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Tincin o coloracin de bacterias Los procedimientos que ponen de manifiesto diferencias entre las clulas bacterianas o en partes una

clula se conoce como tcnica de coloracin diferenciales. Son algo mas que elaboradas que la tcnica simple en la que las clulas se someten a una sola solucin colorante o reactivo colorante. Las tinciones se combinan qumicamente con el protoplasma bacteriano; si la clula no ha muerto el proceso termina de hacerlo. El mtodo, por consiguiente, es bastante drstico y puede producir artificios. Las tinciones mas frecuente son sales. Las tinciones bsicas consiste en un catin coloreado unido a un anin incoloro, mientras las cidas constituyen exactamente lo contrario, unido a dos cationes. Las clulas bacterianas son abundantes en cidos nucleicos, los cuales portan cargas negativas en formas de fosfatos. Los colorantes cidos no tien a las clulas bacterias, y por tanto, pueden utilizarse para teir al fondo con un color de contraste. Las tinciones bsicas tien uniformemente en las clulas bacterianas, a menos que antes de destruyan el ARN del citoplasma. Tambin se pueden usar tcnicas de tincin especiales para flagelos, membranas celulares, paredes celulares, grnulos, nucletidos y esporas Tincin Gram. Una caracterstica taxonmica importante de las bacteria es su respuesta a la tincin a de Gram esta caracterstica parece ser fundamental, reaccin a la tincin se correlaciona a con muchas otras propiedades morfolgicas en maneras relacionadas filogenticamente. Microorganismo potencialmente grampositivo puede verse como tal cuando concurren un conjunto de particular de condiciones ambientales en un cultivo joven. El procedimiento para tincin de Gram se inicia con la aplicacin de un colorante bsico el cristal de violeta. Luego se aplica una solucin de yodo en este momento todas las bacterias de tien de azul. Continuacin las clulas se tratan con alcohol las clulas grampsitiva contienen el cristal violeta-yodo y permanecen de color azul; en cambio las gramnegativa se descoloran completamente por el alcohol. Por ultimo se aplican un colorante de contraste safranina, que es un colorante rojo. De esta manera, las clulas gramnegativas, previamente descoloradas, toman el colorante de contraste y las clulas grampositivas ahora aparecen prpura. La base de la reaccin diferencial de Gram es la estructura de la pared celular. Esta tcnica diferencial es una de las de uso mas comn en microbiologa. El frote bacteriano teido se somete a las soluciones siguientes en el orden en que se indica: cristal violeta, alcohol y safranina o alguna otra solucin de contraste conveniente. Las bacterias gramnegativas contienen un gran porcentaje mas alto de lpidos que de las bacterias grampositivas. Las paredes celulares de la bacterias gramnegativas son tambin mas delgadas que las grampositivas con alcohol extrae lpidos con lo cual se aumenta la porosidad o permeabilidad de la pared celular gramnegativa. As el complejo cristal violeta-yodo (CV-I) puede extraerse en los organismos gramnegativos y de esta manera se destien las paredes celulares de las bacterias grampositivas, por su composicin diferente (bajo contenido lpido) se deshidratan alcohol y se logra extraer el complejo (CV-I). En las bacterias (CV-I) queda retenido en la pared despus del tratamiento con etanol, la cual se supone se supone causa una disminucin de en el dimetro de los poros glucopptido o pptidoglicano de la pared celular. Las bacterias gramnegativas tienen una cantidad mucho menor de ppidoglicano con ligaduras cruzadas menos extensas que en las paredes de las bacterias grampositivas

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se

visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella

Metodologia

Recoger muestras. Hacer el extendido en espiral. Dejar secar a temperatura ambiente. Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.) Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las clulas gram positivas y gram negativas se tien de color azul-purpura. Enjuagar con agua. Agregar lugol y esperar entre 1 minuto. Enjuagar con agua. Agregar acetona y/o alcohol y esperar 4 segundos (parte critica de la coloracion) Enjuagar con agua. Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar 1-2 min Este tinte dejar de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas. Enjuagar con agua.

Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin

Tcnica de la coloracin gram


[editar] Fijar un frotis

Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra. Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lmina. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aqul en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

[editar] Tincin

Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr

cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 C.
[editar] Enjuague

Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo... La solucin de cristal violeta, se recomienda sea al 1% .
[editar] Mordiente

Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 3 minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijacin a las bacterias.
[editar] Decoloracin

Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra ms lquido azul.
[editar] Lavado y secado

Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.
[editar] Tincin de contraste

Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto.
[editar] Nuevo enjuague

Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica.

[editar] Bacterias resistentes a la tincin Gram


La siguientes bacterias de naturaleza grampositiva, tien como gramnegativas:

Mycobacterias (estn encapsuladas). Mycoplasmas (no tienen pared). Formas L (prdida ocasional de la pared). Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared, respectivamente).

[editar] Utilidades
En el anlisis de muestras clnicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:

Identificacin preliminar de la bacteria causal de la infeccin. Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos identificados en la tincin de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor nmero de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados as como la atmsfera de incubacin.

A partir de la tincin de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esfrica. Pueden aparecer aislados despus de la divisin celular (Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos). Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada. Tambin pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rgida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen forma de "coma", o curvados, entonces se los designa vibrios.

[editar] Fundamentos de diferenciacin de Gram positivo y Gram negativo


Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglucano (tambin conocido como murena)

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.

[editar] Causas que alteran la tincin de Gram


I: Edad de la bacteria. II: Errores del operador. III: Uso de antibiticos

A pesar de la gran utilidad del la tincin de Gram, este mtodo debe ser valorado con precaucin, ya que la reaccin puede variar segn la edad de las clulas y la tcnica empleada, por ella junto a la muestra deben teirse controles con grampositivas y gramnegativas.
Examen microscpico de las muestras clnicas levemente modificadas Tincin Simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol). El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped, pero no acta sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos. La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la cpsula aparece

como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos. En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tincin con tinta china.

Examen microscpico de las muestras clnicas muy modificadas Diferencial

Tincin

Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en funcin de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin qumica. Los ejemplos clsicos sera la tincin de GRAM o la de Ziehl-Neelsen En la imagen: BGN y levaduras en una tincin GRAM

El microscopio (de micro-, , pequeo, y scopio, , observar) es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeos para ser vistos a simple vista. El tipo ms comn y el primero que se invent es el microscopio ptico. Se trata de un instrumento ptico que contiene dos o ms lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refraccin. La ciencia que investiga los objetos pequeos utilizando este instrumento se llama microscopa.