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LABORATORIO DE PATOLOGA CLNICA FACULTAD DEVETERINARIA Y ZOOTECNIA Prctica N3 Pruebas de Coagulacin 1.

Introduccin:
La hemostasia es el mecanismo de defensa por medio del cual organismo se defiende ante la lesin micro/macro de un vaso sanguneo. En este proceso intervienen varios componentes:

Pared Vascular (vasoconstriccin) Plaquetas Protenas plasmticas y tisulares (Factores de Coagulacin)

El fenmeno de hemostasia se puede dividir en las siguientes fases

Adhesin plaquetaria al vaso sanguneo Agregacin plaquetaria Formacin de Fibrina Fibrinlisis

Es difcil reconocer medir y separar las diferentes etapas de la coagulacin en forma individual ya que la gran mayora de ellas interactan entre si mismas o son generadoras de las siguientes. Por lo mencionado la coagulacin normal de la sangre se produce a travs de una reaccin en cascada en la que intervienen 12 factores de la sangre (Factor VII, Factor V, Factor II, Factor XII, etc.). Esta reaccin se activa cuando existe una lesin en el interior de un vaso sanguneo o del tejido que lo rodea (vas intrnseca y extrnseca de la coagulacin) pero que acaban convergiendo en la va comn de la coagulacin, con la formacin final de un cogulo que tapona la lesin y evita la hemorragia. La secuencia de pasos que se suceden en la coagulacin se ve alterada si uno solo de los factores que participan en ella est ausente o no realiza correctamente su funcin es por eso que el examen o estudio de las pruebas de coagulacin contempla una serie de anlisis destinados a entregar informacin acerca de uno o ms procesos de la coagulacin Un perfil de coagulacin esta normalmente incluido en un examen pre operatorio en el que por razones obvias se necesita saber cual es el riesgo de perdida de sangre sin compensacin por parte del animal. Tambin es necesario realizar un estudio de coagulacin en pacientes que presentan entre sus signos: Petequias Equimosis Hematomas Purpuras Melena (sin causa aparente) Hematuria (sin causa aparente)

Hipema Celo permanente

Entre las principales pruebas de coagulacin que se pueden usar en Veterinaria tenemos Recuento y morfologa plaquetaria Tiempo de Coagulacin Tiempo de Protrombina (TP) Tiempo Parcial de Tromboplastina Activada (TTPK o TTPA) Tiempo de Coagulacin Tiempo de Sangra

Otros exmenes ms especficos pero de menor frecuencia de uso en veterinaria son:

Productos de Degradacin del Fibringeno (PDF) Test Dmeros D Tiempo de Retraccin de Coagulo Prueba de lisis de Coagulo Prueba de Antitrombina III Factor VIII Relacionado antgeno Tiempo de Trombina Anticuerpos antiplaquetares

Uso de Anticoagulantes en estudios de coagulacin: Como su


nombre lo indica son sustancias que previenen la formacin de cogulos. Estos son de vital importancia ya que se necesita tener los compoentes plaquetarios y precursores de la cascada de coagulacin lo mas intactos posibles para su posterior estudio. Existen diversos tipos los cuales pueden tener presentacin en polvo o lquido. Para el estudio de las pruebas de coagulacin se prefiere usar el citrato de Sodio excepto para el recuento de plaquetas que se necesita EDTA como anticoagulante.

2. Desarrollo de la practica Recuento de Plaquetas (Estimacin en base a frotis de lmina) Unidad de Expresin: miles/ul, x 103/ul, x 109/L Propsito del anlisis: Se busca hallar el promedio o nmero aproximado de plaquetas, de esta manera poder ver si hay una
disminucin o aumento. En medicina veterinaria es mucho ms comn encontrar una disminucin que un aumento en su nmero. Adems

mediante esta tcnica se podr las alteraciones en tamao, color, forma, etc que nos indique alguna alteracin en su gnesis. Metodologa del anlisis:
Se buscar estimar el nmero de plaquetas mediante un frotis sanguneo, si bien este mtodo es menos exacto que el recuento de plaquetas en cmara Neu Bauer, el resultado es comparable entre ambos mtodos.

Materiales:
o o o o Frotis de sangre coloreada con colorante Wright (puede ser la misma del recuento diferencial de leucocitos) Aceite de Inmersin Contador celular manual Microscopio ptico

Procedimiento: Observar el frotis de sangre a microscopio utilizando menores


aumentos (4x 10x), ubicarse en la zona de la cola del frotis. Una vez ajustado el campo visual pasar a mayores aumentos (40 x y 100 x con aceite de inmersin). Ubicar el objetivo del microscopio en campos donde se vean GR uniformemente distribuidos y separados entre s para poder ser fcilmente contados. Nota: Para el recuento de plaquetas es necesario contar cuantas plaquetas hay en 500 1000 glbulos rojos (GR), se elegir contar 1 000 GR. Examinar en el campo la morfologa, tamao, distribucin y color de las plaquetas buscando alguna anormalidad entre ellas Dividir el campo en 4 regiones, en cualquiera de las regiones contar el N de eritrocitos y multiplicarlo por 4 para hallar los GR /campo. Contar las plaquetas encontradas en ese campo Contar los campos necesarios hasta haber contado un nmero aproximado de 1,000 glbulos rojos.

Realizar la sumatoria de todas las plaquetas encontradas en todos

los campos (1000 GR). Multiplicar el nmero de plaquetas encontradas en 1,000GR por la cantidad de GR/ul y dividirlo entre 1000 para expresar el nmero de plaquetas por microlitro

Figura 1:Extendido de sangre coloreando con Wright (100x) en el medio se puede observan una plaqueta.

Tiempo de protrombina (TP): Unidad de Expresin: Segundos Propsito del anlisis: Se realiza para medir indirectamente la presencia y normal funcin de los factores de coagulacin (va extrnseca). Se define como el tiempo en segundos necesario para la formacin del cogulo de fibrina despus de la adicin de calcio y tromboplastina al plasma. Metodologa del anlisis: Si bien existen equipos automatizados capaces de realizar esta prueba, el mtodo manual se considera aceptable y cada laboratorio debe ajustar el tiempo normal de los pacientes.

Materiales: o o o o o o o o o o o o o Aguja N21 x 1 Tubos con anticoagulante (Citrato de Sodio lquido) Tubos de vidrio de 4 x 50 Tubos eppendorf Liga para Hemostasia Neoplastine (Ca + tromboplastina) Micropipeta automtica 10 100 ul Tips para micropipeta de 10 100 ul Beaker de 500 ml com gua corriente Propileno para tubos Termmetro Cronometro Microondas

Procedimiento Hacer hemostasia a nivel del brazo con la liga y aislar la vena ceflica Por medio de la aguja extraer la sangre venosa a un tubo con citrato de Sodio

Nota: la proporcin sangre: anticoagulante deber de ser un aproximado de 9:1. Mezclar por inversin la sangre y el anticoagulante del tubo Llevar el tubo a centrifugacin con su respectivo contrapeso por 5 minutos a una velocidad de 5,000rpm Verificar la separacin de los componentes sanguneos del plasma Con la micropipeta acoplada a su respectivo tip retirar con cuidado la mayor cantidad de plasma posible a un tubo eppendorf. Colocar en el beaker de 400 500 ml de agua corriente y llevarlo por aproximadamente 45 50 segundos a microondas Medir la temperatura del agua con el termmetro y verificar que est exactamente a 37 c, si la temperatura es inferior llevar el beaker con agua por mas tiempo a calentar al microondas, si la temperatura excede los 37c, descartar un poco de agua y agregarle agua fra Rotular dos tubos de 4 x 50 como P (plasma) y N (Neoplastine), en cada uno colocar 200ul de su correspondiente. Colocar en los orificios del propilenos los tubos y luego acoplarlo al Beaker con agua de manera que los 200ul de cada solucin queden sumergidos en el agua temperada a 37 Esperar incubar los componentes por 2 minutos exactamente Con la micro pipeta acoplada a su respectivo tip retirar 100ul de plasma(en una sola toma) y colocarlo en el tubo conteniendo 200 ul de Neoplastine. Nota: Apenas se coloque el plasma en el Neoplastine se deber controlar el tiempo con un cronometro. A los 6 segundos se deber retirar el tubo de incubacin inclinarlo en un ngulo menor de 45 y ver la presencia de un coagulo de fibrina , si es que no se observa se deber regresar rpidamente el tubo a incubacin y repetir el paso anterior cada 2 3 segundos Nota: El tiempo de protrombina resultar de los segundos que demore la prueba en presentar el coagulo de fibrina. Tiempo de Sangra

Unidad de Expresin: Minutos Propsito del anlisis: Evala la integridad endotelial y la interaccin de las plaquetas con los vasos sanguneos y la posterior formacin del tapn plaquetario Metodologa del anlisis: Se estima el tiempo que una lesin endotelial demora en detener el sangrado producto de la manipulacin del operario.

Materiales: o Lanceta o Papel FiltroWhatman o Cronmetro o Gasa Procedimiento: Levantar el labio superior del animal con la ayuda de una gasa Hacer un piquete con la lanceta en la cara interna del labio Activar el cronometro Secar la sangre cada 30 segundos con el papel filtro

Nota: El papel Filtro solo deber tocar la zona circundante al punto de lesin. Se mide el tiempo que transcurre entre la aparicin de la primera gota de sangre y la ltima.

d. Tiempo de Coagulacin Simple Unidad de Expresin: Minutos Propsito del anlisis: Evala el tiempo de formacin de fibrina en la superficie de una gota de sangre. Se evala cualitativamente la funcin de las plaquetas y la capacidad de los factores de coagulacin para la formacin de fibrina. Requiere la confirmacin de un nmero de plaquetas que este en valores promedio. Materiales o Aguja utilizada para la extraccin de sangre o Lmina porta objetos o Cronmetro

Procedimiento: Con la aguja que se extrajo la sangre rpidamente colocar 3 gotas de iguales proporciones una lmina portaobjetos, activar el cronometro. A partir del primer minuto empezar a levantar la gota de sangre ayudado con la aguja, realizarlo cada 30 segundos hasta ver la aparicin del hilo de fibrina.

Cuestionario 1) En que casos se puede producir una trombosis, explique las patologas. 2) Qu grupos de frmacos (ejemplos) pueden alterar la coagulacin sangunea/ 3) Clasifique segn patologas la aparicin de trombocitopenias 4) Cual es la explicacin que se tenga un tiempo elevado de Protrombina en una patologa heptica. Explique la (s) fisiopatologa (s)? 5) Defina el CID y clasifique su aparicin segn las patologas que la producen