EVALUACIN DE UN ADEREZO PROBITICO A BASE DE LACTOSUERO

AUTOR: ING. YOLIMAR BLANCO. TUTOR: MSc. JACOVELIN MORALES.

SAN CARLOS, FEBRERO DE 2011

Universidad Nacional Experimental de los Llanos Occidentales EZEQUIEL ZAMORA Vicerrectorado de Infraestructura y Procesos Industriales Coordinacin de rea de Postgrado Postgrado: Maestra en Ing. Agroindustrial

La Universidad que siembra

EVALUACIN DE UN ADEREZO PROBITICO A BASE DE LACTOSUERO

Requisito parcial para optar al grado de Magister Scientiarum

AUTOR: ING. YOLIMAR BLANCO. C.I.: 13.442.940. TUTOR: MSc. JACOVELIN MORALES.

SAN CARLOS, FEBRERO DE 2011 DESCRIPCIN AMPLIADA DEL OBJETO DE ESTUDIO.

El presente estudio tiene como finalidad, evaluar un producto probitico a base de lactosuero con adicin de aj picante y sal comn, el cual ser una opcin para utilizar el suero que se obtiene en la fabricacin de quesos en el mejoramiento de un producto que actualmente se elabora de forma artesanal y que puede tecnificarse con la adicin de bacterias benficas para el ser humano, comprobado por estudios cientficos recientes sobre las propiedades y la funcionalidad de microorganismos vivos en los alimentos, donde sugieren que los probiticos desempean un importante papel en las funciones inmunitaria, digestiva y respiratoria, y que podran tener un efecto significativo en el alivio de las enfermedades infecciosas entre otras (FAO y OMS, 2006). Lo anterior descrito se conseguir mediante un procedimiento experimental en los laboratorios de la UNELLEZ, caracterizando primeramente de forma fisicoqumica y microbiolgica el lactosuero, crema de leche y ricotta, y de forma microbiolgica el aj picante a utilizar, aplicando las normas COVENIN vigentes en Venezuela, esto con la finalidad de conocer las propiedades y composicin de los derivados lcteos nombrados anteriormente y determinar su influencia en el producto final, as como tambin poder detectar si existiera competencia de microorganismos degenerativos con el probitico utilizado. Se formular el producto variando las concentraciones de aj picante y sal comn, utilizando para ello un diseo experimental completamente aleatorizado con un anlisis factorial de 2 x 3 sobre la base de una mezcla de lactosuero fermentado, crema de leche y ricotta, tomando en cuenta las cantidades a utilizar segn un patrn de elaboracin de suero picante artesanal y la realizacin de una prueba piloto. Luego se estudiar la viabilidad del Lactobacillus casei durante un tiempo estimado de vida til promedio para este tipo de productos, para ello se utilizar medios de cultivos selectivos bajo condiciones anaerbicas con la finalidad de determinar la estabilidad del probitico frente a la concentracin de aj picante y sal comn tras la fermentacin y las caractersticas fisicoqumicas, acidez titulable total y pH en el producto, ensayando la influencia de estos aditivos y elementos

funcionales sobre dichas caractersticas. La comparacin de los resultados se analizar construyendo un ANAVAR con el programa de diseo JMP versin 4.0. Adicionalmente se analizar la aceptabilidad sensorial de las muestras con mejores respuestas mediante el empleo de una escala hednica no estructurada de 20 puntos con un panel de consumidores conformado por 120 personas, aplicando la prueba estadstica de Kruskal- Wallis para el anlisis de los resultados y por ltimo a estas muestras con mejor respuesta sensorial, se caracterizar de forma fisicoqumica y microbiolgicamente.

FORMULACIN DEL PROBLEMA:

A nivel mundial la industria lctea representa uno de los sectores ms importantes de la economa de los pases. Aproximadamente 90% del total de la leche utilizada en la industria quesera es eliminada como lactosuero, el cual est compuesto por agua, lactosa, protenas, minerales (calcio, fsforo, magnesio) y grasa. Segn Almcija (2007), la distribucin de la produccin de lactosuero en el mundo en el ao 2005 fue: Europa 53%, Amrica del Norte y central 28%, Asia 6%, frica 5%, Oceana 4%, Amrica del Sur 4%, anualmente estos porcentajes representan entre 110-115 millones de toneladas mtricas (MTM) de lactosuero que son producidas a nivel mundial a travs de la elaboracin de queso (Briczinski y Roberts, 2002; Revillion et al.; Londoo, 2006), de este valor, el 45% se desechan en ros, lagos y otros centros de aguas residuales, o en el suelo, lo que representa una prdida significativa de nutrientes ocasionando serios problemas de contaminacin (Londoo, 2006). El porcentaje restante es tratado y transformado en varios productos alimenticios, de los cuales cerca del 45% es usado directamente en forma lquida, 30% en polvo, 15% como lactosa y subproductos, y el resto como concentrados de protena de lactosuero (Panesar, Kennedy, Gandhi y Bunko, 2007). La Cmara Venezolana de Industrias Lcteas (CAVILAC), inform, que la produccin de leche en Venezuela, para el ao 2008 fue de 1266 millardos de litros (MMLitros), de los cuales, cerca del 63,1% (798,86 MMLitros) se destin a la elaboracin de quesos, por lo que se supone que la produccin nacional de lactosuero estuvo alrededor de los 718

MMLitros, donde gran parte de ste es utilizado directamente en la alimentacin de cerdos, o en la fertilizacin de pastos al aadirlo al agua de riego y en menor cuanta, es desechado en cuerpos de agua ocasionando problemas de contaminacin al ecosistema Cojedes no escapa de tan lamentable problemtica, a pesar de que la produccin de leche cruda se destina principalmente a la industria procesadora nacional, parte de esta es utilizada en el estado para la elaboracin de quesos artesanales y semi industriales eliminando una cantidad considerable de suero de leche que usualmente es desechado como efluente o bien es utilizado para alimentacin animal. (Alvarado, L. 2010. Com. Personal MAPP). Durante los ltimos aos se ha impulsado diversas alternativas dirigidas a reducir el impacto ambiental ocasionado por la situacin descrita anteriormente y considerando que el lactosuero constituye una fuente importante de pptidos y protenas que est siendo subutilizada, este trabajo tiene como propsito elaborar un producto con caractersticas sensoriales similares al suero picante fabricado artesanalmente en la regin, innovando con la adicin de bacterias que aporten un efecto probitico importante en la ingesta de alimentos diarios y para la salud humana.

IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACIN:

El presente trabajo de investigacin, es de gran importancia, debido a que con ste, se pretende dar valor agregado a un subproducto que actualmente se desecha en cantidades significativas y es altamente contaminante, adems de darle una alternativa a la agroindustria en cuanto a evitar elevados costos en el procesamiento del lactosuero previo a la liberacin al ambiente, logrando as, minimizar emisiones o descargas en las fuentes, reduciendo riesgos para la salud humana y ambiental, y elevando simultneamente la competitividad. Algunas propuestas para la utilizacin de este residuo han sido presentadas, pero las estadsticas indican que la mayor parte del suero se sigue descartando como efluente, lo

cual crea graves problemas ambientales, ya que afecta a la estructura fsica y qumica del suelo, resultando en una disminucin del rendimiento de los cultivos y reduciendo la vida acutica cuando se libera en el agua, debido al agotamiento del oxgeno disuelto por la alta Demanda Biolgica y Bioqumica de ste (30.000 a 50.000 ppm de DBO y 40.000 a 60.000 ppm DQO) (Aider, Halleux y Melnikova, 2009). En la actualidad se utiliza lactosuero en polvo en la fabricacin de alimentos lcteos (helados, yogur, untables), productos crnicos (carnes procesadas, embutidos), panificados (bases para pasteles, galletas, barras nutritivas), productos de confitera (chocolates, coberturas, caramelos) y bebidas (mezclas con cacao, crema para caf, bebidas para deportistas). La produccin de bebidas a base de lactosuero con propiedades probiticas son aceptadas a nivel mundial debido al ya demostrado mejoramiento nutricional que las (endo y exo) enzimas de los microorganismos fermentadores de la lactosa proporcionan al sustrato (Gmez, Gonzlez, Meja y Ramrez, 1999). En este sentido, la importancia de esta investigacin ms que un aporte a la economa de las empresas lcteas del estado entre otros, es proponer una alternativa en busca de solucionar este grave problema ambiental, sumando a esto, es una herramienta excelente para explotar su potencial y posibilidades de innovacin por la reconocida aceptacin de los productos lcteos, en particular, los fermentados que han ayudado a mejorar la salud intestinal, y su aceptacin y popularidad continan en ascenso. Por otra parte este trabajo est enmarcado dentro de las lneas de investigacin de la UNELLEZ 2008-2012 especficamente en los Estudios Biotecnolgicos y Agroecolgica, lo que quiere decir que est basado en las necesidades actuales y est orientado a la solucin de problemas ambientales y de salud. Desde el punto de vista prctico la ejecucin de las medidas propuestas llevar a la solucin del problema descrito y el resultado obtenido podr ser empleado como aporte terico para otras investigaciones

OBJETIVO GENERAL:

Evaluar un aderezo probitico a base de lactosuero.

OBJETIVOS ESPECFICOS:

1. Caracterizar fisicoqumicamente y microbiolgicamente el lactosuero, crema de

leche, ricotta y aj picante a utilizar.

2. Estudiar la viabilidad del Lactobacillus casei y las caractersticas fisicoqumicas,

acidez titulable total y pH, en el producto, ante el empleo de diferentes concentraciones de aj picante y sal comn.
3. Analizar la aceptabilidad sensorial de las muestras con mejores respuestas mediante

el empleo de una escala hednica no estructurada de 20 puntos.

4. Describir las caractersticas fisicoqumicas y microbiolgicas del producto final con

mayor aceptabilidad sensorial.

BASES CONCEPTUALES PRELIMINARES:

Antecedentes de la investigacin: Hasta hace un par de dcadas la produccin de la industria lctea tena como contrapartida un derivado altamente contaminante: el lactosuero, un lquido que se separa de la leche cuando sta se coagula para la obtencin de queso.

Actualmente son muchos los investigadores que han desarrollado diversos trabajos abocados a darle valor a este subproducto de quesera y evitar as que afecte o contamine el medio ambiente cuando es desechado, por citar algunos se tienen: Gmez et al., (1999), Briczinski y Roberts (2002), Revillion et al., (2003), Londoo (2006), Almcija (2007), Panesar et al., (2007), Londoo et al., (2008), Fernandes et al., (2009). Gmez et al.,(1999), presentaron un trabajo donde el propsito fue estandarizar un proceso biotecnolgico, que simultneamente con el control de algunos parmetros de calidad en materia prima, permitiera mejorar las cualidades nutricionales, microbiolgicas y organolpticas del suero de la leche para ofrecerlo al consumidor como una alternativa refrescante y nutritiva, obteniendo como resultados, que las bebidas pueden ser elaboradas con cultivos de microorganismos mesfilos y termfilos y diferentes frutas en cosecha tanto a nivel de laboratorio como a nivel semi industrial, pues no presentaron diferencias significativas en sus caractersticas fisicoqumicas, pH y acidez, ni en sus caractersticas organolpticas a travs del tiempo de almacenamiento y cont con una gran aceptacin sensorial, por su valor nutritivo, su fcil digestibilidad y carcter natural, tanto por la poblacin infantil como por las madres. As mismo, Rodrguez, (2007) present un trabajo de investigacin donde el objetivo principal fue elaborar una bebida fermentada a base de suero cido y leche con el propsito de determinar si la utilizacin de este sub-producto poda generar las caractersticas organolpticas similares al kfir. Para esto, elaboraron cinco formulaciones diferentes a las cuales les realizaron estudios de anlisis proximal, anlisis de cidos orgnicos y compuestos voltiles y anlisis sensorial con el fin de determinar si el suero cido se poda utilizar en la elaboracin de esta bebida. Al final concluy, que si se puede utilizar el suero cido en la elaboracin de una bebida fermentada similar al kfir en una proporcin limitada.

Del mismo modo, Londoo et al.,(2008) elaboraron una bebida fermentada inoculada con Lactobacillus casei usando suero de queso fresco, con el fin de dar una utilizacin ptima al lactosuero e incrementar los efectos benficos de este producto para el consumidor, se plantearon como objetivos especficos el valorar la supervivencia in vitro

del Lactobacillus casei a las mismas condiciones del pH estomacal, evaluar la composicin fisicoqumica de la bebida, calificar la aceptabilidad de la bebida con consumidores potenciales y determinar la viabilidad, dando como resultado que la composicin fsico qumica de la bebida, almacenada a 4C, no tuvo una variacin significativa durante el perodo de 21 das de conservacin, los microorganismos permanecieron viables en la bebida almacenada a 4C, durante los 21 das de vida de anaquel, obteniendo valores superiores a 106 ufcg-1 y tuvo un nivel de aceptacin bueno. Por su parte Colivet et al.,( (2006), compararon el efecto inhibidor de extractos de aj dulce (Capsicum chinense) sobre el crecimiento de Escherichia coli y Bacillus sp. Ellos evaluaron la actividad antimicrobiana de extractos etanlicos, etreos y acuosos de aj dulce (Capsicum chinense) sobre el crecimiento de Escherichia coli y Bacillus sp en agar nutritivo, seleccionaron las muestras de aj, las lavaron, secaron a diferentes temperaturas y molieron, seguida de la extraccin con diferentes solventes segn el caso, para determinar el efecto inhibidor, sembraron los microorganismo en estudio en placas de petri con medio de agar nutritivo, colocando en ellos discos de papel de filtro impregnados de los extractos e incubndolos a 37 C por 24 horas. Obtuvieron como resultados, que la inhibicin microbiana se present slo en el extracto realizado con etanol ya que la mayora de los componentes activos presentes en aj (Capsicum sp.) son solubles en etanol.

Bases Tericas:

Definicin, composicin y tipos de lactosuero.

El lactosuero es definido como la sustancia lquida obtenida por separacin del cogulo de leche en la elaboracin de queso (Foegeding y Luck, 2002). Existen varios tipos de lactosuero dependiendo principalmente de la eliminacin de la casena, el primero denominado dulce, est basado en la coagulacin por la renina a pH 6,5. El segundo llamado cido resulta del proceso de fermentacin o adicin de cidos orgnicos o cidos minerales para coagular la casena como en la elaboracin de quesos frescos (Jelen, 2003).

Calidad de la protena del suero.

La evidencia ms contundente de su importancia nutritiva es la constatacin de que la protena del suero presenta elevado valor biolgico (HBV, sigla en ingls para High Biological Value) y un rico perfil de aminocidos. El perfil de aminocidos del suero presenta considerables cantidades de aminocidos esenciales, aminocidos sulfurados y aminocidos de cadena ramificada (BCAA, sigla en ingls para Branched-Chain Amino Acids). Dichos aminocidos son los principales responsables por el excelente ndice PER (del ingls Protein Efficiency Ratio, un indicador del grado de eficiencia de una protena) y por la amplia gama de aplicaciones de la protena del suero (Archibald, S/F). La misma no constituye la fraccin ms abundante, pero es la ms interesante en los terrenos econmico y nutricional (Linden y Lorient, 1996). Representa una rica y variada mezcla que poseen amplio rango de propiedades qumicas, fsicas y funcionales. Concretamente, suponen alrededor del 20% de las protenas de la leche de bovino (Baro et al., 2001), siendo su principal componente la -lactoglobulina (-LG) con cerca de 10% y -lactoalbmina con 4% de toda la protena lctea (Hinrichs et al., 2004), adems, contiene otras protenas como, lactoferrina, lactoperoxidasa, inmunoglobulinas, y glicomacropptidos (Baro et al., 2001). La -LG es secretada en leches de rumiantes con alta resistencia a la digestin gstrica, lo que origina intolerancia y/o alergenicidad en seres humanos, sin embargo, tratamientos industriales como esterilizacin, calentamiento o presin hidrosttica alta y la hidrlisis mejoran la digestibilidad de la -LG presente en el lactosuero (Pescumma et al., 2008). Los Probiticos. El trmino probitico es una palabra relativamente nueva que significa a favor de la vida y actualmente se utiliza para designar las bacterias que tienen efectos beneficiosos para los seres humanos y los animales (FAO y OMS., 2006).

La observacin original de la funcin positiva desempeada por algunas bacterias se atribuye a Eli Metchnikoff, un investigador de origen ruso galardonado con el premio Nobel por sus trabajos en el Instituto Pasteur a comienzos del siglo pasado, que afirm que "la dependencia de los microbios intestinales con respecto a los alimentos hace posible adoptar medidas para modificar la flora de nuestro organismo y sustituir los microbios nocivos por microbios tiles". Por entonces el pediatra francs Henry Tissier observ que los nios con diarrea tenan en sus heces un escaso nmero de bacterias caracterizadas por una morfologa peculiar en forma de Y. Estas bacterias bfidas eran, por el contrario, abundantes en los nios sanos. Sugiri la posibilidad de administrar estas bacterias a pacientes con diarrea para facilitar el restablecimiento de una flora intestinal sana. Las obras de Metchnikoff y Tissier fueron las primeras en las que se hicieron propuestas cientficas con respecto a la utilizacin probitica de bacterias, aun cuando la palabra "probitico" no se acu hasta 1960, para designar las sustancias producidas por microorganismos que promovan el crecimiento de otros. Havenaar y Huis in't Veld (1992) propusieron una definicin muy similar: "un monocultivo o cultivo mixto viable de bacterias que, cuando se aplica a animales o seres humanos, afecta beneficiosamente al husped mejorando las propiedades de la flora autctona". Una definicin ms reciente, aunque probablemente no ser la ltima, es la siguiente: " microorganismos vivos que, cuando se consumen en cantidades apropiadas, confieren al husped efectos saludables " (Guarner y Schaafsma, 1998). Es evidente que estas definiciones: 1) han circunscrito la utilizacin del trmino probitico a los productos que contienen microorganismos vivos 2) indican la necesidad de proporcionar una dosis apropiada de bacterias probiticas para obtener los efectos deseados. En los 20 ltimos aos la investigacin sobre los probiticos ha progresado considerablemente y se han realizado avances notables en la seleccin y caracterizacin de cultivos de probiticos concretos y la justificacin de las declaraciones de propiedades saludables en relacin con su consumo.

Como microorganismos probiticos se utilizan sobre todo, aunque no exclusivamente, bacterias de los gneros Lactobacillus y Bifidobacterium, y el nmero de alimentos probiticos puestos a disposicin de los consumidores es cada vez mayor. Para comprender la importancia del concepto de alimento probitico para la salud humana son necesarias algunas consideraciones ecolgicas acerca de la flora intestinal.

SISTEMA DE HIPTESIS

Hiptesis general: El producto fermentado a base de lactosuero sometido a la accin de Lactobacillus casei, en presencia de diferentes concentraciones de aj picante y sal comn, responder a la obtencin de un alimento probitico de calidad sensorial aceptable y con las caractersticas fisicoqumicas tpicas de un aderezo cremoso. Hiptesis operacional: Los niveles de los factores en estudio: aj picante y sal comn, permitirn la obtencin de un producto probitico de calidad sensorial aceptable y con las caractersticas fisicoqumicas tpicas de un aderezo cremoso. Hiptesis estadstica: Hiptesis relacionadas con el objetivo 2: Hiptesis Nula. i= 0 (las concentraciones de aj picante y cloruro de sodio no afectaran el crecimiento de probiticos y las caractersticas fisicoqumicas del producto).

Hiptesis alternativa. i 0 (al menos una de las concentraciones de aj picante y cloruro de sodio afectara el crecimiento de probiticos y las caractersticas fisicoqumicas del producto). Hiptesis para el objetivo 3: Hiptesis Nula. i= 0 (las muestras seleccionadas segn la viabilidad de los probiticos y caractersticas fisicoqumicas no permitirn obtener un producto ptimo segn los parmetros sensoriales evaluados). Hiptesis alternativa. i 0 (las muestras seleccionadas segn la viabilidad de los probiticos y caractersticas fisicoqumicas permitirn obtener un producto ptimo segn los parmetros sensoriales evaluados).

SISTEMA DE VARIABLES. Tabla 1 Sistema de variables Objetivo 1 Variable Dependiente Variable Independiente SST, Viscosidad, pH, Acidez titulable total (%), Recuento lcticas (ufc/ml). y de bacterias degenerativas

Cantidades de lactosuero, Concentraciones ricotta y crema de leche. Recuento de

de

aj

picante y cloruro de sodio. de aj

bacterias Concentraciones

probiticas (ufc/ml), pH y picante y cloruro de sodio. Acidez titulable total. Cantidades de producto

Gusto, color, textura. SST, Viscosidad, de pH,

terminado.

Acidez titulable total (%), 5 Recuento (ufc/ml). Tabla 2 Operacionalizacin de las Variables Variable Fisicoqumicas Acidez pH Microbiolgicas Recuento de bacterias lcticas Sensorial Color Gusto Continua Continua Escala Hednica no estructurada Escala Hednica no estructurada 1-20 1-20 Tipo de escala Continua Continua Continua Indicadores % Adimensional ufc/ml Rango 0-100 1-14 0 - >106 bacterias probiticas y degenerativas

METODOLOGA DE INVESTIGACIN.

Tipo de investigacin. La investigacin se regir por el procedimiento a seguir segn una investigacin de tipo experimental y exploratoria bajo condiciones controladas en laboratorio y la metodologa consistir en la evaluacin de un producto probitico a base de lactosuero con adicin de aj picante y sal comn.

Poblacin: Se emplear suero de queso fresco ricotta y crema de leche al 65% de materia grasa de la quesera Tinaquillo localizacin geogrfica; cultivo probitico liofilizado: Lactobacilllus casei; sal comn y aj picante del comercio local. Muestra: Se analizarn muestras por triplicado de cada aditivo, de 250 ml de lactosuero dulce sin procesar, 250 gramos de crema de leche, 250 gramos de ricotta y 250 gramos de aj picante para cumplir con el objetivo 1, para el objetivo 2 se utilizaran las cantidades que se determinen con el estudio previo en campo y la prueba piloto a realizar, en cuanto al objetivo 3, se utilizara 50 gramos de muestra del producto terminado para cada persona del panel de catacin. Diseo de Observacin: Suero fresco Filtrado

Crema de leche y ricotta

Estandarizado

Sal Comn y aj picante Temperatura: 85 C

Homogenizado

Pasteurizado

Cultivo disuelto en leche pasteurizada: L. casei (108 0 ufc/ml) a 41 C

Inoculado

Temperatura 0 C

41 Incubado

Temperatura 4 0C

Refrigerado

Figura 1. Flujograma para la elaboracin de un producto probitico a base de lactosuero con la adicin de aj picante y sal comn. Diseo estadstico. Para el objetivo 2 se formular el producto variando las concentraciones de aj picante y cloruro de sodio, utilizando para ello un diseo experimental completamente aleatorizado con un anlisis factorial de 2 x 3 manteniendo constante el lactosuero, la crema de leche y ricotta, tomando en cuenta las cantidades a utilizar segn un patrn de elaboracin de suero picante artesanal y la realizacin de una prueba piloto.

Tcnicas de recoleccin de datos:

Para los anlisis fisicoqumicos y microbiolgicos se emplearan los procedimientos contemplados en las normas venezolanas COVENIN: Microorganismos aerobios (ufc/ml) (COVENIN, 902-87), Microorganismos Acidricos (ufc/ml) (COVENIN, ufc/ml; Microorganismos Coliformes Totales (ufc/ml) (COVENIN, Staphylococcus aureus (ufc/ml) (COVENIN, 1292-2004), 3123-94), 3339-97),

pH (COVENIN, 1315-79),

acidez (COVENIN, 658-97), mientras que el anlisis sensorial se realizar con una prueba de aceptacin, utilizando escalas hednicas no estructurada de veinte puntos. A cada uno de los calificativos empleados en la escala, se le asignar un valor de 1 a 20.

Tcnica de Anlisis. La comparacin de los resultados del objetivo 2 se analizar construyendo un ANAVAR con el programa de diseo JMP4 y para el objetivo 3 se analizar con estadstica paramtrica si los resultados cumplen con los supuestos necesarios para la aplicacin de la misma de no cumplirse con los supuestos el anlisis se realizar con estadstica no paramtrica aplicando el test de Kruskal - Wallis.

CRONOGRAMA: Tabla 3 Cronograma de actividades de las etapas del proyecto. Actividad/Mes Elaboracin y entrega proyecto para su admisin Entrega de aprobacin propuesta de para Noviembre Febrero Marzo Abril

Ejecucin de los experimentos Elaboracin de informe final. Entrega del proyecto final

REFERENCIAS CONSULTADAS

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