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The sequence of the human genome encodes the genetic instructions for human physiology, as
well as rich information about human evolution. In 2001, the International Human Genome
Sequencing Consortium reported a draft sequence of the euchromatic portion of the human
genome. Since then, the international collaboration has worked to convert this draft into a
genome sequence with high accuracy and nearly complete coverage. Here, we report the result
of this finishing process. The current genome sequence (Build 35) contains 2.85 billion
nucleotides interrupted by only 341 gaps. It covers 99% of the euchromatic genome and is
accurate to an error rate of 1 event per 100,000 bases. Many of the remaining euchromatic gaps
are associated with segmental duplications and will require focused work with new methods.
The near-complete sequence, the first for a vertebrate, greatly improves the precision of
biological analyses of the human genome including studies of gene number, birth and death.
Notably, the human genome seems to encode only 20,000–25,000 protein-coding genes. The
genome sequence reported here should serve as a firm foundation for biomedical research in the
decades ahead.
LA MAPPA FISICA DEL GENOMA
STS: corta sequenza di DNA UNICA che viene ottenuta da inserti clonati più lunghi (es: genoteca in fago λ).
λ)
La presenza di un amplificato
indica che nel clone da YAC
è presente la TAG
Se uno stesso amplificato compare
in due diversi cloni da YAC vuol dire
che si sovrappongono e si costituisce
il contig
IL SEQUENZIAMENTO AUTOMATIZZATO DEL DNA
Un
Un esempio:
esempio: ilil clonaggio
clonaggio ee la
la mappatura
mappatura del
del cromosoma
cromosoma
Y
Purificazione di cromosomi Y mediante FACS
VETTORE DI ESPRESSIONE
E’ un vettore di clonazione
Deve permettere, sia la TRASCRIZIONE (=PROMOTORI
trascrizionali),
sia la TRADUZIONE (=SITO DI ATTACCO DEL RIBOSOMA)
del gene
-GLI OSPITI FINALI PIÙ COMODI PER LA PRODUZIONE COMMERCIALE
SONO I BATTERI, IN PARTICOLARE E.coli.
PROTEINE RICOMBINANTI IMPORTANTI PER L’USO TERAPEUTICO UMANO PRODOTTE IN E. coli E APPROVATE DALL’FDA
Interferoni umani Interferone alfa-2b Trattamento di: leucemia a hairy cells; epatite
cronica B e C; AIDS; cancro
-Promotore
-Inizio della trascrizione RNAm
-Terminazione della trascrizione
-Inizio della traduzione proteina
L’inizio e la fine della trascrizione sono molto diversi nei batteri e negli eucarioti
NUCLEO (β
β,β , 2α)
2α)
I batteri hanno un’unica RNA polimerasi
Fattore σ
Sequenza di consenso
-Le regioni più conservate (che interagiscono con il fattore σ) sono nelle regioni -10 e -35
-Le alternative nucleotidiche nelle posizioni -10 e -35 determinano la forza con cui il fattore σ si lega
al promotore e quindi la frequenza con cui il gene verrà trascritto.
E’ un meccanismo regolativo
I promotori sono asimmetrici: l’orientamento del promotore indica quale dei
due filamenti di DNA verrà trascritto
E’ costituito da una sequenza simmetrica di DNA seguita da una fila di coppie A-T
-La RNA-polimerasi II, anche in vitro, non può iniziare a trascrivere senza l’aiuto dei
FATTORI GENERALI DI TRASCRIZIONE
-In vivo, bisogna anche tenere conto del compattamento del DNA nei nucleosomi e in forme
di ordine di struttura superiore
Ingredienti per la trascrizione in vitro in una cellula eucariota
La RNA-polII continua a
polimerizzare anche dopo il taglio
dell’RNAm. Come perde la
processività?
BOH?!?
Anche l’inizio della traduzione è diverso tra batteri ed eucarioti
Negli eucarioti il ribosoma riconosce l’AUG in prossimità del cap presente in 5’ dell’RNAm
I°° RNAt
Lega direttamente
Il Cap
Il complesso si sposta
in 5’ 3’ per cercare
il 1°° AUG
Il sito di attacco del ribosoma nei batteri:
le sequenze Shine Dalgarno
5’-AGGAGGU-3’
terminatore
T= terminatore batterico
T
COME SI REGOLA L’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI?
FORTE REGOLABILE
Sigma
Factor Promoters Recognized Promoter Consensus
−35 Region −10 Region
σ70 Most genes TTGACAT TATAAT
σ32 Genes induced by heat shock TCTCNCCCTTGA CCCCATNTA
σ28 Genes for motility and chemotaxis CTAAA CCGATAT
σ38 Genes for stationary phase and stress response ? ?
−24 Region −12 Region
σ54 Genes for nitrogen metabolism and other functions CTGGNA TTGCA
plac
placUV5: derivato di plac: ha mutazioni in -10 che lo rendono più forte del wild-type
ptrp
PL
cI: repressore di cro, PL e PR
Impedisce la produzione delle proteine
della fase litica
28°°C 42°°C
PLinattivo cIts PL attivo
Come si regola l’espressione genica nei procarioti?
Definizione
Definizione generale
generale
GENE
GENE TARGETING
TARGETING: :pilotare
pilotarelalaricombinazione
ricombinazioneDel
DelDNA
DNAininsiti
sitispecifici
specificidel
delDNA
DNAgenomico
genomico
SiSirealizza
realizzainserendo
inserendonel
nelvettore
vettorenavetta
navettadelle
delleregioni
regionididiomologia
omologiacon
conilil
sito
sitodel
delcromosoma
cromosomainincui
cuisisivuole
vuoleavere
averericombinazione
ricombinazione
≈50bp
linker
Gene E.coli Gene estraneo
RNAm p. di fusione
Proteasi specifica
2) AGEVOLARE LA PURIFICAZIONE
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
es:flag
3) AUMENTO DELLA SOLUBILITA’
Si ottiene fondendo geni codificanti proteine poco solubili con proteine o peptidi altamente solubili
La MUTAGENESI SITO-SPECIFICA
-Si deve sapere esattamente l’esatta sequenza nucleotidica della regione del DNA che codifica il
codone dell’RNAm da modificare
-Il tipo di cambiamento che si vuole apportare (es: GCA ACA=ser ala nello studio della p-Ser)
Si usa un oligonucleotide di
sintesi che ha un nucleotide
discordante dove si vuole
mutagenizzare
LA MUTAGENESI MIRATA AGLI OLIGONUCLEOTIDI CON IL DNA DI M13
dUTPasi: abbassa il
livello di dUTP
Uracile-N-glucosilasi:
Rimuove il dUTP
Incorporato nel DNA
ATT CTT
Ile Leu
LA MUTAGENESI MIRATA AGLI OLIGONUCLEOTIDI CON DNA PLASMIDICO
50/50?
METODO PER ARRICCHIRE IN PLASMIDI MUTAGENIZZATI
NaOH
Klenow+T4+lig
LA MUTAGENESI CASUALE CON INNESCHI OLIGONUCLEOTIDICI
DEGENERATI
Si usa quando non sono note le sostituzioni in grado di modificare la proteina bersaglio
VANTAGGI