concentrado diluido, ya que tiene todos los nutrientes necesarios para una correcta fermentacin. Adems, al utilizar este mosto concentrado se puede regular la concentracin de azcares, lo cual ya supone una caracterstica adicional de seleccin al poderse fijar unas condiciones ms o menos restrictivas de fermentacin.

3.

Fermentaciones individuales en el laboratorio

Aunque parezca de poca importancia, se trata de un paso bsico, ya que el hecho de que una cepa se haya impuesto en una fermentacin masiva, no garantiza que pueda realizar una fermentacin completa por ella sola. Adems, se tiene que analizar las caractersticas organolpticas del vino obtenido con cada cepa, cosa que hasta ahora no se haba podido hacer, porque al ser un conjunto de cepas no se poda saber qu cepa era la que proporcionaba las diferentes caractersticas, ya fueran favorables o desfavorables.

Despus de haber hecho las pruebas en el laboratorio y por tanto, haber comprobado qu cepas presentan: Buena capacidad fermentativa (estudio de la velocidad y duracin la de fermentacin) Resistencia a altas concentraciones de azcares (debido a las caractersticas particulares de la zona de seleccin) Resistencia a altas concentraciones de etanol 15

 Produccin de glicerol, steres, alcoholes superiores Baja acidez voltil Resistencia a SO2

Se realiza una cata, y se eligen las cepas que adems de fermentar correctamente, tengan un mejor perfil cromtico, aromtico y gustativo.

1.

MANTENIMIENTO O CONSERVACIN DE LOS CULTIVOS

Los objetivos de la conservacin de los cultivos se podran resumir en los siguientes aspectos: a. preservar la pureza gentica del cultivo sin prdida de ninguna de sus propiedades bioqumicas; b. preservar los niveles de su productividad inicial; c. lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad. Esto ltimo puede ser un factor esencial en la seleccin de un mtodo de preservacin.

En todo trabajo de Microbiologa se deben conocer las caractersticas de la poblacin con la cual se va a trabajar (propiedades morfolgicas y bioqumicas). En este sentido, tanto en la conservacin como en el desarrollo del cultivo, ya sea el que suministra o el que recibe la cepa, deberan usar las mismas tcnicas metodolgicas. Tanto para el mantenimiento, preparacin y propagacin de inculos se deben usar mtodos reproducibles que no produzcan variaciones o prdidas de las caractersticas de la cepa empleada.

El conocimiento de las caractersticas del cultivo es esencial en la eleccin de un mtodo de preservacin. La identidad del cultivo puede conocerse en base a sus caractersticas de crecimiento en uno o ms medios especficos, tomando en consideracin propiedades macro y microscpicas exhibidas, o en base a una evaluacin ms exhaustiva empleando muchos ensayos bioqumicos, biolgicos, inmunolgicos y genticos. En general los cultivos no son estudiados en detalle debido a la casi imposibilidad de determinar en cada etapa si ha habido o no alteracin gentica. En la mayora de las situaciones solamente se pueden notar cambios mensurables m observables tales como pigmentacin, morfologa, reacciones fermentativas, propiedades microscpicas, etc. El anlisis de estos parmetros junto con la determinacin cuantitativa del recuento de colonias 16

antes y despus del proceso de mantenimiento brinda la informacin necesaria para la correcta evaluacin de la tcnica de conservacin a elegir.

2.

TECNICA A UTILIZAR EN EL AISLAMIENTO, SELECCIN Y CONSERVACION DE CEPAS DE LA FERMENTACION PARA ELABORACION DE VINO DE ARAZ 1. TECNICA PARA AISLAMIENTO

El aislamiento se realiza segn caractersticas morfolgicas de las levaduras que fermentan el mosto. Se aislara cepas del proceso de fermentacin del mosto de araz. 2. METODO DE ENRIQUECIMENTO

El mtodo de enriquecimiento bsicamente es el mosto propio hecho de araz que contiene todos los nutrientes como son: Nitrgeno (mg/100g de pulpa): 152,7 Fsforo mg/100g de pulpa): 9,0 Potasio mg/100g de pulpa): 215,3 Azucares: 0.54% debido al bajo contenido de azucares debemos colocar como nutriente hasta llegar a 24Brix que son los ptimos para que se realice una buena fermentacin con un optimo rendimiento en obtencin de alcohol 3. 1. TECNICA DE AISLAMIENTO EN MEDIO SELECTIVO

Se realiza en medio de cultivo especifico para levaduras Medio YPDA con un pH ajustado de 3.4-5 con HCl o semejante al medio de enriquecimiento ya que la fruta es muy acida. La siembra es por estriado. Esta tcnica nos permitir seleccin puras de cepas de levaduras fermentadoras de mosto de araz 1. CONSERVACION

2. 3.

Se conserva las cepas a -80C en crioviales con un agente crioprotector como la glicerol al 5%. Primeramente se lleva a una temperatura de -30C por dos horas y luego a la temperatura de 80C 1.
1.

BIBLIOGRAFIA:
Gua completa de alimentos, Knemann Verlagsgesellschaft mbH, Bonner Str.126, D50968 Kln, Alemania, 1999. Pg. 129

17

1.

1.

Seleccin de levaduras: Mas, M. J. Torija, G. Beltrn, M. Novo, N. Hierro, M., Poblet, N. Rozs y J. M. Guillamn-Unitat De enologia del Centro de Referencia en Tecnologa de los Alimentos. Facultad de Enologa de Tarragona biologia.edu.ar/aislamiento de cepas/htm

2.

ANEXOS:

DIAGRAMA DE FLUJO DE ELABORACION DE VINO DE ARAZ

18

Esquema del aislamiento e identificacin de las cepas de levaduras que llevan a cabo la fermentacin alcohlica 19

20