UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA

DINAMICA DE LAS BACTERIAS DE INTERES SANiTARIO ADHERIDAS A PARTICULAS EN UN EMBALSE DE ABASTECIMIENTO

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR ROSA MARIA FERNANDEZ ALVAREZ

Directoras: Dra. Carmen de la Rosa Jorge Dra Josefina Rodrguez de Lecea

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Madrid, 1994

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE FARMACIA

DINAMICA DE LAS BACTERIAS DE INTERES SANITARIO ADHERIDAS A PARTICULAS EN UN EMBALSE DE ABASTECIMIENTO

Rosa Mara Fernndez Alvarez Madrid, 1994

PREFACIO

Quisiera expresar mi agradecimiento a muchas personas que me ayudaron de muy distintas maneras durante la realizacin de este trabajo. Seguramente mi memoria me traicionar y me olvidar de alguna de ellas. Espero que me sabr perdonan A los directores de los Departamentos de Microbiologa II y HL Dr Csar Nombela Cano y Dr. Jos Martnez Peinado, quiero agradecerles haberme dado la oportunidad de trabajar en sus departamentos. A mis directoras de Tesis, Dra. Carmen de la Rosa Jorge y Dra. Josefina Rodrguez de Lecea, Profesoras Titulares de Universidad en los Departamentos de Microbiologa II y III, & las Facultades de Farmacia y Biologa respectivamente, no slo tengo que agradecerles el haber dirigido esta Tesis, tambin han sido importantsimos su apoyo en todo momento y sus nimos para que este trabajo llegara a su fin. A la Dra. Trinidad Soto Esteras, Profesora Titular de Escuela Universitaria del Departamento de Microbiologa II, de la Facultad de Biologa, compaera constante de muestreos y de jornadas de siembra, por su ayuda tanto en el trabajo de campo como en el laboratorio, por su apoyo constante, por su compaerismo y por todos los nimos y buenos consejos que me ha dado en todo este tiempo, incluso en los mamen tos ms desalentadores. Tambin debo recordar a Carmen Chena, compaera de muestreos y de tabo ratono, por todos los ratos que hemos pasado codo con codo. A la Dra. Covadonga Vzquez Estvez, Profesora Titular de Universidad del Departamento de Microbiologa III de la Facultad de Biologa, por haberme ayudado con todo inters cada vez que la necesitaba y por haberme animado continuamente. A la Dra. Angeles Mosso Romeo, por el apoyo incondicional durante todo mi trabajo

A todos mis compaeros del Departamento de Microbiologa HL de la Facultad de Biologa, por hacer ms fcil el trabajo diario con su alegra y su compaerismo. Quiero recordar especialmente a Alberto Espinel, por toda la lata que le di con el ordenador. A M4 Jess Gmez y a Eva Rodrguez, que durante el tiempo que estuvieron en el Departamento de Microbiologa III de la Facultad de Biologa, adems de granjearse las simpatas de todos los que all estbamos, tenan tantas ganas de aprender y tantas ganas de ayudan que se prestaban a todo lo que les pidieses. Las dos me ayudaron mucho y con todo entusiasmo. Desde luego el trabajo no hubiera sido posible sin la colaboracin del Canal de Isabel II, propietario del embalse estudiado, no slo nos concedi los permisos para la recogida & muestras, sino que adems puso a nuestra disposicin la barca y al personal del embalse. Quiero recordar aqu a las personas que trabajaban en el embalse, man{festndoles mi ms sincero agradecimiento por su gran ayuda y por el entusiasmo que ponan en facilitarnos cualquier tarea, participando en la recogida de muestras como uno de nosotros, ya hiciera un fro intenso o un calor sofocante. Quiero agradecer a la Universidad Complutense de Madrid la concesin de la Ayuda a Grupos Precompetitivos al proyecto titulado Caracterizacin de las poblaciones microbianas de un embalse de abastecimiento. Produccin, actividad y biomasa; gracias a ella se ha podido llevar a cabo todo este trabajo. Sin duda mi mayor gratitud es hacia unas personas que me animaron constantemente para que finalizara la Tesis: mi marido y mis padres. A pesar de todo el tiempo que les he hecho esperar, espero que el verla ahora terminada les pueda resarcir de todos los malos ratos que habrn pasado por mi culpa. Adems, con Serafn, mi marido, tengo una deuda de gratitud enorme y este trabajo es tan mo como suyo. El ha participado en l desde sus inicios, remontndonos a cuando realizamos nuestras tesinas juntos, y ha sufrido y se ha alegrado con el tanto como yo. Pareca que nunca iba a llegar, pero aqu est.

INDICE 1. INTRODUCCION 1.1. Los microorganismos en el medio acutico continental 1.1.1. Distribucin en aguas subterrneas, manantiales y ros 1.1.2. Distribucin en lagos y embalses 1.2. Influencia de los factores fisico-qulmicos 1.3. Influencia de los factores biolgicos 1.4. Adhesin microbiana a superficies 1.4.1. Razones que justifican la adhesin 1.4.2. Mecanismos de adhesin 1.4.3. Actividad de las bacterias adheridas 1.4.4. Factores que influyen sobre la adhesin 1.4.5. Importancia de la adhesin 1.4.5.1. Ecolgica 1.4.5.2. Sanitaria 1.4.5.3. Industrial 1.5. Embalse de El Atazar 1.6. Objeto del trabajo 1 2 2 .4 6 16 22 22 24 27 29 36 36 37 39 41 43

2. MATERIAL Y METODOS 2.1. Toma de muestras y su conservacin 2.2. Realizacin de los perfiles de temperatura, oxgeno disuelto y tanto por ciento de saturacin de oxgeno 2.3. Mtodos microbiolgicos 2.3.1. Determinacin de la poblacin bacteriana total 2.3.2. Recuento de bacterias respiratoriamente activas

46 4,7

47 48 48 49

2.3.3. Recuento de bactedas hetertrofas viables a 220C y 370C, totales y adheridas a partculas 2.3.4. Recuento de bacterias del grupo coliforme, totales y adheridas a partculas 2.3.5. Recuento de estreptococos fecales, totales y adheridos a partculas 2.3.6. Identificacin de bacterias 2.3.6.1. Identificacin de coilformes 2.3.6.2. Identificacin de estreptococos 2.3.7. Adhesin
iii

49 50 51 51 51 52 52 54 54 54 54 54 55 55 55

vitro

2.4. Mtodos fsico-qumicos 2.4.1. pH 2.4.2. Concentracin de ion amonio 2.4.3. Concentracin de nitritos 2.4.4. Concentracin de nitratos 2.4.5. Concentracin de ortofosfatos 2.4.6. Concentracin de fsforo total 2.4.7. Demanda qumica de oxgeno (D.Q.O.)

3. RESULTADOS Y DISCUSION 3.1. Perfiles de temperatura, oxgeno disuelto y porcentaje de saturacin de oxgeno 3.2. Parmetros microbiolgicos 3.2.1. Poblacin bacteriana total y clulas respiratoriamente activas 3.2.2. Bacterias hetertrofas totales y adheridas a partculas 3.2.2.1. Bacterias hetertrofas con crecimiento a 220C 3.2.2.2. Bacterias hetertrofas con crecimiento a 370C 3.2.2.3. Porcentaje de bacterias hetertrofas adheridas a partculas 3.2.3. Bacterias del grupo coilforme, totales y adheridas a partculas
....

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58 63 63 68 68 75 82 85

3.2.3.1. Justificacin del mtodo empleado 3.2.3.2. Recuentos 3.2.3.3. Porcentaje de coilformes adheridos a partculas 3.2.4. Estreptococos fecales 3.2.5. Identificacin de bacterias 3.2.5.1. Identificacin de coliformes 3.2.5.2. Identificacin de estreptococos 3.2.6. Adhesin iii vitro 3.3. Parmetros fisico-qulmicos 3.3.1. pH 3.3.2. Concentracin de ion amonio 3.3.3. 3.3.4. 3.3.5. 3.3.6. 3.3.7. Concentracin de nitritos Concentracin de nitratos Concentracin de ortofosfatos Concentracin de fsforo total Demanda qumica de oxgeno

85 86 102 103 105 105 106 107 108 108 109 113 116 120 123 126

4. CONCLUSIONES

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5. BIBLIOGRAFA

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1. INTRODUCCION

1.1. LOS MICROORGANISMOS EN EL MEDIO ACUATICO CONTINENTAL

Prcticamente todas las reas ambientales conocidas se encuentran colonizadas por microorganismos que se han adaptado tambin a los diferentes sistemas acuticos existentes en la Tierra. En casi todos ellos se encuentran microorganismos formando parte de las distintas biocenosis (comunidades biolgicas) con interrelaciones entre todos los grupos que las forman y cuya distribucin, tanto cuantitativa como especfica, es muy diversa y es el resultado de la cooperacin e interaccin de todos los factores biticos y abiticos y, como stos, est sujeta a unos cambios ms o menos profundos de una manera constante (Rhodes y Kator, 1990). Diversas investigaciones en ecologa microbiana acutica han resaltado el papel que juegan las bacterias hetertrofas en la transfonnacin de la materia orgnica, reciclado de nutrientes y flujo de energa en los sistemas acuticos (Azain et al., 1983; Scavia y Lalrd, 1987; van Es y MeyerReil, 1982; Zinabu y Taylor, 1989 a) y en las cadenas alimentarias, ya que la actividad heterotrfica de las bacterias sirve como va primaria por la que la materia orgnica se hace disponible a niveles trficas superiores (Azam et al., 1983; Hubbard y Cbrzanowski, 1986; Murray y Hodson, 1985; Zinabu y Taylor, 1989 b). Las bacterias concentran un carbono intil por disperso (carbono orgnico disuelto, C.O.D.), en un carbono de alta calidad (carbono orgnico paniculado, C.O.P.), til para otros niveles trficas (Murray y Hodson, 1985). Existe una estrecha relacin entre la flora bacteriana de las aguas continentales y la del suelo. Esto es particularmente importante en el caso de aguas corrientes, por estar expuestas constantemente a la contaminacin procedente del suelo; de ah la gran dificultad de separar netamente una y otra flora. Por tanto, muchas de las bacterias que podemos encontrar en las aguas estin presentes tambin en el suelo.
1.1.1. DISTRIBUCION EN AGUAS SUBTERRANEAS, MANANTIALES Y

xios

En las aguas subterrneas y de manantial la cantidad de bacterias es, por regla general, escasa, debido a su pobreza en principios nutritivos y a la filtracin que sufren a travs de las distintas capas de suelo. Dada la escasa concentracin de materias nutritivas, las clulas suelen ser pequeflas, predominando los cocos ms diminutos y los bacilos cortos (Rheinheimer, 1987). aunque algunos autores aseguran que los tamaos de la mayora de las bacterias observadas no son significativamente ms pequeos que los obtenidos de aguas superficiales ricas en nutrientes (Hirsch y Rades-Rohkohl, 1983). El espectro de especies vara mucho segn la clase de agua, teniendo una influencia muy importante la temperatura y la composicin de sustancias minerales

(Buchanam-Mappin eta!., 1986; Fillp a aL, 1988; Hirsch y Rades-Rohkoh], 1983). En las aguas superficiales la flora bacteriana es generalmente mucho ms rica en especies que en las subterrneas. Las determinaciones del nmero total de bacterias en los ros no permiten dar una idea de conjunto debido a la gran diversidad hidrogrfica, encontrndose diferencias enormes en la cantidad de bacterias dependiendo en gran manera de si son ros o arroyos limpios, de regiones montaosas o selvticas, o si se trata de ros que atraviesan zonas pobladas, todos ellos contaminados. Tambin se pueden encontrar grandes oscilaciones en el perfil longitudinal de los ros, atribuibles principalmente a la influencia que ejercen los afluentes, la evacuacin de aguas residuales, las instalaciones portuarias y otros factores entre los que debemos incluir la autodepuracin natural del ro. Contrariamente a lo dicho respecto al perfil longitudinal, tanto el transversal como el vertical ofrecen diferencias relativamente escasas en lo concerniente al nmero de bacterias puesto que la corriente y el viento remueven constantemente el agua, lo que hace que, tanto las bacterias como la materia que usan para alimentarse, se distribuyan ms uniformemente. Slo se pueden advertir diferencias de cierta consideracin en las riberas y en e] fondo. En los ros y arroyos un factor importante es la velocidad de las aguas, que influye tanto en el nmero de microorganismos presentes como en la composicin de las comunidades microbianas. Las aguas que corren a gran velocidad son poco productivas y tienen una micropoblacin pobre en especies, que han de adaptarse a las condiciones extremas determinadas por la corriente. En cuanto a las oscilaciones estacionales en la bibliografa se suelen citar dos modelos dependiendo del grado de contaminacin. En los ros contaminados no es raro encontrar un mximo invernal, con un nmero total de bacterias considerablemente mayor en la estacin fra, que se atribuye a unas condiciones de vida y nutricin ms favorables para las bacterias que llegan conducidas por las aguas residuales, ya que, si bien un aumento de la temperatura aumenta la actividad y disminuye el tiempo de generacin de estas bacterias, tambin aumenta la accin txica y se acelera la autolisis (Granai y Sjogren, 1981). Esto, unido a que los efectos deletreos combinados de la luz y la presencia de ndcrobiota natural son generalmente mayores a temperaturas ms altas (Anderson et aL, 1983; McCambridge y McMeekin, 1979; Ebodes y

Kator, 1988), hace que en verano se obtenga un nmero menor (Awong et aL, 1990). Se pueden obtener aumentos transitorios en el nmero total de bacterias durantelas crecidas de los ros, ya que los terrenos inundados originan una intensa contaminacin adicional a la vez que aportan nuevos nutrientes. En cambio, en los ros que no sufren ninguna contaminacin apreciable a causa de las aguas residuales, no se observa el ritmo estacional indicado anteriormente. Tanto el nmero tota] de bacterias como el de las saprofitas depende en este caso mucho ms de las sustancias nutritivas producidas en el mismo ro, sobre todo por el fitoplancton. Por consiguiente, el mximo no corresponde al invierno sino a las pocas de mxima produccin por parte del fitoplancton (primavera y otoo o las postrimeras del verano). 1.1.2. DISTRIBUCION EN LAGOS Y EMBALSES En los lagos formados por aguas subterrneas hay muchas bacterias de las existentes en esas aguas, a las que se pueden sumar otras especies, en mayor o menor nmero, dependiendo de las condiciones fsico-qumicas. En cambio a los lagos fluviales y a los embalses afluyen ros que van a influir en su micropoblacin, siendo esta influencia tanto mayor cuanto menor sea el lago o embalse, aunque la flora bacteriana lacustre siempre ser diferente a la fluvial debido a las diferencias existentes entre ambos medios. El nmero total de bacterias en lagos y embalses, as como su distribucin estacional, va a depender del grado de contaminacin y del estado trfico de los mismos. En los no contaminados y oligotrficos el nmero mximo de bacterias suele coincidir con la poca de mayor produccin por parte del fitoplancton, es decir la primavera, principio del otoo o final del verano. En lagos y embalses contaminados por aguas residuales se puede obtener un mximo en invierno como ya hemos comentado en el caso de los ros. La distribucin vertical de las bacterias en zonas de clima templado ofrece grandes diferencias estacionales (Cbrzanowski y Hubbard, 1988). En la poca clida la capa superior se calienta, lo que origina una estratificacin estable formada por una capa superior caliente o epilimnion y otra inferior fra o hipolimnion. La temperatura desciende con brusquedad entre una y otra, lo que da lugar a una capa de transicin trmica denominada termoclina o metalimnion. Estas tres capas, mientras dura esta situacin, son totalmente inmiscibles. La estratificacin trmica de la poca estival tiene naturalmente una importancia extraordinaria para

la biologa; en las tres capas no slo es muy diverso el nmero total de bacterias, sino tambin su composicin especfica, su crecimiento y su actividad (Lovel y Konopka, 1985 b, c; Nagata, 1984). Estas diferencias pueden ser particularmente importantes en los lagos y embalses eutrficos, en cuyo hipolimnion, durante la estratificacin, llega a desaparecer por completo el oxgeno disuelto, lo que impide el desarrollo de algunas poblaciones bacterianas, conduce a un fuerte descenso en los recuentos de bacterias aerobias totales (Lewis et aL, 1986; Schmaljohann et aL, 1987), y favorece el de otras, como sulfobacterias, clostridios o Desulfovibrio. El epilimnion bien iluminado y templado constituye la zona productiva por la capacidad asimilativa del fltoplancton que se desarrolla abundantemente. El desarrollo fitoplanctnico est ligado al estado trfico del lago o embalse, siendo ms escaso en los oligotrficos, mientras que en los cutrficos se pueden producir florecimientos durante toda la poca clida. En el lilpolimnion, de escasa o nula iluminacin, tiene lugar la desintegracin de la materia orgnica, llevada a cabo por distintos grupos de microorganismos, dependiendo de la existencia o no de oxgeno. A nivel de la termoclina o metalimnion es frecuente obtener los mayores recuentos de bacterias hetertrofas (Lovel y Konopka, 1985 b, c, d), poblacin fonnada en su mayor parte por bacterias proteoliticas. Cuando llega la poca fra, se produce un enfriamiento de la capa superior que cae sobre las otras, producindose la mezcla de la columna de agua. Esto est ocurriendo continuamente durante todo el invierno, por lo que a esta etapa se la denomina de circulacin. Durante esta poca la distribucin de bacterias es mucho ms uniforme puesto que la columna de agua se encuentra en mezcla continua. Los perfiles longitudinal y transversal de los lagos y embalses grandes, con frecuencia ofrecen tambin diferencias importantes en el contenido de bacterias del agua. Los ros y arroyos que afluyen al lago o embalse pueden tener influencia en el nmero de microorganismos, que disminuye, por regla general, a medida que aumenta la distancia a las orillas. Tambin influye la climatologa; despus de precipitaciones intensas puede aumentar, aunque de manera transitoria, el nmero de bacterias en el agua, as como la cantidad de esporas de hongos. Otras veces el aumento se observa en la actividad beterotrfica, sin detectarse grandes aumentos en el nmero de bacterias (Hubbard y Chrzanowski, 1986). Esta influencia

es tanto mayor cuanto menor sea el lago o embalse.

1.2. INFLUENCIA DE LOS FACTORES FISICO-OUIMICOS

Hay una gran cantidad de factores fsico-qumicos que influyen sobre el desarrollo y supervivencia de los microorganismos en las aguas. Esta influencia no slo se produce sobre el nmero de bacterias presentey sobrela composicin en especies de las poblaciones microbianas, sino que algunos factores repercuten sobre la morfologa y fisiologa de los microorganismos, pudiendo alterar considerablemente el metabolismo, la forma celular o la reproduccin de muchas especies o incluso pueden inducir a una incapacidad para formar colonias en medios bacteriolgicos estandar (Barcina a aL, 1989, 1990; Buchanam-Mappin et al., 1986; Byrd eta!., 1991; Garca-Lara et aL, 1991; Lpez-Torres et aL, 1988; Munro a aL, 1987; Roszack y Colwell, 1987; Roszack et aL, 1984; Singleton et al., 1982; Iamplin y Colwell, 1986; Xu eta!., 1982). Aunque los diversos factores de los medios naturales que pueden influir sobre los seres vivos son numerosos, algunos destacan sobre los dems por su importancia particular.
Luz

La luz es un importante factor ecolgico en las aguas. La intensidad luminosa biolgicamente activa se conserva slo en las capas superiores, variando la profundidad en funcin de la intensidad de la radiacin solar y de la turbidez. Si se trata de aguas muy turbias, la influencia de la luz es posible nicamente en la capa superior de pocos centmetros de espesor; pero en aguas muy claras los efectos pueden extenderse a algunos metros de profundidad. Como fuente de energa la luz es importante para el fitoplaneton, estando la produccin primaria fuertemente influenciada por la intensidad de luz (Loveil y Konopka, 1985 b); pero la irradiacin intensa dalia considerablemente a muchas especies cuyas condiciones ptimas en verano no se encuentran en la superficie sino a unos pocos metros de profundidad. La penetracinde la radiacin ultravioletams perjudicial biolgicamente (UV-B, 280-320 nm) se ve reducida en aguas de embalses y estuarios en comparacin con aguas de ocano abierto, debido a la absorcin selectiva de las longitudes de onda ms cortas por parte del

material orgnico disuelto, la clorofila y la materia paniculada. Por consiguiente las bacterias de la zona ftica estn expuestas principalmente a la luz visible (400-775 mu) y en menor medida al ultravioleta cercano (13V-A, 320400 nm). Aunque los fotones de estas longitudes de onda ms largas seconsideran generalmente menos dainos biolgicamente, retrasan o impiden el crecimiento de poblaciones bacterianas tanto alctonas como autctonas (Rhodes y Kator, 1990; Sieracki y Sieburth, 1986). Numerosos autores han estudiado el efecto de la luz sobre poblaciones bacterianas. Bailey el al. (1983) estudiaron su efecto inhibidor sobre las bacterias en la baha de Cbesapeake (EEUU) y observaron que, con el aumento de la radiacin, se produca una disminucin de la tasa de supervivencia de las bacterias y que la proporcin de poblacin activa se reduca de un 93% a un 20%. Barcina el aL (1989, 1990), estudiando la supervivencia de Escherichia coli y Enterococcus faecalis bajo iluminacin por luz visible en agua dulce, observaron que despus de 72 h la mayora de las clulas de ambas cepas perdan su capacidad para formar colonias en medios de cultivo adecuados, manifestando adems una actividad metablica reducida. Otros autores obtuvieron tambin una rpida reduccin en los recuentos de viables de bacterias entricas despus de la exposicin durante pocas horas a la luz del sol (Cornax el aL, 1990; Fujioka el al., 1981; Fujioka y Narikowa, 1982; Kapuscinski y Mitchel, 1981; Rhodes y (ator, 1990). Algunos autores han observado que la accin conjunta de la luz y la presencia de microbiota natural pueden tener un efecto exacerbado sobre las bacterias entricas (McCanibridge y McMeekin, 1981; Rhodes y (ator, 1990). La influencia perjudicial de la luz afecta mucho ms a las bacterias incoloras debido, no slo al componente ultravioleta, sino tambin a la participacin de la radiacin visible (Fujioka el aL, 1981; Kapuscinski y Mitcbel, 1981; McCambridge y McMeekin, 1981). En el caso de las bacterias pigmentadas que contienen carotenoides la tolerancia es mayor, no producindose ninguna inhibicin si la intensidad luminosa es normal, teniendo incluso una mayor resistencia a los rayos ultra-violeta; por eso muchas bacterias que se encuentran en el aire son intensamente pigmentadas ya que, al aumentar la pigmentacin, se reduce la Usa de mortalidad a causa de la luz.
Temperatura

Las manifestaciones vitales de todos los microorganismos estn supeditadas a la temperatura, que influye tanto sobre la lasa de crecimiento y supervivencia (Barcina el al., 1986;

Lovel y Konopka, 1985 a) como sobre las necesidades nutritivas y, en menor medida, sobre la composicin qumica y enzimticade las clulas (Anderson eta!., 1983; Davenport a aL, 1976; McFeters y Stuart, 1972). En lineas generales, al aumentar la temperatura, dentro del margen cugensico, aumenta la actividad vital y se reduce el tiempo de generacin. Cuando se reduce la temperatura por debajo de la mnima se produce a menudo la detencin de las actividades metablicas, pudiendo muchos microorganismos persistir mucho tiempo en este estado de vida latente. Temperaturas cercanas a la mxima y a la mnima pueden provocar alteraciones morfolgicas, como por ejemplo E. coli que a 70C forma clulas filamentosas. Pero los efectos inequvocos de la temperatura in vit-o, en cultivo puro y condiciones ptimas, no se observan a veces ms que difcilmente o nunca en la naturaleza, ya que, en primer lugar, aqu concurren gran nmero de seres vivos muy diversos, con procesos paralelos o antagnicos, de ah que la influencia de la temperatura no pueda determinarse siempre para cada una de las especiespor separado; adems, otros muchos factores sesuman a la temperatura, ejerciendo su influencia sobre las distintas poblaciones microbianas. Rheinheimer (1987) afirma que, aunque un incremento de la temperatura aumenta la actividad y disminuye el tiempo de generacin, tambin aumenta la accin txica y acelera la autolisis; por eso no es raro que los recuentos de bacterias hetertrofas en aguas contaminadas, con predominio de microorganismos alctonos, sean ms altos en invierno que en verano, ya que las bajas temperaturas invernales hacen ms lentos todos los procesos prolongando la supervivencia de estas bacterias; en cambio, en aguas limpias el nmero total de bacterias suele ser mayor en verano porque muchos microorganismos pueden multiplicarse intensamente en las aguas con temperaturas estivales. Nagata (1984) comprob que los recuentos bacterianos en el lago Biwa estaban correlacionados con la temperatura. Otros autores han observado tambin que la supervivencia de E. cdi y otras bacterias entricas es mayor a temperaturas bajas (Granai y Sjogren, 1981; McCambridge y McMeekin, 1980 b; Sjogren y Gibson, 1981; Vasconcelos y Swartz, 1976). Generalmente el efecto de algunos factores sobre las bacterias entricas es mayor a temperaturas ms altas. Por ejemplo, la presencia de microbiota natural: mientras que en muestras de aguas naturales la supervivencia de bacterias entricas es mayor a temperaturas ms bajas, cuando el agua es filtrada se obtiene mayor supervivencia de estas bacterias a temperaturas clidas (Anderson et aL, 1983; Rhodes e: aL, 1983; Rliodes y (ator, 1988). Tambin los efectos deletreos combinados de la luz y la presencia de microbiota natural son

mayores a temperaturas altas (Anderson e: aL, 1983; Faust e: aL, 1975; McCambridge y McMeekin, 1979, 1980 a, 1981; Rhodes y (ator, 1988, 1990; Vasconcelos y Swartz, 1976). Por tanto el efecto de la temperatura depender de las condiciones del medio. Lo que es indudable es que las oscilaciones estacionales de la temperatura provocan en todo caso una alteracin de las poblaciones microbianas. Las diferencias en la supervivencia de bacterias alctonas, principalmente enterobacterias, en funcin de la estacin, tambin estn relacionadas con la microbiota autctona, cuyas densidades son mayores en la estacin clida, por lo que muchos autores encuentran, durantela poca estival, una menor supervivencia de las poblaciones de enterobacterias, obteniendo grandes diferencias entre los resultados en muestras filtradas y no filtradas (Anderson e: aL, 1983; Rhodes y (ator, 1988). Turbidez La turbidez del agua ejerce tambin influencia sobrela vida de los microorganismos. Est originada por el seston que es el conjunto de materias que se encuentran en suspensin en el agua y que podemos dividir en tres grupos: Sustancias de origen mineral, generalmente transportadas desde el suelo Materiales detrticos, orgnicos e inorgnicos, finamente triturados Plancton, es decir, organismos en suspensin El conjunto de los dos primeros se denomina tripton.
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Una buena referencia de la turbidez la podemos obtener a partir de la profundidad del disco de Secchi y tambin se puede determinar pticamente con un espectrofotmetro. El enturbianiiento es muy variable en los distintos medios acuticos. Es muy escaso en los ros y arroyos limpios y en los lagos y embalses oligotrficos, y mucho mayor en aguas contaminadas y lagos y embalses eutrficos. Carballo (1987) en un estudio comparativo de dos embalses, uno oligotrfico y otro eutrflco, observa grandes diferencias en las profundidades de disco de Secchi; mientras que en el primero obtena valores entre 5 y 8 metros, en el segundo raramente llegaban a alcanzar el metro de profundidad. El seston desempea un papelmuy importante como sustrato de muchos microorganismos. Los materiales detrticos, en particular, son portadores a menudo de una flora compuesta de numerosos hongos y bacterias. Estos microorganismos pueblan no solamente los compuestos orgnicos, que pueden utilizar como alimento, sino tambin los inorgnicos. Las materias en

supensin, tanto de procedencia orgnica como de origen mineral, adsorben sobre su superficie sustancias nutritivas que estn disueltas en el agua a una concentracin baja, de tal manera que los microorganismos encuentran all unas condiciones de alimentacin ms favorables que si estn libres en el medio liquido. Esto es tanto ms patente cuanto menos abundantes sean las sustancias nutritivas en el agua. Adems, la adsorcin a partculas detrticas tambin ofrece una proteccin frente a sustancias txicas e inhibidoras y frente a la luz solar. Por esto es frecuente encontrar un paralelismo entre la turbidez y la concentracin bacteriana, lo que no quiere decir que un aumento o disminucin de los residuos detrticos siempre tenga como consecuencia el incremento o reduccin de la poblacin bacteriana. En general, los aumentos de la turbidez que van acompaados de una elevacin considerable del nmero de bacterias, son atribuibles, al menos en parte, a un aumento de la materia orgnica en suspensin; pero si la concentracin bacteriana vara muy poco, habr que buscar las causas en un aumento de las sustancias inorgnicas. Puede decirse que la turbidez tiene una influenciaindirecta; su efecto dependesobre todo del papel que desempeflen otros factores como la luz y la concentracin de nutrientes. La proporcin de microorganismos que crece sobre los detritos respecto al total de la microflora puede ser muy variable. Mientras que en aguas claras el porcentaje medio suele ser bastante bajo, en las aguas turbias ste puede llegar a ser muy elevado, incluso superior al 90%.
pH

El valor del pH influye poderosamente sobre el crecimiento de los microorganismos. La mayora de las bacterias se desarrollan nicamente dentro del margen de pH comprendido entre 4 y 9, fluctuando el ptimo entre 6,5 y 8.5, valores que predominan en casi todos los medios acuticos estudiados, estando en muchos lagos y embalses en tomo a 7. Durante la poca de floracin del plancton el pH puede aumentar notablememte, pudiendo llegar en lagos eutrficos a 9,5 10. Esto repercute lgicamente sobre la composicin de las poblaciones bacterianas (Klein y Alexander. 1986). Al producirse la descomposicin de algunas algas, tiene lugar un descenso del pH por los cidos presentes en sus jugos celulares. En diversos medios naturales se ha observado que durante esta descomposicin se produca un incremento en el nmero de levaduras relacionado con un descenso del pH (Rheinheimer, 1987). Aunque el pH ptimo de crecimiento para muchas bacterias est alrededor de 7, algunos autores (Granai y Sjogren, 1981; Sjogren y Gibson, 1981) han observado en estudios realizados con En2robacwr, E. cdi y otras enterobacterias, que la supervivencia es mucho mayor cuando

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el valor del pH del agua desciende a valores en tomo a 5,5. Esto lo atribuyen a que estos valores de pH, unidos a temperaturas bajas y a la presencia de iones tales como Ca2t Mg2~ y favorecen la utilizacin de componentes celulares internos. Grandes variaciones en la concentracin de hidrogeniones provocan alteraciones fisiolgicas y, no raramente, tambin morfolgicas. Algunos microorganismos pueden producir formas de involucin, las clulas normalmente aumentan de tamao y pueden formar ramificaciones. Concentracin salina El nivel de concentracin salina determinamuy especialmente las comunidades biolgicas que pueblan las aguas. La proporcin relativamente alta de NaC del agua de mar hace que los organismos de agua dulce y saJada sean fisiolgicamente distintos. La mayora de los microorganismos que viven en lagos y ros limpios son ms o menos halfobos y no pueden desarrollarse en las aguas que contengan una concentracin salina superior al 109k. Slo un nmero relativamente limitado de ellos son halotolerantes. Estos se encuentran en mayor o menor nmero en casi todas las aguas continentales, pero abundan particularmente en las aguas residuales urbanas y en los ros y lagos muy contaminados. En cambio, la inmensa mayora de las bacterias y hongos que viven en el mar son halfilos. Existen numerosos estudios sobre el efecto txico del agua de mar sobre bacterias entricas que indican que, incluso en ausencia de microbiota natural, hay un marcado descenso en el nmero de bacterias entricas despus de su introduccin en agua de mar y durante los periodos de incubacin (Munro e: aL, 1987; Rhodes et al., 1983). Otros autores proponen que este efecto se debe a su menor capacidad para competir por los nutrientes con microorganismos marinos autctonos (Enzinger y Cooper, 1976). Sin embargo, no todas las bacterias entricas muestran una respuesta igual al ser introducidas en agua de mar; Morifligo e: al. (1990) encontraron que la supervivencia de E. coli era mayor que la de E. faecalis cuando ambos eran introducidos en agua de mar, y que los daos subletales eran mayores en el segundo. Tambin observaron que la viabilidad de Salmonella spp. era similar a la de E. coli. Concentraciones salinas que se aparten mucho de la ptima, producen un aumento del tiempo de generacin y muchas veces llevan consigo la aparicin de alteraciones morfolgicas y fisiolgicas. Las bacterias pueden llegar a ser no cultivables (o no recuperables) en medios de

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laboratorio (Garca-Lara e: aL, 1991; Roszak e:al., 1984; Xu eta!., 1982), aunque permanezcan viables (Singleton et al., 1982) y en algunos casos se ha observado que mantienen su virulencia (Grimes y Colwell, 1986). El aumento de la concentracin de sal perturba el mecanismo normal de reproduccin; las clulas se alargan pero dejan de dividirse, pudiendo llegar a formarse filamentos. Muchas bacterias marinas, aunque no todas, se destruyen por lisis al pasarlas a agua dulce. Sustancias inorgnicas Dentro de las sustancias inorgnicas que influyen sobre la vida de los microorganismos en las aguas corresponde un papel importante a los compuestos inorgnicos de nitrgeno y fsforo, elementos limitantes en la mayora de los sistemas acuticos (Currie y (aif, 1984;

Wetzel, 1983).
En los lagos y embalses oligotrficos a veces apenas son detectables el in amonio, los nitritos, los nitratos y los fosfatos porque el fitoplancton los fija inmediatamente despus de su liberacin. En estas condiciones se puede producir una competencia entre las bacterias y las algas planctnicas. En la zona ftica, en las regiones de clima templado, se producen grandes oscilaciones estacionalesen las concentraciones de compuestos nitrogenados y fosforados; suele haber mayores cantidades al final del otoo y en invierno, para descender bruscamente al inicio de la primavera a consecuencia del desarrollo del fitoplancton. Las dems sustancias inorgnicas necesarias para la vida de los microorganismos existen en cantidad suficiente en la mayora de las aguas. Los oligoelementos, como el hierro y el cobalto, son imprescindibles, aunque a concentraciones muy bajas, como componentes de importantes enzimas. Tambin existen numerosos compuestos inorgnicos que producen inhibicin bacteriana, muchas de cuyas identidades no se conocen an ((lein y Alexander, 1986). Los metales pesados pueden ser perjudiciales para la vida en las aguas, porque algunos de ellos son txicos para muchos microorganismos, an a concentraciones relativamente bajas ((lein y Alexander, 1986). No es raro que el cobre y el mercurio, vehiculizados por las aguas residuales y los desechos industriales, lleguen a los ros, lagos, embalses y zonas costeras, destruyendo totalmente las comunidades biolgicas naturales. Su poder txico reside en su capacidad para fijar los grupos sulfbidrilos (Sil-) de las enzimas.

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Los cianuros, presentes ocasionalmente en nuestras aguas, aniquilan tambin a animales y plantas. El grupo CN- bloquea la citocromo-oxidasa al fijar el hierro; por eso es un veneno respiratorio muy activo (Rheinheimer, 1987).

Sustancias orgnicas
Las sustancias orgnicas en suspensin y disueltas en el agua tienen importancia principalmente en la nutricin de los microorganismos hetertrofos y como fuente de energa (LeChevallier et aL, 1991). De la concentracin de materia orgnica depende en gran parte el volumen de las poblaciones de bacterias y hongos en las aguas (Pry y Zia, 1982), pudiendo sta diferir mucho de unos lagos y embalses a otros, encontrndose en mayor concentracin en los lagos eutrflcos y en los ros contaminados. Suele existir una correlacin positiva entre la cantidad de microorganismos y la concentracin de compuestos orgnicos, pero como se puede observar en el siguiente cuadro, no es tan decisiva la cantidad total de estas sustancias como la proporcin de las que son fcilmente asimilables por los microorganismos, que constituyen slo una parte que puede oscilar entre el 0.1% y el 9% del carbono orgnico disuelto total (LeChevalhier e: aL, 1991; Eheinheimer, 1987).

Tipo de lago
______________________________________

~lipeco total Cantidad total Cantidad asimilable

de ini

Oligotrfico A Oligotrfico B Mesocrtico A Mesotrfico B Eurfico A 32,1 Eurfico B 33,7 Distrfico 226.6 (Rbeinheimer, 1987).
-

15,0 15,3

0,3 0,5 143 3,03 3,06 5,16 3,96

1,70 1,30 342 1,64 2,23 3,42 2,32

o~ o~ io5 106 106 106 106

La composicin de la materia orgnica disuelta va a influir tambin, de una manera decisiva, sobre la distribucin especfica de las poblaciones de bacterias y hongos en las aguas. De la materia orgnica disuelta la mayor proporcin suele corresponder a los hidratos de carbono, que pueden constituir alrededor de un 85%, predominando entre ellos los combinados respecto a los libres. Se supone que la escasa concentracin de carbohidratos libres es atribuible a la intensa actividad microbiolgica (Rlieinheimer. 1987)

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Si existe deficiencia de principios nutritivos orgnicos, las bacterias siguen multiplicndose pero apenas pueden crecer, por lo que se encontrar una gran proporcin de clulas cocoides diminutas (Kjelleberg et a!., 1983; MArdn ej aL, 1985). Fry y Zia (1982) citan esta disminucin de volumen como una estrategia de resistencia, disminuyendo el tuni-over celular y el intercambio con el medio. Si la concentracin es an menor, se puede producir la muerte de algunas especies. Sinclair y Alexander(1984) observan una rpidadesaparicin de S:repwcoccus en ambientes pobres en nutrientes. En general, algunos autores afirman que las bacterias entricas parece que son incapaces de competir adecuadamente con la microflora natural a las bajas concentraciones de nutrientes existentes en muchos medios acuticos naturales (Burton e: al., 1987; Gerba y McLeod, 1976; Goyal y Adams, 1984). Algunos estudios realizados con E. cot y otras bacterias entricas han demostrado que, bajo condiciones de inanicin, se produce una evolucin hacia un estado no cultivable, aunque las bacterias permanecen viables y en algunos casos capaces de producir procesos patolgicos en animales de laboratorio (Munro et aL, 1987; Roszak e: aL, 1984; Tamplin y Colwell, 1986; Xu e: al., 1982). Bajo estas condiciones de falta de alimento se pueden producir modificaciones fisiolgicas ms o menos intensas. Entre stas seincluyen la prdida de algunas caractersticas metablicas y el aumento de otras actividades celulares (Munro e: al., 1987), la variacin de la sensibilidad a metales pesados, bacterifagos, antibiticos y colicinas (Chal, 1983; Munro e: aL, 1987) y algunas alteraciones de las envueltas celulares (Munro e: aL, 1987; Zaske e: aL, 1980). Otras especies, como Pseudomonas, son ms resistentes a la inanicin y pueden sobrevivir, mantenindose en gran nmero durante das, en ambientes pobres en nutrientes, incluso en tampn fosfato (Sinclair y Alexander, 1984). No obstante, la resistencia a la inanicin es una condicin necesaria pero no suficiente para la supervivencia de especies en ambientes pobres en nutrientes o de especies que no compiten bien por los aportes limitados de nutrientes, porque entran en juego todos los dems factores (Sinclair y Alexander, 1984). La viabilidad prolongada depende de la regulacin del metabolismo endgeno. En ausencia de sustratos exgenos, son metabolizados constituyentes intracelulares (aminocidos, protenas, RNA), lo que aumenta la capacidadde supervivencia de la clula (Granai y Siogren, 1981; Jones y Rliodes-Roberts, 1981; Sjogren y Gibson, 1981). De acuerdo con los parmetros de crecimiento hay dos grupos de microorganismos: uno, constituido por los que poseen capacidadpara desarrollarse en los medios con una concentracin muy baja de principios nutritivos, por lo que estn adaptados a las condiciones que imperan en las aguas oligotrficas continentales, y otro, formado por los microorganismos adaptados a las

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altas concentraciones de nutrientes, que se dan, por ejemplo, en las aguas eutrficas y en los sedimentos ricos en las mencionadas sustancias. Las bacterias pertenecientes al ltimo grupo permanecen inactivas, en gran parte, en las aguas oligotrficas, pero pueden sobrevivir en ellas. Los microorganismos que pueblan las aguas, estn supeditados tambin, en mayor o menor medida, a los productos metablicos de los animales y plantas presentes en ellas en una cuanta diversa (Sinclair y Alexander, 1984). Los productos extracelulares de las algas son utilizados por numerosos microorganismos (Bel, 1983; Brock y Clyne, 1984; Daft y Fallowfield, 1977; Fallon y Brock, 1979; Lovel y Konopka, 1985 b, e, d; Murray et aL, 1986,1987; Stock y Ward, 1989) y las propias algas tambin se pueden convertir en fuente de nutrientes al morir (Daft y Fallowfield, 1977; Stock y Ward, 1989). Las bacterias hetertrofas han sido reconocidas como importantes componentes en el funcionamiento de ecosistemas acuticos, utilizando una parte significativa de la materia orgnica formada por los productores primarios (Azam e: aL, 1983; Ducklow et al., 1982; Fubrman y Azam, 1980; Griffith y Hetcher, 1990; Servais e: al., 1985; Zinabu y Taylor, 1989 a), aunque en proporciones muy diversas dependiendo de su composicin y de la Influencia de otros factores (Albrigtit y McCrae, 1987). As Bel y Kuparinen (1984) observaron en el lago ErIcen (Suecia), que habla una utilizacin bacteriana relativamente baja de productos carbonatados algales, debido a las bajas temperaturas y al elevado peso molecular de los mismos. Lovel y Konopka (1985 b) advirtieron que el aumento de la produccin primaria iba seguido de un aumento de la produccin bacteriana. McFeters a aL (1978 a,b) observaron que exista una relacin simbitica entre bacterias indicadoras y patgenas y comunidades de algas en agua dulce oliigotrfica. Nagata (1984) cita que la biomasa bacteriana est controlada por el fitoplaneton, mediante la incorporacin por parte de las bacterias de productos algales extracelulares. Zinabu y Taylor (1989 a) observaron una correlacin positiva entrela produccin primaria, la concentracin de clorofila a y la abundancia y la biomasa bacterianas, sobre todo en las muestras de la zona ftica. Parece ser que la supervivencia de bacterias entricas es mayor en sedimentos, hecho que algunos autores atribuyen a una mayor concentracin de materia orgnica en ellos (Burton e: al., 1987; Gerba y McLeod, 1976; Goyal y Adams, 1984). Pero, como veremos ms adelante, hay que tener en cuenta que estos productos no slo tienen gran inters como principios nutritivos, que por tanto favorecen el crecimiento microbiano, sino que tambin pueden ser sustancias inhibidoras, pudiendo actuar sobre algunas especies o sobre grupos enteros de microorganismos. En ambientes acuticos naturales existe

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gran cantidad de compuestos orgnicos que producen inhibicin bacteriana y de muchos de ellos no se conoce an la identidad (Klein y Alexander, 1986; Sinclair y Alexander, 1984). Gases disueltos En las aguas hay tambin pequeas cantidades de gases disueltos que pueden ejercer una influenciamuy considerable sobrela vida de los microorganismos. Son principalmente oxigeno, CO2 y nitrgeno, pero, en determinadas ocasiones, hay que sealar tambin la presencia de SH2 y CO. La solubilidad de todos ellos disminuye al aumentar la temperatura y es mayor en el agua dulce que en la del mar. El oxigeno, el dixido de carbono y el nitrgeno estn pasando constantemente del aire al agua, hasta que se satura la capa superficial de sta, la nica que puede realizar este intercambio con el aire. Adems todos estos gases disueltos pueden formarse en el agua en virtud de distintos procesos bioqumicos. En las aguas vamos a encontrar principalmente microorganismos aerobios y anaerobios facultativos. Pero en el hipolimnion y sedimento anxicos de algunos lagos y embalses eutrficos van a desempear un papel importante los anaerobios estrictos. El 5112 es estable nicamente en medio anaerobio, donde puede aumentar su concentracin gracias a la actividad microbiana. Es un veneno respiratorio por fijar el hierro de la citocromooxidasa. Su efecto es mortal para todos los organismos que poseen esta enzima al final de la cadena respiratoria. Por lo tanto la presencia de 5112 tiene siempre como consecuencia la alteracin total de la biocenosis, ya que van a desaparecer todos los seres vivos superiores y la mayora de los microorganismos, desarrollndose en su lugar algunos microorganismos que lo toleran y otros que lo utilizan como fuente de energa (sulfobacterias quimioauttrofas) o como donador de H2 (sulfobacterias prpura y clorobacterias).

1.3. INFLUENCIA DE LOS FACTORES BIOLOGICOS Adems de los factoresfsicos y qumicos, hay otros de naturaleza biolgica que producen tambin efectos sobre los microorganismos de las aguas. Pero los factores biticos son mucho

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menos conocidos que los abiticos porque su determinacin resulta, casi siempre, mucho ms difcil (Fllnt, 1987) Competencia alimentaria La competencia alimentaria desempea un papel importante en todos los biotopos e influye decisivamente sobre la composicin de la microflora (Awong et aL, 1990; Jannasch, 1968). Acaban por imponerse los microorganismos que alcanzan con mayor rapidez los nutrientes disponibles. En general, los alctonos pueden competir difcilmente con los autctonos, a los bajos niveles de nutrientes existentes en los medios acuticos naturales poco contaminados (Cornax e: al., 1990; Rhodes y Kator, 1988; Sinclair y Alexander, 1984), y esto se ha demostrado como un factor que contribuye a la muerte de estas bacterias alctonas entre las que se encuentran las entricas (McCambridge y McMeekin. 1980 a, 1981; Rhodes y Kator, 1988; Sinclair y Alexander; 1984). Sinclair y Alexander (1984) observaron una rpida disminucin de S:rep:ococcusen aguas residuales en las que, aunque existe una concentracin alta de nutrientes orgnicos, hay una intensa competicin por los mismos. Pero no todos los seres que consumen los mismos alimentos compiten entre s; algunas sustancias slo pueden ser utilizadas cuando existe una cooperacin entre varias especies. La competencia alimentaria carece de importancia cuando concurren condiciones extremas; por ejemplo, en aguas con valores extremos de temperatura, concentracin salina o pH, slo algunas especies son capaces de utilizar los alimentos disponibles. Cooperacin entre microorganismos Es frecuente observar cooperacin entre diversos microorganismos en relacin con la alimentacin y el crecimiento. Por ejemplo, en cultivos puros y libres de bacterias, se obtiene una tasa de crecimiento baja de Oscilla:oria redekei, debido a que, en condiciones normales de crecimiento, se liberan algunas sustancias, principalmente compuestos nitrogenados, que a concentraciones elevadas inhiben su crecimiento. Sin embargo, si en el medio existen bacterias que utilicen estos compuestos, la tasa de crecimiento es claramente ms alta. Tambin es frecuente observar una cooperacin entre microorganismos en la degradacin de sustancias difcilmente atacables. Al desarrollo de microorganismos que disponen de sistemas enzimticos capaces de desdoblar estas sustancias, le sigue el de otros que utilizan los productos

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de esta escisin, lo que sirve para evitar que se acumulen productos txicos del metabolismo. Predacin Hay gran nmero de seres vivos que se alimentan de microorganismos y por tanto pueden hacer que vare notablemente la microflora de las aguas. Para que stos constituyan una base importante como factores de nutricin es preciso que su nmero sea suficientemente elevado, como ocurre en aguas contaminadas (Klein y Alexander, 1986). La predacin por protozoos es importante en la dinmica de los sistemas acuticos, por la regeneracin de grandes cantidades de nutrientes y por la transferencia de energa a niveles trficos superiores (Azam et al., 1983; Jtirgens y (lUde, 1991); por tanto, los protoz8os constituyen un eslabn en la cadena alimentaria, de la que son importantes miembros (Fenchel, 1982 b; Porter ej aL, 1985; Rivier e: aL, 1985; Watson e: aL, 1981). Es, adems, un importante factor de eliminacin de bacterias, tanto autctonas como alctonas, en algunos sistemas acuticos y terrestres (Cornax et aL, 1990; Enzinger y Cooper, 1976; Klein y Alexander. 1986; Mallory e: al., 1983; McCambridge y McMeekin, 1979, 1980 a, 1981; McManus y Furman, 1988; Nagata, 1984; Pace, 1988). Algunos estudios muestran la predacin por protozoos como el factor ms importante en la desaparicin de E. coli en agua de mar (McCambridge y McMeekin, 1979, 1980 a), aunque otros autores sugieren que esto es debido a que las propiedades fsicas y qumicas de las aguas marinas afectan la capacidad de las bacterias entricas para competir con los microorganismos autctonos (Enzinger y Cooper, 1976). La mayora de los protozoos se alimentan de bacterias, al menos parcialmente. Algunos autores citan que los protozoos en el mar parecen utilizar bacterias como principal fuente de alimento, principalmente los flagelados (Bj0rnsen e: al., 1986; Fenchel, 1982 a; Garca-Lara e: aL, 1991; Gonzlez e: aL, 199Gb; Rassoulzadegan y Sheldon, 1986; Sherr e: aL, 1987; Sibbald y Albright, 1988; Wikner e: aL, 1986; Wright y Coffin, 1984), por lo que pueden ejercer un importante control sobre el desarrollo de las poblaciones bacterianas (Andersen y Fenchel, 1985; Andersen y S0rensen, 1986; Fenchel, 1982 b; Rassoulzadegan y Sheldon, 1986; Rivier et al., 1985). Sin embargo, su importancia en agua dulce no est todava bien comprendida (Bj0rnsen e: al,, 1986), pero no se consideran el inico factor determinante (Seale e: al., 1990). Respecto a los ciliados, varios autores aseguran que suelen estar restringidos a ambientes ricos en bacterias, por lo que es improbable que en aguas abiertas sean responsables del control de las poblaciones bacterianas (Andersen y S0rensen, 1986; Fenchel, 1980 a, <1. Algunos autores citan

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la predacin como uno de los factores que influyen en la desaparicin de blooms producidos por cianobacterias (Daft el al., 1985 a; Daft y Fallowfield, 1977; Fallon y Brock, 1980). La tasa de consumo depende de varios factores, entre los que se pueden destacar los siguientes: Tipo de protozoo y estado de crecimiento (Fenchel, 1980 b, c, 1982 b; Sherr e: al., 1988). La concentracin de bacterias (Fenchel, 1980 a, b, c, 1982 b; Pedrs-Ali y Brock, 1983 b; Rivier e: al., 1985; Sherr e: al., 1983). Algunos autores sugieren que la persistencia de determinadasespecies bacterianas puede serel resultado de una densidad de supervivencia demasiado baja para soportar la predacin (Klein y Alexander, 1986; Sinclair y Alexander, 1984; Watson e: al., 1981). El tamao de las bacterias. Algunos autores han observado que los protozoos bactervoros, tanto flagelados como ciliados, ingieren preferiblemente las clulas bacterianas ms grandes en una poblacin mixta (Gonzlez e: al., 1990 b). En algunos casos se ha observado que la predacin est favorecida si las bacterias forman microagregados o si se concentran en interfases (River e: aL, 1985). La especie bacteriana. Algunos autores han observado que los protozoos bacterivoros no consumen necesariamente bacterias de diferentes especies con igual eficiencia (Mitchell e: al., 1988). Gurijala y Alexander (1990) sugieren que las bacterias con superficies celulares ms hidrofbicas son ms resistentes a la predacin, quizs por su adsorcin sobre material particulado
-

Otros factores como la temperatura del agua (Caron et al., 1986; McCambridge y McMeekin, 1980 b; Sherr e: al., 1983, 1988) o la luz que puede estimular la actividad predatoria de algunos protozoos, como por ejemplo Vexill<fera, una ameba predadora de E. coU que aumenta su locomocin y su actividad alimentaria en presencia de radiacin solar (Rhodes y Kator, 1990).

La predacin puede ser tambin importante desde otro punto de vista. King e: al. (1988) mostraron que las bacterias ingeridas por protozoos podan resistir la digestin y demostraron la supervivencia diferencial de bacterias dentro de protozoos durante la cloracin; estas bacterias no digeridas pueden ser expelidas despus de un tiempo. Gonzlez e: al. (1990 a) tambin observaron tasas de digestin distintas segn la especie bacteriana de que se trate.

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Muchos metazoos se alimentan tambin de bacterias, hongos y fitoplancton en mayor o menor medida. Tanto rotferos como pequeos crustaceos son consumidores importantes de fitoplancton y bacterioplancton (Lair, 1991 a, b; Nagata, 1985), siendo su presin predatoria sobre el fitoplancton normalmente mayor en lagos oligotrficos que en eutrficos (Lair, 1991 b). La intensa actividad predatoria de los rotferos puede ser un factor importante que influya sobre la sucesin estacional de las comunidades planctnicas (Lair y Ah, 1990). Los microorganismos pueden ser tambin importantes para la alimentacidn de anlidos y de larvas de insectos que viven en los ros y lagos. Las bacterias pueden desempear un papel importante en la alimentacin de coppodos y de las larvas de langostas. Infeccin La presencia de bacterifagos se ha comprobado tanto en las aguas continentales como en el mar y se ha sugerido que juegan un papel significativo en la mortalidad bacteriana (GarcaLara e: al., 1991), aunque para otros autores no son un factor principal en la regulacin de las densidades bacterianas (Sanders y Porter, 1986). Son particularmente abundantes en las aguas residuales (Hicks y Rowbury, 1987), debido a que en ellas las densidades bacterianas son mayores (Klein y Alexander, 1986; Wiggins y Alexander, 1985). De all se aislan con frecuencia colifagos. as como bacterifagos que infectan a bacterias patgenas para el hombre como Salinonella y Shigella. Se han encontrado tambin algunos especializados en bacterias autctonas de las aguas. Tambin existen actinofagos que atacan a los actinomicetos y parecen tener una especificidad muy acusada. Los cianofagos, cuyos organismos hospedadores son las cianobacterias, desempean a menudo un papel en la desaparicin repentina de sus florecimientos en lagos y embalses cutrficos (Daft e: al., 1985 b; Fallon y Brock, 1980). En las aguas, tanto dulces como saladas, se encuentra tambin un parsito estricto dc bacterias: Rdellovibrio. Es una bacteria pequea, en forma de coma, Gram negativa, que inifecta a otras bacterias Gram negativas. Se han descrito tres especies: 8. bacteriovorus, 8. starhi y B. s:alpti. Lo mismo que los bacterifagos, se encuentra especialmente en aguas contaminadas, en las que la concentracin bacteriana es alta. No existe acuerdo sobre su papel en el control de la dinmica de las poblaciones bacterianas. Aunque es ms probable que su accin sea ms importante en agrupaciones de bacterias en interfases o sobre partculas, Sanders y Poner (1986) observaron que no era un factor principal en la regulacin de las densidades bacterianas.

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Sustancias inhibidoras Se ha comprobado la existencia de sustancias con accin bactericida en aguas continentales y de mar producidas principalmente por algas. Si existen florecimientos de fitoplancton pueden alcanzar concentraciones efectivas, por lo que stos pueden ir acompaados de un acusado descenso del nmero de bacterias saprofitas (IClein y Alexander, 1986). A.lbright el al. (1986) y Cooper er aL (1985) observaron en cultivos de distintas algas, entre las que se encontraba Skele:onema cos:a:um, que las sustancias inhibidoras del crecimiento bacteriano se producan en concentraciones particularmente altas cuando las algas se encontraban hacia el final del crecimiento exponencial. Los antibiticos, producidos por actinomicetos y hongos, tambin pueden ejercer ocasionalmente influencia sobre la microflora en reas muy limitadas, principalmente en los sedimentos, en plantas y animales muertos y en partculas en suspensin; pero, por regla general, no tienen influencia sobre los microorganismos que estn libres en las aguas. Muchas cianobacterias pueden liberar tambin sustancias que inhiben a otras especies, y no slo pueden actuar sobre bacterias, sino que en ocasiones hay florecimientos de cianobactexias que producen la muerte de peces y tambin procesos patolgicos en baistas. Son importantes tambin las bacteriocinas, protenas antibacterianas producidas por bacterias; dentro de stas se encuentran las colicinas, activas frente a coliformes (Hardy, 1982). Se ha implicado a sustancias tipo bacteriocinas en la disminucin de coliformes en sistemas de distribucin de agua potable <Means y Olson, 1981).

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1.4. ADRESION MICROBIANA A SUPERFICIES

Los ambientes naturales contienen un gran nmero de superficies potencialmente disponibles para la adhesin y colonizacin por microorganismos (Breznak, 1984; van Loosdrecht e: aL, 19%). As, en estudios de ecologa microbiana en habitats acuticos se observa frecuentemente adhesin de bacterias a partculas o, en general, a interfases (Characidis, 1984; Hoppe, 1984). La naturaleza de estas partculas es muy variada; pueden ser orgnicas, inorgnicas, artificiales, de animales y plantas vivos o muertos (Beech y Gaylarde, 1989; Breznak, 1984; Costerton y Cheng, 1982; Gordon, 1987; Vanhaecke et al., 1990). Aunque las superficiesproporcionan comnmenteun lugar para la adhesin de bacterias acuticas, exmenes microscpicos revelan que no todas las partculas en algunos biotopos acuticos estn colonizadas. En estos ambientes naturales slo una parte de las partculas presentes est normalmente colonizada por bacterias en un grado considerable. Por otra parte las determinaciones de los porcentajes de clulas que se encuentran adheridas, muestran grandes discrepancias; mientras que para algunos autores las bacterias adheridas exceden en nmero a las libres (Costerton y Geesey, 1979 a; Geesey el al., 1918), para otros es al contrario (Clarke y Joint, 1986; Harvey y George, 1987; Iriberri et aL, 1987, 1990 a, b; Yoon y Rosson, 1990), aunque s parece existir un acuerdo sobre que en agua de mar predominan las bacterias libres, mientras que en agua dulce y de estuario la proporcin de adheridas es variable, pudiendo llegar a ser ms significativa (BeIl y Albright, 1982; Goulder, 1977; Iriberri, 1990 b). Parece que el nmero y la naturaleza de las partculas y sus capacidades de adsorcin son decisivas sobre la adhesin (Hoppe, 1984; Iriberri eral., 1987). Muchas partculas e interfases no proporcionan las condiciones necesarias para la competicin con xito de las bacterias adheridas con las libres. Tambin es importante la composicin de la poblacin microbiana dominante, porque bacterias bien adaptadas a bajas concentraciones de nutrientes en el agua no se beneficiarn significativamente de la vida en adhesin (Hoppe, 1984).
1.4.1. RAZONES QUE WSTIFICAN LA ADHESION

La tendencia microbiana a la adhesin se ha explicado por distintas razones que suponen una serie de ventajas, importantes desde el punto de vista ecolgico, para las bacterias que se encuentran adheridas a partculas (Costerton y Cheng, 1982)

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Altas concentraciones de nutrientes en las superficies El material orgnico adsorbido a las partculas crea una acumulacin local de posibles nutrientes de los que las clulas podran beneficiarse. Esta adsorcin de nutrientes puede hacer de las partculas un ambiente ms rico nutricionalmente paralos microorganismos, lo que hace que esta localizacin parezca ideal para el crecimiento bacteriano (Costerton y Cheng, 1982; DeFlann e: a/., 1990; Fletcher, 1980 It 1984; Goulder, 1977; llendricks, 1974; Kjelleberg e: a/,, 1982; Pedrs-Aii y Brock, 1983 a; Pringle y Fletcher, 1983). Adems parece ser que las bacterias adheridas pueden ver aumentada su capacidad para usar tambin como nutnentes compuestos no cargados, de bajo peso molecular, que pueden no acumularse en las superficies (Breznak, 1984).

Mantenimiento de unas condiciones nutricionales favorables La superficie colonizada puede proporcionar, no solamente altas concentraciones de nutrientes, sino el mantenimiento de estas ventajas nutricionales. En algunos casos la propia superficie es comestible; las partculas colonizadas por las bacterias son frecuentememte orgnicas, en muchos casos pueden ser identificadas como restos de algas o bolas fecales de zooplancton (Pedrs-Ali y Brock, 1983 a). Otro caso es el de la adhesin a superficies vegetales, que no slo servirn como una superficie de adhesin y de concentracin de nutrientes disueltos, sino que adems podrn actuar como sustrato o fuente de nutrientes por su biodegradacin (Bobbie e: aL, 1978) o por el aprovechamiento de sus exudados orgnicos (Costerton y Cheng, 1982) Muchas veces se forman agregados de diferentes especies, bacterianas y no bacterianas, originndose un consorcio estratificado en ocasiones extraordinariamente complejo (Breznak, 1984; Costerton e: aL, 1987; Glbert e: aL, 1989; Hirsch, 1984). En l las bacterias se podrn beneficiar de la materia orgnica disuelta liberada por las actividades de otras bacterias (Pedrs-Ali y Brock, 1983 a) y otros organismos adheridos (Stock y Ward, 1989). Se pueden formar, incluso, micronichos que permitiran a bacterias anaerobias como, por ejemplo, las sulfato-reductoras, obtener anaerobiosis incluso en un agua rica en oxgeno (Characklls, 1984; Costerton y Cheng, 1982; McFeters, 1984; Wbite, 1984).

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Proteccin frente a factores adversos La envoltura exopoilsacrida externa protege a las bacterias, como veremos ms adelante, frente a agentes externos fsicos, qumicos y biolgicos y frente a las condiciones fluctuantes y a menudo estresantes del medio circundante (Cheng e: aL, 1981; Fletcher,1980 b, 1984; Wliite, 1984). Se ha observado que la supervivencia de las bacterias mejora si stas estn adheridas a partculas (Breznak, 1984; .leffrey y Paul, 1986 a, b; Silverman e: al., 1984).

1.4.2. MECANISMOS DE ADHESION Una bacteria puede adherirse a una superficie slida, bsicamente de dos maneras: Adhesin pasiva La adhesin pasiva tiene lugar por un proceso espontneo determinado por adsorcin fsico-qumica que no requiere actividad fisiolgica por parte de la bacteria. Esta adhesin tiene lugar, por ejemplo, cuando las bacterias que se adhieren han muerto por radiacin ultravioleta, calor o formaldebido (Fleteher, 1980 a, 1983, 1987; Paul, 1984). Bajo este punto de vista la adhesin de una bacteria a una superficie slida depende de las fuerzas de atraccin entre las dos superficies (Rutter y Vincent, 1980, 1984). Al mismo tiempo pueden tener lugar fuerzas de repulsin que pueden contrarestar la interaccin de atraccin o incluso inhibir la adhesin. Estas fuerzas fisico-qumicas de atraccin y repulsin incluyen (McEldowney y Fletcher, 1986 b): fuerzas de largo alcance: interacciones electrostticas fuerzas de van der Waals fuerzas de corto alcance: interaccin dipolo-dipolo enlace qumico (electrosttico, covalente,puentede hidrgeno) interacciones hidrofbicas La mayora de las bacterias tienen una carga neta negativa como la mayora de las superficies slidas (McEldowney y Pletcher, 1986 b; Wardell, 1988), por tanto la repulsin electrosttica entre superficies de igual carga tender a evitar una estrecha aproximacin entre superficies (Rutter y Vincent, 1984). Si la repulsin es lo suficientemente fuerte, no tendr lugar la

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adhesin. Que la repulsin evite as la adhesin depende del balance entre fuerzas opuestas de atraccin y repulsin (Marshall e: aL, 1971; Rutter y Vincent, 1984). Algunos autores sugieren que la adhesin se produce por este mecanismo por diversos motivos. La influencia de los cationes sobre la adhesin se puede explicar en trminos de efectos electrostticos y por una disminucin del grosor de la doble capa elctrica (Marshall e:al., 1971). La presencia de sustancias orgnicas disueltas en el medio tambin puede inhibir la adhesin bacteriana (Fletcher, 1976; Fletcher y Loeb, 1979; Marshall e: al., 1971) por la adsorcin de la sustancia sobre la superficie, hacindola menos favorable para la adhesin microbiana a travs de efectos estticos o por afectar la hidratacin de la superficie, convirtiendo una superficie favorable en una desfavorable (Fleteher y Loefr 1979). Adhesin activa La adhesin activa es la que tiene lugar por contribucin fisiolgica de las bacterias. En ocasiones la adhesin es un proceso dependiente del tiempo (Busscher e: al., 1986; Pletcher y Marsball, 1982 1,; Marahail, 1980; Marshafl e! al., 1971; McEldowney y Fletcher, 1988 14 en el que durante la fase inicial las bacterias pueden ser fcilmente lavadas de la superficie, pero despus se vuelven firmemente adheridas y resisten el lavado (Fletcher, 1983; Marshall, 1980; Marshall e: aL, 1971; Rutter, 1984). Estas dos etapas se han descrito como adhesin reversible e irreversible (Marshall et aL, 1971) y se cree que la adhesin firme depende de un adhesivo extracelular polimrico que une la bacteria a la superficie (Fletcher, 1983; Iman a aL, 1984; Marshall, 1980; McEldowney y Fletdher, 1988 b; Pedrs-All y Brock, 1983 a; Rutter, 1984). Algunos estudios han encontrado que ciertos inhibidores metablicos, incluidos antibiticos e inhibidores de la sntesis de protenas, son efectivos en inhibir la adhesin (Fletcher, 1980 a; Paul, 1984). Adems se han descrito casos en los que las clulas bacterianas son capaces de responder ante la presencia de superficies, por ejemplo i/ibro parahaemoly:icus induce la sntesis de flagelos laterales cuando entra en contacto con una superficie (Silverman e! a)., 1984).

Pero en la mayora de los estudios de adhesin bacteriana no ha sido posible dilucidar si la adhesin estaba determinada slo por adsorcin fsico-qumica o dependa del metabolismo bacteriano. En muchos casos el proceso parece estar conforme con las predicciones fisicoqumicas; sin embargo cuando los resultados experimentales no estn de acuerdo con las

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predicciones tericas, es probable que la fisiologa de las bacterias o la complejidad qumica y estructural de sus superficies estn jugando un papel principal (Fletcher, 1987). Wardell (1988) afirma que la interaccin inicial entre la clula bacteriana y la superficie es el resultado de fuerzas fsico-qumicas, principalmente fuerzas de atraccin de van der Waals y fuerzas electrostticas de repulsin, y que posteriormrnte estn implicados adhesivos polimricos. Lo mismo sucede cuando se estudia el efecto de los distintos factores sobre la adhesin; es raramente posible confirmar si el factor analizado influye sobre la adhesin afectando a la fsico-qumica del proceso, a la fisiologa de la bacteria o a ambas (Fletcher, 1988). Adems, la mayora de los datos sobre los efectos de distintas variables, como los componentes del medio, son consistentes tanto con los mecanismos de adhesin pasiva como activa (Fletcher, 1980 a). Por ejemplo, Fletcher (1983) observ que el butanol inhiba la adhesin de Pseudomonas a placas Petri, pudiendo deberse esta accin a la adsorcin del alcohol sobre la superficie de la placa, o a que las bacterias se volvan inmviles, ya que en experimentos previos se haba observado que la eliminacin de flagelos disminua la adhesin de esta bacteria (Fletcher, 1977, 1983). Otros alcoholes, sin embargo, aumentaban la adhesin probablemente debido a una modificacin de la fisiologa de la clula y/o de las caractersticas de la superficie bacteriana (Fletcher, 1983). Estudios realizados con microscopia electrnica han demostrado que en la adhesin estn implicados polimeros estructurales y que la mayora de las comunidades adheridas estn inmersas en una matriz estructural que mantiene unida al sustrato a la comunidad entera (Cheng e: aL, 1981; Real y Costerton, 1987). La histoqulmica ultraestructural ha mostrado que estos polimeros son en su mayor parte polisacridos (Cheng e: al., 1981; Fletcher, 1987; Read y Costerton, 1987) que toman la forma de fibrillas o de material amorfo, que se extiende entre la clula y la superficie, o de matrices hidratadas tipo gel en las que estn embebidas multicapas de clulas. Pero la microscopia no revela qu grupos especficos estn implicados ni proporciona una informacin detallada acerca de la composicin o conformacin de estos polmeros. Aunque los polisacridos parecen ser abundantes, otros polmeros, particularmente protenas, parecen estar implicados en la interaccin adhesiva (Fletcher, 1980 b, 1987; Robb, 1984). Se ha intentado identificar y caracterizar los polimeros que actan realmente como adhesivos mediante investigaciones bioqumicas, pero es difcil obtener suficiente polmero (Christensen e: al., 1985; Sutherland, 1980); en la mayora de los casos ste se ha aislado del medio de cultivo lo que indica que estara disociado de las clulas y seria soluble en agua, por

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lo que Fletcher (1987) piensa que quizs no fueran autenticos polimeros adhesivos que, intuitivamente, cabra esperar que permanecieran asociados a las bacterias. Tambin se han realizado estudios mediante digestiones enzimticas y tratamientos qumicos disruptores, que han proporcionado datos numerosos y en ocasiones conflictivos. Es interesante que, a pesar de las fuertes indicaciones de que los polisacridos son los implicados en la adhesin, las digestiones enzin4ticas han tendido a demostrar que las proteasas son ms efectivas, que las enzimas que degradan carbohidratos, en retirar a las bacterias de las superficies (Hetcher y Marshall, 1982 b; McEldowney y Fletcher, 1986 a; Paul y Ieffrey, 1985 a). Esto sugiere que las protenas de la superficie bacteriana pueden ser importantes al menos en estabilizar las interacciones adhesivas, si no actan como adhesivos reales (Fletcher, 1987; Robb, 1984). Tambin se ha conseguido romper la adhesin por tratamientos con algunos compuestos qumicos, por ejemplo, el peryodato, que degrada carbohidratos (Fletcher, 1980 It McEldowney y Fletcher, 1986 a), por secuestradores de cationes y por surfactantes (McEldowney y Fletcher, 1986 a, b). Puede ser que el tipo de polmero activo en la adhesin dependa de las propiedades del sustrato y por tanto de los tipos de interacciones posibles; as, sobre un sustrato hidrofbico pueden ser activos los constituyentes lipidicos o los grupos no polares de los polisacridos de la superficie bacteriana, mientras que sobreuna superficie hidroflica los adhesivos pueden ser los polisacridos hidratados (Fletcher, 1987; Fletcher y Marshall, 1982 b; Paul y Jeffrey, 1985 a, b). 1.42. ACTIVIDAD DE LAS BACTERIAS ADHERIDAS El efecto de la adhesin sobre la fisiologa bacteriana se ha investigado comparando las actividades de las clulas adheridas con las de sus homlogas libres en la fase lquida (Hreznak, 1984). Se ha sugerido en muchas investigaciones que la actividad fisiolgica puede ser distinta en las bacterias adheridas y en las libres, y se cree que las bacterias asociadas a partculas son responsables a menudo de una fraccin sustancial del metabolismo bacteriano en aguas en las que las partculas son abundantes (Edwards y Meyer. 1986; Griffith y Fletcher, 1990; Hollibaugh y Azam, 1983; Kirchman y Mitchell, 1982). Para detectar estas diferencias se han desarrollado numerosas tcnicas: medida del crecimiento (Kjelleberg et al., 1982, 1983), respiracin (Bright y Fletcher, 1983 a, b; Gordon e: aL, 1983), absorcin de sustrato (Bright y Fletcher, 1983 a, b; Gordon e: aL, 1983; Kirchman y Mitehell, 1982), produccin de calor (Gordon et al., 1983),

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cambio de tamao celular (Humphrey e: al., 1983; Kjelleberg e: aL, 1982, 1983). En cuanto a los resultados obtenidos no existe unanimidad. En muchos casos las poblaciones adheridas son ms activas (Hright y Fletcher, 1983 a, b; Fletcher, 1986; Humphrey e: aL, 1983; Jeffrey y Paul, 1986 a, b; Kjelleberg e: aL, 1982, 1983; Ladd e: aL, 1979; Murray e: al., 1987), mientras que en otros parecen ser ms activas las no adheridas (Gordon et aL, 1983; Iriberri et al., 1987). Cuando la actividad se expresa por clula, las bacterias asociadas a partculas son generalmente ms activas metablicamente que las bacterias no adheridas (Harvey y Young, 1980; Jriberri e: aL, 1987; Kirchman y Mitchell, 1982; Paer y Merkel, 1982). Harvey y Young (1980) utilizando sales de tetrazolio; concretamente el cloruro de 2-(paraiodofenil)-3(paranitrofenil)-5-fenil tetrazolio (NT), estimaron que el 95% de las bacterias respiratoriamente activas estaban adheridas a partculas. Es posible que estas diferencias estn relacionadas con variaciones en las interacciones entre el sustrato y la superficie y con el grado en el que el sustrato tienda a estar concentrado en la superficie por adsorcin (Fletcher y Marshall, 1982 b; Grifflth y Fletcher, 1991). Sustratos que se adsorben muy poco sobre la superficie de las partculas son hidrolizados en mayor grado por parte de las clulas no adheridas, mientras que las bacterias adheridas pueden tener un acceso reducido al sustrato debido a que ste est principalmente en solucin. Niveles de adsorcin relativamente bajos pueden presentarse con solutos de bajo peso molecular que tienden

a mantenerse en un equilibrio de adsorcin. Con sustratos que se adsorben sobre las superficies
la situacin es la contraria, debido, como sugieren algunos autores, a que la actividad enzimtica est favorecida en la superficie, bien por facilitar el contacto entre la enzima y el sustrato o bien por permitir cambios conformacionales en el sustrato o en las enzimas que favorezcan la hidrlisis (Grifflth y Fletcher, 1991). En ambientes naturales las superficies son rpidamente acondicionadas por compuestos orgnicos disueltos, la mayora de alto peso molecular (Griffith y Fletcher, 1991), incluso en aguas relativamente pobres en materia orgnica (Hunter y Liss, 1982; Rutter, 1984). Sin embargo, en estos ambientes naturales existe una mezcla compleja de molculas orgnicas, algunas de las cuales se adsorben ms fcilmente que otras, con lo que el resultado neto de la adhesin bacteriana a partculas es extremadamente difcil de predecir (Griffith y Fletcher, 1991). Si los experimentos se llevan a cabo a concentraciones de sustrato muy bajas, la mayor actividad resultante de las bacterias adheridas se debe a que son capaces de asimilar nutrientes escasos ms facilmente que las bacterias en suspensin, debido a que stos se adsorben en la

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interfase slido-liquido y pueden ser accesibles slo para las bacterias adheridas (Fletcher, 1984, 1986; Griffith y Fletcher, 1991; Kjelleberg et al., 1982; Pedrs-Ali y Brock, 1983 a). 1.4.4. FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE LA ADHTESION Se han realizado numerosos estudios para intentar probar los efectos de diferentes condiciones ambientales o fisiolgicas sobre la adhesin, pero ha habido mucha variacin en los resultados de estos estudios con respecto tanto a la capacidadde adhesin de diferentes especies, cepas o fenotipos bacterianos, como a la susceptibilidad de los mismos a factores modificantes (Fletcher, 1988). Sobre la adhesin bacteriana a superficies en un ambiente acutico pueden influir numerosos factores, que incluyen las propiedades de las superficies slidas, de las propias bacterias y de la fase lquida. Tendn superficial o energa libre de superficie de la superficie slida

La energa libre de superficie de una superficie slida es un indicador de la idoneidad de

esa superficie para la adhesin bacteriana, ya que indica la tendencia de un sustrato a tomar parte en distintos tipos de interaccin espontneamente (Fletcher y Marshall, 1982 a). Algunos autores encuentran que la colonizacin es mayor y ms rpida en las superficies con una tensin superficial baja, es decir liidrofbicas, como el poliestireno, que en las que tienen una

tensin superficial relativamente alta, hidroflicas, como el vidrio (Fletcher y Loeb, 1979; Paul
y Loeb, 1983; Paul y Jeffrey, 1985 b; Pringle y Fletcher, 1983; 1986 a; Samuelsson y Kirchman, 19%). Sin embargo, otros autores afirman lo contrario, obteniendo una adhesin mayor y ms firme, por tanto ms difcil de interrumpir, a superficies hidroflilcas (Absolom e: al., 1983; Dexter e: al., 1975; McEldowney y Fletcher, 1986 a; Pedersen e: al., 1986). Otros no han encontrado diferencias significativas entre ambos tipos de sustratos, es decir, no encuentran una preferencia absoluta por parte de las bacterias por superficies hidrofflicas o hidrofbicas (Baker, 1984; Fletcher, 1980 a; McEldowney y Fletcher, 1986 b; van Pelt e! al., 1985). Existen algunas razones que pueden justificar estas discrepancias. En primer lugar las diferencias en las comunidades bacterianas utilizadas; Fletcher y Loeb (1979) utilizan un solo microorganismo, una especie marina de Pseudomonas, en agua estril, mientras que Dexter y colaboradores (1975) realizan los experimentos con agua de mar natural. En ambientes naturales existe un gran nmero de distintos tipos de bacterias que colonizan superficies y,

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cuando est presente esta variedad de colonizadores bacterianos, la importancia de la tensin superficial de la superficie se reduce, puesto que diferentes bacterias colonizan los diversos tipos de superficies (Baker, 1984). Tambin pueden influir las distintas caractersticas de las superficies bacterianas, que varan enormemente de una especie o una cepa bacteriana a otra (Pedersen e: aL, 1986; Pringle et aL, 1983) y los cambios en las caractersticas del sustrato debido a la adsorcin de sustancias orgnicas que acondicionan su superficie cuando ste se encuentra sumergido (Pringle y Fletcher, 1983). Rugosidad de la superficie Geesey y Costerton (1979) observan que las bacterias adheridas se concentran principalmente en grietas de detritus, mientras que las zonas planas se encuentran casi desprovistas de micropoblacin adherida. Fletcher y Marshall (1982 b) afirman que las fuerzas de repulsin entre una superficie slida y una bacteria, son menores al disminuir el radio de curvatura de las superficies que se aproximan; por lo tanto, puede ser ms fcil para una bacteria entrar en contacto con ondulaciones de la superficie que con un plano completamente llano. Characklis (1984) afirma que la tasa de acumulacin neta de bacterias es mayor en

superficies rugosas por dos razones: primera, la desadhesn debida a fuerzas de arrastre estar
reducida, puesto que las clulas estn protegidas o resguardadas del flujo de la fase lquida, y segunda, estar disponible ms superficie de sustrato para contacto con la clula. Baker (1984) estudiando la adhesin a sustratos rugosos y lisos (portaobjetos de vidrio y trozos de placa Petri de poliestireno, rayados y sin rayar) encuentra que los rugosos son colonizados ms y ms rpidamente que los lisos. Pero esto no se debe ni a un aumento del rea disponible para ser colonizada, ya que la cantidad en que aumenta el rea no est directamente relacionada con el aumento del nmero de bacterias adheridas, ni a que las depresiones de las superficies rugosas puedan proporcionar un lugar ms protegido y, por tanto, ms favorable, puesto que las bacterias no se encuentran particularmente concentradas

en las depresiones, sino uniformemente distribuidas en toda la superficie. El autor sugiere que
las irregularidades de la superficie pueden servir como punto de anclaje de la matriz polisacarida extracelular o glicoclix. Carga de la superficie Cuando un slido se sumerge en un ambiente acutico, normalmente, adquiere una carga

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superficial, bien por adsorcin de iones o por la ionizacin de los grupos superficiales (Fletcher a aL, 1980). La carga de la superficie puede afectar a la concentracin de iones y
molculas cargadas sobre la superficie slida (Bright y Fletcher, 1983 a; Haack y McFeters, 1982).

Caractersticas de las molculas adsorbidas

Cuando una superficie slida se sumerge en un medio acutico, se adsorben rpidamente sobre ella sustancias presentes en solucin (Tosteson e: aL, 1985). Las macromolculas

generalmente se adsorben de manera irreversible y as, tienden a enmascarar las propiedades superficiales originales (Fletcher e: aL, 1980; McEldowney y Fletcher, 1987; Pringle y Pleteher, 1983, 1986 b). La adsorcin de grandes molculas puede conducir a cambios conformacionales que las haga ms accesibles o ms resistentes a la degradacin microbiana
(Bright y Fletcher, 1983 a). Sin embargo el punto hasta el que las macromolculas adsorbidas puedan oscurecer la qumica de la superficie del sustrato, no est claro (Pringle y Fletcher,

1986 b). Se ha observado que algunas macromolculas biolgicas alteran, a travs de la adsorcin, la idoneidad de una superficie para la adhesin bacteriana. Generalmente las protenas adsorbidas disminuyen la posterior adhesin bacteriana (Fletcher, 1976; Fletcher y Marshall, 1982 b) por convertirla en una superficie menos favorable para la adhesin a travs
de efectos estricos o por efectos de hidratacin de la superficie que pasa de hidrofbica

(favorable) ahidroflica (desfavorable) (Fletcher, 1980 a; Fletcher y Loeb, 1979; McEldowney

y Fletcher, 1987). Concentracion de nutrientes en la fase lquida Diversos autores afirman que la adhesin a partculas es beneficiosa para las bacterias en

condiciones de baja concentracin de nutuientes en el agua; en estos casos las bacterias pueden crecer ms fcilmente despus de haberse adherido a superficies, debido a que en ellas se concentran los nutrientes por adsorcin, siendo as ms accesibles(Hetcher, 1976; Pedrs-Aii y Brock, 1983 a), mientras que si la concentracin de nutrientes es alta pueden crecer predominantemente las Ubres (Pedrs-Alid y Brock, 1983 a?). Maushal et aL (1971) comprueban en una cepa marina de Pseudomonas que la adhesin depende de la concentracin de la fuente de carbono; a concentraciones bajas la adhesin est favoreciday al ir aumentando, la adhesin se ve reducida hasta resultar completamente inhibida. McEldowney y Fletcher (1986 a) observan que la presencia de nutrientes modifica los niveles

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de adhesin bacteriana a superficies, pero que el efecto vara dependiendo del sustrato y de la especie bacteriana, y afirman que los cambios en las concentraciones de nutrientes en hbitats acuticos naturales afectan a la adhesin de las especies bacterianas individuales de manera distinta, por lo que estas diferencias influyen en la composicin de especies del biofllm. Pedersen e: aL (1986) tambin observan que al aumentar la concentracin de nutrientes en el agua, disminuye marcadamente la adhesin bacteriana. Concentracin jnica del medio Frecuentemente se ha encontrado que los iones inorgnicos promueven la adhesin de las bacterias (Cowan y Fletcher, 1987; Goldberg e: al., 1990). Un ejemplo es el aumento de la adhesin de S:rep:ococcus faecium inducido por un aumento en la concentracin de cloruro sdico y cloruro potsico (Fletcher, 1980 a). Tambin se ha observado un aumento de la adhesin de Pseudomonas aeruginosa al acero inoxidable (Stanley, 1983) y de Vibrio alginolyllcus al hidroxiapatito (Gordon y Millero, 1984) al incrementarse la concentracin de electrolitos. Los cationes divalentes, particularmente Ca2~ y Mg2~, promueven o favorecen la adhesin de algunas bacterias marinas y se ha observado que la adhesin firme de una cepa marina de Pseudomonas en ausencia de estos cationes no se produce (Maushal e: aL, 1971). Los cationes trivalentes, como AI3~, favorecen la adhesin de estreptococos (Fletcher, 1980 a); por el contrario, La3~ y A13~ inhiben la adhesin de Pseudomonas (Fletcher, 1977, 1980 b). Los cationes pueden influir sobre la adhesin bacteriana de varias maneras: a) Sobre la fisiologa celular o la permeabilidad de membrana (Fleteher, 1980 b). Electrolitos como Ca2~ y Mg2~ intervienen en la fisiologa de las bacterias como importantes cationes celulares y cofactores en reacciones enzimticas (Fletcher, 1988) b) Por su acumulacin en la superficie y la fonnacin de una doble capa elctrica, influyendo por tanto sobre las fuerzas de repulsin entre la superficie bacteriana y del sustrato (Fletcher, 1980 b, 1988; McEldowney y Fletcher, 1986 b; Rutter y Vincent, 1980) y entre grupos negativos del polmero adhesivo, teniendo como resultado su condensacin y la atraccin de la clula hacia la superficie (Fletcher. 1988) c) Ayudando a mantener la integridad estructural de los polimeros adhesivos a travs de enlaces cruzados. Se ha demostrado, por examen al microscopio electrnico, que Ca2~ y Mg2~ pueden ser importantes en mantener la integridad estructural de la matriz polimrica

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intercelular, observndose que al transferir ntcrocolonias adheridas a medios deficientes en estos cationes, hay una desnaturalizacin casi inmediata del polmero (Fletcher y Floodgate, 1976) pH Se ha observado que una disminucin del pH causa un aumento de la adhesin (Stanley, 1983). Fletcher (1988) sugiere que la disminucin del pH reduce la disociacin de grupos aninicos, lo que tendra como resultado una disminucin de la repulsin electrosttica y permitira a las clulas moverse ms cerca de las superficies. Tambin se ha sugerido que el pH puede tener influencia sobre la viscosidad del polmero adhesivo bacteriano, siendo sta mayor a] disminuir el pH, con lo que aumenta la adhesin (Boyle y Reade, 1983; McEldowney y Fletcber, 1988 b>. Otros autores obtienen resultados diferentes segn la cepa bacteriana y el sustrato de que se trate (McEldowney y Fletcher, 1988 b). Especie o cepa bacteriana Pedersen et aL (1986) indican que el principal factor que influye sobre la adhesin es la especie bacteriana de que se trate. Las especies bacterianas difieren considerablemente en la calidad y cantidad de polmeros de la superficie celular, por tanto no es sorprendente que tambin vare su capacidad de adhesin al sustrato, as como la fuerza de la adhesin (Fletcher y McEldowney, 1984, Pringle y Fleteher, 1983). Tambin se pueden encontrar diferencias entre distintas cepas de la misma especie (Fletcher, 1980 a). En un sistema acutico natural, en el que existe una amplia variedad de especies bacterianas, la adhesin est influida por la composicin de la poblacin y puede diferir de la adhesin que presenta cada una de las especies en cultivo puro. Los resultados dependen de la combinacin de especies y de la secuencia de adhesin. En experimentos de laboratorio, tanto en pruebas de adhesin simultnea como secuencial, se ha observado que la presencia de una especie puede influir sobre la adhesin de otra aumentndola, disminuyndola o no teniendo efecto sobre ella, dependiendo de las bacterias y del sustrato de que se trate (McEldowney y Fleteher, 1987).

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Hidrofobicidad de la superficie bacteriana Diversos autores han comprobado en diferentes hbitats que las cepas con hidrofobicidad alta se adhieren mejor a las superficies (Fatton y Shilo, 1984; Hoog y OId, 1987). Las bacterias en ambientes acuticos son predominantemente Gram negativas y tales clulas pueden aumentar su hidrofobicidad en condiciones oligotrficas (Kjelleberg, 1984), lo que podra incrementar su capacidad para unirse a superficies hidrfobas (Breznak, 1984). Estado fisiolgico del fitoplancton Algunasalgas durante el crecimiento exponencial producen sustancias antimicrobianas; por eso, es frecuente observar que la proporcin de bacterias adheridas es mayor cuando comienza el crecimiento del fitoplancton o cuando est senescente, momento en el que se liberan compuestos orgnicos que son rpidamente utilizados por las bacterias hetertrofas (Bel y Albright, 1982). Estos autores observan que la clorofila a y la produccin primaria estn inversamente correlacionadas con el porcentaje de bacterias adheridas (Aibright e: al., 1986). Salinidad y concentracin de partculas La abundancia de partculas puede ser el determinante ms comn de la abundancia de bacterias adheridas en sistemas acuticos naturales (Pedrs-Ali y Brock, 1983 a). Dell y Albright (1982) encuentran que existe una correlacin positiva entre el nmero de partculas y el nmero de bacterias adheridas y negativa entre la salinidad y el nmero de bacterias adheridas. Otros autores tambin encuentran una correlacin positiva entre el nmero de partculas y el de bacterias adheridas (Iriberri et al., 1987; Palumbo e: al., 1984; Pedrs-Alid y Brock, 1983 a; Yoon y Rosson, 1990>, mientras que para otros (Albright e: al., 1986) no existe correlacin. Flujo bidrallco del sistema El flujo hidrulico y la velocidad de la corriente pueden influir sobre la abundancia de bacterias adheridas. Si el flujo es demasiado rpido, la mayora de la biomasa bacteriana se encuentra adherida a superficies (Fletcher y Marshall, 1982 a; Pedrs-Ali y Broclc, 1983 a), tendiendo a acumularse en depresiones o fisuras de las mismas (Fletcher, 1980 b; Fletcher y Marshall, 1982 a). Pedersen (1982 b) observa que al aumentar la velocidad de flujo, aumenta

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la produccin de biofilm. Otros factores

itt

vitro
iii

En la adhesin bacteriana anteriores:

-

vro tambin influyen otros factores, adems de los

Concentracin del cultivo: al aumentar la densidad de clulas del cultivo, aumenta el nmero de colisiones bacterianas con la superficie de adhesin, con lo que aumenta la oportunidad de adhesin (Fletcher, 1977; Pedersen e: aL, 1986). Tiempo de adhesin: del mismo modo que en el punto anterior, al aumentar el tiempo, aumenta el nmero de colisiones y por tanto la posibilidad de que se produzca la adhesin (Fletcher, 1977). Condiciones del cultivo: dentro de una cepa bacteriana dada, la adhesin puede variar al cambiar algunacaracterstica del cultivo, porejemplo limitacin de carbono o de nitrgeno o variacin en la fuente de carbono. Parece posible que estas variaciones en la capacidad de adhesin, inducidas por las distintas condiciones de crecimiento, sean debidas, al menos en parte, a diferencias asociadas con la composicin de la superficie celular (Fletcher y McEldowney, 1984). ya que los componentes macromoleculares de la superficie bacteriana varan en cantidad y composicin con las condiciones de crecimiento (McEldowney y Fletcher, 1986 a>. Edad del cultivo: la adhesin es mayor en la fase de crecimiento exponencial que en la estacionaria o en la de muerte, debido a que la etapa de crecimiento influye en la movilidad celular y en la calidad o cantidad de polimeros de la superficie celular (Fletcher, 1977; Harber e: al., 1983; Pedersen e: aL, 1986). El movimiento de las clulas es importante porque aumenta mucho la posibilidad de que una bacteria se encuentre con una superficie potencialmente colonizable y adems la energa cintica de las clulas mviles puede serimportante para vencer las fuerzas elctrostticas de repulsin que pueden existir entre la superficie bacteriana y la de adhesin (Fletcher, 1980 a; Harber e: aL., 1983; Marshall e: al., 1971). Stratford y Wilson (1990) afirman que, para que se produzca la adhesin, la energa de colisin debe ser alta, por lo que el movimiento browniano seria insuficiente para producir cotacto. Fletcher (1977) observa que los cultivos en fase

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logartmica tienen la mayor proporcin de clulas mviles. Fletcher (1980 a, b) comprueba que la adhesin de Pseudomnonos al poliestireno resulta inhibida al eliminar los flagelos. Harber y colaboradores (1983) estudiando la adhesin de E. coil al poliestireno, observan que las cepas que poseen fimbrias tipo 1 y flagelos se adhieren ms y mejor durante la fase exponencial; adems comprueban que las cepas adherentes pueden volverse no adherentes, simplemente inhibiendo la sntesis de los flagelos, por lo que deducen que la influencia de los flagelos puede deberse no slo a la movilidad de las clulas, sino a que los propios flagelos pueden estar directamente implicados en la adhesin. Iones e: al. (1981) comprueban asimismo que la movilidad promueve la adhesin de Salmonella typhimurtum a clulas HeLa. En cuanto a la produccin o secrecin de polimeros adhesivos por las bacterias, existe una evidencia apreciable de que est influida por la edad del cultivo y, puesto que estos pollmeros juegan un papel importante en la adhesin, sta se encontrar afectada por las variaciones que se produzcan en los mismos (Fletcher, 1977). Van Loosdrecht e: al. (1990) sugieren que el aumento de la adhesin en la fase logartmica puede ser debido a un aumento de la hidrofobicidad de la pared celular durante esta fase. 1.45. IMPORTANCIA DE LA ADHESION La adhesin bacteriana a superficies juegaun importante papel en una amplia variedad de situaciones, de las que aqu resumiremos algunas. 1.4.5.1. Ecolgica La adhesin de bacterias a sustratos slidos les puede conferir una ventaja en trminos de disponibilidad de nutrientes (Breznalc, 1984). Las bacterias que crecen sobre superficies en el medio ambiente desempean una labor beneficiosa debido a su papel en el continuo :urn-over de residuos orgnicos y minerales (Fletcher e: al., 1980).
-

La adhesin permite a las bacterias subsistir en un nicho nutricional adecuado. Adems la envoltura exopolisacaridica las protege de agentes ambientales perjudiciales y de condiciones desfavorables (Costerton y Cheng, 1982; McEldowney y Fletcher, 1987>.

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Las bacterias adheridas son ms resistentes a bacterifagos debido a que los polimeros extracelulares actan como barrerade proteccin (Hicks y Rowbury, 1987; Wrangstadh e: al., 1986). La existencia de agregados bacterianos puede determinar la dominancia de determinadas especies de microflagelados en un sistema, debido a que algunos se alimentan predominanremente de bacterias adheridas (Rodo sp.), mientras que otros consumen preferiblemente bacterias libres (Paraphysononas sp.) (Sibbald y Albright, 1988). Asimismo, aunque algunas especies de zooplancton se alimentan de bacterias libres (Pedrs-Ali y Brock, 1983 b; Sibbald y Albright, 1988), parece que las bacterias adheridas a partculas experimentan una presin de predacin mayor (Fenchel y J0rgensen, 1977; Rassoulzadegan y Etienne, 1981). La divisin microbiana en las interfases hidrocarburos lquidos-agua tiene una aplicacin en la degradacin del petrleo (Goldberg e: al., 1990; Rosenberg y Rosenberg, 1981).

1.45.2. Sanitaria Desde el punto de vista sanitario citaremos varios ejemplos entre los muchos que se pueden encontrar en la bibliografa: Las bacterias adheridas tienen una mayor resistencia al cloro y a otros desinfectantes utilizados para potabilizar el agua de abastecimiento (Berman ej al., 1988; Herson ej aL, 1987; LeChevallier e: aL, 1981, 1984 a; Ridgway y Olson, 1982; Ridgway e: al., 1984); esto puede provocar aumentos repentinos e inesperados en los recuentos de coliformes en sistemas de distribucin de agua potable (Goshko eta?., 1983; Hudson ez al., 1983) debido al crecimiento de bacterias adheridas a las paredes de las tuberas y a la presencia de coliformes en estos biofllms (LeChevallier e: aL, 1987). Asimismo la adhesin, sobre todo a partculas orgnicas, proporciona proteccin frente a la desinfeccin por radiacin ultravioleta, debido a que las bacterias adheridas estn menos expuestas y a que las partculas orgnicas absorben la radiacin (Quals e: al., 1983). Se ha observado que algunas bacterias patgenas que se pueden transmitir por aguas contaminadas, como por ejemplo el agente causante del clera ~/ibrio cholerae serogrupo 01, se encuentran en ellas adheridas a partculas, lo que aumenta su supervivencia (Tamplin e: al.,

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1990).
-

En numerosas infecciones la adhesin es un prerrequisito para la patognesis, ya que constituye una etapa inicial en la colonizacin de tejidos (Wyatt e: al., 1990). Algunos ejemplos son: * Los patgenos entricos colonizan el intestino delgado por medio de adhesinas de superficie que permiten a la bacteria fijarse a los tejidos humanos y animales, por ejemplo en la gastroenteritis por E. coli enterotoxignica (Lindahl y Carlstedt, 1990); se ha comprobado, en voluntarios humanos, que si esta bacteria carece de adhesinas, no es capaz de colonizar el intestino delgado y, por tanto, no produce la enfermedad (Walsh y Bissonnette, 1983). * En la pielonefritis por E. cali, las fimbrias P parecen ser un marcador de virulencia (Harber e: aL, 1983; R.hen, 1985). * La capacidad de Srzphylococcus aureus para adherirse a la mucosa nasal se considera como un factor que conduce a su colonizacin (Wyatt e: aL, 1990). * Las caries dentales se producen cuando bacterias anaerobias adheridas, comprendidas en la placa dental, producen cido que destruye el esmalte dental (Gibbons y van Houte, 1975). Los microorganismos adheridos, por ejemplo, a partculas de alimento, son mucho ms resistentes al cido gstrico que los no adheridos, por lo que la adhesin puede ser un factor importante en la supervivencia de estos microorganismos y por tanto su capacidad para producir la infeccin (Poynter e: aL, 1986) La resistencia de Pseudomonas aeruginosa a los mecanismos de defensa del husped se debe a la produccin de nilcrocolonias envueltas en exopolisacridos sobre la superficie de los tejidos de los rganos infectados (Baltimore y Mitchell, 1980; Lam e: aL, 1980; Marrie e:al., 1979; Schwartzmann y Boring, 1971); esto en muchos casos aumenta adems su resistencia a la terapia convencional con antibiticos y otros agentes antimicrobianos (Costerton y Cheng, 1982; Costerton e: aL, 1987; Gilbert e: aL, 1987, 1989; Wrangstadh e: aL, 1986). Se han descrito tambin numerosos problemas producidos por bacterias capaces de adherirse a distintos materiales utilizados en implantes biomdicos y dispositivos trascutneos, como por ejemplo catteres intravasculares y peritoneales y vlvulas cardiacas. 5. epidermidis infecta frecuentememte estos implantes (Hogt e:al., 1983). En una primera fase la bacteria se adhiere a la superficie del dispositivo; despus tiene lugar, por parte de ciertas cepas, la produccin de un polisacrido extracelular que, in vivo, forma un complejo con factores del husped

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dando lugar a una matriz extracelular que anda a las bacterias firmemente a las superficies de los implantes y las protege de las defensas del husped (Dunne y Burd, 1991). 1.43.3. Industrial Desde el punto de vista industrial la adhesin microbiana es importante tanto por los efectos perjudiciales que pueda ocasionar, como por los beneficiosos. Algunos de los efectos perjudiciales ms comnmente observados son: El desarrollo de microcolonias de algunas especies bacterianas sobre los metales puede constituir un foco de corrosin (Beech y Gaylarde, 1989; Costerton y Geesey, 1979b; Characklis, 1984; Gordon, 1987; Pedersen, 1982 a). Las bacterias que forman parte de microcolonias adheridas en sistemas acuticos industriales son, en muchas ocasiones, resistentes a biocidas (Costerton y Geesey, 1979b; Herson e: al., 1987; Lechevallier a aL, 1984 a; McEldowney y Fletcher. 1987; Wdgway e: aL, 1984; Ridgway y Olson, 1982). La adhesin de bacterias sobre superficies de procesamiento en fbricas de alimentos son una fuente potencial de contaminacin (McEldowney y Fletcher, 1987). En la industria de la alimentacin este riesgo se considera que disminuye cuando tales superficies estn secas, en parte porque el crecimiento y la supervivencia estaran reducidos (McEldowney y Fletcher, 1988 a). Sin embargo, se ha observado la capacidad de bacterias no formadoras de endoesporas para resistir condiciones de desecacin por extensos periodos de tiempo en superficies de procesado de alimentos. McEldowney y Eletcher (1988 a) sugieren que el exopolimero hidratado que rodea las clulas mantiene un ambiente adecuado, protegi6ndolas de la desecacin. Adems, las endoesporas de algunas especies bacterianas, con gran resistencia a la desinfeccin y esterilizacin por calor, se pueden adherir a superficies de equipos de fabricacin, lo que puede ser un importantsimo problema en las industrias de alimentacin y farmaetica (Husmark y Rnner, 1990; RtSnner e: aL, 1990).
-

La adhesin bacteriana en los intercambiadores dc calor ocasiona una disminucin en su

conductividad, disminuyendo, por lo tanto, el rendimiento (Bar-Or, 1990; Characklis, 1984; Pedersen, 1982 a; Ridgway e: aL, 1984).

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La colonizacin de superficies y el desarrollo de biofllms pueden afectar adversamente a la eficiencia de muchos procesos de membrana industriales, por ejemplo la smosis inversa. Al colonizarse la superficie de las membranas de diacetato de celulosa, disminuyen progresivamente tanto el flujo de agua como las propiedades de retencin de minerales de las membranas (Ridgway e: alt 1983, 1984). Respecto a los efectos beneficiosos, citamos tambin algunos ejemplos: Gracias a la adhesin puede favorecerse la fermentacin en procesos industriales, por ejemplo, en la produccin rpida del vinagre (Characklis, 1984). Las pelculas microbianas y las clulas inmovilizadas, junto con reactores de lecho fluido y fijo, son un importante componente de procesos de fabricacin en la industria biotecnolgica (Wardell, 1988). El tratamiento de aguas residuales depende de la accin de microorganismos adheridos que absorben y degradan compuestos orgnicos y nitrogenados (Bar-Or, 1990; van Loosdrecht e: al., 1990; Wardell, 1988).

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1.5. EMBALSE DE EL ATAZAR El embalse de El Atazar est situado a unos 70 1cm de Madrid, en el Norte de la Comunidad Autnoma, pertenece a la junsdiccin de los trminos municipales de El Atazar y Patones, pero sus aguas llegan hasta las estribaciones del casco urbano de El Berrueco. El Atazar es el ltimo de la cadena de embalses del ro Lozoya, formada por otros cuatro embalses ms, que superan cada uno el hectmetro cbico de capacidad. Estos embalses son: La Pinilla, Riosequillo, Puentes Viejas y El Villar. Segn el Canal de Isabel IX, El Atazar multiplica por 2,7 la capacidad de los otros cuatro juntos (Canal de Isabel II, 1972). El Atazar es una presa de tipo bveda-cpula, con un muro de 141 m de altura y una longitud de coronacin de 370 m, esto, unido a una cola mxima de 17 1cm, permite al embalse contener una cantidad de agua de 426 hin3, que inunda una superficie de 1.200 hectreas. Se termin su construccin en 1972 y entr en funcionamiento real en 1974, abasteciendo de agua potable a Madrid. La razn fundamental de su construccin fue regular los excesos de precipitacin en la cuenca del ro Lozoya respecto a la capacidad de los otros cuatro embalses. Su principal papel es pues realizar una regulacin anual de caudales vitales en el abastecimiento a Madrid (Cubillo e: al., 1990). La entrada de agua al embalse se produce por varios caminos: escorrenta superficial, regulacin hidrmjlica de la cadena del ro Lozoya y ros y arroyos que desembocan en el embalse. La escorrenta superficial es muy importante en la consecucin de caudales y se ve potenciada por dos factores: su amplia cuenca de recepcin (con 982 1cm2) y la impermeabilidad del terreno, constituido en su mayora por materiales como pizarras, granitos, neises, etc. (Fuster e: aL, 1971). La geologa de la zona de El Atazar presenta una clara diferenciacin entre sus mitades este y oeste. Mientras que su mitad este es homognea y compuesta por pizarras del Ordovicico, la mitad oeste es ms fragmentada y de una geologa distinta. As, a la altura de Cervera de Huitrago, encontramos una franja estrecha de rafias y arenas del Plioceno; sta es la zona donde la escorrenta superficial es menor, debido a una mayor infiltacin. Junto a sta, y terminando de rodear casi por completo el embalse, existe una zona grantica que se prolonga hasta Bustarviejo. Contigua a estos granitos, en la mitad oeste orilla sur, aparece una zona de neises

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unidos al gran macizo central metamrfico de la cordillera de Guadarrama (Fuster et aL, 1971). En las cercanas del embalse no se observa ninguna falla aparente. En la construccin se encontraron varias diaclasas en la cubeta cuyo material de relleno no ofreca garantas; fueron vaciadas y rellenadas con hormign (Canal de Isabel II, 1972). 14$. OBJETO DEL TRABAJO El abastecimiento de agua potable a la poblacin es un problema que debe preocupar a las autoridades, principalmente las sanitarias, tanto nacionales como locales. Cada da son mayores las cantidades de agua que se requieren por habitante, y debido a la irregularidad pluviomtrica de nuestro pas, es necesario realizar una regulacin de los caudales por medio de embalses. Es innegable la necesidad de suministrar este agua en condiciones ptimas, ya que puede ser un medio de transmisin de enfermedades. La legislacin espaola estipula los anlisis que son necesarios para controlar su calidad, que incluyen tanto la valoracin de parmetros fsicoqumicos como microbiolgicos (B.O.E., 1983; B.O.E., 1990). Para realizar el control de la calidad microbiolgica es sobradamente conocido que no se intenta realizar el aislamiento de posibles microorganismos patgenos, sino de aquellos que se encuentran siempre en heces, denominadosindicadores fecales, que incluyen coliformes, estreptococos y esporasde clostridios sulfito-reductores. La razn para su utilizacin se ha basado en el concepto de que estos microorganismos son ms fciles de detectar que los patgenos, por encontrarse en mayor nmero y tener una supervivencia ms larga. Por lo tanto estos grupos microbianos tienen mucho inters, debido a su enorme importancia, por lo que han sido objeto de los ms diversos trabajos, que incluyen desde estudios para mejorar su recuento y aislamiento, hasta la evaluacin de los efectos de los distintos factores, biticos y abiticos, sobre su supervivencia. La asociacin de bacterias con material particulado es de considerable importancia en ambientes acuticos. Existen numerosos trabajos sobrela adhesin microbiana en aguas dulces. Los distintos autores que trabajan en este tema estn de acuerdo en que el grado de adhesin en ambientes dulceaculcolas varia considerablemente. Tambin existe comn acuerdo en que la adhesin bacteriana a partculas puede tener una gran influencia sobre la supervivencia de los

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microorganismos. Sin embargo, por regla general, todos estos estudios slo se han realizado sobre la micropoblacin total, determinando el nmero de bacterias libres y adheridas a partculas, pero no conocemos ninguno que haya realizado una discriminacin entre libres y adheridas en diferentes grupos bacterianos. Por ello hemos credo de inters determinar si existe una tendencia a la adhesin en grupos microbianos de gran importancia para determinar la calidad microbiolgica de las aguas como son los indicadores de contaminacin fecal, aspecto que contribuira a un mayor conocimiento del comportamiento de estos microorganismos en el ambiente acutico. Para esto se ha elegido una estacin de muestreo en la cabecera del embalse de El Alazar, realizndose la recogida de muestras a distintas profundidades, para determinar si existan diferencias, tanto espaciales como temporales en el nmero total de bacterias de los grupos escogidos y en el porcentaje de ellas que se presentan adheridas a partculas. Los parmetros microbiolgicos estudiados han sido:
*

Recuento directo, para conocer el nmero total de bacterias en el embalse, determinando el

porcentaje de clulas que se encuentran respiratoriamente activas. Recuento de bacterias hetertrofas viables a 220C y 370C, determinando el nmero total y el nmero de ellas que se encuentran adheridas a partculas.
* *

Recuento de coliformes totales y fecales, realizando, asimismo, la discriminacin entre el

nmero total y el de adheridos a partculas.

*

Recuento de estreptococos fecales, totales y adheridos a partculas.

Complementariamente se ha realizado la identificacin de las cepas de coliformes y de estreptococos fecales seleccionadas. Con algunas de estas cepas se han realizado ensayos de adhesin in vUro para intentar determinar si existen diferencias en su tendencia a la adhesin, segn esten libres o adheridas en la muestra de agua.

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Tambin se han estudiado algunos parmetros fsico-qumicos, que nos ayudan a conocer un poco ms el entorno en el que se encuentran los microorganismos estudiados y nos permiten buscar posibles influencias de los mismos sobre la micropoblacin. Los parmetros evaluados han sido:
*

Perfil de temperatura, oxgeno disuelto y porcentaje de saturacin de oxigeno de la columna

de agua del embalse, imprescindibles en el estudio de un embalse debido, como ya hemos citado en la introduccin, a la importancia de la estratificacin trmica.
*

Concentraciones de los compuestos de nitrgeno ms importantes en el estudio de la dinmica

de un embalse, como son el in amonio, los nitritos y los nitratos.

*

Concentraciones de ortofosfatos y fsforo total, parmetros de gran importancia debido a que

el fsforo es el principal elemento limitante en numerosos sistemas acuticos.

*

Demanda qumica de oxigeno, importante como medida de la cantidad de materia orgnica

del agua. *pH Creemos que esta investigacin puede tener inters, ya que al determinarla proporcin de bacterias adheridas en los distintos grupos bacterianos estudiados, aborda un punto de vista poco investigado, lo que puede servir de complemento a los estudios que continuamente se estn realizando sobre la adhesin bacteriana. Hemos elegido los indicadores sanitarios para la realizacin de este trabajo debido a la importancia que la adhesin a partculas puede tener en su supervivencia y en su resistencia a algunos agentes utilizados para potabilizar el agua de abastecimiento.

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2. MATERIAL Y METODOS

2.1. TOMA DE MUESTRAS Y SU CONSERVACION La recogida de muestras se realiza en la cabecera del embalse, en un punto situado a una distancia aproximada de unos 100 m de la pared de la presa y equidistante de ambas orillas. Las muestras se recogen con una botella de muestreo, para toma de muestras en profundidad, que se hace descender hasta la profundidad deseadapor medio de un cable de acero marcado metro a metro, al final del cual va unido un lastre que facilita el descenso y evita desviaciones de la vertical. El equipo toma-muestras se baja con ambas tapas abiertas. Al llegar a la profundidad deseada, se enva por el mismo cable un mensajero, que al golpear contra el dispositivo de enganche de las tapas las libera, con lo que la botella se cierra (Herbert, 1988). Una vez en la superficie, las muestras se pasan a recipientes de plstico estriles de 1,5 1 de capacidad. Durante toda la campaa de muestreo se toman las muestras a las siguientes profundidades: 25 cm, 2, 4, 6, 8, 10, 20 y 40 m. Las muestras se transportan en fro, en neveras porttiles, hasta el laboratorio y se analizan en el mismo da. 2.2. REALIZACION DE LOS PERFILES DE TEMPERATURA. OXIGENO DISUELTO Y TANTO POR CIENTO DE SATURACION DE OXIGENO Los perfiles de temperatura, concentracin de oxgeno disuelto y porcentaje de saturacin de oxgeno de la columna de agua, se realizan ti situ con un aparato electrnico marca pHOX 62, provisto de una sonda de 30 m, marcada metro a metro. Una vez ajustado el aparato, se hace descender la sonda, lentamente para que se vaya estabilizando, hasta la profundidad de 30 m, realizndose la lectura de los tres parmetros. Posteriormente, se va subiendo la sonda metro a metro efectundose las mismas lecturas.

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2.3 METODOS MICROBIOLOGICOS 2.3.1. DETERMINACION DE LA POBLACION BACTERIANA TOTAL El nmero de bacterias totales se determina por recuento directo con naranja de acridina (Acridine Orange Oirect Count, AODC) segn la tcnica de Hobbie eta?. (1977), modificacin de la de Francisco a al. (1973). Para ello se utilizan filtros Nucleopore de policarbonato (Bowden, 1977) de 0,2 pm de dimetro de poro y 25 mm de dimetro, teidos con Negro Irgalan (Ciba-Geigy) en solucin a] 0,2% en cido actico al 2%, esterilizada por filtracin. Antes de usar los filtros, stos se lavan por pases sucesivos por agua destilada esterilizada por filtracin (Hobbie cf aL, 1977) Un mililitro de la dilucin deseada de la muestra se trata durante 3 minutos con 0,2 ml de solucin de naranja de acridina al l%o, esterilizada por filtracin (Hobbie et aL, 1977). Una vez transcurrido este tiempo, se pasa la mezcla a travs de los filtros de policarbonato teidos, utilizando un soporte Millipore de vidrio esmerilado. Una vez terminada la filtracin, se hace pasar a travs del filtro agua destilada, esterilizada por filtracin, para lavar y quitar los excesos de colorante. El filtro se coloca sobre un porta-objetos, se aade una gota de vaselina lquida, se coloca encima un cubre-objetos y sobre l una gota de aceite de inmersin. La preparacin as obtenida se observa con objetivo de inmersin en microscopio de epifluorescencia, equipado con un ocular cuadriculado para facilitar el recuento. Se cuentan todas las bacterias que presentan fluorescencia verde. Los recuentos se efectuan en al menos 20 campos porpreparacin. Conociendo el dimetro del campo del microscopio, el del filtro y la cantidad de muestra filtrada, se realizan los clculos necesarios para expresar los resultados como bacterias totales por mililitro. Todas las soluciones que se utilizan en esta tcnica (negro irgalan, naranja de acridina y agua destilada) deben estar esterilizadas por filtracin para eliminar cualquier partcula que tengan en suspensin y evitar falsos resultados. Adems, nosotros, para asegurar la esterilidad, aadimos a todas las soluciones formol a una concentracin final del 1%.

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2.3.2. RECUENTO DE LAS BACTERIAS RESPIRATORIAMENTE ACTIVAS Para estimar el nmero de bacterias respiratoriamente activas, en el momento de tomar las muestras en el embalse, se realiza la incubacin ti situ y en la oscuridad con INT (cloruro de p-iodo fenil, 3-p-nitro fenil, 5-fenil tetrazolio; Sigma) segn la tcnica de Zimmermann el al. (1978) modificada por Maki y Remsem (1981). El INT se prepara a una concentracin del 0,1% en agua destilada y se esteriliza por filtracin con filtros Millex (Millipore) distribuyndolo en recipientes estriles de 100 m, a razn de 10 ml en cada uno. En el embalse, con cada una de las muestras recogidas, se completan los recipientes basta 100 mi, mantenindose la mezcla durante 20 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Transcurrido este tiempo, se detiene la incubacin aadiendo 1 ml de formaldehido al 10%. Las bacterias que tienen su cadena de transporte electrnico en actividad, utilizan el INT como ltimo aceptor de electrones, reducindolo a Formazn que queda como cristales de color rojo-ladrillo en el interior de la bacteria (Betts a aL, 1989; Zmmerman et al., 1978). La observacin se realiza tiendo las bacterias con naranja de acridina, segn la tcnica descrita en el apanado anterior y observando con objetivo de inmersin en microscopio de epifluorescencia. Se efectua el recuento de las bacterias que presentan los cristales rojo-ladrillo en su interior. Los resultados se presentan como porcentaje respecto a las bacterias totales. 2.3.3. RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS CON CRECIMIENTO A 220C Y A 370C, TOTALES Y ADHERIDAS A PARTCULAS El recuento de bacterias hetertrofas se realiza por el mtodo de dilucin en placa, sembrando 1 ml de las diluciones decimales, realizadas en solucin salina al 9%~. Se utiliza como medio de cultivo el agar de recuento en placa (Adsa-Micro), incubando a 220C y a 370C, durante 5 das y 48 horas respectivamente (APHA, 1989) Para realizar la segregacin entre bacterias libres y adheridas a partculas, se filtra la muestra por un filtro de 3 pm de dimetro de poro, en el que quedan retenidas las bacterias que se encuentran adheridas a partculas (Fry, 1988; Goulder, 1977; Pedrs-Ali y Brock, 1983 a;

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Yoon y Rosgon, 1990), recogiendo el filtrado en un kitasato estril. Posteriormente se realiza el recuento de bacterias totales en la muestra sin filtrar y el de las libres en el filtrado. Por diferencia entre las bacterias totales y las libres obtenemos el nmero de aquellas que se encuentran adheridas a partculas. Todos los recuentos se efectuan por duplicado. Los resultados se expresan como ufc/ml. 2.3.4. RECUENTO DE BACTERIAS DEL GRUPO COLIFORME, TOTALES Y ADHERIDAS A PARTCULAS Al efectuar el recuento de este grupo de bacterias se realiza igualmente una segregacin entre el nmero total de bacterias coliformes y el nmero de aquellas que se encuentran adheridas a partculas. Para ello, como en el caso antenor, se realizan los recuentos en la muestra sin filtrar y en el filtrado obtenido despus de pasar por un filtro de 3 pm de dimetro de poro. Todos los recuentos se efectan por duplicado. En algunas muestras se incuba tambien el filtro de 3 pm de dimetro de poro, en las mismas condiciones, con el fin de obtener cepas que se encuentran adheridas a partculas, para realizar posteriormente los ensayos de adhesin in viiro, corno se detalla en el apartado 2.3.7. El mtodo utilizado para realizar los recuentos es el de filtracin por membrana, usando filtros de 47 mm de dimetro y de 0,45 lun de dimetro de poro. Se filtran 10 ml de las diluciones decimales. El medio elegido, despus de ensayar con algunos de los ms utilizados en la bibliografa, es el caldo m-Endo (Burlingame, a al., 1984; Rivera et aL, 1988; Mates y Shaffer, 1989), impregnado en almohadillas absorbentes en placas Petri de 49 mm de dimetro. Las colonias tpicas desarrolladas en este medio son de color rosa flisia con o sin brillo metlico. La incubacin se realiza siempre en anaerobiosis para impedir que parte de la flora bacteriana acompaante, que podra crecer en el caldo Endo, se desarrolle. Se efectan los recuentos de coliformes totales y fecales, incubando las placas para los primeros a 370C durante 48 horasy para los segundos a 44,50C durante 24 horas. Los resultados se expresan como ufc/l00 ml.

50

2.3.5. RECUENTO DE ESTREPTOCOCOS FECALES, TOTALES Y ADHERJDOS A PARTCULAS El recuento de estreptococos fecales se realiza por el mtodo de filtracin por membrana utilizando filtros Millipore de 47 mm de dimetro y 0,45 pm de dimetro de poro. Se filtran 100 ml de muestra. El medio utilizado es el agar de Slanetz y Bartley (Collin er aL, 1988; Devriese et al., 1992). La incubacin se realiza a 370C durante48 horas. Las colonias tpicas son de color rojo ladrillo. Como en los casos anteriores, tambin efectuamos aqu una segregacin entre el nmero total de estreptococos fecales y el nmero de adheridos a partculas; pero en este caso, en lugar de realizar los recuentos solamente en la muestra sin filtrar y en el filtrado obtenido despus de pasar por un filtro de 3 im, tambin se coloca el filtro de 3 mu sobre la superficie del medio utilizado, obteniendo en este caso el nmero de estreptococos fecales adheridos a partculas. La razon de hacerlo as, es porque estos microorganismos se encuentran en un nmero muy inferior al de los grupos anteriores y el error cometido al calcular el nmero de bacterias adheridas podra ser mayor. Adems estas cepas se utilizan, junto con las obtenidas en el recuento efectuado en el filtrado, para realizar los ensayos de adhesin vi virro, como se detalla en el apartado 2.3.7. Los resultados de los recuentos se expresan como ufc/l00 ml 2.3.6. IDENTIFICACION DE BACTERIAS 2.3.6.1. Identificacin de las Cepas de coliformes Las colonias tpicas aisladas en el medio de recuento se siembran en agar triptona-soja (TSA), incubndose A 370C, 24 h. A partir del cultivo obtenido, en primer lugar se procede a su confirmacin, realizando algunas pruebas preliminares: tincin Gram, produccin de gas en caldo lactosado, citocromo-oxidasa, siembra en medio de Hugh-Leifson para oxidacin/fermentacin de la glucosa, y ONPG (orto-nitrofenil-beta-D-galactopiransido). Posteriormente con las cepas confirmadas se realizan las siguientes pruebas para su identificacin: movilidad, por el mtodo de la gota pendiente; catalasa; crecimiento en medio ICligler, donde se realiza la lectura de tres pruebas, glucosa, lactosa y produccin de ~~2; indol; rojo de metilo y Voges-Proskauer; citrato (Daguet, 1977); lisina descarboxilasa; ornitina

51

descarboxilasa; argiina dehidrolasa; fenilalaninadesaminasa; triptfano desaminasa (Oberhofer, 1985); ureasa; hidrlisis de la gelatina; produccin de cido a partir de glucosa, manitol, inositol, sorbitol, ramnosa, sacarosa, melobiosa, amigdalina y arabinosa; reduccin de nitratos (Daguet, 1977). Para la identificacin de algunas de las cepas se han utilizado las galeras API 20E (Biomerieux), aunque en algunos casos han sido necesarias pruebas complementarias. Para la clasificacin en especies se han seguido los criterios del Manual Bergey s (Krieg y Holt, 1984). 2.3.6.2. Identificacin de las cepas de estreptococos fecales Las colonias tpicas aisladas en el medio de recuento se siembran en TSA, incubando a 37C, 24 It A partirdel cultivo obtenido se realizanlas siguientes pruebas para su identificacin: hidrlisis del almidn (Ruoff, 1992), produccin de cido a partir de lactosa, manitol, sorbitol, rafinosa y sacarosa (Devriese et al., 1992; Ruoff, 1992). Para la clasificacin en especies se han seguido los criterios del Manual Eergeys (Sneath a aL, 1986). 2.3.7. ADHESION IN VITRO Con una seleccin de las cepas aisladas en los recuentos de coilformes y estreptococos, se realizan ensayos de adhesin vi vitro. Se utilizan cepas, pertenecientes a estos dos grupos, aisladas de los recuentos de bacterias libres y cepas crecidas sobre los filtros de 3 hm, sobre los que slo se quedan retenidas las bacterias que se encuentran adheridas a partculas (ver apanados 2.3.4. y 2.3.5.) Para llevar a cabo los ensayos se cultivan las cepas que van a ser utilizadas en caldo triptona soja (TSB) hasta alcanzar la fase exponencial. El comienzo de la fase exponencial se determina realizando la curva de crecimiento. Por lo general los tiempos de incubacin oscilan entre 18 y 22 horas. Posteriormente se recogen las clulas por centrifugacin, lavando dos veces con tampn fosfato y resuspendiendo en tampn fosfato hasta una densidad ptica dc 0,1 a 540 nm (McEldowney y Fletcher, 1986 a).

52

Para estudiar la adhesin al poliestireno, se aaden 5 ml de la suspensin obtenida a placas Petri de este material, de 49 mm de dimetro, que sirven como sustrato de adhesin, dejndose durante 60 minutos a 220C. Transcurrido este tiempo, se lavan con tampn fosfato para retirar las bacterias que no se encuentran adheridas, fijando las adheridas con fijador de Bouin (71% y/y de solucin acuosa saturadade cido pcrico; 24% 0v de formol; 5% y/y de cido actico), tiendo a continuacin con cristal violeta (5 gIl) (McEldowney y Fletcher, 1986 a), y contando al microscopio. Conociendo el dimetro del campo del microscopio y el dimetro de la placa Petri, es posible calcular el nmero total de bacterias que se han adherido a la placa. Por otra parte seestima el nmero de bacterias que permanecen en la solucin, porel mtodo de recuento en placa, expresndose los resultados como porcentaje de clulas adheridas.

53

2.4. METODOS FISICO-QUIMICOS 2.4.1. pH El pH se deterndna en el laboratorio, procurando que el tiempo transcurrido entre la toma de muestras y la medicin sea el mnimo posible. En nuestro caso fue siempreinferior a 6 horas. Se emplea un pHmetro DIGIT 501 marca CRISON, con compensador de temperatura y calibrador. 2.4.2. CONCENTRACION DE ION AMONIO Para la valoracin del in amonio se utiliza el mtodo colorimtrico de Nessler, cuyo fundamento es la formacin de un complejo amarillo-pardo-rojizo de I(NH2)Hg que se obtiene cuando se mezcla el reactivo de Nessler (I2Hg 21K) con la muestra que contiene in amonio. La intensidad de color, funcin del amonio presente, se determina por colorimetra a 415 mn (de la Rubia, 1980). A la muestra se le aade tartrato-sdico-potsico (o sal de La Rochelle) para evitar la precipitacin de los iones calcio y magnesio presentes en la muestra (APHA, 1989). El resultado se expresa en mg/l. 2.42. CONCENTRACION DE NITRITOS El mtodo colorimtrico empleado para la valoracin de nitritos es el de la sulfanilamida. En este mtodo el compuesto diazoico, formado por la diazotacin, en medio cido, de la sulfanilamida por los nitritos presentes en el agua, se combina con la N-(1 -naftil) etilendiamina, produciendo un complejo de color rojo prpura que se determina colorimtricamente a 435 nm (Rodier, 1981). Se expresan los resultados en mg/l. 2.4.4. CONCENTRACION DE NITRATOS El mtodo colorimtrico empleado para la valoracin de la concentracin de nitratos es el de la reduccin con cadmio. En este mtodo se emplea cadmio-cobre granulado para reducir los nitratos a nitritos, que se determinan mediante la diazotacin de la sulfanilamida y su copulacin con el clorhidrato de N-(1-naftil) etilendiamina para formar un complejo rojo prpura, susceptible de valoracin colorimtrica a 535 nm (Rodier, 1981). Los resultados se expresan en mg/l.

54

2.4.5. CONCENTRACTON DE ORTOFOSFATOS El mtodo colorimtrico empleado se fundamenta en la reaccin de los ortofosfatos en medio cido con molibdato amnico y tartrato de antimonio y potasio, formando un complejo de antimonio-fosfo-mollbdato, el cual es reducido por la accin del cido ascrbico, dando un complejo de color azul, cuya intensidad es funcin de la concentracin de ortofosfatos presentes en la muestra. La lectura se efecta a 640 tun (Rodier, 1981). Los resultados se expresan en mg/l. 2.4.6. CONCENTRACION DE FOSFORO TOTAL La concentracin de fsforo total se determina segn el mtodo indicado por el Centro de Estudios Hidrogrficos (de la Rubia 1980), que consiste en hervir suavemente 50 ml de la muestra durante 30 minutos, con 1 ml de H2S04 11 N y 0,4 g de (NH4)2S05. Despus de enfriar, se ajusta el pH a 7 con NaOH 1 N, se diluye hasta 50 ml con agua destilada y se valoran en esta mezcla los ortofosfatos existentes segn el mtodo explicado en el apartado anterior. Los resultados se expresan en mg/l. 2.4.7. DETERMINACION DE LA DEMANDA QUIMICA DE OXIGENO (D.Q.O.) Para la estimacin de la materia orgnica presente en las muestras, se utillza el mtodo de la oxidabilidad al permanganato, segn la tcnica recomendada por el Centro de Estudios Hidrogrficos (de la Rubia, 1980). Para ello se ponen a hervir 100 ml de agua de la muestra con 15 ml de H2S04 1/3. Cuando comienza la ebullicin se aaden 10 ml de KMnO4 N/100 y se mantiene la mezcla en ebullicin durante 10 minutos exactos. Transcurrido este tiempo, se aaden 10 ml de cido oxlico N/l00. Posteriormente se valora con KMnO4 N/l00 hasta obtener una coloracin rosa plida. Se anotan los mililitros de KMnO4 gastados en la valoracin. Para calcular la D.Q.O. se aplica la siguiente frmula:

A=[(V+10)xF~10]x0,8

55

siendo: A y
= =

D.Q.O. expresada como miligramos de oxgeno por litro de agua volumen de KMnO4 N!100, en mililitros, gastado en la valoracin

F = factor de la solucin de KMnO4 N/l00

56

3. RESULTADOS Y DISCUSION

3.1. PERFILES DE TEMPERATURA, OXIGENO DISUELTO Y PORCENTAJE DE SATURACION DE OXIGENO Los perfiles de temperatura y de concentracin de oxgeno disuelto en la columna de agua del embalse se encuentran representados en las figuras 1 a 3, en ellas podemos observar que la estratificacin se produjo en el mes de Mayo, permaneciendo en esta situacin hasta el mes de Noviembre. El mximo espesor del epilimnion apareci en Octubre con 16 metros y el mnimo en Junio y Julio con 4 y 5 metros respectivamente. E] inetalimnion ms gmeso se encontr en Mayo y Julio con 7 y 9 metros respectivamente y el menor en Junio y Octubre con 2 y 3 metros respectivamente. La concentracin de oxgeno disuelto fue siempre bastante elevada, con porcentajes de saturacin entre el 50 % y el 114 %. Durante los meses en los que el embalse se encontraba en circulacin la concentracin de oxgeno disuelto variaba poco a lo largo de la columna de agua del embalse, oscilando ente aproximadamente 8 y 10 mg/1, lo que representaba un porcentaje de saturacin entre el 66 % y el 80 % respectivamente. Naturalmente las mayores diferencias se encontraron durante el perodo de estratificacin. Se observa una sobresaturacin epilimntica en los meses de Junio, con un tanto porciento de saturacin de 102%, y Julio, con un porcentaje entre 101% y 106%, y una situacin de saturacin o cercana a ella en los meses de Mayo, con un 94%, y Octubre, con un 100%, Sin embargo no sedetectaron blooms de fltoplancton ninguno de los das de recogida de muestras, ni visualmente en el momento de la recogida, ni por la valoracin de la concentracin de clorofila. La sobresaturacin puede haber sido debida a tormentas primaverales y veraniegas que descargaron con frecuencia sobre la zona, o tambin al fuerte aire, habitual durante gran parte del alio, que provoca oleaje, en ocasiones fuerte, y que favorecerla una oxigenacin de la capa superficial. En el mes de Mayo encontramos un incremento brusco de la cantidad de oxgeno disuelto en el metalimnion, mientras que al mes siguiente nos encontamos con la situacin opuesta, con un mnimo en el comienzo de la tennoclina, que podra ser consecuencia del consumo de oxgeno en la degradacin de la materia orgnica (Wetzel. 1983). En Julio vuelve a haber un aumento de la concentracin metalimntica de oxgeno, llegndose a obtener porcentajes de saturacin de 114%. Respecto al hipolimnion la situacin no vara mucho con respecto al perodo de circulacin, siendo las concentraciones de oxgeno disuelto altas durante todo el

58

estudio. El embalse de El Atazar, como ya hemos citado en la introduccin, tiene una profundidad en cabecera de 141 m, adems, debido a lo escarpado del terreno, la profundidad se mantiene en gran parte del embalse, lo que le permite contener una cantidad de oxgeno disuelto elevada, que disminuye poco a lo largo del estudio, incluso durante la estratificacin trmica. Estos resultados se pueden comparar con los obtenidos por Carballo (1987) en un estudio realizado en este mismo embalse, aunque en aquella ocasin las concentraciones de oxgeno disuelto fueron, en su mayora, un poco ms bajas. Creemos que esto pudo deberse a una agresin que sufri el embalse en aquellos ahos, debida al trasvase masivo de agua de los embalses que se encuentran por encima de El Atazar en la cadena del Lozoya, todos ellos eutrdfmcos. Esto provoc un aumento en las concentraciones de algunos parmetros estudiados, tanto fsico-qumicos como microbiolgicos, lo que pudo conducir a un mayor consumo de oxgeno (Carballo, 1987; Fernndez, 1985).

59

Hg. 1. PERFILES DE TEMPERATURA/OXIGENO DISUELTO

(meses Febrero, Marzo, Mayo y Junio)
mg/I mg/I

metros 12 o
2 4

io

metros 12 0 2 4 6 8 lo 12 14 26 18 20 22 24 26

10

8
10 12 14 16 18
20 22 24 26

28 30

28
30

10

lO

Temperatura

1- OxgenO disuelto

Temperatura Marzo

4- Oxgeno disuelto

Febrero

mg/l metros 12 10 8 6 4 2 0 metroS 12 10

m9/l 8 6 4

o 2 4
6 8 lo 12 14 16 IB 20

o 2 4
6 8 10 22 14

6
IB 20

22 24 26
28 30 8 20 12 14 16 18

22 24 26 28
30 8 lO 12 14 16 18

Temperatura Moyo

4- Oxgeno disuelto

temperatura Junio

Oxgeno disuelto

Fg. 2. PERFILES DE TEMPERATURA/OXIGENO DISUELTO

(meses Julio,
rrg/l

SeptIembre, 2

Octubre O

y NovIembre)
ng/l

metros 12 o
2

10

metros
o
2

4
6

4
6

8 lo
12 24

8 10
2 14

16

16 18 20

IB
20
22

24 26 28
30 8 70

22 24 26 28
30
~ffi

12

14

18

78

20

22

24

26

70

72

14

16

78

20

22

-e
Ten,peroturo
+~

Oxlg.no disuelto

Ten,peroturo

Oxgeno disuelto

Julio

Septiembre

mg/l metros 12 lO B

nig/l
4 2

o
2 4

metros 12 o
2 4

10

6 8 10 12 14 16

a
lo
12

14
16

18 20

18
20
22

22
24

26
28

24 26 28 8 10 12 14 0
Temper2turo
+

30

16

18

20

30

4 0

lO

Oxgeno disuelto

Ternperoturo

Oxigeno disuelto

Octubre

Noviembre

Fg. 3. PERFILES DE TEMPERATURA/OXIGENO DISUELTO

(meses Diciembre, Enero, Atril mg/l metros 12 o
2 4 6 8

y Julio) mg/l metros 72 o

2 4 lO 8 6 4

-o

a
lo
12 74

lo 12
4

16
IB 20 22 24 26 28 30 2

16
18 20
22

24
26

28 30

jO

10

-e
Ternperoturo ~4 Oxigeno disuelto Ten,peroturo
~+

Oxigeno disuelto

Diciembre

Enero

mg/l nig/l metros 12 o

2

metros 12
4 2 0 O 2

10

lO

4
6 8

4
6 8

lo
72

lo
12 14

14
16 IB

16 18 20
22 24 28 28

20
22 24 26 28 30 0 2 6 8 10 12

30

12

14

16

IB

20

22

24

26

T.mperoturo

4-- Oxgeno disuelto

Temperoturo

+~

Oxigeno disuelto

Abril

Julio

3.2. PARMETROS MICROBIOLOGICOS 3.2.1. POBLACION BACTERIANA TOTAL Y CELUILAS RESPIRATORIAMENTE ACTIVAS

- Distribucin temporal
Los resultados de los recuentos directos por naranja de acridina (AODC) se encuentran representados en las figuras 4 y 5. El nmero total de bacterias oscil entre 7,7 x o~, en el metro 2 en el mes de Julio. y 1,4 x &, en el metro 2 en el mes de Abril, encontrndose durante la mayor parte del estudio en el orden de 106, lo que est de acuerdo con otros estudios realizados en lagos y embalses (Chranowski, 1985; CIxrzanowski y Hubbard, 1988; Zinabu y Taylor, 1989 a, b). Velas clulas bacterianas eran respiratoriamente activas una media de 0.31% en los meses de invierno, 0,93% en los de primavera, 8,46% en los de verano y 0,8 1% en los de otoo. Estos valores se pueden comparar con los de Mali y Remsem (1981) en lagos de EEUU. Otros autores (Zimmerman a al., 1978) han obtenido valores mayores pero en aguas de mar costeras. Como podemos observar en la representacin de la distribucin temporal del nmero de bacterias totales, existe un marcado descenso en el mes de Julio, que puede tener como causa el aumento de la intensidad de la radiacin solar y factores relacionados, para aumentar posteriormente en Septiembre y Octubre. Estos aumentos coincidentes con el comienzo de la etapa de circulacin han sido observados tambin por Zinabu y Taylor (1989 a), que sugieren que pueden deberse a una mayor disponibilidad de nutrientes debido a la mezcla de la columna de agua. Distribucin espacial

En relacin a la distribucin espacial, es decir, respecto a la profundidad, sta se encuentra representada en las figuras 6 y 7. Podemos advertir que no existe una heterogeneidad vertical, ya que la densidad bacteriana no muestra variaciones importantes con la profundidad, slo se aprecia en algunos meses (Febrero, Julio y Septiembre) que la concentracin es algo menor en la muestra de superficie. En la poca estival esto puede estar ocasionado por la accin de la radiacin solar y su influencia sobre otros factores. Como podemos observar no se encuentran diferencias que distingan la poca de estratificacin de la de circulacin. Aunque, como veremos

63

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6. PERFILES DEL RECUENTO TOTAL (AODC)

0

metros

50 15 5

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23 50 35 40 3 4 5 6

20 25 50 SS

o
1 8

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F.bnr.

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5

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0 3 It 5 20 25 50 33 40 3 4 5 6 3 4 5 e y

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metros

lo SS 20 25

20 25 30 33 40 3 4 5 6 7 8

o
35 40 3 4 5 6 7

log It/ml
.~

cg N/ml
4- S.pI.mbs.

Jhs

Fig. 7. PERFILES DEL RECUENTO TOTAL (AODC)

00.1.0 0 0 5 10 3 20 25 30 35 40 3 4 5 Io~ 6/ml Odobro 6 7 8 5 ~5 20 25 30 35 40 3 5 6 7

os U/o,

NoO.n,br.

eolo,.

o
5 10 5 20 25 50 55 40 5 los 6/ml 6 7 6 5 5 20 25 50 35
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8 6/Sol

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0 Loor.

o
5 10 5 20 5 30 35 40 3 4 5 8 6/sol
7

10 15 20 25 30 35 40 8 3 4 5 loe U/ml
-4-

lee

U-- ANII

JulIo

ms adelante, en la distribucin de otras variables si existe heterogeneidad vertical, la densidad bacteriana total no muestra una variacin vertical significativa. Esto mismo es observado por Zinabu y Taylor en su estudio en el lago Awassa (1989 a). 3.2.2. BACTERIAS HETEROTROFAS 3.2.2.1. Bacterias hetertrofas con crecimiento a 220C Los recuentos de bacterias hetertrofas con crecimiento a 220C se presentan en las figuras 8 a 11. En cada una de ellas se representa la distribucin temporal, en cada una de las profundidades estudiadas, de las bacterias viables a 220C totales y aquellas que se encontraban adheridas a partculas. Se realiza la representacin grfica del logaritmo decimal del nmero de unidades formadoras de colonias por mililitro frente al tiempo. Distribucin temporal

Los niveles de bacterias hetertrofas con crecimiento a 220C oscilaron entre 5 x 10/ml en el metro seis, en Julio del primer alio y 8,59 x 103/inl, en el metro ocho en el mes de Diciembre. Los niveles fueron inferiores a los encontrados por Carballo (1987) y por nosotros, en un estudio anterior (Fernndez a aL, 1991) en este mismo embalse, y similares a los publicados por Zinabu y Taylor (1989 a) en el lago Awassa. Los recuentos de estas mismas bacterias, adheridas a partculas, se encontraron entre 3,6 x 100/nil en el metro cuarenta en el mes de Noviembre y 2,35 x 103/ml en el metro cuarenta, en el mes de Julio del segundo ao. La distribucin temporal muestra pocas diferencias a lo largo del estudio, slo pequeos aumentos y disminuciones, sin seguir un modelo claro. Slo destacar el descenso en el mes de Julio del primer alio, que se produce en todas las capas y que coincide en el mismo mes en el que se produca un descenso en el recuento total (AODC). Los recuentos de las bacterias adheridas no siguen lineas paralelas a los de totales, siendo numerosas las ocasiones en las que se producen aumentos o disminuciones en las densidades de las primeras que no se corresponden con variaciones en los recuentos de las segundas.
-

Distribucin espacial En las figuras 12 y 13 se encuentran representados los perfiles de profundidad de estas

68

Fig. 8. RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS CON CRECIMIENTO A 22C, TOTALES Y ADHERIDAS A PARTCULAS
5 4
Log uf e/ml

Feb

Mar

Moy

Jun

Jul

Sep

Oct

Nov

Dic

Ene

Abr

Jul

Meses

O
Metros

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5 4

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Feb

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Jun

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Sep

Oct

Nov

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Abr

4W

Meses

l,mT*tot#~
2

Metros

Hg. 9. RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS CON CRECIMIENTO A 22C, TOTALES Y ADHERIDAS A PARTICULAS
log ufc/ml

5 4 3 2

Eeb

Mar

May

Jun

Jul

Sep

Oct

Nov

Dic

Ene

Abr

Jul

Meses

4 Metros

log 4c/mI

5 4 3 2

Peb

Mor

Moy

Jun

Jul

Sep

Oct

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Dic

Eno

Abr

Jul

Meses

6 Metros

Fg. 10. RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS CON CRECIMIENTO A 220C, TOTALES Y ADHERIDAS A PARTCULAS
5 4 3
log ufc/ml

2 1

Feb

Mar

Moy

lun

.Jul

Sep

Oct

Nov

Dic

Ene

Abr

Jul

Meses >tctaIs Mhetida~

Metros

5 4

Iog fc/ml

3 2

Feb

Mar

May

lun

Jul

Sep

Oc$

Nov

Dic

Eno

Abr

Jul

Meses

Mh~4*s
10 Metros

Fig. 11. RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS CON CRECIMIENTO A 22C, TOTALES Y ADHERIDAS A PARTICULAS
5 4 Iog uf e/ml

3 2

Feb

Mar

Muy

Jun

.JuL

Sep

Oct

No.

Dic

Ene

Abr

Jul

Meses

A4had9s
20 Metros

lo

9 ufc/rnl

4 3 2

Feb

Mar

Muy

Jun

Jul

Sep Oct Meses

Nov

Dic

Ene

Aix

Jul

40 Metros

Fig. 12. PERFILES DE PROFUNDIDAD DE BACTERIAS . HETEROTROFAS <220C>

o
5
20

00 5
20

25 30 32 40 -2 Ooo, U/eso TotoMo rt,.re --- ~4o. 3

25 30 Ja 40
09

2 U/ml
*-

1o10.o Mono

Adl,.ddot

r00*0.

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5

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10 25 30 55 0 2
009

20
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30 35 o0 3
09

2 4/mI

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Tofo.. Moyo

-0- Adsoddeo

J.,lo

floro,.

OsoS,.,

o
5
0

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5

00 la 20 25 30 35 40 2
09

Id 20 25 50 35

12 Ioq U/ml bolso -4

U/MI 4 Mhsddeo

Totales JULIO

Adh.rldoo

S.ytl.mbr.

Hg. 13. PERFILES DE PROFUNDIDAD DE BACTERIAS

.

HETEROTROFAS (22C)

lo
15

lo 15 20 25 30 35 40
12 3 09

so
55 30 SS
40

12 U/ml

log 54/ml Teksoo br.

+

ilwU,.

Toca. soyIsn,tr

A AdI.fldoo

moloso

o
5 10 5 20 25 30 35
o

o
15
20

25
30

3, 40 0 1 2 lee ~/..s 3 4 5
009

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1 Adh*ddoo

Sulo mt lo

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5

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5

20 25 50 55 40 2 ee N/s,O
005.4.. A--

30
2$

50 3$
40

2 lo~ 54/mi toldos Julio

A4inddoo

-4- Adtorfdos

Abril

bacterias, tanto del nmero tota], como de las que se encuentran adheridas a partculas. Observamos que no existe un modelo de distribucin vertical ya que parece que la estratificacin trmica no conduce a una concentracin marcada en alguna de las capas. Tambin podemos observar que la distribucin del nmero total y del nmero de adheridas no estn relacionadas, obtenindose en los perfiles de prcticamente todos los meses, dos lneas totalmente independientes. Slo resaltar el gran aumento de la adhesin en el metro dos en el mes de Julio del primer ao, quizs debido a que las bacterias adheridas estn ms protegidas frente a la radiacin solar. En Julio del segundo alio se obtuvo la mayor similitud entre los recuentos de totales y adheridas, alcanzndose el valor ms alto en el porcentaje de adhesin, como veremos ms adelante. 3.2.2.2. Bacterias betertrofas con crecimiento a 370C Los recuentos de bacterias hetertrofas con crecimiento a 370C se presentan en las figuras 14 a 17. En cada una de ellas, igual que en el caso anterior, se representa la distribucin temporal, en cada una de las profundidades estudiadas, de las bacterias viables a 370C totales y aquellas que se encontraban adheridas a partculas. Se realiza la representacin grfica del logaritmo decimal del nmero de unidades formadoras de colonias por mililitro frente al tiempo. Distribucin temnoral El nmero de estas bacterias oscil entre un mnimo de 1,0 x 10>/ml en Julio del segundo alio en la muestra correspondiente al metro 20, y un mximo de 1,71 x 103/ml en el mes de Septiembre en la muestra correspondiente a la misma profundidad. Los niveles en este caso tambin fueron inferiores a los encontrados por Carballo (1987) y por nosotms en un estudio anterior (Fernndez a al., 1991) en este mismo embalse, y similares a los hallados por Zinabu y Taylor (1989 a) en el lago Awassa. Los niveles de estas bacterias que se encontraban adheridas a partculas estuvieron situados entre 49 x 1&/ml en la muestra correspondiente a] metro 20 del mes de Julio del segundo ao y 7,9 x 102/ml en el mes de Septiembre en la misma profundidad. La distribucin temporal en este caso s sigue una pauta similar en todas las profundidades, ya que es apreciable un descenso que comienza a producirse en el mes de Mayo, para permanecer en esta situacin hasta el final del verano e iniciar una recuperacin en Septiembre, que se producir alo largo del otoo para volver a descender en invierno. Esto podra ser debido

75

Hg. 14. RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS CON CRECIMIENTO A 37~C, TOTALES Y ADHERIDAS A PARTCULAS
cg ufc/ml

Feb

Mor

Moy

Jun

Jul

Sep

Ccl

Nov

Dic

Ene

Aix

ti

Meses

L
4
cg ufo/m

ibtct,s O Metros

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Mor

Moy

Jun

Jul

Sep

Ccl

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Dic

Ene

Aix

Jul

Meses

T*totn
2 Mefros

Hg. 15. RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS CON CRECIMIENTO A c37C, TOTALES Y ADHERIDAS A PARTICULAS
log ufc/rnl

4 3

Feb

Mor

Moy

Jun

Jul

Sep

Oct

Nov

Dic

Ene

Abr

Jul

Meses

Adbed*s

4 Metros

fog ufc/mr

Feb

Mar

May

Jun

Jul

Sep

Oct

Nov

Dic

Ene

Abr

Jul

Meses

6 Metros

Fig. 16. RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS CON CRECIMIENTO A 370C, TOTALES Y ADHERIDAS A PARTCULAS log ufc/ml
4

Feb

Mar

Mc

Jun

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Sep

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Nov

Dic

Ene

Aix

ti

Meses

fi

6 Metros

cg fc/ml

Feb

Mor

May

Jun

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Sep

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Dic

Ene

Abr

Jul

Meses

T*totsa 10

Adhofld*~
Metros

Fig. 17. RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS CON

CRECIMIENTO A 370C, TOTALES Y ADHERIDAS A PARTCULAS

log utc/rnl

4 3

Feb

Mar

Mc

Jun

Jul

Sep

Cci

Nov

Dic

Ene

Abr

Jul

Meses

20

Metros

09

fc/mI

Feb

Mar

May

Jun

Jul

Sep

Oct

Nov

Dio

Eno

Abr

iii

Meses

1w
40 Metros

Fig. 18. PERFILES DE PROFUNDIDAD DE BACTERIAS HETEROTROFAS (MCC) ~

lo 5 20 25 50 55 40 2 1so >4/mi 3 AiheOldoO

lo
5
20

25 30 35 40 2 loo 54/ml Todos Mono A- AhoddCt 3

todo.
r.br.rs

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lo
5 20 25 30
55

15 20 25 30 35 2 los 54/ml Thtci.. Moyo A- A4h.o5.os Tomo. -orlo 3 40 -2 log 54/ml 3

-A-- Adforido.

Ajoro. onoiro.

o
15 20 25

10
8

20 25 S0 35 2 09 54/ml lotolso rile 4 Adl,oddoo Torc.. 3 40 -2 loo 54/mi t Adiorfdo. 3

so
55 40

5.p01.mb,.

Fig. 19. PERFILES DE PROFUNDIDAD DE BACTERIAS HETEROTROFAS (37C)

lo
15 20 23 20 35
o

o
5 20
2$

30 35 40 2 lOO 54/ini Toldo. AA4I,oddcs Tololto

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eolio. moloc
O

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20 2$ 30 3$ 40 2 loe 54/ml t~ci.. A- jdfoddoo

0

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o

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Adforldoo

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5 20 35 30 35 40 2 09 54/ml Totei.c Abril A- Adhorldos 3

o
5 20
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30 3$ 40
12 .2

loe 54/ml Tollos ollo A- AdlIc,ldo.

a la menor supervivencia de las bacterias alctonas cuando se eleva la temperatura (Awong el aL, 1990) debido a que, al mismo tiempo, aumenta la accin txica de numerosos compuestos presentes en el agua y se acelera la autolisis (Granal y Sjogren, 1981). El aumento que se produce en otoo puede explicarse por las razones anteriormente citadas, a] haber un descenso de la temperatura se produce un aumento de la supervivencia de las poblaciones bacterianas alctonas. A diferencia de las bacterias hetertrofas con crecimiento a 220C, aqu los recuentos de las bacterias totales y adheridas a lo largo del tiempo. s siguen un comportamiento muy similar, encontrndose las densidades bacterianas de ambas muy prximas a lo largo de todo el estudio y producindose los aumentos y disminuciones al mismo tiempo. Esto se debe a la gran tendencia a la adhesin encontrada entre las bacterias pertenecientes a este grupo. Distribucin espacial

En las figuras 18 y 19 estn representados los perfiles verticales de estas bacterias durante todo el periodo de estudio. En el perfil correspondiente a cada mes se reproducen las grficas tanto del nmero total de estas bacterias como del nmero de las mismas que se encontraban adheridas a partculas. No podemos afirmar que sigan un modelo de distribucin, porque, como podemos ver en la figura 18, si bien durante la poca de circulacin su distribucin es ms o menos homognea en toda la columna de agua y al producirse la estratificacin existe una mayor concentracin entre el metro 8 y el 10, en la figura 19 existen diferencias significativas en las grficas correspondientes a los meses de Diciembre y Enero, en los que, a pesar de encontrarse el embalse en circulacin, no existe una distribucin homognea a lo largo de toda la columna de agua; sin embargo s es posible observar que en Julio vuelve a producirse una situacin similar a la de la estratificacin del ao anterior, con un aumento de la concentracin entre los metros 8 y 10.
3.2.2.3. Porcentaje de bacterias hetertrofas adheridas a particulas

En la tabla 1 se pueden observar los porcentajes de bacterias hetertrofas viables con crecimiento a 220C que se encontraban adheridas a partculas durante todo el estudio. Como podemos ver stos fueron muy variables, estando comprendidos entre un mnimo de 1,5%. en el mes de Noviembre en la muestra del metro 40, y un mximo de 88% en el mes de Julio del primer ao a la profundidad de 2 metros; dentro de este amplsimo margen, sin embargo,

82

predominan los valores bajos en la mayora de las muestras. El mes en el que obtuvimos un porcentaje de adhesin mayor fue Julio del segundo ao, con una media de 39,6%, y en el que lo obtuvimos menor fue Noviembre, con una media de 11,4%. Esto lo podramos deducir

Feb 0 2 4 6 8 10 20 40 5,3 6,3 8,6 8,3 8,7 14,7 26.1 33,3

Mar 7,7 14,3 18,7 20,0 33,3 7,7 17,0 81,8

May 72,9 31,3 5,0 76,7 35.3 25,9 26,0 15,0

Jun 21,5 3.3 3,4 11,4 2,2 11,5 22.2 23,8

Jal 25,0 88,0 58,3 41,2 5,9 27,7 84 11,5

Sep 4,9 2,1 2,3 23,5 10,5 4,7 48,6 46,6

Oct 61,9 41,1 23,6 13,6 52,0 2,4 20,2 61,8

Nov 15,4 13,2 24,4 14,0 16,1 2,8 4,1 1,5

Dic 9,7 14,7 16,6 30,0 3,5 26,6 5,5 6,3

Ene 40,7 10,3 35,9 21,8 22,8 35,2 38,1 33,8

Abr 57,3 33.3 34,8 51,3 14,3 11,5 8,6 59,1

Jul 58,2 39,6 41,2 39,5 47,1 29,8 19,7 41,9

Tabla l~ Porcentaje de bacterias betertrofas con crecimiento a 220C, que se presentaban adheridas a panculas, durante todo el perodo de estudio, a las diferentes profundidades estudiadas.

igualmente si observamos las figuras 12 y 13, en las que seencuentran representados los perfiles
de profundidad de los recuentos de bacterias totales y adheridas; se puede ver que en la grfica

correspondiente al mes de Noviembre ambas lneas estn muy separadas y que en la del mes de Julio del segundo ao estn muy prximas una de otra. En la tabla 2 se muestran los porcentajes de bacterias hetertrofas viables a 370C, que se
encontraban adheridas a partculas. Podemos ver que en este caso los valores en la mayora de las muestras estuvieron comprendidos entre un 40% y un 50%. El mximo valor lo obtuvimos en Abril en la muestra correspondiente a los 20 metros de profundidad, con un 97,73%, y el valor mnimo en Enero a los 6 metros con un valor excepcionalmente bajo. comparado con todos los dems, un 9,81%. El mes en el que se alcanzaron los porcentajes ms altos de adhesin fue Octubre con una media de 71,4%. Si contemplamos la figura 19, podemos ver que en este mes las lineas que representan las bacterias totales y las adheridas estn muy prximas, lo que indica que sus recuentos fueron muy similares. Los porcentajes ms bajos de adhesin en este grupo de bacterias se obtuvieron en el mes de Enero con una media de 37,8%, aunque

valores muy semejantes se alcanzaron en los meses de Febrero y Marzo con medias de 39,6% 83

y 38,4% respectivamente.

j~jJ Feh Mar May Ion InI Sep Oct Nov Dic Ene Ahr .Ini
0 2 4 6 8 10 20 40 42,6 47,9 45,3 47,5 37,5 38,0 32,8 24,8 38,9 34,1 34,3 35,0 35,7 44,4 43.8 41,0 42,5 40,8 42,2 41,3 439 44,2 37,8 38,5 44,2 45,9 35,5 36,9 38,5 39,2 49,0 43,3 55,6 46,7 45,5 50,0 52,5 37,5 40,6 35,8 57,2 60,0 57,2 47,8 43,7 47,7 46,2 48,5 21,7 55.9 74,1 93,1 96.0 80,3 89,7 60,7 749 80,9 79,1 51,2 49,0 47,0 40,9 42,1 8705 80.0 33,3 32,4 31,7 23,7 68,8 40,8 29,8 66,0 34,8 9,8 20,7 51,6 43,6 46,4 79,2 10,0 36,1 30,9 24,4 23,3 97,7 79,5 92,5 58,3 53,0 52,5 52.7 52,9 49,0 44,5

Tabla 2. Porcentaje de bacterias hetertrofas con crecimiento a 370C, que se piesentaban adheridas a partculas, durante todo el perodo de estudio, a las diferentes profundidades.

El porcentaje de bacterias que se encontraban adheridas a partculas es notablemente

superior entre las hetertrofas con crecimiento a 370C, siendo adems su comportamiento respecto a la adhesin ms constante, es decir, no existen grandes saltos en estos porcentajes, mientras que el porcentaje de bacterias adheridas entre las hetertrofas con crecimiento a 220C sufre grandes variaciones, no presentando un comportamiento homogneo. Algunos autores sugieren que las bacterias hetertrofas con crecimiento a 220C son en su mayor parte autctonas, mientras que las de crecimiento a 370C son predominantemente alctonas. Esto podra explicar las diferencias observadas respecto a la adhesin, puesto que las bacterias autctonas estn adaptadas a las condiciones que imperan en el medio y a las bajas concentraciones de nutrientes existentes en el agua, con lo que no se beneficiaran significativamente de la vida en adhesin
(Hoppe, 1984), no necesitando, por tanto, adherirse a partculas, pudiendo sobrevivir a concentraciones muy bajas de principios nutritivos, mientras que las alctonas tenderan a la

adhesin buscando un ambiente ms rico (Costerton y Cheng, 1982; DePlann e: aL, 1990;
Pringle y Fleteher, 1983).

84

3.22. BACTERIAS DEL GRUPO COLIFORME, TOTALES Y ADHERIDAS A PARTCULAS 3.23.1. Justificacin del mtodo empleado Antes de presentar y discutir los resultados obtenidos, creemos de importancia resaltar algunos aspectos sobre el mtodo y los medios de cultivo utilizados para llevar a cabo estos recuentos. Despus de realizar pruebas preliminares con varios medios, utilizando tanto la tcnica de filtracin por membrana (FM) como la de nmero ms probable (NMP), se eligi la primera por ser sencilla, precisa, ms cuantitativa (Franzblau et aL, 1984; Hsu y Willlams, 1982) ya que proporciona recuentos directos en lugar de un Indice de probabilidad (McDaniels et al., 1987), y por obtener con ella resultados definitivos ms rpidamente que por NMP (Doyle et aL, 1984, LeChevallier e: al0. 1983 a, b; LeChevallier y McPeters, 1984). El medio de eleccin fue el caldo m-Endo (Burlingame et aL, 1984; Rivera et aL, 1988; Shaffer, 1989), seleccionado despus de haber utilizado algunos de los ms comnmente usados (caldo lac~sado, agar Ejido, agar McConkey, agar Chapman-ITC, etc.). La eleccin se realiz por obtenerse con l mayor recuperacin y una mayor reproductibilidad de los resultados. Se ha publicado en numerosas ocasiones que bacterias no coliformes pueden interferir con la deteccin de coliformes, tanto por NMP como por filtracin por membrana (Burlingame et al., 1984; Clark, 1980; Doyle a al., 1984; Evans a al., 1981 b). Por NMP se puede producir enmascaramiento de la produccin de gas, por competicin con los nutrientes (Evans e: al., 1981 b); sobrecrecimiento de bacterias no coliformes mejor adaptadas a crecer en los medios de NMP que los coliformes daados (Bissonnette e: al., 1975); formacin por parte de bacterias no coliformes de productos antagonistas para el crecimiento o la actividad bioqumica de coliformes (Means y Olson, 1981). Por filtracin sepuede producir supresin del crecimiento por liberacin de sustancias antagonistas o por competir por los nutrientes (Doyle e: aL, 1984; Finch e: al., 1987; Hsu y Williams, 1982; LeChevallier y McFeters, 1985 a, b; McFeters e! aL, 1982) Nosotros mismos pudimos comprobar esta inhibicin tanto en este trabajo como en otros anteriores (Fernndez, 1985; Fernndez e: al, 1991), en los que observamos, adems, que esta interferencia en la deteccin de coliformes se produca principalmente por bacterias del gnero

85

Pseudontonas, especialmente por P. aeruginosa. Diversos autores han citado tambin a esta bacteria como una de las principales responsables de la inhibicin de coliformes tanto en NMIP como en filtracin por membrana (Burlingame et al., 1984; LeChevallier y McFeters, 1985 a). Debido a esta inhibicin de las bacterias coliformes por parte de no coliformes que estn creciendo activamente, es necesario un procedimiento que reduzca o inhiba el crecimiento de los no coliformes. La incubacin anaerobia cumple estos requerimientos y ha sido sugeridacomo tcnica para mejorar la deteccin de coliformes en aguas superficiales, por filtracin por membrana (LeChevallier e! aL, 1983 a, b). Su simplicidad y bajo coste puede pennitir su uso en monitorizaciones. Tambin hemos encontrado en la bibliografa la aparicin de coliformes atpicos, que no producan brillo metlico o que eran lactosa negativos: sin brillo metlico: Burlingame e! al. (1984) observan que slo una fraccin de Enterobacter cloacae aislado de aguas naturales produca brillo metlico. Franzblau e: al. (1984) citan que de los aislados de agua natural, aproximadamente el 50% de los que no producan brillo eran coliformes, predominantemente Citrobacter y Enterobacter. lactosa negativos: gran parte de las colonias lac (-), crecidas en medios de recuento como m-FC, se identifican como E. coli (Cenci e: aL, 1990; Rychert y Stephenson, 1981). Algunos autores atribuyen esto a que algunos factores ambientales (como la temperatura) y/o de presin (residuos txicos, biocidas, cloro, etc.) pueden interferir con la expresin del opern lactosa, especialmente en el primer aislamiento sobre medios selectivos (Peng y Hartman, 1982; McFeters e! al., 1982). Por estas razones algunos autores aconsejan que para realizar la confirmacin de las colonias crecidas en los medios de recuento, es ms conveniente realizar las pruebas de la B galactosidasa, o la del ONFO, y la oxidasa (Cenci e: aL, 1990; Rychert y Stephenson, 1981). Nosotros tambin pudimos observar esto mismo, por lo que adems de realizar la confirmacin
-

en caldo lactosado, siempre se efectuaban las pruebas citadas en el apanado 2.3.7.1. 3.2.3.2. Recuentos Los resultados obtenidos en los recuentos del nmero total de coilformes totales y fecales, y del nmero de los que se encontraban adheridos a partculas, se encuentran recogidos en las

86

figuras 20 a 23, para los colifornies totales, y 24 a 27 para los fecales. La representacin se realiza como logaritmo del nmero de unidades formadoras de colonias (ufc) por LOO m, frente al tiempo.
-

Distribucin temporal

El nmero de coliformes totales (figuras 20-23) se encontraba durante la mayora del perodo de estudio en el orden de O~ por 100 m, valores inferiores a los encontrados por nosotros (Fernndez, 1985) en este mismo embalse, y a los encontrados por Bergstein-Ben y Stone (1991) durante la mayor parte de su estudio en el lago Kinneret, a los publicados por Maul y Block (1983) y a los encontrados por Chen y Hickey (1983), y mucho menores que los detectados por Cenci ej aL (1990) y por McDaniels et al. (1987) en distintas aguas superficiales. El mnimo se obtuvo en el mes de Junio en la muestra de superficie con un recuento de 70 ufc/100 mi, y un nmero de bacterias adheridas de 25 ufc/lOO m, y el mximo se alcanz en el mes de Octubre en la muestra de 10 m de profundidad, con un recuento de 1,38 x 04 ufe/ICO ml para totales y 8,20 x lt)~/l00 ml para adheridas a partculas. La distribucin temporal es muy similar a la observada en las figuras 14 a 17 correspondientes a los recuentos de bacterias hetertrofas viables a 370C. En este caso la lnea que representa los recuentos de bacterias adheridas tambin sigue la misma distribucin que la de las totales, estando ambas, en todo momento, muy prximas. Como podemos observar, se produce una disminucin en todas las profundidades en el mes de Mayo. Esto podra ser debido, como se ha citado con anterioridad, a la menor supervivencia de las bacterias alctonas cuando aumenta la temperatura (Awong e: aL, 1990) debido a que tambin aumenta la accin txica de numerosos compuestos presentes en el agua y se acelera la autolisis (Oranai y Sjogren, 1981), adems de que los efectos deletreos combinados de la luz y la presencia de microbiota natural son generalmente mayores a temperaturas ms altas (Anderson et aL, 1983; Mccambridge y McMeekin, 1979; Rhodes y Kator, 1988). En algunas profundidades el descenso contina en el mes de Junio, especialmente en la muestra correspondiente a superficie. En los meses posteriores se observa un ligero aumento, puesto que, a pesar de que la subida de las temperaturas contina, tambin aumentan las descargas urbanas debido al aumento de poblacin en los pueblos de los alrededores por el perodo vacacional; por lo tanto, aunque la temperatura tenga un efecto negativo sobre la supervivencia de estas poblaciones bacterianas, al ser el nmero que llega al embalse mucho

87

Fig. 20. RECUENTO DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES. NUMERO TOTAL Y NUMERO DE ADHERIDAS A PARTICULAS
cg ufc/1

&

DO ml

3
2

Feb

Mar

Muy

lun

Jul

Sep

Ccl

Nov

Dic

Ene

Abr

ti

Meses

Metros

5 4 3

[cg ufc/100 ml

Feb

Mor

Muy

Jun

Jul

Sep

Oct

Nov

Dic

Eno

Abr

ti

Meses

Metros

Fig. 21. RECUENTO DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES. NUMERO TOTAL Y NUMERO DE ADHERIDAS A PARTCULAS
lo 5 4 3 2 9 uf o/lOO ml

Feb

Mar

May

Jun

Jul

Sep Ocf Meses

Nov

Dic

Eno

Abr

tI

Metros

5 4 3

cg ufe/lOD ml

Feb

Mar

Moy

Jun

Jul

Sep

Oct

Nov

Dic

Eno

Abr

Jul

Meses

1 ~ xtt,
6
Metros

Mhtdls

Fig. 22. RECUENTO DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES. NUMERO TOTAL Y NUMERO DE ADHERIDAS A PARTICULAS
5 Iog uf o/l 00 ml

4 3 2

Feb

Mar

May

Jun

Jul

Sep Oct Meses

Nov

Dic

Ene

Abr

Jul

1 !~ TM~9?
8
Metros cg ufc/lOO ml

5 4

Feb

Mar

May

Jun

Jul

Sep

Oct

Nov

Dic

Eno

Abr

Jul

Meses

10 Metros

Fg. 23. RECUENTO DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES NUMERO TOTAL Y NUMERO DE ADHERIDAS A PARTCULAS
5 4 3 og ufc/100 ml

O
Feb Mar May Jun Jul Sep Ocf Meses Nov Dic Eno Abr Jul

Adb*fldos
20

Metros

5 4

cg fc/100 ml

3
2

Feb

Mar

May

Jun

Jul

Sep

Oct

Nov

Dic

Erie

Abr

.JuI

Meses

~
40

Metros

mayor, el resultado es un ligero aumento. En el mes de Octubre se observa un importante incremento en todas las capas del embalse, que puede explicarse por las razones anteriormente citadas, seproduce un aumento de la supervivencia de las poblaciones bacterianas alctonas. En los meses siguientes se vuelve a producir una disminucin en los recuentos, que se mantienen estables hasta que al final del estudio, en el ltimo mes, se produce un ligero aumento que se podra explicar de igual manera que el correspondiente al mismo mes del alio anterior. El nmero de coliformes fecales (figuras 24-27) se encontr durante gran parte del periodo de estudio en el orden de 1 o3iioo ml. Estos valores son inferiores a los encontrados por nosotros (Fernndez, 1985) en este mismo embalse, y a los hallados porotros autores (BergsteinBen y Stone, 1991; Maul y Block, 1983; Chen y Hickey, 1983; Cenci et al. 1990; McDaniels et al., 1987). El mnimo se obtuvo, como en el caso de los coliformes totales, en el mes de Junio, aunque en este caso en la muestra de 8 metros, con un recuento de 25 ufcjl00 m, y un ndmem de bacterias adheridas de 17 ufe/iGO m, y el mximo se alcanz en el mes de Octubre en la muestra de 10 m de profundidad, coincidiendo en este caso, tanto el mes como la profundidad, con los coiformes totales, con un recuento total de 2,00 x O~ uIt/lOO ml y un nmero de adheridos a partculas de 1,20
x j~4 uit/lOO

ml.

Como podemos observar en las grficas de las figuras 24 a 27, la distribucin temporal de las bacterias coliformes fecales es muy similar a la de las totales y se podra explicar por los motivos citados anteriormente; en todas las profundidades se produce una disminucin en el mes de Mayo, que, como dijimos anteriormente, podra ser debida a la menor supervivencia de las bacterias alctonas cuando aumenta la temperatura. En el mes de Junio observamos que en la superficie contina esta disminucin. Como en los coliformes totales, en los meses posteriores se observa un ligero aumento que puede ser debido al incremento de las descargas urbanas durante el perodo vacacional. En este caso tambin se observa un importante incremento en el mes de Octubre en todas las capas del embalse, que puede explicarse por las razones anteriormente citadas. En los meses siguientes se vuelve a producir una disminucin en los recuentos, que se mantienen estables hasta el final del estudio, cuando, en el ltimo mes, en algunas profundidades, se produce un ligero aumento que sepodra explicar de igual manera que el correspondiente al mismo mes del ao anterior. Los recuentos de coliformes fecales adheridos a partculas, como decamos en las bacterias hetertrofas viables a 370C y en los coliformes totales (figuras 14 a 17 y 20 a 23 respectivamente), siguen exactamente la misma distribucin temporal que los de coliformes

92

Fig. 24. RECUENTO DE BACTERIAS COLIFORMES FECALES. NUMERO TOTAL Y NUMERO DE ADHERIDAS A PARTCULAS
log ufc/100 ml 5 4 3

o
reb Mar May .Jun Jul Sep Oct Nov Dic Eno Abr Jul Meses nf abs Mho

Metros

log ufe/100 ml 5 4 .3 2

Feb

Mor

May

Jun

.JuI

Sep

Ocf

Nov

Dic

Eno

Abr

Jul

Meses

T*tQ#S

AdhdUS

2 Metros

Fig. 25. RECUENTO DE BACTERIAS COLIFORMES FECALES. NUMERO TOTAL Y NUMERO DE ADHERIDAS A PARTCULAS
5 4 3 2 Iog ufc/100 ml

Feb

Mar

May

Jun

Jul

Sep

Oct

Nov

Dic

Ene

Abr

Jul

Meses

Thtoks

4 Metros

5 4

Iog ufo/lOD ml

3
2

Feb

Mor

May

Jun

Jul

Sep

Ocf

Nov

Dic

Eno

Abr

Jul

Meses T*toWu A4h~r~dn

Metros

Fig. 26. RECUENTO DE BACTERIAS COLIFORMES FECALES NUMERO TOTAL Y NUMERO DE ADHERIDAS A PARTICULAS
5 4 3 2 log ufc/100 ml

Feb

Mar

Moy

Jun

Jul

Sep

Oc

Nov

Dic

Eno

Abr

Jul

Meses

Adho

8 Metros

log ufc/1 00 ml

3 2

Feb

Mor

May

Jun

Jul

Sep

Ccl

Nov

Dic

Eno

Abr

Jul

Mesos

Adb.4ua 10 Metros

Hg. 27. RECUENTO DE BACTERIAS COLIFORMES FECALES.

NUMERO TOTAL Y NUMERO DE ADHERIDAS A PARTCULAS

log uf c/1 00 ml 5 4 3 2

Feb

Mar

May

Jun

Jul

Sep

Oc

Nov

Dic

Eno

Abr

Jul

Meses

20 Metros

5 4 3

Log ufc/1 00 ml

Feb

Mar

May

Jun

Jul

Sep

Cci

Nov

Dic

Ene

Abr

Jul

Meses

Th*uts
40

A4h.fldo~ Metros

fecales totales, encontrndose ambas lneas muy prximas durante todo el estudio. Distribucin espacial

En las figuras 28 a 31 se presentan los perfiles de profundidad de coliformes totales (en las dos primeras) y fecales (en las ltimas), haciendo tambin la distincin entre el nmero total y el de adheridos a partculas. En ambos casos podemos observar que durante los primeros meses del estudio, en los que el embalse se encontraba en circulacin, la distribucin de estas bacterias con respecto a la profundidad es prcticamente homognea, no encontrndose diferencias en las diferentes profundidades estudiadas. Sin embargo, cuando se produce la estratificacin de la columna de agua del embalse, se comienzan a observar algunas diferencias entre profundidades. Estas se inician en el mes de Mayo, con un aumento de la concentracin tanto de coilformes totales como fecales segn descendemos hacia el metro 6. Este perfil, casi idntico para colifonnes totales y fecales, se mantiene en los meses posteriores, aunque con un marcado aumento tambin en el metro 20, que se mantiene o disminuye ligeramente hacia el 40. La mayor concentracin en el metro seis puede ser debida a que a esta profundidad no llega la accin de la luz del sol y tambin a que exista una mayor concentracin de nutrientes, debido a que muchas especies de fitoplaneton en verano tienen sus condiciones ptimas a unos pocos metros de profundidad, porque la irradiacin intensa las dalia considerablemente (Lovel y Konopka, 1985 b). En el mes de Noviembre, de nuevo el embalse en circulacin, la mayor concentracin se localiz en la muestra de superficie, ya que en esta poca del ao la accin de la luz solar es mucho menor y normalmente en superficie estas bacterias pueden encontrar mayor nmero de partculas que les pueden servir como proteccin o como alimento. En los meses siguientes, se repite la situacin de los primeros meses del estudio, sin diferencias entre las distintas profundidades. Con la llegada del verano, en Julio del segundo alio, se vuelve a la situacin comentada para los meses del verano anterior. En las representaciones de los perfiles de profundidad no se observan diferencias entre bacterias totales y adheridas, siendo las dos lneas generalmente paralelas en todo su recorrido. En los meses en los que el embalse est en circulacin la distancia entre las lneas es un poco mayor, aproximndose, hasta hacerse casi coincidentes en algunos puntos, cuando el embalse est estratificado.

97

Hg. 28. PERFILES DE PROFUNDIDAD DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES

-~ O

lo 15 10 25 30 23
it, O 0 2 3 ,f/l

20
25

30 55 40 0 1 2 5 mg Total.. r.br.,a forn cg ul,/lOOc,l Totales Sor,.

-+ Ajt,etldca

Adtiafldot

so
5
20

lo
5 20
25

25 30 5

30 35 40 0 1 2 3 4 5 O 1 2 3 4 5 cg uf./IOOrnI Total.. S~o

+

mg ut./l Ociol letal.. J.,,la 1-- Adhsdda.

AjNOI..

,n.l,n. O

,,,Wlra.

lo

10 15 20 55 30 35
40 3 2 3 4 3

5 20 23
30

5 40 lo~ ufc/lO0n,I letal.. J,Jllo 4 Adh.,lda.

le, uft/tOO.nt Total..

-+Ajhadda.

S.ptt.rnbr.

Fig. 29. PERFILES DE PROFUNDIDAD DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES

o
15 20 25 30 35 40 2 3 4 5 loa if./l00,,l Total.. Octoibro 4- A4h.mldo.
?0

15 20
25

30 35 40 12 3
4 5

mg ole/O fOrn Total..

+

AdtarIdo.

Neo!., br.

eMmo
o
10 15 20 25 30 55 40 2 5 4 5 lo, olc/l00...l Total., 0- dinddo.

10 15 20 25 30 35 40
3 3 4 5

mg J0o/Ifo~ol 10101,. loare 4-- 440.rIda.

0lel.rnbr.

o.

3~1,0. 0

lo 15 20 25 30 35 *0
0 1 2 3 4 5

10 3 20 25
30

35 40 e; ufc/IOOmo, Tetale
AbrO

mg ofc/IOonl TatmI.. 1. lu * jhmddam

Mito.eltao

Fig. SO. PERFILES DE PROFUNDIDAD DE BACTERIAS ~ COLIFORMES FECALES

5 lo
5

5 10
15

0 25 30 35 40 0 1 2 3 4 5 tog ufc/lOOn.l

20 25 30 35 40 12 3 4 5
log ota/lOOflOl

Tetad., ~.boern o

A Ajir.Adc.

o. roo

o
5 lo 5 20 5 30 35 40 0 1 2 3 4 5 lo; ulr/lfonol Total.. Mmyo 5 lo 5 20 25 30 5 40 0 0 2 3 lo; ulc/lOCrnl mIel.. Jurio -4-- Adk.uldo.

+ AjIttdo.

neCreo o 5 lo 15 0 15 30 35
o O 1 2 3 4 5

0 5

lo
15 20 25 30 35
40

o; sOc/ofOrn Tabdleo Julle 4--- AdftUdd@o

lo; uf/IOOrnl oboe

+-

Adhor$doo

5.phl.mbrn

Fig. 31. PERFILES DE PROFUNDIDAD DE BACTERIAS COLIFORMES FECALES

5 0
33

5 10
13

30 25 30 55 40 Oog ufe/io0n.l olal Oolnb,.

>

20 25 30 55 40

lo; ole/O otmni 10001..

+

Afl.gtdae

AMno4dos

No,I.oe,br.

,o,oOo.

medro. o 5 $0 15
20

o
5 lo 15 20 25 30 35
o

25 30 35 40 2 3 4 5 0 0 2 3 4 5 loa oto/O OCe.oO Tolalto 1- Adhugtdao lo; uta/lOCorol total.. Eoore -4-- Atto.dd,o

Dlol.n.b,.

m.lre. medroo

5 30 $5 20 25 20 35 40 2 3
4 5

30
6

20 25 30 35 40 0 1 2 3 4 5 loa oto/O Qotol total.. AbrO -4-ji,.,Oda. loo ufe/I00rol Totalt JI. t Adho,ldoo

3.2,3,3, Porcentaje de coliformes adheridos a partculas

En la tabla 3 se pueden observar los porcentajes de bacterias coliformes totales que se
encontraban adheridas a partculas durante todo el estudio, en todas las profundidades estudiadas.

Como podemos ver stos estuvieron comprendidos entre un 40 y un 50% en la mayora de las muestras, llegando incluso a un 80% en la muestra de superficie de Julio del primer ao. El mes en que se encontr un porcentaje de adhesin mayor fue en Julio del segundo ao, con una media de 63,74%; si observamos la figura 29 podremos apreciar en la ltima grfica conrspondiente a este mes que las lineas que representan las bacterias totales y las adheridas estn muy prximas, lo que indica que sus recuentos fueron muy similares. El mes en el que se obtuvo el porcentaje menor fue Septiembre, con una media de 28,4%. Respecto a la profundidad, los mximos porcentajes de adhesin correspondieron a las muestras de superficie y de 20
metros

ni

Feb

Mar

May

lun

Jal

Sep

Oct

Nov

Dic

Ene

Abr

lu

0
2

40,6 42.0 39,1 42,5 44,6 40,8 43,9 46,5 42,5

44,9 40,0 37,5 44,2 40,8 42,8 40,6 39,0 41,2

62,5 38,1 39,1 41,5 47,8 40,6 43,8 39,4 44,1

35,7 42,8 30,8 45,0 60,0 61,9 62,2 73,5 51,5

80,0 67,3 32,7 30,6 35,5 429 56,0 43,8 48,6

21,0 25,0 31,0 32,0 26,1 19,0 58,3 15,0 28,4

51.4 45,6 41,9 46,9 40.5 59,4 36,5 5,2 40$

45,7 43,8 44,9 49,7 45,8 49,6 48,5 45,8 46,7

41,5 42,3 40,7 43,1 45,2 41,7 44,4 47,3 43,3

42,1 44,3 41,6 40,5 44,6 41,8 42,3 45,9

45,4 70,3 42,7 72,2 40,6 68,5 41,9 60,3 40,2 61,4 42,9 60,7 45,9 59,3 49,2 57,2

48,4 45,5 40,7 43,2 44,4 45,3 48,3 42,3

4 6 8 10 20 40 x

42,9 43,6 63,7

Tabla 3. Porcentaje de bacterias colifonnes totales que se presentaban adheridas a partculas, durante todo el perodo de estudio a las diferentes pmfundidades estudiadas,

con un 48,42% y un 48,47% respectivamente, y los mnimos a las muestras de 4 metros con un 40,7%. El haber obtenido uno de los mximos porcentajes de adhesin en superficie es algo natural debido a que en esta capa puede haber un mayor nmero de partculas disponibles para la adhesin y a que las bacterias que se encuentran adheridas obtienen una mayor proteccin tiente a factores adversos (Cheng et al, 1981, Fletcher, 1980 1,; White, 1984) entre los que se encuentra la luz del sol (Barcina et al, 1989, 1990; Cornax ej al, 1990; Rhodes y Kator, 1990), lo que explicara tambin el haber obtenido el mayor porcentaje de adhesin en Julio del

102

segundo ao (media=63,74%).

En la tabla 4 se recoge el tanto por ciento de bacterias coliformes fecales que se encontraban adheridas a partculas durante todo el perodo de estudio. Como en los coliformes totales, el porcentaje estuvo comprendido entre un 40% y un 50% durante la mayor parte del estudio, llegando a alcanzar un 86,4% en Septiembre en la muestra de 6 metros. El mes en que
se obtuvo el porcentaje mayor fue Julio del primer ao, con una media de 64,94%, y en el que se encontraron los valores menores fue Marzo, con una media de 41,73%. Respecto a la profundidad, los valores mximos de adhesin se alcanzaron en las muestras coaespondientes a los 10 metros con una media de 59,09%, y los mnimos en los 4 metros, con una media de
44,78%.

Z Feb Mar Muy lun Jul Sep Oct Nov Dic Ene Abr Jul
0 2 4 6 8 10 20 40 50,6 41,6 47,4 53,8 69,7 68.2 63,3 38,2 54,1 39,1 45,5 34,5 42,9 37,7 45,4 46,4 42,3 41,7 55,0 42,1 37,5 51,7 52,9 45,8 42,6 57,1 48,1 60,0 51,7 39,1 43,5 68,0 73,1 66,8 65,9 58,5 62,5 59,0 58,1 65,6 66,6 82,6 63,2 61,9 64,9 72,7 55,0 60,7 86,4 66,6 85,7 34,9 41,7 63,0 57,7 52.9 21,2 30,4 54,7 60,0 49,0 50,0 47,0 53,2 54,1 49,6 48,5 50,4 49,7 48,5 45,3 49,9 47,3 46,7 46,2 45,9 44,8 46,4 47,3 49,1 46,7 43,2 45,1 44,7 45,3 46,8 42,1 43,4 41,6 44,0 46,3 44,2 40,8 45,2 43,6 47,8 51,1 50,4 46,2 56,4 58,2 57,6 59,3 60,1 62,3 59,8 60,2 59,3

x 53,7 49,7 44,8 51,5 55,2 59,1 51,4 50,3

Ii

Tabla 4. Porcentaje de bacterias colifonnesfecales que se presentaron adheridas a partculas, durante todo
el perodo de estudio, a las diferentes profundidades estudiadas.

3.2.4. RECUENTO DE ESTREPTOCOCOS FECALES Como podemos observar en la tabla 5, los recuentos de estreptococos fecales fueron muy irregulares, no siendo posible detectarlos en algunas muestras y estando en las restantes en
nmero muy bajo. Ya anteriormente nosotros (Fernndez ei aL, 1991) observamos en este

mismo embalse que los recuentos de estreptococos fecales eran muy irregulares y bajos. Pourcher er al. (1991) encuentran que en un porcentaje muy elevado de muestras de aguas contaminadas con residuales los coliformes eran tambin muchsimo ms numerosos que los estreptococos fecales.
103

Feb
0 2 4

Mar 2 0
2

May 0 0
3

lun 0 1
2

Jul 0 1
2

Sep 2 0
1

Oct 0 0
1

Nov 0 0
1

Dic 3 1
1

Ene 1 0
2

Abr 0 1
3

lu 0 1
1

0 1
2

6 8 10 20
40 Tabla 5.

2 1 4 1 0

3 1 4 2 1

2 3 1 0 0

1 0 0 2 3

0 2 1 1 2

0 1 2 0 0

3 1 0 1 0

1 0 4 1 2

3 1 2 0 0

0 0 3 1 1

3 1 4 1 0

5 1 4 3 2

Recuento de estreptococos fecales (ufc/l00 ini>.

Se han publicado numerosos trabajos comparando los estreptococos fecales con los coliformes, en cuanto a las diferencias en su resistencia y su supervivencia, y a su idoneidad corno indicadores de la calidad microbiolgica del agua; existe una gran discrepancia al respecto. Mientras que algunos autores encuentran que la supervivencia de los estreptococos fecales es menor (Lessard y Sieburth, 1983) otros autores opinan lo contrario (Barcina el al., 1990; Hergstein-Ben y Stone, 1991; Bissonnette ej al., 1975; McFeters er aL, 1974). Pourcher ej al. (1991) opinan que la resistencia y la supervivencia dependen de las especies, y as, mientras que
los enterococos resultaban ser ms resistentes y con una ma~vr supervivencia que los coliformes,

Strepococcus bovis era mucho menos resistente y su supervivencia era mucho menor. Como se expone en el apartarlo 3.2.5., la especie predominante en el presente estudio ha sido S.bovis, por lo que creemos que los bajos e irregulares recuentos se deben a la menor supervivencia de esta especie. Aunque, dado el escaso nmero de estreptococos encontrados, no resulta adecuado hablar de porcentaje de adheridos a partculas, no queremos pasar por alto que una mayora de las cepas obtenidas fueron aisladas del filtro de 3 m de dimetro de poro en el que, queremos recordar, quedaban retenidas las bacterias que se encontraban adheridas a partculas.

104

3.2.5. IDENTIFICACION DE BACTERIAS 3.2.5.1. Identificacion de coliformes Con las cepas confirmadas como coliformes se realizaba la identificacin, habiendose identificado un total de 1024 cepas con los siguientes resultados:

Especie Cedecea davisae Citrobacrer freundit Crobacrer sp. Enterobacrer aerogenes Enterobacter agglomerans Enterobacter amnigenus Enterobacter ctoacae Enterobacter nrermedum Enterobacter sakazakii Enterobacter sp. Escherichia coli Klebsiella pnewnoniae Klebsiella oxytoca Kluyvera sp. Serrada ficada Serrada fonticola Serrada plymuthica No identificadas 2,9 6,0 1,4 5,0 3,5
1,9

19,4 6,4 3,4 1,8 22,1 4,4 2,6 3,1 2,3 6,7 5.9 1.1

Tabla 6. Identificacin de las cepas de coliformes aisladas Porcentaje de cepas de cada especie.

El espectro de especies obtenido es similar al encontrado por otros autores (Cenci et al., 1990; Rivera et al., 1988). Las cepas aisladas de los recuentos de coliformes fecales pertnecan en su totalidad a las siguientes especies: C. freundil, Citrobacter sp., E. aerogenes, E. cloacae,

105

E. col, 1<. pneumoniae y K. oxytoca. Esta distribucin de especies est de acuerdo con lo publicado por Leclerc y Mossel (1989). 3.252. Identificacin de estreptococos Como ya hemos anticipado en el apartado 3.2.4., una inmensa mayora de las cepas fueron identificadas como Streptococcus bovis.

Especie Sireptococcus bovis Enterococcus faecaUs Enterococcus durans Enrerococcus faecium No identificadas 86 8 3 2 1

Tabla 7. Identificacin de las cepas de estreptococos aisladas Porcentaje de cepas de cada especie

Ya en un trabajo anterior, nosotros (Fernndez er al., 1991) encontramos en este mismo embalse que la especie predominante era S, bovis. El predominio de esta especie en El Atazar pensamos que puede ser debido a que en la zona existe un mtodo de ganadera tradicional, denominado sesteo, que consiste en dejar al ganado suelto durante la mayor parte del ao. Como hemos dicho en la introduccin, en esta zona predominan los materiales impermeables, con lo que las aguas de lluvia llegaran por escorrenta superficial hasta el embalse sin sufrir infiltraciones, y estas aguas de lluvia arrastraran material fecal de todo el ganado de la zona, en el que la especie predominante es & bovis. Estos resultados sugieren que la identificacin de los estreptococos fecales y enterococos, de un habitat acutico, puede proporcionar una informacin muy til sobre el posible origen de la contaminacin, ya que mientras que Enterococcus faecalis predomina en las heces humanas y de pollos, bovis es tpica de heces bovinas y en menor medida tambin de cerdo (Pourcber et al., 1991).

106

3.2.6. ENSAYOS DE ADMESION IN VITRO Debido a la naturaleza variable de las superficies biolgicas algunos investigadores han usado superficies slidas de vidrio o poliestireno para estudiar la adhesin bacteriana ya que estos materiales proporcionan superficies ms estables y mejor definidas. Las fimbrias tipo 1
purificadas se adhieren por sus extremos a partculas de ltex de poliestireno y por eso el

poliestireno parece ser un material altamente adecuado para cuantificar la adhesin bacteriana mediada por este tipo de apndices (Harber et aL, 1983). Con la realizacin de estos ensayos se ha pretendido comprobar si existan diferencias en la capacidad de adhesin de las distintas cepas estudiadas, segnhubieran sido aisladas del filtro de 3 pm de dimetro de poro (donde quedan retenidas las bacterias adheridas a partculas) o del filtrado obtenido con este mismo filtro (donde se encuentran las bacterias libres de la muestra de agua). Para abreviar, y con el fin de agilizar la explicacin, a las primeras las denominaremos
cepas adheridas y a las segundas cepas libres.

Como se citaba en el apartado 2.3.7., los ensayos se realizaron con diversas cepas tanto de coliformes como de estreptococos, que comprendan todas las especies identificadas. En ningn caso se encontraron diferencias importantes entre la adhesin de cepas adheridas y la de cepas libres. Esto quiere decir que no significa que las cepas que se encuentran libres en el momento de llevar a cabo el anlisis de la muestra, tengan una menor capacidad de adhesin, sino que las bacterias adheridas pueden presentarse en algn momento libres, como estrategia de supervivencia, debido a que tienen la capacidad de desadherirse cuando la situacin es desfavorable (cuando disminuyen los nutrientes, cuando aumenta la concentracin bacteriana sobre la superficie de adhesin, etc.)(Marshall, 1980; Marshall et aL, 1971). Pedrs-Ali y Brock (1983) indican que muchas bacterias que se encuentran libres en el plancton tienen glicoellx, formado por fibrillas de polisacridos estrechamente empaquetadas, lo que sugiere que una parte sustancial de la poblacin libre podra potencialmente volverse adherida (Costerton y (leesey, 1979 a; Eletcher y Floodgale, 1976; Paer y Merkel, 1982). Tampoco se observaron diferencias entre las distintas cepas utilizadas. Todas las cepas, tanto de coliformes como de estreptococos estudiadas, presentaron una tendencia a la adhesin elevada, obtenindose en todos los casos unos recuentos mucho mayores

107

sobre la superficie que en solucin, una vez transcurrido el tiempo dejado para la adhesin.

Grupo bacteriano
Coliformes Ubres Coilformes adheridos Estreptococos libres Estreptococos adheridos 67 69

58 57

Tabla 8. Porcentaje de adhesin in titro de los

grupos bacterianos estudiados

3.3. RESULTADOS FISICO-OUIMICOS

3.3.1.

pH En la tabla 6 se presentan los resultados de pH durante todo el perodo de estudio, en

todas las profundidades estudiadas

Z Feb Mar May Jun li i Sep Oct Nov Dic Ene Abr lu
0 2

7,6
7,5 7,5

7,6
7,4 7,5

7,3
7,2 7,2

6,9
6,9 6,8

6,8
6,9 6,7

6,1
6,2 6,3

6,0
5,9 6,3

6,5
6,5 6,5

6,4
6,4 6,5

6,6
6,5 5,7

7,5
7~4 7,4

7,2
7,1 7,1

4 6 8 lO
20 40

7,5
7,4

7,6
7,4

7,2
7,1

6,8
6,8

6,9
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Tabla 9. Valores de pH, durante todo el perodo de estudio, a las diferentes profundidades estudiadas.

Los valores de pH se encontraron entre un mnimo de 5,7 en febrero del segundo ao en la muestra correspondiente al metro cuatro, y un mximo de 7,6 en superficie en los meses de

Febrero y Marzo y en la muestra del metro seis, tambin del mes de Marzo. Todas las 108

profundidadesestudiadas tuvieron valores de pH semejantes durante todo el estudio, sin mostrar grandes variaciones, ni temporales ni espaciales. Los valores son inferiores a los obtenidos en este mismo embalse en trabajos anteriores. (Fernndez, 1985; Carballo, 1987) en los que el pH oscil generalmente entre 8 y 8,8. 3.3.2. CONCENTRACION DE ION AMONIO
-

Distribucin temporal Las concentraciones de ion amonio se encuentran representadas en las figuras 32 y 33.

Como podemos observar en las mismas, no fue posible detectarlo en el primer y ltimo mes del estudio en ninguna de las profundidades ni en el mes de Mayo en las muestras de superficie, dos y cuatro metros. El aumento detectado en Octubre puede observarse en todas las muestras aunque es menor en la de cuatro metros de profundidad. El valor mximo obtenido es de 0,95 mg/l en el mes de Octubre en superficie. Los valores obtenidos son similaits a los encontrados porZinabu y Taylor (1989 a) en el lago Awassa, algo superiores a los encontrados por nosotros, con anterioridad, en este mismo embalse (Fernndez, 1985), e inferiores a los encontrados por Carballo (1987), tambin en este embalse, con concentraciones de 2,5 mg/l en algunas de las muestras y valores entre 1.5 y 2 mg/l durante varios meses. Como hemos citado anteriormente, el haber obtenido porcentajes de saturacin de oxgeno superiores a los detectados en aquel estudio, puede haber influido en que haya una menor concentracin de compuestos de nitrgeno ms reducidos en favor de los ms oxidados. La distribucin del ion amonio es altamente variable en los lagos y embalses y depende de muchos factores (Wetzel, 1983). En ocasiones se pueden producir aumentos bruscos y transitorios, producto del inmediato ataque microbiano a poblaciones fitoplanclnicas que proliferen en ese momento. Pensamos que ste pudo ser el motivo del aumento repentino que se observ en la mayora de las muestras en el mes de Octubre, ya que en el mismo mes, como veremos ms adelante, se produce una disminucin de la concentracin de ortofosfatos que podra haber sido debida a su absorcin por parte del fitoplancton. Es de destacar que en este mes se producen ligeros aumentos en el recuento total (AODC) en algunas profundidades e incrementos algo ms importantes en los recuentos de coliformes totales y fecales.

109

Distribucin espacial

No se observa una variacin con la profundidad, obtenindose unos valores bastante homogneos en toda la columna de agua. Otros autores (Zinabu y Taylor, 1989 a) obtenan, sin embargo, durante todo su estudio diferencias marcadas entre epilimnion e hipolimnion, correspondiendo las mayores concentraciones a la capa ms profunda. Estas diferencias con nuestros datos son debidas a que, en su estudio, las concentraciones de oxgeno disuelto en profundidad eran bajas, disminuyendo marcadamentedurante la estratificacin, momento en que obtenan los valores mximos de ion amonio. Y como ya hemos citado con anterioridad, las concentraciones de oxgeno disuelto en el embalse de El Atazar fueron elevadas durante todo el estudio y a todas las profundidades.

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3.33. CONCENTRACION DE NITRITOS

Distribucin

temporal

Las concentraciones de nitritos obtenidas se encuentran recogidas en las figuras 34 y 35. Como podemos observar los valores obtenidos son bajos, aunque similares, y en algunas muestras algo ms altos que los obtenidos por Carballo (1987) en este mismo embalse. Estuvieron comprendidos entre O y 0,47 mgfl. La distribucin temporal es irregular, con constantes aumentos y disminuciones. No fue posible su deteccin en las muestras de superficie, 2 y 6 metros del mes de Marzo. En Enero hubo un marcado aumento, reflejado en las grficas correspondientes a superficie, 2, 4, 6 y 8 metros; sin embargo el mximo valor obtenido corresponde a las muestras de ms profundidad (10 y 20 metros) con 0,47 mg/l en el mes de Diciembre. En el apanado anterior veamos que se produca un aumento de la concentracin de ion amonio en el mes de Octubre en todas las profundidades estudiadas. En este mes, en la concentracin de nitritos se produce una ligera disminucin en todas las profundidades. Estos sucesos podran estar relacionados con actividades de la poblacin bacteriana, bien por producirse un desplazamiento hacia la reduccin a in amonio o porque en Octubre, como ya hemos citado, se producen aumentos en algunas poblaciones bacterianas (AODC, en algunas profundidades, y coliformes totales y fecales) que pueden suponer un aumento del consumo de nitratos y nitritos. Tambin podemos observar que en los ltimos meses del estudio la concentracin de ion amonio va disminuyendo progresivamente, sobre todo en las tres ltimas profundidades, y en estos mismos meses se produce un ligero aumento de nitritos. Los nitritos, al ser compuestos intermedios en el ciclo del nitrgeno, es lgico que presenten una mayor variacin en las concentraciones detectadas. Otros autores citan estas irregularidades que pueden llegar, en ocasiones, a hacer imposible su deteccin a lo largo de todo un ao (Zinabu y Taylor, 1989 a). Distribucin espacial

Con respecto a la profundidad no se obtuvo un modelo de distribucin espacial, ya que en todos los niveles se alcanzaron valores similares.

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3.3.4.

CONCENTRACION DE NITRATOS

Distribucin temporal

Las concentraciones de nitratos estn representadas en las figuras 36 y 37. Los valores estuvieron comprendidos entre 0,13 mg/l, en Marzo en la muestra de 4 m y en Octubre en superficie, y 6,8 mg/l en Julio del segundo ao en superficie. Durante una gran parte del periodo de estudio, concretamente desde el mes de Marzo hasta el de Diciembre, los valores obtenidos fueron bajos y similares a los encontrados en un trabajo anterior (Carballo, 1987> en este mismo embalse; el resto de los meses la concentracin fue muy superior. Tambin son mayores que os valores encontrados por Zinabu y Taylor (1989 a). En el primer mes del estudio la concentracin de nitratos en todas las profundidades estudiadas era alta, oscilando entre 2 y 6 mg/l. Sin embargo en Marzo se produjo una disminucin, permaneciendo en esta situacin hasta Diciembre. Durante todos estos meses las concentraciones fueron menores de 1 mg/l en la mayora de las muestras, sobrepasando esta cantidad nicamente en los metros 20 y 40 en los meses de Junio y Septiembre. No es de extraar que durante estos meses obtuviramos los valores ms altos en el bipolimnion puesto que, como ya hemos mencionado en el apartado 3.1.. ste permaneca muy oxigenado incluso durante la estratificacin trmica. En Enero se produjo un gran aumento llegando de nuevo a concentraciones de 4 mg/l. mantenindose aproximadamente en esta situacin en todas las profundidades a excepcin de la superficie, en la que en los meses siguientes aumenta hasta llegar al mximo valor obtenido durante todo el estudio que fue de 6,8 mgfl en el mes de Julio del segundo alio. En los apartados anteriores resaltbamos que en el mes de Octubre se producaun aumento de la concentracin de ion amonio y una ligera disminucin de la de nitritos. La concentracin de nitratos en Octubre tambin es baja, producindose una ligera disminucin en todas las profundidades, que podramos explicar por las razones anteriormente citadas. Tambin sealbamos que se produca una disminucin de la concentracin de ion amonio y un aumento de la de nitritos en los tiltimos meses del estudio. Como hemos visto, durante estos meses tambin se produce el aumento de la concentracin de nitratos. Este incremento de la concentracin de nitratos puede haber influida en los aumentos que se producen en los recuentos de algunos grupos bacterianos (bacterias hetertrofas a 220C y coliformes), debido a la mayor disponibilidad de nitrgeno. Sin embargo, si comparamos las grficas de la figuras 32 a 37,

116

correspondientes a las concentraciones de estas tres formas nitrogenadas, observamos que sus dinmicas no son en absoluto similares. Distribucin espacial

En cuanto a la distribucin espacial, las concentraciones de nitratos son muy similares en todas las profundidades durante todo el perodo de estudio, pudindose apreciar que el perfil de la grfica es prcticamente el mismo en las ocho profundidades, nicamente de Marzo a Diciembre, meses en los que se mantuvieron las concentraciones en sus niveles ms bajos, stas son superiores en las capas ms profundas.

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3.3.5. CONCENTRACION DE ORTOFOSFATOS

Las concentraciones de ortofosfatos se encuentran representadas en las figuras 38 y 39. Las concetraciones estuvieron comprendidas entre O y 0,68, valor que se obtuvo en la muestra de superficie en el mes de Septiembre. Los valores obtenidos fueron bajos, siendo muy inferiores a los encontrados por Carballo (1987) en este mismo embalse, y similares a los encontrados por Zinabu y Taylor (1989 a).
-

Distribucin temooral Como se puede apreciar en las figuras citadas, la distribucin temporal es muy irregular,

mostrando continuas oscilaciones. Los ortofosfatos no pudieron ser detectados en el mes de Mayo en ninguna de las muestras ana]izadas, en el mes de Junio en las correspondientes a los metros 2 y 4, en Diciembre en las muestras de los metros 8, 10, 20 y 4<) y en Julio del segundo alio en ninguna de las muestras. Otros autores tambin han obtenido valores muy bajos e irregulares (Zinabu y Taylor, 1989 a). El no poder detectar estos compuestos en algunas de las muestras correspondientes a la primavera y el verano (Mayo, Junio y Julio) se puede atribuir a que el fsforo es el principal elemento limitante en este embalse (Carballo, 1987) y cuando est disponible es inmediatamente utilizado (Wetzel, 1983) compitiendo por l fitoplanclon y bacterioplancton. En los meses ms clidos y con ms horas de luz es cuando se produce un mayor desarrollo del fitoplancton, con lo cual asimilara todo el fosfato disponible. Como citbamos en los apartados anteriores es de destacar la disminucin de la concentracin en el mes de Octubre que coincide con un aumento de la del ion amonio y que ya hemos explicado en el apartado 3.3.2.
-

Distribucin esuacial

En cuanto a la profundidad no podemos reconocer ningn modelo de distribucin espacial, puesto que todas las profundidades secomportan de una manera similar con continuos aumentos y disminuciones.

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3.3.6. CONCENTRACION DE FOSFORO TOTAL Las concentraciones de fsforo total estn representadas en las figuras 40 y 41. Como podemos observar, los valores son tambin en su mayora bajos. En ocasiones podemos detectar similitudes entre las grficas de estas figuras ylas de las figuras 38 y 39, correspondientes a las concentraciones de ortofosfatos. Al igual que en stas, observamos que en Mayo se obtuvieron las menores concentraciones de fsforo total, con valores muy prximos a O mg/l en todas las profundidades estudiadas. Asimismo, tambin se produce un descenso acusado en el mes de Julio del segundo alio, volviendo a estar prxima a O mg/la concentracin de fsforo total en la muestra correspondiente a la superficie. El valor mximo se obtuvo en Enero, en la muestra del metro dos, alcanzando una concentracin de 2 mg/l. El aumento en este mes tambin se puede observar en las muestras de los metros 8, 10, 20 y 40.

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3U3.7.

DEMANDA QUIMICA DE OXIGENO (D.Q.O.)

Los valores de D.Q.O. se encuentran representados en las figuras 42 y 43. Como se puede observar en ellas, stos estuvieron comprendidos entre 4 y 7 mg O~/l. Estos valores son superiores a los encontrados por Carballo (1987) en este mismo embalse, quien obtuvo valores durante la mayor parte de su estudio alrededor de 2 mg 0~Il. Distribucin

El mximo se obtuvo en el mes de Marzo, en la muestra correspondiente al metro 10, con un valor de 6,9 mg OA. El mnimo se encontr en las muestras de los metros 4,10, 20 y 40 del mes de Abril, con valores prximos a los 4 mg 02/1. La distribucin temporal es bastante homognea a la largo de todo el perodo de estudio, no observndose aumentos ni disminuciones acusados en la mayora de las muestras. En cuanto a la distribucin espacial tampoco podemos observar una mayor localizacin de la materia orgnica en alguna de las capas.

A pesar de que la concentracin de materia orgnica puede influir notablemente en la concentracin de las poblaciones microbianas (Fry y Zia, 1982) en este caso no encontramos relaciones entre las variaciones en los valores de DQO y los recuentos bacterianos. Quizs esto sea debido a que los valores obtenidos son bajos y las variaciones pequeas.

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4. CONCLUSIONES

-Los recuentos de bacterias totales en el embalse de El Atazar se encontraron durante el periodo de estudio en el orden 10 6/ml, con porcentajes de clulas respiratoriamente activas muy bajos durante gran parte del estudio, excepto en los meses de verano. -La distribucin temporal es ms homognea en las bacterias autctonas que en las alctonas. Por otra parte la de las bacterias coliformes es semejante a la de las bacterias hetertrofas a 37<C. -Los recuentos de coliformes han sido mucho mayores que los de estreptococos, que no pudieron ser detectados en numerosas muestras. Se recomienda el mtodo de filtracin por membrana con incubacin anaerobia para el recuento de bacterias coliformes en ambientes acuticos naturales, ante la interferencia de bacterias de otros grupos que dificultan su deteccin. -Las especies predominantes entre las bacterias coliformes han sido Enterobacter cloacae y Escherichia cot, mientras que la especie dominante en los estreptococos es Steptococcus bovis, lo que conduce a la obtencin de recuentos muy bajos debido a su menor supervivencia en agua. -Los porcentajes de adhesion han sido mayores entre las bacterias que se consideran alctonas que entre las consideradas autctonas. Las bacterias del grupo coliforme presentan una alta tendencia a la adhesin, obteniendose porcentajes alrededor del 50% en la mayora de las muestras estudiadas. Esta alta tendencia a la adhesin tambin se observ en los estreptococos a pesar de la irregularidad de sus recuentos. -La adhesin itt virro, tanto de las cepas de coliformes como de estreptococos aisladas de las muestras del embalse, ha sido elevada en todos los casos, sin diferencias entre las distintas cepas de bacterias que se encontraban libres y adheridas en el embalse. -La gran tendencia a la adhesin de los coliformes podra suponer una estrategia de supervivencia en medios acuticos de estas bacterias que han sido consideradas tradicionalmente indicadoras de contaminacin fecal.

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