INTRODUCCIN En vista del incremento poblacional mundial se espera que la necesidad de aumentos en los prximos aos no podr ser

cubierta por la agricultura convencional, por lo que se est realizando esfuerzos para hallar fuentes proteicas alternativas no convencionales. La idea de usar protena microbiana de bacterias, levaduras, hongos y algas es considerado como una posibilidad para solucionar en parte las carencias proteicas (Bcckcr, i 082). El concepto de utilizacin de protena unicelular es completamente nuevo por cuanto son utilizados en diferentes regiones del mundo, sin embargo, el inters comercial de stas protenas considera un nuevo desarrollo tecnolgico. Las ventajas en la seleccin de un microorganismo como lucnJc de protena unicelular se consideran las siguientes: Utilizacin de sustratos simples orgnicos c inorgnicas. Alta tasa de reproduccin Ricos en protenas, vitaminas y minerales Totalmente comestibles sin problemas de desechos.

Asimismo se consideran las siguientes desventajas: Alto contenido de cidos nuclecos. Pruebas toxicolgicas no totalmente establecidas Mas costosos que las protenas convencionales Palatabilidad y aceptabilidad aun no evaluados totalmente.

Entre las diferentes fuentes de protenas unicelulares, probablemente las microalgas tienen una larga historia como alimento. Ellos prometen ventajas importantes en la produccin de valiosos productos biolgicos por la eficiente utilizacin de la energa solar; sin embargo, los cultivos masivos presentan numerosos problemas asociados con a calidad nutricional, toxicologa y economa de produccin.

Pese a las diversas limitaciones, actualmente las microalgas son comercializadas como

alimento para salud como fuentes de sustancias qumicas valiosas como betacaroteno. Las microalgas son importantes como alimento e ingredientes aditivos en la crianza comercial de muchos animales acuticos, especialmente moluscos, peneidos y alimento vivo como rotferos los que a su vez son utilizados como alimento de larvas de peces y crustceos (Borowitzka, 1997). Con el incremento notorio de la acuicultura de especies animales hay una necesidad incrementada de microalgas apropiadas para la crianza de animales; en tal sentido es necesario obtener adecuadas cepas alales exentas de bacterias patgenas que puedan causar mortalidades. Segn jjorowitzka (1997). en aos recientes so han realizado estudios para determinar los requerimientos nutricionales y la composicin bioqumica de las microalgas con posibilidades de ser usadas como recurso alimenticio y stos estudios han proporcionado una amplia base de datos para la seleccin de especies a ser utilizadas en la acuicultura. Sin embargo, se requiere adems datos sobre la habilidad del animal para alimentarse de las microalgas, sobre la digestibilidad y sobre los requerimientos nutricionales de los animales cultivados. Tambin se requiere conocer costos efectivos den la produccin a gran escala de las microalgas. De acuerdo a Guillare! (1975) se u t i l i z a n 6 clases de microalgas para la crianza de animales en acuicultura (langostinos, camarones, bivalvos, gasterpodos, ostras, peces y rotferos) hitbicmio.se puesto mayor nfasis en le cultivo de microalgas como alimento para larvas de peneidos.

Tabla I. Clases y gneros de microalgas bajo c u l t i v o Clase Baci 11 a riophyceae Genero Skeletonema, Thalassiosira.Phacodacylum

laptophyccac C h ry so ph y ceae Prasinophyceae Chlorophyceae C hryptophyceae Cyanophyceae

Chaetoccros, Ditylum. sochrysis, Dicrateria, Cricosphacra Coceo iilh us. Monochrysis Pyraminimonas, Tet rase! mis, Micromonas. Dunaliclla, Chlorella, Chlorococcum Nannochloris,ChlamydomonasJ3rachiomonas Chroomonas Spirulina

El uso de microalgas en hatcheries de peces es necesaria, para la produccin de presas vivas y el mantenimiento de la calidad del medio de cultivo larval. Tambin puede ser usado en la formulacin de alimento seco para engorde. El uso rotfero Brachionus plicatilis como alimento vivo es un prerrequisito para el xito de hatcheries marinos. El inters de las microalgas se dan en tres niveles: -Rpida recuperacin de la poblacin de rotferos despus de cosechados -Mejora la calidad nutricional del alimento vivo -Menor contaminacin bacteriana especialmente de Vibrio. El uso de mieroalgas permite obtener mejores resultados cu trminos de supervivencia, crecimiento e ndices de transformacin que cuando los

cultivos de peces se hacen cu aguas claras o transparones. Asimismo, la calidad del agua es mejorada y estabilizada por ia produccin de oxgeno,, estabilizacin del pH, etc. La accin de algunos compuestos bioqumicos secretados podran inducir el comportamiento inicial para capturar las

presas ( BorowitzkiK 1997)

Actualmente los costos ele produccin son altos, por lo que se estn evaluando nuevos sistemas de cultivos, por ejemplo, cultivos heterotrficos

en clsicos termentadores, asimismo-, se estn evaluando nuevos mtodos para concentrar, procesar y almacenar la biomasa algal y la obtencin de nuevas cepas con mayor potencial reproductiva.

En el presente trabajo se consignan aspectos bsicos del cultivo y produccin de microalgas va realizacin de ammas experiencias de cultivo de algas marinas a nivel de laboratorio.

LAS MICROALGAS Las microalgas son vegetales provistos de clorofila capaces de sintetizar complejos orgnicos a partir de sustancias muy simples como e agua, anhdrido carbnico y elementos minerales. Constituyen un grupo de plantas simples heterogneas de gran diversidad en tamao, pigmentacin, mecanismos reproductivos, composicin qumica y habtate. Los estudios botnicos han estado relacionados principalmente, con problemas descriptivos de morfologa, reproduccin y clasificacin sistemtica. Las algas son tpicamente organismos acuticos, aunque hay algunas formas terrrestres y ciertas especies estn adaptadas a ambientes especiales. Son abundantes en agua dulce y en el mar, pero algunas estn limitadas a uno u otro ambiente. Al igual que otras plantas verdes, la tpica clula algal contiene ncleo, uno o mas cioroplastos y otras estructuras ms o menos definidas en. un citoplasma Huido o semisliclo. La clorofila y los carotenoides estn localizados en cioroplastos a excepcin de las cianofitas, en las que no hay ncleo definido ni organizacin de cioroplastos. La capa externa del citoplasma est unida a la membrana plasmtica con caractersticas distintivas de permeabilidad que varan ampliamente entre las especies. La clula algal est usualmenle rodeada por una vaina o pared celular y a menudo embebida en una capa mucilaginosa de material pectnico de grosor variable. En algunas especies, la movilidad es proporcionado por uno o dos flagelos y muchas especies son unicelulares y otras permanecen mas o menos unidos permanentemente en una organizacin colonial que puede ser micro o macroscpico- o extendido como un filamento o una lmina plana. Generalmente presentan reproduccin asexual sin embargo cuando se presenta la reproduccin sexual sta es acompaada por cambios cclicos o ciclos de vida que marcan la transicin de una generacin a otra. El inters en la produccin algal se origin en los aos 40, incrementndose durante la II Guerra Mundial en Alemania, Japn, Estados Unidos, Israel y Checoslovaquia.

Actualmente se hallan operando varios sistemas y empresas de tratamiento de desechos y produccin industrial con fines de alimentacin animal y humana. En ste contexto, se han desarrollado importantes industrias florecientes de Chlorella en Japn y Taiwan, usndose las algas en la manufactura de tabletas, extractos y otros alimentos para la salud humana; asimismo, es notorio el avance de las tcnicas de produccin al aire libre de Spirulina en Estados Unidos y otros pases (En Vekataramen, 196 9).

En los aos 70, se realizaron esfuerzos para hallar alternativas de nuevas fuentes energticas en vista de la disminucin y alto costo del abastecimiento de producidos derivados del petrleo 1.a aplicacin biolgica de la energa solar ha concitado inters mundial y como las algas constituyen eficientes sistemas para capturar dicha energa, se lia incrementado el nteres en la tecnologa de la produccin continua de las microalgas. Unido a ste desarrollo se obtendra la ventaja de disminuir la contaminacin ambiental y daos de los desechos industriales, teniendo las microalgas importante rol en la transformacin de desechos v aguas residuales en biomasa con la posibilidad de utilizar el agua resultante, previo tratamiento, en la irrigacin agrcola. Recientemente, os avances tecnolgicos en la rpoduccin algal a gran escala han sido significativos, permitiendo la transferencia tecnolgica de pases desarrollados a pases subdesarrollados. Con Gnes de produccin masiva, las microalgas llenen la gran ventaja sobre los vegetales superiores en su alta tasa de crecimiento y alto contenido de protenas por lo que el uso de las microalgas como suplemento alimenticio presentan las siguientes caractersticas: Tamao microscpico, de 8-10 mieras de largo por 4-6 Se reproducen por divisin directa Son planctnicas aprovechando eficientemente la iluminacin natural. Crecen muy bien en medios inorgnicos simples. CULTIVO DE MICROALGAS El cultivo puro de las microalgas implica la presencia de una sola especie en un recipiente libre de otros microorganismos vivientes, tambin se define como un cultivo de individuos descendientes de una sola clula paren tal. Actualmente se conocen micras de ancho.

varias categoras de cultivos y el trmino " cultivo puro" o "axnico" se refiere a un cultivo que contiene solamente una especie alga! y ausencia de otros microorganismos, y Pringheim (1962) reconoce 6 tipos de cultivos: - Cultivos de conservacin o preservacin en la que los organismos

individuales pueden mantenerse en condiciones similares a las halladas en la naturaleza. -Cultivo grosero o crudo en el que crece un organismo y despus otro por cambios en el medio de cultivo. -Cultivo de acumulacin o enriquecimiento cuando el medio es diseado para favorecer el desarrollo de un grupo de algas. -Cultivo puro cuando contiene solamente una especie algal. -Cultivo puro absoluto cuando contiene nicamente una especie algal libre de oros microorganismos. -Cultivo monocelular o clona! cuando desciende de clulas simples. Los cultivos algales han sido utilizados en investigaciones genticas, morfolgicas, fisiolgicas y bioqumicas: asimismo, una reevaluacin de las limitaciones taxonmicas de muchas formas, polimorfismo, resistencia a antibiticos, variabilidad, teratologa y mutaciones han sido posible mediante los cultivos algales. Por otro lado, el desarrollo de cultivos sincronizados, en las que las diversas fases de crecimiento estn uniformizados,- es importante para la comprensin de diversos fenmenos fisiolgicos y bioqumicos a nivel celular. REQUERIMIENTO GEN ERALES PARA EL CULTIVO DE ALGAS A continuacin se detallan recipientes, materiales y medios necesarios para, realizar cultivos de microalgas a nivel de laboratorio. RECIPIENTE DE CULTIVO Se prefiere que sean de vidrio excepto en los casos que se requiera otro tipo de material de acuerdo a la investigacin a realizar. Para estudios luitrieonales. particularmente

sobre nutricin o asimilacin del silicio, no es recomendable el uso de material de vidrio por contener varios silicatos y ninguno de stos son totalmente insolubles, recomendndose para tales propsitos recipientes de polietileno o cubrir el interior de los. recipientes de vidrio con una capa tina de paratina. Los recipientes de cuarzo son utilizados para investigaciones especiales. Los recipientes o vasos de vidrio son tapados con algodn no absorbente y cuando se usan tapones de jebe, stos deben hervirse en una solucin de fosfato trisdico y enjuagados con agua destilada, luego pueden ser remojados en IICl 3N y nuevamente enjuagados con agua destilada y almacenados en un lugar libre de polvo. Existen material de vidrio de formas y volmenes diversos de acuerdo a los requerimientos del cultivo. En vista que el material de vidrio es usado repetidamente, no es mucha la importancia de su limpieza, siendo prctica ordinaria sumergirlos en una solucin de acido crmico o una mezcla de dicromato de potasio y cido sulfrico concentrado despus de haber sido lavados con jabn y enjuagados con agua corriente. Como paso final antes de su uso, todo material de vidrio deber lavarse con HCL 3N y enjuagado 6 veces con amia destilada. AGUA El agua destilada es de uso rutinario en un laboratorio. I,as tuberas metlicas del abastecimiento de agua introducen nilales pesados que pueden ser eliminados durante- el icdeslilado. asimismo el exceso de cloruro es removido hirviendo el agua. Es posible la presencia de cierta toxicidad en el agria destilada cuando esta es obtenida mediante condensadores metlicos, recomendndose destiladores de Pyrex o Jena que proporcionan agua destilada de buena pureza. Para la realizacin de estudios iiutricionales. el agua debe ser pasada por una columna de resina catinica o amnica para remover los electrolitos presentes. Tambin es importante chequear

constantemente la conductividad del agua a fin de asegurar la pureza de las aguas desioni/adas. ESTERILIZACIN Un requisito fundamental para la obtencin de cultivos puros, es el desarrollo de mtodos de esterilizacin, es decir, la eliminacin de todos los microorganismos presentes en los materiales a utilizan posteriormente ios objetos esterilizados debern

ser protegidos para evitar posteriores contaminaciones. Los principales mtodos de uso corriente son la esterilizacin por calor y la filtracin, siendo en el primer caso el autoclavado bajo presin, es decir calentar las soluciones a temperaturas mayores que el punto de ebullicin del agua bajo presin. No debe utilizarse para esterilizar soluciones que contengan sustancias termolbilcs como protenas y azcares. La esterilizacin por filtracin consiste en el uso de filtros cuyos poros son lo suficientemente pequeos para evitar el paso de bacterias, en la que la siolucin a filtrar es colocada en el filtro y se le aplica succin, transfirindose la solucin filtrada aspticamente a recipientes estriles. UTENSILIOS DE INOCULACIN Los materiales de inoculacin comunmente utilizados para transferir material algal de un medio a otro, son agujas de alambre, pequeas lancetas y tubos capilares de pequeas dimensiones. Las agujas de alambre de platino o nicroni unidos a un mango de madera o vidrio son muy comunes para los propsitos de inoculacin. El extremo del alambre esta torcido para formar un lazo u ojal que facilite la transferencia del material algal.

Las pequeas lancetas estn hechas de platino o iridio cuyos extremos han sido martillados para formar una hoja fina y son adecuadas para cortar y separar algas filamentosas. Las micropipetas son ideales para coger clulas simples o fragmentos de formas filamentosas pudindose manipular bajo el microscopio. MEDIOS DE CULTIVO Se han desarrollado muchas clases de medios de cultivo a fin de asegurar los requerimientos de las alhgas y la idiosincracia de los investigadores.Un medio de cultivo para ser valioso debe soportar a las especies a cultivarse en l,debe contener sales minerales,fuentes de energa y materiales para la sntesis celular .Generalmente los medios de cultivo son lquidos y solidos. MEDIOS LQUIDOS

La mayora de las algas crecen con facilidad en medios puramente inorgnicos recomendndose utilizar sales anhidras. El aspecto mas importante del medio de cultivo es la forma como la fuente nitrogenada es abastecida,pudiendo las microalgas metabolizar nitratos, nitritos, amonio y otras fuentes orgnicas. Algunas cianofitas son capaces de utilizar el oxgeno atmosfrico. Otro aspecto importante es el cambio de pH como resultado de la absorcin preferencial de la fuente nitrogenada, asi tenemos que la absorcin del nitrgeno amoniacal ocasionan una disminucin del pH, mientras que la asimilacin del nitrato la aumenta. Pese a que los medios de cultivo presentan todos los elementos nutritivos necesarios, a veces las algas crecen poco o nada debido al requerimiento de sustancias o factores nutricionales especiales. El uso de extractos de suelo y otras sustancias satisface mucho estos requerimientos., en consecuencia, la evaluacin del los requerimientos nutricionales necesita la formulacin de un medio ideal para el ptimo crecimiento de determinada alga. MEDIOS SOLIDOS Estos medios tienen la gran ventaja de poder licuarse con el calor y al enfriarse retornar al estado slido. Estos medios son utilizados para inmovilizar a individuos simples o clulas individuales, separarlas de otros organismos asi como proveerles de adecuados nutrientes para su reproduccin. Para la preparacin de los medios slidos es muy comn la utilizacin del agar, que es un polisacrido que agregado a la solucin nutritiva produce un gel firme que se derrite a 95 C, pero que no solidifica hasta enfriarse debajo de 45 C, el medio agarizado enfriado puede incubarse a temperaturas tan altas como a 60 C. sin derretirse. El agar por ser una sustancia orgnica puede proporcionar algunos nutrientes requeridos por las algas, por ello es difcil aislar cultivos puros ya que invariablemente crecen hongos y bacterias. A fin de minimizarla contaminacin se recomienda tratar el agar con HCL diluido por varias horas y luego lavar con agua. Un buen agar solidificado deber presentar un color ligeramente azulado y no amarillento, esto ltimo significar que el agar ha sido sobrecalentado. Es importante tener en cuenta auto lavar por separado los nutrientes y el agar. CRECIMIENTO

El crecimiento es un incremento ordenado de todos los componentes de un organismo y no de algunos de sus constituyentes; en organismos unicelulares la multiplicacin celular es consecuencia del crecimiento, mientras que en organismos multicelulares la mulltplicacin celular resulta en un incremento del tamao de dichos organismos, mientras que en formas unicelulares conducen a un incremento en el nmero de individuos. El crecimiento de los cultivos puede expresarse en trminos de la divisin celular ( duplicacin diurna) y /o crecimiento (tasa relativa de crecimiento) TASA DE CRECIMIENTO Durante el crecimiento de organismos unicelulares, cada clula individual crece hasta determinado tamao despus de lo cual se divide para formar dos clulas hijas; las clulas hijas repiten el proceso por lo que el nmero de clulas se duplica en regulares intervalos de tiempo. El tiempo requerido para que una poblacin de duplique se denomina" tiempo de generacin ". En un sistema de flujo estable el tiempo de generacin promedio es constante y parece ser una caracteristca bioqumica propia del organismo. La tasa especfica de crecimiento, K, bajo determinadas condiciones medioambientales puede calcularse de:

Esta tasa de crecimiento es interpretada diferentemente como "logaritmo de unidades por hora (Ka) o por da (Kb)"," logaritmo de base 10 unidades por dia (Kc)", unidades por dia (duplicacin por dia,K) o tiempo de duplicacin por hora (TI) o en dias (T2). Todos estos valores pueden reducirse al valor K (duplicacin por da) de la ecuacin 2.

K = Ka. 24/0,69 - Kb/0,69 = Kc.2.3/0,69 - 24/T1 = 1/T2 Sin embargo, el tiempo de generacin no implica que siempre cada clula se divida precisamente en el intervalo de tiempo fijado, ello puede ser un valor medio de la curva de distribucin. CURVA DE CRECIMIENTO Cuando un cultivo crece bajo condiciones ptimas de iluminacin, abastecimiento de C02 , nutrientes y temperatura constante su curva de crecimiento sigue un patrn sigmoideo (Fig. 1) en la que se puede reconocer 5 fases: FASELAG Cuando un cultivo es transferido a un medio apropiado y mantenido en ptimas condiciones, el crecimiento exponencial puede ocurrir inmediatamente, sin embargo en algunos casos, un crecimiento constante se establece solamente despus de cierto perodo de tiempo, conocido como fase Lag. Esta primera fase es a veces aparente debido a la introduccin de clulas muertas, mientras que un verdadero Lag puede atribuirse a varios factores: desactivacin de enzimas en el inoculo disminucin del nivel metablico en el inoculo clulas que aumentan de tamao pero que no se dividen algn factor difusible necedario producido por las mismas clulas para la fjacin del carbono ( C02 o cido gliclico) actividad metablica de las clulas inactivan algn factor txico presente en el medio introduccin del inoculo en un medio conteniendo altas concentraciones de una sustancia particular(fosfatos,antibiticos, etc) FASE EXPONENCIAL O LOGARTMICA Esta fase se obtiene cuando el cultivo adquiere una tasa constante de crecimiento ya que el nmero de clulas se duplica durante cada generacin y la poblacin incrementa con la potencia de 2 que corresponde al logaritmo de base 2; por lo tanto, en un cultivo

creciendo exponencialmente, el logaritmo de base 2 del nmero de clulas incrementa en proporcin directa al tiempo, por esta razn el crecimiento es a menudo referido como fase logartmica. Esta fase se caracteriza por la rpida y constante divisin celular dependiendo del tamao del cultivo (rea superficial), intensidad luminosa (debajo del nivel de saturacin) y la temperatura; sin embargo, dura corto tiempo debido a las variaciones ocasionadas por el crecimiento del organismo mismo, por ejemplo la luz que tiene un remarcado efecto. Durante- las fases iniciales del crecimiento, cuando la densidad poblacional es pequea, todas las clulas estn saturadas de luz con la subsiguiente disminucin del crecimiento. FASE LINEAL Cuando un cultivo llega a ser denso, el crecimiento procede de manera lineal, habindose demostrado que sta fase puede establecerse solamente por el factor luz ya que la poblacin densa reduce considerablemente la penetracin de la luz. La fase lineal o de declinacin relativa del crecimiento puede ser causada por varios factores: Autosombreado de los cultivos Reduccin de la tasa especfica de crecimiento Agotamiento de ciertos nutrientes Cambio del pH debido a la absorcin preferencial Interferencia de la fotosntesis por la respiracin.

FASE ESTACIONARIA En sta fase existe una disminucin de la tasa de crecimiento por el limitado abastecimiento de luz y la creciente interferencia de la fotosntesis por la respiracin. El rompimiento oxidativo de las sustancias orgnicas sintetizadas empiezan a reducir el crecimiento, es decir, disminuye la habilidad de los sistemas enzimticos para utilizar rpidamente los recursos para formar biomasa (Koch, 1981) y la curva de crecimiento alcanza un valor asinttico limitante que puede describirse como la mxima concentracin obtenible de biomasa algal. Tambin se considera que sta fase se logra un equilibrio entre la mxima concentracin de biomasa algal y las prdidas ocasionadas por los procesos degradativos.

FASE DE MUERTE Durante sta fase, las clulas empiezan a morir liberando materia orgnica que a menudo inhiben el crecimiento; se considera que sta fase es alcanzada cuando las condiciones medio ambientales son desfavorables y el abastecimiento de luz y nutrientes es limitada. Tambin es caracterstico encontrar la presencia y desarrollo de otros microorganismos as como diversos procesos infecciosos.

PATRONES METABOLICOS Y CRECIMIENTO Hay considerable variabilidad en la actividad metabica y en los productos del metabolismo de cultivos en laboratorio, tales variaciones indicaran la posible variacin en el metabolismo de los cultivos jvenes o viejos.Generalmente los cultivos jvenes son verdes, excepto en diatomeas, y con sedimentos en el fondo del frasco, en contraste, los cultivos viejos en los que se ha agotado la fuente nitrogenada, hay acumulacin de pigmentos carotenoides que recubren a la clorofila y la presencia de lpidos de baja gravedad especfica permiten que las clulas individuales o coloniales floten. Es sorprendente las diferencias cuantitativas halladas en Monodias subterrneas ( Fig. 2) cuando crecen exponencialmente llegando a tener hasta 70% de protenas, altos contenidos de clorofila y cidos nucleicos, bajos contenidos de carbohidratos y lpidos y alta actividad fotosinttica y respiratoria. Por otro lado, las clulas ms grandes de un cultivo viejo deficientes en nitrgeno tienen menos del 10% de protenas, bajos contenidos de polisacridos y lpidos y extremadamente baja actividad fotosinttica y respiratoria.

Es claro que las clulas creciendo exponencialmente tienen alta capacidad fotosinttica y el principal producto es la protena, mientras que el carbono fijado en la fotosntesis se incorpora rpidamente en aminocidos. El flujo de carbono fijado cambia de la sntesis proteica a la de carbohidratos resultando en un aumento del peso seco de las clulas privadas de nitrgeno. La divisin celular ocurre al inicio pero, contina despus que el nitrgeno celular ha cado debajo de un valor limitante, que generalmente es del orden del 30% del peso seco, por lo tanto, la continuada fotosntesis resulta en expansin celular y aumento en peso seco de las clulas. Un prolongado agotamiento del nitrgeno disminuye la tasa mxima de fotosntesis hasta el 5% de la tasa inicial^ acompaado de la disminucin de clorofila, empezando la acumulacin de lipdos, ya que el sistema sintetizador de lpidos es menos susceptible a la desorganizacin que el sistema responsable de la sntesis de carbohidratos. Los cambios en el patrn del metabolismo que acompaan al crecimiento exponencial presumiblemente depende en gran medida de la naturaleza del factor limitante del crecimiento. En cultivos envejecidos de Chlorella hay una variada disminucin en la capacidad fotosinttica que parece estar relacionada directamente con el agotamiento de nitrgeno, aunque tambin es posible que los productos metablicos inhiban la fotosntesis. Respecto a los lpidos, stos se acumulan hasta 70% en clulas viejas creciendo en escaso nitrgeno y hasta 20% en cultivos creciendo activamente. La acumulacin de carotenoides, una caracterstica de muchas algas creciendo en condiciones naturales, a menudo ocurre en cultivos ' envejecidos, habindose observado que la deficiencia de fosfatos y nitrgeno previene la divisin, celular sin daar la habilidad del alga para asimilar carbono. Diferentes especies de algas tienden a tener similares cantidades de protema cruda, lpidos y polisacridos hidrolizables cuando crecen en condiciones aproximadamente similares. En la siguiente tabla se presentan algas marina creciendo bajos similares condiciones fisicoqumicas y cosechada en la fase exponencial, observndose amplia variacin de ceniza especialmente en diatomeas, pero si se hace la comparacin en relacin a las cantidades de las fracciones mayores en trmino de carbono orgnico total, la composicin es similar. (Foggi;1971)

TIPOS DE NUTRICIN La mayora de las algas son pigmentadas y por lo tanto capaces de sintetizar sus propios materiales alimenticios a travs de procesos fotosintticos, por lo que la fototrofa es el principal modo de asimilacin del carbono. Sin embargo, existen varios tipos , de metabolismo agrupndose en auttrofos y hetertrofos, siendo los primeros capaces de crecer con nutrientes inorgnicos solamente y los otros requieren sustancias orgnicas. Es necesario distinguir entre organismos que usan sustancias orgnicas como mente de energa y aquellos que las usan como factor de crecimiento, ya que son capaces de sintetizar algunos metabolitos. De acuerdo a las caractersticas de nutricin se reconocen las siguientes clasificaciones:

BASADO EN LA FUENTE DE ENERGA

NUTRICIN FOTOTROFICA La energa proviene principalmente de reacciones fotoqumicas y en stos organismos, la asimilacin fotosinttica juega rol importante y es una reaccin de oxidacin y reduccin entre el agua como dador de hidrgenos y el C02 como aceptor de hidrgenos.

Esta es una reaccin endergnica y la energa es obtenida de la luz y absorbida por los pigmentos fotosintticos de los cuales la clorofila acta como sensibililizador fotoqumico. En fotosntesis normal, la energa se hace disponible mediante la absorcin por los pigmentos y es usada para reducciones por medio de los hidrgenos derivados del agua. En algunas algas, otras sustancias diferentes del agua pueden utilizarse como fuentes de hidrnos recordando a las bacterias. Se ha reportado que diatomeas (Pinnularia) y cianofitas (Oscillatoria) pueden utilizar H2S para la reaccin del C02, es decir, estn adaptadas a un metabolismo similar al de las bacterias sulfurosas, en las que la evolucin o desprendimiento del 02 es reemplazado por la disposicin de glbulos de azufre dentro de las clulas:

NUTRICINQUIMOTROFTCA Muchas algas fotos inte ticas tambin son capaces de utilizar sustancias de alto potencial de energ+a qumica y algunas formas no pigemntadas poseen absoluto requerimiento de tales de sustancias.En ste tipo de nutricin, la energa proviene enteramente de reacciones qumicas y se consideran 2 tipos de nutricin: QUIMIOLITOTROFIA Cuando los organismos derivan su energa de sustancias inorgnicas, tambin se le

denomina quimiosintticas. Estos organismos asimilan C02 por medio de la energa derivada de la oxidacin de sustancias inorgnicas y no dependen de la luz ni de sustancias orgnicas como fuente de energa. En la nutricin quimiolitotrfca la energa liberada de la reaccin oxihidrgeno es utilizada para la reduccin del C02 a sustancias orgnicas:La quimiotrofa difiere de la fototrofa solamente en la fuente de la que derivan la energa.

La quimiotrofa difiere de la fototrofa solamente en la fuente de la que derivan la energa.

QUIMOORGANOTROFIA Incluye organismos quimioorganotrofos facultativos y quimiotrofos obligados, los primeros poseen pigmentos fotosintticos y son capaces de crecer en la oscuridad o en ausencia de C02 usando sustancias orgnicas preformadas; mientras que las otras carecen de pigmentos y recurren a la fermentacin de sustancias orgnicas. Algunas algas son capaces de nutricin holozoica, es decir son capaces de asimilar alimento particulado. Los flagelados, Eugleninae, Cryptophyceae y Volvocales crecen bien en acetato y no en azcares y son muy abundantes en aguas contaminadas con materiales orgnicos en descomposicin que liberan cidos grasos y alcoholes. Euglena gracilis es un organismo quimioorganotrofo facultativo que responde lentamente a sustratos orgnicos aadidos -en la oscuridad despus de un crecimiento fototrfico. Chlorella varicgata es un organismo con interesante variacin nutricional : cuando son cultivados en la oscuridad y en presencia de sustratos orgnicos, las clulas se tornan amarillas y lentamente recuperan su capacidad para crecer fototrticamente en la luz; sin embargo, algunas clulas pierden permanentemente sta .propiedad por no poder producir clorofila.La produccin de clulas descoloridas (apoclorticas) parece deberse a la desorganizacin del estroma del leucoplasto, mientras que las clulas retienen su

capaciadad para crecer y dividirse. Aunque tales formas espontneas con menos clorofila son raras, es posible inducirlas por irradiacin con rayox X, por tratamiento con estreptomicina y por exposicin a altas temperaturas. La mayora de formas incoloras presentes en la naturaleza, corresponden a algas pigmentada y con productos de reserva; asi tenemos que Astasia es similar a Euglena excepto en los pigmentos; Polytoma recuerda a Chlamydomonas; Polytomella corresponde a Tetrachloris y Prototheca es una Chlorella incolora. BASADO EN LA HABILIDAD PARA SINTETIZAR METABOLITOS ESENCIALES NUTRICIN AUTOTROFICA La mayora de algas pigmentadas son capaces de sintetizar sus propios componentes celulares a partir de materiales inorgnicos y de apropiadas fuentes de energa y carbono. La nutricin autotrfica tiene dos fases importantes: la asimilacin del carbono y la asimilacin del nitrgeno. La asimilacin del carbono requiere de agua y un donador de hidrogeno para la reduccin del C02. Las algas pueden asimilar nitrgeno como nitrato o amonio o en la forma elemental. La asimilacin del nitrgeno molecular (fijacin del nitrgeno atmosfrico) est restringido a unas cuantas especies de cianoftas y son importantes en la agricultura por el rol enriquecedor de los suelos.

Excepto algunos flagelados incoloros y pigmentados y Euglena gracis, la mayora de las algas pueden asimilar nitrgeno en la forma de nitrato, siendo necesario su reduccin en varios pasos. El nitrito puede servir como fuente nitrogenada para algunas algas aunque es txico an en bajas concentraciones. El nitrgeno amoniacal, debido a su estado reducido, es fcilmente asimilado por la mayora de algas con preferencia a otras fuentes nitrogenadas. Si se aaden ambas fuentes nitrogenadas, nitrato y amonaco, hay una absorcin preferencial del nitrgeno amoniacal; pero la fuente amoniacal conduce a ciertas reacciones colaterales en el medio de cultivo como la desminucin del pH. Tambin existen algas capaces de metabolizar fuentes orgnicas de nitrgeno.

NUTRICIN HETEROTROFICA Los organismos hetertrofos son aquellos que requieren fuentes orgnicas exgenas de uno o mas metabolitos esenciales y son incapaces de sintetizar los componentes celulares en su ausencia. Chlorogloca fritsch es conocida por crecer y fijar nitrgeno en la oscuridad si es abastecida con una fuente apropiada de carbono como la sucrosa y Anabaena cylindrica, un fottrofo obligado, puede asimilar nitrgeno en la oscuridad. Coelastrum proboscideum, el crecimiento adicional observado despus de 7 14 dias utilizando glucosa, sugiere la existencia de una respuesta adap.tativa del alga.En cultivos con glucosa se observa a veces una coloracin amarilla con la edad o en cultivos envejecidos; tambin se considera que la acumulacin de polisacridos es una caracterstica de las condiciones heterotrfcas mas que del tipo de clulas. Aparentemente el tipo de nutricin y los factores medioambientales afectan la morfologa de las algas. NUTRICIN AUTROFICA El crecimiento requiere de muy bajas concentraciones de al menos un factor de crecimiento orgnico no usado principalmente como fuente carbonada o de energa. NUTRICIN MIXOTROFCA Crecen en la luz en presencia de C02 pero con un adicional y obligado requerimiento para al menos un sustrato orgnico que es fotometabolizado durante el crecimiento.

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES A fin de lograr el crecimiento de una microalga en un cultivo es necesario que las condiciones medioambientales concuerden con los requerimientos intrnsecos tanto como sea posible. Los factores ambientales pueden ser fsicos como la luz y la temperatura y qumicos como todas las sustancias que proveen materiales para la sntesis estructural o protoplasmtica de la microalga. El xito en la realizacin de estudios de nutricin mineral dependen-del uso de apropiados

mtodos de cultivo y de tcnicas para distinguir sntomas y deficiencias. Pese al desarrollo logrado an no se dispone de un mtodo simple que satisfaga los siguientes requisitos: Cultivos masivos estriles a temperatura y aireacin constantes. Iluminacin constante de las clulas en cada edad y densidad de cultivo. Concentracin constante de hidrogeniones o pH.

Por lo tanto, a veces es difcil precisar si los efectos observados son debido a la deficiencia del mineral o a otros cambios en las condiciones del cultivo, asimismo, es difcil obtener exactas concentraciones de un determinado elemento debido a la presencia de contaminantes en las sales minerales utilizadas. Para satisfacer los requerimientos nutricionales de las microalgas en cultivo se han ideado una serie de medios de cultivo sin poder decirse que uno de ellos es el mejor, asimismo, algunos medios se han diseado para simular las condiciones naturales tan estrechamente como sea posible y otros para producir una gran poblacin. La tcnica para cultivar diferentes algas requiere de una clara comprensin de sus requerimientos nutricionales, que pueden ser absolutos, normales, mnimos u ptimos. La cantidad precisa de los elementos nutritivos,en muchos casos, depende de la composicin del medio y la concentracin de otros minerales, teniendo en cuenta que la accin especfica y el requerimiento absoluto de un elemento es difcil de determinar. REQUERIMIENTO ABSOLUTO Cuando una alga no puede crecer en la ausencia de un nutriente y si ste nutriente no puede ser reemplazado o sustituido por otro. REQUERIMIENTO NORMAL Es la cantidad de cada nutriente contenido en las clulas producido durante el crecimiento de una poblacin, mientras que el nutriente no es limitante. Aunque puede haber absorcin relativa de nutrientes resultando en la variacin de la composicin del medio, no dificulta el balance del medio asi que las clulas producidas tendrn, relativamente, la misma composicin del medio. Tales clulas son definidas como clulas normales. NUTRIENTES

Son sustancias de diversas comoposicin y caractersticas que desempean funciones importantes e intervienen en la produccin y actividad de diversas enzimas, vitaminas, hormonas , etc. ; tambin sonconsideradas como sustancias vitales para el crecimiento, reproduccin y generacin de biomasa algal. Para fines prcticos se consideran como macro y micronutrientes (Pringsheim, 1962). MACRONUTRIENTES Son los nutrientes mayores , es decir aquellos que intervienen en la formulacin de los medios de cultivo en mayor cantidad, siendo las mas importantes las siguientes: CARBONO Generalmente es utilizado el C02, los carbonatos y bicarbonatos entre las sustancias inorgnicas y entre las orgnicas son muy utilizadas la glucosa, melaza, cido actico, etc. El elemento carbono es de vital importancia por cuanto sirve para formar el esqueleto de los diversos compuestos orgnicos de las clulas. NITRGENO Las principales fuentes nitrogenadas son los nitrato, amonaco y rea, tambin es posible utilizar aminocidos, peptonas y otras sustancias orgnicas segn los requerimientos especiales de algunas microalgas. Es muy conocido por los investigadores que la rea es la fuente nitroganada mas utilizada por no interferir con el pH del medio de cultivo y no ocasiona contaminacin bacteriana.Este elemento es muy importante para la formacin de las protenas, vitaminas, enzimas, etc. celulares. FOSFORO Elemento requerido para el crecimiento algal y sus compuestos fosaftado y polifosfatados juegan rol importante en el metabolismo celular, particularmente en las reacciones de transformacin energtica. La asimilacin del fosfato estar en funcin de su concentracin en el medio , cuando es abastecida en exceso, el contenido del fsforo se mantiene constante dentro de las clulas. Es posible que los polifosfatos de alta energa sirvan para reacciones especiales como la sntesis de cidos nucleicos y protenas o en procesos relacionados con la divisin celular. AZUFRE

Es esencial para la elaboracin de importantes aminocidos y albuminoides, tambin se las halla en sustancias activas de la vitamina Bl y de la biotina y otras enzimas. Es abastecida como sulfatos y en aguas naturales parece no ser limitante. El azufre existe en varios estados de oxidacin, desde la forma ms reducida (H2S) hasta la* mas oxidada (aminocidos). La mayora de algas y otros organismos pueden reducir y utilizar sulfatos como su nica fuente de azufre, aunque no se ha determinado si el H2S puede utilizarse como fuente de S para el crecimiento. CALCIO Esencial para algunas algas, sin embargo, juega un rol importante en el mantenimiento de las menbranas plasmticas, en la formacin de coloides y. materiales de la pared celular. En todo caso su requerimiento es abastecido por el contenido normal en aguas dulceacuicolas. MAGNESIO Elemento constitutivo de la molcula de clorofila y es importante para la sntesis y actividad de ste pigmento. Tambin parece intervenir en algunas enzimas del metaboliesmo energtico como activador. POTASIO Este elemento tiene marcada influencia en la intensidad de asimilacin del C02 y es activadora de enzimas que intervienen en el metabolismo de los protidos.Clulas deficientes en potasio, presentan bajo porcentaje de fotosntesis. MICRONUTRIENTES MICRONUTRIENTES INORGNICOS HIERRO Ya que el fierro forma parte de muchas enzimas y citocromos, su deficiencia afecta el crecimiento, retardndolos. La concentracin depende de la especie y de alguna manera de la composicin del medio; con la finalidad de asegurar adecuados abastecimiento del Fe se recurre al uso del quelante EDTA. La disminucin del crecimiento puede deberse a la reduccin de la fotosntesis que a su

vez resulta en una disminucin en el contenido de clorofila. Se presume que una deficiencia de fierro, reduce la sntesis de protena dentro de los cloroplastos y que la disminucin de la clorofila es una consecuencia indirecta. Desde que los citocromos son porfirinas de hierro, parece que ciertas enzimas pueden estar relacionadas con el mecanismo fotosinttico, explicndose por lo tanto, los

efectos adversos de la deficiencia de fierro en ste proceso. La reduccin del nitrato en la luz, estando presente o no una fuente carbonada asimilable, parece no ser afectada por deficiencia de Fe, aunque en clulas deficientes de Fe, creciendo en obscuridad, presentan mas clorosis que en la luz, la asimilacin de nitrgeno contina por un largo perodo. El fierro interviene en algunas enzimas de la respiracin celular, su deficiencia produce clorosis que se manifiesta por una insuficiente produccin de clorofila y participa en la fotosntesis como transportadora de electrones. MANGANESO Se ha demostrado su necesidad para muchas algas, aunque el requerimiento para algunas clorofitas no ha sido bien establecida. Lewin (1967) concluy que para crecimiento autotrfico se requiere 10 M y en cultivos heteretrficos en la oscuridad, la deficiencia se manifiesta en concentraciones menores a 10 M. En cultivos mixotrficos con glucosa y en la luz, el requerimiento de Mn es aparentemente como en cultivos autotrficos; sin embargo, cuando el alga es transferido a condiciones totalmente heterotrficas en la oscuridad, el Mn aparentemente no es requerida. Tambin se observ un alargamiento de Chlorella en cultivos deficientes de Mn creciendo en condiciones mixo y heterotrficas. La tasa fotosinttica siempre decrece en deficiencia de Mn tanto en iluminacin dbil o en saturacin. Aadiendo Mn a clulas deficientes presentan una recuperacin inmediata de la tasa fotosinttica; sin embargo, una recuperacin lenta e incompleta es atribuida a daos en los cloroplastos. Tambin se demostr que en condiciones anaerbicas, la incorporacin de C02 es independiente de Mn, mientras que en condiciones aerbicas si se presenta tal dependencia. No se ha observado clorosis inducida por la deficiencia de Mn, al contrario se nota un aumento en el contenido de clorofila por unidad de peso seco en Chlorella; sin embargo, la deficiencia de Mn aumenta la sensibilidad de la clorofila a destruirse en la luz, por la

que en altas intensidades luminosas puede conducir a la clorosis como un sntoma secundario de la deficiencia. Se sugiere que el Mn puede afectar el mecanismo de produccin de oxgeno durante la fotosntesis, ya que la fotoreduccin no es reducida por la deficiencia de Mn. Aunque un nmero de enzimas relacionadas al metabolismo de los carbohidratos son activadas por le Mn, el efecto de su deficiencia en la respiracin no es marcada, aunque la tasa de respiracin endgena es reducida en Chlorella y Ankistrodesmus. La asimilacin oxidativa de glucosa generalmente no vara o es ligeramente aumentada en las primeras fases de la deficiencia, pero tiende a disminuir con el tiempo. En.Chlorella la tasa de crecimiento autotrfico es reducido en ausencia de Mn cuando se utiliza sales de amonio o nitratos como fuentes de nitrgeno. Bajo condiciones hetero y mixotrficas, se ha observado deficiencia en el crecimiento solamente durante la asimilacin de nitrato. Hopkins(1930) citado por Lewin(1967), considera que en Chlorella el Mn puede estar relacionado con la reoxidacin del Fe, despus de la reduccin al estado ferroso. En clulas deficientes de Mn, la concentracin del Fe en estado ferroso pueden ser tan alto para un buen crecimiento pero con un exceso de Mn, la misma concentracin de Mn puede resultar baja. MOLIBDENO Se conoce que el Mo est relacionado con el metabolismo del nitrgeno, su deficiencia origina clorosis y tiende al almacenamiento de mucho almidn afectando la sntesis de protenas. Debido a que la tasa de respiracin endgena es mayor en clulas deficientes de Mo y la clorofila tiende a disminur, la fotosntesis puede ser suprimida. VANADIO Su rol en el metabolismo de las algas ha sido poco estudiado y sus requerimientos son poco conocidos. La deficiencia de V puede afectar ligeramente el contenido de clorofila y a reduce marcadamente el peso seco. En alta iluminacin, la evolucin del 02 es inhibida pero puede reactivarse despus de un periodo de acondicionamiento con adicin de vanadato, por lo que se estima que el V est relacionado con la fotosntesis probablemente en una de las reacciones oscuras. COBALTO

Es un constituyente de la vitamina. B12 y se ha demostrado que sta vitamina puede suplir la deficiencia del Co en el cultivo de algunas algas, tambin se considera esencial en la fijacin del nitrgeno por las cianofitas. El Co es requerido por las algas capaces de sintetizar B12 y se ha demostrado que la incorporacin del Co depende del abastecimiento de C02 y que ciertos productos de la fotosntesis pueden formar complejos con iones de Co. ZINC Pese a que no se ha investigado mucho en sus requerimientos, se ha demostrado su necesidad en el crecimiento de Schococcm bacila?ks. En Cldorea puyenoidosa, la deficiencia de Zn, disminuye la formacin de clorofila y la actividad fotosinttica as como origina disminucin en el peso seco.

La presencia de ste metal en la enzima anhidrasa carbnica, sugiere su participacin en la fotosntesis a nivel de la fijacin de! C02.

COBRE El Cu forma parte del grupo prosttico del cido ascrbco oxidasa en plantas superiores y est presente en otras enzimas oxidativas que participan en k fotosntesis y respiracin.

BORO Las algas raramente muestran sntomas distintivas de a deficiencia de boro. Se ha demostrado que cultivos de Chlorella vulgari$ exenta de B, exhibe aumento en el nmero de clulas y peso seco cuando el B es aadido en concentracin ptima de 0.5 mg/1.

SILICIO

Es importante para el crecimiento de diaomeas, aunque parece que las

diatnicas tienen un absoluto requerimiento para el silicio, no hay evidencia que sea esencial para otra clase de alga. Se obtuvieron producciones

incrementadas de diaomeas en cultivos masivos con la adicin de "agua de vidrio" hasta 0.16%,

MICRONUTRIENTES ORGNICOS Para el cultivo de u n a gran variedad de especies algales, se requiere la aplicacin de ingredientes orgnicos, principalmente vitaminas. Las vitaminas son sustancias orgnicas esenciales para el mantenimiento de funciones metabicas normales, pero que no sintetizadas por el organismo y por lo tanto deben ser abastecidos exgenamente.

Solamente las vitaminas cianocobalamna(B12), biotnay tiamina (Bl) se han demostrado ser necesarias para algas m arinas y deben aadirse a la m ayora de medios de cultivo (McLachlan, 1975).

La mayora de especies que requieren vitaminas son autotrficas en todos los aspectos, aunque muchos son hetertrofos facultativos, particularmente en su fuente nitrogenada.

REQUERIMIENTOS MEDIOAMBIENTALES El crecimientos de las microalgas dependen esencialmente, del pH del medio acutico, temperatura, composicin de los nutrientes, luz y disponibilidad de C02. (Lewin, 1962).

CONCENTRACIN DE IONES HIDROGENO (pH) La reaccin del medio, acida o bsica, es un factor importante que influyen notoriamente en la existencia de un organismo. Todos los lquidos constituidos por agua, contienen iones hidrgenos (H*) e hidroxilos (OH") libres cargados elctricamente en variadas proporciones. La mayora de sustancias cuando se disuelven en agua se ionizan en mayor o menor grado, de manera que cuando se aade cido

aumenta la concentracin de H33, mientras que baja con la adicin de ubase.

El efecto de una sal sobre el pH depender de las caractersticas del cido y de la base de la cual deriva la sal.

El pH del medio influye en el estado coloidal del protoplasma, la permeabilidad y cualquier funcin fisiolgica, por ejemplo, el movimiento de Oscillatoria es mayor apH 6.4 que a 9.5. El pH del medio siempre debe ser ajustado despus de la esterilizacin bajo condiciones aspticas ya que la esterilizacin misma provoca cambios. El pH inicial del medio cambia debido al crecimiento del organismo ya sea por absorcin selectiva de iones o por productos liberados o por ambas razones.

Debido a que el crecimiento responde a diferentes pH de las especies y como la composicin del medio y el pH interactan para modificar la respuesta al crecimiento, stas interrelaciones deben comprenderse bien antes de asignar condiciones ptimas de crecim iento a las microalgas.

Se ha reportado que el desarrollo de varias cianofitas pueden ser relacionados aun pH definido y en Chiorella, bajo constante abastecimiento de C02, la fotosntesis no es afectado por el pH en el rango de 4 . 6 a 8.9.

La principal dificultad para establecer relaciones del pH a la fotosntesis son los cambios en la fuerza o amplitud inica, concentracin de carbonatas, bicarbonatos y C02 en el medio. Bajo condiciones de inadecuado control del pH, el crecim iento de las algas pueden ser errtico o pobre.

Para prevenir cambios excesivos de pH, se utilizan sistemas buffer que son soluciones conteniendo mezclas de un cido dbil y una base conjugada resistiendo cambios en la concentracin de H* cuando se aaden cidos o lcalis. Muchas sustancias tienen la propiedad de actuar como buffers y son, biolgicamente * muy tiles, tales como los

carbonatas, bicarbonatos, fosfatos, aminocidos y sus componentes, los polipptidos, proteasas y protenas.

El pH influye en la precipitacin de los nutrientes presentes en medio acutico, as a altas concentraciones de fosfatos, precipitan con CaC03 por una simple coprecipitacin cuando el pH aumenta. El incremento de! pH asociado a la fotosntesis induce la precipitacin del P04C03 que a su vez funciona como uno de los controles indirectos de las poblaciones dependientes de la densidad.

Los cuerpos salobres se caracterizan por su alta alcalidad al bicarbonato y por sus altos valores de pH y marcado depsito de CaC03, tienen baja o moderada productividad. TEMPERATURA: La Temperatura es uno de los factores ms importantes que influyen en todas las formas de vida, hallndose diversas temperaturas ptimas para las microalgas, siendo consideradas como mesofticas (20-40C), termoflicas (4)-70C) o psicrfilas (menos de 20C).

Las altas temperaturas ejercen accin en el crecimiento y en la actividad celular, trabajando las clulas ms rpidamente con el consiguiente rpido desgaste, por ello los cultivos a altas temperaturas mueren.

La viabilidad de las clorofitas y c i ano fitas disminuyen paulatinamente con el incremento de la temperatura. Los mecanismos por lo que las cianofitas soportan altas temperaturas han sido investigados considerndose que el lento incremento de la fraccin proteica en especies de bajas temperaturas no se observa en especies normales. La habilidad de las cianofitas de soportar altas temperaturas parece deberse a una alta proporcin de enlaces homopolares cohesivos, sensitivos al calor, uniendo las cadenas ppticas estructurales impidiendo la desnaturalizacin de las protenas. Tambin se ha sugerido la existencia de menor contenido de agua en las clulas vegetativas termfilas y la resistencia a la temperatura puede atribuirse a la mayor gravedad especfica de su protoplasma en las termfilas.

La influencia de la temperatura sobre los seres vivientes puede ser considerado desde 2 puntos de vista.

Ecolgico, con principal inters de su influencia en la distribucin de la especie.

Fisiolgico, para comprender los mecanismos bioqumicos y biofsicos por la que ciertas especie prosperan en condiciones donde otras no pueden supervivir.

Las microalgas son el material adecuado para estudiar la relacin entre la temperatura y la actividad biolgica, debido al amplio rango de condiciones ambientales que ocupan y el alto grado de adaptacin de ciertas especies a condiciones particulares. ILUMINACIN: Siendo las algas principalmente foto auto trficas, requieren de luz para su crecimiento y el efecto de la luz depende de la calidad o intensidad de la misma, as tenemos que altas intensidades luminosas generalmente son dainas para muchas algas, observndose una destruccin de la clorofila.

Cuando la luz incide sobre un cuerpo es reflejada, otra es transmitida y otra puede ser absorbida, siendo esta la efectiva para realizar reacciones qumicas.

Fsicamente segn la teora de los quantos, la iluminacin no es una radiacin continua sino emisiones de quantos de energa; por lo tanto, la luz no puede ser absorbida continuamente sino como un mltiplo de estos quantos. Cuando la luz es absorbida ocurre un incremento de la energa trmica del sistema o la elevacin de electrones en los tomos o molculas a nivel de mayor energa es decir, ocurre la activacin o excitacin electrnica.

Todos los procesos luminosos que no conducen a cambios qumicos son conocidos como procesos fotofsicos y aquellos que implican cambios qumicos, son procesos fotoqumicos. Si la l u z absorbida por un cuerpo tiene suficiente energa ser capaz de elevar ciertos electrones de los tomos no slo a travs de 1 o 2 niveles de energa, sino

separndolos completamente; es decir, ionizando los tomos (efecto fotoelctrico). Si por otro lado, la luz absorbida no es suficientemente enrgicas para remover un electrn completamente, la elevacin momentnea a un nivel superior, retornando a su estado normal, ya sea directamente o en fases con emisin de energa en forma de luz. Esta emisin puede ser instantnea (fluorescencia o retardado (fosforescencia).

La energa puede ser almacenada por los tomos y usada para producir reacciones qumicas, siendo uno de los ms importantes, la formacin fotosinttica de carbohidratos a partir de COI y agua en presencia de luz.

La energa radiante es transferido en paquetes discontinuos llamados fotones y su energa est relacionada inversamente con su longitud de onda.

Cuando la energa radiante es absorbida por la materia, sus efectos estar en funcin del contenido energtico del fotn y por lo tanto de la longitud de onda de radiacin.La luz infrarroja, de ondas mayores de 1 200 nm, tienen baja energa y es convertida rpidamente en calor sin mediar cambio qumico. Las radiaciones ionizantes de longitudes de onda muy cortas (rayos X, partculas a, rayos csmicos) tienen alta energa que as molculas halladas en su camino son inmediatamente ionizadas. Entre estos 2 extremos, las radiaciones varan de 200 a 1 200 nm, teniendo energa cuya absorcin es capaz de producir un cambio qumico en la m o l c u l a absorbente, en sta proporcin del espectro electromagntico se hallan las radiaciones que pueden servir para realizar la fotosntesis. La radiacin solar es modificada profundamente a travs de su paso por la atmsfera, que filtra la radiacin de alta-energa, a nivel del mar, casi el 75% de la energa total de la luz solar estn contenida en la luz de longitudes de onda entre 400 y 1 100 nm (porcin visible y casi infrarrojo del espectro), y es dentro de stos lmites que los pigmentos responsables de la captura de la luz en la fotosntesis tienen sus efectivas bandas de absorcin.

AIREACIN El crecimiento de algas de cultivos estancados son mucho menor que en cultivos aireados con adecuada mezcla de gases. Esto se debe principalmente a la concentracin de la cantidad u tensin de los gases (C02 y 02) en el primer caso.

Los cultivos puede ser aireados por simple inyeccin d e l aire atmosfrico o pasndolo a travs de una mezcla de C02 y aire en proporciones adecuadas, generalmente de 5 a 10% de C02 en aire. El mejoramiento en la tasa de aireacin mediante la agitacin o burbujeo, prolongar el crecimiento exponencial.

La aireacin de los cultivos permiten la agitacin de la suspensin legal evitando la sedimentacin de las algas as como incrementar la disponibilidad de los nutrientes

para las clulas algales.

FUENTES DE CARBONO El carbono es un nutriente indispensable para; el crecimiento de todo microorganismo por la base del esqueleto carbonado de toda sustancia o materia orgnica. Respecto al cultivo de microalgas existen 2 fuentes de abastecimientos del carbono: inorgnico y orgnico.

CARBONO INORGNICO A efectos de realizar cultivos masivo de microalgas, se utilizan 3 especie carbonadas inorgnicas (C02, HC03, CO3) que interactan dinmicamente en el medio acuoso influyendo en el proceso fotosinttico y el pH de los cultivos algales. Al igual que otras plantas auto tro fas, las algas tambin requieren de carbono inorgnico para la fotosntesis en la forma de C02 que est en el aire en 0.03%.

Algunas

aguas

oligotrficas

naturales

contienen

alguna

cantidad

de

C02

absorbida de la atmsfera; sin embargo, las concentraciones son tan bajas que no permiten obtener ptimos crecimiento algales.

El C0 2 es la especie qumica que los sistemas fotosintetizadas utilizan como fuente de carbono para la sntesis de una gran variedad de molculas orgnicas.

Las algas no la incorporas) directamente de la atmsfera sino del C0 2 que se halla disuelto en el ambiente acuoso reaccionando primariamente para formar cido carbnico.

Este cido es muy lbil y se disocia para formar bicarbonato (HC0 3*) que a su vez tambin puede disociarse para formar iones de carbonato (CG3=). Ambos iones se hallan en equilibrio en el que el ion H* ejerce importante rol, siendo el pH una de las propiedades ms sensibles para detectar variaciones en el sistema acutico. As cuando el pH es ms de 10, la especie predominante es el CG3= y a p H 8 y 4.5 es el HC03* y C02 respectivamente; sin embargo, el ph es una funcin de las concentraciones relativas de las

especies y no de sus valores absolutos. En un sistema probablemente tamponeado como el medio nutritivo, la asim ilacin del C02 y el bicarbonato, por el rpido crecimiento de las algas, origina el e q u i l i b r i o para aumentar el pH debido a l a liberacin de OH.

C02 + H20----->H2C0 3 --->*H* + HC0 3- ->2H* + C03 =

La concentracin de algunos de los componentes de ste sistema est en funcin de la temperatura, pH y concentracin de nutrientes. A pH encima de 9 el C03 = puede precipitar en forma de sales resultando en la remocin de nutrientes y como se mencion antes, el cambio del pH es una funcin de! crecimiento fotosinttico de las algas, es decir el pH aumenta, cuando el carbono y el nitrato son asimilados por las clulas (Becker, 1982).

La dosificacin del C0 2 en forma de gas puro ayuda a estabilizar el pH y tambin acta como fuente de carbono, considerndose conveniente aadir a los cultivos de 10 a 20 mi. C02/L/h. Ya que el pH del cultivo indica la cantidad de C0 2 disnelto, se han desarrollado diseos para mantener constante el pH mediante la inyeccin de cantidades controladas de C02 a los cultivos. (Vsquez, 1985).

Por otro lado, no se han demostrado diferencias en el crecimiento algal en cultivos abastecidos con C02 por 8 h/da continuamente o a intervalos de 4 horas por lo tanto, el abastecimiento de C02 4 horas al da en intervalos de 1 hora, es suficiente para mantener buenos crecimientos. Esta dosificacin intermitente permite ahorrar 50% del costoso C02. El mtodo puede mejorarse acortando los intervalos y ajustando el "reloj" de tal manera que durante las horas pico de fotosntesis con altos requerimientos de carbono, se aada ms gas que durante las otras horas del da.

La actividad fotosinttica consume C02 lo que hace que el medio se vaya basificndose cada vez ms hasta llegar a pH 8.3 cuando ya no se encuentra C02 libre. Si se aade C02 por la respiracin al sistema, el cual acidifica el medio hasta llegar a un pH de 4.5 donde prcticamente todo el CO esta en forma libre.

Existen algunas relaciones entre la fotosntesis, el C02 y el pH. Si el agua contiene una apreciable cantidad de Ca (HC03) 2 con el C02 en equilibrio que permita sta solucin, una remocin del C02 mediante la fotosntesis, romper este equilibrio y la reaccin reversible continuar hacia la derecha precipitando el carbonato de calcio de la siguiente manera:

Ca(HC03)2 ----> CaC0 3

H20 +

C02

sta reaccin conlleva un aumento del pH y el carbonato de calcio. Futuras reacciones de hidrlisis de los bicarbonatos y carbonates produce hidroxos, basificndose aun ms el pH.

Con la respiracin se produce C02, se forma cido carbnico y la reaccin se orienta de nuevo hacia la izquierda (Roldan, 1992)

La principal importancia del bicarbonato para las algas verdes reside en su rol de transporte del C02 y su remocin por la fotosntesis causa elevacin del pH por encima de 10 (Lewn, 1962). CARBONO ORGNICO Los requerimientos de carbono orgnico de varias algas difieren ampliamente, y el patrn de utilizacin esto vara est desde basado los en autotrofos la obligados de las a los

heterotrfos

obligados;

habilidad

algas,

naturalmente auto tro fieos, para metabolizar sustratos carbonados orgnicos. Obviamente, es necesario realizar un proceso previo de adecuacin o

"aclimatacin" de las algas al nuevo sustrato posibilitando . l a realizacin de cultivos lietero trficos. Las ms importantes fuentes de carbono orgnico con fines de produccin masiva son la maleza, el cido actico y el C02 obtenido por compostaje.

MELAZA

La melaza es un subproducto de la manufactura o refinera de la sacarosa de azcar de caa y no debe contener menos del 46% de azcares totales como azcares invertidos. La melaza contiene la mayor porcin de los no azcares del jugo del cual deriva junto con una porcin de sacarosa y azcares reductores (dextrosa y levulosa). Se considera que la melaza es una solucin acuosa muy compleja por la presencia de una serie de elementos minerales y

sustancia orgnicas (Tabla 3) importantes para el crecimiento de una serie de microorganismos (Meade-Chen, 1997)

Debido a la presencia , en la melaza, de una amplia gama de nutrientes y su solubilidad en soluciones acuosas, son accesibles a las microalgas permitiendo obtener altos crecimientos en cultivos masivos al aire libre de Scenedesmas acuius. Alva y col (1983) demostraron la asimilacin de melaza por la clorofila Seenesesmus acato favoreciendo el crecimiento de los cultivos por su adecuada regulacin del pH, y mejora de la utilizacin de la iluminacin solar. Sin embargo, la utilizacin de la melaza en cultivos masivos al aire libre debe ser evaluada adecuadamente ya sea en su concentracin como en la manera de su dosificacin a fin de evitar o minimizar la presencia de microorganismos no deseables. ACIDO ACTICO:

Este sustrato es muy utilizado en la produccin industrial de CMoretta en Japn, habindose demostrado su idoneidad para soportar adecuadas concentraciones de biomas algal y ptima regulacin de las fluctuaciones el pH de los cultivos.

El uso de cido actico en los cultivos de Scenedesmus flcw-regula las fluctuaciones del pH permitiendo la eficaz asimilacin y minimizando la precipitacin de los nutrientes (Merino y col. 1988).

La presencia de sales minerales en el medio acuoso permiten mantener en equilibrio el pH interno de los microorganismos y el ambiente, por lo que las variaciones de dicho equilibrio provocarn alteraciones en la permeabilidad plasmtica afectando la cintica de crecimiento.

La disolucin del cido actico en la suspensin algal favorece la formacin de sustancias de cierta persistencia y accesibilidad para las algas, por lo que stos cultivos presentan mejores condiciones de- crecimiento y en consecuencia, mayores incrementos de biomasa.

Segn Lewin (1962), las membranas celulares de las algas son permeables a las molculas de cido actico debido al equilibrio existente entre las molculas disociadas y no disociadas dentro y fuera de la clula; cuando el medio es ms cido el citoplasma, las molculas se disocian y penetran altas concentraciones del anin (CH3COO ) pudindose acumular dentro de las clulas e incrementando la mayor disponibilidad de metabolitos para la sntesis protoplasmtica.

CARBONO DE COMPOSTAJE Segn Becker (1982), en la i n d i a se utiliza abono de ganado vacuno y compostaje de granjas para producir aire enriquecido con C02 por la degradacin microbiana de la materia orgnica mediante la fermentacin aerbica. Este sistema es diferente de la conocida produccin de bioalgas basado en la liberacin de metano.

El proceso consiste en la degradacin biolgica resultante de la mezcla de abono fresco con compost activo el "bioalgas aerbico" obtenido por ste proceso es enriquecido con C02 bajo condiciones ptimas de hasta 100 veces la concentracin normal del C02 en el aire, en tal sentido se realizaron pruebas para aumentar la produccin de C02 (Tabla 4). PROGRAMA DE CULTIVO

La principal rea en los sistemas de la acuicultura intensiva es la provisin de alimento, siendo las microalgas unicelulares apropiadas para una variedad de condiciones o situaciones de cultivo. Para fines de produccin de larvas de organismos de inters econmico, las microalgas sin muy importantes por lo tanto, sus cultivos masivos requieren se cepas apropiadas y el uso de agua de mar, natural o artificial, enriquecida ya q u e el agua de mar superficial raramente contiene suficientes nutrientes para el cultivo masivo de una especie algal(Fox. 1983)

El agua de mar es el medio ideal para el crecimiento de algas marinas y aun no han sido mejorado ya que es un medio muy completo y contiene mas de 50 elementos conocidos, adems de aquellos compuestos orgnicos de mayor cantidad y en nmero variable. Sin embargo es usual fortificar e! agua de mar con varios nutrientes vegetales como nitrgeno, fsforo y fierro (Mc Lanchlan, 1975).

El problema principal en la preparacin de medios marinos es la precipitacin durante la esterilizacin o autoclavado, por lo que se recomienda usar agentes queantes como el EDTA (cido etilendiamino tetraactico), adems la mayora de medios de cultivo

pueden ser esterilizados por filtracin. Las cepas pueden obtenerse de colecciones de laboratorio o aislando especies endmicas locales debido a su habilidad de prosperar en aguas locales. Los cultivos algales se inician con cultivos stock que son cultivos iniciadores mantenidos en tubos de vidrio (20 x 160 mm), en condiciones aspticas. Luego se deben seguir un proceso de peridicas diluciones o sembrados utilizando como inoculos los cultivos precedentes, teniendo siempre en cuenta el mantenimiento de todos los niveles de cultivo afn de evitar interferencias en el proceso productivo.

Para la preparacin de los cultivos algales en cualquiera de sus niveles es necesario recurrir al uso de soluciones nutritivas stock debido a que la cantidad de nutrientes es pequea y difciles de pesar; asimismo, el uso de stock concentrados permite ahorrar tiempo y reduce el potencial de contaminacin. Obviamente se debe tener en cuenta las reglas de asepsia para el sembrado, repiques y transferencias de inoculos y preparacin de las soluciones stocks as como del material a utilizar.

En la siguiente tabla y figura, se resumen los diversos niveles de los cultivos algales as como los parmetros ms importantes de su manejo.

En la preparacin de las soluciones Stock, es importante asegurarse que la adicin de los nutrientes no alteran significativamente la salinidad.

Los cultivos stocks deben ser mantenidos por un mes y luego generar una nueva lnea de cultivo incidiendo en la aplicacin de las regas de asepsia para transferir e inocular las algas.

CULTIVOS EXPERIMENTALES EN LABORATORIO Las microalgas Chaeto ceros gracis (Divisin Baclariophyta) y

Teraselns suecica (divisin Chlorophyt) son importantes en las redes alimentarias marinas, y en cultivos masivos se han obtenido crecimientos satisfactorios que junto, a su buena calidad nutricional son utilizados como alimento vivo en cultivos intensivos de larvas de organismos acutico (moluscos, bivalvos, crustceos, peneido, etc.) de importancia comercial (Fernndez-Reiriz et al. 1989).

Respecto a las bacilarioftas la presencia caracterstica en su pared celular de Silicio, lo hacen interesante en la alimentacin de moluscos y crustceos. El elemento Silicio es agregado al m e d i o de cultivo y segn Werner (1979 ) existen al menos cuatro diferentes interacciones de la bioqumica del slice en el metabolismo general de las clulas. Como componente de una isoenzimaentre el acetil-CoA y el 2-oxiglutarato en el

ciclo de Krebs. En la sntesis de protenas especiales de los cromosomas y cloroplastos. En la regulacin de la respiracin y utilizacin de criso laminarina, y En la regulacin de la sntesis de clorofila.

En relacin a la clorofila T. suecica, se caracteriza por su delgada pared celular formada por carbohidratos de lenta digestiblidad y son considerados de buen valor alimenticio para larvas y adultos de bivalvos (Paniagua y col. 1986).

Las microalgas son muy utilizadas en magricultura, p o r lo que segn Cceres y col. (1988) en la medida que se desarrollen tcnicas simples para el cultivo masivo, los problemas de produccin de larvas de moluscos se vern disminuidos grandemente. Tambin considera que el desarrollo de sistemas de cultivo para microalgas bajo condiciones rudimentarias, tales que puedan reproducirse a bajo costo, son alternativas apropiadas para el desarrollo de unidades de cultivo a nivel masivo. En consecuencia las investigaciones a realizar pretende buscar las ventajas del uso de

diferentes fuentes nitrogenadas, inyeccin de C02 en los cultivos y su influencia en el crecimiento de las microalgas, asimismo la realizacin de cultivos heterotrfcos utilizando fuentes orgnicas de N y C a fin de evaluar sus efectos en el crecimiento y morfologa de las microalgas. OBJETIVOS: OBJETIVO GENERAL: Evaluar el efecto de la fuente nitrogenada y concentracin de silicatos en el crecimiento y contenido de lpidos y carbohidratos de G gracilis y el efecto del N y C orgnicos en el crecimiento de T. suecka.

OBJETIVOS ESPECFICOS:

Determinar la tasa de crecimiento (u) de C. gracilis segn la fuente nitrogenada (nitrato de sodio, sulfato de amonio y rea) en interaccin con ia concentracin de silicato (30, 60 y 120 mg. L ) utilizados en el medio de cultivo.

Determinar el contenido de carbohidratos (mg. g* ) de C. gracilis segn la fuente nitrogenada (nitrato de sodio, sulfato de amonio y rea) en interaccin con la concentracin de silicato (30,. 60 y 120 mg. L"1) utilizados en el medio de cultivo.

Determinar el contenido de lpidos (mg. g*) de C. gracilis segn la fuente nitrogenada (nitrato de sodio, sulfato de amonio y rea) en interaccin con la concentracin de silicato (30, 60 y 120 mg. I/1) utilizados en el medio de cultivo.

Determinar el efecto del C02 en el crecimiento de C. gracilis. Determinar el efecto d medio Scenedesmus en el crecimientos de G gracilis Determinar el efecto del N y C orgnico en el crecimiento de T. suecica en cultivos heterotrfcos.

MATERIALES Y MTODOS

MATERIAL BIOLGICO

La poblacin del presente estudio estuvo constituida por la cepa G gracilis y T. suecica procedentes del Laboratorio de Cultivos Marinos del IMARPE, y mantenida en agua de mar filtrada enriquecida con medio F/2 Guillard modificado (1975) bajo condiciones semicontroladas. Durante las experiencias realizadas se tomaron registros del pH con pH Testr 2 WATERPTROOF con compensacin automtica de.temperatura y con exactitud de 0.1 pH; de la temperatura ambiental y de la suspensin algal con termmetro simple de 0.01 C de sensibilidad. Asimismo, los cultivos fueron iluminados continuamente con un fluorescentes de 40 Watts.

VOLMENES DE INOCULO: Se desarrollaron cultivos en matraces de 250 mi. que luego fueron utilizados como inculos para los cultivos experimentales de 1 500 mi y 3,000 mi. las unidades experimentales consistieron de recipientes plsticos a los que se les inyect aire continuamente procedente de un Blower (Fig. ). Los cultivos mantenidos con aireacin constante (300 m l - m i n " ) , con la finalidad de mantener las clulas en suspensin, evitando la sedimentacin, y,aumentando el contacto de las clulas con la fuente de luz, adems de proveer el dixido de carbono necesario para el crecimiento y estabilizar el pH de los cultivo (Guillard, 1975).

CRECIMIENTO ALGAL Los ensayos con los tratamientos fueron realizados por triplicado teniendo una duracin de 7 da cada uno y se utiliz agua de mar natural esterilizada qumicamente con hipoclorito de sodio (Fig. 7). El mtodo de cultivo fue de tipo Baten, el que se implementa una vez y se cosecha completamente luego que la poblacin ha alcanzado un nivel apropiado de densidad (Uribe, 1992).

Para determinar el crecimiento algal se realizaron contajes celulares mediante el

uso de cmara Neubauer y un microscopio binocular as como, lecturas i fotocolorimtricas (SPECTRONIC BAUSH 20) para determinar la densidad y biomas de los cultivos.

El valor de K fue calculado mediante la aplicacin de la siguiente ecuacin (ecuacin de Ford-Walford modificada), tomndose los valores de a

poblacin a partir del punto de inflexin:

N ( t + At) = a + b N t

El resto de los parmetros, se determinaron mediante la ecuacin de Verhulst con base en una regresin lineal por mnimos cuadrados:

Ln (K-N)/N = a rt

DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS Y LIPIDOS:

Los cultivos experimentales al llegar al inicio de la fase estacionaria sern cosechadas por centrifugacin a 3 000 rpm. por 15 min. y sern lavadas con agua destilada y secada en estufa a 60C durante 24 horas para luego ser colocadas en un desecador por 45 min. Posteriormente , se pesarn y por diferencia de pesos se obtendr el peso seco iota! de cada cultivo. Para la determinacin de carbohidratos totales se utilizar la tcnica descrita por Dubois et al. (1965) y para los l p i d o s

totales, la tcnica de Bligh & Dyer (1959) y Marsh & Winstein (1966).

TRATAMIENTO ESTADSTICO: Consistir en relacionar las fuentes nitrogenadas y las concentraciones de slice con el crecimiento algal y las concentraciones de carbohidratos y lpidos totales, a fin de establecer correlaciones y/o regresiones. Asimismo, los

diferentes datos de los tratamientos sern sometidos a anlisis de varianza (ANVA) siguiendo el diseo completamente al azar y se aplicarn pruebas de significancia estadstica, tales como F-snedecor para las varianzas y t-student para las medias.

RESULTADOS Y DISCUSIN EFECTO DE LA CONCENTRACIONES DE SILICATO EN EL CRECIMIENTO DE G. gracilis. En los siguientes cuadros y figuras se muestran el efecto de la concentracin del silicato en el crecimiento de Ck gracilis

De los resultados obtenidos a la fecha, es p o s i b l e demostrar que el crecimiento de Ck. graciis es mayor a LO ml.L" de silicatos al parecer, por la adecuada disponibilidad del nutriente Si que para el caso de las diatomeas puede ser considerada como sustrato limitante. S i n embargo, es necesario evaluar el efecto de concentracin de Si ms altas por cuanto el medio f/2 de Gullard es usado para muchas especies de diatomeas.

En la figura 8 se observa una larga fase LAG, de casi 3 das, siendo necesario determinar el tamao de inoculo ideal para la realizacin de otros ensayos, cabe mencionar que las lneas quebradas de las curvas de crecimiento se deben a errores de muestreo, sedimentacin algal y principalmente parque son valores puntuales. En tal sentido se ha previsto para anlisis posteriores, la aplicacin de un modelo logstico para obtener curvas de crecimiento noblacional de las algas.

En la figura 9 se observa poco crecimiento alga! debido a la procedencia del inoculo que estuvo en fase estacionaria; sin embargo debido al adecuado tamao del inoculo, stos cultivos no presentan fase LAG y cuya fase de crecimiento logartmico o LOG dura 04 das.

Cabe destacar que todos los cultivos presentan clulas unialgales debido a las

adecuadas condiciones de crecimiento que permiten la reproduccin asexual de las diatomeas.

Respecto a las fluctuaciones del pH, stas se hallan dentro de lo normal (tablas y 7) observndose ligero incremento del pH de los cultivos que estn creciendo activamente debido a que la fotosntesis permite el consumo del C02 y posibilita la presencia del bicarbonato y carbonatos. Asimismo, es posible observar que los cultivos al entrar en fase estacionaria incrementan a presencia del pH.

Respecto a la temperatura de los cultivos, stos varan poco siguiendo las fluctuaciones de la temperatura ambiental (tablas y 7) merced a la continua aireacin y las condiciones cerradas del laboratorio. El tamao de] inoculo algal va a permitir la presencia o no de una fase o de adecuacin as como influir en la determinacin de las tasas especficas de crecimiento (u), observndose en las tablas 8 y 9 que stos valores son mayores en los cultivos que crecen mejor (1.0 ml.L"1 de silicato) y sus valores son ms altos en aquellos cultivos creciendo exponencialmente tabla 9 ya que como puede observarse en las figuras 8 y 9.

Los valores de la constante de crecimiento (db.da) varan en relacin al tiempo en que los cultivos entran en fase estacionaria siendo ms altos en aquellos cultivos que obtienen menores incrementos poblacionales (tablas 8 y 9).

Al aumentar la concentracin de silicatos aumenta la cantidad de diatomeas, razn por la cual se podra decir que los silicatos son muy buenos promotores de algas en especial de las diatomeas (Roa, 1999) y segn Werner (1979 ) la diatomea Cycotella ctypca creciendo exponencialmente son capaces de tomar un exceso de cido silcico en la oscuridad 5 horas despus que la divisin celular ha cesado. Estas clulas pueden usar ste exceso de silicato almacenado para mantener pro tena.

Al parecer los cultivos dosificados con mayor cantidad de silicatos pueden seguir creciendo merced a su capacidad de almacenamiento de dicho nutriente en la luz cuando

estn creciendo muy activamente.

EFECTO DEL TAMAO DE INOCULO EN EL CRECIMIENTO DE G gracis.

Es bien conocida la tendencia de los cultivos algales diluidos a presentar una larga fase Lag debido a la previa adecuacin de los sistemas enzimticos y restablecimiento de las concentraciones de sustratos a niveles necesarios para rpido crecimiento (Fogg, 1971). Tambin se ha establecido que una induccin en la multiplicacin celular puede ser ms aparente que real si una gran proporcin de clulas inoculadas son no viables; por otro lado, una mayora de clulas pueden ser viables pero no en una condicin para dividirse inmediatamente.

A fin de evitar una larga fase Lag es recomendable utilizar inculos de cultivos creciendo exponencialmente y en adecuada concentracin o biomasa algal. EFECTO DEL C02 EN EL CRECIMIENTO DE C. gracilis.

Los cultivos dosificados con C02 crecen ms rpidamente por el aporte de la fuente inorgnica de carbono que favorece la fijacin fotosinttica de dicho nutriente; asimismo, ste crecimiento es influenciado por las fluctuaciones del pl. Desde que el pH del cultivo indica la cantidad de C02 disuelto disponible para las algas es de esperarse m ejor crecimiento.

Segn Roldan (1992), existen algunas relaciones entre la fotosntesis COZ y el pH de manera que si el agua contiene una apreciable cantidad de bicarbonatos con el C02 en equilibrio que permita sta solucin, una remocin del C02 mediante la fotosntesis romper este equilibrio y la relacin reversiva continuar hacia la derecha precipitando el carbonato de calcio de la siguiente ra asi era:

Ca(HC03)2 <----->CaC03

H20 +

C02

Por lo tanto se demuestra que la actividad fotosinttica, al consumir C02 hace que el medio

se vaya basificndose cada vez ms hasta pH 8.3 nivel en que desaparece el C0 2 y aparecen los bicarbonatos. El mantenimiento de las condiciones neutrales de pH por la adicin de CO se debe a la existencia del sistema C02-HC03-C03, presentes e el agua de mar que acta como un buffer o amortiguador impidiendo que el medio de cultivo se acidifique o basifique bruscamente. En consecuencia basado en ste principio, se entiende porqu el medio acutico se torna bsico durante la fotosntesis y cido durante la respiracin.

El efecto del C0 2 en la tasa de crecimiento y el pH son notorios (Fig. 11) indicando el consumo del COI por las algas, su incorporacin en biomasa algal. La dosificacin peridica del C0 2 fue realizada mediante la agitacin de la botella gaseosa (Coca Cola) por 30 - 60 segundos permitiendo la rpida disminucin d\ pH y su inmediata recuperacin como producto de la asimilacin del C02 por las algas. Durante la experiencia realizada, el cultivo dosificado con C02 presenta mayor claridad de la suspensin algal dehido, al parecer, por la disolucin de las sales minerales del medio de cultivo. Cabe destacar que el ingreso continuo de C02 en pequeas cantidades, permite una gradual y sostenida variacin del pH del cultivo observado durante la parte Segn los resultados obtenidos, es notoria la relacin entre el tamao del inoculo y la duracin de la fase Lag, observndose la inexistencia de sta fase cuando los cultivos se inician con 100 x 104cel.m1/2.

Cabe destacar que los 3 tratamientos ensayados, fueron dosificados con el mimo inoculo de un cultivo creciendo en fase Log o exponencial observndose ntidamente el efecto del tamao del inoculo en la presencia y duracin de la fase Lag.

Estos resultados son importantes porque permiten adecuar el manejo de los cultivos de C gracUts en funcin de los requerimientos de biomasa algal y tiempo de abastecimiento de dichos cultivos, es decir, permiten incrementar la certeza de los programas de produccin de micro algas en condiciones de laboratorio. Adems se debe tener en cuenta que el valor nutricin al de las micro algas depende de la fase de crecimiento, siendo ms valiosas las que estn ofreciendo ms rpidamente que los cultivos viejos. final de la experiencia, posibilitando el desarrollo de un diseo que mantenga constante el pH mediante la inyeccin controlada del C02 en el cultivo.

Como se mencion lneas arriba, la presencia de carbn ato s y bicarbonatos en el agua de mar, permite la adecuada utilizacin del C02 por las microalgas, considerndose al agua de mar como muy productivo. La referida basicidad, indicadora de la presencia de bicarbonatos, se mantiene durante toda la experiencia en el cultivo sin CO2.

Tambin es importante tener en cuenta que la dosificacin de C02 debe realizarse solamente en cultivos de 2 o ms litros de cultivo, en caso contrario, en pequeos volmenes de cultivos no prosperarn por la acidez el medio de cultiv ya que la alcalinidad del agua de mar rpidamente ser rebasada por C02 inyectado.

EFECTO C. gracilis.

DEL

MEDIO

SCENEDESMUS

EN

EL

CRECIMIENTO

DE

La principal finalidad de cualquier medio de cultivo es soportar el rpido crecimiento durante largo tiempo sin requerir frecuentes re emplazamientos o dosificacin de sus componentes, asimismo que la composicin de sus nutrientes este bien balanceada, el medio Scenedesmus usado en la produccin masiva de Scenedesmus amias al aire libre, se caracteriza por estar compuestos de fertilizantes utilizado en la agricultura convencional (urea, KCL, H3P04) y cuyas soluciones stocks se preparan utilizando agua de cao, asumindose la presencia de micronutrientes aportados por el agua de cao y las impurezas presentes en los fertilizantes comerciales utilizados. Adems en los ensayos realizados, el agua de mar empleado proporciona importantes nutrientes. El medio Scenedesmus contiene mayor cantidad de nitrgeno que el medio F/2 debido a que la clorofila Se. acutusse caracteriza por su alto contenido de protena (50, 55%) de tal manera que durante los ensayos se reemplazaron las sustancias aportaderas de N, P, K Fe y mieronutrientes del medio f/2 por el medio Scenedesmus (Tabla 11) mantenindose las

cantidades de vitaminas solamente. De los resultados obtenidos (Fig. 12) es posible observar similares crecimientos de los medios Scenedesmus y f/2 o control, debido a que a dilucin (1/3) d medio Scenedesmus proporciona elementos nutritivos para G graciBs en concentraciones ms o menos adecuadas (Tabla 12).

Respecto al pH, las fluctuaciones (Fig. 12) observadas son caractersticas de cultivos creciendo activamente ya que dichas fluctuaciones obedecen a la dinmica de consumo del carbono inorgnico (C02, HCO y C03) por las algas durante el proceso fotosinttico siendo ms alto el pH conforme las algas consumen ms C02 libre. Por otro lado, las tasas de crecimiento obtenidas mediante determinacin es foto calorimtricas, demuestran la Misma tendencia (Fig. 13) ratificando el positivo efecto del medio Scenedesmus en el crecimiento de C. gracilis.

Segn Sorokin(I975) la D.O. (densidad ptica) es particularmente apropiado para determinar la tasa de crecimiento debido a la facilidad de tomar repetidas lecturas del incremento de laturbidez en el mismo cultivo Batch. Es decir, se puede tomar lecturas y retornar el lquido utilizado al mismo cultivo. Adems , la tcnica de la turbidez permite ahorrar tiempo e incrementar la exactitud de las determinaciones del crecimiento algal. Segn la tabla 13 en la que consignan las tasas de crecimiento exponencial denotadas como A Log2 D.O. permite ensayos juzgar como se observ la el crecimiento de exponencial fase de durante los asimismo, indicara duracin dicha crecimiento.

Finalmente es importante mencionar que el rpido crecimiento exponencial

observado (2-3 das) se debe al adecuado tamao del inoculo empleado (60 x l04e.ml-1 ).

De acuerdo a los resultados obtenidos, es posible usar el medio Scenedesmus en la produccin masiva de C gracilis previo ajuste, mediante diluciones, de las concentraciones de los nutrientes N, P, K y Fe. Las experiencias realizadas demuestran la factibilidad de su uso con las consiguientes ventajas de la disponibilidad de los fertilizantes en el mercado local y su menor costo en comparacin con los nutrientes aportados por sustancias qumicamente puras, v

EFECTO DE LA FUENTE NITROGENADA Y. CONCENTRACIN DE SILICATO EN EL CRECIMIENTO Y CONTENIDO DE LIPIDOS Y CARBOHIDRATOS DE C. gracilk La mayora de las algas pueden usar nitrato, nitrito o rea como fuente de nitrgeno. No solamente como fuentes de nitrgeno sino tambin la fuente de ste elemento usado en el medio de cultivo puede producir cambios importantes en el crecimiento y composicin bioqumica de las clulas algales (Fabregas, 1989). De acuerdo a nuestros resultados, los cultivos dosificados con nitrato de sodio y rea son los que mejor crecimiento han mostrado (Figs. 14, 15 y 16) siendo notorio el efecto de la concentracin del silicato. A mayor concentracin de silicato se observa mayor crecimiento. Los

cultivos ms eficientes con rea, segn Fabregas (1989) puede deberse a la naturaleza orgnica de la rea que contiene carbono y es hidrotizada por la enzinu ureasaproduciendo dos moles de amonio y una de C02. La mayor densidad celular obtenida con la urea probablemente es debido a sta molcula de C02 del metabolismo de la rea.

Asimismo, Peers (2000) sostiene que la rea es rnetabelizada a amonio y C02 a travs de una de fas dos vas: Ureasa o ATP y que la ureasa requiere de Zinc y que la EDTA incrementa la actividad enzimtica. Por otro lado, Flynn (1992) considera que las diferencias en la utilizacin del nitrgeno, afecta la fisiologa y asimilacin de las algas, p.e. la asimilacin o\ nitrato requiere un sistema de incorporacin para transportar en accin contra una gradiente de potencial electroqumico. Respecto al metabolismo del silicato, su transporte es mediado por el sodio siendo muy importante la proporcionalidad de ambos elementos y segn Bhattacharyya and Volcani, citado por Martin-Jezquel (2000), el transporte es electrognica y la proporcin Si (OH) 4: Na+ es 1:1. Resultados demuestran que las diatomeas mantienen concentraciones super saturad as de Si intracelular en una forma soluble, en forma de complejos poicdos con material orgnico o secuestrados en vesculas especializadas. Tambin se conoce que la mayora de las diatomeas contienen vacuolas internas para almacenar nutrientes que pueden representar el 30 a 90% del volumen total celular (Smayda, citado por Lomas, 2000). En consecuencia es importante realizar la evaluacin econmica del uso del silicato en la produccin de diatomeas ya que segn los datos estadsticos obtenidos no hay diferencias significativas en el crecimiento y la

concentracin del silicato con las tres fuentes nitrogenadas utilizadas (Tabla 14) Tambin es importante observar las variaciones del pH de os cultivos presentndose adecuadas fluctuaciones en los cultivos con rea revelando mayores tenores de pH segn progresa el proceso fotosinttico. La variacin del pH en el medio no solamente afecta la tasa de incorporacin dl C02 sino tambin los procesos metablicos en las diatomeas, afectando los procesos de transporte de membrana y las funciones metablcas relacionadas en la regulacin del pH celular. Ciertamente las enzimas relacionadas en las vas metablcas en las clulas tienen diferentes pH ptimos, implicando que una elevacin en el pH interna probablemente afectara la tasa de los procesos metablicos. Algunos reportes indican, de hecho, que las clulas algales son capaces de mantener constante e i p H interno con cambios de pH en ei medio (Taraldsvik, 2000). Igualmente, los resultados obtenidos de los cultivos realizados con las diferentes

fuentes nitrogenada y concentraciones de silicatos, revelan cierta proporcionalidad en los parmetros poblacionales (Tabla 15) en la quQ los datos de peso seco deben cuidadosamente interpretados ya que puede haber error por la salinidad y eitus orgnico presente en las muestras. Nuevamente estos resultados no muestran diferencias estadsticas significativas, es decir la fuente nitrogenada no presentan notorios incrementos en el crecimiento de los cultivos, lo mismo se puede sostener para las diferentes concentraciones de silicato usado. En relacin a la composicin de lpidos y carbohidratos, la mayor diferencia entre la composicin surge de los lpidos almacenados, ms bien que de los carbohidratos como fuentes principales de carbono y energa, p.e. en Chlorela se ha demostrado que la va carbonada pu$dz ser influenciada por la fuente de nitrgeno, y que el nitrgeno inorgnico incrementa el flujo de carbono del ciclo de Calvin ai ciclo TCA y a sus derivados nitrogenados y a nivel menor hacia lpidos a expensas del flujo de carbono hacia los carbohidratos e reserva (Cederlo, 1975). Asimismo, cuando un cultivo est privado de un nutriente esencial, la divisin celular se para y la fraccin de carbono dirigido a lpidos y carbohidratos pueden ser grandemente incrementado a expensas de la sntesis proteica. En la mayora de algas, la acumulacin de lpidos es impuesta por las condiciones de deficiencia de nitrgeno (Sukensk, 1991). Segn nuestros resultados, las muestras para determinar las concentraciones de carbohidratos y lpidos se realizaron en condiciones de agotamiento de nutrientes cuando los cultivos han alcanzado la fase estacionaria inicial. Cambios en la composicin bioqumica de las diatomeas responde al incremento de la limitacin del nutriente es reportado por varios autores (Osborne, 1986). La mayor acumulacin de carbohidratos se observa en cultivos dosificados con nitrato de sodio y mayor concentracin de lpidos en cultivos con nitrito de amonio (Fig. 17). En este aspecto es lamentable mencionar que los resultados obtenidos no son confiables para realizar una acertada discusin por cuanto, los respectivos anlisis fueron fuertemente interferidos sor el limitado acceso a los laboratorios del Canipus Universitario por alumnos revoltosos.

EFECTO DEL N Y C ORGNICOS EN EL CRECIMIENTO DE T. suecica..

La habilidad de algunas algas para incorporar sustratos especficos y regular sus sistemas de transporte en respuesta a parmetros medioambientales es de fundamental importancia en !a he tero trfica (Hellebust, 1997), Sin embargo, segn Fe.og (1995) los cultivos helero tro fieos presentan pro Memas-Jales como el limitado uso de sustratos orgnicos, laprdidade la habilidad para producir algunos productos inducidos por la luz y la inhibicin del crecimiento por sustratos orgnicos encima de ciertas concentraciones.

Diversos componentes orgnicos conteniendo nitrgeno incluye aminocidos libres contribuyen a los requerimientos de nitrgeno de fitoplancton tes marinos (Qafaiti, 1989) asimismo., la entrada de aminocidos libres pueden tener significativa contribucin en ios requerimientos de nitrgeno y carbono reducido.

Frecuentemente se ha descrito microalgas creciendo sobre aminocidos aadidos exgen ament as como se ha reportado la sntesis de protenas y otros polmeros

complejos requeridos para el crecimiento heterotrfico de diatnicas antarticas bajo condiciones limitadas de luz. Asimismo, los aminocidos absorbidos son generalmente y a menudo utilizados como fuentes nitrogenadas para el crecimiento con la pecuiaridad de que los aminocidos pueden servir como fuentes de nitrgeno y carbono y estn por lo tanto, bajo una compleja red de control (Hellio, 1999); asimismo organismos capaces de crecer hetero trficamente sobre sustratos especficos, son capaces de utilizar sustratos en las vas respiratorias para generar suficiente energa para el crecimiento y en las vas biosintticas para la produccin de esqueletos carbonados para todos los componentes celulares (Hellebust, 1997).

AMINOL: A efectos de evaluar el efecto de aminocidos en el crecimiento de T. suecica, se dosificaron cultivos algales con varias dosis de Animo!, que es un estimulante de vegetales superiores utilizado en el cultivo de frutales, flores, hortalizas y plantas herbceas. Es un producto orgnico, natural, ecolgico, Con una alta cantidad de acido aspartico y acido glatamico que son precursores del resto de aminocidos. (Tabla 17).

Durante las experiencias previas con Ammol se pudo .observar e efecto negativo de la oscuridad generada por la aplicacin de altas concentraciones de la sustancia y disminucin d pH (7.1 - 7.2); asimismo, era notoria la precipitacin alga! por la alta viscosidad de la suspensin y la formacin de espuma superficial Los resultados adversos fueron observados cuando se emplearon concentraciones encima de 3 y 5 mi. del Aminol por litro de medio de cultivo.

Posteriores ensayos demostraron la eficacia del Aminol en el crecimiento de T. suecka en concentraciones menores de 2 ml.L'1 (Fig. 18) en las que los valores del pH fueron bsicas (7.5 - 8.4).

La dosificacin del Aminol a los cultivos algales genera cierta atenuacin de la iluminacin por lo que m cultivos diluidos podra ser favorable pero en cultivos ms densos inducira condiciones de heerorofa en las que el sustrato, es decir los aminocidos libres, o intermediarios de las vas metablicas energticas podran sustituir a la fotosntesis.

Los mayores resultados se obtuvieron a los 3-4 das coincidiendo con Qafaiti (1989) cuyos resultados en Platymonas, sinnimo de Tetraselmis, muestras picos de crecimiento a las 72 horas y.que la luz influye en la asimilacin de los aminocidos, siendo 7.5 veces que en la oscuridad. De los resultados obtenidos es posible demostrar que a bajas concentraciones de Aminol (0.5 mi.L") se obtiene mejores crecimientos de T. sucica, permitiendo el empleo de sustancias orgnicas accesibles y econmicas para la produccin masiva de micro algas en condiciones hetero trficas. Finalmente consideramos pendiente la evaluacin del efecto de las bacterias generadas por el uso de stos sustratos orgnicos en las algas cultivadas respecto a su valor nutricional. ENSILADO DE PESCADO

El ensilado de pescado es un producto de fcil elaboracin basado en la acidificacin del medio con la finalidad de favorecer la protelisis del pescado, lo que puede lograrse tanto qumicamente, usando cidos orgnicos (cido frmico), cidos inorgnicos (cido sulfrico, cido clorhdrico), como en forma biolgica con bacterias lcticas homofermentadoras de sustancias ricas en azcares fermentables; tambin pueden usarse levaduras y mohos. (TP.1995).

Por su composicin qumica (Tabla 18) considerada como una sopa de aminocidos y alto contenido de elementos minerales, es factible su utilizacin en la ejecucin de cultivos algaies en condiciones de helerorofa.

En los ensayos realizados, se utiliz 3,5 g. de ensilado de pescado diluido en 350 ml. de agua de mar, de los cuales se tomaron 50, 100 y 200 ml. respectivamente para obtener concentraciones en los cultivos de 0.5, 1 y 2.0 g.L" , frente aF/2 considerado como control. Como se muestra en la siguiente figura, la menor concentracin {0.5 g.L") ensayada es la que permiti obtener mejores crecimientos y la coloracin de los cultivos fue ms saludable (verde oscuro). Posiblemente a mayor concentracin de ensilado de pescado los cultivos crecen menos por la disminucin del pH o a la coloracin ambarina proporcionada por el ensilado que dificultara la utilizacin de la luz. . .

En la tabla 19 se observa las variaciones del pH de los cultivos, observndose dos aspectos importantes: Disminucin del pH en funcin a la cantidad de ensilado aplicado., Recuperacin del pH conforme crecen los cultivos.

El efecto positivo, al parecer, se debe a la presencia e incorporacin de aminocidos en cantidades adecuadas para sostener el crecimiento de T. suecica; asimismo, el rango de pH (7.4 - 8.2) est dentro de lo indicado para los cultivos de dicha alga. Segn Qafaiti (1989), la luz interviene en la tasa de asimilacin de aminocidos cidos, bsicos y neutros, que en los ensayos realizados se reflejan en las fluctuaciones del pH (Tabla 19). indudablemente la cintica de la asimilacin de ios aminocidos presentes en el ensilado de pescado, est relacionado con las fluctuaciones de! pH, mostrando similar tendencia a lo observado durante la fotosntesis, es decir, tienden a incrementarse conforme los cultivos crecen.

CONCLUSIONES

La esterilizacin del agua marina mediante la aplicacin de hipoclorito de sodio y posterior neutralizacin con tiosulfato de sodio ha resultado ser muy eficaz. En cultivos de C. gracilis, la urea es la mejor fuente nitrogenada y la concentracin de silicato no influye en el crecimiento debido a su acumulacin intracelular.

Las variaciones del pH de los cultivos mantienen estrecha relacin con el crecimiento de los cultivos algales por su influencia en el proceso fotosinttico. La dosificacin de aminocidos en cultivos T. Suecica favorece su consumo e incrementa las densidades celulares posibilitando la realizacin de cultivos hetertrofos.

Por razones ajenas a nuestra voluntad no se pudo obtener datos confiables de los anlisis de lpidos y carbohidratos.

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