INFLUENCIA DE LA CIDEZ VOLTIL EN EL PROCESO DE FERMENTACIN DE LA PLANTA DE ALCOHOL DEL INGENIO RISARALDA S.A.

CLARITA MILENA GALLEGO GIL CDIGO 42.029.525

UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA ESCUELA DE TECNOLOGA QUMICA PROGRAMA DE QUMICA INDUSTRIAL PEREIRA AO 2007

INFLUENCIA DE LA CIDEZ VOLTIL EN EL PROCESO DE FERMENTACIN DE LA PLANTA DE ALCOHOL DEL INGENIO RISARALDA S.A.

CLARITA MILENA GALLEGO GIL CDIGO 42.029.525

Trabajo de Grado Requisito parcial para optar el ttulo de Qumico Industrial

Director Carlos Humberto Montoya Navarrete Qumico Industrial

UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PEREIRA ESCUELA DE TECNOLOGA QUMICA PROGRAMA DE QUMICA INDUSTRIAL PEREIRA AO 2007

CONTENIDO Pg. INTRODUCCIN 1. OBJETIVOS 1.1 OBJETIVO GENERAL 1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 2. JUSTIFICACIN 3. MARCO TERICO 3.1 PROCESO DE PRODUCCIN DE AZCAR 3.2 PROCESO DE PRODUCCIN DE ALCOHOL 3.3 PRODUCCIN DE ALCOHOL EN PLANTAS AZUCARERAS 3.4 MICROBIOLOGA DE LA LEVADURA 3.4.1 Metabolismo aerbico 3.4.2 Metabolismo anaerbico 3.4.3 Poblacin y Viabilidad 3.4.4 Cintica de crecimiento 3.4.4.1 3.4.4.2 3.4.4.3 Fase latente Fase de crecimiento Fase estacionaria 1 3 3 3 4 5 5 7 7

9 10 11 12 12 13 13 14 15 15

3.5 PROCESO DE FERMENTACIN 3.6 FACTORES QUE AFECTAN LA LEVADURA EN LA FERMENTACIN 3.6.1 Materia prima

16

Pg. 3.6.2 Almacenamiento de la materia prima 3.6.3 Azucares fermentables 3.6.4 Contenido total de materia orgnica 3.6.5 Contenido total de materia inorgnica y cenizas 3.6.6 Contenido de slidos sedimentables 3.6.7 pH 3.6.8 Temperatura 3.6.9 Acidez voltil orgnica 3.6.10 Contenido de caramelos 3.6.11 Contenido de bacterias 3.6.12 Sodio 3.6.13 Relacin carbono/Nitrgeno 3.6.14 Contenido celular 3.6.15 Tiempo de residencia 3.6.16 Agitacin en el fermentador 3.6.17 Concentracin de etanol 3.7 FERMENTACIN CONTINUA CON RECIRCULACIN DE LEVADURA 3.8 ETAPA DE PROPAGACIN 3.9 ETAPA DE FERMENTACIN 3.10 RECIRCULACIN DE LEVADURA 3.11 RECIRCULACIN DE VINAZA 3.12 TIPO DE CONTAMINANTES EN LA FERMENTACIN ALCOHLICA 17 17 17 18 18 18 18 18 19 19 19 19 19 19 20 20 20

20 23 24 26 26

Pg. 3.12.1 Bacterias lcticas 3.12.2 Fermentacin cido lctica 3.12.3 Bacterias acticas 3.13 IDENTIFICACIN MICROBIANA 4. MARCO DE REFERENCIA 4.1 MARCO GEOGRFICO 4.2 TIPO DE ESTUDIO 4.3 ANTECEDENTES 5. METODOLOGA 5.1 PUNTOS DE MUESTREO 5.2 TOMA DE MUESTRAS 5.2.1 Anlisis Fisicoqumicos y Cromatogrficos 5.2.2 Anlisis Microbiolgicos 5.3 MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 5.3.1 Equipos 5.3.2 Material de vidrio 5.3.3 Reactivos 5.3.4 Gases 5.3.5 Medios de cultivo 5.3.6 Otros implementos de laboratorio 5.3.7 Equipos de proteccin personal 5.4 MTODOS DE ANLISIS 5.4.1 Acidez voltil titulable en mieles y mosto fermentado en trminos de cido actico y sales de acetato 27 27 28 29 31 31 32 32 33 33 34 34 37 37 37 39 39 40 40 40 41 41 41

Pg. 5.4.2 Determinacin del porcentaje de alcohol en el mosto fermentado usando densmetro 5.4.3 Determinacin y cuantificacin de cidos voltiles en mieles y mosto fermentado por cromatografa de gases 5.4.3.1 5.4.3.2 5.4.3.3 Tratamiento de la muestra 43 Condiciones Cromatogrficas 45 Curvas de calibracin 45 5.4.4 Anlisis Microbiolgicos 46 6. DATOS, RESULTADOS Y DISCUSION 48 6.1 ACIDEZ VOLTIL TITULABLE EN MIELES Y MOSTO FERMENTADO EN TRMINOS DE CIDO ACTICO O SALES DE ACETATO 6.1.1 Tanque de alimentacin (T-124) 48 6.1.2 Fermentadores R-311 y R-312 50 6.1.3 Tanque activacin de Levadura R-305 51 6.1.4 Vinaza recirculada T-403 53 6.2 ANLISIS POR CROMATOGRAFA DE GASES 55 6.2.1 Condiciones cromatogrficas ptimas 55 6.2.2 Identificacin 57 6.2.3 Curva de calibracin 58 6.2.4 Cuantificacin de los cidos voltiles en el proceso de fermentacin 6.2.4.1 6.2.4.2 6.2.4.3 Tanque de alimentacin (T-124) 61 Fermentador R-311 63 Fermentador R-312 65 61 48 43

43

Pg. 6.2.4.4 6.2.4.5 Tanque de Activacin de levadura R-305 Vinaza Recirculada T-403 67 69 71 76 77 78

6.2.5 Anlisis Microbiolgicos 7. CONCLUSIONES 8. RECOMENDACIONES 9. BIBLIOGRAFIA

LISTA DE TABLAS Pg.

Tabla 1. Calidad del jugo de caa Tabla 2. Suelo y cultivo Tabla 3. Prcticas de cultivo Tabla 4. Proceso de elaboracin Tabla 5. Almacenamiento y manejo de mieles Tabla 6. Aspectos positivos de la melaza da caa Tabla 7. Aspectos negativos de la melaza de caa Tabla 8. Parmetros a tener en cuenta en la fermentacin Tabla 9. Caractersticas de la materia prima Tabla 10. Factores de recuperacin del equipo de destilacin utilizado Tabla 11. Condiciones cromatogrficas empleadas Tabla 12. Patrones de cidos voltiles Tabla 13. Resultados de la Acidez Voltil en la materia prima Tabla 14. Resultados de la acidez voltil versus porcentaje de alcohol en el mosto fermentado Tabla 15. Resultados de la acidez voltil de tanque de activacin de Levadura a diferentes pH Tabla 16. Resultados de la Acidez voltil y porcentaje de recirculacin de vinaza Tabla 17. Tiempos de retencin de los cidos orgnicos por cromatografa de gases Tabla 18. Concentracin de cada cido voltil en la materia prima comparado con la acidez total por titulacin Tabla 19. Concentracin de cada cido voltil en el fermentador R311 Tabla 20. Concentracin de cada cido voltil en el fermentador R312 Tabla 21. Concentracin de cada cido voltil en el tanque R-305 Taba 22. Concentracin de cada cido voltil en la vinaza recirculada del tanque T-403 Tabla 23. Recuento en placa de bacterias mesfilas y lcticas en el proceso de fermentacin

6 8 8 8 8 9 9 16 21 43 45 45 48 51 52 54 57 62 64 66 68 70 72

LISTA DE FIGURAS Pg. Figura 1. Diagrama general del proceso de produccin de azcar Figura 2. Diagrama esquemtico para la produccin de alcohol Figura3. Reproduccin de la levadura vista al microscopio electrnico Figura 4. Metabolismo aerbico (Respiracin) Figura 5. Metabolismo anaerbico (Fermentacin) Figura 6. Cintica de crecimiento de la levadura Figura 7. Esquema de propagacin de levadura Figura 8. Fotografa cubas de propagacin de la planta de alcohol del Ingenio Risaralda Figura 9. Fotografa de los fermentadores de la planta de alcohol del Ingenio Risaralda Figura 10. Fotografa del sedimentador de la planta de alcohol del Ingenio Risaralda Figura 11. Esquema de recirculacin de levadura Figura 12. Fotografa del Sistema de recirculacin de levadura de la planta de alcohol de Ingenio Risaralda Figura 13. Esquema de recirculacin de vinaza Figura 14. Fermentacin acido lctica Figura 15. Reacciones metablicas por bacterias Figura 16. Vista superior de la maqueta del ingenio Risaralda S.A. Figura 17. Esquema General de fermentacin Figura 18. Fotografa al tanque de alimentacin T-124 Figura 19. Punto de muestreo Fermentador R-311 Figura 20. Punto de Muestreo Tanque R-305 Figura 21. Punto de muestreo Tanque T-335 Figura 22. Punto de muestreo tanque de vinaza T-403 Figura 23. Alcotest Figura 24. Cromatgrafo de gases Figura 25. Densmetro DMA 4500 Figura 26. Titulador Automtico Methrom Figura 27. Diagrama del procedimiento para determinar la acidez voltil titulable en mieles y mosto fermentado Figura 28. Diagrama para determinar el factor de recuperacin del equipo de destilacin por arrastre de vapor Figura 29. Diagrama para determinar el porcentaje en volumen de alcohol en el mosto fermentado utilizando densmetro 6 7 10 11 12 13 22 23 23 24 25 25 26 28 30 31 33 34 35 35 36 36 37 38 38 39 41 42 43

Pg. Figura 30. Diagrama Recuento de bacterias por placa Figura 31. Cromatograma de un estndar con los seis cidos en etanol Figura 32. Cromatograma de una muestra problema diluida en etanol Figura 33. Cromatograma de un estndar con los seis cidos en Diclorometano Figura 34. Curvas de Calibracin de los cidos en estudio Figura 35. Cromatograma de una muestra en estudio de T-124 Figura 36. Cromatograma de una muestra en estudio del fermentador R-311 Figura 37. Cromatograma de una muestra en estudio del fermentador R-312 Figura 38. Cromatograma de una muestra en estudio del tanque R-305 Figura 39. Cromatograma de una muestra en estudio de la vinaza recirculada 46 55 56 57 58 61 63 65 67 69

LISTA DE GRFICOS Pg. 49 50 53 54 62 64 66 68 70 72 73 73 74 74

Grfico 1. Curva de control acidez voltil en la materia prima Grfico 2. Curvas de control acidez voltil en los fermentadores 1 y 2 Grfico 3. Curva de control acidez voltil en el tanque de activacin de levadura Grfico 4. Comportamiento de la AVT en la vinaza recirculada en el proceso de fermentacin Grfico 5. Comportamiento de cada cido voltil en la materia prima durante el tiempo de desarrollo del cultivo Grfico 6. Comportamiento de cada cido voltil en el fermentador R-311 durante el tiempo de desarrollo de cultivo Grfico 7. Comportamiento de cada cido voltil en el fermentador R-312 durante el tiempo de desarrollo de cultivo Grfico 8. Comportamiento de cada cido voltil en el tanque R-305 durante el tiempo de desarrollo de cultivo Grfico 9. Comportamiento de cada cido voltil de la vinaza recirculada durante el tiempo de desarrollo de cultivo Grfico 10. Recuento en placa de mesfilas y lcticas con respecto a la acidez voltil total en la materia prima (T-124) Grfico 11. Recuento en placa de mesfilas y lcticas con respecto a la acidez voltil total en el tanque de activacin de levadura Grfico 12. Recuento en placa de mesfilas y lcticas con respecto a la acidez voltil total en el fermentador R-311 Grfico 13. Recuento en placa de mesfilas y lcticas con respecto a la acidez voltil total en el fermentador R-312 Grfico 14. Recuento en placa de mesfilas y lcticas con respecto a la acidez voltil total en la vinaza recirculada (T-403)

INTRODUCCION

Por el ao 1925, Henry Ford predijo: El combustible del futuro derivar de los productos agrcolas. Consistentemente con esta prediccin, en 1927, el primer Ford A vena equipado de fbrica con un carburador de regulacin manual para dar al comprador del vehculo la posibilidad de usarlo con gasolina o alcohol. (3) Llegando a la actualidad, el resurgimiento del alcohol como combustible es una posible solucin para el problema que atraviesan varios pases que no logran cubrir el 100% de sus necesidades de petrleo, debiendo importar el mismo a altos precios. Este alto costo surgi debido a la llamada crisis de Oriente, en la cual los pases ms ricos en petrleo elevaron el precio del mismo en forma substancial. Una razn ms para adicionar alcohol carburante al combustible es la proteccin del medio ambiente debido a que se disminuye la generacin de monxido de carbono (CO) y de hidrocarburos (HC) ya que se aumenta la eficiencia de combustin al presentarse una mejor relacin aire-combustible. (9) Colombia es un pas agrcola que puede producir alcohol de varias fuentes (melaza de caa de azcar, granos, vinos, etc.) en cantidades importantes. La principal ventaja de este combustible radica en que se trata de un recurso renovable, no como los hidrocarburos que representan una riqueza nica y agotable. (9) El Ingenio Risaralda S.A. estuvo entre los cinco primeros ingenios de Colombia en construir la planta de alcohol carburante a partir de la caa de azcar. La construccin se inici en enero del 2005 y entr en operacin el 28 de enero de 2006 alcanzando una produccin de 16.389.235 litros ese ao, de los cuales el 98.3% fueron de alcohol carburante y el 1.7% de otros alcoholes para uso industrial. La produccin de alcohol a partir de mieles o meladura se fundamenta en una etapa de reaccin bioqumica (fermentacin), una primera etapa de extraccin de alcohol (destilacin), una segunda etapa de separacin en la que se obtiene alcohol absoluto (deshidratacin) y finalmente una etapa de tratamiento de efluentes (compostaje). (1) La Fermentacin es una de las etapas iniciales ms importantes en el proceso de produccin de alcohol que consiste en la transformacin de los azcares fermentables de la mezcla jugo-miel en alcohol y CO2 por medio de reacciones bioqumicas usando un tipo especial de levaduras (Sacharomyces cerevisiae). El material resultante se denomina vino y contiene cerca del 8 al 10% (v/v) de alcohol. (1) Existen varios factores que afectan el proceso de fermentacin entre ellos est la acidez voltil la cual es un factor determinante en la produccin de alcohol carburante ya que las levaduras Sacharomyces cerevisiae se ven afectadas

cuando los niveles de acidez voltil superan los rangos de tolerancia, 3000ppm aproximadamente, esto conlleva a bajos rendimientos, aparicin de otros compuestos e incluso a la inactivacin de la levadura. (1) En el proceso de obtencin de alcohol el Ingenio Risaralda S.A pretende recircular parte de la vinaza producida en la destilacin, lo cual genera incremento de la acidez voltil haciendo ms crtico el control de la misma. En el presente trabajo la acidez voltil se determina en forma total por destilacin en medio cido y/o cuantitativamente y con precisin utilizando cromatografa de gases y con dichos resultados se pretende conocer la influencia que tiene sobre el proceso de fermentacin de la planta de alcohol.

1. OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GENERAL Determinar la influencia de la acidez voltil en el proceso de fermentacin de la planta de alcohol del Ingenio Risaralda S.A.

1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS Determinar la concentracin de cidos voltiles titulables en trminos de cido actico presentes en la materia prima y en cuatro puntos crticos del proceso de fermentacin alcohlica utilizando procedimientos de destilacin por arrastre de vapor. Cuantificar los cidos voltiles presentes en el proceso de fermentacin en cinco puntos crticos utilizando cromatografa de gases. Identificar cul de los cidos voltiles es el que se produce en mayor cantidad. Identificar la poblacin microbiana empleando recuentos en placa y pruebas comunes de microbiologa.

2. JUSTIFICACIN

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La produccin de alcohol etlico en el Ingenio Risaralda S.A. se realiza mediante la fermentacin de materias primas ricas en azcares. Esta fermentacin es provocada por la levadura Sacharomyces cerevisiae y puede ser desfavorable si entran en accin bacterias que desvan la marcha de las reacciones, produciendo cidos voltiles y otros productos que son perjudiciales en el proceso y en la calidad del alcohol. La acidez voltil genera incrementos de la presin osmtica que estresan e inhiben la actividad de la levadura y hasta causan su muerte. Por tal razn los microorganismos utilizan los azcares para la produccin de cidos de bajo peso molecular tales como actico, butrico, isobutrico, valrico, isovalrico, propinico, etc. Estos reducen la eficiencia de fermentacin y la produccin del etanol. Un incremento en la acidez voltil es un indicador de la presencia de bacterias cido lcticas en la fermentacin (1). Es inevitable la presencia de cidos voltiles ya que estos estn presentes desde el cultivo de la caa de azcar y van aumentado en los perodos de permanencia de la caa en patios y durante el proceso de elaboracin. Esto es debido a que los materiales contienen gran cantidad de azcar disponible y el azcar es una necesidad bsica para la vida microbiolgica. Los microbios provenientes del aire, las tuberas, los tanques de almacenamiento o el suelo entran y se desarrollan en el material. Los valores recomendados para este parmetro, sin que afecte notablemente la actividad de la levadura estn entre 3000 ppm y 5000 ppm. (1) Es as como el conocimiento de la concentracin de cidos voltiles en la materia prima y durante el proceso de fermentacin es algo muy importante ya que es una medida indirecta de la contaminacin que est entrando o se est generando en el proceso, incrementando el tiempo de fermentacin y disminuyendo la eficiencia total de la planta. Se puede determinar en forma total por destilacin en medio cido y/o individualmente y con precisin utilizando cromatografa de gases. (1) Adems controlar esta variable en todo el proceso nos garantiza la calidad del producto final y cumplir con ciertas especificaciones dadas por la legislacin colombiana. (7)

3. MARCO TEORICO

3.1 PROCESO DE PRODUCCIN DE AZCAR (1)

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De manera breve se tratar el esquema de produccin de azcar a partir de la caa. Normalmente, el jugo es extrado de la caa a travs de procesos de molienda empleando metodologas tradicionales de imbibicin. Esta tcnica consiste en moler la caa aplicando simultneamente agua a una temperatura entre 70-75 C con el propsito de facilitar la extraccin. Los jugos extrados (jugo primario y jugo secundario) son mezclados y enviados a la seccin de elaboracin. Una composicin representativa de jugo de caa puede observarse en la tabla 1. El jugo resultante (jugo crudo) se calienta entre 70 a 75 C para acondicionarlo. Asimismo, el jugo crudo se somete a un tratamiento qumico con cido fosfrico, dixido de azufre y lechada de cal para remover impurezas y contaminantes indeseados, en una operacin de clarificacin. En la clarificacin, el jugo crudo se separa en dos corrientes: los fondos sedimentados y el jugo claro. Los fondos sedimentados, que contienen una alta carga de slidos orgnicos, son tratados en filtros rotatorios al vaco donde se obtiene un subproducto slido de consistencia pastosa conocido en el lenguaje tcnico como cachaza. Usualmente esta cachaza se aprovecha como abono orgnico despus de ser sometida a un tratamiento de compostaje. El licor resultante del proceso de filtracin se retorna al proceso en la etapa previa de clarificacin. Por su parte, el jugo claro con un contenido de agua cercano a 85%, se concentra por medio de evaporadores de mltiple efecto para producir un jarabe (meladura) con un contenido de agua de 37 al 43%. La meladura se trata nuevamente con SO2 antes de ser enviada a la estacin de cristalizacin (tachos) para ajustar el pH. El licor agotado en el primer tacho, es decir, el lquido al que se le han retirado los cristales de azcar, se enva al segundo y luego al tercer tacho. Estos licores agotados (melazas o mieles) tienen un menor contenido de sacarosa pero altos contenidos de glucosa y fructosa que, aunque no son cristalizables, constituyen la materia prima para la produccin de alcohol. El producto principal obtenido en los tachos (conocido como masacocida) se enva a la estacin de centrifugas para separar los cristales de azcar del licor

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madre. El licor madre se enva de nuevo a la estacin de tachos para su recristalizacin. En la figura 1 se esquematiza el proceso. Tabla 1. Calidad del jugo de caa Parmetros Slidos Disueltos (%) Agua (%) Sacarosa (%) Azucares Reductores Cenizas (%) Purezas (%) pH CaO (mg/L) P2O5 (mg/L) Color (NTU) Valor 14 a 18 82 a 86 11 a 14 0.5 a 1.5 0.5 a 0.7 80 a 84 5.0 a 5.4 600 a 800 80 a 150 8200 a 8600

Figura 1. Diagrama general del proceso de produccin de azcar

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3.2 PROCESO DE PRODUCCIN DEL ALCOHOL (1) En trminos generales, la produccin de alcohol a partir de mieles o meladura se fundamenta en una etapa de reaccin bioqumica (fermentacin), seguida por una primera etapa de extraccin de alcohol (destilacin), luego una segunda etapa de separacin en la que se obtiene alcohol absoluto (deshidratacin) y finalmente una etapa de tratamiento de efluentes (compostaje). Vase figura 2. Figura 2. Diagrama esquemtico para la produccin de alcohol

3.3 PRODUCCION DE ALCOHOL EN PLANTAS AZUCARERAS (1) Las fbricas azucareras que deciden aprovechar las mieles para producir alcohol implementan nuevos esquemas de produccin y de operacin con el objeto de contextualizar de una forma distinta la planta de produccin. En este naciente esquema de produccin aparece un nuevo producto (alcohol absoluto) y nuevos efluentes (vinazas, flemazas, lodos, etc.) cuyas caractersticas y cantidades producidas dependen en gran medida de la calidad de las mieles obtenidas (vase las tablas siguientes) y, por supuesto, de la operacin apropiada del proceso de produccin de alcohol. En este contexto, las dos plantas de produccin, azcar y alcohol, deben ser vistas como una sola, una nueva planta que maneja coordinadamente dos productos principales.

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Tabla 2. Suelo y cultivo Caractersticas

Composicin del suelo y variedad de la caa.

Efecto
Imparte slidos inorgnicos y no fermentables, adicionalmente compuestos espumantes que tienen efecto buffer.

Observacin
Estos elementos son extractados finalmente en las melazas. P, K y ANL( Amino Nitrgeno libre) finalmente terminan en las melazas. Deciden la cantidad y tipo de slidos en la melaza.

Prcticas de fertilizacin

Imparte N:P:K en las melazas

Prcticas y niveles de irrigacin

Deciden la composicin de jugo y el contenido de agua

Tabla 3. Prcticas de cultivo Caractersticas

Caa pre madurada. y sobre

Efecto
Pre madurada altos contenidos de ceras. Sobre madurada altos contenidos de cidos Caramelizacin de los materiales. Composicin del jugo y contenido de agua.

Observacin
Finalmente extractados en la melaza. Alto contenido de caramelo en miel final. Cantidad y tipo de slidos en la melaza.

Quema de caa Tiempo de permanencia

Tabla 4. Proceso de elaboracin Accin

Extraccin y manejo del jugo Clarificacin de jugos Proceso de cristalizacin

Efecto
El tiempo de retencin y la higiene de los equipos permiten crecimiento de bacterias y formacin de cidos. El tiempo de retencin y la adicin de qumicos deciden el crecimiento de bacterias y la formacin de cidos. Los niveles de temperaturas, tiempos de retencin, lavados con vapor y condensados producen caramelizacin y furfurales.

Tabla 5. Almacenamiento y manejo de mieles Accin

Temperatura de las melazas Prcticas de manejo almacenamiento y

Efecto
Altos niveles de temperatura fomentan la degradacin de las melazas y la formacin de caramelo. Altos tiempos de almacenamiento, condiciones no higinicas y diluciones con agua fomentan el crecimiento microbiano y formacin de cidos.

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Tabla 6. Aspectos positivos de la melaza de caa Propiedad

Azucares fermentables Relacin Azcares Fermentables a No Fermentables (F:N) Nitrgeno Fermentable Vitaminas naturales (Especialmente complejo B) Trazas de nutrientes vitales

Contenido
37 52% 0.85 1.45%

Efecto
Decide produccin de alcohol y costos de materia prima por litro. A mayor relacin, mayor velocidad de fermentacin. Fomenta el crecimiento de la levadura y la produccin de alcohol. Vital para el crecimiento de la levadura, su carencia reduce la productividad. Vital para las enzimas, fomenta la produccin de alcohol.

200 -3000 ppm Trazas Trazas

Tabla 7. Aspectos negativos de la melaza de caa Propiedad

Slidos totales Ceniza inorgnica total Calcio (como sulfatos) Lodos orgnicos precipitables Capacidad buffer Capacidad de espumacin Caramelo (furfural, Hidroximetilfurfural) Bacterias y levadura silvestre Acidez voltil Sustancias inhibidoras

Contenido
72 80% 7 14% 0.5 4% 1.5 4% 4.8 8.0pH Cualitativa 0.1 -0.7 O.D 100 50.000 unid/gr 4000 15000 ppm Trazas

Efecto
Afecta la viscosidad y las propiedades de flujo en climas fros. Altos niveles causa toxicidad salina a la levadura Genera Incrustacin dura y mayores tiempos perdidos para limpieza. Incrementa ahogamiento/puntos muertos que alojan poblacin microbiana. Si es alta, incrementa los requerimientos de cido para el proceso. Incrementa al consumo de anti-incrustante para el proceso. Inhibe la levadura y la produccin de alcohol; las eficiencias. Inhibe la levadura, produce Acidez Voltil; afecta la fermentacin Retarda el crecimiento de la levadura; afecta la productividad de alcohol Biocidas, Zn, Pb

Como se observa, la composicin de los materiales de entrada son determinantes para maximizar la produccin de alcohol y optimizar los procesos de destilera. 3.4 MICROBIOLOGIA DE LA LEVADURA (9) La levadura es un microorganismo unicelular y eucaritico, de forma esfrica u ovalada y su tamao vara entre 5 y 10 micras dependiendo de la edad (5 10 milsimas de milmetro). La reproduccin de la levadura se realiza por va asexual mediante duplicacin celular y el tiempo de reproduccin vara entre 2 y 3 horas. Cada clula puede reproducirse entre 4 y 5 veces (vase figura 3).

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Figura 3. Reproduccin de la levadura vista al microscopio electrnico

Levadura es el nombre genrico de una categora de microorganismos entre los que se pueden encontrar hasta 500 clases. En particular, la Sacharomyces cerevisiae tiene la propiedad de producir, en un medio rico en carbohidratos y en ausencia de oxgeno, alcohol etlico (C2H5OH) y dixido de carbono (CO2). Esta levadura requiere como nutrientes: carbono, nitrgeno, fsforo, oxgeno, y micronutrientes como el calcio, magnesio, zinc, vitaminas, entre otros. Las levaduras son microorganismos facultativos, lo que significa que tienen la capacidad de vivir en presencia o ausencia de oxgeno, es decir, aerbia o anaerbicamente. 3.4.1 Metabolismo aerbico La levadura utiliza el mecanismo de respiracin o ruta metablica aerbica con el fin de obtener energa para crecer y reproducirse. La fuente de energa la constituyen los azcares fermentables (glucosa y fructosa) que son absorbidos a travs de la pared celular, al igual que el oxgeno. Dentro de la clula se desencadenan una serie de reacciones bioqumicas donde los principales productos son la energa en forma de molcula de ATP (Adenosin Trifosfato) y el dixido de carbono (CO2) el cual se enva hacia el exterior de la clula a travs de la pared celular. La energa obtenida de la molcula de ATP se utiliza en el crecimiento y reproduccin de la clula (vase figura 4). (11)

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Figura 4. Metabolismo aerbico (Respiracin)

3.4.2 Metabolismo anaerbico Este proceso se lleva a cabo en ausencia de oxgeno. La levadura absorbe, a travs de la pared celular, los azcares fermentables (glucosa y fructosa) y desarrolla una serie de reacciones bioqumicas cuyos productos son alcohol etlico (etanol), CO2, glicerol y succinato; los cuales son enviados al exterior de la clula por medio de la pared celular. Los productos generados en mayores proporciones durante este proceso son el etanol y el CO2. Este mecanismo lo usa la clula nicamente para su conservacin y no para su crecimiento ni reproduccin (vase la figura 5). (11) Esta propiedad de la levadura para producir etanol se aprovecha industrialmente para la produccin de licores, alcohol industrial o alcohol carburante. Es importante aclarar que dentro del proceso fermentativo la concentracin de alcohol es una variable a controlar, debido a que niveles muy altos (tericamente superiores al 18%) afectan negativamente la misma levadura generado estrs osmtica, inhibicin competitiva, oxidacin, entre otros. De igual forma se destaca el hecho de que el porcentaje de tolerancia al alcohol depende de la capa de levadura utilizada. (9)

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Figura 5. Metabolismo anaerbico (Fermentacin) (1)

3.4.3 Poblacin y viabilidad Una sola clula de levadura produce tan solo cantidades microscpicas de alcohol, por lo tanto, se requieren cientos de millones de ellas para obtener las concentraciones de alcohol demandadas a escala industrial. (1) En el proceso de fermentacin se mide la concentracin celular por medio de un parmetro llamado poblacin celular; stas varan entre 250 y 300 clulas por mililitro o entre 10 -12 gramos de clula en peso seco por litro. Se recomienda que esta poblacin est realizando el proceso de produccin de alcohol y para ello deben estar vivas, lo cual se determina por medio del parmetro llamado viabilidad, definido como el nmero de clulas vivas por nmero de clulas totales. En la etapa de fermentacin el valor apropiado de viabilidad debe ser mayor o igual a 90%. (1) 3.4.4 Cintica de crecimiento En lo que se refiere al crecimiento celular existe un mecanismo que permite visualizar el comportamiento de la levadura a travs del tiempo y se denomina cintica de crecimiento. Esquemticamente se puede representar como se muestra en la figura 6. (8)

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Figura 6. Cintica de crecimiento de la levadura

En la figura 6 se observan cuatro etapas de crecimiento. La primera, llamada fase latente, es la etapa de adaptacin del microorganismo al medio donde se est desarrollando, en ella se presenta un mnimo crecimiento en la poblacin de la levadura. En la segunda etapa, denominada fase de crecimiento, las clulas presentan una alta velocidad de reproduccin por lo que se incrementa notablemente la poblacin. En la siguiente etapa, la fase estacionaria; al igual que en la primera fase, no se presenta aumento en la poblacin celular, es una etapa donde el cultivo alcanza un estado de slo supervivencia. La cuarta etapa y ltima fase representa la muerte de la levadura. (8) 3.4.4.1 Fase latente Se caracteriza por la sntesis y degradacin del material celular y adaptacin al nuevo medio ambiente. La expresin matemtica que representa este comportamiento es la siguiente: (1) donde x es biomasa y t es tiempo: Esto significa que no existe cambio de la concentracin celular o de biomasa con el tiempo. (8) 3.4.4.2 Fase de Crecimiento Esta etapa est caracterizada por la reproduccin y multiplicacin del microorganismo a mxima velocidad. En consecuencia, se requiere que los nutrientes estn en exceso y, adems, evitar al mximo una mezcla incompleta o la precipitacin de los componentes del medio. Asimismo, se debe tener en cuenta que existen elementos inhibidores de la levadura tales como SO2, sulfitos, cidos orgnicos, iones de cobre y el mismo etanol, que debe estar presentes en el medio de cultivo en muy bajas concentraciones. (8)

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La fase de crecimiento est ligada tanto al medio de cultivo como a la especie de levadura. Es importante anotar que la levadura, como cualquier organismo vivo, no tiene un crecimiento infinito por lo que es necesario contemplar esta condicin para lograr una apropiada operacin de la etapa de propagacin. (8) (2) Donde es a velocidad de crecimiento del microorganismo y adquiere valores desde = 0 hasta = mx que es la velocidad mxima de crecimiento del microorganismo. Entonces, (3) Integrando, (4) Donde xo es la concentracin celular inicial. Graficando el logaritmo natural de x como una funcin del tiempo, la pendiente = mx. En resumen, las ecuaciones mostradas, junto con datos obtenidos en el laboratorio, permitirn establecer las mejores condiciones de operacin de los tanques de propagacin. (8) Cuando la ecuacin (4) se expresa de la forma (5) Se obtiene la ecuacin fundamental para crecimiento en lote (6) Cuando x = 2xo, t = td = tiempo de duplicacin

(7)

Este parmetro permite establecer el tiempo requerido para lograr la poblacin celular que se desea cuando se opera por lotes (propagacin). (8) 3.4.4.3 Fase estacionaria En la fase estacionaria no se presenta incremento de la poblacin celular, es decir, el nmero de clulas que mueren es igual al nmero de clulas que se duplican. (8) Los parmetros anteriormente descritos, que suceden durante el periodo normal de vida de la levadura, son supremamente tiles al momento de operar

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apropiadamente el proceso. Con base en la velocidad de crecimiento (mx) y el tiempo de duplicacin de la levadura (td) se realiza el diseo del biorreactor, las ecuaciones previamente descritas son aplicables a sistemas de fermentacin por lotes y no son aplicables a la fermentacin continua. (8) Para el caso de la fermentacin continua, la operacin apropiada de los biorreactores se establece por medio de balances de nutrientes y celular. (8)

3.5 PROCESO DE FERMENTACIN En general, es el proceso mediante el cual se obtiene alcohol etlico, a partir de azcares fermentables, usando como catalizador organismos vivos (levadura). En el caso de la planta de alcohol carburante del Ingenio Risaralda se usa especficamente la levadura Sacharomyces cerevisiae en un proceso continuo, con recirculacin de levadura y de vinaza. La cepa utilizada se conoce como GR y es suministrada por la compaa PRAJ. (1) La reaccin bioqumica que se lleva a cabo en la fermentacin alcohlica se muestra a continuacin:

La estequiometra de la reaccin establece que por cada 100 gramos de glucosa/fructosa que se consumen, se obtienen 51.1 gramos de alcohol etlico. Sin embargo, la mxima eficiencia que se logra en el fermentador est alrededor del 87% al 89% pues coexisten reacciones adversas que impiden aprovechar completamente los azucares. (1) 3.6 FACTORES QUE AFECTA LA LEVADURA EN LA FERMENTACIN (1) La levadura, por ser un ser vivo, requiere de condiciones apropiadas en el medio para que su desempeo sea satisfactorio. Este microorganismo es altamente sensible a cambios de temperatura, pH, materia prima, presencia y calidad de los nutrientes, concentracin de sales, condiciones de higiene y asepsia, variedad de la caa y concentracin de alcohol, entre otros.

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3.6.1 Materia Prima La materia prima utilizada en el ingenio para la produccin de etanol puede ser obtenida de diferentes etapas en el proceso de elaboracin del azcar. Puede utilizar jugo clarificado, meladura clarificada o sin clarificar, miel de segunda extraccin (Miel B), o cualquier combinacin entre estas corrientes. La diferencia fundamental entre estas corrientes est en el contenido de sacarosa, glucosa y fructosa. La levadura consume glucosa y fructosa, los dos monosacridos que conforman la sacarosa, la cual se desdobla por medio de la accin de una enzima (la invertasa contenida en la levadura) y por la inversin cida de la sacarosa. Tabla 8. Parmetros a tener en cuenta en la fermentacin Componente
Azucares fermentables Sacarosa Glucosa Fructosa Sales Mg, Na, SO4, Mn, Fe, Al, etc. Ca, K, Si Otros compuestos orgnicos Protenas, compuestos nitrogenados Grasas, esteroles, fosfolpidos Acidos orgnicos especialmente acontico y lctico Acidos voltiles (actico, propinico, butrico, valrico) 0.5- 2 Inhibidores 1 -3 0.4 - 1 3 -4 Favorecen Favorecen Inhibidores 2.4 3.4 Favorecen Inhibidores 25 - 32 6-7 7-9 Favorecen Favorecen Favorecen

Concentracin %

Observaciones

En este sentido, la caa de azcar representa el origen comn de estas materia primas por lo que, los nutrientes obtenidos por sta durante su vida, son transferidos directamente a los jugos y mieles que se obtienen en las diferentes etapas del proceso de produccin de azcar. Por todo lo anterior, se debe prestar especial atencin en el campo y en la fbrica con la adicin de los diferentes biocidas, pesticidas, nutrientes y madurantes, al igual que los aditivos como la cal, azufre, floculantes y blanqueadores para evitar efectos negativos en la etapa de fermentacin. En este punto cabe mencionar que la formacin de caramelos, debido a la exposicin de mieles a altas temperaturas, tambin afecta negativamente el proceso de fermentacin. (4) En la tabla 8 se describen los diferentes elementos provenientes de los jugos y mieles que afectan la levadura y las concentraciones y la forma cmo la favorecen o la desfavorecen. (1)

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3.6.2 Almacenamiento de la materia prima El jugo diluido y la meladura estn expuestos a la contaminacin bacteriana debido a que poseen baja presin osmtica, baja viscosidad y alta concentracin de azcares. Por este motivo, al cabo de un par de horas, se inicia la accin bacteriana sobre ellas. Estas bacterias llegan al fermentador y compiten con la levadura por los azucares y los nutrientes. Debido a que el tiempo de duplicacin de las bacterias est alrededor de 20 minutos, mientras que el de la levadura est entre dos y tres horas, se produce una alta concentracin si estas dos materias primas no son esterilizadas. De otro lado, en la miel B y en la miel C (segunda y tercera extraccin respectivamente), por manejar altas viscosidades, la sensibilidad a la penetracin bacteriana es menor y, pese a que poseen alta concentracin de azucares, se pueden almacenar en condiciones adecuadas. La miel C puede llegar a almacenarse por meses sin ningn problema y la miel B hasta por 50 das. Si estas mieles se almacenan a ms de 40C pueden formar caramelos no deseados en el proceso. La materia prima para el inicio del proceso de propagacin de la levadura en el laboratorio se desea de alta calidad, por ello se prefiere que sea meladura clarificada y esterilizada. Para la etapa de propagacin en planta se prefiere utilizar meladura y miel de segunda extraccin (miel B). (1) 3.6.3 Azcares fermentables Como se indic en el metabolismo de la levadura, la glucosa es la fuente de energa que ella toma para transformarla, bien sea en su reproduccin o en la fermentacin. Se consideran como azcares fermentables la sacarosa (compuesta de una molcula de glucosa y una de fructosa), la glucosa y la fructosa, pues son los nicos azcares que la levadura fermenta, convirtindolas en alcohol. La concentracin de azcares fermentables debe ser alta, con el fin de incrementar la produccin de alcohol y disminuir la cantidad de subproductos como la vinaza, pero tiene un lmite mximo a partir del cual inhibe la levadura debido a que aumenta la presin osmtica del medio de cultivo; esto depende de la levadura utilizada. (1) 3.6.4 Contenido total de materia orgnica La materia orgnica est representada por el contenido de protenas, almidones, dextranas, cidos, azcares no fermentables, xilosa, arabinosa y polmeros. Los azcares no fermentables son los azcares como las pentosas, xilosas y slidos que la levadura no puede fermentar, pues su metabolismo no est estructurado para asimilarlas. El contenido de azcares no fermentables vara dependiendo de la variedad de la caa. Un parmetro importante para tener en cuenta es la relacin entre azcares fermentables y azcares no fermentables (F/N) este valor puede variar entre 0.7 y 2.7; mientras ms alto sea este valor, ms eficiente ser la fermentacin. (1)

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3.6.5 Contenido total de materia inorgnica y cenizas Las sales disueltas afectan la presin osmtica del medio de cultivo y por ende de la levadura, disminuyendo la actividad de la misma, por ello se requiere un bajo contenido de cenizas en las mieles a utilizar. Los elementos que conforman la materia inorgnica son: calcio, potasio, slice, hierro, manganeso, xidos, nitratos, compuestos clorados. Generalmente las mieles con alta relacin de azcares fermentables a azcares no fermentables poseen bajo contenido de ceniza. (1) 3.6.6 Contenido de slidos sedimentables Los slidos sedimentables poseen sulfatos de calcio y magnesio, algunas protenas y clulas muertas. Un alto contenido de slidos sedimentables supone problemas de precipitacin y de lodos. Adicionalmente, y considerando que el proceso de destilacin se desarrolla a temperaturas relativamente altas, puede ocurrir la incrustacin de estas sales en los rehervidotes y dems equipos del proceso de destilacin. (1) 3.6.7 pH Todos los microorganismos tienen un pH ideal para desarrollarse y crecer. El pH en la fermentacin debe mantenerse entre 4.0 y 4.7 para obtener una actividad ptima de la levadura y reducir la actividad microbiana de bacterias indeseadas. El pH de la fermentacin debe ajustarse con cido sulfrico si es necesario. Debe tenerse en cuenta que sobre este parmetro tiene incidencia directa la capacidad buffer de la melaza. (1) 3.6.8 Temperatura La temperatura es uno de los factores crticos para que el progreso de la fermentacin sea apropiado. La reaccin de generacin de alcohol es exotrmica, es decir, genera calor continuamente y este calor debe ser retirado. Cada tipo de levadura tiene una temperatura ptima para su correcto desempeo la cual vara entre 30C y 35C. Incrementos de la temperatura reducen la actividad enzimtica de la levadura, y por ende la fermentacin se hace lenta. Asimismo, por encima de 35C hay desarrollo de bacterias mesfilas indeseadas. (1) 3.6.9 Acidez voltil orgnica La acidez voltil se refiere principalmente a la presencia de cido actico, cido propinico, cido valrico, cido isovalrico, cido isobutrico y cido butrico. Los cidos son txicos para la levadura, disminuyen su actividad y pueden causar su muerte. Un alto contenido de estos cidos incrementa el tiempo de fermentacin, y genera subproductos por las reacciones colaterales con el azcar, disminuyendo la eficiencia de la fermentacin. Adicionalmente, el incremento en acidez voltil es un indicador de la presencia de bacterias en la fermentacin. (1) Normalmente, se pueden encontrar mieles con acidez voltil entre 500 ppm y 2500 ppm. Los valores mximos a aceptar para este parmetro, sin que afecten notablemente la actividad de la levadura, estn entre 2500 ppm y 5000 ppm. (1)

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3.6.10 Contenido de Caramelos Los caramelos se forman por la exposicin de los azcares, durante un tiempo prolongado, a altas temperaturas. Los caramelos colorean las mieles generando un color caf oscuro. Se ha observado que altos contenidos de caramelos en las mieles pueden retardar al doble de tiempo la fermentacin. (1) 3.6.11 Contenido de bacterias El contenido de bacterias se define como el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) por mL. Comnmente se pueden encontrar valores entre 1 x 102 UFC 1 x 103 UFC cuando se inicia la fermentacin. Por ser de un tamao menor que el de la levadura, deben observarse al microscopio con un lente de orden de 100x. Las bacterias se reproducen ms rpidamente que la levadura y compiten por el azcar, causando disminucin en el rendimiento del alcohol y generando subproductos indeseados. (1) 3.6.12 Sodio La mayora de los equipos utilizados en el rea de fermentacin se limpian con una solucin de hidrxido de sodio (NaOH). Esta solucin debe retirarse completamente despus de la limpieza debido a que los residuos de sodio causan cambios indeseados en la morfologa de la levadura, observndose mas ovalada de lo normal y ocasionando cambios genticos en sta. (1) 3.6.13 Relacin carbono/Nitrgeno El contenido de nitrgeno, al igual que el contenido de la fuente de energa o carbono, son de mucha importancia en la fermentacin. El nitrgeno es necesario para la generacin de protenas constituyentes de las clulas, es decir de la levadura. Este nitrgeno es adicionado al medio de cultivo como urea cuando el etanol que se va a producir no es de consumo humano; de lo contrario, se recomienda utilizar Difosfato de Amonio (DAP) como fuente de nitrgeno. (1) 3.6.14 Contenido celular Cuando el reactor tiene un alto contenido celular, la fermentacin se torna ms eficiente, pues son ms clulas trabajando para producir etanol. El contenido de clulas en un sistema sin recirculacin debe ser del orden de 80 x 106 cell/ml a 100 x 106 cell/ml (clulas por mililitro). En sistemas con recirculacin debe ser del orden de 350 x 106 cell/ml para incrementar la productividad de la fermentacin, es decir, se disminuye el tiempo de fermentacin. (1) 3.6.15 Tiempo de residencia En procesos continuos, el tiempo de residencia es el tiempo de permanencia de una partcula que ingresa al interior de un recipiente antes de ser evacuada por la corriente de descarga. En particular, la expresin matemtica que le corresponde es el volumen del fermentador dividido por el flujo de salida. (1) Cada sistema de fermentacin est diseado para un tiempo de fermentacin determinado; la prolongacin de este tiempo de fermentacin puede generar

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incrementos en la poblacin bacteriana con el consecuente aumento en la acidez voltil. Por otro lado, tiempos de residencia muy bajos impiden que los microorganismos procesen completamente los azcares residuales disminuyendo la eficiencia de la fermentacin. (1) 3.6.16 Agitacin en el fermentador Por medio de agitadores se mejora la transferencia de nutrientes entre el medio y la levadura homogenizando el medio en los fermentadores. El CO2 que se genera en la fermentacin tambin ayuda a la agitacin de la mezcla y a mantener las partculas en suspensin. (1) 3.6.17 Concentracin de etanol La tolerancia a la concentracin de alcohol depende del tipo de levadura, esta puede variar desde un 5% v/v a 23 %v/v (volumen a volumen). El etanol afecta negativamente la pared celular y las enzimas intracelulares de la levadura. (1) En la tabla 9 se muestra un resumen de las caractersticas en la materia prima y los efectos ocasionados en la fermentacin. (1)

3.7 FERMENTACIN CONTINUA CON RECIRCULACIN DE LEVADURA El proceso de fermentacin de alcohol est conformado por tres etapas principales: propagacin, fermentacin - separacin, y recirculacin de levadura. En la planta de alcohol del Ingenio Risaralda S.A. el proceso de fermentacin es continuo, se inicia con la preparacin y propagacin de la levadura a nivel de laboratorio. De este proceso es responsable el rea de microbiologa y exige buenas prcticas de laboratorio y de asepsia en el mismo. Esta etapa se considera de alta vulnerabilidad en el proceso ya que debe garantizar un inculo libre de contaminacin en las cubas de reproduccin en planta. 3.8 ETAPA DE PROPAGACIN La levadura suministrada por la compaa PRAJ, denominada cultivo maestro, est preservada en medio con glicerol. El primer paso consiste en activar la levadura en un medio lquido adecuado para su crecimiento. Una vez activada se llevan a cabo dos siembras: una para prueba cualitativa de contaminacin bacteriana y la otra para continuar la propagacin de la levadura. Para continuar la propagacin es preciso confirmar que la levadura se encuentre libre de contaminacin, es decir, que la prueba cualitativa sea negativa.

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Tabla 9. Caractersticas de la materia prima Parmetro

F/N: Fermentables/No fermentables

Concentracin
0.85 a 1.45 en miel final 1.15 en meladura

Efecto
Alta relacin favorece la fermentacin. A mayor valor, permite la recirculacin de no fermentables sin afectar el proceso y por lo tanto favorece la recirculacin de vinaza. No se debe superar este valor porque la fermentacin disminuye. El N fermentable es requerido como nutriente de las levaduras en la fermentacin. Afecta la viscosidad y por lo tanto las propiedades de flujo

Slidos no fermentables Nitrgeno fermentable

Mximo 17% 200-300 ppm en mieles requerido entre 600 a 800 ppm. 75 -80 % w/w 7 -14% A mayores concentraciones pueden ocasionar toxicidad a la levadura 0.5 4% 1.5- 4% 4.8 - 8 Prueba cualitativa 0.1 7.0 100 50.000 UFC/g 2500 - 5000 ppm debe mantenerse en 2000 ppm en el fermentador

Slidos totales Cenizas inorgnicas totales

Ca como sulfato Slidos orgnicos precipitable Capacidad buffer pH Caractersticas espumantes Caramelo Bacterias y levaduras salvaje cidos voltiles

Causa incrustaciones. Valores alrededor del 2% se consideran normales. Incrementa la presencia de puntos muertos, infeccin bacterial. Si es muy alto, incrementa los requerimientos de cido para el proceso Si alto, se incrementa el uso de antiespumante Inhibe severamente las levaduras, afectan eficiencias y produccin de alcohol Inhibe levadura Retarda el crecimiento de la levadura, la productividad y reduce el rendimiento. Se requiere el uso de biocidas. El amonio cuaternario usado en los medios hasta concentraciones de 10ppm no representa problemas. Existen biocidas que no son biodegradabes con la temperatura pero pueden llegar a las mieles o meladuras que impiden la fermentacin.

Trazas de sustancias inhibidoras

El proceso de preservacin de levadura consiste en colocar una colonia aislada de la placa de siembra en un tubo de ensayo con medio de cultivo para crecimiento y dejarla incubar en un agitador con temperatura controlada entre 28 y 32C durante 24 horas. Este procedimiento se repite para diez tubos de ensayo con 12 ml de medio de cultivo cada uno, los cuales son preservados a 4C. El tubo de ensayo con material preservado constituye el cultivo de trabajo. Para mantenimiento de las condiciones de la cepa se realiza pases del cultivo cada dos o tres meses. En la figura 7 se muestra el esquema de propagacin de la levadura. Partiendo del cultivo de trabajo que se tiene preservado, se toma un inculo y se pasa a seis tubos de ensayo con miel B o meladura como medio de cultivo a una concentracin de azcares fermentables del 5% para hacer incubados bajo agitacin (90 100 rpm) y temperatura controlada (30 -32C) durante 20 horas, los cuales constituyen la etapa L1. Cada etapa siguiente tiene como medio de cultivo melaza a la concentracin de azcares fermentables ya mencionada y requiere como inculo todo el volumen de la etapa anterior. La etapa L2 o segunda etapa

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de laboratorio y L3 requieren un volumen de 5 y 15 litros respectivamente de cultivo que es igualmente manejado a temperatura y agitacin controlada. El tiempo de incubacin desde L2 a L3 es de 20 a 24 horas, cada una. El volumen de 15litros obtenidos del laboratorio es inoculado a T1 y as sucesivamente se transfiere desde T1 a T4, cada vez con el objetivo de aumentar biomasa de levadura. Finalmente, se tiene el cultivo para cargarse al fermentador de la planta. Las condiciones de aireacin son de 1 vvh (volumen de aire por volumen de medio por hora). Figura 7. Esquema de propagacin de levadura

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Figura 8. Fotografa Cubas de Propagacin de la Planta de alcohol del Ingenio Risaralda

Cuba 1

Cuba 2 Cuba 3

3.9 ETAPA DE FERMENTACIN En el ingenio Risaralda S.A. existen dos fermentadores (Ver figura 9) para llevar a cabo la produccin de alcohol a las concentraciones deseadas. El tiempo de residencia es un factor importante en el proceso y depende de la concentracin celular, de la productividad y de la concentracin de alcohol. Figura 9. Fotografa de los fermentadores de la Planta de alcohol del Ingenio Risaralda S.A.

FERMENTADOR R-312 FERMENTADOR R-311

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3.10 RECIRCULACIN DE LEVADURA (1) La Recirculacin de levadura genera los siguientes beneficios: Reduccin en el tiempo de residencia hidrulico que ayuda al lavado de bacterias. Incremento de la eficiencia de fermentacin debido a la reduccin de los subproductos de la fermentacin y en la generacin de clulas nuevas. Reduccin en los costos de inversin de capital ya que los fermentadores son ms pequeos y por ende algunos de los equipos asociados a ellos. El sistema de separacin de levadura usa como principio de separacin la sedimentacin por gravedad (figura 10), aprovechando el hecho que la densidad de la levadura es mayor que la densidad del mosto. Desde el punto de vista operativo se requiere que la velocidad de sedimentacin de la levadura sea mayor a la velocidad de flujo en el sistema, cabe anotar que la levadura muerta no sedimenta sino que sobrenada, por ello sale del sistema junto con el vino. Figura 10. Fotografa del Sedimentador de la Planta de alcohol del Ingenio Risaralda S.A.

Esta parte del proceso consta de un sedimentador en forma cnica y de un tanque de activacin celular donde se dispone la crema separada (vase figura 11). Del sedimentador se retira por rebose el mosto que va hacia la destilera y del fondo la crema de levadura. (1)

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Figura 11. Esquema de recirculacin de levadura

Algunas de las ventajas que se han encontrado con la recirculacin de levadura mediante el sedimentador son: No recicla los lodos Ahorro en energa y mantenimiento ya que no necesita de centrifugas, es decir, altas velocidades mecnicas para su separacin. Ahorro de la solucin de limpieza. Figura 12. Fotografa del Sistema de recirculacin de levadura de la planta de alcohol del Ingenio Risaralda

Sedimentador

Tanque de Activacin

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3.11 RECIRCULACIN DE VINAZA El esquema de recirculacin de vinaza surge de la necesidad de reducir la generacin de efluentes, de reducir el consumo de agua de proceso y de reciclar nutrientes. En la figura 13 se muestra un esquema del proceso. Figura 13. Esquema de recirculacin de vinaza.

La cantidad de vinaza recirculada depende de la concentracin de slidos en el vino que es una funcin de la relacin F/N y del nivel de cidos voltiles como funcin de los cidos voltiles alimentados. De acuerdo con la experiencia de la compaa PRAJ, la cantidad de vinaza recirculada es una funcin de la composicin del alimento, del diseo, del proceso, del tipo de levadura utilizado, motivo por el cual saliendo de la planta se puede generar entre 2 y 3 L de vinaza/L de alcohol.

3.12 TIPO DE CONTAMINANTES EN LA FERMENTACIN ALCOHLICA (5) Cuando un proceso fermentativo tiene problemas en el rendimiento es importante establecer cuales son las posibles causas e indicadores que estn afectando el proceso. Entre stos tenemos la prdida en la produccin de etanol, aumento de

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cidos orgnicos voltiles, muerte de la levadura, incremento en el nmero de bacterias, presencia de sabores extraos y productos no deseados. (5) Los contaminantes que generalmente se encuentran en el proceso fermentativo son de tres tipos: (5) Bacterias Gram positivas: Clulas en forma de cocos y bacilos, productoras de cido lctico, generalmente prefieren condiciones anaerbicas y son acidotolerantes. Entre stas tenemos: Lactobacillus, Pedicoccus y Leuconostoc. Bacterias Gram negativas: Clulas en forma de bacilos, oxidan el etanol a acido actico, son aerobias obligadas, causan problemas serios en la propagacin de la levadura y son acidoalcohol tolerantes. Entre stas tenemos: Acetobacter, Gluconobacter y Zymomonas. Otro tipo de bacterias Gram negativas, aerobias facultativas, que se consideran contaminantes son: Coliformes totales como el Aerobacter que produce cido a partir de la glucosa. Levaduras salvajes: Aquellas que compiten por nutrientes con S. cerevisiae. Tambin estn las llamadas levaduras asesinas productoras de toxinas de carcter proteico y glicoproteico fatales para otro tipo de levaduras.

3.12.1 Bacterias lcticas Son bacterias Gram positivas que obtienen la energa exclusivamente por fermentacin de azcares, carecen de ciclo de Krebs funcional, requieren factores nutritivos especiales (aa, bases nitrogenadas y vitaminas) lo que contribuye a su reducido crecimiento en medios comunes, toleran bien concentraciones relativamente altas de cidos y valores de pH ms bajo que otras bacterias lo cual facilita su colonizacin.(5) Las bacterias lcticas son importantes a nivel industrial porque fermentan azcares produciendo cantidades considerables de cido lctico lo que permite su empleo en la elaboracin de productos fermentados vegetales y lcticos y en la elaboracin industrial de cido lctico pero perjudiciales para otros productos como el vino o cerveza y el alcohol. (5) La termoresistencia o propiedades termodricas de la mayora de los Lactobacillus que crecen bien a temperaturas altas, es lo que les permite sobrevivir a la pasteurizacin y a otros tratamientos trmicos. (5) 3.12.2 Fermentacin acido lctica La fermentacin cido lctica es aquella que se lleva a cabo por las bacterias cido lcticas cuya actividad se desarrolla en

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ausencia de oxgeno (anaerobiosis), y se manifiesta en la transformacin de los azcares presentes en la materia prima, en cido lctico, etanol y dixido de carbono (figura 14). (5) Figura 14. Fermentacin acido lctica

3.12.3 Bacterias acticas Son bacilos Gram negativos polimrficos, aerobias obligadas, no esporgenos, oxidan el alcohol etlico a cido actico y transforman otros compuestos orgnicos en productos de oxidacin diversos. Crecen generalmente en el intervalo de 5 8 das a 35 40 C. (5) Acetobacter aceti es la especie ms importante en este grupo de bacterias debido a que utiliza el ciclo del cido ctrico o ciclo de Krebs, tiene flagelos pertricos cuando son mviles y utilizan el cido lctico como nutriente. Es capaz de metabolizar hexosas para oxidar el etanol y son acidotolerantes. Otra especie importante es Gluconobacter oxidans capaz de metabolizar cierto nmero de hexosas y pentosas realizando oxidacin incompleta de los alcoholes originando acumulacin de cidos rganicos como productos finales. (5) Las bacterias acticas son importantes para otros procesos industriales diferentes al de alcohol porque: Oxidan el alcohol etilco a cido actico, lo que las hace tiles en la fabricacin del vinagre y perjudiciales para las bebidas alcohlicas. Tienen un extraordinario poder oxidante que puede ser utilizado para eliminar especies nocivas.

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Otro tipo de bacteria Gram negativa pero que no producen cido actico es la Zymomonas movilis que es un microorganismo con alta tolerancia al etanol, pero muy sensible a infecciones por otro tipo de bacterias y virus y adems no fermenta los azucares de hidrolizados lignocelulosicos. (5) Entre las bacterias coliformes encontramos E. coli, capaz de fermentar azucares pero no tolera altas concentraciones de etanol y esta asociado con enfermedad en el hombre. Los contaminantes bacterianos compiten con la levadura por nutrientes como vitaminas y aminocidos y los productos finales como el cido lctico y actico inhiben la actividad metablica de S. cerevisiae, adems se multiplican exponencialmente mientras la levadura se encuentra en fase de latencia. (5) Utilizan los carbohidratos como la glucosa, que metabolizada por va aerbica o anaerbica, es convertida a cido pirvico y a partir de ste se genera una cantidad de productos indeseados que a altas concentraciones afectan el metabolismo normal de la levadura (Figura 15). (5) Dentro de estos cidos encontramos el cido lctico como producto final de las bacterias lcticas y el cido actico que es generado por las bacterias acticas en condiciones de aerobiosis o por bacterias trmofilas como Clostridium en anaerobiosis. Tambin se producen otro tipo de productos como glicerol, acetona, acido butrico que son menos significativos. (5) 3.13 IDENTIFICACIN MICROBIANA

La determinacin de la concentracin de bacterias contaminantes en el proceso de produccin de alcohol es importante puesto que perjudican la eficiencia; las ms implicadas son los Lactobacillus sp que producen cido lctico como metabolismo principal, el cual tiene efecto inhibidor sobre la levadura. Adicionalmente se pueden medir las bacterias mesfilas totales como indicadoras del nivel de contaminacin del sistema y otros microorganismos como los mohos y levaduras. Se utiliza el procedimiento de recuento en placa. Despus del tiempo de incubacin se puede realizar tcnicas de identificacin como la coloracin de Gram y catalasa para las bacterias y examen directo con Azul de Lactofenol y Cinta adhesiva para el montaje de hongos.

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Figura 15. Reacciones metablicas por bacterias

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4. MARCO DE REFERENCIA

4.1 MARCO GEOGRFICO El rea de Fermentacin est ubicada en la planta de alcohol del Ingenio Risaralda S.A. El cual geogrficamente se encuentra en el municipio de Balboa Departamento de Risaralda. Aunque est mas cerca de la zona urbana del municipio de La Virginia a 2km va La Virginia - Balboa a orillas del ro Risaralda. El ingenio Risaralda lleva 29 aos prestando sus servicios a la comunidad y cada da quiere innovar con nuevos productos y tecnologa el mercado nacional e internacional por tal razn entra en el mundo del alcohol carburante.

Figura 16. Vista superior de la Maqueta del Ingenio Risaralda S.A.

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ZONA DE ESTUDIO 1 1. Fermentacin 4 2. Destilacin 3. Calderas 4. Planta Elctrica 5. Planta de aguas 6. Elaboracin de azcar

La construccin de la planta de alcohol se inici en enero del 2005 y entr en operacin el 28 de enero de 2006 alcanzando una produccin de 16.389.235 litros

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de los cuales el 98.3% fueron de alcohol carburante y el 1.7% de alcoholes para uso industrial durante este ao. En la figura 16 se puede visualizar una fotografa de una seccin de la maqueta del Ingenio Risaralda y en donde se observa claramente donde se encuentra ubicada el rea de fermentacin y en donde se realiz el estudio de la acidez voltil. 4.2 TIPO DE ESTUDIO

Investigativo

4.3 ANTECEDENTES Dentro del contexto industrial, El Ingenio Risaralda S.A. no haba desarrollado ningn estudio previo sobre el contenido de acidez voltil, ya que no era necesario desde el punto de vista de la produccin de azcar. En la actualidad, con la produccin de alcohol etlico, se hace necesario el desarrollo de un estudio detallado de esta variable y mucho ms por el sistema de recirculacin de vinaza que es una fuente rica en cidos voltiles. En Colombia, la mayora de los estudios de acidez voltil se enfocan en el campo de la produccin de vinos o bebidas alcohlicas como el ron, vodka entre otros. En el mbito internacional se conoce que Brasil, uno de los ms importantes productores de alcohol carburante en Amrica latina y el mundo no utiliza de forma general la recirculacin de vinaza como parte del proceso, pero actualmente algunas destileras brasileas estn adaptando esta tecnologa aunque los costos de adaptacin son altos. Pases europeos y Australia se encuentran en la misma situacin, siendo India un pas con gran desarrollo en este campo. (3)

43

5. METODOLOGA

5.1 PUNTOS DE MUESTREO Materia prima (Miel B y Jugo Clarificado) T-124 Mosto fermentado del tanque de activacin de levadura R-305 Mosto fermentado del fermentador R-311 Mosto fermentado del fermentador R-312 Mosto fermentado del tanque recibidor de mosto T-335 Vinaza recirculada (T-403)

Figura 17. Esquema General de Fermentacin

ESQUEMA GENERAL DE FERMENTACION

R-311
MIEL T-124

R-312

S-331

AGUA

R-305

T-335
Destilacion

Vinaza T-403 Por: Cano Ingenieria

44

5.2 TOMA DE MUESTRAS 5.2.1 Anlisis fisicoqumicos y cromatogrficos Tanque de alimentacin T-124: Muestra compuesta de 24 horas. Cada hora se tom una muestra de 500mL y de all una alcuota de aproximadamente 50mL para llegar a un volumen total de 1litro. La muestra permaneca en la nevera para evitar alteraciones. El tanque est ubicado en la seccin de elaboracin en la fbrica de azcar. Figura 18. Fotografa al tanque de alimentacin T-124

Punto de Muestreo

Fermentadores (R311 y R312), tanque de activacin (R-305) y recibidor de mosto (T-335): Muestreo puntual cada 8 horas aproximadamente de 500 mL, cada tanque tena una hora diferente de muestreo con el fin de analizar la muestra inmediatamente despus de recolectada para as obtener resultados ms confiables. Para el anlisis de la acidez voltil titulable se realizaba un promedio por da de los resultados y para los anlisis cromatogrficos solo se analizaba una de estas tres muestras. Los tanques estn ubicados en el rea de fermentacin en la planta de alcohol carburante.

45

Figura 19. Punto de muestreo Fermentador R-311

PUNTO DE MUESTREO R-311

Figura 20. Punto de muestreo Tanque R-305

PUNTO DE MUESTREO R-305

46

Figura 21. Punto de Muestreo Tanque T-335

PUNTO DE MUESTREO T-335

Tanque de vinaza (T-403): Muestreo puntual cada 24 horas aproximadamente de 500mL. Se procesaba inmediatamente llegaba al laboratorio. Se encuentra ubicado en el rea de destilacin y de all la vinaza se regresa nuevamente al rea de fermentacin. Figura 22. Punto de Muestreo Tanque de vinaza T-403

Tanque Flash

47

Como se puede observar en las figuras 18 al 22 cada tanque tiene su respectivo toma muestra y siempre estn en continua agitacin.

5.2.2 Anlisis Microbiolgicos Para este tipo de anlisis las muestras fueron puntuales y se tomaron en frascos de vidrio limpios y estriles, de calidad pyrex o schott de boca ancha de aproximadamente 200 ml de capacidad con tapa rosca. Se tomaron de sus respectivos toma muestras desinfectando con alcohol al 70%, con esto se asegura la asepsia requerida para este procedimiento, eliminando cualquier pelcula o suciedad existente en la superficie del toma muestras que puedan interferir con el procedimiento. As mismo proporciona proteccin contra la contaminacin del medio ambiente y por lo tanto se asegura la integridad de la muestra. Inmediatamente se hizo la recoleccin de las muestras, stas fueron llevadas al laboratorio de Microbiologa y procesadas, a cada una se les asign un nmero el cual corresponde a la fecha en la cual fue tomada la muestra y la identificacin del tanque. 5.3 MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 5.3.1 Equipos Equipo de destilacin por arrastre de vapor, Alcotest Raypa. Figura 23. Alcotest

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Cromatgrafo de gas Shimadzu GC-2010, con automuestreador, detector de ionizacin de llama, columna Rtx-1701 30m y 0.25 mmID de 14% cianopropilfenil - 86% dimetilpolisiloxano. Figura 24. Cromatgrafo de Gases

GC 2010

Densmetro Anton Paar DMA4500 Figura 25. Densmetro DMA 4500

DMA 4500

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Titulador automtico Figura 26. Titulador Automtico Methrom

Titulador

Microscopio Binocular Incubadora Autoclave Cabina Flujo Laminar Balanza analtica Estufa secadora Contador de colonias 5.3.2 Material de vidrio Balones volumtricos de 10, 50 y 100mL Pipetas graduadas de 1, 2 y 10 mL Pipeta volumtrica de 10mL y 50mL Cajas de Petri de 100 x 15 mm Probeta graduada de 200 y 250 mL Vasos de precipitado de 150 , 250 y 500 mL Embudos de separacin de 250mL Embudo en forma de V pequeo Viales con tapa de 2mL para el automuestreador 5.3.3 Reactivos Acido sulfrico concentrado Hidrxido de sodio 0.1N Acido clorhdrico 0.1 N

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Ftalato cido de potasio Sulfato de sodio anhidro Acido actico glacial Diclorometano Acido propinico para CG Acido isobutrico para CG Acido n-butrico para CG Acido isovalrico para CG Acido Valrico para CG Solucin salina a 0.85% Alcohol Etlico al 95% Acetona Alcohol de tipo industrial para el mechero Hipoclorito de sodio industrial Agua destilada 5.3.4 Gases Aire sinttico cero Helio (gas de arrastre) Hidrgeno 5.3.5 Medios de cultivo Agar MRS (Man, Rogosa and Sharpe) para lactobacilos Agar Plate Count para mesfilos 5.3.6 Otros implementos de Laboratorio Aro metlico para embudo de separacin Soporte metlico Pipeteador Mechero de alcohol Palillos de madera Gradilla Cinta indicadora de esterilizacin Tijeras Cinta de papel Papel Kraf Esptula metlica Encendedor

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5.3.7 Equipos de Proteccin Personal Tapabocas Cofia Indumentaria limpia Guantes desechables Delantal blanco Gafas

5.4 MTODOS DE ANLISIS 5.4.1 Acidez Voltil titulable en mieles y mosto fermentado en trminos de cido actico y sales de acetato. (6) La fermentacin alcohlica es un proceso no estril. Las bacterias presentes en el mosto fermentado producen cidos que son txicos para la levadura y afectan la productividad del proceso. La acidez voltil es una medida indirecta de la contaminacin bacteriana en la materia prima y/o en el mosto fermentado. Para su determinacin la muestra es acidulada y al destilarla se obtienen los cidos voltiles que posteriormente se titulan con hidrxido de sodio estandarizado. En la figura 27 se indica cmo determinar la acidez voltil en mieles y mosto fermentado. (6) Figura 27. Diagrama del procedimiento para determinar la acidez voltil titulable en mieles y mosto fermentado
Adicione 50mL del mosto o de la miel al tubo del equipo de destilacin (figura 12) con una pipeta volumtrica. Adicione 1mL de H2SO4 concentrado y unas gotas de antiespumante para evitar que la muestra se derrame. Acople el tubo al alcotest asegurando que quede hermticamente sellado e inicie el calentamiento.

Registre el volumen de NaOH gastado.

Transfiera el destilado a un beaker de 250mL y titlelo con hidrxido de sodio 0.1N automticamente hasta un pH de 8.2 o manualmente utilizando fenolftalena.

Colecte el destilado en un baln volumtrico de 100 mL.

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Figura 28. Diagrama para determinar el factor de recuperacin del equipo de destilacin por arrastre de vapor
Prepare un estndar de 1000ppm de cido actico. Trate ste estndar como una muestra. Adicione 50mL del estndar al tubo del equipo de destilacin con una pipeta volumtrica. Adicione 1mL de H2SO4 concentrado y unas gotas de antiespumante para evitar que la muestra se derrame.

Transfiera el destilado a un beaker de 250mL y titlelo con hidrxido de sodio 0.1N automticamente hasta un pH de 8.2 o manualmente utilizando fenolftalena.

Colecte el destilado en un baln volumtrico de 100 mL.

Acople el tubo al alcotest asegurando que quede hermticamente sellado e inicie el calentamiento.

Registre el volumen de NaOH gastado y ste ser el valor de A.

Tome 50mL del estndar en un beaker de 150 mL y titlelo con NaOH 0.1N como hizo con el destilado.

Registre el volumen de NaOH gastado como B.

Calcule el Factor de recuperacin de la siguiente manera:

FR=A/B
Use este factor para calcular la acidez voltil en mieles o mosto fermentado en ppm.

Vol. NaOH x 0.1 x 60000 Acidez voltil (ppm)= FR x Vol. Muestra tomada (50mL)
Donde, 0.1 = Normalidad de hidrxido de sodio 60000 = Peso molecular del cido actico en miligramos FR = Factor de recuperacin del equipo de destilacin (Usualmente est entre 0.55 y 0.7)

53

5.4.2 Determinacin del porcentaje de alcohol en el mosto fermentado usando densmetro (6) Debido a que el mosto fermentado es una mezcla de componentes el contenido de alcohol es separado por medio de una destilacin y el destilado es medido utilizando un densmetro. En la figura 29 se describe el procedimiento a seguir. Figura 29. Diagrama para determinar el porcentaje en volumen de alcohol en el mosto fermentado utilizando densmetro
Adicione 50mL del mosto o de la miel al tubo del equipo de destilacin (figura 23) con una pipeta volumtrica. Adicione unas gotas de antiespumante para evitar que la muestra forme espuma y se derrame. Acople el tubo al alcotest asegurando que quede hermticamente sellado e inicie el calentamiento.

Espere a que el equipo se estabilice a 20C y arroje el valor. Registre el porcentaje en volumen del alcohol presente en el mosto.

Con una jeringa inyecte el destilado en el densmetro (Figura 25). Asegrese que la celda quede completamente llena y sin burbujas. Presione la tecla STAR.

Colecte el destilado en un baln volumtrico de 50 mL.

5.4.3 Determinacin y cuantificacin de cidos voltiles en mieles y mosto fermentado por cromatografa de gases

5.4.3.1 Tratamiento de la muestra Para extraer los cidos voltiles presentes en la materia prima o en el mosto fermentado se realiza la destilacin de la misma manera que se realiz en el mtodo anterior con la diferencia que no se titula sino que se analiza por cromatografa de gases, una tcnica ms exacta y en donde se puede cuantificar individualmente cada cido. Para ste mtodo debemos tener factores de recuperacin de cada cido, los cuales se realizan de la misma manera como se realiz el del cido actico (figura 29) pero preparando el patrn del respectivo cido. En la tabla 10 se presenta los factores de recuperacin del equipo de destilacin para cada tubo.

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Tabla 10. Factores de recuperacin del equipo de destilacin utilizado CIDO VOLTIL ACIDO ACTICO ACIDO PROPINICO ACIDO ISOBUTRICO ACIDO BUTRICO ACIDO ISOVALRICO ACIDO VALRICO TUBO 1 0.5919 0.7955 0.9574 0.8992 0.9752 0.9544 TUBO 2 0.5485 0.7582 0.9516 0.8855 0.9762 0.9522

A los 100mL del destilado se adicionan 10mL de HCl 0.1N y 10mL de diclorometano para extraer los cidos, utilizando un baln de separacin. Esta extraccin es con el fin de no ingresar agua a la columna capilar (el agua es nociva para las columnas). La fase orgnica queda en la parte inferior; para separarla y evitar que pase cualquier gota de agua se utiliza un embudo en vidrio en forma de V que tenga una pequea cantidad de sulfato de sodio anhidro, que es una sal inerte y absorbe el agua. El diclorometano con los cidos se hace pasar por el embudo y se recogen en un baln volumtrico de 10mL, cuando pase todo el solvente orgnico se lava con unos cuantos mililitros de diclorometano limpio, se recogen en el mismo baln y se afora. En un vial con tapa se transfiere 1.5mL de este extracto y se inyecta en el cromatgrafo de gases.

Para obtener el resultado final se realiza el siguiente clculo:

(CG * 5)/FR cido

Donde, CG: Concentracin de cada cido hallada por cromatografa de gases 5: Factor de dilucin obtenido de dividir el volumen de muestra tomada y el volumen final de la extraccin con diclorometano (50/10) FR cido: Factor de recuperacin de cada cido que depende del tubo en donde se realiz la destilacin. (Ver figura 29)

55

5.4.3.2 Condiciones cromatogrficas Tabla 11. Condiciones cromatogrficas empleadas Columna Longitud de la columna 30 m Temperatura inicial 45C Tiempo calentamiento inicial 5 min Rata de temperatura 20C/min Temperatura final 100C Tiempo de calentamiento final 5 min Tiempo total 15 min Inyector Temperatura 240C Modo Divisor Rata de divisin 1:30 Volumen de inyeccin 1L Detector Tipo Ionizacin de llama Temperatura 260C Gas de combustin Hidrgeno (40ml/min) Gas oxidante Aire (400ml/min) Make Up Helio (30ml/min) Gas de Arrastre Tipo Helio Velocidad lineal 25cm/s 5.4.3.3 Curva de calibracin Se realiz curva de calibracin para los siguientes cidos: cido actico, cido propinico, cido isobutrico, cido butrico, cido isovalrico y cido valrico. Se prepar un patrn inicial con los seis cidos, de all se tom los volmenes para realizar las diluciones y formar 5 patrones cada uno con concentraciones diferentes de los cidos y utilizando como solvente el diclorometano. En la tabla 12 se especifican las concentraciones de cada cido en los diferentes patrones. Tabla 12. Patrones de cidos voltiles
ACIDO ACTICO ppm PROPIONICO ppm ISOBUTIRICO ppm BUTIRICO ppm ISOVALERICO ppm VALERICO ppm PATRON 1 200 20 100 10 10 20 PATRON 2 400 40 200 20 20 40 PATRON 3 600 60 300 30 30 60 PATRON 4 800 80 400 40 40 80 PATRON 5 1000 100 500 50 50 100

56

5.4.4 Anlisis Microbiolgicos Una vez tomadas las muestras se procede a realizar el cultivo microbiolgico a partir de una dilucin inicial de 10-1 la cual se logra tomando 1ml de la muestra y 9ml de diluyente que en nuestro caso es agua destilada estril. Una vez obtenida esta suspensin se procede a realizar diluciones secuenciales y para conseguirlo se debe disponer de varios tubos que contengan 9 ml de diluyente a los cuales se transfiere 1 ml de la dilucin anterior. De esta forma y a partir de 10-1 se obtienen diluciones 10-2, 10-3 ,10-4 hasta 10-8. Tradicionalmente se ha recomendado que con la finalidad de minimizar el error producido en los recuentos, todas las diluciones se deben sembrar por duplicado. As mismo se deben realizar diluciones hasta 10-8 cuando no se conoce el grado de contaminacin que pueda tener la muestra. (6) Todos los procedimientos de microbiologa deben ser realizados aspticamente, al frente de un mechero o en la cabina de flujo laminar. El nivel de dilucin del mosto fermentado puede variar dependiendo del grado de contaminacin. Usualmente una dilucin de 10-8 es suficiente. (12)

Figura 30. Diagrama Recuento de bacterias por placa

Coloque 1mL de mosto fermentado en un tubo de ensayo estril que contenga 9mL de agua estril y agite -1 bien. (Dilucin 10 ) Tome 1mL de sta dilucin y adicinelo a otro tubo que contenga 9mL de agua estril y agite bien. (Dilucin -2 10 ) De la misma manera Prepare diluciones hasta -8 10 .

Vierta aproximadamente 20mL del medio nutriente en la caja petri.

Adicione 5mL de solucin actidione (1mg/ml) a 100mL de medio Lactobacillus MRS agar fundido y Plate Count.

Transfiera 1mL de cada -6 -8 dilucin 10 y 10 en dos cajas de petri estriles.

Disperse el medio sobre toda la caja rotando e inclinando la caja.

Deje solidificar el medio a temperatura ambiente.

Incube estas cajas en posicin invertida por 72 horas a 35C.

Cuente el nmero de colonias desarrolladas despus de la incubacin.

57

Una vez preparadas las diluciones de las muestras y teniendo los medios de cultivo Agar Plate Count para mesfilos y Agar MRS para bacteria lcticas, se procede a realizar la siembra. Los medios empleados deben estar fundidos y enfriados a 45 50C, se realiza la siembra inoculando 1 ml de cada dilucin en las respectivas cajas de Petri y encima se agrega el medio. Una vez mezclado y solidificado se incuban a una temperatura de 35 C por 48 a 72 horas. (6) Luego del tiempo de incubacin se procede a realizar el conteo de las colonias utilizando un cuenta colonias. Se escogi la tcnica de recuento en placa con siembra en profundidad ya que es la recomendada por Industrias PRAJ y la utilizacin de otras tcnicas como la Filtracin por Membrana se dificulta debido a la naturaleza de la materia prima. (6)

58

6. DATOS, RESULTADOS Y DISCUSIN

6.1 ACIDEZ VOLTIL TITULABLE EN MIELES Y MOSTO FERMENTADO EN TRMINOS DE CIDO ACTICO O SALES DE ACETATO A cada uno de los puntos crticos se les realiz un seguimiento de la acidez voltil total desde el primer da que inicia la fermentacin hasta el final de la misma. Este tiempo depende de la planificacin del producto del Ingenio Risaralda; la levadura puede durar hasta 2 meses seguidos produciendo alcohol efectivamente. 6.1.1 Tanque de alimentacin (T-124) La acidez voltil en este tanque es muy variable, todo depende del tipo de caa que entra a molinos, del tiempo de permanencia en patios, de las condiciones climticas, de la utilizacin de madurantes, etc. Lo ideal es que sta variable est siempre menor de 2500ppm para que no afecte el proceso de fermentacin. En la tabla 13 se puede observar la acidez voltil total en trminos de cido actico que suministra la materia prima del Ingenio Risaralda al proceso de fermentacin desde el inicio hasta el final del cultivo que en este caso fueron 20 das. Tabla 13. Resultados de la Acidez voltil en la materia prima Da 1 2 3 4 5 6 7 AV (ppm) 3735.3 2176.54 2788.09 2804.28 3186.03 2502.21 1861.01 PROMEDIO DESVIACIN ESTNDAR LMITE DE ACCIN SUPERIOR LMITE DE ALERTA SUPERIOR Da 8 9 10 11 12 13 14 AV (ppm) 2192.83 2192.83 2094.82 2136.47 2355.23 1767.91 2676.24 Da 15 16 17 18 19 20 AV (ppm) 2379.01 2496.71 3547.71 2628.68 2479.47 2380.76

2548.9 504.86 3558.63 4063.49

59

Grafico 1. Curva de control acidez voltil en la materia prima

4500 4000 3500

Acidez Voltil (ppm)

3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 5 10 15 20 25

Tiempo (das)

En el grfico 1 el lmite de accin corresponde al promedio 2 veces la desviacin estndar y el lmite de alerta 3 veces la desviacin estndar. En l se observa que la acidez voltil en la materia prima en ocasiones pasa el lmite de accin incrementado la concentracin de cidos voltiles en el proceso de fermentacin y posiblemente afectando la productividad del proceso pero en este caso todava se puede controlar con la adicin de antibitico y disminucin del pH. Si pasa el lmite de alerta este material no se debe de ingresar porque podra afectar el proceso gravemente. En el primer da se tiene una alta concentracin de AVT 1 debido a que en el arranque solo se utiliza Miel de segunda extraccin para la alimentacin pues es el nico material que se puede dejar almacenado y as iniciar la propagacin al mismo tiempo con la fbrica de azcar. En los das siguientes ya se alimenta con una mezcla de miel segunda y jugo clarificado bajando la concentracin de estos cidos orgnicos. En el grfico 1 tambin se puede observar que el valor de la desviacin estndar es alto debido a que son muchos los factores que influyen sobre ste parmetro tales como tipo de caa que entra a molinos, del tiempo de permanencia en patios, de las condiciones climticas, entre otros y que finalmente el proceso de fermentacin debe resistir, por tal razn en el rea de fermentacin cuando el incremento de la acidez voltil es muy alto utilizan antibiticos para contrarrestar la contaminacin que est entrando en la materia prima y evitar que se incremente la acidez voltil asociada a esta contaminacin.
1

AVT: Acidez voltil total

60

6.1.2 Fermentadores R311 y R312 Debido a que estos dos tanques presentan condiciones anaerbicas similares se observa un igual comportamiento de la acidez voltil. A medida que transcurre el tiempo la AVT aumenta progresivamente. El objetivo central en los fermentadores es mantener un porcentaje de alcohol ptimo que no afecte a la levadura pero que s aumente la eficiencia de la planta. Para lograr este objetivo se debe controlar la acidez voltil en estos tanques pues un aumento de sta variable incrementa la presin osmtica generando estrs y mortalidad en la levadura e interrumpe la produccin de alcohol, bajando el rendimiento de la planta. Esto se ve claramente en el grfico 2, cuando la AVT pasa el lmite de accin, el porcentaje de alcohol empieza a descender y a medida que aumenta y pasa el lmite de alerta el descenso es mucho ms fuerte y muy difcil de recuperar. En este caso es conveniente reforzar los tanques con levadura nueva o iniciar con un cultivo nuevo. Grfico 2. Curvas de control acidez voltil en los fermentadores 1 y 2

4500 4000 3500

9 8 7 % Alcohol mosto 6 5 4 3 2 1 0
0 5 10 15 20 25

Acidez Voltil (ppm)

3000 2500 2000 1500 1000 500 0

R-311 R-312 Lmite de Accin Lmite de Alerta % ALCOHOL

Tiempo (das)

61

Tabla 14. Resultados de la Acidez Voltil de los fermentadores vs porcentaje de alcohol en el mosto fermentado Tiempo (Das) 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 PROMEDIO DES. ESTNDAR LMITE DE ACCIN LMITE DE ALERTA AV R-311 (ppm) 369.45 520.89 549.48 981.26 1784.72 2387.65 2666.44 2579.86 2410.85 2652.89 2648.29 2805.5 2794.69 3125.28 3375.85 3399.94 3363.13 3552.63 2044.63 1205.14 3000 3500 AV R-312 (ppm) 337.74 549.43 570.58 996.49 1731.07 2502.06 2918.78 2794.2 2775.15 2862.45 2761.42 2941.52 3113.53 3125.86 3344.68 3508.93 3874.93 3541.99 2136.26 1310.87 3000 3500 Alcohol mosto (%v/v) 7.07 8.10 8.17 7.93 7.90 7.70 7.50 7.20 7.40 7.60 7.60 7.47 7.55 7.53 7.15 7.07 6.73 6.33 7.44 0.47 NA NA

La acidez voltil es una medida indirecta de la contaminacin por lo tanto se podra hacer una comparacin con la curva de crecimiento de los microorganismos (figura 6). En el grfico 2 se observa que los cinco primeros das las bacterias estn adaptndose al medio, se encuentran inactivas y de all en adelante se activan e inician su metabolismo consumiendo azcares para generar cidos voltiles, poco a poco estos cidos se van acumulando en el medio hasta que llegan a un punto que es perjudicial para la levadura alrededor de 3500ppm afectando la produccin de alcohol. 6.1.3 Tanque Activacin de levadura R-305 Como su nombre lo indica el objetivo de este tanque es activar nuevamente la levadura despus de haber realizado su trabajo en los fermentadores, debido a que en la destilera del Ingenio Risaralda se recircula levadura. Es un sistema aerbico, se suministra aire y nutrientes para garantizar su reproduccin y eliminar su estrs. En este medio tambin hay presencia

62

bacteriana; la acidez voltil tambin aumenta a medida que pasa el tiempo. En este tanque es donde se adiciona la mayor concentracin de antibiticos ya que las bacterias tienden a reproducirse a mayor velocidad en estas condiciones. En la tabla 15 se pueden observar los resultados de acidez voltil de un cultivo que se mantuvo a un pH de 4.3 y otro cultivo a pH 3.5. Este cambio de pH se realiz con el fin de disminuir la poblacin bacteriana y as controlar la acidez voltil en este tanque. La levadura es capaz de soportar pHs bajos alrededor de 2.5 al contrario las bacterias no lo soportan y mueren. Tabla 15. Resultados de la Acidez voltil del tanque de activacin de levadura a diferentes pH Tiempo (Das) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 PROMEDIO DES. ESTNDAR LMITE DE CONTROL LMITE DE ACCIN LMITE DE ALERTA AV R-305 a pH 4.3 (ppm) 241.63 278.93 363.38 217.64 286.02 403.42 888.68 1319.22 1728.64 1629.31 1819.73 1885.56 2001.47 1783.24 1797.76 1731.96 1940.37 1952.93 2104.05 2315.24 2305.52 1380.70 763.74 2000 2500 3000 AV R-305 a pH 3.5 (ppm) 263.14 223.39 286.56 314.45 666.07 1323.00 1843.51 2496.01 2454.85 2105.52 2037.22 2381.69 2026.55 1769.23 1652.11 1991.84 2279.93 1964.16 2068.43 1702.77 2437.68 1632.77 791.53 2000 2500 3000

63

Grafico 3. Acidez voltil total en el tanque de activacin de levadura

3500 3000

Acidez Voltil (ppm)

2500 2000 1500 1000 Cultivo a pH 4.3 Cultivo a pH 3.5 Lmite de accin Lmite de alerta Lmite de control

500 0 0 5 10 15 20 25

Tiempo (das)

Del grfico 3 se puede decir que tanto el cultivo a pH 4.3 como el de pH 3.5 tienen comportamientos similares. En los primeros das los cidos orgnicos van aumentando su concentracin progresivamente hasta que se llega a una concentracin mxima en e da 13 y de all empieza a oscilar. Esta oscilacin es debida a la materia prima que entra, a la adicin de antibitico, a la contaminacin que se genera en el medio y a la cantidad de vinaza y levadura recirculada. 6.1.4 Vinaza Recirculada T-403 La vinaza es otra entrada al proceso de fermentacin, el mosto fermentado del T-335 entra a la columna mostera C-401 (Columna de destilacin) y all es destilado separndose el alcohol de los dems componentes, lo que queda en el fondo de esta columna es vinaza entre 5 a 10 Brix, de all se enva al tanque flash T-403 donde ocurre una evaporacin quedando de 13 a 16 Brix. Se enfra por medio de un intercambiador de calor y una parte se recircula en fermentacin y la otra parte se enva al flubex (Equipo para concentrar la vinaza) donde se concentra mucho ms para ser utilizado en compostaje. Dependiendo de la acidez voltil que tengan los fermentadores se recircula o no vinaza ya que sta es una fuente grande de cidos voltiles. Despus de 3500 ppm de AVT en los fermentadores se disminuye la recirculacin de vinaza, comnmente ste porcentaje se maneja en 50% del total de vinaza producida en destilacin. Si se observa que la concentracin de estos cidos aumenta a gran velocidad se disminuye del todo la recirculacin de vinaza y se enva a compostaje.

64

Grfico 4. Comportamiento de la AVT de la vinaza recirculada en el proceso de fermentacin

5000 4500 4000 AV Vinaza AV R-311 70 Lmite de control % Recirculacin vinaza Lineal (Lmite de control)

60 50 40 30 20 10
500 0 0 5 10 15 20 25

Acidez Voltil (ppm)

3500 3000 2500 2000 1500 1000

0 Tiempo (das)

Tabla 16. Datos de acidez voltil y porcentaje de recirculacin de vinaza Tiempo (Das) 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 PROMEDIO DES. ESTNDAR LMITE DE CONTROL AV Vinaza (ppm) 307.61 396.17 549.68 1199.74 1696.87 2720.83 3415.83 3956.38 3844.91 3330.69 3600.61 3319.44 3690.59 3830.07 3615.47 43338.3 4077.96 4264.94 2897.56 1400.26 3500 % Recirculacin de vinaza 19 35 40 54 61 61 47 56 56 56 60 55 56 47 51 54 50 24 NA NA NA

65

% Recirculacin de vinaza

En la grfica 4 se puede observar el comportamiento de AVT de la vinaza y del fermentador R-311 (Tabla 14) como tambin el porcentaje de recirculacin de vinaza que se enva al rea de fermentacin. Se puede observar que a medida que pasa el tiempo el porcentaje de recirculacin aumenta al igual que la acidez. El porcentaje mximo que se ha manjado es 61%. Debido a que la vinaza sufre un proceso de evaporacin antes de entrar nuevamente a los fermentadores la acumulacin de cidos orgnicos es mucho mayor que en los fermentadores. Por tal razn se debe tener un control en el porcentaje de recirculacin en caso que la acidez en los fermentadores aumente porque es una fuente rica en cidos voltiles. 6.2 ANLISIS POR CROMATOGRAFA DE GASES 6.2.1 Condiciones cromatogrficas ptimas Como principal referencia bibliogrfica para la cuantificacin de los cidos voltiles por cromatografa de gases tenamos el mtodo G-2 del manual de anlisis de la industria Praj (Determinacin de cidos voltiles en materias primas o mosto fermentado por el mtodo de cromatografa de gases). En ste mtodo utilizan un cromatgrafo de gas Hewlett Packard serie 5890 equipado con detector de ionizacin de llama y mdulo qumico Alltech Allchrome y una columna capilar de silica fundida BP 21, SGE de 25mm x 0.5mm de dimetro y 0.5 micras de espesor. (6) Debido a que el Ingenio Risaralda tiene un cromatgrafo de gas y una columna capilar diferente lo primero que se realiz fue investigar que condiciones eran las ms apropiadas en este nuevo equipo. Con un patrn que contena una mezcla de los seis cidos disueltos en etanol se evalu las condiciones de operacin dadas por el mtodo de Praj como son la temperatura del inyector, del horno y del detector, el flujo de gas de arrastre y el tipo de gas. Figura 31. Cromatograma de un estndar con los seis cidos en etanol

66

En el cromatograma que se presenta en la figura 31 se ve claramente siete picos que corresponde a los seis cidos y al solvente que en este caso era etanol. Se identific cada pico con su respectivo tiempo de retencin y se realiz la curva de calibracin con estas condiciones cromatogrficas obtenidas. El primer pico que corresponde al etanol interfiere con el pico del cido actico. No se muestra buena separacin adems los dems picos quedan muy cerca de los otros. Con el tratamiento de las muestras problemas se tuvo dificultades. De acuerdo a la preparacin de la muestra que indica ste mtodo G-2 se tomaba 5ml del destilado de los cidos orgnicos que se obtienen en el procedimiento de la figura 13 y se afora en un baln de 10mL con etanol. De all se toma en un vial 1.5mL y se inyecta en el cromatgrafo. Esto implicaba el ingreso de agua a la columna. Con este tratamiento de muestra se empez a obtener cromatogramas del tipo que se presentan en la figura 32, donde la separacin no era bien definida y se observa que la presencia del agua en la columna presenta interferencia en la resolucin de los picos y las colas que se generan en algunos picos afectan la integracin y cuantificacin de los cidos. Figura 32. Cromatograma de una muestra problema diluida en etanol

No siendo aplicable sta tcnica en el Ingenio Risaralda se acudi a expertos en el tema como es el director del Laboratorio de Calidad de Productos Naturales de la Universidad Tecnolgica de Pereira Jos Hiplito Isaza Martnez Ph.D. y se le plante el problema. De all lo ms importante era mejorar el tratamiento de la muestra debido a que nuestra columna no tolera el agua. Se pens en una extraccin lquido-lquido de los cidos con un solvente orgnico que no interfiriera en la separacin; el ms adecuado y que estaba a nuestro alcance era el diclorometano. Los cidos quedan en la fase orgnica y se elimina por completo el

67

agua. Ya con este nuevo tratamiento de muestra se evaluaron nuevamente las condiciones de operacin y se crearon nuevas curvas de calibracin. Los detalles y resultados de este estudio se presentan en los numerales siguientes. 6.2.2 Identificacin Para determinar el tiempo de retencin de cada cido se prepar un patrn de 500ppm por cada uno, utilizando como solvente diclorometano y se inyect por separado; con el cromatograma de cada cido se pudo esclarecer el tiempo de retencin de los cidos en estudio. Posteriormente para tener mayor seguridad en estos tiempos de retencin se prepar un patrn con la mezcla de los seis cidos y se inyect varias veces, en cada inyeccin que se realizaba se enriqueca un cido diferente por lo tanto el rea del pico del cido enriquecido aumentaba y con esto aseguramos que realmente este era el cido que estaba a prueba. En la tabla 17 se observa el tiempo de retencin encontrado de cada cido utilizando como solvente diclorometano y en la figura 33 se observa el cromatograma del patrn que contena la mezcla de cidos bajo las condiciones cromatogrficas indicadas en el numeral 4.5.2.2. En l se ve claramente que los primeros picos que corresponden al diclorometano no interfieren para nada con los picos de inters, adems hay buena separacin entre ellos mismos. Tabla 17. Tiempo de retencin de los cidos orgnicos por cromatografa de gases TIEMPOS DE CIDOS VOLTILES RETENCIN (min) Acido Actico 3.918 cido Propinico 6.175 cido Isobutrico 7.221 cido Butrico 7.750 cido Isovalrico 8.551 cido Valrico 9.274 Figura 33. Cromatograma de un estndar con los seis cidos en diclorometano

68

6.2.3 Curva de calibracin Bajo las condiciones cromatogrficas descritas en el numeral 4.5.2.2 y con los patrones preparados de acuerdo al numeral 4.5.2.3 se obtuvo seis curvas de calibracin correspondientes a cada cido. En la figura 34 se observan las diferentes curvas que se utilizaron en la cuantificacin de los cidos voltiles obtenidas directamente del cromatgrafo con su respectivo coeficiente de correlacin. Figura 34. Curvas de calibracin de los cidos voltiles en estudio

69

70

71

6.2.4 Cuantificacin de los cidos voltiles en el proceso de fermentacin 6.2.4.1 Tanque de alimentacin (T-124) En la figura 35 se observa un cromatograma correspondiente a una de las muestras que se analizaron, en el cual se puede identificar cuatro de los cidos en estudio y otros compuestos desconocidos para nosotros que generaron las bacterias en el transcurso del proceso de produccin de azcar. Figura 35. Cromatograma de una muestra en estudio del T-124

Durante el tiempo de desarrollo del cultivo (20 das) se estudi el comportamiento de cada cido en la materia prima que ingresaba al rea de fermentacin. En la tabla 18 se puede visualizar la concentracin de cada cido durante el tiempo de produccin y en el grfico 5 se ilustra claramente el comportamiento de cada cido durante el tiempo de desarrollo del cultivo. De acuerdo al grfico 5 el cido que se presenta en mayor concentracin en la materia prima es el actico el cual a partir del cuarto da entra a hacer parte de la acidez voltil total. Los cidos butrico e isovalrico se encuentran en menor concentracin desde el primer da de la alimentacin y siempre estn presentes, hacen parte de ella. El propinico, isobutrico y valrico no son constantes, aparecen los das en que la contaminacin en la materia prima es alta, cuando se ha tenido problemas en la fbrica de azcar o se alimenta solo con miel de segunda extraccin.

72

Tabla 18. Concentracin de cada cido voltil en la materia prima comparado con la acidez total obtenida por titulacin
Tiempo (Das) Actico (ppm) Propinico (ppm) Isobutrico (ppm) Butrico (ppm) Isovalrico (ppm) Valrico (ppm) AV x CG (ppm) AVT (ppm) % AV x CG

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 X

ND ND ND 1296.62 1207.16 1143.85 1005.23 1204.56 1148.48 ND 1289.45 1008.19 1201.64 1200.41 1104.06 1345.89 1298.97 1004.57 1245.63 1354.85 1179,8

ND 106.98 ND ND ND ND 98.45 ND 75.69 ND 104.12 ND 124.93 ND ND 54.32 53.41 ND 57.49 104.79 86,7

456.08 ND ND ND ND ND ND 425.78 256.45 ND 432.83 256.89 231.76 ND ND ND ND ND ND ND 278,5

196.94 217.85 200.18 203.09 187.82 201.35 189.75 200.58 178.93 196.45 213.76 198.45 206.95 216.62 159.37 162.41 160.43 65.78 159.47 145.89 189,1

62.96 77.47 57.22 66.82 61.42 59.63 60.12 63.47 52.41 55.61 62.41 64.23 57.46 62.48 86.53 78.32 80.23 79.16 82.15 84.56 67,7

86.15 86.60 ND 87.84 87.69 ND 75.42 ND 89.62 ND 78.32 ND ND 88.39 ND 81.42 78.48 35.46 76.34 ND 80,1

802.13 488.23 257.40 1654.37 1544.09 1404.83 1428.97 1894.39 1801.58 252.06 2180.89 1527.76 1822.74 1567.9 1349.96 1722.36 1671.52 1184.97 1621.08 1690.09 1430,3

2103.50 1883.48 1719.35 2050.27 2376.75 2147.39 2348.68 2227.70 2541.29 1768.18 3318.90 2421.15 3029.87 2299.41 2074.26 2577.68 2585.0 1902.14 2518.09 2797.19 2334,5

38 26 15 81 65 65 60 85 70 70 54 63 60 68 66 66 64 67 64 60 60.7

ND: No detectable

Grafico 5. Comportamiento de cada cido voltil en la materia prima durante el tiempo de desarrollo del cultivo
A c e tic o Pr o p i n ic o 1 2 0 0 ,0 0 Is o b u tr ic o B u tr ic o 1 0 0 0 ,0 0 A c id e z V o l t il ( p p m ) Is o v a l r ic o V a l r ic o 8 0 0 ,0 0

6 0 0 ,0 0

4 0 0 ,0 0

2 0 0 ,0 0

0 ,0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 T ie m p o ( d a s )

73

Comparando la acidez voltil determinada por cromatografa de gases y la obtenida por titulacin se tiene que sta primera es el 61% de la acidez total. El resto de porcentaje es debido a la presencia de otros cidos como el lctico, succnico, mlico y dems que no se pueden determinar por CG debido a que se descomponen a altas temperaturas por lo tanto se deben determinar por HPLC. 6.2.4.2 Fermentador R-311 La figura 36 ilustra un cromatograma de una de las muestras del fermentador R-311 en estudio y donde se refleja la presencia de cinco de los cidos y otros compuestos desconocidos generados por las bacterias que entraron con la materia prima y las que han crecido durante el transcurso del cultivo. En la tabla 19 se encuentran las concentraciones de cada cido comparada con la obtenida por titulacin de una muestra puntual cada 24 horas. Figura 36. Cromatograma de una muestra en estudio del fermentador R-311

De acuerdo a lo que se observa en el grfico 6 en el fermentador R-311 el cido actico es el de mayor concentracin y slo a partir del sexto da se detecta en el tanque y el da noveno es donde tiene su mxima concentracin debido a que este da la contaminacin est alta. Los cidos isobutrico, butrico e isovalrico se encuentran desde el primer da de cultivo como se pudo ver en el numeral anterior, vienen desde la materia prima. El isobutrico a travs del tiempo va aumentado su concentracin y en el noveno da tambin llega a su concentracin mxima y de all en adelante permanece constante. El butrico y el isovalrico estn en concentraciones bajas todo el tiempo. El valrico aparece en el segundo da y tambin se mantiene durante todo el proceso en concentraciones bajas. El cido propinico no se detecta en este fermentador ningn da.

74

Tabla 19. Concentracin de cada cido voltil en el fermentador R-311

Tiempo (Das) Actico (ppm) Isobutrico (ppm) Butrico (ppm) Isovalrico (ppm) Valrico (ppm) AV x CG (ppm) AVT (ppm) % AV x CG

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 X

ND ND ND ND ND 938,46 1325,87 1568,49 1945,62 1589,47 1623,41 1745,69 1645,23 1423,89 1548,96 1532,45 1623,78 1685,45 1703,54 1756,55 1577,1

96,25 102,6 118,8 121,45 190,45 241,36 354,12 362,15 478,26 450,12 462,13 471,23 431,56 398,78 401,23 399,45 415,26 416,89 422,33 425,12 338,0

72,59 71,96 89,41 89,36 90,45 91,58 102,45 114,89 184,26 132,45 152,45 162,54 150,32 164,25 154,26 160,45 163,45 162,78 166,23 174,56 132,5

53,21 56,26 55,22 60,77 70,13 70,02 95,63 104,56 120,36 118,65 120,49 174,26 170,78 167,62 171,48 167,96 170,45 169,21 172,45 173,21 123,1

ND 66,39 91,57 93,31 98,9 97,62 98,47 113,28 145,36 139,45 140,23 120,45 119,45 102,56 122,96 118,42 123,48 122,66 125,45 128,49 114,1

222,05 297,21 355,00 364,89 449,93 1439,04 1976,54 2263,37 2873,86 2430,14 2498,71 2674,17 2517,34 2257,10 2398,89 2378,73 2496,42 2556,99 2590,00 2657,93 1884,9

295.87 294.99 373.5 348.88 619.25 1638.62 3461.76 4143.12 5066.90 3436.92 4058.04 4577.76 4125.63 3965.41 4235.78 4159.89 4352.16 4617.85 4812.62 4956.13 3162.2

75 100 95 104 72 87 62 54 56 70 61 58 61 56 56 57 57 55 53 53 67

ND: No Detectable

Grafico 6. Comportamiento de cada cido voltil en el fermentador R-311 durante el tiempo de desarrollo del cultivo
2500

A c ti c o Is o b u tr i c o B u tr i c o Is o v a l r i c o V a l ric o

2000

1500

A c id e z V o l t il ( p p m )

1000

500

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

T ie m p o ( d a s )

75

Realizando el comparativo con la acidez voltil total (tabla 19), la acidez voltil determinada por cromatografa de gases es el 67% de la total, como se explic en el numeral anterior por la presencia de otros cidos que no se pueden determinar por Cromatografa de Gases y que si afectan la acidez. 6.2.4.3 Fermentador R-312 En la figura 37 se muestra un cromatograma de una muestra tomada al fermentador R-312 y en donde se visualiza los seis cidos voltiles. Aqu ya se detecta el cido propinico en bajas concentraciones, con la presencia de ste cido se puede decir que en este fermentador existe una poblacin microbiana diferente a la que se encuentra en el fermentador R-311, se han generado otros tipos de bacterias que en su metabolismo producen cido propinico. En la tabla 20 se encuentran las concentraciones de cada cido comparada con la de acidez voltil titulable. Figura 37. Cromatograma de una muestra en estudio del fermentador R-312

En este fermentador se observa una concentracin mayor de cidos voltiles, el actico, propincio e isobutrico se incrementaron las bacterias que venan del fermentadorr R-311 seguan all y quizs muchas ms, al contrario el butrico e isovalrico disminuyeron, posiblemente las bacterias que estaban presentes en este tanque lo producan en menor cantidad y como el proceso es continuo entra y sale mosto fermentado la concentracin de estos dos cidos disminuy. Adems ste tanque recibe menor cantidad de materia prima y vinaza en comparacin con el R-311. Realizando el comparativo con la acidez voltil titulable, con ste anlisis cromatogrfico en este tanque se pudo determinar el 71% del total de la acidez.

76

Tabla 20. Concentracin de cada cido voltil en el fermentador R-312

Tiempo (Das) Actico (ppm) Propinico (ppm) Isobutrico (ppm) Butrico (ppm) Isovalrico (ppm) Valrico (ppm) AV x CG (ppm) AVT (ppm) % AV x CG

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 X

ND ND ND ND ND ND 1142.54 1452.36 1789.46 1856.12 1845.32 1778.96 1802.44 1800.14 1845.00 1799.14 1785.42 1790.63 1798.56 1752.32

ND ND ND ND ND ND 52.63 50.18 52.69 52.79 53.78 57.46 59.12 55.23 56.41 54.96 53.14 54.66 54.87 53.46

ND ND 306.41 316.09 298.32 297.80 301.42 302.45 378.41 389.56 380.49 380.41 382.45 379.55 380.46 388.66 380.46 385.71 374.00 368.94

ND ND 35.12 49.27 72.58 79.75 81.56 83.47 90.25 96.13 95.47 93.66 94.78 93.78 94.25 92.41 90.87 91.58 93.46 93.48

ND ND 40.13 42.55 57.78 61.51 63.24 65.23 70.49 73.41 73.42 70.44 72.11 71.64 72.05 71.89 73.46 72.48 74.28 73.45

ND ND ND ND 93.52 90.55 91.25 96.45 104.23 106.79 103.78 98.83 100.49 99.23 103.20 101.25 100.88 104.69 106.48 104.29

1731.3

54.4

355.1

84.5

66.6

100.4

ND ND 381.66 407.91 522.20 529.61 1732.64 2050.14 2485.53 2574.80 2552.26 2479.76 2511.39 2499.57 2551.37 2508.31 2484.23 2499.75 2501.65 2445.94 1984.4

ND ND 305.19 310.29 356.65 579.33 2265.85 3728.81 4963.03 5330.66 4893.56 4293.85 4997.00 4523.15 4612.30 4378.96 4213.58 4412.57 4432.56 4215.89 3489.6

ND ND 125.1 131.5 146.4 91.4 76.5 55.0 50.1 48.3 52.2 57.8 50.3 55.3 55.3 57.3 59.0 56.7 56.4 58.0 71

ND: No Detectable

Grafico 7. Comportamiento de cada cido voltil en el fermentador R-312 durante el tiempo de desarrollo del cultivo
2000.00 1800.00 1600.00

Actico Isobutrico Butrico Isovalrico Valrico Propinico

Acidez Voltil (ppm)

1400.00 1200.00 1000.00 800.00 600.00 400.00 200.00 0.00 1 2

10 11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

Tiempo (das)

En el grfico 7 se ilustra el comportamiento de cada cido durante el tiempo de cultivo. Cada 24 horas se tomaba una muestra y se analizaba cromatogrficamente. El da 7 se empieza a detectar el cido actico y el da 10 tiene su mxima concentracin, de all en adelante se puede decir que la concentracin del cido actico se mantiene constante. A partir del da 7 se

77

observa la presencia de los seis cidos voltiles en estudio. Los cidos isobutrico, butrico e isovalrico se presentan todo el tiempo del cultivo, el isobutrico en mayor concentracin que los otros dos. El cido actico sigue siendo el principal y lo sigue el isobutrico. 6.2.4.4 Tanque de Activacin de Levadura R-305 De igual manera se estudi el comportamiento de los cidos voltiles en el tanque de activacin de levadura dando resultados muy similares a los del fermentador R-311 en donde no se detecta el cido propinico. En la figura 38 se visualiza un cromatograma de una de las muestras problemas (Da sexto) en donde se identifican cuatro de los cidos en estudio y otros componentes desconocidos que se producen en el proceso de fermentacin aerbica. La investigacin de estos componentes incgnitas queda como continuacin de este trabajo. En los tiempos de retencin de 3.4 y 5.1 min aproximadamente se tienen dos compuestos desconocidos que sera muy interesante saber de que sustancias se tratan. Los dos primeros picos corresponden al diclorometano. Figura 38. Cromatograma de una muestra en estudio del tanque R-305

En la tabla 21 se observan cada una de las concentraciones en ppm de los cidos encontrados en el tanque de activacin de levadura y se realiza un comparativo con la acidez voltil titulable dando como resultado que por cromatografa de gases se determina el 68% de la acidez total de la muestra. Los dems componentes que influyen en este parmetro se deben determinar por otro mtodo, uno de estos mtodos puede ser cromatografa lquida.

78

Tabla 21. Concentracin de cada cido voltil en el tanque R-305

Tiempo (Das) Actico (ppm) Isobutrico (ppm) Butrico (ppm) Isovalrico (ppm) Valrico (ppm) AV x CG (ppm) AVT (ppm) % AV x CG

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 X

ND ND ND 442,85 1012,45 1145,87 1541,22 1847,12 1745,68 1789,25 1800,14 1865,32 1825,44 1832,63 1844,69 1839,23 1842,99 1887,66 1879,31

1633,9

96,74 98,42 102,38 92,41 192,31 201,65 250,41 384,31 231,69 301,46 299,45 312,46 305,48 312,55 320,13 319,63 325,68 330,44 329,13 253,0

65,41 60,41 70,30 75,23 99,20 104,56 120,65 284,65 152,12 220,13 231,21 230,41 224,63 236,45 229,22 231,46 233,13 245,88 250,47 177,1

40,21 38,47 52,22 43,48 83,94 97,66 110,32 243,96 120,11 160,47 165,74 170,42 169,33 163,79 165,84 166,45 169,47 170,62 173,48 131,9

ND ND ND ND ND 79,44 115,48 132,88 81,20 114,56 120,66 118,47 122,78 130,47 135,42 133,11 132,39 131,53 136,98 120,4

202 197 224 653 1387 1629 2138 2892 2330 2585 2617 2697 2647 2675 2695 2689 2703 2766 2769 2026,6

267,26 221,57 303,64 570,68 1722,45 2978,25 3092,32 4692,06 4343,77 4030,04 4136,59 4523,15 4289,47 4347,23 4412,57 4315,98 4332,14 4526,35 4478,55 3241,3

75,7 89,0 74,1 114,6 80,6 54,7 69,1 61,7 53,7 64,2 63,3 59,6 61,7 61,6 61,1 62,3 62,4 61,1 61,8 68,0

ND: No Detectable

Grfico 8. Comportamiento de cada cido voltil en el tanque R-305 durante el tiempo de desarrollo del cultivo
2 0 0 0 ,0 0 1 8 0 0 ,0 0 1 6 0 0 ,0 0 1 4 0 0 ,0 0 1 2 0 0 ,0 0

A c ti c o Is o b u tr i c o B u tr i c o Is o v a l r i c o V a l ric o P ro p i n ic o

A c id e z V o l t il ( p p m )

1 0 0 0 ,0 0 8 0 0 ,0 0 6 0 0 ,0 0 4 0 0 ,0 0 2 0 0 ,0 0 0 ,0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

T ie m p o ( d a s )

79

En el grfico 8 se refleja el comportamiento de cada cido, la tendencia que tuvo durante el desarrollo y como en todos los tanque el cido actico es el que predomina luego lo sigue el cido isobutrico, butrico, isovalrico y por ltimo el valrico. El cido propinico no se detecta en este tanque. 6.2.4.5 Vinaza Recirculada T-403 En la figura 39 se visualiza un cromatograma de una muestra en estudio de la vinaza recirculada al proceso de fermentacin en l se puede identificar los primeros picos que corresponden al diclorometano y solo tres de los cidos en estudio como es el isobutrico, butrico e isovalrico. Los dems cidos se eliminan por el choque trmico que tienen en el tanque flash. Un procedimiento similar a ste se le debe hacer a la materia prima antes de entrar a fermentacin para eliminar una gran cantidad de cidos orgnicos que interfieren en el proceso. Figura 39. Cromatograma de una muestra en estudio de la vinaza recirculada

Debido a las altas temperaturas que maneja este tanque los cidos ms voltiles se evaporan, como son el actico, propinico y valrico y los tres que quedan se concentran mucho ms; con las concentraciones que se registran en la tabla 22 se puede analizar ms detenidamente ste punto comparndolo con los dems tanques. Adems la acidez voltil total tambin aumenta comparndola con la acidez del fermentador R-312 que en forma indirecta es la entrada a la columna mostera.

80

Tabla 22. Concentracin de cada cido voltil en la vinaza recirculada del tanque T-403
Tiempo (Das) Isobutrico (ppm) Butrico (ppm) Isovalrico (ppm) AV x CG (ppm) AVT (ppm) % AV x CG

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 X

180.32 189.46 200.94 205.03 620.83 1256.42 1998.66 2465.98 2276.35 2385.13 2146.78 2185.64 2231.08 2204.62 2346.98 2367.59 2413.02 2400.05 1670.8

50.23 50.47 65.48 67.43 79.09 160.48 286.32 315.88 312.95 319.46 305.16 313.23 324.79 322.32 325.48 330.01 298.78 300.46 234.9

81.42 89.46 103.45 98.68 57.68 120.22 246.49 283.02 280.96 291.78 279.46 286.44 296.15 285.55 290.03 292.13 295.64 304.96 221.3

311.97 329.39 369.87 371.14 757.60 1537.12 2531.47 3064.88 2870.26 2996.37 2731.40 2785.31 2852.02 2812.49 2962.49 2989.73 3007.44 3005.47 2127.0

356.78 398.47 437.80 475.30 969.50 2884.60 5318.63 6531.21 5646.59 6220.85 5294.50 5563.42 5742.95 5641.32 5749.89 5896.43 5903.02 5841.30 4159.6

87.4 82.7 84.5 78.1 78.1 53.3 47.6 46.9 50.8 48.2 51.6 50.1 49.7 49.9 51.5 50.7 50.9 51.5 59.1

Analizando el porcentaje de cidos voltiles determinados por Cromatografa de Gases con relacin a la acidez total ste es menor que el de los dems tanques en un 59%, este hecho posiblemente es debido a que los otros cidos que no se pueden determinar por sta tcnica y se concentran mucho ms afectando en mayor grado la AVT. Grfico 9. Comportamiento de cada cido voltil en la vinaza recirculada durante el tiempo de desarrollo del cultivo
3000.00

Actico Is obutrico Butrico Is ovalrico Valrico Propinico

2500.00

Acidez Voltil (ppm)

2000.00

1500.00

1000.00

500.00

0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Tiempo (das)

81

En el grfico 9 se visualiza ms claramente la tendencia de cada cido con el transcurso del tiempo. El cido isobutrico es el que predomina en este caso, lo sigue el butrico y por ltimo el isovalrico. Los otros tres cidos en estudio no se detectan. 6.2.5 Anlisis Microbiolgicos A cada uno de los puntos de muestreo se les realiz recuento en placa tanto para bacterias mesfilas como para lcticas. La muestra fue puntual y tomada como se indica en el numeral 4.3.2 y analizada inmediatamente llevada al laboratorio. Las bacterias en mosto fermentado son selectivamente cultivadas con la adicin de Actidione (ciclohexamida) que inhibe el crecimiento de las clulas de levadura. El conteo de bacterias es determinado por cultivo sobre agar Plate Count solidificado en placa, de una cantidad determinada de diluciones de mosto fermentado (preparadas con agua destilada). En una incubacin adecuada de la placa, las clulas de bacterias sobre la placa generan la formacin de colonias y las clulas son expresadas como unidades formadoras de colonia UFC. Cada colonia representa una clula de bacteria individual. El conteo total de bacterias en el mosto fermentado est representado por el nmero total de colonias multiplicado por el factor de dilucin. (6) Las bacterias cido lcticas se presentan naturalmente en las materias primas y mosto fermentado que entran y estn en el proceso de fermentacin. Las condiciones del medio durante la fermentacin son ideales para el crecimiento y multiplicacin de estas bacterias. Su presencia causa prdidas de azcares y formacin de cidos. Esto afecta la eficiencia total y los rendimientos. (6) Sin embargo, un medio selectivo llamado Lactobacillus MRS es usado para el cultivo y aislamiento del lactobacilo. El medio de cultivo MRS contiene polisorbato, acetato, magnesio y manganeso, los cuales se sabe que actan como factores especiales para el crecimiento del lactobacilo, tambin como una rica base nutricional. Con el fin de conocer que relacin se tiene entre la acidez voltil total y el recuento en placa para mesfilas y lcticas se realiz un seguimiento a cada tanque en estudio y se compar con la acidez voltil titulable y los resultados se reflejan en los siguientes grficos. En la tabla 23 se presentan las UFC/mL de cada tanque durante el tiempo de desarrollo de cultivo.

82

Tabla 23. Recuento en placa de bacterias mesfilas y lcticas en el proceso de fermentacin

Tiempo (das) 3 6 10 13 18 20 T-124 Mesfilas 8.00E+01 1.28E+03 2.88E+03 1.30E+03 4.90E+02 5.50E+03 Lcticas 8.00E+01 6.80E+02 5.60E+03 8.30E+03 1.01E+03 7.30E+03 R-305 Mesfilas 1.00E+06 1.40E+08 5.80E+07 4.90E+07 1.47E+07 9.40E+07 Lcticas 1.00E+06 6.50E+08 6.10E+07 4.80E+07 1.17E+08 7.80E+07 R-311 Mesfilas 1.00E+06 3.00E+08 1.13E+08 4.30E+07 3.70E+07 1.20E+08 Lcticas 1.00E+06 9.90E+06 1.20E+08 3.80E+07 1.44E+08 8.10E+07 R-312 Mesfilas Lcticas Vinaza Mesfilas Lcticas 1.00E+02 8.00E+02 3.70E+03 3.00E+04 8.00E+04 4.00E+03

1.00E+06 1.00E+06 1.00E+02 1.01E+09 4.12E+09 8.00E+02 1.42E+09 2.84E+09 1.04E+04 3.70E+08 7.70E+08 3.00E+04 4.30E+08 9.60E+08 8.00E+04 5.60E+08 7.88E+08 6.20E+03

Grfico 10. Recuento en placa de mesfilas y lcticas con respecto a la acidez voltil total en la materia prima (T-124)
Mesofilas Lacticas AVT 3000 2500 AVT ppm 2000 1500

1.00E+04 8.00E+03
UFC/mL

6.00E+03 4.00E+03 2.00E+03 0.00E+00 3 6 10 13 18 20

Tiempo (das)

1000 500 0

En general la contaminacin bacteriana de mesofilas y lcticas en la materia prima es baja comparada con los dems tanques en estudio. En el tercer da existe una acidez total pero se tiene una baja poblacin de mesfilas y lcticas, sta acidez posiblemente es desarrollada por bacterias gram negativas que no son determinadas en esta investigacin y que puede estar en el medio produciendo cidos orgnicos. Los das siguientes estas bacterias se presentan en mayor proporcin haciendo que la acidez voltil total aumente.

83

Grfico 11. Recuento en placa de mesfilas y lcticas con respecto a la acidez voltil total en el tanque de activacin de levadura (R-305)
Mesfilas Lcticas AVT

7.00E+08 6.00E+08 5.00E+08 UFC/mL 4.00E+08 3.00E+08 2.00E+08 1.00E+08 0.00E+00 3 7 10

3000.00 2500.00 AVT ppm

AVT ppm

2000.00 1500.00 1000.00 500.00 0.00 14 18 20 Tiem po (Das)

Como se pudo ver en el numera 5.2.2.2 a medida que transcurre el tiempo la acidez voltil aumenta pero en los recuentos solo se ve que aumenta considerablemente el sptimo da, los dems das disminuyen aunque la AVT sigue aumentando entonces se podra decir que en el medio existen otros tipos de bacterias (Gram negativas) que producen cidos orgnicos que no son determinadas por sta tcnica. Grfico 12. Recuento en placa de mesfilas y lcticas con respecto a la acidez voltil total en el fermentador R-311
3.50E+08 3.00E+08 2.50E+08

Mesofilas Lacticas AVT

3000 2500 2000 1500

UFC/mL

2.00E+08 1.50E+08 1.00E+08 5.00E+07 0.00E+00

1000 500 0 3 7 10 14 18 20 Tiempo (das)

84

Grfico 13. Recuento en placa de mesfilas y lcticas con respecto a la acidez voltil total en el fermentador R-312
Mesofilas Lacticas AVT

4.50E+09 4.00E+09 3.50E+09 3.00E+09 2.50E+09 2.00E+09 1.50E+09 1.00E+09 5.00E+08 0.00E+00 3 7 10

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 AVT ppm

UFC/mL

14

18

20

Tiempo (das)

En los dos fermentadores se tiene resultados similares a los obtenidos en el tanque de activacin de levadura donde a pesar del aumento de la acidez voltil con el tiempo el recuento es inconstante unos das aumenta y otros disminuye. Esto es debido a que en el proceso utilizan antibiticos para contrarrestar la contaminacin eliminando algunas bacterias de medio pero los cidos no disminuyen se acumulan da a da. Grfico 14. Recuento en placa de mesfilas y lcticas con respecto a la acidez voltil total en la vinaza recirculada (T-403)
Mesofilas Lacticas AVT

9.00E+04 8.00E+04 7.00E+04 UFC/mL 6.00E+04 5.00E+04 4.00E+04 3.00E+04 2.00E+04 1.00E+04 0.00E+00 3 7 10

4000 3500 3000 AVT ppm 2500 2000 1500 1000 500 0

14

18

20

Tiempo (das)

85

En la vinaza recirculada el recuento es menor que en los dos fermentadores y el tanque de activacin de levadura pero un poco ms alta que el de la materia prima. En la grfica 14 se observa una relacin directa entre el recuento de mesfilas y lcticas con la acidez voltil total con el transcurso del tiempo. Al aumentar el recuento aumenta la acidez voltil. El da 20 el recuento disminuye por el efecto del antibitico y por ende la AVT. Debido a que la vinaza pasa por un proceso trmico la contaminacin microbiana disminuye con respecto a la que sale del fermentador R-312 pero en el retorno hacia fermentacin por contacto con la tubera, intercambiador y dems nuevamente se crea contaminacin bacteriana que debe ser controlada para que no afecte el proceso de fermentacin.

86

7. CONCLUSIONES

La Acidez Voltil en el proceso de fermentacin de la planta de alcohol del ingenio Risaralda S.A. depende significativamente del proceso de produccin de azcar, del control que se le realice al material de alimentacin. En el momento no hay un control estricto que garantice la baja contaminacin y concentracin de cidos orgnicos. En caso de algn problema en la fbrica de azcar por contaminacin el proceso fermentativo de inmediato se ve afectado. As que es muy importante tener un tratamiento previo a la materia prima que va hacia fermentacin para mejorar las condiciones iniciales. Con el transcurso de tiempo la acidez voltil en los fermentadores, en el tanque de activacin de levadura y en la vinaza recirculada aumenta exponencialmente, cuando en los fermentadores sobrepasa las 3000 ppm la levadura Sacharomyces cerevecieae se inactiva y la produccin de alcohol empieza a decaer, el rendimiento de la planta disminuye. El cido que se encuentra en mayor concentracin en el proceso de fermentacin es el actico, con excepcin de la vinaza recirculada que por el efecto del calentamiento que tiene en el proceso de destilacin se eliminan varios cidos como es el actico y propinico pero se concentran los de alto peso molecular como son el isobutrico, butrico e isovalrico. El cido propinico es el que se produce en menor cantidad en el proceso de fermentacin, slo se detect en el fermentador R-312 y con concentraciones bajas, alrededor de 54.4ppm. La presencia de los cidos voltiles se observa desde el primer da del cultivo, y con el transcurso del tiempo su concentracin se acumula; en ningn momento la presencia individual de alguno de los cidos en particular afecta la levadura, si no que el efecto se ve cuando la concentracin total aumenta por encima de 3500ppm. La relacin que existe entre el recuento en placa y la acidez voltil total no es directa, en ocasiones las responsables del aumento de la acidez voltil son bacterias gram negativas y con el recuento en placa que se desarroll en ste trabajo solo se observ gram positivas.

87

8. RECOMENDACIONES Una alternativa para mejorar las condiciones iniciales de la materia prima que va hacia fermentacin es disear un sistema de calentamiento donde la mezcla miel y jugo que viene de fbrica de azcar tenga un choque trmico, un flascheo, para que los cidos orgnicos y las bacterias presentes disminuyan y se eliminen respectivamente. Para esto se necesitara un tanque, caldern y un intercambiador de calor y as evitar que la materia prima llegue con temperaturas elevadas a los fermentadores y afecte a la levadura. Es importante llevar un control ms estricto, continuo y con mayor frecuencia a la materia prima antes de entrar al rea de fermentacin para evitar que ingrese material de mala calidad y pueda afectar gravemente el proceso de produccin de alcohol. La limpieza, sanitizacin y desinfeccin adecuada de la planta de produccin de alcohol mediante el uso de detergentes, desinfectantes y agentes antimicrobianos, es un aspecto fundamental para la eliminacin de contaminantes bacterianos. Continuar la cuantificacin de cidos voltiles por tcnicas instrumentales confiables como la cromatografa lquida, con el fin de determinar la concentracin de cidos lctico, mlico y succnico y otros que por cromatografa de gases no se pueden determinar por las altas temperaturas que sta tcnica maneja. Con estos resultados se podra establecer la relacin que existe entre la concentracin del cido lctico y el recuento en placa de bacterias lcticas. Establecer la relacin entre la acidez voltil que se est generando por contaminacin bacteriana y el recuento en placa por medio de un clculo, frmula o balance que permita cuantificar la cantidad de cidos producidos en un sistema de fermentacin continuo y con recirculacin de vinaza.

88

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