Universidad de Chile Facultad de Ciencias Departamento de Qumica Qumica Biolgica Lic.

Ciencias mencin Qumica

Laboratorio N5

Cintica enzimtica Parte b y c.

Integrantes: lvaro Etcheverry Matas Leal. Profesora: M Cecilia Rojas Fecha del Entrega: Jueves 19 de Mayo de 2011

INTRODUCCIN

El objetivo de este laboratorio fue el de determinar la actividad cataltica de la fosfatasa cida de grmen de trigo a distintos tiempos de incubacin, y finalmente realizar una curva de progreso de la reaccin enzimtica. Se realizaron distintos ensayos enzimticos y se consideraron distintos controles para poder confirmar que la reaccin fuera catalizada por la enzima en cuestin. MTODOS En primer lugar se confeccion una curva de calibracin con una solucin de pnitrofenol 60 M (que es el producto final de la reaccin), utilizando para ello, volmenes entre 1 y 5 mL y luego se llev a un volumen de 6 mL con una solucin de NaOH 0.1 M. Las distintas soluciones fueron medidas en un espectrofotmetro utilizando como blanco la solucin de NaOH 0.1 M utilizada anteriormente, esto debido a que el p-nitrofenol absorbe a 405 nm. Los datos obtenidos estn en la siguiente tabla: Tabla N1: Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de p-nitrofenol.
Volumen de pnitrofenol 60 M (mL) 1 2 3 4 5 Volumen de NaOH 0,1 M (mL) 5 4 3 2 1 Volumen total (mL) 6 6 6 6 6 Concentraci Absorba n pncia nitrofenol (M) 10 20 30 40 50

HO O2N O

O P

+
N

f o
H2O

s f a t a s a
O2N

OH

HPO4

-2

O2N

OH

a O

O2N

FiguraN1: Reaccin catalizada por fosfatasa cida, adems se muestra la estructura del p-nitrofenol en su forma coloreada que absorbe a 405 nm. Luego se defini un volumen de incubacin adecuado para distribuir con exactitud los componentes del medio de reaccin, segn se muestra en la Tabla N2, se confeccionaron los 5 tubos sin agregarles el extracto enzimtico y se incubaron en un bao termorregulado por 3 minutos a 37C. Una vez transcurridos los 3 minutos de incubacin se le agreg la enzima y se dej que transcurriera la reaccin por el tiempo indicado, excepto ara el control tiempo cero al cual se le agreg inmediatamente 5.5 mL de NaOH 0.1 M, para detener la reaccin y para poder visualizar el p-nitrofenol. Para el resto de los tubos se esper a que transcurriera el tiempo de incubacin para despus

agregar los 5.5 mL de NaOH 0.1 M; para el caso de los controles blanco de sustrato y sin enzima se detuvieron las reacciones una vez transcurridos 10 minutos de incubacin. Tabla N2: Volmenes utilizados para distribuir los componentes del medio de reaccin y las absorbancias respectivas para los distintos ensayos enzimticos.
Volumenes (mL) H2 pCitrato de sodio Enzima Tot Absorba O nitrofenilfosfat 0,1 M pH 5,0 0,4 al ncia o 25 mM mg/mL 0.1 0.1 0.2 0.1 0.5 0.1 0.2 0.2 0.1 0.1 0.1 0 0.1 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 0 0.1 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 ----

Incubacin a 5 minutos Incubacin a 10 minutos Control sin enzima Control blanco de sustrato Control tiempo cero

Finalmente se realiz una curva de progreso de reaccin utilizando para ello un tubo de ensayo que contena 2 mL de citrato 0.1 M pH 5.0, 2 mL de p-nitrofenilfosfato 25 mM, y se incub por 3 minutos en un bao termorregulado a 37C. Pasado ese tiempo se agreg 1 mL de enzima y se continu la incubacin. Cada ciertos intervalos de tiempo se extrajeron 0.5 mL del medio de reaccin y se le agregaron 5.5 mL de NaOH 0.1 M. Luego de haber tomado varias porciones a distintos intervalos de tiempo, se analizaron las absorbancias respectivas para poder determinar la cantidad de producto formado a mediad que avanzaba la reaccin, segn la tabla N3. Luego se repiti este experimento con el doble de la concentracin de enzima(????????). Tabla N3: Absorbancias medidas a distintos intervalos de tiempo.
Concentracin normal de enzima Tubo 1 2 3 4 5 Tiempo Absorban (min) cia 10 15 20 25 30 Doble de concentracin de enzima Tiempo Absorban (min) cia 10 15 20 30 40

RESULTADOS Y DISCUSIN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS Gua de trabajos prcticos Bioqumica 2011. ALBERTS, B. et al; 2005; Introduccin a la Biologa Celular; 1 Edicin; Editorial Mdica Panamericana; Mxico. STRYER, L. et al; 2001; Bioqumica; 6 Edicin; Editorial Revert; Espaa.