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A vida nas pontas

O que mantm a estabilidade do material gentico de gerao em gerao? Por cerca de 60 anos, a cincia buscou a resposta para essa pergunta aparentemente simples, mas com importantes conseqncias. Ela foi encontrada na extremidade dos cromossomos, em um trecho de DNA que pode ser comparado fita plstica que sela as pontas dos cadaros de um sapato. Esse trecho, que ganhou o nome de telmero, tornou-se desde sua descoberta o foco de ateno de uma das reas mais instigantes da pesquisa biolgica.

Maria Isabel Nogueira Cano Departamento de Gentica, Instituto de Biocincias, Universidade Estadual Paulista (Botucatu)

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dos cromossomos

Todo o material gentico contido no ncleo de uma clula, seja de um organismo unicelular (como protozorios e vrios fungos e algas) ou multicelular (como insetos, plantas, rpteis, mamferos e outros), est compactado em estruturas denominadas cromossomos, termo que significa corpos coloridos (do grego chroma = cor e soma = corpo). Os cromossomos, que variam em tamanho, forma e nmero em cada uma das diferentes espcies, so compostos essencialmente de DNA e protenas associadas. Neles, portanto, est toda a informao gentica que caracteriza e diferencia tanto as clulas e os tecidos quanto todos os seres vivos. Essas informaes so transmitidas pelos diferentes seres s novas geraes, que para crescer multiplicam suas clulas em um processo denominado mitose. Na mitose, uma clula-me, aps duplicar toda a sua estrutura, inclusive os cromossomos, divide-se originando duas clulas-filhas idnticas a ela. Para que toda a informao gentica seja transmitida com sucesso, os cromossomos devem ser cpias fiis dos que estavam na clula-me. O DNA existente em um cromossomo contm os genes, mensagens codificadas na forma de seqncias de nucleotdeos (tijolos bsicos que compem o material gentico das clulas), onde esto as instrues para a formao de todas as clulas e tecidos do nosso corpo e para a sntese de protenas (responsveis por todos os processos biolgicos), alm de outras seqncias capazes de sintetizar mensageiros que atuam na regulao de processos celulares e reas que no carregam qualquer tipo de instruo, ou codificao.
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Figura 1. Localizao dos centrmeros e dos telmeros em cromossomos humanos: na ilustrao, as linhas indicam a posio dos centrmeros e dos telmeros no cromossomo, e no detalhe (fotografia) os cromossomos aparecem com seu corpo corado em azul e os telmeros, situados em suas pontas, corados em rosa

Entre as estruturas que o DNA no-codificador forma nos cromossomos esto os centrmeros e os telmeros. Os centrmeros permitem a separao exata dos cromossomos duplicados durante a diviso celular que gera as clulas-filhas. J os telmeros (do grego telos = fim e meros = parte), localizados nas pontas dos cromossomos, funcionam como capas protetoras dessas extremidades, tendo papel muito importante na manuteno da integridade do genoma. Eles impedem, por exemplo, a fuso de terminais de diferentes cromossomos e a degradao destes por enzimas que, na falta dos terminais, reconheceriam o material cromossmico como DNA danificado (figura 1). Em nossos sapatos, quando os pedaos de fita adesiva que selam as pontas dos cadaros se desprendem, estes comeam a desfiar,

desmanchando-se. Em uma clula, ocorre o mesmo com os cromossomos que tm seus telmeros danificados: eles tendem a ser destrudos e, nesse processo, a clula morre.

Primeiras pesquisas sobre telmeros

O interesse pela compreenso das propriedades dos telmeros comeou no final dos anos 1930, com trabalhos pioneiros dos geneticistas norte-americanos Hermann Mller (1890-1967) e Barbara McClintock (1902-1992) bem antes, portanto, que o mdico

Figura 2. O problema da replicao nos terminais dos cromossomos: na maioria das clulas, a extremidade de uma das fitas do cromossomo (fita de baixo, no desenho) fica mais curta a cada diviso celular porque as enzimas que duplicam o DNA no conseguem finalizar sua sntese. Isso ocorre porque a parte da molcula dessas enzimas que se liga extremidade do DNA para iniciar a sntese degradada ao final do processo, deixando um fragmento sem fita complementar (indicado pelo retngulo em vermelho)

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Figura 3. Os telmeros humanos apresentam uma seqncia de nucleotdeos em que o terminal da fita mais longa do DNA (em cima) rico em guanina (letra G), e a fita mais curta (em baixo) complementar primeira e rica em citosina (letra C). Os telmeros so encontrados com esse terminal livre (I) ou formando um arranjo em lao (t-loop, em ingls) (II), presente nos cromossomos de alguns eucariotos (os corpos coloridos representam protenas telomricas que mantm essa estrutura)

canadense (radicado nos Estados Unidos) Oswald Avery (1877-1955) identificasse, em 1944, o DNA como o material hereditrio. Muller e McClintock definiram os telmeros como estruturas funcionais que protegem os terminais dos cromossomos. Com a descoberta, em meados dos anos 50, dos princpios que regem a duplicao do DNA e a revelao de que as enzimas responsveis pelo processo no so capazes de finalizar a replicao dos terminais dos cromossomos (figura 2), um novo dogma surgiu na biologia, trazendo vrias questes no menos importantes. A pergunta principal era: Como a replicao do DNA finalizada nos terminais dos cromossomos? Isso porque era sabido que, se esses trechos no fossem mantidos, em cada evento de replicao as clulas perderiam pores de cromossomos a partir das extremidades. Assim, imaginando que cada poro perdida tivesse 16 repeties da seqncia TTAGGG (as letras representam grupos qumicos componentes do DNA) e que os telmeros contivessem duas mil repeties dessa seqncia, ao final de 125 divises celulares eles desapareceriam por completo. E que destino teriam as clulas com cromossomos progressivamente mais curtos? Por terem um genoma menor e totalmente instvel, elas provavelmente entrariam em um estado irreversvel de incapacidade de proliferao conhecido como senescncia replicativa ou envelhecimento celular, como veremos adiante. Dois bilogos, o norte-americano James Watson e o russo Alexei Olovnikov, foram os primeiros a propor, no incio dos anos 70, possveis solues para esse caso. Eles descobriram que molculas circulares de DNA evitam o problema juntando-se e formando um colar antes da replicao, sem deixar terminais livres. Olovnikov sugeriu, inclusive, que as perdas de DNA nos terminais dos cromossomos

seriam responsveis por uma limitao da capacidade replicativa das clulas humanas o que reconhecido hoje como uma das principais funes dos telmeros. Para entender melhor essas estruturas terminais, a bioqumica australiana (naturalizada norte-americana) Elizabeth H. Blackburn, durante seu doutorado na Universidade Yale, em meados dos anos 70, no laboratrio do bilogo norte-americano Joseph Gall, seqenciou os telmeros de ciliados (protozorios unicelulares) e descobriu que eles so formados por centenas de repeties de DNA que, em uma fita, tm a seqncia de nucleotdeos 5-GGGGTT3, e na fita complementar exibem a seqncia 5CCCCAA-3 as duas fitas do DNA so complementares (C sempre faz par com G e A com T) e dispostas em antiparalelo (os nmeros 5 e 3 indicam, por conveno, as extremidades das fitas e a sntese do DNA ocorre sempre no sentido 5 3). Hoje, sabe-se que todos os telmeros terminam com uma extenso curta da repetio telomrica (figura 3A) rica em nucleotdeos formados pela base guanina (G). Est provado experimentalmente que essa extenso forma um tipo mais complexo de arranjo, em lao (figura 3B), em pelo menos metade dos cromossomos de mamferos, de leveduras (fungos) e de tripanossomas (protozorios). Embora os achados de Blackburn e Gall no tenham resolvido de imediato a questo do trmino da replicao do DNA, eles deram pistas para que se comprovasse a conservao dessas estruturas durante a evoluo. Bastou identificar os telmeros de organismos evolutivamente distantes e comparar suas seqncias para confirmar isso. Os telmeros de humanos e de alguns protozorios primitivos (como leishmanias e tripanossomas), por exemplo, so formados pela seqncia 5-TTAGGG-3.
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Surge a soluo: a descoberta da telomerase

A primeira pista de que algum fenmeno especial possibilitava a replicao dos terminais de cromossomos surgiu em 1982. O bioqumico norte-americano David Prescott mostrou que, durante uma das fases de desenvolvimento de ciliados, seu genoma se fragmenta e, nesse momento, seqncias telomricas so adicionadas aos terminais dos cromossomos. Dois anos depois, outros achados comprovaram esse processo. Duas pesquisas nos Estados Unidos revelaram que seqncias telomricas do ciliado Tetrahymena podiam substituir os telmeros da levedura Saccharomyces e que esta tambm era capaz de adicionar suas repeties telomricas aos terminais dos cromossomos desse ciliado. Um terceiro achado, de um grupo de cientistas holandeses, mostrou que telmeros de tripanossomas que causam a doena do sono ficavam progressivamente mais longos a cada diviso celular durante a infeco no hospedeiro mamfero. Todos esses resultados indicavam claramente que os terminais dos cromossomos ganhavam seqncias por um mecanismo aparentemente comum a organismos diferentes e, ao mesmo tempo, especial e desconhecido.

Vrias hipteses foram ento lanadas para explicar essa regenerao dos telmeros, at que em 1985, na Universidade da Califrnia (em Berkeley), a biloga norte-americana Carol Greider, estudante de doutorado sob orientao de Elizabeth Blackburn, descobriu uma enzima que adicionava DNA telomrico aos terminais dos cromossomos de Tetrahymena. A enzima ganhou o nome sugestivo de telomerase. Essas pesquisadoras, e depois vrios outros cientistas, mostraram experimentalmente que a telomerase formada por um componente protico um tipo de enzima denominado transcriptase reversa e por uma molcula de RNA, que contm o molde invertido (uma seqncia de nucleotdeos complementar) da seqncia telomrica rica em guanina encontrada nos terminais de todos os cromossomos. O componente protico faz a cpia complementar desse molde e a adiciona ao terminal 3 dos cromossomos. Quando a adio de uma repetio inteira finalizada, a telomerase desloca-se ao longo da extremidade do cromossomo e posicionase de forma a reiniciar a sntese (figura 4). O descobrimento da telomerase resolveu o problema da replicao dos trechos terminais de molculas lineares de DNA. E a atividade dessa enzima foi detectada em inmeros organismos, de mamferos a leveduras, incluindo os protozorios que causam malria, leishmaniose, doena de Chagas e doena do sono. Alm disso, demonstrou-se que organismos ou clulas com mutaes nos genes que codificam o componente protico e o RNA da te-

Figura 4. Replicao dos telmeros. A telomerase (I) formada por um componente protico (estrutura em roxo) e por uma molcula de RNA (seqncia de letras, em preto), que contm uma seqncia-molde, complementar a mais de uma repetio telomrica (seqncia em branco, em II). Quando a telomerase liga-se ao telmero (III), ocorre o pareamento dos nucleotdeos deste e do molde contido no RNA, ligando citosina com guanina (C-G) e uracila com alanina (U-A) (em molculas de RNA, a timina encontrada no DNA substituda por uracila), e novos nucleotdeos (em amarelo) so adicionados ao telmero. Em cada ciclo de replicao, uma nova repetio telomrica (a seqncia TTAGGG) surge no fim do cromossomo. Em seguida, a telomerase desloca-se sobre o telmero (IV) para iniciar um novo ciclo de replicao ou desliga-se do cromossomo, encerrando sua ao
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Figura 5. Relao entre o tamanho dos telmeros e a capacidade de proliferao celular: clulas germinativas (no diferenciadas linha amarela) tm telmeros longos e multiplicam-se indeterminadamente, enquanto clulas somticas (j diferenciadas linha laranja) dividem-se por 50-60 geraes e perdem seus telmeros gradualmente (o limite de Hayflick o momento em que a maioria das clulas somticas mostra sinais de envelhecimento). Clulas em crise que j acumularam diferentes mutaes morrem ou reativam a telomerase, tornando-se imortais. O encurtamento acelerado dos telmeros (linha roxa) ocorre em muitas sndromes relacionadas ao envelhecimento prematuro. Indivduos portadores dessas sndromes apresentam precocemente patologias associadas apenas a idosos

lomerase perdem a capacidade de se dividir e envelhecem rapidamente, comprovando a importncia biolgica da enzima.

Telomerase e proliferao celular

A maioria das clulas humanas somticas (ou seja, j diferenciadas) apresenta normalmente pouca ou nenhuma atividade de telomerase. Isso significa que, embora essas clulas contenham o gene que codifica a enzima, ele est silencioso (inativo), no sendo capaz de produzi-la. Portanto, tais clulas se dividem por apenas 50 a 60 geraes antes que seus telmeros fiquem muito curtos para dar proteo aos cromossomos. Quando alguns desses terminais chegam a um limite mnimo de tamanho (caracterstico para cada clula), isso sinaliza a parada das divises celulares e o incio do envelhecimento. Esse ponto crtico, conhecido como limite de Hayflick (figura 5), uma das razes que explicam por que no podemos viver para sempre! Existem, porm, clulas normais com alta capacidade proliferativa, como clulas germinativas jovens (esperma e vulo no maduros), clulas-tronco embrionrias e algumas clulas somticas. Entre estas esto as clulas endoteliais (que revestem o corao e os vasos sangneos e linfticos), as clulas endometriais (que revestem o tero) em adultos e os linfcitos T e B (tipos de glbulos brancos) quando induzidos proliferao. Nestas, ao contrrio do que ocorre na maioria das clulas somticas, a telomerase se mantm ativa.

Entretanto, aquelas clulas que no tm esse poder de proliferao e que transpem o chamado limite de crise reativam a atividade de telomerase e continuam a se dividir indefinidamente. Tais clulas so consideradas imortais, e isso o que acontece com 85% a 90% das clulas cancergenas. A atividade ininterrupta da telomerase verificada nas clulas tumorais tambm encontrada na maioria dos eucariotos (organismos cujas clulas tm ncleo definido) unicelulares. Assim, tais organismos tambm apresentam uma capacidade infinita de multiplicao quando em condies propcias no meio ambiente ou no hospedeiro, sendo considerados imortais. Essa condio s pode ser alterada se eles estiverem em meio no adequado para sua sobrevivncia.

O papel dos telmeros no cncer

Como foi mostrado, a capacidade proliferativa das clulas est diretamente associada atividade da telomerase. Assim, clulas somticas senescentes que passaram a se dividir indefinidamente apresentam alta atividade de telomerase e perda de controle sobre o ciclo celular. Aliado a isso elas tm telmeros curtos e acumulam vrios tipos de mutaes (figura 5). Em conseqncia, a cada diviso celular ocorre uma diminuio gradual da integridade de seus cromossomos, levando instabilidade do genoma e, por isso, ao acionamento da maquinaria de reparo da clula. Esta interpreta que o DNA cromossmico est defeituoso ou quebrado e passa
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Figura 6. Clulas HeLa em cultura dividindo-se, em imagem obtida com microscpio eletrnico

a reparar esses danos promovendo, por exemplo, a fuso entre os terminais. Ao que parece, a somatria desses efeitos que determina uma das primeiras etapas do desenvolvimento de alguns tipos de cncer e a formao de tumores. Um exemplo de que clulas cancergenas so imortais a linhagem celular denominada HeLa, originada de clulas extradas em 1951 de um cncer cervical da norte-americana Henrietta Lacks (1920-1951). Mais de 50 anos depois, essas clulas

ainda so utilizadas em laboratrio, j que possvel mant-las indefinidamente em frascos de cultura (figura 6). Como a telomerase necessria para a imortalizao da maioria das clulas de tumores e importante para a multiplicao de organismos unicelulares, essa enzima considerada um bom alvo para o desenvolvimento no s de drogas contra o cncer e outras doenas, mas tambm de mtodos no-invasivos de diagnstico precoce do cncer. Terapias experimentais que visam inibir a ao da telomerase tm sido aplicadas em animais de laboratrio e algumas j comeam a ser testadas em pacientes humanos. Alteraes nos genes que instruem a sntese dos componentes da telomerase e outros mtodos tambm podero, no futuro, dar origem a tratamentos para doenas (ver Mais plos em camundongos e Telmeros e leishmaniose). A inibio da telomerase, no entanto, no poder ser usada como terapia nos 10% a 15% de tumores malignos em que a telomerase no reativada. Essas clulas cancergenas usam um mecanismo conhecido como alongamento alternativo dos telmeros (ALT, na sigla em ingls), que adiciona novas seqncias aos terminais cromossmicos permutando DNA entre telmeros de cromossomos diferentes. Esse processo j havia sido proposto h muitos anos,

NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH

MAIS PLOS EM CAMUNDONGOS

Pesquisadores da Universidade Stanford, nos Estados Unidos, mostraram, em artigo publicado recentemente pela revista cientfica britnica Nature, os efeitos provocados pela ativao localizada de um gene extra do componente protico da telomerase em um camundongo. Esse gene foi ativado especificamente em clulas epiteliais presentes na pele do animal. Isso resultou em rpida transio do ciclo de crescimento dos plos, levando proliferao de clulas-tronco que estavam em repouso na regio do folculo piloso (estrutura que d origem ao plo). Aps algum tempo, os animais transgnicos estavam abundantemente peludos, se comparados aos no transgnicos. Como essa funo da telomerase no envolve o componente RNA, pode ser considerada um mecanismo independente de manuteno dos telmeros, o que abre a possibilidade de que, no futuro, essa enzima tambm seja utilizada em terapias para a recuperao de queimados e de doenas associadas a danos nos tecidos e ao envelhecimento.

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TELMEROS E LEISHMANIOSE
O Laboratrio de Telmeros do Departamento de Gentica da Universidade Estadual Paulista em Botucatu pioneiro em pesquisas com telmeros de protozorios patognicos, principalmente os causadores da leishmaniose em humanos e animais domsticos. O objetivo encontrar meios de utilizar a telomerase e outras protenas telomricas como novos e potenciais alvos para o desenvolvimento de terapias antiparasitrias, incluindo o desenho de drogas de baixa toxicidade para o hospedeiro e mais eficazes no combate doena. A leishmaniose, doena infecciosa transmitida pela picada de um inseto, pode se manifestar de diferentes formas clnicas e mais grave em hospedeiros com o sistema imunolgico enfraquecido. O nmero crescente de casos da doena em transplantados e em portadores do vrus HIV tem alarmado as comunidades mdica e cientfica. Alm disso, a Organizao Mundial da Sade considera a leishmaniose uma das doenas cuja incidncia mais cresce na atualidade (juntamente com a dengue e a malria), pois para ela no existem mtodos eficazes de preveno, diagnstico e tratamento.

quando ainda se discutia como eram mantidos os terminais dos cromossomos.

O relgio molecular das clulas

O envelhecimento celular ou senescncia um processo que ocorre constantemente com a maioria das clulas somticas humanas e com alguns microrganismos eucariotos que se multiplicam por diviso celular simples. Esse processo ocorre aps um nmero determinado de geraes e se caracteriza por perda da capacidade de diviso, estresse oxidativo (acmulo no organismo de radicais livres, grupos qumicos altamente reativos capazes de destruir molculas orgnicas) e ausncia da atividade de telomerase. Resultados de muitas pesquisas sugerem que o encurtamento dos telmeros funciona como um relgio molecular que registra quantas vezes as clulas se duplicaram (ver Telmeros: relgios do envelhecimento, em CH n 137). Quando esse encurtamento atinge um ponto crtico, o crescimento celular interrompido, culminando na senescncia e na induo da morte da clula. Acredita-se que telmeros curtos em clulas que ainda tm capacidade proliferativa seriam responsveis por alguns dos fenmenos que associamos ao envelhecimento normal. Em geral, o que se sabe que, em cultura, clulas de um feto dividem-se mais vezes que as de uma criana, que por sua vez dividem-se mais vezes que as de um adulto. A primeira evidncia direta de que o tamanho dos telmeros determina a capacidade proliferativa

das clulas humanas surgiu no final dos anos 90, em experimentos realizados pela corporao norteamericana Geron. Seus pesquisadores introduziram um gene ativo da telomerase em fibroblastos humanos normais (clulas do tecido conjuntivo que produzem substncias importantes para a sustentao do corpo, como colgeno e elastina). Nos fibroblastos, o gene da telomerase normalmente est inativo. Com a expresso desse gene ativo, essas clulas voltaram a apresentar atividade de telomerase e aumentaram muito o nmero limite de duplicaes em cultura, de 60 para quase uma centena. Alm disso, essas clulas mantiveram o nmero correto de cromossomos, continuaram crescendo de forma normal e no apresentaram sinais de carcinognese. Essa funo dos telmeros ficou mais clara com a clonagem da ovelha Dolly, nascida em 1996, a partir de clulas de glndula mamria de ovelha adulta (clulas somticas). Dolly nasceu com telmeros menores que os de animais concebidos de forma natural e, aos seis anos, j apresentava artrite e doena pulmonar progressiva, enfermidades incomuns para sua idade cronolgica. Vale mencionar que indivduos acometidos por doenas genticas como a sndrome de Werner (causada por deficincias na maquinaria de reparo envolvida com os telmeros) e disqueratose congnita (DKC, causada por uma deficincia na telomerase) apresentam envelhecimento prematuro. Entretanto, ainda no est totalmente claro se o tamanho dos telmeros est relacionado idade biolgica de indivduos normais. A principal funo da telomerase, portanto, parece ser a manuteno da estabilidade dos telmeros e das divises celulares, o que pode levar a importantes descobertas relacionadas ao processo de envelhecimento e ao reparo de tecidos danificados.

SUGESTES PARA LEITURA

BLACKBURN, E.H. The end of the (DNA) line, in Nature Structural Biology, v. 7, p. 847, 2000. BLASCO, M.A. Telomeres and human disease: ageing, cancer and beyond, in Nature Reviews Genetics, v. 6, p. 611, 2005. CANO, M.I.N. Telomere biology of trypanosomatids: more questions than answers, in Trends in Parasitology, v. 17(9), p. 425, 2001. LEWIS, J.; ALBERTS, B. & BRAY, D. Biologia molecular da clula, Porto Alegre, Artmed, 2004.

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