Laboratrio de Morfognese e Bioqumica Vegetal, Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Santa Catarina Florianpolis/SC. m2@cca.ufsc.

br

Marcelo Maraschin

Engenharia do
PESQUISA

Division of Pharmacognosy, Leiden/Amsterdam Center for Drug Research, Leiden University, Leiden, The Netherlands. verpoort@lacdr.leidenuniv.nl
Foto cedida pelos autores

Robert Verpoorte

METABOLISMO SECUNDRIO
Otimizao da produo de metablitos secundrios em culturas de clulas vegetais

esde os tempos antigos as 12.000/g, respectivamente. Todavia, alm alguns grupos taxonmicos, no sendo plantas vm sendo utilizado alto valor agregado que algumas considerados essenciais ao metabolismo das nas sociedades humadrogas de origem vegetal apresentam, basal da clula vegetal, donde surge a nas com propsitos teraesta rea demonstra um grande potencidenominao metablitos secundrios. puticos, sendo que suas al no que concerne ao desenvolvimento No mbito da interao planta/ambiente propriedades txicas ou curativas foram de novos medicamentos, uma vez que a (efeito atrativo/repulsivo a microrganisdescobertas pelo homem principalmendiversidade qumica associada diversimos, insetos, vertebrados, plantas, etc.), te enquanto este buscava por alimento. dade biolgica encontrada em ecossistedesempenham um importante papel, De fato, o conhecimento etnobotnicomas terrestres e aquticos, um imporgarantindo a sobrevivncia das espcies farmacolgico acumulado ao longo de tante aspecto a ser considerado em no ecossistema. Adicionalmente, metageraes tem servido como base para o processos e diretrizes de desenvolviblitos secundrios so utilizados em desenvolvimento de frmacos escala industrial para a prode grande importncia, tais duo de inseticidas, coranAjmalicina Quinina como : digoxina, quinina, mortes, flavorizantes, aromatizanfina, hiosciamina, cido salictes e medicamentos. Exemlico e artemisina. Neste conplos de metablitos secundtexto, os metablitos secundrios de grande importncia rios vegetais apresentam um na indstria farmacutica so grande valor do ponto de vista mostrados na Figura 1. A dessocial e econmico e, como peito do alto valor econmiexemplo, na dcada de 80 foco de alguns destes biofrmaram identificados 121 composcos, baixos nveis de produtitos de origem vegetal, provevidade tm sido usualmente nientes de 95 espcies, os quais encontrados nos sistemas de tm sido usualmente empregaproduo agrcola convencidos como teraputicos nos paonais, decorrentes de uma ses ocidentais. Alm disso, do srie de motivos. Tal fato gera total de medicamentos aprovaa necessidade de desenvolMorfina Taxol dos no perodo 1983-1994, 6% ver sistemas alternativos de so obtidos diretamente de esproduo e, neste contexto, o Figura 1: Estrutura molecular de metablitos secundpcies vegetais, sendo denocultivo de clulas e tecidos rios vegetais utilizados como biofrmacos minados produtos naturais, 24% vegetais tem sido consideraso compostos derivados e 9% do como um sistema de alto foram desenvolvidos a partir de commento de novos biofrmacos. Como potencial para a superao desse propostos vegetais cuja estrutura molecular estimativa, cerca de 110.000 compostos blema, embora algumas dificuldades conserviu como unidade precursora em tm sido identificados at o presente, cernentes sua viabilidade econmica processos de sntese. sendo que deste total, os terpenides ainda no tenham sido superadas. Do ponto de vista econmico, podeconstituem o maior grupo [~ 33.000 Em funo disso, diversas estratgias se mencionar os alcalides indlicos compostos], seguidos pelos alcalides tm sido empregadas objetivando auterpenodicos vincristina (utilizado no [~16.000 compostos] (1). Anualmente, mentar os valores de produtividade de tratamento de leucemia) e vinblastina 4000 novos compostos de origem vegecompostos bioativos em sistemas de (usado na terapia de corio-carcinomas e tal tm sido relatados, com uma tendncultura de clulas e tecidos vegetais, na doena de Hodgkins) de Catharancia de crescimento para este valor. Como incluindo a manipulao epigentica, a thus roseus, os quais tm seus valores de caracterstica geral, tais compostos moselucidao de vias biossintticas e a mercado estimados em US$ 6.000 e tram um padro de ocorrncia restrito a aplicao de tcnicas de biologia mole24 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

cular, segundo uma abordagem de engenharia de vias metablicas. O presente artigo enfoca algumas estratgias frequentemente adotadas quando se busca a otimizao da produo de metablitos secundrios em sistemas de culturas de clulas vegetais. Manipulao epigentica Provavelmente, a primeira estratgia utilizada para otimizar a produo de metablitos secundrios em cultivos celulares vegetais foi a manipulao epigentica. Tal estratgia considera a identificao e seleo de linhagens celulares de maior potencial produtivo, otimizao do meio de cultura, manipulao de fatores de ambiente (intensidade luminosa, fotoperodo, temperatura, CO , 2 O , e.g.), a influncia do nvel de dife2 renciao celular, a adio de inibidores ou precursores ao meio de cultura e a elicitao. Identificao, seleo clonal e otimizao do meio de cultura: Ao longo das ltimas dcadas, vrios relatos tm sido feitos na literatura mostrando incrementos na produo de metablitos secundrios atravs da identificao e seleo de linhagens celulares com maior potencial de biossntese/acmulo de metablitos secundrios. A seleo de clones celulares pode ser feita atravs da adio de compostos txicos (cido nicotnico, e.g.) ou seletivos ao meio de cultura, os quais atuam de modo a permitir apenas a sobrevivncia de clulas com maior capacidade de metabolizao do intermedirio, ou ainda atravs de alteraes nos fatores ambientais. Todavia, com relativa frequncia e de modo espontneo, observa-se a expresso de variao gentica em linhagens selecionadas, de modo que o potencial de biossntese do(s) composto(s) de interesse uma caracterstica instvel. As razes que determinam tal fato no so claramente conhecidas at o presente momento. A hiptese baseada na variao gentica e seleo celular (2) tem sido proposta com o intuito de explicar a heterogeneidade/instabilidade observada em culturas de clulas vegetais quanto produo de metablitos secundrios. Buscando superar tal problema, a identificao de clones de maior produtividade tem sido feita atravs do cultivo de protoplastos (single cell), ou de pequenos agregados celulares (cell nursery culture) em programas de longa durao. Os resultados indicam que para algumas espcies esta abordagem possi-

(A)

(B)

celular em meio de crescimento,inicialmente, de modo a favorecer o mximo acmulo de biomassa, seguido pela transferncia para o meio de produo, onde a biossntese do(s) metablito(s) de interesse favorecida. Incrementos de produtividade de 84% e 47% para o triterpenide velutinol A e seu derivado glicosilado MV8612 foram obtidos em cultivos celulares de Mandevilla velutina (4) com a utilizao deste sistema. Entretanto, como regra geral, esta abordagem somente funciona se um nvel basal do composto de interesse estiver presente no cultivo celular. Se as clulas no sintetizam o composto, como no caso de morfina, hiosciamina e vinblastina, tal estratgia, de fato, no poder ser utilizada. Adio de precursores : Em diversos cultivos celulares a produo de metablitos secundrios pode ser positivamente afetada pela adio de intermedirios da via biossinttica. Como exemplo disto, culturas de clulas de Catharanthus roseus suplementadas com secologanina mostraram elevao nos teores de estrictosidina, o precursor comum na biossntese de alcalides indlicos monoterpenodicos (5). Resultados similares foram encontrados com a adio de L-Triptofano, com uma resposta tempo-dependente, enquanto a produo de ajmalicina no foi afetada. interessante mencionar trs aspectos bsicos ao se considerar esta metodologia como estratgia para a obteno de incremen-

Figura 2. Estruturas de fitoanticipinas constitutivas encontradas em clulas de (a) Sorghum bicolor e (b) Cicer arietinum. As antocianinas pelargonidina e cianidina tm ao protetora contra radiao UV, enquanto as isoflavonas formononetina (FGM) e biochanina A (BGM) so inibidores de infeco fngica (Lo & Nicholson, 1998 e Barz & Mackenbrock, 1994)

bilitou a obteno de linhagens com alto potencial produtivo e estveis, como no caso de berberina e antocianina em cultivos celulares de Coptis, Thalictrum e Euphorbia, respectivamente. A superao da instabilidade neste sistema atribuda reduo da heterogeneidade gentica nos cultivos ao longo dos sucessivos subcultivos. A otimizao da composio do meio de cultura se mostra como uma estratgia efetiva para a obteno de incrementos de produtividade de metablitos secundrios in vitro. A literatura disponvel ilustra este aspecto enfocando a utilizao de constituintes de natureza orgnica ou inorgnica. Contudo, um meio de cultura que oferea condies timas ao incremento da biomassa celular , via de regra, antagnico sntese do(s) composto(s) de interesse. Em funo disto, o estabelecimento de um meio de cultura adequado simultaneamente ao crescimento celular e produo bastante difcil. Um sistema de produo envolvendo dois estgios tem sido proposto (3) como estratgia para superar a condio de antagonismo entre o crescimento celular/biossntese metablitos secundrios. Este sistema consiste no cultivo

(A) Brassilexina

(B) Orizalexina A (C) Micosinol

Figura 3. Estrutura qumica de fitoalexinas produzidas por clulas de (a) Brassica, (b) Oryza e (c) Coleostephus como resposta infeco por microrganismos (Keen, 1990).
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tos de produtividade de metablitos de interesse: a) a concentrao do substrato; b) o metablito de interesse (ou no) um produto final da via biossinttica; c) a capacidade celular de acmulo do composto. No primeiro caso, a adio de precursor(es) pode induzir aumentos de produo do composto bioativo, na medida em que permite superar a pequena disponibilidade de substrato no meio de reao, especialmente quando a arquitetura da via biossinttica linear, como no caso da maioria das vias de biossntese de metablitos secundrios conhecidas. Em segundo lugar, se o metablito alvo no um produto final da via biossinttica, a taxa de seu catabolismo pode tornar inefetiva a adio de precursor(es). Neste contexto, tem sido demonstrado que a taxa de sntese e de degradao de ajmalicina so similares em culturas celulares de Catharanthus roseus, de modo que no foi observado acmulo deste alcalide em cultivos suplementados com precursor. A curta meia-vida de compostos na planta, como observado para nicotina (22 horas) e morfina (7,5 horas) refora a importncia deste aspecto. A capacidade celular de acmulo de metablitos secundrios no tem sido estudada em profundidade at o presente momento. Contudo, esperado haver um limite de acmulo destes compostos, o que influencia a produtividade dos cultivos. Como exemplo, a produo de antocianinas em cultivos celulares de Catharanthus roseus dependente da percentagem de clulas produtoras, quando todas as clulas tm similar contedo daquele composto. Clulas diferenciadas: Como regra geral, em plantas h uma grande correlao entre citodiferenciao e metabolismo secundrio, Um aumento de 4-6 vezes no teor de alcalides (voafilina, aparicina, and 3S-hidroxi-voacangina), concomitante a um incremento no nvel de diferenciao celular foi observado em culturas celulares de Tabernaemontana pandacaqui (6). A ocorrncia de estruturas compacto-globulares (agregados celulares exibindo um alto grau de diferenciao) foi observada em cultivos de Tabernaemontana and Cinchona, os quais produziram quantidades bastante superiores dos alcalides aspidospermatanos valesamina e O-acetilvalesamina e de quinina, respectivamente, em relao ao controle. Ao longo da ltima dcada, o cultivo de meristemas e razes recebeu grande ateno quanto ao seu potencial como sistema produtor
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cas (biorreatores com nebulizao, e.g.), dificultando a produo de biomassa em larga escala, com um consequente aumento nos custos de produo. Elicitao : Elicitores biticos so compostos que induzem respostas de defesa em clulas vegetais contra infeces microbianas, em particular a produo de fitoalexinas, ou ainda induzem aumentos no nvel de fitoanticipinas constitutivas (Fig. 2) Fitoalexinas so compostos com atividade antibitica, de baixo peso molecular, formados e acumulados em clulas vegetais em resposta infeces por microrganismos (Fig. 3). Elicitores de natureza abitica (radiao UV e ons de metais pesados) tambm tm sido utilizados neste contexto. Este princpio tem sido aplicado em estudos de biossntese de fitoalexinas, como tambm para aumentar a produtividade de metablitos secundrios em cultivos celulares vegetais. Em geral, a elicitao de uma cultura celular resulta na sntese de novo de compostos, algumas vezes no encontrados na planta intacta (dihidropiranocumarina, e.g.), ou no aumento da produo de metablitos secundrios nos cultivos in vitro (antraquinonas, e.g.). Todavia, a eficincia do tratamento com um dado elicitor, no que concerne induo de produtividade de um composto, depende de vrios fatores, sendo a resposta de induo restrita a certas vias biossintticas. Em funo disto, a escolha correta do elicitor fundamental, no havendo regras indicadoras de uma combinao adequada para o sistema clula/elicitor. Alm disto, a concentrao do elicitor, a densidade de inculo, o momento de adio do elicitor, o perodo de contato entre as clulas e o agente de elicitao e o teor de nutrientes do meio de cultura so fatores importantes a se considerar, quando se busca a otimizao da produo de biofrmacos atravs desta abordagem. Na prtica, poli/oligossacardeos (oligossacarinas Fig. 4) de parede celular de plantas ou microrganismos, enzimas (celulases, hemicelulases e pectinases, e.g.), peptdeos, glicopeptdeos e lipdios tm sido usados como elicitores. Da mesma forma, compostos sinalizadores envolvidos em vias de transduo, como o cido jasmnico e seu metil ster, ou ainda o ergosterol (Fig. 5) podem induzir respostas de estresse celular, levando ao aumento da sntese/ acmulo de metablitos secundrios. Provavelmente, cada espcie vegetal tem uma classe de compostos que so sintetizados aps o estmulo causado pelo

Figura 4. Estrutura de oligossacardeos elicitores isolados de parede celular de (a) plantas e fungos (b, c, e d). O grau de polimerizao (n) varia de 11 a 14 (Hahn et al., 1992)

de compostos bioativos. Os resultados tm demonstrado valores de produtividade nos cultivos semelhantes aqueles observados na planta ex vitro, ou mesmo valores mais elevados, via manipulao epigentica. Uma metodologia que tem despertado grande interesse neste contexto a transformao gentica de

(A)

(B)

Figura 5. Aspectos estruturais de molculas sinalizadoras em clulas vegetais: [A] ergosterol e [B] cido jasmnico (R = H), ou seu metil ster (metil jasmonato, R = CH3)

plantas com Agrobacterium rhizogenes, uma bactria de solo capaz de infectar clulas vegetais, causando a proliferao do crescimento radicular (hairy roots). O cultivo de razes (ou plos radiculares) transformados pode ser realizado em meio de cultura desprovido de reguladores de crescimento, apresentando estabilidade gentica e bioqumica, e produo similar quela observada em razes no-transformadas (3). No entanto, este sistema requer a utilizao de biorreatores com caractersticas especfi-

elicitor, os quais no so gene(s), o(s) qual(is) encontrados na planta na poder(o) ser oriundo(s) ausncia deste estmulo. Asda planta em si, de outra sim, muitos compostos de espcie vegetal, ou ainda interesse, constitutivamende outro organismo (bactte formados na planta, no ria, e.g.). Independente do so passveis de induo objetivo, a engenharia mepor elicitores em cultivos tablica tem como pressucelulares, como observado posto bsico o conhecimenpara quinina, morfina e vinto de todos os passos consblastina. Por outro lado, tituintes da via biossinttica compostos outros como Velutinol A [(15R, 16R, 20S)-14,16:15,20:16,21-triepoxi-15-16do metablito de interesse, cidos fenlicos (Catharan- seco-14,17-pregn-5-ene-3,15-diol] (Bento et al., 1995). aspecto que limita a aplicathus roseus), triterpenos o desta abordagem, visto (Tabernaemontana divarique a maioria destas vias cata), velutinol A e seu so conhecidas apenas a derivado glicosilado (Mannvel de seus intermediridevilla velutina Fig. 6) os. Com o conhecimento tiveram suas concentraes da via biossinttica a nvel aumentadas em culturas de dos intermedirios envolviclulas. Metablitos cuja bidos, o passo seguinte a ossntese induzida so identificao das enzimas usualmente produzidos em envolvidas e a determinaaltos nveis, podendo alo de quais destas aprecanar valores de 3 a 10%, sentam funo regulatria. com base em peso seco. A Alm disto, importante utilizao desta estratgia considerar outros aspectos possibilita a induo de inintrnsecos ao processo de cremento de produtividasntese, como a arquitetura Figura 6. Mandevilla velutina de em momento especfico da via biossinttica, a exis(Apocynaceae), planta nativa de do processo produtivo. No tncia de etapas regulatriecossistemas de restinga e entanto, o maior problema verificado at as, o transporte do produto final e a cerrado no Brasil, fonte de o presente momento reside no nmero compartimentalizao. A arquitetura da velutinol A, um antagonista de limitado de compostos que tem sua via biossinttica poder ser linear, ou bradicinina (BK) biossntese aumentada, os quais, em mesmo apresentar-se como uma rede alguns casos, no so o produto final de complexa. No primeiro caso, a situao interesse. mais simples no que concerne sua ca de clulas transformadas e tambm manipulao, contudo, em sendo o perEngenharia Metablica sobre os mecanismos de regulao de fil da via biossinttica uma rede complevias biossintticas de metablitos secunxa de etapas (terpenides, e.g.), a posA introduo de genes em plantas ou drios so fatores limitantes nesta aborsibilidade de manipulao no contexto clulas vegetais atravs de tcnicas de dagem. Entretanto, os progressos que da engenharia metablica tarefa que engenharia gentica (sistema Agrobactm sido alcanados na tecnologia gniencontrar maior grau de dificuldade. A terium e o bombardeamento com partca permitiro um aumento no nmero existncia de mecanismos de regulao culas metlicas coloidais, e.g.) permite a de genes clonados, bem como um maior a nvel enzimtico bastante comum alterao da expresso de genes envolentendimento das vias biossintticas em (retro-inibio), como observado na bividos em vias biossintticas de interesse seus aspectos estruturais e regulatrios, ossntese de triptofano em culturas de e assim modificar a produo de metade modo que perspectivas interessantes clulas de C. roseus. Nesta via, a superblitos secundrios. Agrobacterium tude aplicao da engenharia metablica expresso da antranilato sintetase (AS) mefaciens tem sido amplamente utilizasurgem no que se refere otimizao da no apresentou efeito positivo, porque a da para a transformao de plantas, produo de compostos de interesse. mesma inibida pelo produto final da apresentando como maior restrio o Num contexto mais amplo, a engenharia via biossinttica (7). Adicionalmente, nmero limitado de hospedeiros, princimetablica objetiva o incremento do importante considerar o efeito que a palmente dicotiledneas, ainda que nem fluxo de carbono em direo ao produto compartimentalizao exerce sobre a todas as espcies deste grupo. O bomfinal de interesse. Neste sentido, diverbiossntese de metablitos secundrios, bardeamento com partculas , em prinsas estratgias tm sido utilizadas busindicando que o transporte do produto cpio, aplicvel a qualquer espcie, mas cando superar o(s) evento(s) limitante(s), final e/ou de intermedirios da via biosainda que a transformao seja vivel, a bloqueando vias metablicas competitisinttica atuam como agentes de regularegenerao da planta a partir da clula vas ou do catabolismo pela utilizao de o desta. A biossntese de alcalides transformada tem se mostrado uma taregenes com transcrio no sentido inverindlicos terpenodicos requer no mnifa difcil. Alm disso, a reduzida disponiso (anti-sense), ou ainda pelo uso de mo trs compartimentos : os plastdios bilidade de genes e promotores especanticorpos. O aumento da atividade de [produo de triptofano e a poro terficos ao objetivo em tela, o pouco couma determinada enzima poder ser penodica do produto final], o citosol nhecimento sobre a estabilidade genticonseguido com a clonagem de seu(s) [descarboxilao do triptofano] e o vaBiotecnologia Cincia & Desenvolvimento 27

colo [ligao entre triptamina e secologanina] (8). A clonagem de genes de plantas relacionados vias biossintticas foi primeiramente realizada, em escala comercial, com o intuito de alterar a colorao de flores. Outra aplicao diz respeito introduo do gene tdc (triptamina descarboxilase) em plantas de tabaco, resultando no aumento da produo de triptamina em nveis que atingem 1% com base em peso seco. No entanto, a instabilidade dos cultivos celulares transgnicos em relao produo de metablitos secundrios tm sido mais recentemente observada, ainda que estes apresentem nveis superiores de expresso do produto gnico (enzima). Por outro lado, alguns estudos tm demonstrado que a despeito da expresso de estabilidade de clones celulares transgnicos, o fluxo total atravs da via biossinttica de alcalides indlicos apresenta um comportamento de instabilidade, como observado em linhagens selvagens de C. roseus. Outra importante e bvia concluso refere-se ao fato de que a superao de uma etapa limitante da via biossinttica remete, automaticamente, ao encontro da prxima etapa com esta caracterstica. Concluses Muitos metablitos secundrios de grande importncia econmica so produzidos em quantidades muito baixas, ou ainda no so produzidos (e.g. morfina, vinblastina, vincristina) em cultivos de clulas vegetais at o presente momento. Em decorrncia disto, somente uns poucos produtos gerados a partir desta tecnologia alcanaram uma escala comercial (e.g. chiconina e misturas de polissacardeos). A produo industrial de biofrmacos a partir da biotecnologia vegetal sugere anlise duas questes bsicas : a) a viabilidade da tecnologia disponvel b) a competitividade econmica desta tecnologia em relao aos mtodos de produo existentes. Em muitos casos, a tecnologia disponvel se mostra vivel, ainda que clculos do custo de produo indiquem a necessidade de incrementos de produtividade, para que tais processos sejam adequados do ponto de vista econmico. As razes que concorrem para este quadro so o alto investimento necessrio, principalmente devido ao custo de depreciao do biorreator e tambm a baixa produtividade de metablitos secundrios dos cultivos celulares, como
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discutido anteriormente. Na tentativa de superar essas dificuldades, estratgias para otimizar a produo in vitro de compostos bioativos tm sido continuamente desenvolvidas e revistas, com resultados promissores, sendo que para o atual momento, maior ateno vem sendo dada utilizao combinada das abordagens anteriormente discutidas. Os avanos em estudos de engenharia metablica permitiro incrementos de produtividade de metablitos secundrios nos cultivos in vitro, contribuindo para a reduo dos custos de produo, ou mesmo viabilizando a produo de novos compostos. importante considerar que nos casos em que a produo de um biofrmaco no possvel por mtodos agrcolas convencionais ou qumicos, ou

Figura 7. Exemplos de mecanismos de regulao de vias biossintticas considerados na engenharia de metabolismo secundrio. A concentrao do produto final (PF) dependente de alguns fatores: a) nvel de inibio da atividade enzimtica pelo produto (retro-inibio AE1); b) disponibilidade do substrato (B) em via no linear; c) transporte e compartimentalizao. A engenharia metablica requer a identificao de todos os constituintes da via biossinttica (intermedirios e enzimas - E1E7)

mesmo quando sua demanda no totalmente suprida, a biotecnologia vegetal poder ser o sistema final de pro-

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