PLASMA RICO EN PLAQUETAS (PRP) COMO SISTEMA DE ENTREGA LOCAL DE ANTIBITICOS EN INFECCIONES OSEAS

(ESTUDIO IN VITRO) INTRODUCCIN: Mltiples bacterias son causantes de infecciones musculoesquelticas. El agente patgeno depende de la edad del paciente, va de inoculacin, circunstancias en las cuales se produjo la infeccin y respuesta inmune del organismo. En recin nacidos y hasta los 6 meses predominan el Staphylococcus, Streptococcus spp .y bacterias Gram negativas. En nios de 6 meses a 3 aos el Haemophilus influenzae tipo B, es igual de frecuente que el Staphylococcus y Streptococcus. Desde los 3 aos hasta la adolescencia los principales agentes son nuevamente el Staphylococcus SPP y el Streptococcus SPP. Durante la adolescencia la Neisseria gonorrhoeae esta ocasionalmente implicada en infecciones musculoesquelticas. Los microorganismos que predominan en infecciones de prtesis e implantes, adems de osteomielitis y artritis sptica son el Staphylococcus aureus y el Staphylococcus coagulasa negativo.5-8. La idea de utilizar cemento de (PMMA) como una forma de antibiticoterapia local fue introducida en la literatura por Buchholz y colaboradores en 1970, con la incorporacin de un antibitico con el cemento seo4. Se desarrollaron perlas de (PMMA) impregnadas en gentamicina, las cuales se encuentran disponibles comercialmente desde 1977. Este sistema de quimioterapia local se utiliza como mezcla de cemento con antibitico, utilizado en artroplastias o como cadenas de perlas impregnadas de antibitico en infecciones musculoesquelticas. El xito de este sistema se atribuye a que el (PMMA) no genera respuesta inmune en el husped, y a que la forma de perlas le confiere una amplia rea de superficie y facilita la rpida liberacin del antibitico. La seleccin del antibitico que puede ser aplicado en estas preparaciones depende de su estabilidad ante temperaturas elevadas (mas de 100 C) a la cual ocurre la polimerizacin del PMMA, los aminogluccidos por ser estables a dicha temperatura son ampliamente utilizados en estas preparaciones. Estudios in vitro han demostrado que los aminoglucsidos y las quinolonas se liberan a mayores concentraciones que otros antibiticos, alcanzando su pico de liberacin durante el primer da, a medida que el cemento pierde su viscosidad se incrementa la liberacin del antibitico. In vivo, el suero, fluidos inflamatorios y antibitico forman al rededor del cemento un seroma en el cual se encuentran altas concentraciones de antibitico que alcanza su pico de concentracin durante el primer da y continua liberndose durante 28 das. La gentamicina se encuentra en altas concentraciones 2 o 3 centmetros alrededor del implante, mientras que en la circulacin sistmica su concentracin es muy baja o casi indetectable disminuyendo su toxicidad.4

El cemento acrlico mezclado con antibiticos se usa en el tratamiento de artroplastias infectadas y como profilaxis en dichos procedimientos. En el caso de infecciones de prtesis de cadera con perdida amplia de la parte proximal del fmur se utilizan prtesis de cemento cargado con antibitico 4. Muchas de las bacterias implicadas en la osteomielitis crnica, particularmente el S.epidermidis y algunas cepas de S.aureus, producen un glucocalix que limita la actividad de los antibiticos, este glucocalix hace que la bacteria se adhiera a cuerpos extraos como las perlas de PMMA, esto produce recurrencia de la infeccin y le confiere resistencia a la bacteria.4-10-11-12-13-14 3.4.2 Esponjas colgeno gentamicina Las esponjas de colgeno gentamicina tambin se encuentran disponibles comercialmente y su uso es tan popular en algunos sitios como el PMMA en el tratamiento de infecciones seas crnicas. Se producen a partir de tendn bovino esterilizado en el cual se introduce gentamicina. La esterilizacin del tendn se realiza con oxido de etileno o con radiacin gamma, las esterilizadas con oxido de etileno alcanzan mayor concentracin local de antibitico que las esterilizadas con radiacin gamma, pero estas ultimas facilitan la degradacin de la esponja. La gentamicina es liberada a mayores concentraciones que las alcanzadas con el PMMA. El antibitico se difunde desde la esponja a partir de su implantacin pero principalmente desde la degradacin del colgeno causada por las colagenasas producidas por los macrfagos. La degradacin se completa en 8 semanas, pero estudios in vitro demuestran que la liberacin del antibitico puede completarse en solo 4 das.4 3.4.3 Polmetros de acido lctico El cido lctico polimerizado es un promisorio sistema de transporte de antibiticos en la prctica clnica. Sus principales ventajas son que es biodegradable y que los antibiticos que libera tienen farmacocintica adecuada. Tiene dos formas: perlas compuestas de cido polilctico / poligliclico y dilctico polimerizado de varios pesos moleculares. Los copolmeros de polilctico y poligliclico se producen con relaciones entre los dos compuestos que van desde 90: 10 y 50: 50 respectivamente. Su degradacin se produce por su descomposicin al pH de los fluidos corporales. Los polmeros con relacin 90:10 tienen mejor estabilidad, descomposicin tarda y producen ms altos niveles de concentracin de clindamicina, vancomicina y tobramicina, que los polmeros con otras relaciones entre sus componentes. En osteomielitis experimental en perros, los polmeros 50:50 con gentamicina muestran resultados similares que las perlas de PMMA gentamicina y mejores resultados que los logrados con gentamicina endovenosa.

Los polmeros de cido lctico de diferentes pesos moleculares han mostrado ventajas en cuanto al transporte y liberacin de quinolonas, sobre otros sistemas de transporte. Las quinolonas se consideran antibiticos de eleccin en la osteomielitis crnica debido a su buena penetracin en tejidos con pobre vascularizacin, y su efecto bactericida sobre todos los probables agentes patgenos causantes de osteomielitis crnica. Estudios in vitro han demostrado que con polmeros de bajo, medio y alto peso molecular ( 2, 26 y 100 kD) , a los cuales se les incorpora ciprofloxacina , pefloxacina y fleroxacina a concentraciones del 10 %, se obtiene liberacin sostenida de dichos antibiticos por periodos mas prolongados y a mas altas concentraciones que utilizando todos los otros tipos de transportadores. Las quinolonas son liberadas a concentraciones que exceden 100 a 1000 veces la concentracin inhibitoria mnima para los principales agentes patgenos implicados en la osteomielitis crnica, el pico de liberacin se presenta en el primer da en los polmeros de bajo y medio peso molecular 20-50kD respectivamente. En los polmeros de 100 kD se observa liberacin sostenida de ciprofloxacina que alcanza los 350 das. 15-4

3.4.4 Sistemas miscelneos Otros sistemas incluyen, bloques de apatita wollastonita, bloques de hidroxiapatita y poliuretanos biomdicos. Los bloques de apatita wollastonita ,existen en dos formas: una con porosidad del 20 al 30 % , otra con porosidad del 70%, se aplicaron en un estudio piloto en 5 pacientes con artroplastias infectadas, se observaron excelentes resultados dos aos despus de iniciado el tratamiento y el material implantado indujo osteognesis y radiolgicamente se observo reparacin del defecto seo. Resultados similares se obtuvieron con bloques de hidroxiapatita con arbekacin, en cuanto a reparacin del defecto y erradicacin de la infeccin causada por estafilococo aureus en osteomielitis crnica. Solo existen datos in vitro para poliuretanos biomdicos como transportadores de flucloxacilina, fosfomicina, ciprofloxacina y gentamicina, liberando estos agentes por cortos periodos, a concentraciones anlogas a la cantidad de antibitico incorporado. Otro mtodo que presenta resultados favorables es el uso de autoinjertos de hueso esponjoso mezclado con antibiticos, el objetivo es manejar la osteomielitis crnica con una sola intervencin quirrgica. Chan y colaboradores reportaron resultados de 36 fracturas infectadas luego de accidentes de transito en las cuales luego de realizar desbridamiento quirrgico se aplico injerto de cresta iliaca en el sitio del defecto seo

mezclado con piperacilina y/o vancomicina dependiendo de la susceptibilidad del microorganismo aislado. Las fracturas se consolidaron en 4 meses y la nica complicacin fue erupcin cutnea.4-16 El concepto de una sustancia que poda inducir una nueva formacin de hueso fue reconocido por Marshall R. Urist en 1965 1, quien llam a este fenmeno el principio de induccin sea. Posteriormente identific la protena capaz de tales efectos que fue llamada protena sea morfogentica (POM o BMP), este hallazgo abri el camino para una serie de investigaciones que arrojaron como resultado un mejor entendimiento del proceso de la reparacin sea y de los mltiples factores que intervienen en l1. Varios experimentos se han conducido para obtener esos factores de crecimiento de diversos tejidos animales, una vez logrado esto se intent aislarlos de una forma autloga, eliminando as el riesgo de reacciones adversas. El paso siguiente fue purificar los factores de crecimiento con el fin de llevarlos en concentraciones elevadas al sitio de lesin para promover la reparacin del tejido de una forma ms eficiente y rpida. Una de las alternativas encontradas es el gel de plasma rico en plaquetas (PRP) desarrollado a inicios de la dcada de los 90 como un producto paralelo de la plasmafresis por Gible y Ness, quienes describieron inicialmente el pegante de fibrina (sellante de fibrina o gel de fibrina). Dicho pegante fue propuesto como un adhesivo biolgico autlogo impermeable al agua que aseguraba una buena hemostasia local, fijaba tejidos y sellaba grandes espacios muertos, previniendo que se presentaran filtraciones cutneas y disminuyendo la posibilidad de infeccin de la herida al actuar como barrera sellante.17-18 Posteriormente se combin un plasma concentrado de plaquetas con fibrina y calcio, capaz de formar rpidamente un gel viscoso rico en plaquetas al que se denomin Gel de Plasma Rico en Plaquetas.17 Al alcanzarse una comprensin mayor de las propiedades regenerativas de los factores de crecimiento derivados de las plaquetas, quienes actan de manera sinrgica para acelerar la tasa y velocidad de curacin de los tejidos, se presentaron varios reportes iniciales de carcter anecdtico acerca de su uso en varias aplicaciones curativas.17 Como otros adhesivos derivados de la fibrina, el gel rico en plaquetas se utiliz extensivamente en tejidos blandos (rasgaduras de duramadre, quemaduras, injertos cutneos, ciruga de bypass coronario, fstulas bronquiales, anastomosis esofgicas, tratamiento de ulceras de decbito, ulceras del pie diabtico, etc.). Sin embargo, sus mayores estudios y aplicaciones se han hecho en el campo de los implantes dentales y ciruga maxilofacial, cuya primera referencia data en 1982 por Matras, donde el gel rico en plaquetas se us en aplicaciones junto con tejido seo, ya que adems de servir como transporte de factores de crecimiento, es un medio que permite mantener los injertos seos en una determinada forma, facilitando la implantacin de prtesis dentales y

cirugas de reconstruccin maxilar y mandibular. El mismo autor en 1998 report resultados satisfactorios con el uso de PRP en injertos seos, demostrando gran densidad sea y calidad de los injertos.2 En ciruga ortopdica sus aplicaciones han sido varias, incluyendo las artroplastias totales de cadera y rodilla, fusiones espinales, correcciones de escoliosis, laminectomas, fracturas, no uniones y defectos seos. Se cree que los factores de crecimiento inician la cascada de osteognesis en el sitio de la intervencin, y favorecen una mayor velocidad de mineralizacin del colgeno en las reparaciones seas y en los sitios de injerto. Adems promueven una integracin mas rpida de los mismos (en aproximadamente 2 meses). Tambin mejoran la densidad sea de las trabculas (15 a 30%), y tienen una accin como osteoinductores al crear una trama que facilita el desplazamiento de los osteoblastos. Actualmente se ha establecido que las propiedades de los Plasmas Ricos en Plaquetas estn basadas en la produccin y liberacin de mltiples factores de crecimiento y diferenciacin luego de la activacin de las plaquetas. Estos factores son crticos en la regulacin y estimulacin del proceso de curacin de las heridas y juegan un papel importante regulando procesos celulares tales como la mitognesis, quimiotaxis, diferenciacin y metabolismo.17 El PRP obtenido de sangre del propio paciente es utilizado para concentrar factores de crecimiento hasta un 33.8% por encima de los valores encontrados en el plasma normal y es aplicado posteriormente en los tejidos buscando potenciar la cascada biolgica de la osteoinduccin. El gel de PRP es formado con la mezcla de PRP obtenido con la centrifugacin de la sangre autloga, con trombina y cloruro de calcio, contiene un compuesto de fibringeno y plaquetas activadas (por la adicin de la trombina), lo cual determina la liberacin de una cascada de factores de crecimiento de los grnulos de las plaquetas. La tcnica utilizada ms comnmente a nivel mundial para la comprobacin de la sensibilidad antibacteriana es la prueba de difusin de disco, la cual produce un resultado cuantitativo (zonas o dimetros de inhibicin) y una categora interpretativa cualitativa (sensible o resistente). Una vez demostradas las grandes ventajas de las tcnicas de dilucin en caldo, el paso siguiente, pensando sobre todo en poder realizar fcilmente pruebas de sensibilidad de un microorganismo frente a mltiples antibiticos a la vez, consisti en buscar la manera de aplicar la idea directamente a las placas de agar.

Las primeras pruebas se realizaron inoculando la superficie de una placa de agar con el microorganismo en estudio, colocando pequeas cubetas (de metal o vidrio) sobre el agar y agregando las soluciones de los diferentes antimicrobianos dentro de dichas cubetas. Los agentes antimicrobianos difundan en el medio en forma radial alrededor de la cubeta e inhiban el desarrollo del microorganismo en la zona donde su concentracin era suficientemente alta. Las reas de inhibicin grandes indicaban una actividad antimicrobiana ms efectiva. Este mtodo fue modificado en 1947 por Bondi y colaboradore. incorporando el agente antimicrobiano a discos de papel de filtro. Fue un paso adelante gigantesco ya que el uso de los discos de papel permita preparar un gran nmero de pruebas idnticas y almacenarlas para uso futuro. En 1966, despus de los estudios realizados por Bauer, Kirby, Sherris y Turk, ensayando diferentes cepas bacterianas, el empleo de los discos de papel de filtro para las pruebas de sensibilidad fue estandarizado y correlacionado definitivamente con las concentracin inhibitoria mnima correspondientes. Durante muchos aos, y a pesar de ser una tcnica puramente cualitativa, el mtodo de difusin por disco (o mtodo Kirby-Bauer), en funcin sobre todo de su comodidad, economa y fiabilidad, ha sido, y aun es, uno de los ms utilizados en los laboratorios de todo el mundo. El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar y sobre su superficie se disponen los discos correspondientes a varios antibiticos. Se incuban las placas durante 16-24 horas a 35 C y al cabo de este tiempo se estudia el crecimiento en ellas. Se valora el dimetro de la zona de inhibicin que se forma alrededor de cada disco y se compara con las referencias publicadas por el NCCLS/CLSI. Con esta referencia podemos informar si el microorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente (S, I, R) a cada uno de los antibiticos ensayados en las placas. 20-21 Determinar si el gel de plasma rico en plaquetas (PRP) como sistema de transporte y liberacin local de antibiticos inhibe el crecimiento in vitro de Staphylococcus aureus, por el mtodo de difusin en agar, y, evaluar la inhibicin del crecimiento in vitro de Staphylococcus aureus producida por el gel de PRP suplementado con un antibitico (oxacilina, ciprofloxacina, gentamicina o vancomicina) por medio de la tcnica de difusin en agar, siguiendo los parmetros establecidos por el CLSI 200721. MATERIALES Y METODOS 9.1 Estandarizacin del mtodo de obtencin del plasma rico en plaquetas.

Se tomaron 30 ml de sangre total de donante voluntario para cada una de las pruebas, los cuales se recolectaron en tubos de ensayo con citrato para prevenir su coagulacin, inmediatamente la sangre total se centrifug a distintas revoluciones y tiempos y a cada una de las muestras se le hizo recuento de plaquetas por mtodo automatizado ADIVA60 Bayer. 9.2 Estandarizacin del volumen de PRP y de la activacin del plasma rico en plaquetas Para lograr obtener un gel de PRP que se pudiera manipular y sembrar en los medios de cultivo se realiz una prueba con 6 muestras de 500 l de PRP, a cada una se le agrego un volumen distinto de (CaCl2 10%) 1l, 2l, 3l, 5l, 7l, 15 l y se estableci el tiempo y las caractersticas del coagulo que se formaba. 9.3 Diluciones de los antibiticos Para determinar el volumen de antibitico necesario para lograr las diferentes concentraciones se tuvo en cuenta el volumen de cada muestra de PRP mas el volumen del activador (520 l) y 10 diluciones seriadas en base dos (de la dilucin 32 hasta la dilucin 0.06) preparadas a partir de una solucin stock de 10.000 g\ml.

9.4 Mezcla del PRP-activador antibitico y obtencin del gel En placa de 24 pozos, se mezclaron 492 l de PRP con 15 l de activador, y 13 l de cada una de las diluciones del antibitico. Como control negativo tomamos 492 l de PRP con 15 l de activador sin antibitico. Con cada antibitico la prueba se realizo por triplicado, obteniendo 80 muestras, y 24 controles negativos. (Figura 1). Las muestras se dejaron en incubacin a temperatura ambiente por 25 minutos formando cogulos que posteriormente se sembraron en los medios de cultivo.

A C

Figura 1. Mezcla de las muestras en placa de 24 pozos A. PRP activado y mezclado con vancomicina B. PRP activado y mezclado con oxacilina. C. PRP sin antibitico (control negativo)

9.5 Siembra de Staphylococcus aureus ATCC 29213 en medio de cultivo MuellerHinton. Se tom una muestra de cultivo de Staphylococcus aureus ATCC 29213, y se diluy en solucin salina 0.9 %, mediante espectrofotometria, con una longitud de onda de 625 nm y se obtuvo absorbancia equivalente al estndar 0.5 en la escala de Mcfarland. Se impregn un escobilln de algodn estril con la suspensin, contra la pared interna del tubo se elimin el exceso de liquido, se sembr uniformemente sobre los cuatro cuadrantes de la superficie del medio de cultivo y sobre el permetro de la caja21. 9. 6 Siembra de las muestras y los sensidiscos en los medios de cultivo. Con puntas plsticas se tomaron los cogulos de cada uno de los pozos y se sembraron en el medio de cultivo distribuyndolos en forma progresiva segn la dilucin del antibitico que contenan y a una distancia que evitara la interferencia de cada uno de los halos de inhibicin producidos. Se molde el cogulo para darle una forma esfrica que generara halos de inhibicin de forma circular que se pudieran medir, puesto que en algunas pruebas preliminares al sembrar cogulos de forma irregular los halos de inhibicin no eran circulares y no se podan medir. En cada caja se sembr un sensidisco del antibitico estudiado como control positivo y una muestra de PRP con activador sin antibitico como control negativo (Figura 2). Los cultivos se incubaron a 37 C durante 24 horas para realizar la medicin de los halos de inhibicin.

C C 1 A B C C

Figura 2. Siembra de las muestras. A. sensidisco de gentamicina como control positivo. B .PRP sin antibitico como control negativo C. PRP con diluciones distintas de antibitico. 9.7 Recoleccin de datos Se midieron los halos de inhibicin formados por cada muestra y se consignaron en el instrumento de recoleccin (Anexo 1). 10. RESULTADOS 10.1 Estandarizacin de la obtencin de PRP. La mayor concentracin de plaquetas se logr con centrifugacin a 3.000 rpm por 5 minutos obteniendo un recuento de plaquetas de 700.000 por mm3 (Tabla 1)

Tabla 1. Concentracin de plaquetas obtenidas con diferentes tiempos y rpm.

Muestra Tiempo de centrifugado Revoluciones /minuto Concentracin plaquetas por mm 3

1 2 3

5 minutos 10 minutos 10 minutos

3000 rpm 3000 rpm 1000 rpm

700.000 650.000 525.000

10.2 Estandarizacin del volumen de PRP y de la activacin del plasma rico en plaquetas. El volumen de PRP con el que se pudo obtener un coagulo de tamao adecuado fue de 500 l. Con 15 l de activador se logr una consistencia adecuada del coagulo, se midi el tiempo de su obtencin el cual fue de 25- 30 minutos. 10.3 Inhibicin del crecimiento bacteriano obtenido con PRP y vancomicina

Se obtuvo inhibicin del crecimiento bacteriano utilizando concentraciones de vancomicina, de 8, 16 y 32 g /ml. El promedio de los halos de cada concentracin fue de 8.1 mm, 9.3 mm, y 11.6 mm respectivamente. Con la concentracin mas alta la inhibicin fue de 73% con respecto al control positivo . Los 6 controles negativos no generaron inhibicin del crecimiento bacteriano. (Tabla 2), (Grafica 1), (Figura 3). Tabla 2. Resultados obtenidos con vancomicina Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3 Promedio inhibicin en inhibicin en inhibicin en inhibicin en mm mm mm mm 11 13 11 11.6 32 9 10 9 9.3 16 8 8 8 8.1 8 0 0 0 0 4 0 0 0 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0.5 0 0 0 0 0.25 0 0 0 0 0.125 0 0 0 0 0.06 16 16 16 16 D1 16 16 16 16 D2 0 0 0 0 PRP1 0 0 0 0 PRP2 D1 -D2 Sensidiscos de vancomicina (OXOID) 30 g. (sensible halo mayor 15) PRP1PRP2 Plasma rico en plaquetas sin antibitico (control negativo) Dilucin

Grafica No 1. Dimetro del halo de inhibicin (mm) para diferentes concentraciones de Vancomicina
18 16 100%

Diametro del halo (mm)

14 12 10 8 6 4 2 0 ctr - 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 ctr + 51% 58% 73%

Concentracin de vancomicina (g/mL)

ctr- (control negativo PRP sin antibitico) ctr+ (control positivo sensidisco)

C1 B

C5

C4 C2

C3

Figura 3 Halos de inhibicin producidos por vancomicina

A sensidisco de vancomicina control positivo. B. PRP sin antibiotico control negativo. C. PRP con antibiotico,( C1 dil 32,C2 dil 16, C3 dil 8, C4 dil 4, C5 dil 2.) 10.4 Inhibicin del crecimiento bacteriano obtenido con PRP y oxacilina Con oxacilina se obtuvo inhibicin del crecimiento bacteriano, a partir de la dilucin 2. El promedio del dimetro del halo de inhibicin obtenido con la dilucin mas alta ( 32), fue superior al halo de inhibicin del sensidisco (20.3mm contra ,20 mm) 102%. Los 6 controles de PRP no produjeron inhibicin del crecimiento bacteriano. (Tabla 3), (Grafica 2).

Tabla 3 resultados obtenidos con oxacilina Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3 Promedio inhibicion en inhibicion en inhibicion en inhibicion en mm mm mm mm 16 22 23 20.3 32 15 20 16 17 16 18 18 16 17.3 8 11 13 10 11.3 4 9 7 7 7.6 2 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0.5 0 0 0 0 0.25 0 0 0 0 0.125 0 0 0 0 0.06 20 20 20 20 D1 20 20 20 20 D2 0 0 0 0 Prp1 0 0 0 0 Prp2 D1 -D2 Sensidiscos de oxacilina (OXOID) 1 g. (sensible halo mayor a 13 mm) PRP1-PRP2 Plasma rico en plaquetas sin antibitico (control negativo) Dilucion

Grafica No 2. Dimetro del halo de inhibicin (mm) para diferentes concentraciones de oxacilina

25

Diametro del halo (mm)

102% 100% 20 87% 85%

15 57% 10 38%

0 ctr0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 ctr+

Concentracin de oxacilina (g/mL)

ctr- : (control PRP sin antibiotico) ctr+ (control positivo sensidisco)

10.5 Inhibicin del crecimiento bacteriano obtenido con PRP y gentamicina Al evaluar el PRP con gentamicina se obtuvo inhibicin del crecimiento bacteriano, desde la dilucin 2, diluciones menores no produjeron inhibicin. La inhibicin producida por la concentracin mas alta fue de 16.6 mm, se alcanzo el 83 % del dimetro de inhibicin del sensidisco empleado 20 mm. Los controles de PRP no generaron inhibicin del crecimiento bacteriano. (Tabla No 4), (Grafica No 3).

Tabla 4 Resultados obtenidos con gentamicina Dilucion Prueba 1 inhibicion en mm 19 18 16 15 11 0 0 0 0 0 20 20 0 0 Prueba 2 inhibicion en mm 15 14 10 9 7 0 0 0 0 0 20 20 0 0 Prueba 3 inhibicion en mm 16 12 9 9 7 0 0 0 0 0 20 20 0 0 Promedio inhibicion en mm 16.6 14.6 11.6 11 8.3 0 0 0 0 0 20 20 0 0

32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.06 D1 D2 Prp1 Prp2

D1 -D2 Sensidiscos de Gentamicina (OXOID)10 g. (sensible halo mayor a 12 mm) PRP1-PRP2 Plasma rico en plaquetas sin antibitico (control negativo)

Grafica No 3. Dimetro del halo de inhibicin (mm) para diferentes concentracines de Gentamicina

Dimetro del halo (mm)

25 20 15 10 5 0 ctr- 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 42% 73% 55% 58% 83%

100%

ctr+

Concentracin de Gentamicina (g/mL)

ctr- : (control PRP sin antibiotico) . ctr +: (sensidisco de gentamicina) 10.6 Inhibicin del crecimiento bacteriano obtenido con PRP y ciprofloxacina Con ciprofloxacina se produjo inhibicin con las concentraciones 4, 8, 16, 32, el promedio de la medida del halo formado por la dilucin 32 fue de 18.6, correspondiente al 69 % del halo generado por el sensidisco el cual fue de 27 mm. Ninguno de los controles negativos produjo inhibicin. (Tabla 5), (Grafica 4).

Tabla 5. Resultados obtenidos con ciprofloxacina Dilucion Prueba 1 inhibicion en mm 14 18 18 10 0 0 0 Prueba 2 inhibicion en mm 20 19 16 11 0 0 0 Prueba 3 inhibicion en mm 22 19 19 15 0 0 0 Promedio inhibicion en mm 18.6 18.6 17.6 12 0 0 0

32 16 8 4 2 1 0.5

0 0 0 0 0.25 0 0 0 0 0.125 0 0 0 0 0.06 25 27 27 26.3 D1 26 28 27 27 D2 0 0 0 0 Prp1 0 0 0 0 Prp2 D1 -D2 Sensidiscos de ciprofloxacina (OXOID)5 g. (sensible halo mayor a 21 mm) PRP1-PRP2 Plasma rico en plaquetas sin antibitico (control negativo)

Grafica No 4. Dimetro del halo de inhibicin (mm) para diferentes concentracines de Ciprofloxacina

30

100%

Dimetro del halo (mm)

25 20 15 10 5 0 ctr- 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 ctr+ 44% 65% 69% 69%

Concentracin de Ciprofloxacina (g/mL)

ctr- : (control negativo PRP sin antibiotico) ctr+ (control positivo sensidisco) DISCUSIN El primer paso para realizar este estudio fue establecer la metodologa para obtener PRP con concentraciones adecuadas de plaquetas, y un volumen suficiente para realizar el total de las pruebas propuestas. La concentracin de plaquetas fue un factor determinante en la formacin del gel, de PRP. Al evaluar plasma con concentraciones bajas de plaquetas se aumenta el tiempo para su formacin, y disminuye su volumen, lo cual a su vez influye sobre la capacidad para transportar y liberar antibitico. Posiblemente con preparados que tengan mayores concentraciones de plaquetas, el volumen y la calidad del coagulo aumenten y por ende tambin su capacidad de difundir antibitico al medio. El volumen de activador para preparar PRP ya esta establecido sin embargo, para el estudio fue necesario utilizar un volumen de activador, que permitiera formar un coagulo adecuado para ser manipulado, evaluamos el PRP activado sin antibitico, sin observar inhibicin del crecimiento bacteriano. Tambin evaluamos en el medio de cultivo el plasma restante de la separacin del coagulo de cada antibiotico en las diluciones mas

altas, y tampoco observamos inhibicin. De esta manera se evidencia que ni el plasma rico en plaquetas por si solo, ni su activador tienen efecto inhibitorio sobre el crecimiento bacteriano. El PRP activado y mezclado con antibiotico forma redes de fibrina que absorben el antibitico y lo liberan controladamente al medio. Encontramos que los cuatro antibiticos evaluados fueron transportados y liberados, por el gel de PRP produciendo inhibicin del crecimiento bacteriano en las mayores concentraciones, ninguno produjo inhibicin por debajo de la dilucin 1, solamente la oxacilina en dilucin 32 produjo un halo de inhibicin mayor que el sensidisco, este resultado fue consistente en las tres pruebas que se le realizaron. En contraste la vancomicina genero los halos de inhibicin de menor dimetro y la ciprofloxacina obtuvo el porcentaje mas bajo con respecto la difusin del sensidisco, este comportamiento heterogneo, sugiere que cada antibiotico tiene una capacidad de difusin propia la cual debe ser tenida en cuenta si se quiere emplear el gel de PRP como transportador. Para el estudio la forma de obtener PRP con mayor concentracin, con volumen suficiente para obtener las muestras fue centrifugando la sangre a 3000 rpm por 5 minutos. Para obtener cogulos de suficiente volumen y consistencia se mezclan 500l de PRP ,con 15 l de activador y un periodo de incubacin de 25- 30 minutos. Al sembrar el coagulo en el medio de cultivo este se debe moldear con las puntas plasticas, de forma esfrica , para que produzca halos de inhibicin medibles. El gel de plasma rico en plaquetas por si solo no inhibe el crecimiento staphylococcus aureus, en los medios de cultivo utilizados en este estudio. El gel de PRP transporta y libera antibiticos, produciendo inhibicin del crecimiento de staphylococcus aureus in vitro. Las concentraciones con las cuales se produjo inhibicin del crecimiento de staphylococcus aureus fueron altas, no se produjo inhibicin con concentraciones menores a 2. La liberacin local del antibiotico, y por ende su actividad inhibitoria in vitro frente a staphylococcus aureus, depende de las caractersticas del coagulo formado y de la capacidad de difusin de cada antibitico.

Para establecer adecuadamente una relacin entre la inhibicin lograda con el gel de PRP y una medida de referencia con el mtodo de difusin en agar, es necesario medir la cantidad de antibiotico presente en cada muestra de PRP. La oxacilina tiene mayor capacidad de dilucin a partir del PRP, que otros antibiticos, por ende la dosis requerida es mas baja. La ciprofloxacina presento la menor capacidad de inhibicin. Este estudio genera las bases, para estudios experimentales y clnicos posteriores que evalen la utilidad del gel de PRP como sistema de transporte y liberacin local de antibiticos. No se conoce exactamente el volumen de cada una de las muestras de PRP, por tal motivo tampoco se conoce la cantidad de antibitico que contiene, lo cual no permite comparar de manera adecuada la inhibicin producida por el PRP, con la inhibicin estandarizada de cada sensidisco como referente de susceptibilidad de la bacteria. Se propone que en estudios posteriores se debe medir la cantidad de antibitico de cada muestra para poder establecer una relacin objetiva entre la muestra y el control. Una de las caractersticas principales de los transportadores de antibiticos utilizados clnicamente es la liberacin sostenida del antibitico en el medio durante varios das o aun meses en algunos casos, basados en este estudio se debera realizar la medicin de la inhibicin del crecimiento bacteriano producida por el PRP suplementado con antibitico, cambindolo de medio de cultivo cada determinado periodo, correlacionando tiempo e inhibicin. Es necesario establecer que sucede con las plaquetas al mezclar el PRP con antibitico, no sabemos si varan sus cualidades osteoinductoras y regenerativas. Se puede evaluar clnicamente el PRP mezclado con antibitico realizando un estudio en ulceras cutneas infectadas de difcil manejo, ya que se podran evaluar con observacin directa sus resultados.

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